CN101967475B - 一种基于位点特异性重组的基因打靶载体快速构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术和基因工程技术领域，具体为一种基于φBT1整合酶及其突变识别位点的基因打靶载体快速构建方法。本发明通过严格突变筛选和验证，提供三对突变的整合酶识别序列，突变的底物对参与反应效率与野生型相当，且在同一体系中表现为不兼容。在此基础上，构建一整套相关载体，包括一个可实现大肠杆菌-天蓝色链霉菌穿梭的骨架载体，以及三个含有突变底物对用于同源臂构建和筛选的TA克隆载体，并提供四个DNA片段体外串联重组反应的具体方法。本发明方法简单、快速并且高效，可用于链霉菌的基因打靶载体的构建；并可通过相应原件替换，广泛用于不同物种基因打靶载体的快速构建。

Description

一种基于位点特异性重组的基因打靶载体快速构建方法

技术领域

本发明属于生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种基于φBT1整合酶及其突变识别位点的基因打靶载体快速构建方法。 

背景技术

基因打靶技术通常是指含已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中的同源序列发生同源重组，整合至受体细胞基因组中，在靶位点增加外源DNA片段或基因，或者定向敲除或增加某些相关基因的技术。基因打靶技术作为现代分子生物学和遗传操作的重要手段，在对单个基因、基因组和基因家族进行深入分析和定性研究中发挥着至关重要的作用。通过该技术，可实现对生物遗传信息的定向改造，改造后的遗传信息在细胞或生物活体内稳定遗传，表达相应突变的性状。以此可确定相关基因的功能，帮助揭示各种生化途径和信号传导通路；阐明疾病发生的分子机制，并为相关疾病的治疗提供可选药物、评价模型及预防、治疗疫苗等。基因打靶技术是后基因组时代基因功能研究的重要技术手段。 

构建基因打靶载体是基因打靶技术的第一步。以双交换实现基因敲除载体为例，常规的基因打靶载体一般包括：同源双臂(分别为待敲除基因的上游和下游DNA序列)、可筛选的抗性基因、供体菌复制元件以及不同物种间基因转移的相关元件。为实现基因敲除，需要把多个相关元件集中到单一质粒DNA上，而这一过程目前主要是通过常规克隆方法，即通过基于限制性内切酶和连接酶作用的酶切/连接体系。然而，传统的限制性酶切/连接不仅操作繁琐(以构建基因敲除载体为例，需要经过至少六步的亚克隆和验证)，需要耗费大量的时间，试剂成本也随之增加，同时合适单一酶切位点的选择也成为大片段操作和大规模基因克隆无法回避的问题。 

随着技术的不断更新，基于同源重组和位点特异性重组的克隆方法也先后被开发出来并被研究者使用，这两种方法都很好的克服了传统克隆方法的缺点。同源重组克隆的原理，是重组酶能够识别并催化同源序列间的链交换，达到重组的目的。将这一原理应用到体外，使用纯化的重组酶，在优化的反应条件下，实验载体与目的基因的重组。重组完成之后，不会在载体上留下任何不必要的序列，但是一方面，同源重组有可能产生非预期的链交换，专一性有待进一步研究；另一方面，同源重组的效率一般比较低。由于这两个方面的缺陷，使用同源重组的方法实现多个长片段的串联克隆几乎成为了不可能的任务。 

位点特异性重组广泛发生在噬菌体整合到宿主染色体上的过程中。噬菌体编码一种位 点特异性重组酶，能特异性的识别自身的attP位点和宿主染色体attB位点，并介导两位点的切割和链交换，将噬菌体基因组整合进宿主染色体。对位点特异性重组酶的体外研究发现，该类酶催化的重组反应不仅专一性高，而且快速高效。很快，研究较早且机理清楚的λ整合系统被应用到体外的重组克隆中，率先突破了传统克隆的缺点。进一步的研究发现丝氨酸酶类(φC31 integrase，φBT1 integrase)的重组效率要高于酪氨酸类重组酶(λintegrase)，且参与重组反应所需要的蛋白因子单一，便于纯化和体外重组系统的建立和应用。对位点特异性重组发生机理的深入研究发现，核心序列(即切割和链交换发生的序列)在重组反应中只负责链切割和交换后粘性末端的配对，而不参与酶特异性识别和结合的过程，核心碱基的突变并不会影响重组反应的发生以及重组效率；且反应只在含有相同核心突变的底物对间进行，核心不匹配，重组反应则不能发生。利用丝氨酸重组酶的这一特性，即可很方便的获得可用于同一反应体系的不兼容底物对，实现对片段的串联或者多重重组。基于以上特性，丝氨酸重组酶的重组和突变不兼容底物对系统可以为基因打靶载体的构建提供更加高效快速的新方法。 

发明内容

本发明的目的在于提出一种简单，高效，快速构建基因打靶载体的方法。 

本发明提出的构建基因打靶载体方法，是一种基于大型丝氨酸重组酶φBT1 integrase的基因打靶载体的构建方法。本发明通过严格突变筛选和验证，提供三对突变的整合酶识别序列，突变的底物对参与反应效率与野生型相当，且在同一体系中表现为不兼容，即可同时使用。在此基础上，以构建重要模式和工业菌种天蓝色链霉菌的基因敲除载体为例，构建一整套相关载体，包括一个可实现大肠杆菌-天蓝色链霉菌穿梭的骨架载体，以及三个含有突变底物对用于同源臂构建和筛选的TA克隆载体。并提供四个DNA片段体外串联重组反应的具体方法和步骤。 

本发明提供的基因打靶载体构建方法简单、快速并且高效，可广泛用于链霉菌的基因打靶载体的构建；另外，针对不同实验材料和对象的具体需求，只要在骨架载体上加入相应实验对象所需的原件(例如转化植物细胞或者转染动物细胞所需的相应元件)，获得相应的入门载体，即可实现用于该物种基因打靶载体的快速构建。 

本发明提出的上述方法与应用具体如下： 

本发明以敲除模式菌株天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)中放线紫红素(Act)生物合成相关部分结构基因，导致Act的合成中断为例。 

1、φBT1整合酶兼容底物对的获取及重组效率确定。 

为获取三组突变底物对，并测算突变底物对的反应效率以及交叉反应的效率，设计了一套蓝白筛选系统。将野生型和三个突变的attB位点克隆到通用载体pBC-SK(-)中，精确插入到lacZα基因的开放阅读框当中，不破坏β-半乳糖苷酶基因α亚基的表达；通过PCR的方法，获得野生型和三个突变的attP位点，均插入到TA克隆载体pMD19-T中。 

构建含有野生型和突变attB位点质粒所用核苷酸序列依次为：primer 1(SEQ No.1)和primer 2(SEQ No.2)在同一体系退火后插入pBC-SK(-)获得质粒pZLB00，以primer 3(SEQNo.3)和primer 4(SEQ No.4)获得质粒pZLB06，以primer 5(SEQ No.5)和primer 6(SEQ No.6)获得质粒pZLB13，以primer 7(SEQ No.7)和primer 8(SEQ No.8)获得质粒pZLB15。构建含有野生型和突变attP位点质粒所用核苷酸序列依次为：primer 9(SEQ No.9)和primer10(SEQ No.10)分别为上下游引物，以pRT802为模板，获得含有attP位点的PCR产物后克隆到pMD19-T获得质粒pZLP00；以primer 9(SEQ No.9)和primer 11(SEQ No.11)获得质粒pZLP06；以primer 9(SEQ No.9)和primer 12(SEQ No.12)获得质粒pZLP13；以primer9(SEQ No.9)和primer 13(SEQ No.13)获得质粒pZLP15。 

将pZLB系列和pZLP系列质粒在整合酶的作用下发生体外重组反应后，转化大肠杆菌，在含有IPTG和X-gal的抗性平板上生长，进行蓝白菌落筛选。如果反应发生，则呈现白色菌落；以此即可测算不同底物对之间的反应效率。分析发现突变型和野生型底物参与反应效率相当，均大于90％，且反应严格发生在同种突变底物之间，没有交叉反应发生(附图1)。因此突变型底物对attB₆/attP₆、attB₁₃/attP₁₃、attB₁₅/attP₁₅和野生型底物对attB₀/attP₀可以组合应用到同一反应体系当中，实现单因子(只需要φBT1 integrase)催化下的多片段串联重组。 

2、用于基因敲除的整套入门载体的构建。 

要实现基因打靶载体的快速串联重组构建，需要首先获得相应的入门载体(EntryVectors)。包括一个可实现大肠杆菌-天蓝色链霉菌穿梭的骨架载体，以及三个含有突变底物对用于同源臂构建和筛选的TA克隆载体。 

以限制性内切酶BamHI和XbaI酶切质粒pHZ1358，获得大小为9706bp的骨架片段；该片段包含有青霉素抗性基因(bla)、大肠杆菌-链霉菌穿梭元件(oriT)、硫链丝菌素抗性基因(tsr)和大肠杆菌及链霉菌复制起始位点(ori和rep)。以天蓝色链霉菌基因组为模板，以primer 14(SEQ No.14)和primer 15(SEQ No.15)扩增大小为460bp的DNA片段；以质粒pCY104为模板，以primer 16(SEQ No.16)和primer 17(SEQ No.17)扩增大小为1906bp的DNA片段；以该两片段为模板，以引物primer 14(SEQ No.14)和primer 17(SEQ No.17)通过重叠PCR获得大小为2346bp的DNA片段；将该片段连入pMD19-T载体，得到 中间质粒1。以质粒pIJ6021为模板，以primer 18(SEQ No.18)和primer 19(SEQ No.19)扩增大小为550bp的DNA片段；以质粒pSET152为模板，以primer 20(SEQ No.20)和primer 21(SEQ No.21)扩增大小为927bp的DNA片段；以该两片段为模板，以引物primer18(SEQ No.18)和primer 21(SEQ No.21)通过重叠PCR获得大小为1456bp的DNA片段；将该片段连入pMD19-T载体，得到中间质粒2。以限制性内切酶NheI酶切中间质粒1，以限制性内切酶XbaI酶切中间质粒2，连接，即获得质粒T-Bxbatt1-Bxbatt2(SEQ No.22)。以限制性内切酶NheI和BglII酶切质粒T-Bxbatt1-Bxbatt2，获得大小为2049bp的DNA片段；该片段含有氯霉素抗性基因(cat)，该基因两侧分别含有突变位点attP₀和attB₁₅。将分别从pHZ1358和T-Bxbatt1-Bxbatt2获得的两片段连接，即得到可实现大肠杆菌-天蓝色链霉菌穿梭的骨架载体pFDZ100(SEQ No.23，附图2)。 

本发明还包括所述重组克隆骨架质粒的相应元件，包括质粒复制起始位点、抗药性基因(完整或部分)、接合转移起始位点以及位点特异性重组识别位点attB₁₅和attP₀。 

以质粒pSET152为模板，用引物PT1(SEQ No.24)和PTF(SEQ No.25)扩增得到两侧分别带有整合位点attB₀和attP₆的阿泊拉霉素抗性基因片段(aac(3)IV)，将该片段克隆到pMD19-T载体上，即得到用于携带上游片段的载体pTA0006(SEQ No.26，附图3)；在整合位点和抗性基因之间引入了一对限制性内切酶XcmI的识别位点，酶切后，可以方便的通过TA克隆的方式将同源片段插入到该载体(附图3)。以同样的方法获得含有整合位点attB₆和attP₁₃的质粒pTA0613(SEQ No.27，附图4)，以及含有attB₁₃和attP₁₅的质粒pTA1315(SEQ No.28，附图5)。 

3、上游和下游同源臂序列的扩增和克隆。 

本发明示例中拟敲除Act生物合成基因簇中相关基因actI、actVII和actIV的全部或部分，实现Act合成的中段。以天蓝色链霉菌基因组为模板，用引物primer 22(SEQ No.29)和primer 23(SEQ No.30)扩增得到含有actIII和actI部分基因的上游同源臂片段，将该片段插入到pTA0006中，获得质粒pTA0006-upstream；以引物primer 24(SEQ No.31)和primer25(SEQ No.32)扩增得到含有部分actVB基因的下游同源臂片段，插入到pTA1315中，获得质粒pTA1315-downstream。 

4、体外一步重组克隆获取最终基因敲除载体。 

为获得较高的阳性克隆率，可将质粒pTA0006-upstream、pTA0613和pTA1315-downstream线性化；尤其是pTA0613，线性化至只含有阿泊拉霉素抗性基因(aac(3)IV)和一对整合位点为佳。将适当摩尔量的质粒pTA0006-upstream、pTA0613、pTA1315-downstream和pFDZ100混合于统一体系中，在适当的反应条件下由φBT1 integrase 催化发生串联重组，重组反应完成后，灭活整合酶并将反应产物转化大肠杆菌，阳性率不低于95％，即实现基因敲除载体的一步构建。 

本发明涉及的质粒pRT802[1)、pSET152[1]、pHZ1358[2]、pCY104[3]和pIJ6021[4]相关信息见对应参考文献；质粒pBC-SK(-)购于德国默克公司，pMD19-T购于宝生物工程(大连)有限公司；pZLB00、pZLB06、pZLB13、pZLB15、pZLP00、pZLP06、pZLP13、pZLP15、T-Bxbatt1-Bxbatt2、pFDZ100、pTA0006、pTA0613、pTA1315、pTA0006-upstream和pTA1315-downstream为本专利设计中构建。 

附图说明

图1：体外重组反应及交叉反应效率测算方法示意。以attB₀/attP₀、attB₆/attP₆重组反应和attB₀/attP₆、attB₆/attP₀交叉反应示意，白色菌落即为重组反应发生，蓝色菌落示意未发生。 

图2：大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pFDZ100结构图。其中： 

图3：含有整合位点attB₀和attP₆的TA克隆载体结构图。其中： 

图4为含有整合位点attB₆和attP₁₃的TA克隆载体结构图。其中： 

图5为含有整合位点attB₁₃和attP₁₅的TA克隆载体结构图。其中： 

图6为体外串联重组获取目的克隆示意。四组底物对attB₀/attP₀、attB₆/attP₆、attB₁₃/attP₁₃和attB₁₅/attP₁₅分别发生位点特异性重组，将四个独立的DNA分子串联拼接起来。 

具体实施方式

1、φBT1整合酶兼容底物对的获取及重组效率确定。 

(1)由于检测突变底物对反应效率之系列质粒构建：引物primer 1和primer 2互补，primer 3和primer 4互补，primer 5和primer 6互补，primer 7和primer 8互补；将上述引物溶解至终浓度为20μM，各取10μl与相应的互补引物混合后，与沸水中冷却退火，退火后，得到含有野生型和突变位点的双链DNA分子，且两端分别带有以EcoRI和HindIII消化后相同的末端。以EcoRI和HindIII酶切(体系：适量质粒，NEB“10×buffer”5μl，10×BSA5μl，限制性内切酶各1μl，以ddH₂O补充总体积至50μl)质粒pBC-SK(-)，酶切产物产物经0.7％的琼脂糖凝胶电泳后以GeneRay公司GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收，先将切下的凝胶块以三倍体积的Binding Solution混合，加热溶解后转移到离心柱中以3000rpm离心30sec，以500μl Wash Solution洗涤两次，加入50μl ddH₂O洗脱收集。将获得的pBC-SK(-)片段分别与上述四个小片段DNA以T4DNA ligase连接(体系为：质 粒骨架1.5μl，小片段片段7μl，10×ligation buffer 1μl，T4ligase 0.5μl)；连接过夜后将连接产物以CaCl₂法转化DH5α，抗性为氯霉素，并在培养基中加入IPTG和X-gal，37℃过夜培养。挑取蓝色菌落培养，以分子克隆实验指南所述碱法提取质粒DNA，限制性内切酶酶切(体系如上述)验证，筛选得到阳性克隆。即pZLB00、pZLB06、pZLB13和pZLB15。 

构建含有野生型和突变attP位点质粒：引物primer 9(SEQ No.9)和primer 10(SEQ No.10)分别为上下游引物，以pRT802为模板，获得含有attP位点的PCR产物后克隆到pMD19-T获得质粒pZLP00；以primer 9(SEQ No.9)和primer 11(SEQ No.11)获得质粒pZLP06；以primer 9(SEQ No.9)和primer 12(SEQ No.12)获得质粒pZLP13；以primer 9(SEQ No.9)和primer 13(SEQ No.13)获得质粒pZLP15。PCR扩增反应体系为：10×Taq DNAPolymerase buffer 5μl，10mM each dNTP 1μl，DNA模板、引物和Taq DNA Polymerase分别0.5μl，以ddH₂O补充总体积至50μl；PCR条件为，95℃预变性5min，95℃30sec/60℃30sec/72℃40sec循环30次，72℃保温10min；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后以时机和回收(如上述)。 

(2)体外重组反应：加入两种底物(pZLB00/pZLP00、pZLB06/pZLP06、pZLB13/pZLP13或者pZLB15/pZLP15)到0.5ml小离心管中，尽量保持两种底物(attB∶attP)的摩尔比为1∶4，加入1μl Recombination Buffer、0.5μlφBT1 integrase，以ddH₂O补充总体积至10μl；30℃温育0.5-2hrs，75℃高温灭活10min后转化感受态细胞，抗性为氯霉素，并在培养基中加入IPTG和X-gal，37℃过夜培养。 

(3)重组效率与交叉反应的确定：重组发生后，β-半乳糖苷酶基因α亚基的表达遭到破坏，使得菌落呈现白色。计算白色菌落占总菌落数的比例即可测算出重组反应发生的效率。每组反应经过三次验证，反应效率分别为：94.8％±1.8(pZLB00/pZLP00)、93.4％±1.2(pZLB06/pZLP06)、97.7％±1.8(pZLB13/pZLP13)和95.3％±0.5(pZLB15/pZLP15)，反应效率均大于90％，且未见交叉反应发生。 

2、用于基因敲除的整套入门载体的构建。 

(1)pFDZ100的构建：以限制性内切酶NheI和BglII酶切质粒T-Bxbatt1-Bxbatt2(体系：适量质粒，NEB“10×buffer”5μl，10×BSA5μl，限制性内切酶各1μl，以ddH₂O补充总体积至50μl)，获得大小为2049bp的DNA片段；琼脂糖凝胶电泳后割胶回收，以胶回收试剂盒纯化备用。取适量质粒pHZ1358，以限制性内切酶BamHI和XbaI消化，获得大小为9706bp的骨架片段；同样以试剂盒纯化备用。对回收纯化后的DNA片段做定量分析，然后按照摩尔比3∶1(目的片段：载体)用T4DNAligase连接过夜后转化感受态细胞，在含 有氨苄青霉素的抗性平板上培养过夜16hrs，挑取单菌落提取质粒DNA后以限制性内切酶EcoRI酶切验证，阳性克隆即为pFDZ100。将质粒DNA于零下20摄氏度冻存。 

(2)pTA0006，pTA0613和pTA1315的构建：该组质粒以带有的整合位点编号顺序命名，通过PCR引入整合位点，构建系列TA克隆载体。为方便筛选，以阿泊拉霉素抗性基因模板，在两端引入一对整合位点。以质粒pSET152为模板，用引物PT1(含有野生型attB位点)和PTF(含有突变位点attP₆)扩增得到两侧分别带有整合位点attB₀和attP₆的阿泊拉霉素抗性基因片段(PCR体系为：10×Taq DNA Polymerase buffer 5μl，10mM each dNTP 1μl，DNA模板、引物和Taq DNA Polymerase分别0.5μl，以ddH₂O补充总体积至50μl；PCR条件为，95℃预变性5min，95℃30sec/60℃30sec/72℃1min循环30次，72℃保温10min)，以PCR产物回收试剂盒回收片段(体系如上述)，保存备用。将该片段以TA克隆载体pMD19-T(TAKARA)连接过夜(体系为：pMD19-T载体0.5μl，PCR片段3μl，3.5μl Solution 1)，后转化感受态细胞，在氨苄青霉素和阿泊拉霉素双抗性平板上生长，筛选获取阳性克隆，测序验证整合位点序列的正确性；即获得含有一对整合位点的TA克隆载体pTA0006。使用相同的方法构建得到pTA0613和pTA1315。 

3、上游和下游同源臂序列的扩增和克隆。 

(1)同源臂序列的扩增：以天蓝色链霉菌基因组为模板，用引物primer 14和primer 15PCR扩增得到大小2108bp的上游同源臂片段，为保证扩增产物的正确性，选用Takara公司的高保真聚合酶(PrimerSTAR^TM HS DNA polymerase)进行扩增。PCR扩增体系为：5×PrimerSTAR^TM Buffer10μl，2.5mM each dNTP Mixture 4μl，DNA模板、引物和DNAPolymerase分别0.5μl，以ddH₂O补充总体积至50μl；PCR条件为，95℃预变性5min，98℃10sec/60℃10sec/72℃2min循环30次，72℃保温10min。用同样条件以引物primer 16和primer 17扩增得到大小2058bp的下游同源臂片段。扩增片段经Taq DNA polymerase加A后琼脂糖凝胶电泳分离，用胶回收试剂盒纯化保存(如上述)。 

(2)同源臂序列的克隆：载体pTA0006和pTA1315均含有限制性内切酶XcmI的识别位点(如附图3、附图5所示)，酶切后的DNA骨架片段含有3’-T的突出末端，可与含有3’-A突出末端的DNA片段互补，实现TA克隆。酶切pTA0006和pTA0315，与上述获得的PCR片段连接(体系如上述)。克隆筛选步骤如上述。最后获取质粒pTA0006-upstream和pTA1315-downstream，零下20摄氏度保存。 

4、体外一步重组克隆获取最终基因敲除载体。 

(1)载体的线性化：以限制性内切酶EcoRI和HindIII消化pTA0613，获得大小为1062bp的DNA片段，该片段含有突变位点attB₆、attP₁₃和阿泊拉霉素抗性基因(aac(3)IV)；以限制性内切酶ScaI(单一识别位点)消化pTA0006-upstream和pTA1315-downstream，分别获得大小为4937bp和4895bp的DNA片段。酶切体系及纯化回收如上述。 

(2)体外重组反应：将四种底物加入到0.5ml小离心管中，尽量保持四种底物的摩尔比为1∶1∶1∶1(具体为pFDZ100 1μl，pTA0613片段、pTA0006-upstream片段和pTA1315-downstream片段各2μl)，加入1μl Recombination Buffer、0.5μlφBT1 integrase，以ddH₂O补充总体积至10μl；为保证反应效率，30℃温育过夜；为除去大分子的联会复合体，反应过后用proteinase K于55℃处理30min，在于80℃灭活proteinase K 10min。处理完成的反应产物保存备用。 

(3)重组阳性克隆的筛选和鉴定：重组产物转化DH5α，涂布于含有氨苄青霉素和阿泊拉霉素的双抗固体培养基，37℃过夜培养。生长出来的克隆几乎为阳性克隆，经EcoRI酶切验证，阳性率不低于90％；进一步测序验证阳性克隆的正确性。即获得用于中断Act生产的基因打靶载体。 

参考文献： 

1.Gregory，M.A.，Till，R.and Smith，M.C.M.(2003)Integration site for StreptomycesphageφBT1 and development of site-specific integrating vectors.J Bacteriol.，185，5320-5323. 

2.Kieser，T.，Bibb，M.J.，Buttner，M.J.，Chater，K.F.and Hopwood，D.A.(2000)PracticalStreptomyces Genetics.The John Innes Foundation，Norwich，United Kingdom. 

3.Yao，W.S.，Yang，Y.L.and Chiao，J.S.(1994)Cloning Vector System for Nocardia Spp.Curr.Microbiol.，29，223-227. 

4.Takano，E.，White，J.，Thompson，C.J.and Bibb，M.J.(1995)Construction ofThiostrepton-Inducible，High-Copy-Number Expression Vectors for Use in Streptomyces Spp.Gene，166，133-137. 

序列表

序列表

<110>复旦大学

<120>一种基于位点特异性重组的基因打靶载体快速构建方法

<130>001

<160>32

<170>PatentIn version 3.3

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<212>DNA

<213>整合酶

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<213>整合酶

<400>10

gtgctgagta gtttcccatg gatcactgtc cagagac          37

<210>11

<211>37

<212>DNA

<213>整合酶

<400>11

gtgctgagta gtttcccatg gatcagtgtc cagagac          37

<210>12

<211>37

<212>DNA

<213>整合酶

<400>12

gtgctgagta gtttcccatg gatctgtgtc cagagac          37

<210>13

<211>37

<212>DNA

<213>整合酶

<400>13

gtgctgagta gtttcccatg gatcggtgtc cagagac                             37

<210>14

<211>72

<212>DNA

<213>整合酶

<400>14

agatctggtt tgtctggtca accaccgcgc tctcagtggt gtacggtaca aacccatcag    60

tgtggtccgc ct                                                        72

<210>15

<211>59

<212>DNA

<213>整合酶

<400>15

ccatggatca ctgtccagag acaacaaccc agcaccggga tccgcccgcg gagcggccg     59

<210>16

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<212>DNA

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<400>16

ctctggacag tgatccatgg gaaactactc agcacctacg ccccgccctg cca           53

<210>17

<211>28

<212>DNA

<213>整合酶

<400>17

tctagaaata ttttatctga ttaataag                                       28

<210>18

<211>59

<212>DNA

<213>整合酶

<400>18

tctagaccag gtttttgacg aaaccgatcc agatgatcca gctcggcgcc gcagccgtc     59

<210>19

<211>59

<212>DNA

<213>整合酶

<400>19

gatgatcctg acgacggaga ccgccgtcgt cgacaagccg gaaagttttg tcgtctttc    59

<210>20

<211>46

<212>DNA

<213>整合酶

<400>20

gtctccgtcg tcaggatcat ccgctagcat gtgcagctcc atcagc                  46

<210>21

<211>25

<212>DNA

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<400>21

tctagaccta gccaatcgac tggcg                                         25

<210>22

<211>6490

<212>DNA

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<400>22

ctagcggagt gtatactggc ttactatgtt ggcactgatg agggtgtcag tgaagtgctt   60

catgtggcag gagaaaaaag gctgcaccgg tgcgtcagca gaatatgtga tacaggatat  120

attccgcttc ctcgctcact gactcgctac gctcggtcgt tcgactgcgg cgagcggaaa  180

tggcttacga acggggcgga gatttcctgg aagatgccag gaagatactt aacagggaag  240

tgagagggcc gcggcaaagc cgtttttcca taggctccgc ccccctgaca agcatcacga  300

aatctgacgc tcaaatcagt ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt  360

tccccctggc ggctccctcg tgcgctctcc tgttcctgcc tttcggttta ccggtgtcat  420

tccgctgtta tggccgcgtt tgtctcattc cacgcctgac actcagttcc gggtaggcag  480

ttcgctccaa gctggactgt atgcacgaac cccccgttca gtccgaccgc tgcgccttat  540

ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg aaagacatgc aaaagcacca ctggcagcag  600

ccactggtaa ttgatttaga ggagttagtc ttgaagtcat gcgccggtta aggctaaact  660

gaaaggacaa gttttggtga ctgcgctcct ccaagccagt tacctcggtt caaagagttg  720

gtagctcaga gaaccttcga aaaaccgccc tgcaaggcgg ttttttcgtt ttcagagcaa  780

gagattacgc gcagaccaaa acgatctcaa gaagatcatc ttattaatca gataaaatat  840

ttctagaaat cgtcgacctg caggcatgca agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt  900

cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag  960

tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg 1020

cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg 1080

gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc 1140

tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc 1200

acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg 1260

aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat 1320

cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag 1380

gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga 1440

tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg    1500

tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt    1560

cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac    1620

gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc    1680

ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt    1740

ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc    1800

ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc    1860

agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg    1920

aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag    1980

atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg    2040

tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt    2100

tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca    2160

tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca    2220

gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc    2280

tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt    2340

ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg    2400

gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc    2460

aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg    2520

ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga    2580

tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga    2640

ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta    2700

aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg    2760

ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact    2820

ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata    2880

agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt    2940

tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa    3000

ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt    3060

atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct cgcgcgtttc    3120

ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg    3180

taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt    3240

cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg    3300

tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgcca ttcgccattc    3360

aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg    3420

gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca    3480

cgacgttgta aaacgacggc cagtgaattc gagctcggta cccggggatc ctctagagat    3540

tagatctggt ttgtctggtc aaccaccgcg ctctcagtgg tgtacggtac aaacccatca    3600

gtgtggtccg cctttcctgg gtggatcgtt cgcccaacgc cgccccggcc cgagggtgtc    3660

ggtgtcggtc agggacgcgg cggcgttgcg acgctccggc aagtctgggg cgctgcgctg    3720

acggcccgct gacggttggc tgacccccgg ggcgggacgc ccgccgggcg gggccgcggt    3780

cagtgagccg tcagcgcccg gtcaggggcc ccggccagac tcggtgcggc cggggggccc    3840

ggattcactc cccacacctg ccggccggca aaccgtccat cacgcgagga gcacacacgt    3900

ggtttcccgt ctccgccgcc gcaccaggcc caccgcacac cgcggccgct ccgcgggcgg    3960

atcccggtgc tgggttgttg tctctggaca gtgatccatg ggaaactact cagcacctac    4020

gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct gccgacatgg    4080

aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac cttgtcgcct    4140

tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat attggccacg    4200

tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa catattctca  4260

ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc ttgcgaatat  4320

atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga aaacgtttca  4380

gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac cagctcaccg  4440

tctttcattg ccatacggaa ttccggatga gcattcatca ggcgggcaag aatgtgaata  4500

aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc cgtaatatcc  4560

agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc aaaatgttct  4620

ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt ctccatttta  4680

gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag tgatcttatt  4740

tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt tcgccaaaag  4800

ttggcccagg gcttcccggt atcaacaggg acaccaggat ttatttattc tgcgaagtga  4860

tcttccgtca caggtattta ttcggcgcaa agtgcgtcgg gtgatgctgc caacttactg  4920

atttagtgta tgatggtgtt tttgaggtgc tccagtggct tctgtttcta tcagctgtcc  4980

ctcctgttca gctactgacg gggtggtgcg taacggcaaa agcaccgccg gacatcagcg  5040

ctagaccagg tttttgacga aaccgatcca gatgatccag ctcggcgccg cagccgtcgt  5100

cgccgccggt gtcccgctgg tcgcccttcc cgccgcccgc gcggacgatc gggggcacca  5160

cacccccgag gtccccggga acccggccgc gtccggcgcc cccgccgcct tcgacgagat  5220

cccgcaaaag cggcctttga ctccctgcaa gcctcagcga ccgaatatat cggttatgcg  5280

tgggcgatgg ttgttgtcat tgtcggcgca actatcggta tcaagctgtt taagaaattc  5340

acctcgaaag caagctgata aaccgataca attaaaggct ccttttggag cctttttttt  5400

tggagatttt caacgtgaaa aaattattat tcgcaattcc tttagttgtt cctttctatt  5460

ctcactccgc tgaaactgtt gaaagttgtt tagcaaaacc tcatacagaa aattcattta  5520

ctaacgtctg gaaagacgac aaaactttcc ggcttgtcga cgacggcggt ctccgtcgtc  5580

aggatcatcc gctagcatgt gcagctccat cagcaaaagg ggatgataag tttatcacca  5640

ccgactattt gcaacagtgc cgttgatcgt gctatgatcg actgatgtca tcagcggtgg  5700

agtgcaatgt cgtgcaatac gaatggcgaa aagccgagct catcggtcag cttctcaacc  5760

ttggggttac ccccggcggt gtgctgctgg tccacagctc cttccgtagc gtccggcccc  5820

tcgaagatgg gccacttgga ctgatcgagg ccctgcgtgc tgcgctgggt ccgggaggga  5880

cgctcgtcat gccctcgtgg tcaggtctgg acgacgagcc gttcgatcct gccacgtcgc  5940

ccgttacacc ggaccttgga gttgtctctg acacattctg gcgcctgcca aatgtaaagc  6000

gcagcgccca tccatttgcc tttgcggcag cggggccaca ggcagagcag atcatctctg  6060

atccattgcc cctgccacct cactcgcctg caagcccggt cgcccgtgtc catgaactcg  6120

atgggcaggt acttctcctc ggcgtgggac acgatgccaa cacgacgctg catcttgccg  6180

agttgatggc aaaggttccc tatggggtgc cgagacactg caccattctt caggatggca  6240

agttggtacg cgtcgattat ctcgagaatg accactgctg tgagcgcttt gccttggcgg  6300

acaggtggct caaggagaag agccttcaga aggaaggtcc agtcggtcat gcctttgctc  6360

ggttgatccg ctcccgcgac attgtggcga cagccctggg tcaactgggc cgagatccgt  6420

tgatcttcct gcatccgcca gaggcgggat gcgaagaatg cgatgccgct cgccagtcga  6480

ttggctaggt                                                         6490

<210>23

<211>11755

<212>DNA

<213>整合酶

<400>23

tggtttgtct ggtcaaccac cgcgctctca gtggtgtacg gtacaaaccc atcagtgtgg    60

tccgcctttc ctgggtggat cgttcgccca acgccgcccc ggcccgaggg tgtcggtgtc     120

ggtcagggac gcggcggcgt tgcgacgctc cggcaagtct ggggcgctgc gctgacggcc     180

cgctgacggt tggctgaccc ccggggcggg acgcccgccg ggcggggccg cggtcagtga     240

gccgtcagcg cccggtcagg ggccccggcc agactcggtg cggccggggg gcccggattc     300

actccccaca cctgccggcc ggcaaaccgt ccatcacgcg aggagcacac acgtggtttc     360

ccgtctccgc cgccgcacca ggcccaccgc acaccgcggc cgctccgcgg gcggatcccg     420

gtgctgggtt gttgtctctg gacagtgatc catgggaaac tactcagcac ctacgccccg     480

ccctgccact catcgcagta ctgttgtaat tcattaagca ttctgccgac atggaagcca     540

tcacagacgg catgatgaac ctgaatcgcc agcggcatca gcaccttgtc gccttgcgta     600

taatatttgc ccatggtgaa aacgggggcg aagaagttgt ccatattggc cacgtttaaa     660

tcaaaactgg tgaaactcac ccagggattg gctgagacga aaaacatatt ctcaataaac     720

cctttaggga aataggccag gttttcaccg taacacgcca catcttgcga atatatgtgt     780

agaaactgcc ggaaatcgtc gtggtattca ctccagagcg atgaaaacgt ttcagtttgc     840

tcatggaaaa cggtgtaaca agggtgaaca ctatcccata tcaccagctc accgtctttc     900

attgccatac ggaattccgg atgagcattc atcaggcggg caagaatgtg aataaaggcc     960

ggataaaact tgtgcttatt tttctttacg gtctttaaaa aggccgtaat atccagctga    1020

acggtctggt tataggtaca ttgagcaact gactgaaatg cctcaaaatg ttctttacga    1080

tgccattggg atatatcaac ggtggtatat ccagtgattt ttttctccat tttagcttcc    1140

ttagctcctg aaaatctcga taactcaaaa aatacgcccg gtagtgatct tatttcatta    1200

tggtgaaagt tggaacctct tacgtgccga tcaacgtctc attttcgcca aaagttggcc    1260

cagggcttcc cggtatcaac agggacacca ggatttattt attctgcgaa gtgatcttcc    1320

gtcacaggta tttattcggc gcaaagtgcg tcgggtgatg ctgccaactt actgatttag    1380

tgtatgatgg tgtttttgag gtgctccagt ggcttctgtt tctatcagct gtccctcctg    1440

ttcagctact gacggggtgg tgcgtaacgg caaaagcacc gccggacatc agcgctagac    1500

caggtttttg acgaaaccga tccagatgat ccagctcggc gccgcagccg tcgtcgccgc    1560

cggtgtcccg ctggtcgccc ttcccgccgc ccgcgcggac gatcgggggc accacacccc    1620

cgaggtcccc gggaacccgg ccgcgtccgg cgcccccgcc gccttcgacg agatcccgca    1680

aaagcggcct ttgactccct gcaagcctca gcgaccgaat atatcggtta tgcgtgggcg    1740

atggttgttg tcattgtcgg cgcaactatc ggtatcaagc tgtttaagaa attcacctcg    1800

aaagcaagct gataaaccga tacaattaaa ggctcctttt ggagcctttt tttttggaga    1860

ttttcaacgt gaaaaaatta ttattcgcaa ttcctttagt tgttcctttc tattctcact    1920

ccgctgaaac tgttgaaagt tgtttagcaa aacctcatac agaaaattca tttactaacg    1980

tctggaaaga cgacaaaact ttccggcttg tcgacgacgg cggtctccgt cgtcaggatc    2040

atccgctaga gtcgacctgc aggtccccgg ggatcggtct tgccttgctc gtcggtgatg    2100

tacttcacca gctccgcgaa gtcgctcttc ttgatggagc gcatggggac gtgcttggca    2160

atcacgcgca ccccccggcc gttttagcgg ctaaaaaagt catggctctg ccctcgggcg    2220

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ctcatctgtt acgccggcgg tagccggcca gcctcgcaga gcaggattcc cgttgagcac    2640

cgccaggtgc gaataaggga cagtgaagaa ggaacacccg ctcgcgggtg ggcctacttc    2700

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aaacgcaagc gcaaagagaa agcaggtagc ttgcagtggg cttacatggc gatagctaga    3060

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ggttgggaag ccctgcaaag taaactggat ggctttcttg ccgccaagga tctgatggcg    3180

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ccagccgatc cggattgtcc ccgagttcct tcacggaaat gtcgccatcc gccttgagcg    3600

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cgacgggaag ggagaagacg taacctcggc tggccctttg gagacgccgg tccgcgatgc    3720

tggtgatgtc actgtcgacc aggatgatcc ccgacgctcc gagcgcgagc gacgtgcgta    3780

ctatcgcgcc gatgttcccg acgatcttca ccccgtcgag aacgacgacg tccccacgcc    3840

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accaccgacc gcgaccgcgc catggccgcc gccgacggcc tggtcgccgc cgccgcccgc    4560

cggttcggcg cctgacccga ccaacccccg cggggcgccg gcacttcgtg ctggcgcccc    4620

gcccccaccc accaggagac cgaccatgac cgacttcgac ggacgcctga ccgaggggac    4680

cgtgaacctg gtccaggacc cacaacggcg gtggctggtc cgcccactgc gctgagcccg    4740

gttgcgactg ggccgacttc gccggaccgc tcggcttcca gggcctcgtg gccatcgctc    4800

gccgacacac gcactgaccg cacgtcaaag ccccgccgga tcaccggcgg ggctctcttc    4860

ggccctccaa gtcacaccag ccccaagggg cgtcgggagt ggcggaggga acctctggcc    4920

cgattggtgc caggattccc accagaccaa agagcaacgg gccggacttc gcacctccga    4980

cccgtccgct cccagactcg cgccccttag ccgggcgaga caggaacgtt gctcgtgccc    5040

agagtacgga gcgatgccga ggcattgcca gatcggcccg ccgggccccg ctgccactgc    5100

gggaccgcaa ttgcccacac accgggcaaa cggccgcgta tctactgctc agaccgctgc    5160

cggatggcag cgaagcgggc gatcgcgcgt gtgacgcgag atgccgcccg aggcaaaagc    5220

gaacaccttg ggaaagaaac aacagagttt cccgcacccc tccgacctgc ggtttctccg    5280

gacggggtgg atggggagag cccgagaggc gacagcctct cggaagtagg aagcacgtcg    5340

cggagcgacg ctgcccgact gcggaaagcc gcccggtaca gccgccgccg gacgctgtgg    5400

cggatcagcg gggacgccgc gtgcaagggc tgcggccgcg ccctgatgga ccctgcctcc    5460

ggcgtgatcg tcgcccagac ggcggccgga acgtccgtgg tcctgggcct gatgcggtgc    5520

gggcggatct ggctctgccc ggtctgcgcc gccacgatcc ggcacaagcg ggccgaggag    5580

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acggcccgcc atgggcacac ggaccggctc gcggacctca tggacgccct ccagggcacc    5700

cggaagacgc cggacagccc ccggcggccg ggcgcctacc agcgactgat cacgggcggc    5760

acgtgggccg gacgccgggc caaggacggg caccgggccg ccgaccgcga gggcatccga    5820

gaccggatcg ggtacgtcgg catgatccgc gcgaccgaag tcaccgtggg gcagatcaac    5880

ggctggcacc cgcacatcca cgcgatcgtc ctggtcggcg gccggaccga gggggagcgg    5940

tccgcgaagc agatcgtcgc caccttcgag ccgaccggcg ccgcgctcga cgagtggcag    6000

gggcactggc ggtccgtgtg gaccgccgcc ctgcgcaagg tcaaccccgc cttcacgccc    6060

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ctctcgcgct ggcacgagta cgagcgggca acccggggac gccgggccat cgaatggacc    6360

cgctacctgc ggcagatgct cgggctcgac ggcggcgaca ccgaggccga cgacctcgat    6420

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gacggatggc acgcggtcac ccgccgcgcc ctcgacctcg aggcgacccg ggccgccgaa    6540

ggcaaggacg gcaacgagga ttcggcggcc gtgggcgaac gggtgcggga ggtcctggcg    6600

ctggccgacg cggccgacac agtggtggtg ctcacggcgg gggaggtggc cgaggcgtac    6660

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atcgcccggc tcgcaagtgg gcccacttcg cactaactcg ctcccccccg ccgtacgtca    6840

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ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct    7680

gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg    7740

cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt    7800

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tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc    7920

gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga    7980

tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg    8040

catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat    8100

ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg    8160

ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc    8220

tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta    8280

tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg actctggggt tcgaaatgac cgaccaagcg    8340

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ttcggaatcg ttttccggga cgccggctgg atgatcctcc agcgcgggga tctcatgctg    8460

gagttcttcg cccaccccgg gctcgatccc ctcgcgagtt ggttcagctg ctgcctgagg    8520

ctggacgacc tcgcggagtt ctaccggcag tgcaaatccg tcggcatcca ggaaaccagc    8580

agcggctatc cgcgcatcca tgcccccgaa ctgcaggagt ggggaggcac gatggccgct    8640

ttggtccgga tctttgtgaa ggaaccttac ttctgtggtg tgacataatt ggacaaacta    8700

cctacagaga tttaaagctc taaggtaaat ataaaatttt taagtgtata atgtgttaaa    8760

ctactgattc taattgtttg tgtattttag attccaacct atggaactga tgaatgggag    8820

cagtggtgga atgcctttaa tgaggaaaac ctgttttgct cagaagaaat gccatctagt    8880

gatgatgagg ctactgctga ctctcaacat tctactcctc caaaaaagaa gagaaaggta    8940

gaagacccca aggactttcc ttcagaattg ctaagttttt tgagtcatgc tgtgtttagt    9000

aatagaactc ttgcttgctt tgctatttac accacaaagg aaaaagctgc actgctatac    9060

aagaaaatta tggaaaaata ttctgtaacc tttataagta ggcataacag ttataatcat    9120

aacatactgt tttttcttac tccacacagg catagagtgt ctgctattaa taactatgct    9180

caaaaattgt gtacctttag ctttttaatt tgtaaagggg ttaataagga atatttgatg    9240

tatagtgcct tgactagaga tcataatcag ccataccaca tttgtagagg ttttacttgc    9300

tttaaaaaac ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt    9360

tgttaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt    9420

cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt    9480

atcttatcat gtctggatct gacgggtgcg catgatcgtg ctcctgtcgt tgaggacccg    9540

gctaggctgg cggggttgcc ttactggtta gcagaatgaa tcaccgatac gcgagcgaac    9600

gtgaagcgac tgctgctgca aaacgtctgc gacctgagca acaacatgaa tggtcttcgg    9660

tttccgtgtt tcgtaaagtc tggaaacgcg gaagtcagcg ctcttccgct tcctcgctca    9720

ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg    9780

taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc    9840

agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca    9900

taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa    9960

cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc   10020

tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc   10080

gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct   10140

gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg   10200

tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag   10260

gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta   10320

cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg   10380

aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt   10440

tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt   10500

ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag   10560

attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat   10620

ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc   10680

tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat   10740

aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc   10800

acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag   10860

aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag   10920

agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgctg caggcatcgt   10980

ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg   11040

agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt   11100

tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc 11160

tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc 11220

attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa cacgggataa 11280

taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg 11340

aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc 11400

caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag 11460

gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt 11520

cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 11580

tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc 11640

acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac 11700

gaggcccttt cgtcttcaag aattcgcggc cgcaattaac cctcactaaa ggatc      11755

<210>24

<211>66

<212>DNA

<213>整合酶

<400>24

gaccaggttt ttgacgaaag tgatccagat gatccagctc tacactggtt catgtgcagc    60

tccatc                                                               66

<210>25

<211>77

<212>DNA

<213>整合酶

<400>25

ggtgctgagt agtttcccat ggatcagtgt ccagagacaa caacccagca ctcgaatggc    60

tcagccaatc gactggc                                                   77

<210>26

<211>3695

<212>DNA

<213>整合酶

<400>26

agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg   60

gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta  120

gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg  180

aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagct  240

tgcatgcctg caggtcgacg atgaccaggt ttttgacgaa agtgatccag atgatccagc  300

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actatttgca acagtgccgt tgatcgtgct atgatcgact gatgtcatca gcggtggagt  420

gcaatgtcgt gcaatacgaa tggcgaaaag ccgagctcat cggtcagctt ctcaaccttg  480

gggttacccc cggcggtgtg ctgctggtcc acagctcctt ccgtagcgtc cggcccctcg  540

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tcgtcatgcc ctcgtggtca ggtctggacg acgagccgtt cgatcctgcc acgtcgcccg  660

ttacaccgga ccttggagtt gtctctgaca cattctggcg cctgccaaat gtaaagcgca  720

gcgcccatcc atttgccttt gcggcagcgg ggccacaggc agagcagatc atctctgatc     780

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ggcaggtact tctcctcggc gtgggacacg atgccaacac gacgctgcat cttgccgagt     900

tgatggcaaa ggttccctat ggggtgccga gacactgcac cattcttcag gatggcaagt     960

tggtacgcgt cgattatctc gagaatgacc actgctgtga gcgctttgcc ttggcggaca    1020

ggtggctcaa ggagaagagc cttcagaagg aaggtccagt cggtcatgcc tttgctcggt    1080

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tcttcctgca tccgccagag gcgggatgcg aagaatgcga tgccgctcgc cagtcgattg    1200

gctgagccat tcgagtgctg ggttgttgtc tctggacact gatccatggg aaactactca    1260

gcaccatctc tagaggatcc ccgggtaccg agctcgaatt cactggccgt cgttttacaa    1320

cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct    1380

ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc    1440

agcctgaatg gcgaatggcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt    1500

tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag    1560

ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc    1620

gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca    1680

tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc    1740

atgataataa tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc    1800

cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc    1860

tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc    1920

gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg    1980

gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat    2040

ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc    2100

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gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg    2760

tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa    2820

aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt    2880

tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt    2940

tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt    3000

ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag    3060

ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta    3120

gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat    3180

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ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg    3300

agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac    3360

aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga    3420

aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt    3480

ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta  3540

cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat  3600

tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg  3660

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<210>27

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<212>DNA

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<400>27

gaccaggttt ttgacgaaac tgatccagat gatccagctc tacactggtt catgtgcagc     60

tccatcagca aaaggggatg ataagtttat caccaccgac tatttgcaac agtgccgttg    120

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gcgaaaagcc gagctcatcg gtcagcttct caaccttggg gttacccccg gcggtgtgct    240

gctggtccac agctccttcc gtagcgtccg gcccctcgaa gatgggccac ttggactgat    300

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ggcgacagcc ctgggtcaac tgggccgaga tccgttgatc ttcctgcatc cgccagaggc    900

gggatgcgaa gaatgcgatg ccgctcgcca gtcgattggc tgagccattc gagtgctggg    960

ttgttgtctc tggacacaga tccatgggaa actactcagc accaatcgtc gacctgcagg   1020

catgcaagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc   1080

acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga   1140

gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg   1200

tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg   1260

cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg   1320

gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga   1380

aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg   1440

gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag   1500

aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc   1560

gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg   1620

ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt   1680

cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc   1740

ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc   1800

actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg   1860

tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca   1920

gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc   1980

ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat   2040

cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt   2100

ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt   2160

tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc  2220

agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc  2280

gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata  2340

ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg  2400

gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc  2460

cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct  2520

acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa  2580

cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt  2640

cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca  2700

ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac  2760

tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca  2820

atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt  2880

tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc  2940

actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca  3000

aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata  3060

ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc  3120

ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc  3180

cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat  3240

aggcgtatca cgaggccctt tcgtctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga  3300

cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa  3360

gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gctggcttaa ctatgcggca  3420

tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta  3480

aggagaaaat accgcatcag gcgccattcg ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg  3540

cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg  3600

cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt  3660

gaattcgagc tcggtacccg gggatcctct agagatt                           3697

<210>28

<211>3695

<212>DNA

<213>整合酶

<400>28

agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg     60

gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta    120

gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg    180

aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagct    240

tgcatgcctg caggtcgacg atgaccaggt ttttgacgaa actgatccag atgatccagc    300

tctacactgg ttcatgtgca gctccatcag caaaagggga tgataagttt atcaccaccg    360

actatttgca acagtgccgt tgatcgtgct atgatcgact gatgtcatca gcggtggagt    420

gcaatgtcgt gcaatacgaa tggcgaaaag ccgagctcat cggtcagctt ctcaaccttg    480

gggttacccc cggcggtgtg ctgctggtcc acagctcctt ccgtagcgtc cggcccctcg    540

aagatgggcc acttggactg atcgaggccc tgcgtgctgc gctgggtccg ggagggacgc    600

tcgtcatgcc ctcgtggtca ggtctggacg acgagccgtt cgatcctgcc acgtcgcccg    660

ttacaccgga ccttggagtt gtctctgaca cattctggcg cctgccaaat gtaaagcgca    720

gcgcccatcc atttgccttt gcggcagcgg ggccacaggc agagcagatc atctctgatc    780

cattgcccct gccacctcac tcgcctgcaa gcccggtcgc ccgtgtccat gaactcgatg    840

ggcaggtact tctcctcggc gtgggacacg atgccaacac gacgctgcat cttgccgagt     900

tgatggcaaa ggttccctat ggggtgccga gacactgcac cattcttcag gatggcaagt     960

tggtacgcgt cgattatctc gagaatgacc actgctgtga gcgctttgcc ttggcggaca    1020

ggtggctcaa ggagaagagc cttcagaagg aaggtccagt cggtcatgcc tttgctcggt    1080

tgatccgctc ccgcgacatt gtggcgacag ccctgggtca actgggccga gatccgttga    1140

tcttcctgca tccgccagag gcgggatgcg aagaatgcga tgccgctcgc cagtcgattg    1200

gctgagccat tcgagtgctg ggttgttgtc tctggacaca gatccatggg aaactactca    1260

gcaccatctc tagaggatcc ccgggtaccg agctcgaatt cactggccgt cgttttacaa    1320

cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct    1380

ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc    1440

agcctgaatg gcgaatggcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt    1500

tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag    1560

ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc    1620

gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca    1680

tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc    1740

atgataataa tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc    1800

cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc    1860

tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc    1920

gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg    1980

gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat    2040

ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc    2100

acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa    2160

ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa    2220

aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt    2280

gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct    2340

tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat    2400

gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg    2460

cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg    2520

atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt    2580

attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg    2640

ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg    2700

gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg    2760

tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa    2820

aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt    2880

tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt    2940

tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt    3000

ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag    3060

ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta    3120

gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat    3180

aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg    3240

ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg    3300

agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac    3360

aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga    3420

aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt    3480

ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta    3540

cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat    3600

tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg  3660

accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcgga                             3695

<210>29

<211>20

<212>DNA

<213>整合酶

<400>29

gccaccatct ccgccacctc    20

<210>30

<211>20

<212>DNA

<213>整合酶

<400>30

accgcagctt ccgctccctg    20

<210>31

<211>20

<212>DNA

<213>整合酶

<400>31

gtctgcctgg ctcgtacggc    20

<210>32

<211>21

<212>DNA

<213>整合酶

<400>32

ctcggacggc tcgggatgat c  21

 

Claims (6)

1.一组突变的φBT1整合酶识别的重组位点序列，其特征在于为attP₆、attP₁₃、attP₁₅和attB₆、attB₁₃、attB₁₅位点，其序列依次如SEQ No.11、SEQ No.12、SEQ No.13以及SEQ No.3、SEQ No.5和SEQ No.7所示。

2.一个重组克隆骨架质粒，其特征在于为基于权利要求1所述的突变的φBT1整合酶识别的重组位点序列所构建，其序列如SEQ No.23所示，记为pFDZ100。

3.一种构建权利要求2所述重组克隆骨架质粒的方法，其特征在于具体步骤如下：

以限制性内切酶BamHI和XbaI酶切质粒pHZ1358，获得大小为9706bp的骨架片段；以限制性内切酶NheI和BglII酶切质粒T-Bxbatt1-Bxbatt2，其序列如SEQ No.22所示，获得大小为2049bp的DNA片段；将两片段连接，即得到可实现大肠杆菌-天蓝色链霉菌穿梭的骨架载体pFDZ100。

4.利用权利要求1所述的突变的φBT1整合酶识别的重组位点序列所构建的重组克隆入门质粒，其特征在于其序列为SEQ No.17、SEQ No.18或SEQ No.19所示，依次记为pTA0006、pTA0613和pTA1315。

5.一种构建权利要求4所述重组克隆入门质粒的方法，其特征在于具体步骤如下：

以质粒pSET152为模板，用引物PT1和PTF扩增得到两侧分别带有整合位点attB₀和attP₆的抗性基因片段，将该片段克隆到pMD19-T载体上，即得到用于携带上游片段的载体pTA0006；同样以PCR扩增的方法获得含有整合位点attB₆和attP₁₃的抗性基因片段，克隆到pMD19-T得载体pTA0613，以及含有attB₁₃和attP₁₅的抗性基因片段，克隆到pMD19-T得载体pTA1315；其中：

引物PT1的序列为SEQNo.15，引物PTF的序列为SEQNo.16；载体pTA0006的序列为SEQ No.26；载体pTA0613的序列为SEQ No.27，载体pTA1315的序列为SEQ No.28。

6.利用权利要求2和4所述质粒与φBT1整合酶实现体外一步串联重组构建基因打靶载体的方法，其特征在于具体步骤如下：

将适当摩尔量的质粒pTA0006-upstream、pTA0613、pTA1315-downstream和pFDZ100混合于统一体系中，在合适的反应条件下由φBT1整合酶催化发生串联重组，重组反应完成后，灭活整合酶并将反应产物转化大肠杆菌，阳性率不低于95％；其中：

质粒pTA0006-upstream由下述方法制备获得：以天蓝色链霉菌基因组为模板，用引物SEQ No.29和SEQ No.30扩增，得到含有actlll和actl部分基因的上游同源臂片段，将该片段插入到载体pTA0006即序列SEQ No.26中，即获得质粒pTA0006-upstream；

质粒pTA1315-downstream由下述方法制备获得：以天蓝色链霉菌基因组为模板，用引物SEQ No.31和SEQ No.32扩增，得到含有部分actVB的基因的下游同源臂片段，将该片段插入到载体pTA1315即序列SEQ No.28中，即获得质粒pTA1315-downstream

质粒pTA0613的序列为SEQ No.27，质粒pFDZ100的序列为SEQ No.23。

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