CN100366747C - 低氧诱导因子小干扰rna质粒 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，公开了一种低氧诱导因子小干扰RNA(SiRNA-HIF-1α)质粒，它是将针对HIF-1α设计的抑制性siRNA片段插入到pSilence U6-1.0载体，构建而成的重组质粒。本发明的质粒可在细胞内稳定且高效地表达，从而可以强烈抑制哺乳动物细胞中独立基因的表达。

Description

低氧诱导因子小干扰RNA质粒

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种基因工程质粒，进一步的，本发明涉及一种可在细胞内稳定且高效表达的低氧诱导因子小干扰RNA质粒。

背景技术

RNA干扰(或称为RNA干涉，RNA interference，RNAi)指的是细胞内由双链RNA(dsRNA)诱导降解与其配对的特定mRNA的过程。在一些生物系统中，少量拷贝的dsRNA能导致细胞内所有同源基因的降解。这个现象在进化过程中保守而且广泛，许多基因在这个过程中发挥了重要的作用。这个现象在线虫、昆虫、哺乳动物、植物和真菌中广泛存在。

当长链的dsRNA进入细胞时，它被一种Dicer核酸水解酶所识别，剪切成21-25个碱基的小的干扰RNA(SiRNA)，双链的SiRNA被RNA解链酶解链，以单链的形式与另一核酸水解酶结合形成RNA酶复合体，复合体中的单链RNA引导酶复合体识别与之互补的mRNA序列并将其水解，从而特异性地抑制基因的翻译表达。在线虫和植物中，单链SiRNA除了上述作用外，还可作为聚合反应的引物，在RdRP的作用下，以mRNA为模板，单链的SiRNA为引物合成互补链，使得单链的mRNA成为双链RNA，新合成的dsRNA则又被核酸酶Dicer剪切成SiRNA。RdRP的作用使RNAi的信号得到放大，只要极微量的dsRNA就能引起强烈的基因表达抑制。

RNAi可高效且专一地抑制基因表达，因此在基因的功能研究方面具有广泛的应用，并且也为一些目前难以治疗的疾病提供一种潜在的治疗手段。目的基因mRNA的二级结构不会影响RNAi的效率，只要微量的dsRNA就能引起强烈的基因表达抑制。

RNAi技术应用于哺乳动物系统的关键是制备SiRNA。目前，SiRNA设计均根据SiRNA设计软件设计，在多条备选片断中选取，因此抑制效率有差异。在现有技术中，经常出现SiRNA片段的选择无特异性，RNA链稳定性差，易降解，不利于进一步提高转染效率等问题。

与本发明相比较，最接近的现有技术是德国JorgHanze(Medical School of theJustus-liebig-University)设计的针对HIF-1α的片断，但所合成的为RNA双链，而非稳定性较高的质粒。

本发明总结了现有技术的经验，设计出了SiRNA-HIF-1α片段，能够在细胞内稳定高效地表达。本发明结合SiRNA设计软件选取抑制性片段，抑制效果显著；同时，只需化学合成1/10SiRNA的量就可得到同样效果，从而使转染效率更高。体外连接pSilence-1.0(Ambion公司)载体后使构建的质粒在细胞内稳定表达；便于进一步连接病毒载体，提高质粒的转染效率。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种低氧诱导因子小干扰RNA质粒，由针对HIF-1α设计的抑制性SiRNA插入到pSilence U6-1.0载体构建而成。

更特别的，在所述的低氧诱导因子小干扰RNA质粒中，所述针对HIF-1α设计的抑制性SiRNA具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的基因结构。

更特别的，在所述的低氧诱导因子小干扰RNA质粒中，所述pSilence U6-1.0载体具有SEQ ID NO：3所述的基因结构。

更特别的，在针对HIF-1α设计的抑制性SiRNA上设计特定的酶切位点EcoRI和ApaI，连接到pSilence U6-1.0载体相应的酶切位点上，构建成上述的目的质粒。

进一步的，所述的低氧诱导因子小干扰RNA质粒具有SEQ ID NO：5所示的基因结构。

本发明所要解决的技术问题还在于提供所述低氧诱导因子小干扰RNA质粒的制备方法，通过特定的酶切位点，将针对HIF-1α选择和设计的SiRNA插入到pSilence U6-1.0载体，构建成重组质粒。

进一步的，在本发明所述的方法中，所述针对HIF-1α设计的抑制性SiRNA通过http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html所提供的方法进行设计和选择。

进一步的，所述的酶切位点为EcoRI和ApaI。

通过本发明的技术获得的重组质粒可在细胞内稳定且高效地表达，所述SiRNA的简单使用，就可以强烈抑制哺乳动物细胞中独立基因的表达。

在本发明的一个实施方式中发现，在RNA水平，SiRNA抑制HIF-1α转录效率很高(大于70％)，其下游靶基因VEGF(血管内皮细胞生长因子)表达也明显下降。针对HIF-1αCDNA编码序列产生的RNA干扰在抑制HIF-1α的前提下，显著抑制了HIF的氧依赖区(ODD)与VEGF启动子DNA的结合及转录活性。对HIF-1α的抑制不但显著降低了VEGF水平，同时HIF-1作为广谱的转录因子，红细胞生成素及糖代谢途径也可能被同时抑制，起到了多途径抑制效果。

并且，在本发明的另一个实施方式中发现，在SiRNA-HIF-1α干扰后，HIF-1α蛋白合成明显受抑制，胞核显棕色的数量及程度明显减少。

更深层次的，本发明可用于：1.进一步与病毒载体连接，包装为病毒质粒，提高转染效率；2.潜在可抑制哺乳动物肿瘤的发展；3.用于缺血模型，与HIF-1α质粒成组比较，从反面验证HIF-1α基因与内皮祖细胞成血管活性的关系。4.以细胞为载体的基因转染为临床应用打下基础。

附图说明

图1显示了本发明一种低氧诱导因子小干扰RNA质粒构建和抑制细胞内基因表达的原理图。

图2显示了将本发明的质粒转染后进行基因检测，获得的电泳结果。其中，图1A为转染后20小时HIF-1αCDNA电泳；图1B为转染后20小时VEGFCDNA电泳。

图3显示了低氧中SiRNA-HIF-1α抑制HIF-1α蛋白。A为HIF-1α阴性对照(PBS代替一抗)；B为低氧6小时HIF-1α蛋白；C为低氧，转SiRNA12小时后HIF-1α蛋白。

图4显示了本发明所用的pSilence U6-1.0载体。

图5显示了在SiRNA序列上酶切位点的设计。

具体实施方式

如图1所示，本发明是一种低氧诱导因子小干扰RNA质粒，将针对HIF-1

αCDNA设计的抑制性SiRNA插入到pSilence U6-1.0载体构建而成，通过电穿孔或脂质体等方法转染细胞，质粒进入细胞后，被特异性核酸内切酶Dicer识别，结合在其结构域上，Dicer随以该序列为模板，识别mRNA；识别后，核酸酶在同样位置对mRNA进行切割并置换、释放出原结构域上的siRNA。这样siRNA在细胞内的数量会增加，以正反馈的形式对目的基因的mRNA进行干扰，起到抑制基因的作用。

实施例1 SiRNA-HIF-1α的制备

目的基因HIF-1αsiRNA序列的设计

打开siRNA设计工具http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html，将人低氧诱导因子1α(HIF-1α)基因的CDS(HIF-1α的CDS(29-2509)见SEQID NO：4)粘贴在输入框中，选择end with TT，提交后得到一系列21个碱基(nt)的输出序列，选择其中1到2个序列，通过Blast检验确认与其它基因没有显著相似性，将输出序列转化为正义链和反义链两种插入序列。

选择的序列如下：

获得SiRNA-上游序列为(SEQ ID NO：1)：

5′-TGTGAGTTCGCATCTTGATTTCAAGAGAATCAAGATGCGAACTCACATTTTTT-3′

其中，TGTGAGTTCGCATCTTGAT为所得上游片段；TTCAAGAGA为特定的loop环；ATCAAGATGCGAACTCACA为上游片段的回文结构。

获得SiRNA-下游序列为(SEQ ID NO：2)：

5′-AATTAAAAAATGTGAGTTCGCATCTTGATTCTCTTGAAATCAAGATGCGAACTCACAGGCC-3′；

该下游序列与上游互补，5′-AATT为EcoRI酶切位点，GGCC-3′为ApaI酶切位点，与pSilence U6-1.0载体酶切位点对应；AAAAAA为终止信号。酶切位点的设计见图5。

插入序列的处理

设计好的序列送赛百盛生物技术公司(基因合成公司)合成，5’端磷酸化，合成后的序列进行退火，使之形成双链。将序列溶解于水中至浓度为1ug/ul，两条链各取2ul，与46ul退火缓冲液(100mM KAc，30mM Hepes-KOH PH 7.4，2mM乙酸镁)混匀，90℃水浴3分钟，37℃水浴1小时。退火后的溶液可以直接用来连接，也可以在-20℃长期保存。

载体的酶切和回收

pSilence U6-1.0载体(Ambion公司，见图4)的序列见SEQ ID NO：3所示。将pSilence U6-1.0载体44ug(89ul)用ApaI0.5ul、EcoRI0.5ul、Y+/Tango缓冲液10ul构成100ul酶切体系，37℃水浴3小时，通过胶回收纯化将酶切片段回收。

载体片段与插入序列连接转化

将载体的酶切片段与相应的插入序列以1∶2比例用T4连接酶连接，16℃水浴4小时，CaCl₂法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，琼脂板铺板。同时设置pSilence U6-1.0载体为空白对照。

重组子鉴定

在阳性平板上挑取一定数量的菌落，分别接种于Amp+LB培养液中，200转/分，37℃摇过夜。次日质粒小量抽提，用XhoI酶切鉴定。能被XhoI酶切开的是假阳性菌。酶切初步鉴定为正确的克隆由生工生物技术公司用T7正向引物测序鉴定。

插入了SiRNA的重组质粒的测序结果见SEQ ID NO：5。

实施例2 SiRNA-HIF-1α的检测

通过电穿孔法，将外源SiRNA-HIF-1α转染入内皮祖细胞，与未转染SiRNA组作如下比较。

1.基因检测

培养3天后细胞进行质粒转染，分别置于常氧及低氧中孵育20小时，进行RT-PCR，β-actin量化。电泳结果如图2，其中，泳道1为100bp Marker；泳道2、4、6为常氧；泳道3、5、7为低氧；泳道2-3未转染细胞；泳道4-5为pEGFP空质粒转染细胞；泳道6-7为SiRNA-HIF-1α转染细胞。A为转染后20小时HIF-1α电泳，B为转染后20小时VEGF电泳。结果显示：HIF1αCDNA在常氧及低氧下均存在，其表达与氧浓度无关，SiRNA干扰使HIF1α抑制；VEGF在低氧诱导下表达上调，SiRNA干扰使VEGF表达减少。

可见，在RNA水平，SiRNA组抑制HIF-1α转录效率大于70％，其下游靶基因VEGF表达也明显下降。针对HIF-1αCDNA编码序列产生的RNA干扰在抑制HIF-1α的前提下，显著抑制了HIF的氧依赖区(ODD)与VEGF启动子DNA的结合及转录活性。对HIF-1α的抑制不但显著降低了VEGF水平，同时HIF-1作为广谱的转录条件因子，红细胞生成素及糖代谢途径也可能被同时抑制，起到了多途径抑制效果。

2.蛋白检测

图3显示了低氧中SiRNA-HIF-1α抑制HIF-1α蛋白。A为HIF-1α阴性对照(PBS代替一抗)；B为低氧6小时HIF-1α蛋白；C为低氧，转SiRNA 12小时后HIF-1α蛋白。HIF-1α蛋白呈氧浓度依赖性，在常氧及低氧1小时时细胞核无染色，而低氧3小时HIF-1α蛋白开始成倍出现，6小时达高峰，24小时回到基线水平。在SiRNA-HIF-1α干扰后，HIF-1α蛋白合成明显受抑制，胞核显棕色的数量及程度明显减少；而pEGFP对照组质粒对HIF-1α蛋白合成无影响。

可见，在SiRNA-HIF-1α干扰后，HIF-1α蛋白合成明显受抑制，胞核显棕色的数量及程度明显减少。

                          序列表

<110>上海第二医科大学附属仁济医院

王长谦，姜萌

<120>低氧诱导因子小干扰RNA质粒

<160>5

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>53

<212>DNA

<213>引物

<400>1

TGTGAGTTCG CATCTTGATT TCAAGAGAAT CAAGATGCGA ACTCACATTT TTT         53

<210>2

<211>61

<212>DNA

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<400>2

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C                                                                  61

<210>3

<211>3292

<212>DNA

<213>载体

<400>3

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<210>4

<211>3678

<212>DNA

<213>HIF-1αCDS

<400>4

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aggaatatat agttgtcaca gtaaatatct tgttttttct atgtacattg tacaaatttt    3600

tcattccttt tgctctttgt ggttggatct aacactaact gtattgtttt gttacatcaa    3660

ataaacatct tctgtgga                                                  3678

<210>5

<211>3678

<212>DNA

<213>重组质粒

<400>5

ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc   60

attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga  120

gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc  180

caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc  240

ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag  300

cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa  360

agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac  420

cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg  480

caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg  540

gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg  600

taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtacccg  660

ctctagaact agtggatccg acgccgccat ctctaggccc gcgccggccc cctcgcacag  720

acttgtggga gaagctcggc tactcccctg ccccggttaa tttgcatata atatttccta  780

gtaactatag aggcttaatg tgcgataaaa gacagataat ctgttctttt taatactagc  840

tacattttac atgataggct tggatttcta taagagatac aaatactaaa ttattatttt  900

aaaaaacagc acaaaaggaa actcacccta actgtaaagt aattgtgtgt tttgagacta  960

taaatatccc ttggagaaaa gccttgtttg ggcctgtgag ttcgcatctt gatttcaaga 1020

gaatcaagat gcgaactcac attttttaat tcctgcagcc cgggggatcc actagttcta 1080

gagcggccgc caccgcggtg gagctccagc ttttgttccc tttagtgagg gttaattgcg 1140

cgcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt 1200

ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc 1260

taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc 1320

cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct 1380

tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca 1440

gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac 1500

atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 1560

ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 1620

cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 1680

tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 1740

gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 1800

aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 1860

tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 1920

aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 1980

aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 2040

ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 2100

ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 2160

atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc 2220

atgagattat caaaaaggan nttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa 2280

tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag 2340

gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg 2400

tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga 2460

gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag 2520

cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa 2580

gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc 2640

atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca 2700

aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg 2760

atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat 2820

aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc 2880

aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg 2940

gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg 3000

gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt 3060

gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca 3120

ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata 3180

ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac 3240

atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa 3300

gtgccac                                                           3307

Claims (7)

1.一种低氧诱导因子小于扰RNA质粒，其特征在于，由针对HIF-1α设计的抑制性SiRNA插入到pSilence U6-1.0载体构建而成，所述针对HIF-1α设计的抑制性SiRNA具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的基因结构。

2.根据权利要求1所述的低氧诱导因子小干扰RNA质拉，其特征在于，所述的pSilence U6-1.0载体具有SEQ ID NO：3所述的基因结构。

3.根据权利要求1所述的低氧诱导因子小干扰RNA质粒，其特征在于，在具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的基因结构的SiRNA上设计酶切位点EcoRI和ApaI，然后连接到pSilence U6-1.0载体相应的酶切位点上，构建成目的质粒。

4.根据权利要求1-3任一所述的低氧诱导因子小干扰RNA质粒，其特征在于，具有SEQ ID NO：5所示的基因结构。

5.权利要求1所述的低氧诱导因子小干扰RNA质粒的制备方法，其特征在于，通过特定的酶切位点，将针对HIF-1α设计的SiRNA插入到pSilence U6-1.0载体，构建成重组质粒，所述针对HIF-1α设计的抑制性SiRNA具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的基因结构。

6.根据权利要求5所述的低氧诱导因子小干扰RNA质粒的制备方法，其特征在于，所述针对HIF-1α设计的抑制性SiRNA通过http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html所提供的方法进行设计和选择。

7.根据权利要求5所述的低氧诱导因子小干扰RNA质粒的制备方法，其特征在于，所述的酶切位点为EcoRI和ApaI。

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