CN111455092B - 用于大丽轮枝菌定量pcr检测的内参菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于大丽轮枝菌定量PCR检测的内参菌株及其应用。本发明提供了一株用于对土壤中大丽轮枝菌qPCR定量检测结果进行校正的内参菌株，该内参菌株选用黑白轮枝菌菌株YJ3.3为出发菌株，在其基因组上插入多拷贝串联的人工构建内参DNA片段。本发明采用荧光定量PCR方法对土壤中大丽轮枝菌及定量加入的内参菌株进行检测，以内参菌株的回收效率对靶标大丽轮枝菌的回收效率进行校正。通过对12份不同地区不同质地的土壤样品中大丽轮枝菌及内参菌株回收效率的测定发现使用内参菌株校正可以将大丽轮枝菌回收效率提高4.14‑14.10倍，更接近于理论回收效率，有效提高了大丽轮枝菌qPCR定量检测的准确性。

Description

用于大丽轮枝菌定量PCR检测的内参菌株及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于大丽轮枝菌定量PCR检测的内参菌株及其应用。

背景技术

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)是一种重要的植物病原真菌，寄主范围广泛，可以引起14个科植物的黄萎病(Verticillium wilt)，包括棉花、马铃薯、向日葵、西红柿、辣椒、草莓、生菜、大白菜、菠菜、甘蓝等重要作物。被侵染作物的叶片变黄枯萎，维管束变为浅褐色至黄褐色，严重影响产量和品质。黄萎病为典型的土传病害，土壤中越冬的病原菌是该病害主要的初侵染源，病害发生程度与土壤中病原菌的数量显著正相关。

大丽轮枝菌的检测已有很多方法，如平板检测法、生物测定法、血清学检测法、常规PCR检测和定量PCR(qPCR)检测技术等。qPCR技术因其检测快速，灵敏度高、特异性强、可定量等特点成为近些年最重要的检测技术。

我国不同地区土壤的土壤类型、有机质含量和pH值差异很大，同时土壤中富含酚类、多糖、腐植酸、重金属离子等PCR抑制因子，这些因素均会影响土壤中大丽轮枝菌DNA的提取和后续的qPCR检测。但是目前已报道的土壤大丽轮枝菌qPCR定量检测方法均未对包括样品预处理、DNA提取纯化以及qPCR检测在内的整个样品检测过程进行有效的校正。因此，建立合适的内参用于校正检测结果，消除各种因素造成的病原菌回收效率偏差，对于土壤大丽轮枝菌的准确检测十分重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于大丽轮枝菌定量PCR检测的内参菌株及其应用。

第一方面，本发明保护特异DNA片段，如SEQ ID No.1自5’端第51-195位所示。

所述特异DNA片段由区段A、区段B、区段C和区段D组成。所述区段A如SEQ No.1自5’端第51至69位所示；所述区段B如SEQ No.1自5’端第70至85位所示；所述区段C如SEQ No.1自5’端第86至176位所示；所述区段D如SEQ No.1自5’端第177至195位所示。

第二方面，本发明保护重组菌，是将N个拷贝的前文所述特异DNA片段插入出发菌基因组得到的；所述N为1～150之间的自然数。

示例性地，所述N＝24。

示例性地，所述出发菌为黑白轮枝菌，更具体可为黑白轮枝菌菌株YJ3.3。

所述重组菌的制备是通过将含有质粒载体的农杆菌转化出发菌实现的。

所述质粒载体中含有24个拷贝特异DNA片段；所述24个拷贝特异DNA片段位于所述质粒载体的T-DNA上。

示例性地，所述质粒载体为SEQ ID No.3所示的环状质粒。SEQ ID No.3中，自5’端第1至10890位为T-DNA，自5’端第579至3533位及第5843至8797位为两个12拷贝DNA片段。

示例性地，所述农杆菌为农杆菌AGL1。

第三方面，本发明保护产品，包括前文所述的重组菌和引物探针组合；

所述引物探针组合包括引物对、探针甲和探针乙；

所述引物对由上游引物F和下游引物R组成；

所述上游引物F为SEQ ID No.1自5’端第51至69位所示的单链DNA分子；

所述下游引物R为与SEQ ID No.1自5’端第177至195位所示的核苷酸反向互补的单链DNA分子；

所述探针甲为与SEQ ID No.4自5’端第525-550位所示的核苷酸反向互补的单链DNA分子；

所述探针乙为SEQ ID No.1自5’端第79至102位所示的单链DNA分子；

所述探针甲和所述探针乙一端采用荧光基团标记，一端采用淬灭基团标记。

进一步地，所述探针甲和所述探针乙的5’端采用FAM标记，3’端采用TAMRA标记。

所述产品的用途为如下(a1)-(a5)中任一种：

(a1)检测或辅助检测大丽轮枝菌；

(a2)大丽轮枝菌定量检测；

(a3)提高大丽轮枝菌定量检测的准确性；

(a4)辅助判断大丽轮枝菌检测中的假阴性结果；

(a5)校正大丽轮枝菌定量检测结果。

第四方面，本发明保护前文所述的特异DNA片段或重组菌或产品在如下(a1)-(a5)任一种中的应用：

(a1)检测或辅助检测大丽轮枝菌；

(a2)大丽轮枝菌定量检测；

(a3)提高大丽轮枝菌定量检测的准确性；

(a4)辅助判断大丽轮枝菌检测中的假阴性结果；

(a5)校正大丽轮枝菌定量检测结果。

第五方面，本发明保护前文所述的特异DNA片段或重组菌或产品在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(a1)-(a5)中的任一种：

(a1)检测或辅助检测大丽轮枝菌；

(a2)大丽轮枝菌定量检测；

(a3)提高大丽轮枝菌定量检测的准确性；

(a4)辅助判断大丽轮枝菌检测中的假阴性结果；

(a5)校正大丽轮枝菌定量检测结果。

第六方面，本发明保护试剂盒，包括前文所述的特异DNA片段或重组菌或产品；所述试剂盒的用途为如下(a1)-(a5)中的任一种：

(a1)检测或辅助检测大丽轮枝菌；

(a2)大丽轮枝菌定量检测；

(a3)提高大丽轮枝菌定量检测的准确性；

(a4)辅助判断大丽轮枝菌检测中的假阴性结果；

(a5)校正大丽轮枝菌定量检测结果。

第七方面，本发明保护一种大丽轮枝菌定量检测方法或对大丽轮枝菌定量检测结果进行校正的方法，包括如下步骤：

(1)向待测样本中加入已知量的前文所述重组菌的分生孢子，然后提取样本总DNA或微生物DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA样本为模板，分别采用引物探针组甲和引物探针组乙进行qPCR检测；所述引物探针组甲由前文所述引物对和探针甲组成；所述引物探针组乙由前文所述的引物对和探针乙组成；(3)将步骤(2)中采用引物探针组甲进行qPCR检测得到的Ct值代入公式1，得到检测值，将步骤(2)中采用引物探针组乙进行qPCR检测得到的Ct值代入公式2，得到内参值；(4)根据公式：回收效率＝内参值/重组菌的实际添加量，计算得到回收效率，然后根据公式：校正后含量＝检测值/回收效率，计算得到校正后大丽轮枝菌的含量；

公式1是根据采用不同已知浓度的大丽轮枝菌靶标片段为模板，按照步骤(2)进行qPCR检测后以Ct值和模板含量得到的标准曲线公式以及步骤(1)和(2)整个过程中的数量关系得到用来根据Ct值x计算得到检测值y的公式；所述大丽轮枝菌靶标片段为前文所述引物对在大丽轮枝菌基因组中的靶序列；

公式2是根据采用不同已知浓度的内参片段为模板，按照步骤(2)进行qPCR检测后以Ct值和模板含量得到的标准曲线公式以及步骤(1)和(2)整个过程中的数量关系得到用来根据Ct值x计算得到内参值y的公式；所述内参片段为SEQ ID No.1自5’端第51至195位所示的DNA片段。

所述公式1具体可为：y＝(a×10^{x-36.14/-3.39})/(b×c)；

公式1中，y为每g土壤中大丽轮枝菌含量(单位为基因组拷贝数/g土)，x为Ct值，a为单次提取DNA的最终体积(μL)，b为大丽轮枝菌单位基因组中靶标序列的拷贝数，c为单次提取的土壤质量(g)。

所述公式2具体可为：y＝(a×10^{x-35.60/-3.35})/(24×c)；

公式2中，y为每g土壤中内参菌株含量(单位为基因组拷贝数/g土)，x为Ct值，a为单次提取DNA的最终体积(μL)，24为内参菌株单位基因组中内参片段的拷贝数，c为单次提取的土壤质量(g)。

所述qPCR检测的反应体系具体可为：TaKaRa Taq^TM(5U/μL)0.5μL，10×PCR Buffer(Mg²⁺free)2.5μL，25mM MgCl₂3μL，dNTP Mixture(各2.5mM)2μL，0.1％BSA 5μL，两条引物各1μL，探针1μL，ddH₂O 4μL，DNA模板5μL。

引物均以引物溶液的形式加至反应体系中，引物在引物溶液中的浓度为10μM。探针以探针溶液的形式加至反应体系中，探针在探针溶液中的浓度为10μM。

所述qPCR检测的反应程序具体可为：95℃预变性5min，1个循环，之后进行45个循环，每个循环包括95℃30s、58℃30s。

所述步骤(1)中，重组菌的分生孢子加入量为4×10³-4×10⁴个分生孢子/克干土。

所述待测样本具体可为土壤。

所述待测样本还可为植物组织。

本发明提供了一株用于对土壤中大丽轮枝菌qPCR定量检测结果进行校正的内参菌株，该内参菌株选用黑白轮枝菌菌株YJ3.3为出发菌株，在其基因组上插入多拷贝串联的人工构建内参DNA片段。本发明采用荧光定量PCR方法对土壤中大丽轮枝菌及定量加入的内参菌株进行检测，以内参菌株的回收效率(Recovery efficiency)对靶标大丽轮枝菌的回收效率进行校正。针对该内参菌株，设计了内参菌株特异的TaqMan探针用于区分内参菌株与大丽轮枝菌，同时通过使用内参特异性探针以及与大丽轮枝菌相同的qPCR检测引物来保证内参菌株qPCR检测体系在自然DNA背景中的特异性，避免土壤中其他生物DNA序列对检测的影响。此外在检测内参菌株和大丽轮枝菌时，除Taqman探针之外的反应体系以及反应条件完全一致，最大限度地减少了两检测体系间的差异。以不同浓度内参DNA片段为模板进行检测，证明该内参菌株的qPCR检测体系灵敏度可达到50个拷贝的内参DNA片段。通过对12份不同地区不同质地的土壤样品中大丽轮枝菌及内参菌株回收效率的测定发现使用内参菌株校正可以将大丽轮枝菌回收效率提高4.14-14.10倍，更接近于理论回收效率，有效提高了大丽轮枝菌qPCR定量检测的准确性。同时该内参菌株也可用于判断大丽轮枝菌qPCR检测中的假阴性结果，即在定量加入了内参菌株的试验中未检测到内参菌株，则表明该次检测因为试剂、操作等原因导致检测失败，需重新检测。

附图说明

图1为内参DNA片段结构示意图。

图2为4拷贝内参DNA片段结构示意图。

图3为内参菌株southern blot验证结果。

图4为大丽轮枝菌及内参菌株qPCR检测标准曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

PDA培养基：将200g马铃薯切块煮烂，四层纱布过滤，加入葡萄糖20g，加水至1L，搅拌均匀，分装至三角瓶中，琼脂按照15g/L添加，115℃灭菌30min备用。

PDB培养基：将200g马铃薯切块煮烂，四层纱布过滤，加入葡萄糖20g，加水至1L，搅拌均匀，分装至三角瓶中，115℃灭菌30min备用。

潮霉素B溶液：用ddH₂O溶解潮霉素B固体，母液浓度为50mg/mL，过滤灭菌后保存于-20℃。

特美汀溶液：用ddH₂O溶解特美汀固体，母液浓度为200mg/mL，过滤灭菌后保存于-20℃。

LB培养基：称量10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，加入约800mL水，充分搅拌溶解，定容至1L，调整pH至7.2，分装至试管，制作固体培养基时，按照15g/L加入琼脂，分装至三角瓶中，121℃灭菌20min备用。

IM培养基：K₂HPO₄ 0.1472g/L，MgSO₄·7H₂O 0.6g/L，NaCl 0.3g/L，CaCl₂.2H₂O0.01g/L，FeSO₄ 0.001g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.0005g/L，CuSO₄·5H₂O 0.0005g/L，H₃BO₃0.0005g/L，MnSO₄·H₂O0.0005g/L，NH₄NO₃ 0.5g/L，甘油0.5％，MES(pH＝5.5)0.04M，葡萄糖2g/L，乙酰丁香酮0.2mM。

CM培养基：K₂HPO₄ 0.1472g/L，MgSO₄·7H₂O 0.6g/L，NaCl 0.3g/L，CaCl₂.2H₂O0.01g/L，FeSO₄ 0.001g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.0005g/L，CuSO₄·5H₂O 0.0005g/L，H₃BO₃0.0005g/L，MnSO₄·H₂O0.0005g/L，NH₄NO₃ 0.5g/L，甘油0.5％，MES(pH＝5.5)0.04M，葡萄糖1g/L，乙酰丁香酮0.2mM，琼脂15g/L。

变性液：0.5M NaOH，1.5M NaCl。

中和液：0.5M Tris-HCl(pH7.5)，3M NaCl。

20×SSC：3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，pH＝7.0。

Washing buffer：0.1M马来酸，0.15M NaCl，0.3％吐温20，pH7.5。

Detection buffer：0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，pH9.5。

Color substrate solution：加入200μL NBT/BCIP stock solution(DIG HighPrime DNALabeling and Detection Starter Kit I(罗氏))至10mL Detection buffer中，混合均匀。

实施例1、用于对大丽轮枝菌qPCR定量检测结果进行校正的内参菌株的构建

一、内参DNA片段的构建

经过筛选，选择针对已报道的大丽轮枝菌qPCR定量检测的特异性引物及Taqman探针设计用于构建内参菌株的内参DNA片段，特异性引物及Taqman探针均记载于文献：Bilodeau,G.J.,Koike,S.T.,Uribe,P.,and Martin,F.N.(2012).Development of AnAssay for Rapid Detection and Quantification of Verticillium dahliae inSoil.Phytopathology 102,331-343.；具体信息如下：

引物Vd-F929-947:5’-CGTTTCCCGTTACTCTTCT-3’；

引物Vd-R1076-1094:5’-GGATTTCGGCCCAGAAACT-3’；

Taqman探针Vdhrc FAM：5’-CACCGCAAGCAGACTCTTGAAAGCCA-3’。

设计的内参DNA片段如SEQ ID No.1所示，其结构示意图见图1。

所述内参DNA片段共由6个区段组成(在图1中用数字1-6标出)。其中，区段2～区段5(SEQ ID No.1自5’端第51至195位)为内参扩增子区段，区段1(SEQ No.1自5’端第1至50位)和区段6(SEQ No.1自5’端第196至245位)为侧翼序列。

在内参扩增子区段(区段2～区段5)中，区段2(SEQ No.1自5’端第51至69位)和区段5(SEQ No.1自5’端第177至195位)分别为引物Vd-F929-947和引物Vd-R1076-1094在大丽轮枝菌IGS区的结合区段；将引物Vd-F929-947和引物Vd-R1076-1094在大丽轮枝菌IGS区的靶序列中引物结合区段之间的序列替换为区段3和区段4(目的是保证内参的特异性以及与原大丽轮枝菌qPCR检测体系扩增效率的相似性)，区段3(SEQ No.1自5’端第70至85位)为部分绿色荧光蛋白基因序列，区段4(SEQ No.1自5’端第86至176位)为部分含有一SpeI酶切位点的卡那霉素抗性基因序列。

所述侧翼序列为来自绿色荧光蛋白的部分序列，侧翼序列的功能是保持不同拷贝内参扩增子其引物结合序列之间的距离，避免内参DNA多拷贝串联之后不同拷贝之间引物结合序列距离过近导致对qPCR过程造成影响。

在将内参DNA片段用于对大丽轮枝菌qPCR定量检测结果进行校正时，为了保证内参DNA片段qPCR检测体系对于内参DNA片段具有足够的特异性，可针对区段3和区段4交界处设计内参Taqman探针。

二、4拷贝串联的内参DNA片段的构建

人工合成4拷贝的内参DNA片段，如SEQ ID No.2所示，其结构示意图见图2。

SEQ ID No.2中，自5’端第1至240位为第一拷贝，第247至491位为第二拷贝，第498至742位为第三拷贝，第749至981位为第四拷贝。其中，第二拷贝和第三拷贝序列与SEQ IDNo.1完全相同，第一拷贝的前侧翼序列(SEQ ID No.2自5’端第1至45位)和第四拷贝的后侧翼序列(SEQ ID No.2自5’端第944至981位)进行了修改，为了便于后续的PCR。

三、多拷贝内参DNA基本片段及重组质粒载体的构建

以步骤二制备的4拷贝的内参DNA片段为模板，采用引物对IC-F4和IC-R4进行PCR扩增后，先将4拷贝内参DNA片段克隆至载体pMD18-BglII(SEQ ID No.6)，之后通过酶切连接将4拷贝内参DNA片段先后两次克隆至已连接在载体上的4拷贝内参DNA片段上，形成了12拷贝的内参片段。

IC-F4:5’-AATAGATCTGCTCGGTATCCGGTGATCCACTAGA-3’

IC-R4:5’-AGTCGACTTGGATCCTAGCTTGTATGCCAGCAGC-3’。

将2个12拷贝内参串联片段先后克隆至质粒载体pGKO2-Hyg上，得到含有24个内参DNA片段的重组质粒载体pGKO2-Hyg-24Copies(SEQ ID No.3所示的环状质粒)。SEQ IDNo.3中，自5’端第1至10890位为重组质粒载体pGKO2-Hyg-24Copies上的T-DNA部分，自5’端第579至3533位及第5843至8797位为两个12拷贝内参串联片段。

四、内参菌株的构建

1、将100μL农杆菌感受态细胞AGL1(可自上海唯地生物技术有限公司购得)置于冰上，加入10μL步骤三制备的重组质粒载体pGKO2-Hyg-24Copies，混匀，冰浴30分钟。将加入质粒的感受态细胞置于液氮中1分钟，取出；于37℃水浴锅热激90秒，取出冰浴2分钟；加入500μL LB液体培养基，28℃，150rpm摇培3小时；将菌液涂布于含有50μg/mL卡那霉素和40μg/mL利福平的LB固体平板上，28℃培养至有菌落形成。

2、挑选3-4个菌落，分别接种于5mL含有50μg/mL卡那霉素和40μg/mL利福平的LB液体培养基中，28℃，150rpm摇培约30小时。提取质粒，并分别用PstI/SacI和KpnI/SalI双酶切验证质粒。正确菌株其质粒的PstI/SacI双酶切结果为一条约3kb的条带与一条10kb以上的条带，KpnI/SalI双酶切结果为一条约3.8kb的条带与一条10kb以上的条带。将验证正确的菌株AGL1-24Co用于后续实验。

3、将黑白轮枝菌菌株YJ3.3在含有50μg/mL卡那霉素的PDA平板上活化，25℃培养10-12天。取少量活化好的菌组织，转移至含有50μg/mL卡那霉素的PDB液体培养液中，25℃，150rpm摇培4-5天，用灭菌的四层擦镜纸过滤收集步骤3培养得到的黑白轮枝菌菌株YJ3.3分生孢子，并用血球计数板计数，将浓度调整至1×10⁶个孢子/mL。

黑白轮枝菌菌株YJ3.3记载于文献：申建芳.东北、华北马铃薯黄萎病病原菌分离鉴定和遗传多样性及生物防治的初步研究[D].内蒙古农业大学，2017.；公众可以从中国农业大学获得。

4、将步骤2验证正确的菌株AGL1-24Co单菌落接种至含有50μg/mL卡那霉素和40μg/mL利福平的LB液体培养基中，28℃，150rpm摇培24h。

5、将步骤4培养的菌株AGL1-24Co转接于IM培养液中，调整培养液OD₆₀₀＝0.15～0.18，28℃，150rpm摇培4-5小时。

6、准备CM培养基平板，并分别在每个平板上放置1张0.22μm的滤膜；将步骤5摇培4-5小时后的土壤杆菌(OD₆₀₀≈0.8-1.0)与步骤3调整浓度后的大丽轮枝菌孢子液按照体积比1：1混合，取200μL涂布于贴有膜的CM固体培养基上，注意不要涂布到膜外部，待液体蒸发完全之后于25℃正置培养70小时。

7、完成步骤6后，将涂布有黑白轮枝菌菌株YJ3.3分生孢子和土壤杆菌的膜在超净台中略吹干后，取灭菌的剪刀和镊子，将膜剪成条状(约1-2mm宽)，贴于含有20μg/mL潮霉素B和400μg/mL特美汀的PDA培养基平板。平板至于25℃培养，7-10天后可见转化子。

8、采用southern blot对转化子进行验证，具体步骤如下：

(1)将转化子接种至含有20μg/mL潮霉素B和50μg/mL卡那霉素的PDB培养基中，25℃，80rpm培养7-10天，取出其中菌组织，用吸水纸初步干燥；加入液氮充分研磨，CTAB法提取转化子基因组DNA。

(2)采用重组质粒pMD18-ISPC(SEQ ID No.5)为模板，采用引物IC copies-F和引物IC copies-R组成的引物对进行PCR扩增(扩增序列为SEQ ID No.1自5’端第71至第173位)，回收PCR扩增产物。

IC copies-F:5’-CAACCATTACCTGTCTGA-3’；

IC copies-R:5’-GAAGAACTCGTCAAGAAG-3’。

(3)取步骤(2)回收的DNA片段1μg，用ddH₂O调整体积至16μL；将DNA片段进行沸水浴10分钟，之后迅速冰浴使之变性；将DIG High Prime DNA Labeling and DetectionStarter Kit I(罗氏)中的DIG-High Prime充分混匀，取4μL加至上述DNA片段中，使之总体积为20μL，充分混匀，瞬离；于37℃静置孵育20小时进行探针标记；于65℃孵育10分钟，终止反应，完成探针标记。

(4)用限制性内切酶EcoRI和BamHI对30μg转化子基因组DNA进行消化，消化完毕后以0.8％琼脂糖凝胶进行电泳分离；将电泳完毕的凝胶至于合适的容器中，加入0.25M盐酸，震荡脱嘌呤20分钟；去掉0.25M盐酸，加入变性液，震荡变性30分钟；去掉变性液，加入中和液，震荡中和30分钟；清洗凝胶，采用盐桥毛细管法转膜20h至尼龙膜；采用2×SSC简短清洗，80℃烘烤2小时进行交联。

(5)取5-10mL DIG Easy Hyb buffer，加热到42℃，膜预杂交30min；准备一定量步骤(3)中标记好的探针，沸水浴10分钟，然后迅速插入冰中冷却，将探针变性；将膜置于加入变性探针的15mL DIG Easy Hyb buffer中(探针浓度为25ng/ml)，42℃杂交过夜；膜于20mL2×SSC+0.1％SDS溶液中，15-25℃清洗两次，每次5min；膜于20mL 0.5×SSC+0.1％SDS溶液中，55℃清洗两次，每次15min；于washing buffer中15-25℃清洗1-5min；于30mLblocking solution中15-25℃封闭30min；于20mL antibody solution中15-25℃结合30min；于30mL washing buffer中15-25℃清洗两次，每次15min；15-25℃浸泡在detectionbuffer中2-5min；置于黑暗处在膜上滴加5-10mL color substrate solution，黑暗处显色，显色完毕后，蒸馏水清洗，终止反应。

结果如图3所示。图3中，泳道pGKO2-Hyg-12Co为包含有12拷贝内参片段的重组质粒载体，作为阳性对照；其余泳道为随机选取的转化子YJ3.3-6和YJ3.3-7，分别使用BamHI和EcoRI对其基因组进行消化后进行southern blot验证的结果，所使用探针序列为SEQ IDNo.1自5’端第71至第173位；southern blot结果表明转化子YJ3.3-6和YJ3.3-7基因组上均插入1拷贝T-DNA，即插入24拷贝内参DNA片段。将鉴定正确的转化子(内参菌株)用于后续实验。

实施例2、标准曲线的构建

一、标准质粒的构建

构建重组载体pMD18-VD与pMD18-ISPC作为模板构建标准曲线。使用标准质粒作为模板可以准确定量模板浓度，且于低温保存时更为稳定。

重组载体pMD18-VD为SEQ ID No.4所示的环状质粒。

重组载体pMD18-VD是将大丽轮枝菌特异性靶标序列(SEQ ID No.4自5’端第427至586位)克隆至载体pMD^TM18-T得到的重组载体。

重组载体pMD18-ISPC为SEQ ID No.5所示的环状质粒。

重组载体pMD18-ISPC是将内参片段扩增子序列(SEQ ID No.5自5’端第427至571位)克隆至载体pMD^TM18-T得到的重组载体。

pMD^TM18-T来自pMD^TM18-T Vector Cloning Kit，货号为6011，购自宝日医生物技术(北京)有限公司。

二、模板的制备

将步骤一制备的两个标准质粒使用EcoRI进行酶切，经电泳和凝胶回收得到线性化质粒，计算得到其拷贝数浓度，用ddH₂O梯度稀释成浓度分别为1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹、1×10⁰拷贝/μL的稀释液，将上述稀释液置于-20℃冰箱中保存备用。

三、荧光定量PCR反应

1、荧光定量PCR使用的引物和靶标荧光探针为文献：(Bilodeau,G.J.,Koike,S.T.,Uribe,P.,and Martin,F.N.(2012).Development of An Assay for RapidDetection and Quantification of Verticillium dahliae in Soil.Phytopathology102,331-343.)中记载的，具体信息如下：

引物Vd-F929-947:5’-CGTTTCCCGTTACTCTTCT-3’；

引物Vd-R1076-1094:5’-GGATTTCGGCCCAGAAACT-3’；

靶标荧光探针Vdhrc FAM：5’-CACCGCAAGCAGACTCTTGAAAGCCA-3’。

探针5’端采用FAM标记，3’端采用TAMRA标记。

2、内参特异性探针的筛选

根据内参片段设计若干探针，从中筛选灵敏度最高的，为内参荧光探针ISPC-P，具体信息如下：

探针ISPC-P：5’-ACCTGTCTGACCGCTTCCTCGTGC-3’(SEQ ID No.1自5’端第79至102位)；

探针5’端采用FAM标记，3’端采用TAMRA标记。

2、分别以上述重组载体pMD18-VD各浓度稀释液和重组载体pMD18-ISPC各浓度稀释液(1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹、1×10⁰拷贝/μl)为模板，采用特异引物对Vd-F929-947/Vd-R1076-1094和靶标荧光探针Vdhrc FAM(重组载体pMD18-VD)或内参荧光探针ISPC-P(重组载体pMD18-ISPC)进行实时荧光定量PCR。

反应体系(25μL)：TaKaRa Taq^TM(5U/μL)0.5μL，10×PCR Buffer(Mg²⁺free)2.5μL，25mM MgCl₂ 3μL，dNTP Mixture(各2.5mM)2μL，0.1％BSA 5μL，两条特异性引物各1μL，靶标荧光探针Vdhrc FAM或内参荧光探针ISPC-P 1μL，ddH₂O 4μL，DNA模板5μL。

其中，TaKaRa Taq^TM、10×PCR Buffer(Mg²⁺free)、25mM MgCl₂、dNTP Mixture(各2.5mM)来自同一试剂盒，名称为TaKaRa Taq^TM(with Mg²⁺free Buffer)，货号为R001AM；BSA产品名称为Bovine Serum Albumin(BSA)，货号为2320；以上试剂均购自宝日医生物技术(北京)有限公司。

特异性引物均以引物溶液的形式加至反应体系中，引物在引物溶液中的浓度为10μM。探针以探针溶液的形式加至反应体系中，探针在探针溶液中的浓度为10μM。

反应程序：95℃预变性5min，1个循环，之后进行45个循环，每个循环包括95℃30s、58℃ 30s。

qPCR检测体系标准曲线如图4所示。图4A为不同浓度大丽轮枝菌特异性靶标片段(重组载体pMD18-VD)与Ct值的标准曲线，图4B为不同浓度内参DNA片段(重组载体pMD18-ISPC)与Ct值的标准曲线。

大丽轮枝菌特异性靶标片段含量的标准曲线公式为：y＝-3.39x+36.14；

内参DNA片段含量的标准曲线公式为：y＝-3.35x+35.60。

公式中，y为Ct值，x为每微升模板中DNA分子拷贝数的对数值(以10为底)。

检测结果显示，对于大丽轮枝菌及内参菌株的qPCR检测体系，其检测灵敏度均为50个拷贝靶标片段(即1×10¹拷贝/μL的浓度梯度5μL)。

以上标准曲线可应用于实际的土壤检测，在实际应用中，每g土壤中大丽轮枝菌含量Calculated amount_path计算公式为：

公式1：y＝(a×10^{x-36.14/-3.39})/(b×c)

公式中，y为每g土壤中大丽轮枝菌含量(单位为基因组拷贝数/g土)，x为Ct值，a为单次提取DNA的最终体积(μL)，b为大丽轮枝菌单位基因组中靶标序列的拷贝数，c为单次提取的土壤质量(g)。

每g土壤中内参菌株含量Calculated amount_ISPC计算公式为：

公式2：y＝(a×10^{x-35.60/-3.35})/(24×c)

公式中，y为每g土壤中内参菌株含量(单位为基因组拷贝数/g土)，x为Ct值，a为单次提取DNA的最终体积(μL)，24为内参菌株单位基因组中内参片段的拷贝数，c为单次提取的土壤质量(g)。

四、对比荧光定量PCR反应

采用探针ISPC-P1：5’-ACCATTACCTGTCTGACCGCTTCC-3’(SEQ ID No.1自5’端第73至96位)替代步骤三中的探针ISPC-P，其他不变，按照步骤三进行检测。检测结果显示，采用重组载体pMD18-ISPC作为模板，反应灵敏度仅为500个拷贝，比步骤三中的灵敏度降低10倍，故本发明设计的探针ISPC-P效果最佳。

实施例3、大丽轮枝菌及内参菌株回收效率测定及校正

一、土壤样品的采集和前处理

在呼伦贝尔、沈阳、昆明、南昌、重庆、成都、长沙、上海、南宁、邢台、哈尔滨、乌兰察布12个地区的试验田进行采样，所用土壤取样器内径为2cm，取样深度为0-20cm，每个实验田根据其大小采用“W”形取样方法进行随机取样，样品覆盖整个实验田。采集到的土壤样品置于室温下避光自然风干，将风干后的土壤样品采用九阳料理机(JYL-C020E)进行破碎，处理后的土壤过20目筛，去除塑料薄膜等杂质。土壤性质测定由中化(烟台)作物营养有限公司完成。

二、大丽轮枝菌及内参菌株分生孢子的准备

将大丽轮枝菌WX-1活化至含有50μg/mL卡那霉素的PDA平板上，将内参菌株活化至含有20μg/mL潮霉素B和50μg/mL卡那霉素的PDA平板上，25℃培养7天。然后将大丽轮枝菌WX-1接种至含有50μg/mL卡那霉素的PDB液体培养基中，内参菌株接种至含有20μg/mL潮霉素B和50μg/mL卡那霉素的PDB液体培养基中，25℃,150rpm摇培7天，使用四层擦镜纸过滤得到孢子悬浮液，在血球计数板下计数得到孢子数浓度。

大丽轮枝菌WX-1记载于文献：王彦.棉花黄萎菌致病力分化测定及其致萎毒素研究[D].河北农业大学,2010.；公众可以从中国农业大学获得。

三、土壤中大丽轮枝菌分生孢子回收效率测定与校正

人工定量添加大丽轮枝菌WX-1与内参菌株分生孢子至步骤一的各土壤样品中，使得两种分生孢子在同一土壤样品中的含量均为10⁵个分生孢子/克干土，采用

Kit(QIAGEN)提取土壤DNA，通过实施例2中的荧光定量PCR方法获得Ct值，通过实施例2中构建的标准曲线和公式1、公式2计算得到每克土中大丽轮枝菌及内参菌株基因组的含量Calculated amount_path和Calculated amount_ISPC。根据公式RE_path＝Calculated amount_path/Added amount_path和RE_ISPC＝Calculated amount_ISPC/Addedamount_ISPC分别计算得到大丽轮枝菌回收效率RE_path，内参菌株回收效率RE_ISPC，其中，Addedamount_path和Added amount_ISPC为两菌株的实际添加量。根据公式计算得到校正后大丽轮枝菌回收效率NRE_path＝RE_path/RE_ISPC。结果如表1所示。

结果显示，使用内参菌株进行校正可以将大丽轮枝菌回收效率提高4.14-14.10倍，更接近于理论回收效率(100％)，有效提高了大丽轮枝菌qPCR定量检测的准确性。

表1

实际土壤中大丽轮枝菌含量检测方法如下：

1、采集土壤样品，置于室温下避光自然风干并将风干后的土壤样品进行破碎处理，然后过20目筛，收集过筛后的土壤样品。

2、完成步骤1后，人工定量添加内参菌株分生孢子至土壤样品中，使得内参菌株分生孢子在土壤样品中的含量为4×10³-4×10⁴个分生孢子/克干土。

内参菌株分生孢子制备方法：将内参菌株接种至含有20μg/mL潮霉素B和50μg/mL卡那霉素的PDB液体培养基中，25℃，150rpm摇培7天，使用四层擦镜纸过滤得到孢子悬浮液，在血球计数板下计数得到孢子数浓度。

3、完成步骤2后，提取土壤样品的土壤微生物DNA(具体可采用

Kit(QIAGEN)进行提取)，以所述土壤微生物DNA为模板，采用特异性引物对Vd-F929-947/Vd-R1076-1094和靶标荧光探针Vdhrc FAM或内参荧光探针ISPC-P进行实时荧光定量PCR。

反应体系(25μL)：TaKaRa Taq^TM(5U/μL)0.5μL，10×PCR Buffer(Mg²⁺free)2.5μL，25mM MgCl₂ 3μL，dNTP mixture(各2.5mM)2μL，0.1％BSA 5μL，两条特异性引物各1μL，靶标荧光探针Vdhrc FAM或内参荧光探针ISPC-P 1μL，ddH₂O 4μL，DNA模板5μL。

特异性引物均以引物溶液的形式加至反应体系中，引物在引物溶液中的浓度为10μM。探针以探针溶液的形式加至反应体系中，探针在探针溶液中的浓度为10μM。

探针ISPC-P：5’-ACCTGTCTGACCGCTTCCTCGTGC-3’；

探针VdhrcFAM：5’-CACCGCAAGCAGACTCTTGAAAGCCA-3’；

探针5’端均采用FAM标记，3’端均采用TAMRA标记；

Vd-F929-947：5’-CGTTTCCCGTTACTCTTCT-3’；

Vd-R1076-1094：5’-GGATTTCGGCCCAGAAACT-3’。

反应程序：95℃预变性5min，1个循环，之后进行45个循环，每个循环包括95℃30s、58℃ 30s。

4、完成步骤3后，将加入探针Vdhrc FAM进行检测的Ct值结果代入公式1，得到每克土中大丽轮枝菌的含量Calculated amount_path；将加入内参荧光探针ISPC-P进行检测的Ct值结果代入公式2，得到每克土中内参菌株的含量Calculated amount_ISPC。根据公式RE_ISPC＝Calculated amount_ISPC/Added amount_ISPC计算得到内参菌株回收效率RE_ISPC，其中，Addedamount_ISPC为内参菌株的实际添加量。根据公式Normalized amount_path＝Calculatedamount_path/RE_ISPC计算得到校正后大丽轮枝菌在土壤中的含量Normalized amount_path。

上述方法也可用于除了土壤以外的其他样品中大丽轮枝菌的含量检测。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 用于大丽轮枝菌定量PCR检测的内参菌株及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 245

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccattatcaa caaaatactc caattggcga tggccctgtc cttttaccag cgtttcccgt 60

tactcttcta caaccattac ctgtctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc 120

ccgactagta ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct tgacgagttc ttctgaagtt 180

tctgggccga aatccttcga aagatcccaa cgaaaagaga gaccacatgg tccttcttga 240

gtttg 245

<210> 2

<211> 981

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctcggtatc cggtgatcca ctagaggaga gggtgaaggt gatgccgttt cccgttactc 60

ttctacaacc attacctgtc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgac 120

tagtattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg aagtttctgg 180

gccgaaatcc ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt cttgagtttg 240

ctcgggccat tatcaacaaa atactccaat tggcgatggc cctgtccttt taccagcgtt 300

tcccgttact cttctacaac cattacctgt ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg 360

ccgctcccga ctagtattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct 420

gaagtttctg ggccgaaatc cttcgaaaga tcccaacgaa aagagagacc acatggtcct 480

tcttgagttt gctcgggcca ttatcaacaa aatactccaa ttggcgatgg ccctgtcctt 540

ttaccagcgt ttcccgttac tcttctacaa ccattacctg tctgaccgct tcctcgtgct 600

ttacggtatc gccgctcccg actagtattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga 660

cgagttcttc tgaagtttct gggccgaaat ccttcgaaag atcccaacga aaagagagac 720

cacatggtcc ttcttgagtt tgctcgggcc attatcaaca aaatactcca attggcgatg 780

gccctgtcct tttaccagcg tttcccgtta ctcttctaca accattacct gtctgaccgc 840

ttcctcgtgc tttacggtat cgccgctccc gactagtatt cgcagcgcat cgccttctat 900

cgccttcttg acgagttctt ctgaagtttc tgggccgaaa tccagacacg tgctgaagtc 960

aagctgctgg catacaagct a 981

<210> 3

<211> 17143

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60

gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga attaattcgg gggatctgga ttttagtact 120

ggattttggt tttaggaatt agaaatttta ttgatagaag tattttacaa atacaaatac 180

atactaaggg tttcttatat gctcaacaca tgagcgaaac cctataggaa ccctaattcc 240

cttatctggg aactactcac acattattat ggagaaactc gattggcaag ctgctctagc 300

caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcaga acattaacgt 360

ttacaatttc gcgccattcg ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc 420

gggcctcttc gctattacgc cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt 480

gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gaattgtaat 540

acgactcact atagggcgaa ttgggtaccc ggagatctgc tcggtatccg gtgatccact 600

agaggagagg gtgaaggtga tgccgtttcc cgttactctt ctacaaccat tacctgtctg 660

accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgacta gtattcgcag cgcatcgcct 720

tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgaa gtttctgggc cgaaatcctt cgaaagatcc 780

caacgaaaag agagaccaca tggtccttct tgagtttgct cgggccatta tcaacaaaat 840

actccaattg gcgatggccc tgtcctttta ccagcgtttc ccgttactct tctacaacca 900

ttacctgtct gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgact agtattcgca 960

gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga agtttctggg ccgaaatcct 1020

tcgaaagatc ccaacgaaaa gagagaccac atggtccttc ttgagtttgc tcgggccatt 1080

atcaacaaaa tactccaatt ggcgatggcc ctgtcctttt accagcgttt cccgttactc 1140

ttctacaacc attacctgtc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgac 1200

tagtattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg aagtttctgg 1260

gccgaaatcc ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt cttgagtttg 1320

ctcgggccat tatcaacaaa atactccaat tggcgatggc cctgtccttt taccagcgtt 1380

tcccgttact cttctacaac cattacctgt ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg 1440

ccgctcccga ctagtattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct 1500

gaagtttctg ggccgaaatc cagacacgtg ctgaagtcaa gctgctggca tacaagctag 1560

gatctgctcg gtatccggtg atccactaga ggagagggtg aaggtgatgc cgtttcccgt 1620

tactcttcta caaccattac ctgtctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc 1680

ccgactagta ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct tgacgagttc ttctgaagtt 1740

tctgggccga aatccttcga aagatcccaa cgaaaagaga gaccacatgg tccttcttga 1800

gtttgctcgg gccattatca acaaaatact ccaattggcg atggccctgt ccttttacca 1860

gcgtttcccg ttactcttct acaaccatta cctgtctgac cgcttcctcg tgctttacgg 1920

tatcgccgct cccgactagt attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt 1980

cttctgaagt ttctgggccg aaatccttcg aaagatccca acgaaaagag agaccacatg 2040

gtccttcttg agtttgctcg ggccattatc aacaaaatac tccaattggc gatggccctg 2100

tccttttacc agcgtttccc gttactcttc tacaaccatt acctgtctga ccgcttcctc 2160

gtgctttacg gtatcgccgc tcccgactag tattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt 2220

cttgacgagt tcttctgaag tttctgggcc gaaatccttc gaaagatccc aacgaaaaga 2280

gagaccacat ggtccttctt gagtttgctc gggccattat caacaaaata ctccaattgg 2340

cgatggccct gtccttttac cagcgtttcc cgttactctt ctacaaccat tacctgtctg 2400

accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgacta gtattcgcag cgcatcgcct 2460

tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgaa gtttctgggc cgaaatccag acacgtgctg 2520

aagtcaagct gctggcatac aagctaggat ctgctcggta tccggtgatc cactagagga 2580

gagggtgaag gtgatgccgt ttcccgttac tcttctacaa ccattacctg tctgaccgct 2640

tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg actagtattc gcagcgcatc gccttctatc 2700

gccttcttga cgagttcttc tgaagtttct gggccgaaat ccttcgaaag atcccaacga 2760

aaagagagac cacatggtcc ttcttgagtt tgctcgggcc attatcaaca aaatactcca 2820

attggcgatg gccctgtcct tttaccagcg tttcccgtta ctcttctaca accattacct 2880

gtctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat cgccgctccc gactagtatt cgcagcgcat 2940

cgccttctat cgccttcttg acgagttctt ctgaagtttc tgggccgaaa tccttcgaaa 3000

gatcccaacg aaaagagaga ccacatggtc cttcttgagt ttgctcgggc cattatcaac 3060

aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccagc gtttcccgtt actcttctac 3120

aaccattacc tgtctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgactagtat 3180

tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgaagttt ctgggccgaa 3240

atccttcgaa agatcccaac gaaaagagag accacatggt ccttcttgag tttgctcggg 3300

ccattatcaa caaaatactc caattggcga tggccctgtc cttttaccag cgtttcccgt 3360

tactcttcta caaccattac ctgtctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc 3420

ccgactagta ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct tgacgagttc ttctgaagtt 3480

tctgggccga aatccagaca cgtgctgaag tcaagctgct ggcatacaag ctaggatcca 3540

ggcgtttaag ggcaccaata actgccttaa aaaaattacg ccccgccctg ccactcatcg 3600

cagtactgtt gtaattcatt aagcattctg ccgacatgga agccatcaca aacggcatga 3660

tgaacctgaa tcgccagcgg catcagcacc ttgtcgcctt gcgtataata tttgcccatg 3720

gtgaaaacgg gggcgaagaa gttgtccata ttggccacgt ttaaatcaaa actggtgaaa 3780

ctcacccagg gattggctga gacgaaaaac atattctcaa taaacccttt agggaaatag 3840

gccaggtttt caccgtaaca cgccacatct tgcgaatata tgtgtagaaa ctgccggaaa 3900

tcgtcgtggt attcactcca gagcgatgaa aacgtttcag tttgctcatg gaaaacggtg 3960

taacaagggt gaacactatc ccatatcacc agctcaccgt ctttcattgc catacgaaat 4020

tccggatgag cattcatcag gcgggcaaga atgtgaataa aggccggata aaacttgtgc 4080

ttatttttct ttacggtctt taaaaaggcc gtaatatcca gctgaacggt ctggttatag 4140

gtacattgag caactgactg aaatgcctca aaatgttctt tacgatgcca ttgggatata 4200

tcaacggtgg tatatccagt gatttttttc tccattttag cttccttagc tcctgaaaat 4260

ctcgataact caaaaaatac gcccggtagt gatcttattt cattatggtg aaagttggaa 4320

cctcttacgt gccgatcaac gtctcatttt cgccaaaagt tggcccaggg cttcccggta 4380

tcaacaggtc gacggtatcg ataagcttga taactggttc ccggtcggca tctactctat 4440

tcctttgccc tcggacgagt gctggggcgt cggtttccac tatcggcgag tacttctaca 4500

cagccatcgg tccagacggc cgcgcttctg cgggcgattt gtgtacgccc gacagtcccg 4560

gctccggatc ggacgattgc gtcgcatcga ccctgcgccc aagctgcatc atcgaaattg 4620

ccgtcaacca agctctgata gagttggtca agaccaatgc ggagcatata cgcccggagg 4680

cgcggcgatc ctgcaagctc cggatgcctc cgctcgaagt agcgcgtctg ctgctccata 4740

caagccaacc acggcctcca gaagaggatg ttggcgacct cgtattggga atccccgaac 4800

atcgcctcgc tccagtcaat gaccgctgtt atgcggccat tgtccgtcag gacattgttg 4860

gagccgaaat ccgcatgcac gaggtgccgg acttcggggc agtcctcggc ccaaagcatc 4920

agctcatcga gagcctgcgc gacggacgca ctgacggtgt cgtccatcac agtttgccag 4980

tgatacacat ggggatcagc aatcgcgcat atgaaatcac gccatgtagt gtattgaccg 5040

attccttgcg gtccgaatgg gccgaacccg ctcgtctggc taagatcggc cgcagcgatc 5100

gcatccatgg cctccgcgac cggctggaga acagcgggca gttcggtttc aggcaggtct 5160

tgcaacgtga caccctgtgc acggcgggag atgcaatagg tcaggctctc gctgaactcc 5220

ccaatgtcaa gcacttccgg aatcgggagc gcggccgatg caaagtgccg ataaacataa 5280

cgatctttgt agaaaccatc ggcgcagcta tttacccgca ggacatatcc acgccctcct 5340

acatcgaagc tgaaagcacg agattcttcg ccctccgaga gctgcatcag gtcggagacg 5400

ctgtcgaact tttcgatcag aaacttctcg acagacgtcg cggtgagttc aggctttttc 5460

atttggatgc ttgggtagaa taggtaagtc agattgaatc tgaaataaag ggaggaaggg 5520

cgaacttaag aaggtatgac cgggtcgtcc acttaccttg cttgacaaac gcaccaagtt 5580

atcgtgcacc aagcagcaga tgataataat gtcctcgttc ctgtctgcta ataagagtca 5640

cacttcgagc gccgccgcta ctgctacaag tggggctgat ctgaccagtt gcctaaatga 5700

accatcttgt caaacgacac aaattttgtg ctcaccgcct gacgactaaa ccaaaatagg 5760

cattcattgt tgacctccac tagctccagc cagcccaaaa atgctccttc atatcagtat 5820

cgatctgcag cccgggggat cctagcttgt atgccagcag cttgacttca gcacgtgtct 5880

ggatttcggc ccagaaactt cagaagaact cgtcaagaag gcgatagaag gcgatgcgct 5940

gcgaatacta gtcgggagcg gcgataccgt aaagcacgag gaagcggtca gacaggtaat 6000

ggttgtagaa gagtaacggg aaacgctggt aaaaggacag ggccatcgcc aattggagta 6060

ttttgttgat aatggcccga gcaaactcaa gaaggaccat gtggtctctc ttttcgttgg 6120

gatctttcga aggatttcgg cccagaaact tcagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa 6180

ggcgatgcgc tgcgaatact agtcgggagc ggcgataccg taaagcacga ggaagcggtc 6240

agacaggtaa tggttgtaga agagtaacgg gaaacgctgg taaaaggaca gggccatcgc 6300

caattggagt attttgttga taatggcccg agcaaactca agaaggacca tgtggtctct 6360

cttttcgttg ggatctttcg aaggatttcg gcccagaaac ttcagaagaa ctcgtcaaga 6420

aggcgataga aggcgatgcg ctgcgaatac tagtcgggag cggcgatacc gtaaagcacg 6480

aggaagcggt cagacaggta atggttgtag aagagtaacg ggaaacgctg gtaaaaggac 6540

agggccatcg ccaattggag tattttgttg ataatggccc gagcaaactc aagaaggacc 6600

atgtggtctc tcttttcgtt gggatctttc gaaggatttc ggcccagaaa cttcagaaga 6660

actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaata ctagtcggga gcggcgatac 6720

cgtaaagcac gaggaagcgg tcagacaggt aatggttgta gaagagtaac gggaaacggc 6780

atcaccttca ccctctcctc tagtggatca ccggataccg agcagatcct agcttgtatg 6840

ccagcagctt gacttcagca cgtgtctgga tttcggccca gaaacttcag aagaactcgt 6900

caagaaggcg atagaaggcg atgcgctgcg aatactagtc gggagcggcg ataccgtaaa 6960

gcacgaggaa gcggtcagac aggtaatggt tgtagaagag taacgggaaa cgctggtaaa 7020

aggacagggc catcgccaat tggagtattt tgttgataat ggcccgagca aactcaagaa 7080

ggaccatgtg gtctctcttt tcgttgggat ctttcgaagg atttcggccc agaaacttca 7140

gaagaactcg tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc gaatactagt cgggagcggc 7200

gataccgtaa agcacgagga agcggtcaga caggtaatgg ttgtagaaga gtaacgggaa 7260

acgctggtaa aaggacaggg ccatcgccaa ttggagtatt ttgttgataa tggcccgagc 7320

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cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct 840

tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca 900

gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac 960

atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 1020

ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 1080

cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 1140

tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 1200

gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 1260

aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 1320

tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 1380

aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 1440

aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 1500

ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 1560

ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 1620

atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc 1680

atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa 1740

tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag 1800

gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg 1860

tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga 1920

gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag 1980

cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa 2040

gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc 2100

atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca 2160

aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg 2220

atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat 2280

aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc 2340

aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg 2400

gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg 2460

gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt 2520

gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca 2580

ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata 2640

ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac 2700

atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa 2760

gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt 2820

atcacgaggc cctttcgtc 2839

<210> 6

<211> 2692

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gcttgcatgc ctgcaggtcg 420

acgatatctc tagaagatct ccgggtaccg agctcgaatt cgtaatcatg gtcatagctg 480

tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata 540

aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca 600

ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc 660

gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg 720

cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta 780

tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 840

aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 900

catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 960

caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 1020

ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt 1080

aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 1140

gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 1200

cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 1260

ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta 1320

tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 1380

tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 1440

cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 1500

tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc 1560

tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact 1620

tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 1680

cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta 1740

ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta 1800

tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc 1860

gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat 1920

agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt 1980

atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg 2040

tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca 2100

gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta 2160

agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg 2220

cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact 2280

ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg 2340

ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt 2400

actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga 2460

ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc 2520

atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 2580

caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt 2640

attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tc 2692

Claims (8)

1.重组菌，是通过将含有质粒载体的农杆菌转化出发菌制备获得的，

所述质粒载体中含有24个拷贝特异DNA片段；

所述特异DNA片段如SEQ ID No.1自5’端第51-195位所示；

所述质粒载体为SEQ ID No.3所示的环状质粒。

2.产品，包括权利要求1的重组菌和引物探针组合；

所述引物探针组合包括引物对、探针甲和探针乙；

所述引物对由上游引物F和下游引物R组成；

所述上游引物F为SEQ ID No.1自5’端第51至69位所示的单链DNA分子；

所述下游引物R为与SEQ ID No.1自5’端第177至195位所示的核苷酸反向互补的单链DNA分子；

所述探针甲为与SEQ ID No.4自5’端第525-550位所示的核苷酸反向互补的单链DNA分子；

所述探针乙为SEQ ID No.1自5’端第79至102位所示的单链DNA分子；

所述探针甲和所述探针乙一端采用荧光基团标记，一端采用淬灭基团标记。

3.权利要求1所述的重组菌或权利要求2所述的产品在如下(a1)-(a5)任一种中的应用：

(a1)检测或辅助检测大丽轮枝菌；

(a2)大丽轮枝菌定量检测；

(a3)提高大丽轮枝菌定量检测的准确性；

(a4)辅助判断大丽轮枝菌检测中的假阴性结果；

(a5)校正大丽轮枝菌定量检测结果。

4.权利要求1所述的重组菌或权利要求2所述的产品在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(a1)-(a5)中的任一种：

(a1)检测或辅助检测大丽轮枝菌；

(a2)大丽轮枝菌定量检测；

(a3)提高大丽轮枝菌定量检测的准确性；

(a4)辅助判断大丽轮枝菌检测中的假阴性结果；

(a5)校正大丽轮枝菌定量检测结果。

5.试剂盒，包括权利要求1所述的重组菌或权利要求2所述的产品。

6.一种大丽轮枝菌定量检测方法或对大丽轮枝菌定量检测结果进行校正的方法，包括如下步骤：

(1)向待测样本中加入已知量的权利要求1所述的重组菌的分生孢子，然后提取样本总DNA或微生物DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA样本为模板，分别采用引物探针组甲和引物探针组乙进行qPCR检测；所述引物探针组甲由权利要求2中的引物对和探针甲组成；所述引物探针组乙由权利要求2中的引物对和探针乙组成；(3)将步骤(2)中采用引物探针组甲进行qPCR检测得到的Ct值代入公式1，得到检测值，将步骤(2)中采用引物探针组乙进行qPCR检测得到的Ct值代入公式2，得到内参值；(4)根据公式：回收效率＝内参值/重组菌的实际添加量，计算得到回收效率，然后根据公式：校正后含量＝检测值/回收效率，计算得到校正后大丽轮枝菌的含量；

公式1是根据采用不同已知浓度的大丽轮枝菌靶标片段为模板，按照步骤(2)进行qPCR检测后以Ct值和模板含量得到的标准曲线公式以及步骤(1)和(2)整个过程中的数量关系得到用来根据Ct值x计算得到检测值y的公式；所述大丽轮枝菌靶标片段为权利要求2中所述引物对在大丽轮枝菌基因组中的靶序列；

所述公式1为：y＝(a×10^{x-36.14/-3.39})/(b×c)；

公式1中，y为每g土壤中大丽轮枝菌含量，单位为基因组拷贝数/g土，x为Ct值，a为单次提取DNA的最终体积，单位为μL，b为大丽轮枝菌单位基因组中靶标序列的拷贝数，c为单次提取的土壤质量，单位为g；

公式2是根据采用不同已知浓度的内参片段为模板，按照步骤(2)进行qPCR检测后以Ct值和模板含量得到的标准曲线公式以及步骤(1)和(2)整个过程中的数量关系得到用来根据Ct值x计算得到内参值y的公式；所述内参片段为SEQ ID No.1自5’端第51-195位所示的DNA片段；

所述公式2为：y＝(a×10^{x-35.60/-3.35})/(24×c)；

公式2中，y为每g土壤中内参菌株含量，单位为基因组拷贝数/g土，x为Ct值，a为单次提取DNA的最终体积，单位为μL，24为内参菌株单位基因组中内参片段的拷贝数，c为单次提取的土壤质量，单位为g。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，重组菌的分生孢子加入量为4×10³-4×10⁴个分生孢子/克样本。

8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述待测样本为土壤。

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