CN103397046B - 一种定向筛选同源重组pgc的载体及构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种定向筛选同源重组PGC的载体及制备方法和应用，将表达框UAS:mRFP-UTRnos1和表达框UAS:puma-UTRnos1串联构建出一种可定向筛选同源重组PGC的载体p(UAS:mRFP,UAS:puma)，其序列为SEQIDNO.1所示。该载体具有荧光特异高效标记PGC的作用，又具有促凋亡基因特异剔除PGC的作用。以p(UAS:mRFP,UAS:puma)为载体骨架，将打靶基因同源序列的左右臂分别置于表达框UAS:mRFP-UTRnos1的两侧，并且使表达框UAS:puma-UTRnos1位于同源序列的外侧，制备出同源重组载体。在Tg(kop:KalTA4)胚胎中导入同源重组载体，挑选出在PGC中表达mRFP的胚胎，即为在生殖细胞中发生了同源重组的胚胎。

Description

一种定向筛选同源重组PGC的载体及构建方法和应用

技术领域

本发明属于鱼类生物工程技术领域，本发明涉及一种定向筛选同源重组PGC的载体，还涉该载体的制备方法，还涉及该载体在定向筛选斑马鱼同源重组PGC中的应用，本发明的定向筛选同源重组PGC的载体可以高效地利用同源重组技术制备带有特定遗传修饰的斑马鱼品系。

背景技术

同源重组技术是构建基因敲除小鼠模型最普遍使用的方法，其基本步骤是：首先将打靶载体转入小鼠胚胎干细胞中；再通过合适的筛选系统鉴定出发生了同源重组的胚胎干细胞；然后通过嵌合体技术将遗传修饰过的胚胎干细胞培养成小鼠个体，从而制备出带有特定基因失活或者缺失的小鼠(Schafer,C.(2007).“NobelPrize in medicine.Knockout mice revolutionize genetics”.Unfallchirurg.110,1082-1084.)。因此，同源重组技术和胚胎干细胞技术为小鼠中进行基因敲除奠定了基础。然而，在鱼类中，尽管同源重组事件也同样存在，由于尚没有建立把体外培养的细胞株转变成为个体鱼的技术，但是利用同源重组进行基因打靶的研究并不多（Liu,J.,Gong,L.,Chang,C.,Liu,C.,Peng,J.and Chen,J.(2012)Development of novel visual-plus quantitative analysis systems for studying DNAdouble-strand break repairs in zebrafish.J Genet Genomics39,489-502）。

值得注意的，在小鼠中的嵌合体技术中，移植的胚胎干细胞只有发育为生殖细胞才能将遗传修饰传递下去，所以胚胎干细胞和嵌合体技术的最终目标是希望将遗传修饰作用到生殖细胞基因中。斑马鱼鱼具有产卵量大的优势，如果直接将斑马鱼的PGC作为基因打靶的对象，PGC是将来要发育为生殖细胞的胚胎细胞，筛选出PGC打靶成功的胚胎就能成功地将遗传修饰传递下去。

但是，由于同源重组在动物中发生率只有10^-2～10^-5，如何筛选出发生了同源重组的细胞非常重要。在小鼠中应用最多的是正负筛选法，比如常用药物G418筛选所有能表达正筛选基因neo的细胞，然后用Ganciclovir淘汰表达单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶（HSV-TK）的细胞，剩下的细胞为发生了同源重组的细胞。然而，基于药物G418和Ganciclovir的正负筛选系统却不能在斑马鱼胚胎中使用。由于没有合适的筛选系统，Zu等人利用同源重组在斑马鱼中进行基因打靶，结果经过了繁重的筛选工作才筛选出能够将发生了同源重组传递下去的斑马鱼(Zu,Y.,Tong,X.,Wang,Z.,Liu,D.,Pan,R.,Li,Z.,Hu,Y.,Luo,Z.,Huang,P.,Wu,Q.,Zhu,Z.,Zhang,B.and Lin,S.(2013)TALEN-mediated precise genome modificationby homologous recombination in zebrafish.Nat Methods.10,329-331.)。因此，为了能够在斑马鱼中实现基因打靶并在细胞水平上对胚胎进行早期筛选，有必要在生殖细胞中建立高效的正筛选系统。

为了能够标记PGC，研究者们构建了一些利用PGC特异的启动子和UTR调控荧光蛋白表达的转基因品系。但在这些转基因载体直接地注射到斑马鱼胚胎中并不能很好的标记PGC。例如注射vasa:EGFP载体后，PGC和体细胞能表达EGFP(Krovel,A.V.and Olsen,L.C.(2002)"Expression of a vas::EGFP transgene inprimordial germ cells of the zebrafish."Mech Dev116,141-150)；注射kop:EGFP后，不能在胚胎任何细胞中观察到荧光表达(Blaser,H.,Eisenbeiss,S.,Neumann,M.,Reichman-Fried,M.,Thisse,B.,Thisse,C.and Raz,E.(2005)"Transition fromnon-motile behaviour to directed migration during early PGC development inzebrafish."J Cell Sci118,4027-4038)。

在我们之前的研究中，我们建立了在PGC特异表达KalTA4转录激活因子的转基因斑马鱼品系Tg(kop:KalTA4)。KalTA4是Gal4/UAS系统中经过优化的转录激活因子，与4xUAS搭配使用可以有效的减少Gal4/UAS系统的细胞毒性和提高诱导激活效率(Distel,M.,Wullimann,M.F.and Koster,R.W.(2009)"OptimizedGal4genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish."Proc Natl Acad Sci U S A.106,13365-13370)。在斑马鱼品系Tg(kop:KalTA4)的胚胎中注射包含表达框UAS:mRFP-UTRnos1的质粒就能特异、高效、持续地标记PGC。此外，研究者们通过对凋亡通路中的分析，已经可以实现在胚胎发育早期通过过表达凋亡相关基因如puma，控制斑马鱼胚胎整体的存活（Kratz,E.,Eimon,P.M.,Mukhyala,K.,Stern,H.,Zha,J.,Strasser,A.,Hart,R.and Ashkenazi,A.(2006)Functionalcharacterization of the Bcl-2gene family in the zebrafish.Cell Death Differ.13,1631-1640.）。

在本发明中，我们在PGC中特异地表达KalTA4转录激活因子的转基因品系Tg(kop:KalTA4)（申请号：201310169181.6，一种高效标记斑马鱼PGC的载体及转基因鱼的制备方法和用途）的基础上，注射UAS驱动的mRFP载体正筛选载体p(UAS:mRFP)就能高效特异标记PGC细胞，实现正筛选功能；同时在该载体上串联UAS驱动的促凋亡基因的表达框UAS:puma-UTRnos1，就能将随机整合该载体的PGC杀死，实现负筛选功能。如果在正负筛选载体p(UAS:mRFP,UAS:puma)上连入同源重组目的基因的左右臂，就能实现在斑马鱼中进行基因打靶并对胚胎进行早期筛选。

发明内容

发明的目的是在于提供了一种定向筛选同源重组PGC的载体p(UAS:mRFP,UAS:puma)，其序列为SEQ ID NO.1所示。该载体包含有2个串联表达框：一个是UAS驱动mRFP的表达框，另一个是UAS驱动促凋亡基因puma的表达框。载体p(UAS:mRFP,UAS:puma)的表达框UAS:mRFP-UTRnos1具有荧光特异高效标记PGC的作用，表达框UAS:puma-UTRnos1具有促凋亡基因特异剔除PGC的作用。

本发明的另一个目的在于提供了一种定向筛选同源重组PGC的载体p(UAS:mRFP,UAS:puma)的制备方法。该方法易行，操作简单。以pMD-18T（takara公司）为载体骨架，分别连入利用连接PCR拼接而成的表达框UAS:mRFP-UTRnos1和表达框UAS:puma-UTRnos1，形成载体p(UAS:mRFP,UAS:puma)。

本发明最后一个目的在于提供了p(UAS:mRFP,UAS:puma)载体在定向筛选斑马鱼同源重组PGC中的应用。以质粒p(UAS:mRFP,UAS:puma)为载体骨架构建出同源重组质粒，然后将同源重组质粒注射到Tg(kop:KalTA4)胚胎中。挑选出在PGC中表达mRFP的胚胎，即为在生殖细胞中发生了同源重组的胚胎。将这些胚胎培养至性成熟，就能从它们的子代中筛选出基因打靶成功的斑马鱼。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下技术措施：

本发明的设计思路是：

以质粒p(UAS:mRFP,UAS:puma)为载体骨架构建出同源重组质粒，即在表达框UAS:mRFP-UTRnos1表达框两侧分别插入打靶目的基因的左右臂序列，同时UAS:puma-UTRnos1表达框位于左右臂序列的外侧。然后将同源重组质粒注射到Tg(kop:KalTA4)胚胎中。当发生同源重组时，表达框UAS:mRFP-UTRnos1连同左右臂都整合入基因组中，表达框UAS:mRFP-UTRnos1在PGC中表达特异的mRFP实现正筛选功能，而表达框UAS:puma-UTRnos1由于没有整合到基因组中而最终被降解；若发生随机整合，表达框UAS:mRFP-UTRnos1和UAS:puma-UTRnos1都将整合入基因组中，UAS:puma-UTRnos1就能表达促凋亡基因诱导PGC死亡实现负筛选功能。

一种定向筛选同源重组PGC的载体，其制备步骤是：

（1）构建UAS驱动mRFP表达标记PGC的正筛选载体p(UAS:mRFP)

分别以质粒pBK-kalTA4和PCS2-mRFP为模板，UAS-mRFP-F和UAS-mRFP-m-R，UAS-mRFP-m-F和UAS-mRFP-R为引物，运用搭桥PCR连接PCR将UAS和mRFP全长编码序列连接成一条DNA链UAS:mRFP。扩增条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，62-58℃（每个循环降0.5℃）复性30秒，68℃延伸60秒，8个循环；95℃变性30秒，63℃复性30秒，68℃延伸60秒，15个循环；68℃延伸10分钟；4℃保存。再分别以UAS:mRFP和质粒kop-new-F-EGFP-UTRnos1为模板，loxp66-4UAS-F和mRFP-nos1-m-F，mRFP-nos1-m-R和loxp71-4UAS-R为引物，运用搭桥PCR连接PCR将UAS:mRFP和nanos13’UTR连接成一条DNA链UAS:mRFP-UTRnos1。扩增条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，61-57℃（每个循环降0.5℃）复性30秒，68℃延伸90秒，8个循环；95℃变性30秒，62℃复性30秒，68℃延伸90秒，20个循环；68℃延伸10分钟；4℃保存。最后将表达框UAS:mRFP-UTRnos1连入pMD-18T载体（takara公司）中，获得载p(UAS:mRFP)。

（2）构建UAS驱动mRFP表达串联UAS驱动促凋亡基因puma表达的正负筛选载体p(UAS:mRFP,UAS:puma)

分别以质粒pBK-kalTA4和zPuma为模板，UAS-mRFP-F和UAS-puma-m-R，UAS-puma-m-F和UAS-mRFP-R为引物，运用连接PCR将UAS和puma全长编码序列连接成一条DNA链UAS:puma。扩增条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，61-57℃（每个循环降0.5℃）复性30秒，68℃延伸50秒，8个循环；95℃变性30秒，62℃复性30秒，68℃延伸50秒，15个循环；68℃延伸10分钟；4℃保存。再分别以UAS:puma和质粒kop-new-F-EGFP-UTRnos1为模板，4UAS-puma-F-NdeI和UASpuma-nos-m-R，UASpuma-nos-m-F和4UAS-puma-R-HindIII为引物，运用连接PCR将UAS:puma和nanos13’UTR连接成一条DNA链UAS:puma-UTRnos1表达框。扩增条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，61-57℃（每个循环降0.5℃）复性30秒，68℃延伸80秒，10个循环；95℃变性30秒，62℃复性30秒，68℃延伸80秒，20个循环；68℃延伸10分钟；4℃保存。再用NdeI和HindIII酶切连接的方法将表达框UAS:puma-UTRnos1连入载体p(UAS:mRFP)，获得p(UAS:mRFP,UAS:puma)载体，其序列为SEQ ID NO.1所示。

p(UAS:mRFP,UAS:puma)载体的功能验证，其步骤是：

（1）在Tg(kop:KalTA4)胚胎中分别过表达p(UAS:mRFP)和p(UAS:mRFP,UAS:puma)质粒

通过显微注射仪和显微注射法分别将质粒p(UAS:mRFP)和p(UAS:mRFP,UAS:puma)导入激活品系Tg(kop:KalTA4)的胚胎中，DNA注射剂量为25ng/μl，1-2nl/卵。

（2）荧光观察

在注射了p(UAS:mRFP)质粒的Tg(kop:KalTA4)胚胎PGC中可以观察到高效特异的mRFP；而在注射了p(UAS:mRFP,UAS:puma)质粒的Tg(kop:KalTA4)胚胎PGC中不能观察到mRFP。表明在转基因品系Tg(kop:KalTA4)胚胎中能特异地激活表达框UAS:puma-UTRnos1在PGC中过表达puma，过表达的puma特异地诱导PGC凋亡。即表达框UAS:puma-UTRnos1能够在不影响胚胎存活的条件下特异地剔除PGC。

p(UAS:mRFP,UAS:puma)载体在定向筛选斑马鱼同源重组PGC中的应用，其步骤是：

（1）设计基于荧光-凋亡的正负筛选系统进行靶向PGC的同源重组载体

策略图见图3所示：以质粒p(UAS:mRFP,UAS:puma)为载体骨架，将同源序列的左右臂分别置于表达框UAS:mRFP-UTRnos1的两侧，并且使表达框UAS:puma-UTRnos1位于同源序列的外侧。当发生同源重组时，表达框UAS:mRFP-UTRnos1连同左右臂都整合入基因组中，表达框UAS:mRFP-UTRnos1在PGC中表达特异的mRFP实现正筛选功能，而表达框UAS:puma-UTRnos1由于没有整合到基因组中而最终被降解；若发生随机整合如图3b所示，表达框UAS:mRFP-UTRnos1和UAS:puma-UTRnos1都将整合入基因组中，UAS:puma-UTRnos1就能表达促凋亡基因诱导PGC死亡实现负筛选功能。

（2）在Tg(kop:KalTA4)中导入同源重组载体

通过显微注射仪和显微注射法将构建的同源重组质粒导入激活品系Tg(kop:KalTA4)的胚胎中，DNA注射剂量为25ng/μl，1-2nl/卵。

（3）荧光观察

挑选出在PGC中表达mRFP的胚胎，即为在生殖细胞中发生了同源重组的胚胎。将这些胚胎培养至性成熟，就能从它们的子代中筛选出基因打靶成功的斑马鱼。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：

（1）载体p(UAS:mRFP,UAS:puma)的表达框UAS:mRFP-UTRnos1具有荧光特异高效标记PGC的作用，表达框UAS:puma-UTRnos1具有促凋亡基因特异剔除PGC的作用。从而可以对PGC进行体内遗传操作。

（2）由于载体p(UAS:mRFP,UAS:puma)具有标记PGC和剔除PGC的作用，可以建立基于荧光-凋亡的正负筛选系统靶向PGC的同源重组技术。由于在PGC中打靶就能实现生殖细胞中打靶，只要挑选出PGC中表达mRFP的胚胎饲养，就可以高效地从这些胚胎的子代中筛选发生了遗传修饰的胚胎，从而避免了在没有筛选系统的条件下进行斑马鱼基因打靶而导致的繁重的筛选工作。同时由于PGC是培养于胚胎中的，也无需小鼠中进行的细胞移植操作和嵌合体饲养等过程。

附图说明

图1为一种表达载体p(UAS:mRFP,UAS:puma)示意图

由UAS和PGC特异的nanos13’UTR调控mRFP的表达框，串联UAS和PGC特异的nanos13’UTR调控调控促凋亡基因puma的表达框。

图2为一种在Tg(kop:KalTA4)胚胎中过表达质粒p(UAS:mRFP)和质粒p(UAS:mRFP,UAS:puma)的荧光表达情况示意图

胚胎发育至1天时，注射了p(UAS:mRFP)质粒的Tg(kop:KalTA4)胚胎PGC中能高效特异地观察到mRFP（图2，a，a’）；而注射了串联载体p(UAS:mRFP,UAS:puma)的Tg(kop:KalTA4)胚胎中不能观察到mRFP在PGC表达（图2，b，b’）

图3为一种建立靶向PGC的同源重组技术原理示意图

发生同源重组时，图a所示，同源重组质粒p(nL-UAS:mRFP-nR,UAS:puma)中的表达框UAS:mRFP-UTRnos1连同左右臂整合入基因组中，而表达框UAS:puma-UTRnos1由于没有整合到基因组中而被降解。表达框UAS:mRFP-UTRnos1能在PGC中表达特异的mRFP，即利用PGC特异高表达的荧光发挥正筛选作用；若发生随机整合，图b所示，同源重组质粒p(nL-UAS:mRFP-nR,UAS:puma)中全部序列包括表达框UAS:puma-UTRnos1都整合入基因组中，UAS:puma-UTRnos1就能表达促凋亡基因诱导PGC死亡，即利用PGC特异高表达的促凋亡基因发挥负筛选作用。

具体实施方式

本发明实施例中的方法未经特别说明，均为本领域技术人员熟知的常规方法，具体可参考《分子克隆实验指南》（第二版，J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，1993）。本发明中所用的生物试剂如未经特别说明，均来源于Fermantas公司。

实施例1：

一种定向筛选同源重组PGC的载体，其制备步骤是：

（1）构建向UAS驱动mRFP表达标记PGC的正筛选载体p(UAS:mRFP)。

分别以质粒pBK-kalTA4(Distel,M.,Wullimann,M.F.and Koster,R.W.(2009)Optimized Gal4genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.Proc Natl Acad Sci U S A.106,13365-13370.)和PCS2-mRFP(Addgene)为模板，UAS-mRFP-F和UAS-mRFP-m-R，UAS-mRFP-m-F和UAS-mRFP-R为引物，运用连接PCR将UAS和mRFP全长编码序列连接成一条DNA链UAS:mRFP。扩增条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，62-58℃（每个循环降0.5℃）复性30秒，68℃延伸60秒，8个循环；95℃变性30秒，63℃复性30秒，68℃延伸60秒，15个循环；68℃延伸10分钟；4℃保存。

再分别以UAS:mRFP和质粒kop-new-F-EGFP-UTRnos1(Blaser,H.,Eisenbeiss,S.,Neumann,M.,Reichman-Fried,M.,Thisse,B.,Thisse,C.and Raz,E.(2005)"Transition from non-motile behaviour to directed migration during earlyPGC development in zebrafish."J Cell Sci118,4027-4038)为模板，loxp66-4UAS-F和mRFP-nos1-m-F，mRFP-nos1-m-R和loxp71-4UAS-R为引物，运用连接PCR将UAS:mRFP和nanos13’UTR连接成一条DNA链UAS:mRFP-UTRnos1。扩增条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，61-57℃（每个循环降0.5℃）复性30秒，68℃延伸90秒，8个循环；95℃变性30秒，62℃复性30秒，68℃延伸90秒，20个循环；68℃延伸10分钟；4℃保存。

将UAS:mRFP-UTRnos1表达框及pMD-18T（takare公司）载体利用T4连接酶在4℃中过夜连接，最后将连接产物转化入大肠杆菌TOP10菌株（购自Invitrogen公司）。转化的过程为：将连接产物加入4℃的感受态细胞中，轻混匀，冰浴30分钟；42℃热激90秒后冰浴2分钟；加入600ul LB培养基，于37℃，100rpm培养1h；涂平板，于37℃培养12-16h（常规方法，分子克隆实验指南，第二版，J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，1993）。利用引物F：TGACAAACATAATCGCCATA，R：CCCCAGGCTTTACACTTTA进行PCR筛选阳性克隆，扩增条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，55℃复性30秒，72℃延伸30秒，30个循环；72℃延伸10分钟；4℃保存。经序列测定，获得p(UAS:mRFP)载体。引物序列如下：

（2）构建了UAS驱动mRFP表达串联UAS驱动促凋亡基因puma表达的正负筛选载体p(UAS:mRFP,UAS:puma)。

分别以质粒pBK-kalTA4(Distel,M.,Wullimann,M.F.and Koster,R.W.(2009)Optimized Gal4genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.Proc Natl Acad Sci U S A.106,13365-13370.)和zPuma(Kratz,E.,Eimon,P.M.,Mukhyala,K.,Stern,H.,Zha,J.,Strasser,A.,Hart,R.and Ashkenazi,A.(2006)Functionalcharacterization of the Bcl-2gene family in the zebrafish.Cell Death Differ.13,1631-1640.)为模板，UAS-mRFP-F和UAS-puma-m-R，UAS-puma-m-F和UAS-mRFP-R为引物，运用连接PCR将UAS和puma全长编码序列连接成一条DNA链UAS:puma。扩增条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，61-57℃（每个循环降0.5℃）复性30秒，68℃延伸50秒，8个循环；95℃变性30秒，62℃复性30秒，68℃延伸50秒，15个循环；68℃延伸10分钟；4℃保存。

再分别以UAS:puma和质粒kop-new-F-EGFP-UTRnos1为模板，4UAS-puma-F-NdeI和UASpuma-nos-m-R，UASpuma-nos-m-F和4UAS-puma-R-HindIII为引物，运用连接PCR将UAS:puma和nanos13’UTR连接成一条DNA链UAS:puma-UTRnos1表达框。扩增条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，61-57℃（每个循环降0.5℃）复性30秒，68℃延伸80秒，10个循环；95℃变性30秒，62℃复性30秒，68℃延伸80秒，20个循环；68℃延伸10分钟；4℃保存。

将UAS:puma-UTRnos1表达框及人工合成的载体p(UAS:mRFP)在37℃水浴中用限制性内切酶NdeI和HindIII双酶切酶切4-6小时，然后参照Axygen公司DNA胶回收试剂盒回收酶切产物。再将回收的DNA片段UAS:puma-UTRnos1与载体骨架利用T4连接酶在4℃中连接过夜，最后将连接产物转化入大肠杆菌TOP10菌株（购自Invitrogen公司）。转化的过程为：将连接产物加入4℃的感受态细胞中，轻混匀，冰浴30分钟；42℃热激90秒后，冰浴2分钟；加入600ulLB培养基，于37℃，100rpm培养1h；涂平板，于37℃培养12-16h（常规方法，分子克隆实验指南，第二版，J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，1993）。利用引物F：TGACAAACATAATCGCCATA，R：AAAGTGAGGCTGAGACGC进行PCR筛选阳性克隆，扩增条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，55℃复性30秒，72℃延伸30秒，30个循环；72℃延伸10分钟；4℃保存。经序列测定，获得p(UAS:mRFP,UAS:puma)载体，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。见图1。引物序列如下：

实施例2：

正负筛选载体p(UAS:mRFP,UAS:puma)功能的验证，其步骤是：

（1）激活品系Tg(kop:KalTA4)的胚胎的制备：将含转基因载体pTol2(kop:KalTA4-UTRnos1,CMV：EGFP-SV40)（序列为SEQ ID NO.2所示）导入斑马鱼受精卵中。转基因鱼性成熟后，与野生型的雌鱼杂交，将交胚胎培养于28℃培养24hr，在荧光解剖镜下挑选出能发出绿色荧光的胚胎继续培养，最后建立纯系Tg(kop:KalTA4)（一种高效标记斑马鱼PGC的载体及转基因鱼的制备方法和用途，

申请号：201310169181.6）。

（2）Tg(kop:KalTA4)胚胎中分别过表达p(UAS:mRFP)和p(UAS:mRFP,UAS:puma)质粒。

通过显微注射仪和显微注射法（Zhu Z,Li G,He L,et al.Novel gene transferinto the fertilized eggs of goldfish(Carassius auratus L.1758).Z angew Ichthyol,1985,1:31-34）在激活品系Tg(kop:KalTA4)的胚胎中分别导入p(UAS:mRFP)和p(UAS:mRFP,UAS:puma)质粒，DNA注射剂量25ng/μl，1-2nl/卵。

（3）荧光观察

胚胎发育至1天时，相对于注射了质粒p(UAS:mRFP)的Tg(kop:KalTA4)胚胎PGC中能观察到明亮的mRFP（图2，a，a’），注射了质粒p(UAS:mRFP,UAS:puma)的Tg(kop:KalTA4)胚胎不能观察到mRFP表达（图2，b，b’）。表明在转基因品系Tg(kop:KalTA4)胚胎中能特异地激活UAS-puma-UTRnos1在PGC中过表达puma，从而在不影响胚胎存活的条件下特异地剔除PGC。

实施例3：

p(UAS:mRFP,UAS:puma)载体在定向筛选斑马鱼同源重组PGC中的应用，其应用过程是：

（1）制备基于荧光-凋亡的正负筛选系统进行靶向PGC的同源重组质粒。

通过分子克隆技术（常规方法，分子克隆实验指南，第二版，J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，1993），以质粒p(UAS:mRFP,UAS:puma)为载体骨架，在UAS:mRFP-UTRnos1表达框两侧分别插入打靶目的基因的左右臂DNA序列，同时UAS:puma-UTRnos1表达框位于左右臂序列的外侧，构建出靶向目的基因nanog的同源重组载体，见图3。以目的基因nanog(Accession#BC162318)为例，具体方法如下：

以野生型斑马鱼DNA为模板，利用引物nL-F：tatacgcgtccagtaagtgcttaggag和nL-R：tataagcttGCCATTTCGCCGTTAGAT扩增出目的基因nanog的左臂DNA序列nL。扩增条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，61-56℃（每个循环降0.5℃）复性30秒，68℃延伸120秒，10个循环；95℃变性30秒，62℃复性30秒，68℃延伸120秒，25个循环；68℃延伸10分钟；4℃保存。将扩增出的左臂DNA序列nL及载体p(UAS:mRFP,UAS:puma)在37℃水浴中用限制性内切酶MluI和HindIII双酶切4-6小时，然后参照Axygen公司DNA胶回收试剂盒回收酶切产物。再将回收的DNA片段nL与载体骨架利用T4连接酶在4℃中过夜连接，最后将连接产物转化入大肠杆菌TOP10菌株（购自Invitrogen公司），转化的过程为：将连接产物加入4℃的感受态细胞中，轻混匀，冰浴30分钟；42℃热激90秒后，冰浴2分钟；加入600ul LB培养基，于37℃，100rpm培养1h；涂平板，于37℃培养12-16h（常规方法，分子克隆实验指南，第二版，J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，1993）。利用引物F：TTACTTTCTGCTTGAGTTTATCT，R：AACTGAGGGGACAGGATG进行PCR筛选阳性克隆，扩增条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，54℃复性30秒，72℃延伸30秒，30个循环；72℃延伸10分钟；4℃保存。经序列测定，获得p(nL-UAS:mRFP,UAS:puma)载体。

以野生型斑马鱼DNA为模板，利用引物nR-F：tatcgtacgagaccagcagtgatacaccc和nR-R：tatggtaccTCAATGCAGGCAGAGGAGGCT扩增出目的基因nanog的右臂DNA序列nR。扩增条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，61-56℃（每个循环降0.5℃）复性30秒，68℃延伸120秒，10个循环；95℃变性30秒，62℃复性30秒，68℃延伸120秒，25个循环；68℃延伸10分钟；4℃保存。将扩增出的右臂DNA序列nR及载体p(nL-UAS:mRFP,UAS:puma)在37℃水浴中用限制性内切酶BsiWI和KpnI双酶切4-6小时，然后参照Axygen公司DNA胶回收试剂盒回收酶切产物。再将回收的DNA片段nR与载体骨架利用T4连接酶在4℃中过夜连接，最后将连接产物转化入大肠杆菌TOP10菌株（购自Invitrogen公司），转化的过程为：将连接产物加入4℃的感受态细胞中，轻混匀，冰浴30分钟；42℃热激90秒后，冰浴2分钟；加入600ul LB培养基，于37℃，100rpm培养1h；涂平板，于37℃培养12-16h（常规方法，分子克隆实验指南，第二版，J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，1993）。利用引物F：TGACAAACATAATCGCCATA，R：TCGAGTCGAGTGTACGCA进行PCR筛选阳性克隆，扩增条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，55℃复性30秒，72℃延伸30秒，30个循环；72℃延伸10分钟；4℃保存。经序列测定，获得同源重组载体p(nL-UAS:mRFP-nR,UAS:puma)。

（2）在Tg(kop:KalTA4)中注射同源重组载体

通过显微注射仪和显微注射法（Zhu Z,Li G,He L,et al.Novel gene transferinto the fertilized eggs of goldfish(Carassius auratus L.1758).Z angew Ichthyol,1985,1:31-34）在激活品系Tg(kop:KalTA4)的胚胎中导入同源重组质粒p(nL-UAS:mRFP-nR,UAS:puma)，DNA注射剂量25ng/μl，1-2nl/卵。

（3）荧光观察

注射到胚胎中的同源重组质粒p(nL-UAS:mRFP-nR,UAS:puma)整合到生殖细胞基因组中有2种情况：

一是发生了同源重组，如图3a所示，同源重组载体中的表达框UAS:mRFP-UTRnos1和左右臂序列整合入基因组中，而表达框UAS:puma-UTRnos1由于没有整合到基因组中而被降解。表达框UAS:mRFP-UTRnos1能够在PGC中特异的表达mRFP。

二是发生了随机整合，如图3b所示，同源重组载体中的全部序列包括表达框UAS:mRFP-UTRnos1和UAS:puma-UTRnos1都整合入基因组中。UAS:puma-UTRnos1表达框就能表达促凋亡基因诱导PGC死亡实现负筛选功能，那么发生了随机整合的生殖细胞将凋亡。

在注射的4000颗胚胎中，挑选出了3颗在PGC中表达mRFP的胚胎，这些胚胎即为在生殖细胞中发生了同源重组的胚胎。将这些胚胎培养至性成熟，筛选出了基因打靶成功的斑马鱼。

  SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院水生生物研究所

<120>一种定向筛选同源重组PGC的载体及制备方法和应用

<130>一种定向筛选同源重组PGC的载体及制备方法和应用

<160>  2    

<170>  PatentIn version 3.1

<210>  1

<211>  5536

<212>  DNA

<213>人工合成

<400>  1

cgcgtttgcg gccgcaacta gtttgggccc aagcttgcat gcctgcaggt cgacataact     60

tcgtatagca tacattatac gaacggtaga tcccccgggc tgcagcggag tactgtcctc    120

cgagcggagt actgtcctcc gagcggagta ctgtcctccg agcggagtac tgtcctccga    180

gtctagaggg tatataatgg atcccatcgc gtctcagcct cactttgagc tcctccacac    240

gaattcgcta gccgccacca tggcctcctc cgaggacgtc atcaaggagt tcatgcgctt    300

caaggtgcgc atggagggct ccgtgaacgg ccacgagttc gagatcgagg gcgagggcga    360

gggccgcccc tacgagggca cccagaccgc caagctgaag gtgaccaagg gcggccccct    420

gcccttcgcc tgggacatcc tgtcccctca gttccagtac ggctccaagg cctacgtgaa    480

gcaccccgcc gacatccccg actacttgaa gctgtccttc cccgagggct tcaagtggga    540

gcgcgtgatg aacttcgagg acggcggcgt ggtgaccgtg acccaggact cctccctgca    600

ggacggcgag ttcatctaca aggtgaagct gcgcggcacc aacttcccct ccgacggccc    660

cgtaatgcag aagaagacca tgggctggga ggcctccacc gagcggatgt accccgagga    720

cggcgccctg aagggcgaga tcaagatgag gctgaagctg aaggacggcg gccactacga    780

cgccgaggtc aagaccacct acatggccaa gaagcccgtg cagctgcccg gcgcctacaa    840

gaccgacatc aagctggaca tcacctccca caacgaggac tacaccatcg tggaacagta    900

cgagcgcgcc gagggccgcc actccaccgg cgcctaatcc ggagcggaca ttgatgctcc    960

gggagatttg aagaaacact ttttaccgca ggttttaatg tttaagtttt aactctttaa   1020

ttgtttgttt ggttgatacg cggcggattg cgagtttgca tgcatgtgtg cgttcactgt   1080

ttgattttgc actttttgtg tgtgtgtata tgtgtgtgtt tgctgtgttt tattttgtgt   1140

gcactggtgt tgtgttttca cttggtaaca aacttgtaca caagccagca ggctcgctac   1200

aggcgcaacc gcactcaaaa acaaaccctt tcatgcttat ttggtaaata caatgtgtgt   1260

ttagtcctcc ttttaaatgt cagattttat ggtgttgtat ttaaacaaaa aattcaatgt   1320

taatatttag attttagtga ttttattatt gaaaacggct tgttttgtat aagtaacctt   1380

taaaaaaagt tttctccatt gcatttaaat tcagtttgac aaacataatc gccatatttt   1440

catgtcgctt gctaaaattc atgtactact ttcatcattt tatgtcagtg tgtgattttt   1500

gacttgtgat ggagtgaaaa atgtgaggaa aatataaaca ttttctctag acttaatacc   1560

gttcgtatag catacattat acgaagttat cgtacgaatc tctagaggat ccccgggtac   1620

cgagctcgaa ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca   1680

caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag   1740

tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt   1800

cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc   1860

gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg   1920

tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa   1980

agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg   2040

cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga   2100

ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg   2160

tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg   2220

gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc   2280

gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg   2340

gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca   2400

ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt   2460

ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag   2520

ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg   2580

gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc   2640

ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt   2700

tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt   2760

ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca   2820

gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg   2880

tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac   2940

cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg   3000

ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc   3060

gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta   3120

caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac   3180

gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc   3240

ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac   3300

tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact   3360

caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa   3420

tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt   3480

cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca   3540

ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa   3600

aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac   3660

tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg   3720

gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc   3780

gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata   3840

ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac   3900

acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag   3960

cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg ctggcttaac tatgcggcat   4020

cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tggatccccc gggctgcagc ggagtactgt   4080

cctccgagcg gagtactgtc ctccgagcgg agtactgtcc tccgagcgga gtactgtcct   4140

ccgagtctag agggtatata atggatccca tcgcgtctca gcctcacttt gagctcctcc   4200

acacgaattc gctagcttgt cgacgccacc atggcccgac cagagatgga aagcagagtg   4260

gacgaacata actctggcac gccgaacagc tgcaggatgg aggtgctgcg tcaggacgcc   4320

tggccaaatg gcagcatcat ccagccctgc catcgacgcc gaaccattgc cactcaaacc   4380

agcactctct ctgcaccact gccccacatc ccctcacatg atgccttcag cttggacagc   4440

gtccagcagc aggacagtct actcagggac aattcaggaa cagaacagga agtgtccagg   4500

cctcttcctc tgccagatct gctagcagac aaccagagct cctcagagga gtccacgtcc   4560

agcagcagct cgaccgctga ggacgacccc acactggagg agcaggctgt ggagagggtg   4620

gccgtacaac tgaggacaat cggggacgag atgaacgctg tcttccttca gaggaatgcc   4680

gtcccgcact ggcagaactg gagaggcctg taccgcgggc tcatggcgct ggtctcggac   4740

accatcaatg ccctctacca gcacggcctc agatgaggcg cgccaactcg agagcggaca   4800

ttgatgctcc gggagatttg aagaaacact ttttaccgca ggttttaatg tttaagtttt   4860

aactctttaa ttgtttgttt ggttgatacg cggcggattg cgagtttgca tgcatgtgtg   4920

cgttcactgt ttgattttgc actttttgtg tgtgtgtata tgtgtgtgtt tgctgtgttt   4980

tattttgtgt gcactggtgt tgtgttttca cttggtaaca aacttgtaca caagccagca   5040

tgcatgtgtg cgttcactgt ttgattttgc actttttgtg tgtgtgtata tgtgtgtgtt   5100

tgctgtgttt tattttgtgt gcactggtgt tgtgttttca cttggtaaca aacttgtaca   5160

caagccagca ggctcgctac aggcgcaacc gcactcaaaa acaaaccctt tcatgcttat   5220

ttggtaaata caatgtgtgt ttagtcctcc ttttaaatgt cagattttat ggtgttgtat   5280

ttaaacaaaa aattcaatgt taatatttag attttagtga ttttattatt gaaaacggct   5340

tgttttgtat aagtaacctt taaaaaaagt tttctccatt gcatttaaat tcagtttgac   5400

aaacataatc gccatatttt catgtcgctt gctaaaattc atgtactact ttcatcattt   5460

tatgtcagtg tgtgattttt gacttgtgat ggagtgaaaa atgtgaggaa aatataaaca   5520

ttttctctag acttaa                                                   5536

<210>  2

<211>  11556

<212>  DNA

<213>人工合成

<400>  2

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca     60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg    120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc    180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc    240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat    300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt    360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gcttatcgta cgtttggtca    420

agaaccagag gtgtaaagta cttgagtaat tttacttgat tactgtactt aagtattatt    480

tttggggatt tttactttac ttgagtacaa ttaaaaatca atacttttac ttttacttaa    540

ttacattttt ttagaaaaaa aagtactttt tactccttac aattttattt acagtcaaaa    600

agtacttatt ttttggagat cacttcattc tattttccct acgcgttggt cctttggaag    660

tgacgtcatg tcacatctat taccacaatg cacagcacct tgacctggaa attagggaaa    720

ttataacagt caatcagtgg aagaaaatgg aggaagtatg tgattcatca gcagctgcga    780

gcagcacagt ccaaaatcag ccacaggatc aagagcaccc gtggccgtat cttcgcagat    840

ctgatctaga ggatcataat cagccatacc acatttgtag aggttttact tgctttaaaa    900

aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt tgttgttctc    960

gccactgcat catccattct gtcactgata ccaggtacca ccttgctcag gatattgatc   1020

acaacactac gaacatcctc tcccggtttc tcttgtaccc cgtgtagttt cagtgtccac   1080

 

ctccaactgt accgtttgca cactcccact tcttctttta aagttgcgtt cacctgtttt   1140

agctcgagaa tctccgtgtt cacaacctga agggcttcct tgtgagtgga cacttcggct   1200

acaagctgat gcacggtcga ggacaagttt tcaatctgtt ttgcagtaac ggcagttgtt   1260

tggtcaattg acgcaatctt ttcgaacatc ttgtcatatt taccagcaag atcttgaatg   1320

gcggccaaaa ttgcagcgga tgtgttgtca ctatccatgc cttcacgttt tgactttttt   1380

gagctgggtt ttattggggt gtcgggcaac ggagttgcca ggacatcgct cattttgggc   1440

cgaacgttaa accattcgtt cgttgacttt tcccctgtcg ctaagtcttg ttcatcctcc   1500

gaaagtgcag gcttcagggt acattcactt tgatcaggat ccatccttga cttagatgac   1560

acgtgagtaa cttgtgcttg cttgtttttt cttctgccca taaactcaac tcgaagtaac   1620

gtcttaaata acagtcctaa atatatgttt atccataagt attaatttgt gcgttactgg   1680

ttgttttatg ctccaacctc aagttttcct gacgagactt cagcaacacc tcctatctct   1740

ccgccatctt ggccggcctt gagcggcagt tctgttggcg caaatgcctt gttgctgtca   1800

gaggagaatg gccagacagg ttccagctga tagaaaggca acagtaactc aaataaccac   1860

tcgttacaac caaggtctgc aaaagagcaa ctctgaacct gccaacacat tgaaccttga   1920

ggaagatgga ctacagcagc agacgaccag acggctactt ccagcaggat attgcaacat   1980

gtcataaagc gcgaatcatc tcagactggt ttcttaaaca tgacaatgag ttcagtgtac   2040

tcaaatggcc tccacagtct ccagatcctt atccaataga gcacctttgg gatttggtgg   2100

aacaggagaa tcacataatg aatgtgcagc cgacaaatct gcagcaactg cgtgatgcta   2160

tcatgtcaat atggagctaa atctcagagg aatatttcca gtaccttgtt gaatctatgt   2220

catgaagtat taaagcagtt ctgaaggcaa aagggggtcc aacctggtag tgggtaaggg   2280

tacctaataa agtggctggt gagtatgttg atttttgttt catttttcat tggatttcat   2340

tattttactt ttaataaagg gattggtgtt aaaataatgc tctttaagaa gcttacaatt   2400

atataatgat atagtttcta taaagcaaaa ctttaattat aaaattatta taattatagc   2460

attgcattac tatggatttc caaggtatgc tttataaaac acttattatt ttgcatttta   2520

catgcatttt tccagccaat aatataccag aagtcattta agacaggtac agtgtgaaat   2580

gcttgctcat gttgaaatat aataatcatt taaaagcagt gaactcatat ttatcgtcaa   2640

actgattaaa aatacaacac aagcagttag tttgtggttt acaaagggtt tatttcactt   2700

cataagggaa gttctaacac ccactgttag ttcctgtttg cattaatcgt ttcattttca   2760

tacattaaaa ctgtgaagtg atgtgtttta attgatgttt taatagcgcc atccagtggt   2820

aaaatgaagg cagtgctgtt acgagtgttt ggaatgtcaa tccacattgt tgtcatattt   2880

taatttcatt tctgtgtttt taattatcat tggctattta aagttgttat tatatcacaa   2940

agtgcatgat ggatatattt cacgcgatat gtattaatat tcataaaatc gccaggataa   3000

aaagagcaat acctactaat ataaactgta gtaatatctg catcttatta aacacattta   3060

aaccccaagc caacaaacca aatccacatt tattatttaa aatctgtctc tcagccaata   3120

aattataagt acagaccgac cgttgcattg tgtaattagt attcatgacg tcttcgtttt   3180

catcagcagg ctttataaac tcgaattaac cacacctatg tttttgaact tcaataataa   3240

tctaattaaa agttgataag gctattaaaa agggctattt aaagttgtta ttagctcaca   3300

gagtgcattg ttggatatat ttcatgcaat atttattaat attcataaaa tcagcaggct   3360

gttaagagca atacctactg atataaatca tagtaatctt cattgtaatc ctcaaacaaa   3420

caaactaaat tcaccttctt aattcaaact cggtctgtca gccaatcaat tgtaagtacg   3480

acctttgtat tgcgtaatta atattcatga agtccacgtt tttgtcagta gggtttttaa   3540

attttattaa ccacacatat atgttttttt atactttaat aattctattt aaaggtacta   3600

aggctttttt ttaaataagg ctatttaaaa gtttttttat tagccttatt aaacattcaa   3660

acttaaaaca aaccccactt cattcaaaat ctgtctgcca accaattgta agtacaggcc   3720

gaccgtctta ttgcctaatt aatattcatg aagtccacgt tttcatcagt aggatttata   3780

aattcgaatt taccacttct atgttttttt agactttaat aataattgta tttaacattc   3840

aactcggtat ttgactgatt ttgaatatca caaataccat ttaatttaat ttgattccaa   3900

aaaaataatc cacatgattt ccagccaatc agcagcctgg gtgtcagtga aacgttagtt   3960

ttgatatttg agtttgtcag tctgtttggg taataatttg cactttaaaa aaacgcgata   4020

tcgtactaca ggtaagtttt cagagtgtta attatctctc aatcgttcaa cctcatcaat   4080

ttagaacagt ttaaagttaa cgttatcaac aaactcataa catgcataac gttacaccac   4140

acgtttaact tgaacgatgt ttgtgtttag ctgtttgcaa gtcacccggt cgtgatatcg   4200

acacaatcct gtttcaatac cgttaattat catcatacat tctttgtttg cggagataat   4260

attagccctt gtgcacagtt caaattgacc acccgtttgt tatgttcctg gctgttttgt   4320

tctattgact tccatcgtaa ttaacttaaa aatttttatt gcaatgcctt gacactgtat   4380

aatccgtgcg ttcttgattg ttggtggttt tcgctgttga gaagaggtca aatctgtact   4440

gttgatcaga tcgtcaattg gtattaaccc tttagataga cctgtgcaaa aaataaataa   4500

aacgtttctg gcttttatat ggggttctat ggaggaaaac gggtaattat actgtgtgtg   4560

tatgtgtgtg cgcatgaatt tttgctatgt ttctaaaagc tgagtgaatc aagtgtgcaa   4620

tggtctctct caaatacact cacacttctc tctctctgac tcacaaacac aaaccagacc   4680

atgcccgcca gcctggtgaa aggggtggtt cttatttttc cagttattcg cctcattttt   4740

atttaattat gaggtttaga tgctgcattt tagtagcatt tcaagcacaa ttttttgctg   4800

gattagtttg tcggatggtc atcataatcc cattttttat gtgtcaaaaa catttctgaa   4860

atatttagaa taaagaaatg tgaatatgat acttattttt aaaatacaaa ttttctactt   4920

catatatcat tagaaaaata ggaatttgtt aatgttttaa ataaaaaaaa aaaaaactga   4980

gtattgattt cccagagatg ggttgcggct ggaaggacat ctgctccgta aaaatgtgct   5040

ggataaattg gcggctaatt ccgctgtggc ggcctcggat taataaaggg actaagccga   5100

caagaaaatg aatgaatgag aattaacatg actatttttt atacaaaaaa atactattgt   5160

catttattag gctaaataca aactggccag cacattcaac tttccttaat cagtatttgg   5220

gatgctgagt ttggtacggc atgacttcag tacaggaaca caggattctg cttggtctta   5280

aggccttttt taaagggttg ctttcacaat ttatgatggc atagcagtca aaataggaca   5340

aatgagtatg tattggacaa attatggact tttgtcagtg aggggtgggt ctttcaataa   5400

gacaccatat ccaaaatgca catcaaacta ggaaagaaac attgctgttg tactgcataa   5460

cagtggtttg ttttgtagac aattgaaaca aaatgttgct tatgggagct aatgctattg   5520

aagaaattgt gttttcaact gtataaacta ataatgaata gaatttatag aaaaggtact   5580

atactgggat atctttgtca gggtattatg agatggctta tatcataaga gtatttttgt   5640

catatccagt taatctactg ctgaaaataa cttttttttt tttcttcagg tttcaagagg   5700

tttcagaaga caagacgatt tatcttcctc tttcagtggt agttttttcc tacaaaaata   5760

tcattcggcg cgccgagaac cctggacctc aattcgccgc caccatgaaa ctgctctcat   5820

ccatcgagca agcctgcgac atttgtcggc ttaagaagct gaaatgctcc aaggaaaagc   5880

cgaaatgtgc caaatgcctg aagaacaatt gggaatgtcg ttactctccc aaaaccaagc   5940

gaagtccact cacaagggct catctgaccg aagtggagag caggctagag agactggaac   6000

aactcttttt gctcatcttc cctagagagg accttgacat gatcctcaag atggattctc   6060

tccaggatat taaagccctt ttgactggct tattcgtcca ggacaatgtg aacaaagacg   6120

ctgtgacaga ccgattggca agtgtcgaga ccgatatgcc tctgacactg agacagcaca   6180

gaatcagcgc tacttcctca agcgaagagt cttctaacaa gggacagaga cagctgactg   6240

tttcgagcag gtcgaccccg tccccggccg acgccctgga cgacggcgac ctggacatgc   6300

tgcctgctga tgctctcgat gatttcgatc tggatatgct cccggccgac gccctggacg   6360

actacgacct ggacatcctc ccgggtaact aagtaaggat ctctagagat ccggagcgga   6420

cattgatgct ccgggagatt tgaagaaaca ctttttaccg caggttttaa tgtttaagtt   6480

ttaactcttt aattgtttgt ttggttgata cgcggcggat tgcgagtttg catgcatgtg   6540

tgcgttcact gtttgatttt gcactttttg tgtgtgtgta tatgtgtgtg tttgctgtgt   6600

tttattttgt gtgcactggt gttgtgtttt cacttggtaa caaacttgta cacaagccag   6660

caggctcgct acaggcgcaa ccgcactcaa aaacaaaccc tttcatgctt atttggtaaa   6720

tacaatgtgt gtttagtcct ccttttaaat gtcagatttt atggtgttgt atttaaacaa   6780

aaaattcaat gttaatattt agattttagt gattttatta ttgaaaacgg cttgttttgt   6840

ataagtaacc tttaaaaaaa gttttctcca ttgcatttaa attcagtttg acaaacataa   6900

tcgccatatt ttcatgtcgc ttgctaaaat tcatgtacta ctttcatcat tttatgtcag   6960

tgtgtgattt ttgacttgtg atggagtgaa aaatgtgagg aaaatataaa cattttctct   7020

agacttaacg ctcgaggtac catcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga   7080

gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg   7140

cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg   7200

acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca   7260

tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc   7320

ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc   7380

tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc   7440

acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa   7500

tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag   7560

gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctggttta gtgaaccgtc agatcgcctg   7620

gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgactctaga ggatccaccg   7680

gtcgccacca tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc   7740

gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat   7800

gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc   7860

tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac   7920

cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc   7980

accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc   8040

gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc   8100

ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag   8160

cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg   8220

cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc   8280

gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat   8340

cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg   8400

tacaagtaaa gcggccgcga ctctagatca taatcagcca taccacattt gtagaggttt   8460

tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc ccctgaacct gaaacataaa atgaatgcaa   8520

ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca   8580

caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtagg cctgaattcg   8640

taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacgggcc   8700

catctggcct gtgtttcaga caccagggag tctctgctca cgtttcctgc tatttgcagc   8760

ctctctatca agactaatac acctcttccc gcatcggctg cctgtgagag gcttttcagc   8820

actgcaggat tgcttttcag ccccaaaaga gctaggcttg acactaacaa ttttgagaat   8880

cagcttctac tgaagttaaa tctgaggttt tacaactttg agtagcgtgt actggcatta   8940

gattgtctgt cttatagttt gataattaaa tacaaacagt tctaaagcag gataaaacct   9000

tgtatgcatt tcatttaatg ttttttgaga ttaaaagctt aaacaagaat ctctagtttt   9060

ctttcttgct tttactttta cttccttaat actcaagtac aattttaatg gagtactttt   9120

ttacttttac tcaagtaaga ttctagccag atacttttac ttttaattga gtaaaatttt   9180

ccctaagtac ttgtactttc acttgagtaa aatttttgag tactttttac acctctgtca   9240

agaactcctg gacaaacctc tgacctgtgt ggaacagagt ggatatgggt gtctgaacag   9300

atattcacgt cttttgcaga tctatgaatt cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt   9360

gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag   9420

cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt   9480

tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag   9540

gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg   9600

ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat   9660

caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta   9720

aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa   9780

atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc   9840

cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt   9900

ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca   9960

gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg  10020

accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat  10080

cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta  10140

cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct  10200

gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac  10260

aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa  10320

aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa  10380

actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt  10440

taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca  10500

gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca  10560

tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc  10620

ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa  10680

accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc  10740

agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca  10800

acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat  10860

tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag  10920

cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac  10980

tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt  11040

ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt  11100

gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc  11160

tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat  11220

ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca  11280

gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga  11340

cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg  11400

gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg  11460

ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga  11520

cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccct                            11556

Claims (3)

1.一种人工合成的载体，其特征在于载体p(UAS:mRFP,UAS:puma)，其序列为SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述载体的制备方法，其步骤是：

(1)构建UAS驱动mRFP表达的正筛选载体p(UAS:mRFP)：

分别以质粒pBK-kalTA4和PCS2-mRFP为模板，UAS-mRFP-F和UAS-mRFP-m-R，UAS-mRFP-m-F和UAS-mRFP-R为引物，运用连接PCR将UAS和mRFP全长编码序列连接成一条DNA链UAS:mRFP；扩增条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，62-58℃，每个循环降0.5℃，复性30秒，68℃延伸60秒，8个循环；95℃变性30秒，63℃复性30秒，68℃延伸60秒，15个循环；68℃延伸10分钟；4℃保存；再分别以UAS:mRFP和质粒kop-new-F-EGFP-UTRnos1为模板，loxp66-4UAS-F和mRFP-nos1-m-F，mRFP-nos1-m-R和loxp71-4UAS-R为引物，运用连接PCR将UAS:mRFP和nanos13’UTR连接成一条DNA链UAS:mRFP-UTRnos1；扩增条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，61-57℃，每个循环降0.5℃，复性30秒，68℃延伸90秒，8个循环；95℃变性30秒，62℃复性30秒，68℃延伸90秒，20个循环；68℃延伸10分钟；4℃保存；再将片段UAS:mRFP-UTRnos1连入pMD-18T载体中，获得载体p(UAS:mRFP)；

(2)构建UAS驱动mRFP表达串联UAS驱动促凋亡基因puma表达的正负筛选载体p(UAS:mRFP,UAS:puma)：

分别以质粒pBK-kalTA4和zPuma为模板，UAS-mRFP-F和UAS-puma-m-R，UAS-puma-m-F和UAS-mRFP-R为引物，运用连接PCR将UAS和puma全长编码序列连接成一条DNA链UAS:puma；扩增条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，61-57℃，每个循环降0.5℃；复性30秒，68℃延伸50秒，8个循环；95℃变性30秒，62℃复性30秒，68℃延伸50秒，15个循环；68℃延伸10分钟；4℃保存；再分别以UAS:puma和质粒kop-new-F-EGFP-UTRnos1为模板，4UAS-puma-F-NdeI和UASpuma-nos-m-R，UASpuma-nos-m-F和4UAS-puma-R-HindIII为引物，运用连接PCR将UAS:puma和nanos13’UTR连接成一条DNA链UAS:puma-UTRnos1表达框；扩增条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，61-57℃，每个循环降0.5℃，复性30秒，68℃延伸80秒，10个循环；95℃变性30秒，62℃复性30秒，68℃延伸80秒，20个循环；68°C延伸10分钟；4℃保存；再用NdeI和HindIII酶切连接的方法将UAS:puma-UTRnos1表达框连入载体p(UAS:mRFP)，获得p(UAS:mRFP,UAS:puma)载体；所述的引物如下：

UAS-mRFP-F：TATACGCGTGGCCGCTCTAGAACTAGTG；

UAS-mRFP-m-R：GGCGGCTAGCGAATTCGTGTGGAGGAGCTC；

UAS-mRFP-m-F：CACGAATTCGCTAGCCGCCACCATGGCCTCCTCCGAGGACG；

UAS-mRFP-R：ATATCCGGATTAGGCGCCGGTGGAGTGG；

loxp66-4UAS-F：ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAACGGTAGATCCCCCGGGCTGCAGCG；

mRFP-nos1-m-R：TCCGCTCCGGATTAGGCGCCGGTGGAGTGG；

mRFP-nos1-m-F：CGCCTAATCCGGAGCGGACATTGATGCTCCG；

loxp71-4UAS-R：CGTACGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAACGGTATTAAGTCTAGAGAAAATGT；

UAS-puma-m-R：GGTGGCGTCGACAAGCTAGCGAATTCGTGTGGAGGAGCTC；

UAS-puma-m-F：GCTAGCTTGTCGACGCCACCATGGCCCGACCAGAGATGG；

UAS-mRFP-R：ATATCCGGATTAGGCGCCGGTGGAGTGG；

4UAS-puma-F-NdeI：ATACATATGGATCCCCCGGGCTGCAGC；

UASpuma-nos-m-R：CCGCTCTCGAGTTGGCGCGCCTCATCTGAGGCCGTGCTGG；

UASpuma-nos-m-F：GATGAGGCGCGCCAACTCGAGAGCGGACATTGATGCTCCG；

4UAS-puma-R-HindIII：TTTAAGCTTGGGCCCAAACTAGTTGCGGCCGCAAACGCGTTAAGTCTAGAGAAAATGTT。

3.权利要求1所述载体在定向筛选斑马鱼同源重组PGC中的应用。