CN115873899A - 肝母细胞瘤动物模型、其构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本公开涉及一种肝母细胞瘤动物模型、其构建方法及其应用。所述动物通过导入基因转移载体进行制备，其中所述基因转移载体选自：(1)所述基因转移载体包含转座子表达载体以及表达转座酶的辅助质粒，其中，所述转座子表达载体包含转座子5’末端重复序列和转座子3’末端重复序列以及在两者之间的多克隆插入位点，所述辅助质粒包含转座酶编码基因及其启动子；或(2)所述基因转移载体包含转座子5’末端重复序列和3’末端重复序列以及在两者之间的多克隆插入位点、转座酶编码序列以及控制所述转座酶表达的启动子。本公开的肝母细胞瘤动物及其原代肿瘤细胞在筛选或评价肝母细胞瘤药物等领域具有广泛的应用前景。

Description

肝母细胞瘤动物模型、其构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及生命科学和生物技术领域，具体涉及肝母细胞瘤动物模型、其构建方法及其应用。

背景技术

肝母细胞瘤(Hepatoblastoma，HB)是儿童中最常见的肝脏恶性肿瘤，其大多发生于3岁以下的婴幼儿，常为散发病例，然而其中一些病例报道与先天遗传变异、畸形、以及Beckeith-Widedmann综合征和家族性腺瘤性息肉病等家族性癌症相关。近来全球范围内HB发病率的增长速度高于所有其他儿童恶性肿瘤。该疾病的5年存活率在发达国家中约为80％，但对于复发或难治的HB患者存活率低于50％，其具有更复杂的肿瘤生物学特征，如肝细胞癌样的突变特征和侵袭能力，导致化疗耐药、血管侵袭和肿瘤的转移扩散。目前HB的致病机理尚未十分清楚，现有的治疗方案不能够有效缓解高风险HB的进展，因此，深入研究HB发病的分子机制对HB的治疗具有重要意义。目前对于HB治疗相关的研究进展缓慢，其主要限制因素之一为缺乏有效的临床前模型。有效的动物模型有助于探索HB的发生、发展过程，为HB药物开发和筛选提供适宜的平台。

目前临床前研究HB常用的小鼠模型包括通过移植人肿瘤细胞或病人来源的肿瘤组织到受体免疫缺陷小鼠的移植瘤模型(patient-derived xenografts,PDX)(Schnater JM,Bruder E,Bertschin S,et al.Subcutaneous and intrahepatic growth of humanhepatoblastoma in immunodeficient mice[J].Journal of Hepatology,2006,45(3):377-386；Fuchs J,DSchmidt,Pietsch T,et al.Successful transplantation of humanhepatoblastoma into immunodeficient mice[J].Journal of Pediatric Surgery,1996,31(9):1241.)，通过激活原癌基因或失活抑癌基因来诱导肿瘤发生的遗传工程小鼠，以研究特异基因在肿瘤起始和发展中的作用机制(Lin28b Is Sufficient to DriveLiver Cancer and Necessary for Its Maintenance in Murine Models[J].CancerCell,2014,26(2):248-261.)以及尾静脉液态高压注射模型(Tao J,Calvisi D F,Ranganathan S,et al.Activation ofβ-Catenin and Yap1 in Human Hepatoblastomaand Induction of Hepatocarcinogenesis in Mice[J].Gastroenterology,2014,147(3):690-701.)。

在目前已有的临床前模型中，移植瘤模型为避免小鼠自身免疫系统对人源肿瘤细胞或组织的排异反应，受体小鼠一般采用免疫缺陷型小鼠，这类小鼠不能模拟完整的免疫反应以及肿瘤微环境中各种细胞因子、趋化因子关联的信号通路，不能用于肿瘤免疫治疗的研究。

对于遗传工程小鼠而言，首先构建生殖系敲除或转基因小鼠耗时且成本较高。其次，大多数情况下重要原癌基因或抑癌基因对胚胎的发育必不可少，在生殖系过表达或失活这些基因将导致胚胎致死或发育畸形，阻止其在肝脏的功能研究。为避免该缺陷，可利用组织特异的启动子实现基因的组织特异表达，或利用四环素控制系统和Cre-Lox重组系统等条件性诱导基因在特定时间的表达。

1999年Liu等人首次将编码基因的质粒DNA通过尾静脉液态高压注射到小鼠肝脏，实现外源基因在小鼠肝细胞的表达(Liu F,Song Y,Liu D.Hydrodynamics-basedtransfection in animals by systemic administration of plasmid DNA[J].GeneTher,1999,6(7):1258-66)。该方法主要过程是将约占小鼠体重10％体积的大量质粒DNA溶液在5-7秒时间内快速注射入小鼠尾静脉，质粒溶液在下腔静脉形成瞬时高压而经肝静脉逆流入肝脏中，而此时与肝实质细胞紧密连接的毛细血管内皮的屏障被打破，因此质粒DNA被吸收并滞留在肝实质细胞中。Liu等人发现转染的DNA主要被肝脏所吸收(效率达10％-40％)，而在其他器官如肾脏、脾脏、心脏和肺中的转染极低，不到肝脏的0.1％。因此，该方法能实现外源基因在肝脏相对特异的表达。此外，外源基因在肝脏的表达是瞬时的，在转染后8小时表达量最高，随后急速下降。该方法与转座子系统结合可以实现外源基因稳定整合到小鼠肝细胞基因组中，从而实现基因长期稳定表达，诱导肝脏肿瘤的发生。尾静脉液态高压注射方法诱导小鼠肝癌模型体现出一定的优势，该方法经济，操作简单，并诱导肝脏原发肿瘤发生，避免转基因或敲除小鼠的较长周期的操作和繁殖，避免使用免疫缺陷的小鼠。另外可以同时注射不同基因的质粒，来研究肿瘤起始过程中多种信号通路之间的相互作用。

原癌基因MYC编码的蛋白在细胞周期进程、凋亡和细胞转化中发挥重要作用。MYC与相关转录因子MAX形成异二聚体复合物，该复合物与E-box序列结合并调节特定靶基因到转录。MYC基因主要通过扩增和染色体易位重排的方式激活，在包括肝癌在内的多种人类癌症中常观察到MYC基因的扩增。

FGF19编码的蛋白质是成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor,FGF)家族的成员。FGF家族成员具有广泛的促有丝分裂和细胞存活活性，参与胚胎发育、细胞生长、形态发生、组织修复、肿瘤生长和侵袭等多种生物学过程。研究报道FGF19基因扩增是肝细胞癌的驱动因素之一，此外在肝母细胞瘤中，FGF19作为自分泌生长因子影响肿瘤的进展(Elzi D J,SongM,Blackman B,et al.FGF19 functions as autocrine growth factorfor hepatoblastoma[J].Genes&cancer,2016,7(3-4):125.)。

CCND1蛋白属于高度保守的细胞周期蛋白家族，其与CDK4或CDK6形成复合物并作为其调节亚单位发挥作用，调节细胞周期G1/S转换。CCND1已被证明与抑癌蛋白Rb相互作用，且其表达受到Rb的正调控。该基因的突变、扩增和过表达常出现在多种人类癌症中。

但是，目前已有的HB相关的尾静脉液态高压注射模型研究较为有限，仅报道Myc(Chow EK et al，2012)，Yap/β-catenin(Tao et al，2014)，以及Myc/Yap(Yamamoto M etal，2017)诱导HB发生。因此，在本领域中构建新的HB模型，深入探索HB发生发展的分子机制，为HB的治疗提供药物筛选平台具有重要意义。

发明内容

鉴于本领域有限的临床前模型，本发明的目的在于提供一种诱导肝母细胞瘤的基因组合及其应用。利用所述基因组合得到的原发性肝母细胞瘤模型以及原代肿瘤细胞在筛选或评价肝母细胞瘤药物等领域具有广泛的应用前景。

在一方面，本公开提供了一种基因转移载体，其选自：

(1)所述基因转移载体包含转座子表达载体以及表达转座酶的辅助质粒，其中，所述转座子表达载体包含转座子5’末端重复序列和转座子3’末端重复序列以及在两者之间的多克隆插入位点，所述辅助质粒包含转座酶编码基因及其启动子；或

(2)所述基因转移载体包含转座子5’末端重复序列和3’末端重复序列以及在两者之间的多克隆插入位点、转座酶编码序列以及控制所述转座酶表达的启动子；

其中，所述多克隆插入位点用于可操作地插入外源基因编码序列以及可选的控制外源基因表达的启动子；所述外源基因选自癌基因和FGF基因中的一种或多种。

在另一方面，本公开提供了一种建立肝母细胞瘤动物模型的方法，其包括：

(1)构建所述的基因转移载体；

(2)将步骤(1)构建的基因转移载体导入动物，获得携带肝母细胞瘤的动物。

在另一方面，本公开提供了转基因动物的肿瘤细胞或组织，其来自由所述的方法所制备的动物。

在另一方面，本公开提供了一种筛选用于治疗肝母细胞瘤的药物候选物的方法其包括：

(1)将药物候选物施用于所述的方法所制备的动物或所述的细胞或组织；

(2)测量所述肝母细胞瘤的肿瘤细胞对所述治疗的响应。

在另一方面，本公开提供了构建的动物在肝母细胞瘤相关研究中的应用。

附图说明

图1示出了构建肝母细胞瘤动物模型的主要流程。

图2示出了模型构建相关质粒。

图3示出了PB转座质粒表达的免疫印迹检测结果。

图4示出了PB转座质粒在小鼠体内短期表达检测结果。

图5示出了MYC+FGF19/CCND1诱导小鼠肝脏肿瘤的肝脏外观图以及成瘤情况。其中，图5A示出了MYC+F/C诱导小鼠肝母细胞瘤的小鼠的肝脏外观图如图。图5B示出了成瘤情况统计。

图6示出了肝母细胞瘤模型小鼠肝脏的HE染色情况。

图7示出了肝母细胞瘤模型小鼠肝脏的免疫组化染色情况。

图8示出了肝母细胞瘤模型的原代肿瘤细胞对不同药物的响应情况。其中，图8A示出了在用药物处理0h、24h、48h和72h后分别测量对应时间点的细胞活力。图8B示出了用不同浓度的药物处理72h后三种细胞的IC50。

具体实施方式

在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所用的，“转座酶”是催化从供体多核苷酸(例如载体)切除相应转座子，并且随后将该转座子整合到靶核酸中的多肽。

如本文中所用的，术语“转座”是指转座酶在从一个多核苷酸切出转座子然后将其整合到同一多核苷酸的不同位点或第二多核苷酸中的作用。

如本文中所用的，术语“转座子”是指通过相应的反式作用的转座酶的作用，可以从第一多核苷酸(例如载体)上切下并整合到同一多核苷酸的第二位置或第二多核苷酸(例如细胞的基因组或染色体外DNA)中的多核苷酸。转座子包含第一转座子末端和第二转座子末端，它们是被转座酶识别和转座的多核苷酸序列。转座子通常进一步在两个转座子末端之间包含第一多核苷酸序列，使得第一多核苷酸序列通过转座酶的作用与两个转座子末端一起转座。

如本文中所用的，术语“转座子末端”是指足以被相应的转座酶识别和被其转座的顺式作用核苷酸序列。piggyBac类转座子的转座子末端包含完美或不完美的重复序列，使得两个转座子末端中的各自重复序列是彼此的反向互补。这些被称为反向末端重复序列(ITR)或末端反向重复序列(TIR)。转座子末端可以包括或可以不包括与ITR相近的、促进或增强转座的其他序列。

如本文中所用的，术语“载体”或“DNA载体”或“基因转移载体”是指用于对另一多核苷酸执行“携带”功能的多核苷酸。例如，载体通常用于允许多核苷酸在活细胞内繁殖，或允许多核苷酸被包装以递送到细胞中，或用于将多核苷酸整合到细胞的基因组DNA中。载体可以进一步包含其他功能元件，例如它可以包含转座子。

在一方面，本公开提供了ー种基因转移载体，其选自：

(1)所述基因转移载体包含转座子表达载体以及表达转座酶的辅助质粒，其中，所述转座子表达载体包含转座子5’末端重复序列和转座子3’末端重复序列以及在两者之间的多克隆插入位点，所述辅助质粒包含转座酶编码基因及其启动子；或

(2)所述基因转移载体包含转座子5’末端重复序列和3’末端重复序列以及在两者之间的多克隆插入位点、转座酶编码序列以及控制所述转座酶表达的启动子；

其中，所述多克隆插入位点用于可操作地插入外源基因编码序列以及可选的控制外源基因表达的启动子；所述外源基因选自癌基因和FGF基因中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述转座子选自piggyBac、Sleeping Beauty、Mos1、Tc1/mariner、Tol2、微型Tol2(mini-Tol2)、Tc3、MuA、Himar I和Frog Prince。

在一些实施方案中，所述转座子为piggyBac转座子。

在一些实施方案中，所述转座子5’末端重复序列为PiggyBac转座子5’末端重复序列；更优选地，所述PiggyBac转座子5’末端重复序列的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述5’末端重复序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在一些实施方案中，所述转座子3’末端重复序列为PiggyBac转座子3’末端重复序列；更优选地，所述PiggyBac转座子3’末端重复序列的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述3’末端重复序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

在一些实施方案中，所述转座酶为PiggyBac转座酶；优选地，所述PiggyBac转座酶的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述PiggyBac转座酶的氨基酸序列如SEQID NO:3所示；优选地，所述PiggyBac转座酶基因的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:4所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述PiggyBac转座酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

在一些实施方案中，所述癌基因选自MYC、CCND1、CTNNB1、JAK1、MET、NFE2L2、EGFR、RAS、AKT和PIK3CA。

在一些实施方案中，所述MYC选自c-MYC、n-MYC、L-MYC、r-MYC；优选地，所述癌基因为c-MYC和CCND1；更优选地，所述c-MYC的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述c-MYC的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；优选地，所述c-MYC基因的核苷酸序列包含与SEQID NO:6所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述c-MYC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

在一些实施方案中，所述CCND1的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:7所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述CCND1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；优选地，所述CCND1基因的核苷酸序列包含与SEQID NO:8所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述CCND1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

在一些实施方案中，所述FGF为FGF19；优选地，所述FGF19的氨基酸序列包含与SEQID NO:9所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述FGF19的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；优选地，所述FGF19基因的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:10所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述FGF19基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

在一些实施方案中，所述启动子选自CMV启动子、CAG启动子、EF1α启动子、SV40启动子、Ubiquitin B启动子、HSP70启动子、PGK-1启动子、β-actin启动子、TK启动子和GRP78启动子。

在一些实施方案中，所述MYC的启动子为CAG启动子；更优选地，所述CAG启动子包含与SEQ ID NO:11所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述CAG启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。

在一些实施方案中，所述CCND1和FGF19的启动子为CMV启动子；更优选地，所述CMV启动子包含与SEQ ID NO:12所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述CMV启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；优选地，所述CCND1的表达框的方向与FGF19基因表达框的方向相反。

在一些实施方案中，所述转座子表达载体具有表达标签；优选地，所述表达标签选自HA、Ollas、Flag、Myc-tag和V5。

在一些实施方案中，所述HA的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:13所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述HA的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；优选地，所述HA基因的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:14所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。

在一些实施方案中，所述Ollas的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:15所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述Ollas的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；优选地，所述Ollas基因的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:16所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述Ollas基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。

在一些实施方案中，所述辅助质粒包含与SEQ ID NO:21所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述辅助质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示。

在一些实施方案中，所述基因转移载体包含第一转座子表达载体、第二转座子表达载体以及表达转座酶的辅助质粒，第一转座子表达载体插入的外源基因为MYC，第二转座子表达载体插入的外源基因为CCND1和FGF19。

在一些实施方案中，所述第一转座子表达载体中，所述MYC的表达标签为HA。在一些实施方案中，所述第一转座子表达载体包含与SEQ ID NO:22所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述第一转座子表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示。

在一些实施方案中，所述第二转座子表达载体中，所述FGF19的表达标签为HA；优选地，所述CCND1的表达标签为Ollas。在一些实施方案中，所述第二转座子表达载体包含与SEQ ID NO:23所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述第二转座子表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示。

在一方面，本公开提供了一种制备肝母细胞瘤动物的方法，包括：

(1)构建基因转移载体；

(2)将步骤(1)构建的基因转移载体导入动物，获得携带肝母细胞瘤的动物。

在一些实施方案中，所述方法还包括：(3)鉴定所述的肝母细胞瘤动物。

在一些实施方案中，所述方法还包括：(4)将步骤(3)鉴定后的动物作为肝母细胞瘤动物模型。

在一些实施方案中，所述鉴定包括检测外源基因、检测外源基因编码蛋白和/或鉴定肿瘤细胞的病理表型。

在一些实施方案中，所述检测外源基因编码蛋白通过靶向HA或Ollas的免疫组化染色来检测。

在一些实施方案中，所述病理表型表现出接近人肝母细胞瘤的病理特征；优选地，所述病理特征选自：病理表型接近人胚胎上皮细胞样肝母细胞瘤的特征，HE染色呈现肿瘤高核质比，肿瘤细胞边缘模糊，多分裂相以及细胞呈腺状或管状排列，髓外造血现象明显，出现巨核细胞和成簇的幼红细胞。

在一些实施方案中，免疫组化染色表型选自：细胞增殖标志物pH3染色表现高比例阳性信号、甲胎蛋白AFP染色阳性、Ly76染色阳性、B220染色阳性、MPO染色阳性和CD34染阳性。

在一些实施方案中，所述动物为小鼠。

在一方面，本公开提供了转基因动物的细胞或组织，其获自所述动物。

在一方面，本公开提供了一种筛选用于治疗肝母细胞瘤的药物候选物的方法，其包括：

(1)将药物候选物施用于所述的动物或所述的细胞或组织；

(2)测量所述肝母细胞瘤对所述治疗的响应。

在一些实施方案中，步骤(2)包括评估所述药物候选物引起至少一种选自下组的响应的能力：减少肿瘤细胞数目，缩小肿瘤尺寸或肿瘤负荷，抑制肿瘤细胞浸润入周围器官，抑制肿瘤转移，抑制肿瘤生长，和促进肿瘤细胞死亡。

在一些实施方案中，药物候选物为小分子化合物，肽，多肽，抗体，RNA，病毒，或细胞。

在一些实施方案中，所述药物候选物为小分子化合物。

在一些实施方案中，所述小分子化合物为lxazomib。

在一方面，本公开提供了一种所述动物在肝母细胞瘤相关研究中的应用，所述应用不是疾病的诊断和治疗方法，所述的应用包括：在体内研究治疗肝母细胞瘤药物的筛选、药效检测、验证或评价。

本公开制备的肝母细胞瘤动物中的肿瘤细胞具有接近人肝母细胞瘤的病理特征，病理表型接近人胚胎上皮细胞样肝母细胞瘤的特征，HE染色呈现肿瘤高核质比，肿瘤细胞边缘模糊，多分裂相以及细胞呈腺状或管状排列，髓外造血现象明显，出现巨核细胞和成簇的幼红细胞。此外，免疫组化染色进一步支持上述模型的肝母细胞瘤的表型。细胞增殖标志物pH3染色表现高比例阳性信号，显示肿瘤细胞较强的增殖能力；甲胎蛋白AFP染色呈现阳性；Ly76染色显示肿瘤内有丰富的有核幼红细胞和无核成熟红细胞、B220染色显示肿瘤内具有丰富的B细胞、MPO染色显示肿瘤内具有丰富的粒细胞、CD34染色显示肿瘤内还具有少量的造血干细胞，证明肿瘤中髓外造血的出现。

本公开基于尾静脉液态高压注射方法并结合PB转座系统将相关质粒递送到小鼠肝细胞内发挥作用，首次利用MYC、FGF19与CCND1基因组合成功诱导原发性肝母细胞瘤。小鼠成瘤时间快，约1-2个月，成瘤效率约42.3％。小分子蛋白酶体抑制剂lxazomib可以特异性抑制从MYC+F/C原发性HB模型小鼠的肿瘤中分离的原代肝脏肿瘤细胞活性。本公开不仅可以作为基础研究的手段，有助于解释基因相互作用诱导肝母细胞瘤的机制，此外该小鼠模型及对应的原代肿瘤细胞可为后续HB药物筛选提供一个新平台。

为了达到清楚和简洁描述的目的，本文中作为相同的或分开的一些实施方案的一部分来描述特征，然而，将要理解的是，本公开的范围可包括具有所描述的所有或一些特征的组合的一些实施方案。

下面，参考具体实施例更详细地描述本公开，然而，实施例仅用于说明目的，对于本公开不具有限制作用。

实施例

实施例1原发性肝母细胞瘤模型小鼠的构建

本实施例利用MYC、FGF19和CCND1基因组合(MYC+F/C)，基于尾静脉液态高压注射方法并结合PB(piggyBac)转座子系统构建原发性肝母细胞瘤模型。

PB是从粉纹夜蛾Trichoplusia ni基因组中分离出来的转座元件，可在哺乳动物细胞或小鼠中实现高效率转座。PB转座系统由位于DNA两侧末端反向重复序列(invertedterminal repeats，ITRs)的转座元件和催化转座的转座酶组成。转座酶识别并结合转座元件ITR序列，切割ITR序列间的DNA片段，并将片段整合到基因组新的位点。相关质粒通过液态高压注射递送到活体小鼠肝细胞内发挥作用，从而诱导小鼠肝脏肿瘤发生。

步骤1：表达MYC、FGF19与CCND1质粒的构建

首先构建PB质粒，通过基因合成获得PB空载体(PB-empty载体)(其核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示)，然后通过特异性引物(SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19)从pCAGGS载体(BCCM/GeneCorner，LMBP 2453)上扩增特异的CAG启动子片段(SEQ ID NO:11)，将获得到CAG片段通过同源重组的方法在GCCGGGCATTTAAAT(SEQ ID NO:20)位点克隆到PB空载体，最后得到PB载体。将通过基因合成获得的PBase基因片段克隆到经XhoⅠ酶切的pCAGGS载体得到转座酶质粒pCAGGS-PBase(SEQ ID NO:21)。

从培养的Hela细胞提取RNA，经反转录获得cDNA，使用c-MYC、FGF19、CCND1特异性引物扩增，特别地，扩增c-MYC、CCND1的正向引物上分别引入HA、Ollas序列，扩增FGF19的反向引物上引入HA序列，进行扩增得到HA-c-MYC、FGF19-HA、Ollas-CCND1目的片段。

将扩增得到的HA-MYC克隆到经EcoRI和BamHI双酶切后的PB质粒中得到PB-HA-MYC质粒(SEQ ID NO:22)。

对于PB-Ollas-CCND1-FGF19-HA质粒的构建，首先将扩增得到的FGF19-HA克隆到经Age1和Pac1双酶切的pQCXIH载体(Clontech，货号631516)，得到pQCXIH-FGF19质粒，然后将CMV-FGF19-HA片段从pQCXIH-FGF19载体上进行扩增并亚克隆到经EcoRI和SwaⅠ酶切的PB质粒最终得到PB-FGF19-HA。类似地，将扩增得到的Ollas-CCND1克隆到经Age1和Pac1双酶切的pQCXIH载体，得到pQCXIH-CCND1质粒，再将CMV-Ollas-CCND1片段从pQCXIH-CCND1载体上进行扩增并克隆到经AscI酶切的PB-FGF19-HA载体上，最后得到PB-Ollas-CCND1-FGF19-HA质粒(SEQ ID NO:23)。

其中，所述PiggyBac转座子5’末端重复序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述PiggyBac转座子3’末端重复序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述PiggyBac转座酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述PiggyBac转座酶的基因如SEQ ID NO:4所示；所述c-MYC的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述c-MYC的基因如SEQ ID NO:6所示；所述CCND1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述CCND1的基因如SEQ ID NO:8所示；所述FGF19的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述FGF19的基因如SEQ ID NO:10所示。

MYC、FGF19和CCND1的Gene ID分别为4609、9965、595(对应的GeneBank号分别为：NM_002467.6，NM_005117.3，NM_053056.3)，均为人源基因。此外，所述癌基因表达质粒均携带如图所示表达标签如HA或Ollas，通过对标签的检测实现在成瘤过程中对肿瘤细胞的追踪。

步骤2：细胞转染与质粒体外表达检测

HEK293T在含有10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养，放置于细胞培养箱中以维持一个稳定的37℃、5％CO₂的培养环境。

将HEK293T细胞以合适的密度接种在6孔板中，第二天显微镜观察细胞状态和密度，在接种后8-12小时开始转染。将步骤1构建的PB-HA-MYC质粒和PB-Ollas-CCND1-FGF19-HA质粒分别和YEASEN转染试剂(购于YEASEN，Cat#40802ES0)以1(μg):3(μl)的比例)加入到OPTI-MEM培养液(购于Gibco，Cat#31985088)中混匀，室温静置30min，同时更换新鲜的含有10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，将混合液缓慢加入到培养细胞的孔板中，转染6小时后更换新鲜的含有10％胎牛血清的培养基，继续培养24-48小时。收细胞，吸尽孔板中的细胞培养基，加入适量1×SDS裂解液(SDS粉末购于生工，Cat#s0227)ml离心管，95℃变性5min。细胞裂解液用相应的HA标签抗体(购于CST，Cat#3724)或Ollas标签抗体(购于NovusBiologicals，Cat#NBP1-06713)进行免疫印迹检测(图3)。由图3可见，在上述质粒转染的HEK293T细胞中，通过对各个表达标签的免疫印迹检测，结果显示MYC、FGF19和CCND1都能够成功表达符合理论分子量大小的蛋白。

步骤3：尾静脉液态高压注射及质粒体内表达检测

准备4周大的SPF级野生型ICR雄性小鼠(体重约在20g左右，购于上海斯莱克实验动物有限公司)，对小鼠进行称重并剪脚趾进行编号。为检测PB-HA-MYC、PB-Ollas-CCND1-FGF19-HA质粒在体内的表达情况，首先提前将相关质粒混合于2ml无菌Ringer’s平衡盐溶液(溶液体积按1ml/10g小鼠体重配制)，其中注射质粒包括25μgPB-HA-MYC质粒，25μg PB-Ollas-CCND1-FGF19-HA质粒以及10μg转座酶质粒pCAGGS-PBase。异氟烷麻醉小鼠后，将混合溶液在5-7s内快速注射入小鼠尾静脉。注射结束后，用手指按压针口处防止血液从针口流出，随后用酒精棉球对针孔处进行消毒。在注射后2天处死并收集小鼠肝脏，使用HA或Ollas标签抗体对肝脏切片进行免疫组化染色检测MYC、FGF19、CCND1在体内的表达情况(图4)。图4可见，在上述质粒注射后2天，收集小鼠肝脏切片的免疫组化染色结果，发现MYC、FGF19和CCND1检测均呈棕色的阳性信号，这表明在小鼠肝脏中MYC、FGF19和CCND1均成功表达，说明质粒构建成功，均能正常表达。

步骤4：小鼠成瘤监测

为诱导小鼠肝母细胞瘤的形成，将相关质粒按上述尾静脉液态高压注射方法注射小鼠，长期监测小鼠成瘤情况，并定期观察小鼠状态，如出现弓背、腹部肿大、小鼠精神状态和活动异常等情况或时间达2个月，成瘤小鼠即为MYC+F/C原发性HB模型小鼠。

步骤5：小鼠成瘤效率统计

在注射后2个月或小鼠有明显成瘤迹象如腹部肿大时，使小鼠安乐死，小鼠称重后将其固定在解剖板上，将肝取出并称重、拍照记录。对于肝脏组织(包括肿瘤和癌旁组织)，部分置于10％中性甲醛溶液中，室温固定24小时用于病理分析；其余直接置于-80℃保存。

其中一只MYC+F/C诱导小鼠肝母细胞瘤的小鼠的肝脏外观图如图5A所示，肿瘤呈白色或红色，可见明显的多发肿瘤结节，结节的直径可达1-2cm，总量可达13个，整个肝的总量占小鼠体重的比值(L/B)可达25％，远超正常肝5％的比例。

成瘤情况统计如图5B所示。MYC+F/C诱导小鼠最快1个月肿瘤发生，如饼图所示，MYC+F/C诱导小鼠在1个月时到成瘤效率为11.5％，在第2个月时又有30.8％的小鼠成瘤，在2个月内MYC+F/C诱导的总成瘤率为42.3％。

步骤6：小鼠肝母细胞瘤的病理组化判定

(1)组织脱水、包埋和切片

取步骤5安乐死小鼠的组织，待组织在10％多聚甲醛溶液中固定24小时后，对组织按以下流程进行脱水处理：75％乙醇，过夜→95％乙醇，2h→95％乙醇，1h→100％乙醇，1h→100％乙醇，1h→二甲苯，1h→二甲苯，1h→石蜡，65℃1h→石蜡，65℃2h。将浸过蜡的组织块用石蜡包埋机进行包埋，蜡块过夜冷却。然后将石蜡切片机切片厚度调为5μm，进行切片，放于42℃ddH₂O进行展片，待充分舒展无褶皱时用黏附性载玻片进行捞片，然后将切片置于37℃烘箱中过夜，室温保存。

(2)苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin，HE)染色

石蜡切片脱蜡至水依次经过如下步骤：二甲苯两次，每次15min；无水乙醇一次5min；95％乙醇两次，每次5min；75％乙醇一次5min；流水冲洗后浸入蒸馏水中。对于HE染色，将切片置于苏木素中染色1min，流水冲洗，镜下观察，若核染色太深，则用1％盐酸分化后流水冲洗。将切片先后置于75％乙醇和95％乙醇中各3min，然后浸入伊红染色液中染色1-3min，依次将切片放入95％乙醇I、95％乙醇II、无水乙醇各5min，最后二甲苯5min完成切片的脱水透明，中性树胶封片。镜下观察染色情况。如图6所示，MYC+F/C诱导的肝癌类型接近人胚胎上皮细胞样HB，呈现高核质比，肿瘤细胞边缘模糊，多分裂相以及细胞呈腺状或管状排列等相同特征。此外，MYC+F/C肿瘤髓外造血现象也格外明显，出现巨核细胞和成簇的幼红细胞。

(3)免疫组化染色

按步骤(2)的描述将石蜡切片脱蜡至水，放入蒸馏水中浸洗10min后进行抗原修复。根据不同的抗体选择合适的修复方法。若采用酸或碱修复方法，则将切片置于盛有酸修复液或碱修复液的盒中，放入70℃水浴锅，并将水浴锅调至95℃，加热修复40min，然后取出盒子逐渐降温至室温。若采用蛋白酶修复方法，则向切片滴加20μg/ml蛋白酶K溶液，室温反应3min。切片修复完成后，流水冲洗，浸入3％H₂O₂/PBS 30min以封闭组织内源过氧化酶。切片浸入PBS洗两次，每次10min。用蜡笔在组织外围画圈以避免孵育过程中液体外溢，组织不能被完全覆盖。用含10％亲和素和10％山羊血清的PBS在室温下封闭切片30min，回收封闭液后直接加入特定的一抗，4℃过夜孵育。回收一抗，切片浸入PBS洗三次，每次10min。加入相应的二抗，室温下孵育30min，随后切片浸入PBS洗三次，每次10min。加入提前配好的ABC溶液，室温下孵育30min，切片浸入PBS洗三次，每次10min。用过氧化物酶进行显色，镜下观察以控制显色时间，得到合适的信号强度。随后流水冲洗，苏木素染细胞核，梯度酒精(75％-100％乙醇)脱水，二甲苯透明，用中性树胶封片，镜检，结果如图7所示。

病理结果分析显示肿瘤内HA标签抗体(购于CST，Cat#3724)和Ollas标签抗体(购于Novus Biologicals，Cat#NBP1-06713)染色信号呈阳性，表明肿瘤来源于整合了MYC、FGF19和CCND1的肝细胞；细胞增殖标志物PH3(购于CST，Cat#9701)高比例阳性，显示较强的增殖能力；人HB诊断时90％患者血清AFP水平升高，本实施例构建的MYC+F/C原发性HB模型小鼠的肿瘤也呈AFP(购于Abcam，Cat#ab46799)阳性。

病理形态和免疫组化显示肿瘤具有HB中常见的髓外造血特征，例如，Ly76(购于Abcam，Cat#ab91113)染色显示肿瘤内有丰富的有核幼红细胞和无核成熟红细胞；B220(购于BD，Cat#550286)标记显示肿瘤内具有丰富的B细胞；MPO(购于Abcam，Cat#ab9535)标记显示肿瘤内具有丰富的粒细胞；CD34(购于Abcam，Cat#ab81289)染色显示肿瘤内还具有少量的造血干细胞，证明髓外造血的发生。

实施例2MYC+F/C模型以及其原代细胞的应用

本实施例在以从实施例1制备的MYC+F/C原发性HB模型小鼠的肿瘤中分离的原代肝脏肿瘤细胞的基础上开展药物测试。对照细胞为SNU475细胞(购于ATCC，Cat#CRL-2236)。

步骤1：原代肝脏肿瘤细胞的培养

从MYC+F/C小鼠肝脏肿瘤中分离的原代肝脏肿瘤细胞培养在含有10％胎牛血清、2μm Dex、20ng/mL EFG、5μg/mL胰岛素的DMEM F1/2培养基中，细胞放置于细胞培养箱中以维持一个稳定到37℃、5％CO₂的培养环境。克隆1和克隆2细胞经原代肿瘤细胞分离后原代培养，挑细胞克隆纯化得到。具体步骤如下：

(1)原代肿瘤细胞的分离：(1a)用颈部脱臼法杀鼠，固定小鼠使其腹面朝上，喷洒酒精以杀灭皮毛间微生物，用专用的剪刀和镊子剪开表面皮毛，打开腹腔，取出肝脏放于洗涤缓冲液(1xPBS 500mL+青链霉素(Pen Strep)3mL)中浸泡，拿进超净台进行后续操作。(1b)取组织样品：先将肝脏放在一个10cm皿中，用洗涤缓冲液冲洗两次，确保没有大量的血液。选择完整的球形肿瘤组织块，用专用的剪刀镊子剥下肿瘤，注意尽量避免肝脏包膜。将取出的肿瘤组织用洗涤缓冲液冲洗一次，装在1.5mL离心管中，称重。(1c)消化：将已称重的肿瘤组织从离心管中取出，放置在干净的10cm皿上并用专用剪刀剪至1mm³以下大小。后将组织转移至MACS C tube(购于Miltenyi Biotec 130-093-237)，加入5ml过滤除菌的消化液(0.02g Collagenase IV(购于Worthington,LS004196)和5U重组DNA酶I(RecombinantDNase I，购于TakaRa，Cat#2270A)加入至10ml RPMI-1640培养基配制成消化液)。旋紧管盖，将MACS C tube插到gentleMACS Dissociator上，于37℃加热消化。(1d)终止消化，分离细胞：将70μm的细胞滤网放置在50ml离心管上，过滤并收集消化液，并且通过滤网加入等体积的RPMI-1640培养基，降低酶浓度。450rcf,3min离心去除消化液。(1e)去除红细胞：加入3ml 1X血红细胞裂解缓冲液(Red Blood Cell Lysis Buffer：NH4Cl 80g、KHCO3 10g、Na2EDTA 3.7g溶于蒸馏水1000mL并调pH至7.2-7.4)，吹匀，室温放置5min。加入3ml PBS，450rcf,3min离心取上清。(1f)去除死细胞和细胞碎片：加入3ml 30％Percoll重悬细胞。4℃,450rcf 10min离心后加入5ml1xPBS重悬，450rcf,3min离心得到细胞。

(2)肿瘤细胞原代培养与建立细胞系：将通过消化得到的细胞用10ml原代培养基(primary culture medium：含有10％FBS的DMEM-F12,并加入5μg/mL胰岛素,20ng/mL EGF,1uM地塞米松与抗生素青链霉素(Pen Strep))重悬，种在10cm细胞培养皿中，待细胞贴壁。原代细胞的增殖比较慢，而且会出现细胞死亡，每3天换一次液，待细胞增殖到70％-80％，进行传代培养。等待培养皿中有克隆状的细胞团生成。待出现肉眼可见的细胞克隆，用记号笔在皿上做好标记，吸去培养基，用PBS清洗一次后加入1mL胰酶，放入37℃细胞培养箱中消化，每隔2min观察一次，带细胞变圆之后，用10ul枪吸取原代培养基，在克隆上反复吹吸，将细胞吸入枪中并转移至12孔板中培养以得到克隆细胞。

步骤2：原代肝脏肿瘤细胞的给药处理与药效检测

在细胞给药前一天，将原代细胞以2×10³细胞/孔的密度接种在96孔板中，每个实验准备三个复孔。第二天在显微镜下观察细胞的密度和状态。接种12小时后，分别加入0μM、0.01μM、0.1μM、1μM的药物Ixazomib(购于Selleck，Cat#S2180)以及0μM、1μM、10μM、100μM的Olomoucine(购于MCE，Cat#HY-w011428)。

通过Cell Titer-Blue细胞活力检测来评估给药效果，其检测原理是基于活细胞能将一种氧化还原染料(刃天青，resazurin)转化成一种荧光终产物(试卤灵，resorufin)，而不具有活力的细胞丧失新陈代谢能力，不能产生荧光信号。使用酶标仪测量反应后的荧光强度来检测细胞活力，进而判断给药效果。其具体操作如下：在加入药物后马上检测最初的细胞活力，以此时作为基线(0小时)，每个孔加入20μl的Cell Titer-Blue(购于Progema，Cat#G8081)，在37℃、5％CO₂的培养环境中避光孵育3小时。孵育后将每孔100 μl的培养基转移至检测板中(购于costar，Cat#3922)，用酶标仪检测波长540-10nm Ex/590-10nm Em的荧光值。后续再分别检测加药后24小时、48小时和72小时的细胞活力，步骤与测量0小时的一致。

结果如图8A所示，在用药物处理0h、24h、48h和72h后分别测量对应时间点的细胞活力，能看到0.1μM的Ixazomib可以显著地抑制克隆1和克隆2的细胞活力，而对SNU475细胞系没有明显的抑制作用。而不同浓度的Olomoucine对克隆1、克隆2和HepG2细胞活力的影响均没有明显差异。分别计算用不同浓度的药物处理72h后的IC50(图8B)，可以看到，Olomoucine在处理三种细胞时IC50相对较高，而且三种细胞之间没有显著的差异。而Ixazomib在克隆1和克隆2上的IC50相对SNU475来说则非常低(克隆1的IC50：32.2nM；克隆2的IC50：35.8nM)。这些结果表明，蛋白酶体抑制剂Ixazomib能在分离的原代细胞上展现一定的抗癌活性。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 肝母细胞瘤动物模型、其构建方法及其应用

<130> MTI21224

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1052

<212> DNA

<213> Trichoplusia ni

<400> 1

ccctagaaag ataatcatat tgtgacgtac gttaaagata atcatgcgta aaattgacgc 60

atgtgtttta tcggtctgta tatcgaggtt tatttattaa tttgaataga tattaagttt 120

tattatattt acacttacat actaataata aattcaacaa acaatttatt tatgtttatt 180

tatttattaa aaaaaaacaa aaactcaaaa tttcttctat aaagtaacaa aacttttaaa 240

cattctctct tttacaaaaa taaacttatt ttgtacttta aaaacagtca tgttgtatta 300

taaaataagt aattagctta acttatacat aatagaaaca aattatactt attagtcagt 360

cagaaacaac tttggcacat atcaatatta tgctctcgac aaataacttt tttgcatttt 420

ttgcacgatg catttgcctt tcgccttatt ttagaggggc agtaagtaca gtaagtacgt 480

tttttcatta ctggctcttc agtactgtca tctgatgtac caggcacttc atttggcaaa 540

atattagaga tattatcgcg caaatatctc ttcaaagtag gagcttctaa acgcttacgc 600

ataaacgatg acgtcaggct catgtaaagg tttctcataa attttttgcg actttgaacc 660

ttttctccct tgctactgac attatggctg tatataataa aagaatttat gcaggcaatg 720

tttatcattc cgtacaataa tgccataggc cacctattcg tcttcctact gcaggtcatc 780

acagaacaca tttggtctag cgtgtccact ccgcctttag tttgattata atacataacc 840

atttgcggtt taccggtact ttcgttgata gaagcatcct catcacaaga tgataataag 900

tataccatct tagctggctt cggtttatat gagacgagag taaggggtcc gtcaaaacaa 960

aacatcgatg ttcccactgg cctggagcga ctgtttttca gtacttccgg tatctcgcgt 1020

ttgtttgatc gcacggttcc cacaatggtt aa 1052

<210> 2

<211> 674

<212> DNA

<213> Trichoplusia ni

<400> 2

tgacaatgtt cagtgcagag actcggctac gcctcgtgga ctttgaagtt gaccaacaat 60

gtttattctt acctctaata gtcctctgtg gcaaggtcaa gattctgtta gaagccaatg 120

aagaacctgg ttgttcaata acattttgtt cgtctaatat ttcactaccg cttgacgttg 180

gctgcacttc atgtacctca tctataaacg cttcttctgt atcgctctgg acgtcatctt 240

cacttacgtg atctgatatt tcactgtcag aatcctcacc aacaagctcg tcatcgcttt 300

gcagaagagc agagaggata tgctcatcgt ctaaagaact acccatttta ttatatatta 360

gtcacgatat ctataacaag aaaatatata tataataagt tatcacgtaa gtagaacatg 420

aaataacaat ataattatcg tatgagttaa atcttaaaag tcacgtaaaa gataatcatg 480

cgtcattttg actcacgcgg tcgttatagt tcaaaatcag tgacacttac cgcattgaca 540

agcacgcctc acgggagctc caagcggcga ctgagatgtc ctaaatgcac agcgacggat 600

tcgcgctatt tagaaagaga gagcaatatt tcaagaatgc atgcgtcaat tttacgcaga 660

ctatctttct aggg 674

<210> 3

<211> 594

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Gly Cys Ser Leu Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Ala Leu Leu Gln

1 5 10 15

Ser Asp Asp Glu Leu Val Gly Glu Asp Ser Asp Ser Glu Ile Ser Asp

20 25 30

His Val Ser Glu Asp Asp Val Gln Ser Asp Thr Glu Glu Ala Phe Ile

35 40 45

Asp Glu Val His Glu Val Gln Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu Ile Leu

50 55 60

Asp Glu Gln Asn Val Ile Glu Gln Pro Gly Ser Ser Leu Ala Ser Asn

65 70 75 80

Arg Ile Leu Thr Leu Pro Gln Arg Thr Ile Arg Gly Lys Asn Lys His

85 90 95

Cys Trp Ser Thr Ser Lys Ser Thr Arg Arg Ser Arg Val Ser Ala Leu

100 105 110

Asn Ile Val Arg Ser Gln Arg Gly Pro Thr Arg Met Cys Arg Asn Ile

115 120 125

Tyr Asp Pro Leu Leu Cys Phe Lys Leu Phe Phe Thr Asp Glu Ile Ile

130 135 140

Ser Glu Ile Val Lys Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys Arg Arg

145 150 155 160

Glu Ser Met Thr Gly Ala Thr Phe Arg Asp Thr Asn Glu Asp Glu Ile

165 170 175

Tyr Ala Phe Phe Gly Ile Leu Val Met Thr Ala Val Arg Lys Asp Asn

180 185 190

His Met Ser Thr Asp Asp Leu Phe Asp Arg Ser Leu Ser Met Val Tyr

195 200 205

Val Ser Val Met Ser Arg Asp Arg Phe Asp Phe Leu Ile Arg Cys Leu

210 215 220

Arg Met Asp Asp Lys Ser Ile Arg Pro Thr Leu Arg Glu Asn Asp Val

225 230 235 240

Phe Thr Pro Val Arg Lys Ile Trp Asp Leu Phe Ile His Gln Cys Ile

245 250 255

Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Ala His Leu Thr Ile Asp Glu Gln Leu Leu

260 265 270

Gly Phe Arg Gly Arg Cys Pro Phe Arg Met Tyr Ile Pro Asn Lys Pro

275 280 285

Ser Lys Tyr Gly Ile Lys Ile Leu Met Met Cys Asp Ser Gly Thr Lys

290 295 300

Tyr Met Ile Asn Gly Met Pro Tyr Leu Gly Arg Gly Thr Gln Thr Asn

305 310 315 320

Gly Val Pro Leu Gly Glu Tyr Tyr Val Lys Glu Leu Ser Lys Pro Val

325 330 335

His Gly Ser Cys Arg Asn Ile Thr Cys Asp Asn Trp Phe Thr Ser Ile

340 345 350

Pro Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gln Glu Pro Tyr Lys Leu Thr Ile Val

355 360 365

Gly Thr Val Arg Ser Asn Lys Arg Glu Ile Pro Glu Val Leu Lys Asn

370 375 380

Ser Arg Ser Arg Pro Val Gly Thr Ser Met Phe Cys Phe Asp Gly Pro

385 390 395 400

Leu Thr Leu Val Ser Tyr Lys Pro Lys Pro Ala Lys Met Val Tyr Leu

405 410 415

Leu Ser Ser Cys Asp Glu Asp Ala Ser Ile Asn Glu Ser Thr Gly Lys

420 425 430

Pro Gln Met Val Met Tyr Tyr Asn Gln Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr

435 440 445

Leu Asp Gln Met Cys Ser Val Met Thr Cys Ser Arg Lys Thr Asn Arg

450 455 460

Trp Pro Met Ala Leu Leu Tyr Gly Met Ile Asn Ile Ala Cys Ile Asn

465 470 475 480

Ser Phe Ile Ile Tyr Ser His Asn Val Ser Ser Lys Gly Glu Lys Val

485 490 495

Gln Ser Arg Lys Lys Phe Met Arg Asn Leu Tyr Met Ser Leu Thr Ser

500 505 510

Ser Phe Met Arg Lys Arg Leu Glu Ala Pro Thr Leu Lys Arg Tyr Leu

515 520 525

Arg Asp Asn Ile Ser Asn Ile Leu Pro Asn Glu Val Pro Gly Thr Ser

530 535 540

Asp Asp Ser Thr Glu Glu Pro Val Met Lys Lys Arg Thr Tyr Cys Thr

545 550 555 560

Tyr Cys Pro Ser Lys Ile Arg Arg Lys Ala Asn Ala Ser Cys Lys Lys

565 570 575

Cys Lys Lys Val Ile Cys Arg Glu His Asn Ile Asp Met Cys Gln Ser

580 585 590

Cys Phe

<210> 4

<211> 1785

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgggatgtt ctttagacga tgagcatatc ctctctgctc ttctgcaaag cgatgacgag 60

cttgttggtg aggattctga cagtgaaata tcagatcacg taagtgaaga tgacgtccag 120

agcgatacag aagaagcgtt tatagatgag gtacatgaag tgcagccaac gtcaagcggt 180

agtgaaatat tagacgaaca aaatgttatt gaacaaccag gttcttcatt ggcttctaac 240

agaatcttga ccttgccaca gaggactatt agaggtaaga ataaacattg ttggtcaact 300

tcaaagtcca cgaggcgtag ccgagtctct gcactgaaca ttgtcagatc tcaaagaggt 360

ccgacgcgta tgtgccgcaa tatatatgac ccacttttat gcttcaaact attttttact 420

gatgagataa tttcggaaat tgtaaaatgg acaaatgctg agatatcatt gaaacgtcgg 480

gaatctatga caggtgctac atttcgtgac acgaatgaag atgaaatcta tgctttcttt 540

ggtattctgg taatgacagc agtgagaaaa gataaccaca tgtccacaga tgacctcttt 600

gatcgatctt tgtcaatggt gtacgtctct gtaatgagtc gtgatcgttt tgattttttg 660

atacgatgtc ttagaatgga tgacaaaagt atacggccca cacttcgaga aaacgatgta 720

tttactcctg ttagaaaaat atgggatctc tttatccatc agtgcataca aaattacact 780

ccaggggctc atttgaccat agatgaacag ttacttggtt ttagaggacg gtgtccgttt 840

aggatgtata tcccaaacaa gccaagtaag tatggaataa aaatcctcat gatgtgtgac 900

agtggtacga agtatatgat aaatggaatg ccttatttgg gaagaggaac acagaccaac 960

ggagtaccac tcggtgaata ctacgtgaag gagttatcaa agcctgtgca cggtagttgt 1020

cgtaatatta cgtgtgacaa ttggttcacc tcaatccctt tggcaaaaaa cttactacaa 1080

gaaccgtata agttaaccat tgtgggaacc gtgcgatcaa acaaacgcga gataccggaa 1140

gtactgaaaa acagtcgctc caggccagtg ggaacatcga tgttttgttt tgacggaccc 1200

cttactctcg tctcatataa accgaagcca gctaagatgg tatacttatt atcatcttgt 1260

gatgaggatg cttctatcaa cgaaagtacc ggtaaaccgc aaatggttat gtattataat 1320

caaactaaag gcggagtgga cacgctagac caaatgtgtt ctgtgatgac ctgcagtagg 1380

aagacgaata ggtggcctat ggcattattg tacggaatga taaacattgc ctgcataaat 1440

tcttttatta tatacagcca taatgtcagt agcaagggag agaaggttca aagtcgcaaa 1500

aaatttatga gaaaccttta catgagcctg acgtcatcgt ttatgcgtaa gcgtttagaa 1560

gctcctactt tgaagagata tttgcgcgat aatatctcta atattttgcc aaatgaagtg 1620

cctggtacat cagatgacag tactgaagag ccagtaatga aaaaacgtac ttactgtact 1680

tactgcccct ctaaaataag gcgaaaggca aatgcatcgt gcaaaaaatg caaaaaagtt 1740

atttgtcgag agcataatat tgatatgtgc caaagttgtt tctga 1785

<210> 5

<211> 454

<212> PRT

<213> Human

<400> 5

Leu Asp Phe Phe Arg Val Val Glu Asn Gln Gln Pro Pro Ala Thr Met

1 5 10 15

Pro Leu Asn Val Ser Phe Thr Asn Arg Asn Tyr Asp Leu Asp Tyr Asp

20 25 30

Ser Val Gln Pro Tyr Phe Tyr Cys Asp Glu Glu Glu Asn Phe Tyr Gln

35 40 45

Gln Gln Gln Gln Ser Glu Leu Gln Pro Pro Ala Pro Ser Glu Asp Ile

50 55 60

Trp Lys Lys Phe Glu Leu Leu Pro Thr Pro Pro Leu Ser Pro Ser Arg

65 70 75 80

Arg Ser Gly Leu Cys Ser Pro Ser Tyr Val Ala Val Thr Pro Phe Ser

85 90 95

Leu Arg Gly Asp Asn Asp Gly Gly Gly Gly Ser Phe Ser Thr Ala Asp

100 105 110

Gln Leu Glu Met Val Thr Glu Leu Leu Gly Gly Asp Met Val Asn Gln

115 120 125

Ser Phe Ile Cys Asp Pro Asp Asp Glu Thr Phe Ile Lys Asn Ile Ile

130 135 140

Ile Gln Asp Cys Met Trp Ser Gly Phe Ser Ala Ala Ala Lys Leu Val

145 150 155 160

Ser Glu Lys Leu Ala Ser Tyr Gln Ala Ala Arg Lys Asp Ser Gly Ser

165 170 175

Pro Asn Pro Ala Arg Gly His Ser Val Cys Ser Thr Ser Ser Leu Tyr

180 185 190

Leu Gln Asp Leu Ser Ala Ala Ala Ser Glu Cys Ile Asp Pro Ser Val

195 200 205

Val Phe Pro Tyr Pro Leu Asn Asp Ser Ser Ser Pro Lys Ser Cys Ala

210 215 220

Ser Gln Asp Ser Ser Ala Phe Ser Pro Ser Ser Asp Ser Leu Leu Ser

225 230 235 240

Ser Thr Glu Ser Ser Pro Gln Gly Ser Pro Glu Pro Leu Val Leu His

245 250 255

Glu Glu Thr Pro Pro Thr Thr Ser Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln Glu

260 265 270

Asp Glu Glu Glu Ile Asp Val Val Ser Val Glu Lys Arg Gln Ala Pro

275 280 285

Gly Lys Arg Ser Glu Ser Gly Ser Pro Ser Ala Gly Gly His Ser Lys

290 295 300

Pro Pro His Ser Pro Leu Val Leu Lys Arg Cys His Val Ser Thr His

305 310 315 320

Gln His Asn Tyr Ala Ala Pro Pro Ser Thr Arg Lys Asp Tyr Pro Ala

325 330 335

Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp Ser Val Arg Val Leu Arg Gln Ile Ser

340 345 350

Asn Asn Arg Lys Cys Thr Ser Pro Arg Ser Ser Asp Thr Glu Glu Asn

355 360 365

Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln Arg Arg Asn Glu

370 375 380

Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile Pro Glu Leu Glu

385 390 395 400

Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys Lys Ala Thr Ala

405 410 415

Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu

420 425 430

Asp Leu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu Gln

435 440 445

Leu Arg Asn Ser Cys Ala

450

<210> 6

<211> 1365

<212> DNA

<213> Human

<400> 6

ctggattttt ttcgggtagt ggaaaaccag cagcctcccg cgacgatgcc cctcaacgtt 60

agcttcacca acaggaacta tgacctcgac tacgactcgg tgcagccgta tttctactgc 120

gacgaggagg agaacttcta ccagcagcag cagcagagcg agctgcagcc cccggcgccc 180

agcgaggata tctggaagaa attcgagctg ctgcccaccc cgcccctgtc ccctagccgc 240

cgctccgggc tctgctcgcc ctcctacgtt gcggtcacac ccttctccct tcggggagac 300

aacgacggcg gtggcgggag cttctccacg gccgaccagc tggagatggt gaccgagctg 360

ctgggaggag acatggtgaa ccagagtttc atctgcgacc cggacgacga gaccttcatc 420

aaaaacatca tcatccagga ctgtatgtgg agcggcttct cggccgccgc caagctcgtc 480

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<211> 295

<212> PRT

<213> Human

<400> 7

Met Glu His Gln Leu Leu Cys Cys Glu Val Glu Thr Ile Arg Arg Ala

1 5 10 15

Tyr Pro Asp Ala Asn Leu Leu Asn Asp Arg Val Leu Arg Ala Met Leu

20 25 30

Lys Ala Glu Glu Thr Cys Ala Pro Ser Val Ser Tyr Phe Lys Cys Val

35 40 45

Gln Lys Glu Val Leu Pro Ser Met Arg Lys Ile Val Ala Thr Trp Met

50 55 60

Leu Glu Val Cys Glu Glu Gln Lys Cys Glu Glu Glu Val Phe Pro Leu

65 70 75 80

Ala Met Asn Tyr Leu Asp Arg Phe Leu Ser Leu Glu Pro Val Lys Lys

85 90 95

Ser Arg Leu Gln Leu Leu Gly Ala Thr Cys Met Phe Val Ala Ser Lys

100 105 110

Met Lys Glu Thr Ile Pro Leu Thr Ala Glu Lys Leu Cys Ile Tyr Thr

115 120 125

Asp Asn Ser Ile Arg Pro Glu Glu Leu Leu Gln Met Glu Leu Leu Leu

130 135 140

Val Asn Lys Leu Lys Trp Asn Leu Ala Ala Met Thr Pro His Asp Phe

145 150 155 160

Ile Glu His Phe Leu Ser Lys Met Pro Glu Ala Glu Glu Asn Lys Gln

165 170 175

Ile Ile Arg Lys His Ala Gln Thr Phe Val Ala Leu Cys Ala Thr Asp

180 185 190

Val Lys Phe Ile Ser Asn Pro Pro Ser Met Val Ala Ala Gly Ser Val

195 200 205

Val Ala Ala Val Gln Gly Leu Asn Leu Arg Ser Pro Asn Asn Phe Leu

210 215 220

Ser Tyr Tyr Arg Leu Thr Arg Phe Leu Ser Arg Val Ile Lys Cys Asp

225 230 235 240

Pro Asp Cys Leu Arg Ala Cys Gln Glu Gln Ile Glu Ala Leu Leu Glu

245 250 255

Ser Ser Leu Arg Gln Ala Gln Gln Asn Met Asp Pro Lys Ala Ala Glu

260 265 270

Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Val Asp Leu Ala Cys Thr Pro Thr

275 280 285

Asp Val Arg Asp Val Asp Ile

290 295

<210> 8

<211> 888

<212> DNA

<213> Human

<400> 8

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<210> 9

<211> 216

<212> PRT

<213> Human

<400> 9

Met Arg Ser Gly Cys Val Val Val His Val Trp Ile Leu Ala Gly Leu

1 5 10 15

Trp Leu Ala Val Ala Gly Arg Pro Leu Ala Phe Ser Asp Ala Gly Pro

20 25 30

His Val His Tyr Gly Trp Gly Asp Pro Ile Arg Leu Arg His Leu Tyr

35 40 45

Thr Ser Gly Pro His Gly Leu Ser Ser Cys Phe Leu Arg Ile Arg Ala

50 55 60

Asp Gly Val Val Asp Cys Ala Arg Gly Gln Ser Ala His Ser Leu Leu

65 70 75 80

Glu Ile Lys Ala Val Ala Leu Arg Thr Val Ala Ile Lys Gly Val His

85 90 95

Ser Val Arg Tyr Leu Cys Met Gly Ala Asp Gly Lys Met Gln Gly Leu

100 105 110

Leu Gln Tyr Ser Glu Glu Asp Cys Ala Phe Glu Glu Glu Ile Arg Pro

115 120 125

Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Arg Ser Glu Lys His Arg Leu Pro Val Ser

130 135 140

Leu Ser Ser Ala Lys Gln Arg Gln Leu Tyr Lys Asn Arg Gly Phe Leu

145 150 155 160

Pro Leu Ser His Phe Leu Pro Met Leu Pro Met Val Pro Glu Glu Pro

165 170 175

Glu Asp Leu Arg Gly His Leu Glu Ser Asp Met Phe Ser Ser Pro Leu

180 185 190

Glu Thr Asp Ser Met Asp Pro Phe Gly Leu Val Thr Gly Leu Glu Ala

195 200 205

Val Arg Ser Pro Ser Phe Glu Lys

210 215

<210> 10

<211> 651

<212> DNA

<213> Human

<400> 10

atgggacgga gcgggtgtgt ggtggtccac gtatggatcc tggccggcct ctggctggcc 60

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cttccactct ctcatttcct gcccatgctg cccatggtcc cagaggagcc tgaggacctc 540

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<210> 11

<211> 1725

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60

catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120

acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180

ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240

aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300

ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360

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gcggggcgag gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc 600

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cgggctgtaa ttagcgcttg gtttaatgac ggcttgtttc ttttctgtgg ctgcgtgaaa 840

gccttgaggg gctccgggag ggccctttgt gcggggggag cggctcgggg ggtgcgtgcg 900

tgtgtgtgtg cgtggggagc gccgcgtgcg gctccgcgct gcccggcggc tgtgagcgct 960

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cccctccccg agttgctgag cacggcccgg cttcgggtgc ggggctccgt acggggcgtg 1200

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cctctagcgg gcgcggggcg aagcggtgcg gcgccggcag gaaggaaatg ggcggggagg 1500

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ggggggacgg ctgccttcgg gggggacggg gcagggcggg gttcggcttc tggcgtgtga 1620

ccggcggctc tagagcctct gctaaccatg ttcatgcctt cttctttttc ctacagctcc 1680

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<210> 12

<211> 640

<212> DNA

<213> herpesvirus

<400> 12

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atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180

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catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300

catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 360

atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 420

ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 480

acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg cctggagacg 540

ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgggac cgatccagcc tccgcggccg 600

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<210> 13

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

1 5

<210> 14

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tacccatacg atgttccaga ttacgct 27

<210> 15

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Ser Gly Phe Ala Asn Glu Leu Gly Pro Arg Leu Met Gly Lys

1 5 10

<210> 16

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agtggctttg cgaatgaatt gggacctagg ttgatgggca ag 42

<210> 17

<211> 5804

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gagactagtt ctagagcggc cgcggatccg aattcgaagc taattcactc caattcactc 60

ctcaggtgca ggctgcctat cagaaggtgg tggctggtgt ggccaatgcc ctggctcaca 120

aataccactg agatcttttt ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg aagccccttg 180

agcatctgac ttctggctaa taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg tgttggaatt 240

ttttgtgtct ctcactcgga aggacatatg ggagggcaaa tcatttaaaa catcagaatg 300

agtatttggt ttagagtttg gcaacatatg ccatatgctg gctgccatga acaaaggtgg 360

ctataaagag gtcatcagta tatgaaacag ccccctgctg tccattcctt attccataga 420

aaagccttga cttgaggtta gatttttttt atattttgtt ttgtgttatt tttttcttta 480

acatccctaa aattttcctt acatgtttta ctagccagat ttttcctcct ctcctgacta 540

ctcccagtca tagctgtccc tcttctctta tgaagatccc tcgacctgca gcccaagctt 600

ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca 660

caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact 720

cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagcg 780

gacgatctga caatgttcag tgcagagact cggctacgcc tcgtggactt tgaagttgac 840

caacaatgtt tattcttacc tctaatagtc ctctgtggca aggtcaagat tctgttagaa 900

gccaatgaag aacctggttg ttcaataaca ttttgttcgt ctaatatttc actaccgctt 960

gacgttggct gcacttcatg tacctcatct ataaacgctt cttctgtatc gctctggacg 1020

tcatcttcac ttacgtgatc tgatatttca ctgtcagaat cctcaccaac aagctcgtca 1080

tcgctttgca gaagagcaga gaggatatgc tcatcgtcta aagaactacc cattttatta 1140

tatattagtc acgatatcta taacaagaaa atatatatat aataagttat cacgtaagta 1200

gaacatgaaa taacaatata attatcgtat gagttaaatc ttaaaagtca cgtaaaagat 1260

aatcatgcgt cattttgact cacgcggtcg ttatagttca aaatcagtga cacttaccgc 1320

attgacaagc acgcctcacg ggagctccaa gcggcgactg agatgtccta aatgcacagc 1380

gacggattcg cgctatttag aaagagagag caatatttca agaatgcatg cgtcaatttt 1440

acgcagacta tctttctagg gttaaaaaag atttgcgctt tactcgacct aaactttaaa 1500

cacgtcatag aatcttcgtt tgacaaaaac cacattgtgg ccaagctgtg tgacgcgacg 1560

cgcgctaaag aatggcaaac caagtcgcgc gagcgtcgac ctcgaggggg ggcccggtac 1620

ccagcttttg ttccctttag tgagggttaa ttgcgcgctt ggcgtaatca tggtcatagc 1680

tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca 1740

taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct 1800

cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac 1860

gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc 1920

tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt 1980

tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 2040

ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 2100

agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 2160

accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 2220

ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 2280

gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 2340

ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 2400

gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 2460

taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag 2520

tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 2580

gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 2640

cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 2700

agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 2760

cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 2820

cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 2880

ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 2940

taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 3000

tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 3060

ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 3120

atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 3180

gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 3240

tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 3300

cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 3360

taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 3420

ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa 3480

ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 3540

cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 3600

ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 3660

gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 3720

gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 3780

aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgcg ccctgtagcg 3840

gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg 3900

ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc 3960

cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc 4020

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<212> DNA

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caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag 5160

caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 5220

ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 5280

cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 5340

ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 5400

tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 5460

gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 5520

ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 5580

ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 5640

gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 5700

aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 5760

tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 5820

ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 5880

tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 5940

aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta 6000

tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa 6060

ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac 6120

gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa 6180

gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag 6240

taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg 6300

tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag 6360

ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg 6420

tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc 6480

ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat 6540

tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata 6600

ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa 6660

aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca 6720

actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc 6780

aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc 6840

tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg 6900

aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 6960

ctgacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga 7020

ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg 7080

ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat 7140

ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg 7200

ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 7260

gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 7320

tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 7380

ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaatttc cattcgccat tcaggctgcg 7440

caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 7500

gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 7560

taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tggagctcca 7620

ccgcggccgc ccggtttatc gttaatatgg atcaatttga acagttgatt aacgtgtctc 7680

tgctcaagtc tttgatcaaa acgcaaatcg acgaaaatgt gtcggacaat atcaagtcga 7740

tgagcgaaaa actaaaaagg ctagaatacg acaatctcac agacagcgtt gagatatacg 7800

gtattcacga cagcaggctg aataataaaa aaattagaaa ctattattta accctagaaa 7860

gataatcata ttgtgacgta cgttaaagat aatcatgcgt aaaattgacg catgtgtttt 7920

atcggtctgt atatcgaggt ttatttatta atttgaatag atattaagtt ttattatatt 7980

tacacttaca tactaataat aaattcaaca aacaatttat ttatgtttat ttatttatta 8040

aaaaaaaaca aaaactcaaa atttcttcta taaagtaaca aaacttttaa acattctctc 8100

ttttacaaaa ataaacttat tttgtacttt aaaaacagtc atgttgtatt ataaaataag 8160

taattagctt aacttataca taatagaaac aaattatact tattagtcag tcagaaacaa 8220

ctttggcaca tatcaatatt atgctctcga caaataactt ttttgcattt tttgcacgat 8280

gcatttgcct ttcgccttat tttagagggg cagtaagtac agtaagtacg ttttttcatt 8340

actggctctt cagtactgtc atctgatgta ccaggcactt catttggcaa aatattagag 8400

atattatcgc gcaaatatct cttcaaagta ggagcttcta aacgcttacg cataaacgat 8460

gacgtcaggc tcatgtaaag gtttctcata aattttttgc gactttgaac cttttctccc 8520

ttgctactga cattatggct gtatataata aaagaattta tgcaggcaat gtttatcatt 8580

ccgtacaata atgccatagg ccacctattc gtcttcctac tgcaggtcat cacagaacac 8640

atttggtcta gcgtgtccac tccgccttta gtttgattat aatacataac catttgcggt 8700

ttaccggtac tttcgttgat agaagcatcc tcatcacaag atgataataa gtataccatc 8760

ttagctggct tcggtttata tgagacgaga gtaaggggtc cgtcaaaaca aaacatcgat 8820

gttcccactg gcctggagcg actgtttttc agtacttccg gtatctcgcg tttgtttgat 8880

cgcacggttc ccacaatggt taattcgagc tcgcccaaac cgggcgcgcc gggcatttaa 8940

at 8942

<210> 23

<211> 8942

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ctgacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga 60

ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg 120

ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat 180

ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg 240

ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 300

gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 360

tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 420

ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaatttc cattcgccat tcaggctgcg 480

caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540

gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600

taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tggagctcca 660

ccgcggccgc ccggtttatc gttaatatgg atcaatttga acagttgatt aacgtgtctc 720

tgctcaagtc tttgatcaaa acgcaaatcg acgaaaatgt gtcggacaat atcaagtcga 780

tgagcgaaaa actaaaaagg ctagaatacg acaatctcac agacagcgtt gagatatacg 840

gtattcacga cagcaggctg aataataaaa aaattagaaa ctattattta accctagaaa 900

gataatcata ttgtgacgta cgttaaagat aatcatgcgt aaaattgacg catgtgtttt 960

atcggtctgt atatcgaggt ttatttatta atttgaatag atattaagtt ttattatatt 1020

tacacttaca tactaataat aaattcaaca aacaatttat ttatgtttat ttatttatta 1080

aaaaaaaaca aaaactcaaa atttcttcta taaagtaaca aaacttttaa acattctctc 1140

ttttacaaaa ataaacttat tttgtacttt aaaaacagtc atgttgtatt ataaaataag 1200

taattagctt aacttataca taatagaaac aaattatact tattagtcag tcagaaacaa 1260

ctttggcaca tatcaatatt atgctctcga caaataactt ttttgcattt tttgcacgat 1320

gcatttgcct ttcgccttat tttagagggg cagtaagtac agtaagtacg ttttttcatt 1380

actggctctt cagtactgtc atctgatgta ccaggcactt catttggcaa aatattagag 1440

atattatcgc gcaaatatct cttcaaagta ggagcttcta aacgcttacg cataaacgat 1500

gacgtcaggc tcatgtaaag gtttctcata aattttttgc gactttgaac cttttctccc 1560

ttgctactga cattatggct gtatataata aaagaattta tgcaggcaat gtttatcatt 1620

ccgtacaata atgccatagg ccacctattc gtcttcctac tgcaggtcat cacagaacac 1680

atttggtcta gcgtgtccac tccgccttta gtttgattat aatacataac catttgcggt 1740

ttaccggtac tttcgttgat agaagcatcc tcatcacaag atgataataa gtataccatc 1800

ttagctggct tcggtttata tgagacgaga gtaaggggtc cgtcaaaaca aaacatcgat 1860

gttcccactg gcctggagcg actgtttttc agtacttccg gtatctcgcg tttgtttgat 1920

cgcacggttc ccacaatggt taattcgagc tcgcccaaac cgggcgcgcc gggcatttac 1980

tagtcggaat tccggatcct ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac 2040

cattatggat ccgttaatta agactgatag tgacctgttc gttgcaacaa attgataagc 2100

aatgctttct tataatgcca actttgtaca agaaagctgg gttctagatg tccacgtccc 2160

gcacgtcggt gggtgtgcaa gccaggtcca cctcctcctc ctcctcttcc tcctcctcgg 2220

cggccttggg gtccatgttc tgctgggcct ggcgcaggct tgactccagc agggcttcga 2280

tctgctcctg gcaggcccgg aggcagtccg ggtcacactt gatcactctg gagaggaagc 2340

gtgtgaggcg gtagtaggac aggaagttgt tggggctcct caggttcagg ccttgcactg 2400

cggccaccac gctccccgct gccaccatgg agggcggatt ggaaatgaac ttcacatctg 2460

tggcacagag ggcaacgaag gtctgcgcgt gtttgcggat gatctgtttg ttctcctccg 2520

cctctggcat tttggagagg aagtgttcaa tgaaatcgtg cggggtcatt gcggccaggt 2580

tccacttgag cttgttcacc aggagcagct ccatttgcag cagctcctcg ggccggatgg 2640

agttgtcggt gtagatgcac agcttctcgg ccgtcagggg gatggtctcc ttcatcttag 2700

aggccacgaa catgcaagtg gcccccagca gctgcaggcg gctctttttc acgggctcca 2760

gcgacaggaa gcggtccagg tagttcatgg ccagcgggaa gacctcctcc tcgcacttct 2820

gttcctcgca gacctccagc atccaggtgg cgacgatctt ccgcatggac ggcaggacct 2880

ccttctgcac acatttgaag taggacaccg agggcgcgca ggtctcctcc gccttcagca 2940

tggcccgcag cacccggtcg ttgaggaggt tggcatcggg gtacgcgcgg cggatggttt 3000

ccacttcgca gcacaggagc tggtgttcca ttccgcctcc cttgcccatc aacctaggtc 3060

ccaattcatt cgcaaagcca cttcccatgg atcaattcct gcaggtccgt tccaatgcac 3120

cgttcccggc cgcggaggct ggatcggtcc cggtgtcttc tatggaggtc aaaacagcgt 3180

ggatggcgtc tccaggcgat ctgacggttc actaaacgag ctctgcttat atagacctcc 3240

caccgtacac gcctaccgcc catttgcgtc aatggggcgg agttgttacg acattttgga 3300

aagtcccgtt gattttggtg ccaaaacaaa ctcccattga cgtcaatggg gtggagactt 3360

ggaaatcccc gtgagtcaaa ccgctatcca cgcccattga tgtactgcca aaaccgcatc 3420

accatggtaa tagcgatgac taatacgtag atgtactgcc aagtaggaaa gtcccataag 3480

gtcatgtact gggcataatg ccaggcgggc catttaccgt cattgacgtc aatagggggc 3540

gtacttggca tatgatacac ttgatgtact gccaagtggg cagtttaccg taaatactcc 3600

acccattgac gtcaatggaa agtccctatt ggcgttacta tgggaacata cgtcattatt 3660

gacgtcaatg ggcgggggtc gttgggcggt cagccaggcg ggccatttac cgtaagttat 3720

gtaacggact ctagaggatc gatcccccag atcgatcccc cagatcttca attccggcgc 3780

ctagagaagg agtgagggct gaaatgggat ctgggggatc gatcctctag agtccgttac 3840

ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc 3900

aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt 3960

ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac 4020

gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac 4080

cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt 4140

gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc 4200

aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt 4260

tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg 4320

ggaggtctat ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga gacgccatcc 4380

acgctgtttt gacctccata gaagacaccg ggaccgatcc agcctccgcg gccgggaacg 4440

gtgcattgga acggacctgc aggaattgat ccgcatggga cggagcgggt gtgtggtggt 4500

ccacgtatgg atcctggccg gcctctggct ggccgtggcc gggcgccccc tcgccttctc 4560

ggacgcgggg ccccacgtgc actacggctg gggcgacccc atccgcctgc ggcacctgta 4620

cacctccggc ccccacgggc tctccagctg cttcctgcgc atccgtgccg acggcgtcgt 4680

ggactgcgcg cggggccaga gcgcgcacag tttgctggag atcaaggcag tcgctctgcg 4740

gaccgtggcc atcaagggcg tgcacagcgt gcggtacctc tgcatgggcg ccgacggcaa 4800

gatgcagggg ctgcttcagt actcggagga agactgtgct ttcgaggagg agatccgccc 4860

agatggctac aatgtgtacc gatccgagaa gcaccgcctc ccggtctccc tgagcagtgc 4920

caaacagcgg cagctgtaca agaacagagg ctttcttcca ctctctcatt tcctgcccat 4980

gctgcccatg gtcccagagg agcctgagga cctcaggggc cacttggaat ctgacatgtt 5040

ctcttcgccc ctggagaccg acagcatgga cccatttggg cttgtcaccg gactggaggc 5100

cgtgaggagt cccagctttg agaagggagg cggataccca tacgatgttc cagattacgc 5160

ttgaaattcg aaattcactc ctcaggtgca ggctgcctat cagaaggtgg tggctggtgt 5220

ggccaatgcc ctggctcaca aataccactg agatcttttt ccctctgcca aaaattatgg 5280

ggacatcatg aagccccttg agcatctgac ttctggctaa taaaggaaat ttattttcat 5340

tgcaatagtg tgttggaatt ttttgtgtct ctcactcgga aggacatatg ggagggcaaa 5400

tcatttaaaa catcagaatg agtatttggt ttagagtttg gcaacatatg ccatatgctg 5460

gctgccatga acaaaggtgg ctataaagag gtcatcagta tatgaaacag ccccctgctg 5520

tccattcctt attccataga aaagccttga cttgaggtta gatttttttt atattttgtt 5580

ttgtgttatt tttttcttta acatccctaa aattttcctt acatgtttta ctagccagat 5640

ttttcctcct ctcctgacta ctcccagtca tagctgtccc tcttctctta tgaagatccc 5700

tcgacctgca gcccaagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt 5760

tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt 5820

gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg 5880

ggaaacctgt cgtgccagcg gacgatctga caatgttcag tgcagagact cggctacgcc 5940

tcgtggactt tgaagttgac caacaatgtt tattcttacc tctaatagtc ctctgtggca 6000

aggtcaagat tctgttagaa gccaatgaag aacctggttg ttcaataaca ttttgttcgt 6060

ctaatatttc actaccgctt gacgttggct gcacttcatg tacctcatct ataaacgctt 6120

cttctgtatc gctctggacg tcatcttcac ttacgtgatc tgatatttca ctgtcagaat 6180

cctcaccaac aagctcgtca tcgctttgca gaagagcaga gaggatatgc tcatcgtcta 6240

aagaactacc cattttatta tatattagtc acgatatcta taacaagaaa atatatatat 6300

aataagttat cacgtaagta gaacatgaaa taacaatata attatcgtat gagttaaatc 6360

ttaaaagtca cgtaaaagat aatcatgcgt cattttgact cacgcggtcg ttatagttca 6420

aaatcagtga cacttaccgc attgacaagc acgcctcacg ggagctccaa gcggcgactg 6480

agatgtccta aatgcacagc gacggattcg cgctatttag aaagagagag caatatttca 6540

agaatgcatg cgtcaatttt acgcagacta tctttctagg gttaaaaaag atttgcgctt 6600

tactcgacct aaactttaaa cacgtcatag aatcttcgtt tgacaaaaac cacattgtgg 6660

ccaagctgtg tgacgcgacg cgcgctaaag aatggcaaac caagtcgcgc gagcgtcgac 6720

ctcgaggggg ggcccggtac ccagcttttg ttccctttag tgagggttaa ttgcgcgctt 6780

ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca 6840

caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact 6900

cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct 6960

gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc 7020

ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca 7080

ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 7140

agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 7200

taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 7260

cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 7320

tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 7380

gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 7440

gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 7500

tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 7560

gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 7620

cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg 7680

aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt 7740

tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt 7800

ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag 7860

attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat 7920

ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc 7980

tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat 8040

aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc 8100

acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag 8160

aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag 8220

agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt 8280

ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg 8340

agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt 8400

tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc 8460

tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc 8520

attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa 8580

taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg 8640

aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc 8700

caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag 8760

gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt 8820

cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 8880

tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc 8940

ac 8942

Claims (10)

1.ー种基因转移载体，其选自：

(1)所述基因转移载体包含转座子表达载体以及表达转座酶的辅助质粒，其中，所述转座子表达载体包含转座子5’末端重复序列和转座子3’末端重复序列以及在两者之间的多克隆插入位点，所述辅助质粒包含转座酶编码基因及其启动子；或

(2)所述基因转移载体包含转座子5’末端重复序列和3’末端重复序列以及在两者之间的多克隆插入位点、转座酶编码序列以及控制所述转座酶表达的启动子；

其中，所述多克隆插入位点用于可操作地插入外源基因编码序列以及可选的控制外源基因表达的启动子；所述外源基因选自癌基因和FGF基因中的一种或多种。

2.权利要求1所述的基因转移载体，其中，所述转座子选自piggyBac、SleepingBeauty、Mos1、Tc1/mariner、Tol2、微型Tol2(mini-Tol2)、Tc3、MuA、Himar I和FrogPrince；

优选地，所述转座子为piggyBac转座子；

优选地，所述转座子5’末端重复序列为PiggyBac转座子5’末端重复序列；更优选地，所述PiggyBac转座子5’末端重复序列的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述5’末端重复序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

优选地，所述转座子3’末端重复序列为PiggyBac转座子3’末端重复序列；更优选地，所述PiggyBac转座子3’末端重复序列的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述3’末端重复序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

优选地，所述转座酶为PiggyBac转座酶；优选地，所述PiggyBac转座酶的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述PiggyBac转座酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；优选地，所述PiggyBac转座酶基因的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:4所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述PiggyBac转座酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

优选地，所述癌基因选自MYC、CCND1、CTNNB1、JAK1、MET、NFE2L2、EGFR、RAS、AKT和PIK3CA；

优选地，所述MYC选自c-MYC、n-MYC、L-MYC、r-MYC；优选地，所述癌基因为c-MYC和CCND1；优选地，所述c-MYC的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述c-MYC的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；更优选地，所述c-MYC基因的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:6所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述c-MYC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

优选地，所述CCND1的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:7所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述CCND1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；优选地，所述CCND1基因的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:8所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述CCND1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；

优选地，所述FGF为FGF19；优选地，所述FGF19的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:9所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述FGF19的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；优选地，所述FGF19基因的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:10所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述FGF19基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

优选地，所述启动子选自CMV启动子、CAG启动子、EF1α启动子、SV40启动子、UbiquitinB启动子、HSP70启动子、PGK-1启动子、β-actin启动子、TK启动子和GRP78启动子；

优选地，所述MYC的启动子为CAG启动子；更优选地，所述CAG启动子包含与SEQ ID NO:11所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述CAG启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；

优选地，所述CCND1和FGF19的启动子为CMV启动子；更优选地，所述CMV启动子包含与SEQ ID NO:12所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述CMV启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；优选地，所述CCND1的表达框的方向与FGF19基因表达框的方向相反；

优选地，所述转座子表达载体具有表达标签；优选地，所述表达标签选自HA、Ollas、Flag、Myc-tag和V5；

优选地，所述HA的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:13所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述HA的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；更优选地，所述HA基因的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:14所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；

优选地，所述Ollas的氨基酸序列包含与SEQ ID NO:15所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述Ollas的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；更优选地，所述Ollas基因的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:16所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述Ollas基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。

3.权利要求1或2所述的基因转移载体，其中，所述基因转移载体包含第一转座子表达载体、第二转座子表达载体以及表达转座酶的辅助质粒，第一转座子表达载体插入的外源基因为MYC，第二转座子表达载体插入的外源基因为CCND1和FGF19；

优选地，所述辅助质粒包含与SEQ ID NO:21所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述辅助质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；

优选地，所述第一转座子表达载体中，所述MYC的表达标签为HA；优选地，所述第一转座子表达载体包含与SEQ ID NO:22所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述第一转座子表达载体的核苷酸序列如SEQID NO:22所示；

优选地，所述第二转座子表达载体中，所述FGF19的表达标签为HA；优选地，所述CCND1的表达标签为Ollas；优选地，所述第二转座子表达载体包含与SEQ ID NO:23所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述第二转座子表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示。

4.一种制备肝母细胞瘤动物的方法，包括：

(1)构建权利要求1所述的基因转移载体；

(2)将步骤(1)构建的基因转移载体导入动物，获得携带肝母细胞瘤的动物；

优选地，所述方法还包括：(3)鉴定所述的肝母细胞瘤动物；

优选地，所述方法还包括：(4)将步骤(3)鉴定后的动物作为肝母细胞瘤动物模型；

优选地，所述鉴定包括检测外源基因、检测外源基因编码蛋白和/或鉴定肿瘤细胞的病理表型；

优选地，所述检测外源基因编码蛋白通过靶向HA或Ollas的免疫组化染色来检测；

优选地，所述病理表型表现出接近人肝母细胞瘤的病理特征；更优选地，所述病理特征选自：病理表型接近人胚胎上皮细胞样肝母细胞瘤的特征，HE染色呈现肿瘤高核质比，肿瘤细胞边缘模糊，多分裂相以及细胞呈腺状或管状排列，髓外造血现象明显，出现巨核细胞和成簇的幼红细胞；

优选地，免疫组化染色表型选自：细胞增殖标志物pH3染色表现高比例阳性信号、甲胎蛋白AFP染色阳性、Ly76染色阳性、B220染色阳性、MPO染色阳性和CD34染阳性；

优选地，所述动物为小鼠。

5.转基因动物的细胞或组织，其来自由权利要求4所述的方法所制备的动物。

6.一种筛选用于治疗肝母细胞瘤的药物候选物的方法，其包括：

(1)将药物候选物施用于权利要求4所述的方法所制备的动物或权利要求5所述的细胞或组织；

(2)测量所述肝母细胞瘤的肿瘤细胞对所述治疗的响应。

7.权利要求6的方法，其中步骤(2)包括评估所述药物候选物引起至少一种选自下组的响应的能力：减少肿瘤细胞数目，缩小肿瘤尺寸或肿瘤负荷，抑制肿瘤细胞浸润入周围器官，抑制肿瘤转移，抑制肿瘤生长，和促进肿瘤细胞死亡。

8.权利要求6或7所述的方法，所述药物候选物为小分子化合物，肽，多肽，抗体，RNA，病毒，或细胞。

9.权利要求8所述的方法，其中，所述药物候选物为小分子化合物；

优选地，所述小分子化合物为lxazomib。

10.权利要求4的方法制备的动物在肝母细胞瘤相关研究中的应用，所述应用不是疾病的诊断和治疗方法，所述的应用包括：在体内研究治疗肝母细胞瘤药物的筛选、药效检测、验证或评价。

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