CN113549614A - 一种circle FOXP1 RNA分子及其合成方法与应用 - Google Patents

一种circle FOXP1 RNA分子及其合成方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药学技术领域，尤其涉及一种circleFOXP1RNA分子及其合成方法与应用。circleFOXP1RNA分子的合成包括如下步骤：(1)以线性化的FOXP1DNA为模板，进行转录，得到线性化的FOXP1RNA；(2)将线性化的FOXP1RNA进行连接，得到circleFOXP1RNA。本发明合成得到的circleFOXP1RNA分子能够促进FOXP1基因的表达，促进间充质干细胞增殖，延缓间充质干细胞衰老，还能促进软骨再生，抑制关节炎。

Description

一种circle FOXP1 RNA分子及其合成方法与应用
技术领域
本发明涉及生物医药学技术领域，尤其涉及一种circle FOXP1 RNA分子及其合成方法与应用。
背景技术
骨性关节炎是一种以由关节软骨纤维化、皲裂、溃疡和脱失为主要病理特征的骨科常见疾病，属于退行性病变。骨关节炎的临床症状主要为关节疼痛。现有技术中用于骨关节炎治疗的药物包括：(1)炎症抑制药物：包括非甾体类药物，玻璃酸钠等；这类药物只能暂时延缓骨关节的炎症和关节软骨的降解，不能终止与逆转炎症反应，终止骨关节炎的病理进程；而且长时间服用非甾体类抗炎药物，还有一定的副作用。(2)抗骨质疏松药物：包括双膦酸盐等药物；这类药物虽然能促进骨再生，但是容易导致关节表面形成骨刺与骨赘，加剧关节疼痛。(3)氨基葡萄糖类药物：包括透明质酸等，这类药物只能起润滑关节的作用，并没有终止炎症反应的作用。(4)间充质干细胞(MSCs)治疗：这种治疗方法在体内长期驻留的比例低，基本上1周后就开始迅速衰减，甚至消失。(5)microRNA核酸分子药物miR-140，虽然以证明对大鼠软骨退变具有显著抑制作用，但存在非靶向聚集、生物利用率低以及不能及时清除的缺陷。综上可以看出，现有技术中用于治疗骨关节炎的药物还存在一定的缺陷。
最新研究发现FOXP1是一类新型的骨髓间充质干细胞抗衰老因子。FOXP1蛋白是隶属于Forkhead转录因子家族的一员。拥有一个100个氨基酸构成的保守的DNA结合区，这个保守的结构区被称为“Forkhead”，还包括锌指结构(zinc finger)和Leucine Zipper结构区。FOXP1在骨髓干细胞群体(SSCs)中的表达水平随衰老进程而下降。敲除小鼠骨骼SSCs中的FOXP1基因，小鼠表现出明显的骨质疏松，成骨分化能力下降；骨髓SSCs自我更新能力下降，p16INK4a表达水平上升等一系列衰老症状。
可见FOXP1蛋白可以调控骨骼干细胞的衰老。但现有技术并未发现一种可以促进FOXP1基因表达的物质，用于调控骨骼干细胞，从而用于治疗骨关节炎，来填充现有技术治疗骨关节炎引起的不足。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的为提供一种可以促进FOXP1基因表达的分子，从而更有效的治疗骨关节炎。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种circle FOXP1 RNA分子的合成方法，包括如下步骤：
(1)以线性化的FOXP1 DNA为模板，进行转录，得到线性化的FOXP1RNA；
(2)将线性化的FOXP1 RNA进行连接，得到circle FOXP1 RNA；
circle FOXP1 RNA的序列如SEQ ID NO.1所示；
circle FOXP1 RNA的序列长度为692nt。
作为优选，转录的体系包括：2.0μL的10×NTP labeling mixture；2.0μL的10×Transcriptionbuffer；1.0μL的Protector RNase inhibitor；2.0μL的20U/μl的RNA转录酶；线性化的FOXP1 DNA 1μg；DEPC-treated ddH2O；
RNA转录酶为SP6、T7或T3中的一种或几种。
作为优选，转录的温度为36～38℃；转录的时间为1.5～2.5h。
作为优选，连接的体系包括：0.0125U/μL T4 RNA连接酶；50mM Tris-HCl缓冲液；2mM MgCl2；1mM DTT；0.4mMATP；1μM搭桥引物；
作为优选，搭桥引物的序列如SEQ ID NO.2所示。
作为优选，连接的温度为36～38℃；连接的时间为3～4h。
本发明还提供了所述的方法合成得到的circle FOXP1 RNA分子。
本发明还提供了包含所述的circle FOXP1 RNA分子的包裹体，包裹体为脂质体LNP包裹的circle FOXP1 RNA分子或类病毒载体包裹的circle FOXP1 RNA分子。
本发明还提供了所述的circle FOXP1 RNA分子在制备促进FOXP1基因表达药物、促进间充质干细胞增殖药物、延缓间充质干细胞衰老药物或抑制骨关节炎药物中的应用。
本发明还提供了所述的circle FOXP1 RNA分子的包裹体在制备促进FOXP1基因表达药物、促进间充质干细胞增殖药物、延缓间充质干细胞衰老药物或抑制骨关节炎药物中的应用。
本发明提供了一种circle FOXP1 RNA分子及其合成方法与应用。本发明合成的circle FOXP1 RNA分子具有如下功能：
(1)可调控骨骼干细胞增殖、衰老进程，既能消炎，又能促进软骨细胞再生；
(2)将本发明的分子用于治疗骨关节炎时，可以起到治标和治本的作用，比单纯的干细胞疗法的疗效更持久；
(3)本发明的分子对人脐带来源的间充质干细胞药物进行增殖调控，避免了基因改造脱靶效应，相对于针对干细胞本身的基因改造赋能技术，更加安全；
(4)本发明的分子稳定，免疫原性低，易于获得。
附图说明
图1为类病毒载体包裹circle FOXP1 RNA分子的制备方法图。
图2为pMSCV-circFOXP1质粒载体图。
图3为pCMV-circFOXP1-8XMS2载体图。
图4为pMS2S-PH-GagPol-D64V质粒载体图。
图5为circle FOXP1 RNA分子促进FOXP1基因表达结果图。
图6为circle FOXP1 RNA分子促进脐带干细胞增殖结果图。
图7为circle FOXP1 RNA分子对脐带干细胞中P16、P21、P27基因表达的影响图。
图8为circle FOXP1 RNA分子对脐带干细胞成骨分化、软化分化和脂肪形成的影响图(A为对干细胞成骨分化影响图，B为对干细胞成软骨分化影响图，C为对干细胞脂肪形成的影响图)。
图9为FOXP1 RNA分子对小鼠关节软骨结构的影响图(A为Safranin O染色结果图，B为对MMP13蛋白抗体免疫组分析结果图)。
图10为FOXP1 RNA分子对骨关节炎小鼠的软骨结果的影响图。
具体实施方式
在本发明中脂质体LNP包裹的circle FOXP1 RNA分子的制备方法包括如下步骤：
(1)采用pH4.0，浓度为10mmol/L的柠檬酸缓冲液将circle FOXP1RNA分子稀释成1mg/mL的溶液，得到circle FOXP1 RNA分子溶液；
(2)利用适量的乙醇，将LNPs脂质体进行溶解，得到LNPs脂质体乙醇溶液；
(3)用LNPs脂质体乙醇溶液在纳米流体混合泵上包裹circle FOXP1RNA分子溶液，得到脂质体LNP包裹的circle FOXP1 RNA分子。
LNPs脂质体中包括摩尔比为40:10:40:10的氨基脂质、二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇和(R)-2,3-双(十八烷基氧基)丙基-1-(甲氧基聚乙二醇2000)丙基氨基甲酸酯。
LNPs脂质体的制备方法采用预成囊泡法制备。
在本发明中类病毒载体包裹的circle FOXP1 RNA分子的制备方法如图1所示，其制备方法包括如下步骤：
(1)将circle FOXP1 RNA分子插入到pMSCV载体上，得到pMSCV-circFOXP1质粒载体；
(2)在pMSCV-circFOXP1质粒载体PolyA片段后面插入8XMS2序列片段，得到pCMV-circFOXP1-8XMS2载体；
(3)将pCMV-circFOXP1-8XMS2载体与pMD.2G载体和pMS2S-PH-GagPol-D64V质粒载体，共同转染293T细胞，培养48h后，收集细胞上清液，得到类病毒载体包裹的circle FOXP1RNA分子。
pMSCV-circFOXP1质粒载体如图2所示，其序列如SEQ ID NO.3所示；
pCMV-circFOXP1-8XMS2载体如图3所示，其序列如SEQ ID NO.4所示；
pMS2S-PH-GagPol-D64V质粒载体如图4所示，其序列如SEQ ID NO.5所示。
在本发明中脂质体LNP包裹的circle FOXP1 RNA分子和类病毒载体包裹的circleFOXP1 RNA分子与本发明实施例中所述的circle FOXP1 RNA分子具有相同的功效，实施例是以单独的circle FOXP1 RNA分子进行的举例说明。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1circle FOXP1 RNA分子的合成
按如下步骤合成SEQ ID NO.1所示的circle FOXP1 RNA分子：
(1)将SEQ ID NO.6所示的circle FOXP1DNA插入含有T7启动子的pUCm-T载体后，用内切酶将其线性化，得到线性化的FOXP1 DNA；
(2)以线性化的FOXP1 DNA为模板，在37℃条件下进行转录，转录2h后，得到线性化的FOXP1 RNA；
(3)将线性化的FOXP1 RNA在37℃条件进行连接，连接3h，得到circle FOXP1 RNA；
(4)对circle FOXP1 RNA依次采用质量分数为5％的PAGE变性胶、1unit/μLRNA酶R和FPLC纯化后得到纯circle FOXP1 RNA分子。
转录体系为20μL，转录体系如下：
Figure BDA0003217837640000051
连接体系如下：
0.0125U/μLT4 RNA连接酶；50mM Tris-HCl缓冲液；2mM MgCl2；1mM DTT；0.4mMATP；SEQ ID NO.2所示的1μM搭桥引物。
实施例2circle FOXP1 RNA分子促进FOXP1基因转录和表达实验
将circle FOXP1 RNA分子注入P20代脐带间充质干细胞中进行过表达，采用定量PCR分析的方法检测FOXP1基因的表达情况。以不注入circle FOXP1 RNA分子的P20代脐带间充质干细胞为对照。结果如图5所示。
图5显示，circle FOXP1 RNA分子可以促进FOXP1基因的表达。由于201611085228.0专利中已经公开了FOXP1基因过表达可以延缓人源间充质干细胞的衰老。因此本发明的circle FOXP1 RNA分子有望作为延缓间充质干细胞衰老的重要分子机制。
实施例3circle FOXP1 RNA分子促进间充质干细胞增殖、减缓衰老，向成骨、软骨、脂肪分化的研究
利用逆转录病毒为载体，在第16代的脐带间充质干细胞中，过表达circle FOXP1RNA，以逆转录病毒空载体为对照，观察过表达circle FOXP1 RNA分子对脐带间充质干细胞的增殖速度、衰老进程，成骨、成软骨分化和脂肪分化的影响。
circle FOXP1 RNA分子对脐带间充质干细胞的增殖速度的结果如图6所示；circle FOXP1 RNA分子对脐带间充质干细胞中P16、P21、P27基因表达的影响如图7所示；circle FOXP1 RNA分子对脐带间充质干细胞成骨分化、成软骨分化和脂肪分化的影响如图8所示。
circle FOXP1 RNA分子对脐带间充质干细胞成骨分化影响时，采用碱性磷酸酶细胞染色以及成骨标记基因定量PCR检测得到的。
circle FOXP1 RNA分子对脐带间充质干细胞成软骨分化影响时，采用AlcianBlue细胞染色以及软骨标记基因定量PCR检测得到。
circle FOXP1 RNA分子对脐带间充质干细胞脂肪分化的影响时，采用油红染色以及脂标记基因定量PCR检测。
图6～8显示，circle FOXP1 RNA分子能促进脐带间充质干细胞的增殖；减慢脐带间充质干细胞中P16、P21、P27衰老基因的表达；加强脐带间充质干细胞向成骨、软骨和脂肪分化。
实施例4FOXP1 RNA分子在改善关节软骨结构，抑制骨关节炎发生中的应用
在2月龄的Prx1-Cre(选择性基因敲除小鼠模型)的小鼠骨骼干细胞(SSCs)中过表达FOXP1 RNA分子，将过表达的小鼠标记为FOXP1Prx1 Tg/Tg，对照小鼠中不表达circle FOXP1RNA分子，将对照小鼠标记为FOXP1Tg/Tg。然后通过Safranin O染色检测各小鼠膝关节股骨端关节软骨结构。关节软骨切片后运用MMP13蛋白抗体进行免疫组化染色，观察各小鼠关节软骨组织中MMP13的表达水平。结果如图9所示。
图中红色代表的II型胶原蛋白在关节软骨表面的覆盖程度。
图9显示，红色代表的II型胶原蛋白在整个关节软骨表面覆盖的完整性，相对于对照小鼠明显要好；FOXP1Prx1 Tg/Tg小鼠关节软骨组织中MMP13的表达水平相对降低。说明在SSCs中过表达FOXP1 RNA，能促进SSCs增殖与软骨再生能力，改善关节软骨结构。
之后利用十字韧带切除手术(DMM)，诱导各组小鼠发生骨关节炎。在小鼠手术后4周，通过切片染色观察，各组小鼠的软骨组织结构。结果如图10所示。
图10显示，FOXP1Prx1 Tg/Tg小鼠红色染色的软骨组织比对照要厚，关节软骨保持比较完整。这一结果说明在SSCs中过表达FOXP1 RNA能治疗和抑制骨关节炎。
由以上实施例可知，本发明提供了一种circle FOXP1 RNA分子及其合成方法与应用。本发明合成的circle FOXP1 RNA分子具有如下功能：
(1)可调控骨骼干细胞增殖、衰老进程，既能消炎，又能促进软骨细胞再生；
(2)将本发明的分子用于治疗骨关节炎时，可以起到治标和治本的作用，比单纯的干细胞疗法的疗效更持久；
(3)本发明的分子对人脐带来源的间充质干细胞药物进行增殖调控，避免了基因改造脱靶效应，相对于针对干细胞本身的基因改造赋能技术，更加安全；
(4)本发明的分子稳定，免疫原性低，易于获得。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 安可来（重庆）生物医药科技有限公司
<120> 一种circle FOXP1 RNA分子及其合成方法与应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 692
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gccgccgtcc ccttctccct ctccagcctc ggggctgtcc gcggggggac ggctgccttc 3840
gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt gaccggcggc tctagagcct 3900
ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac gtgctggtta 3960
ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tcgggccgcg ttgacgcgca cggcaagagg 4020
cgaggggcgg cgactggtga gagatggcgt ccaatttcac gcagttcgtc ctggttgaca 4080
acggggggac tggggacgtt acggtcgctc cgagcaactt tgccaatggt attgcggagt 4140
ggatttcttc taattcacgg tcccaagctt acaaagtgac ctgttccgtg cggcaaagtt 4200
ctgctcagaa tagaaagtac actataaagg tcgaagtccc taagggggcc tggcgatcat 4260
atctcaatat ggagcttacc atcccaatat ttgccactaa ttctgattgt gaattgattg 4320
tcaaagcaat gcaaggactc ttgaaagacg gaaacccaat ccccagcgca atcgcagcca 4380
actccggtat ataagccaga actatccgat tgtgcagatg gactcgggcc gggacttcct 4440
gaccctgcac ggcctacagg atgatgagga tctacaggcg ctgctgaagg gcagccagct 4500
cctgaaggtg aagtccagct catggaggag agagcgcttc tacaagttgc aggaggactg 4560
caagaccatc tggcaggagt cccgcaaggt catgcggacc ccggagtccc agctgttctc 4620
catcgaggac attcaggagg tgcgaatggg gcaccgcacg gagggtctgg agaagttcgc 4680
ccgtgatgtg cccgaggacc gctgcttctc cattgtcttc aaggaccagc gcaatacact 4740
agacctcatc gccccatcgc cagctgatgc ccagcactgg gtgctggggc tgcacaagat 4800
catccaccac tcaggctcca tggaccagcg tcagaagcta cagcactgga ttcactcctg 4860
cttgcgaaaa gctgacaaaa acaaggacaa caagatgagc ttcaaggagc tgcagaactt 4920
cctgaagatg ggtgcgagag cgtcagtatt aagcggggga gaattagatc gatgggaaaa 4980
aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa atataaatta aaacatatag tatgggcaag 5040
cagggagcta gaacgattcg cagttaatcc tggcctgtta gaaacatcag aaggctgtag 5100
acaaatactg ggacagctac aaccatccct tcagacagga tcagaagaac ttagatcatt 5160
atataataca gtagcaaccc tctattgtgt gcatcaaagg atagagataa aagacaccaa 5220
ggaagcttta gacaagatag aggaagagca aaacaaaagt aagaaaaaag cacagcaagc 5280
agcagctgac acaggacaca gcaatcaggt cagccaaaat taccctatag tgcagaacat 5340
ccaggggcaa atggtacatc aggccatatc acctagaact ttaaatgcat gggtaaaagt 5400
agtagaagag aaggctttca gcccagaagt gatacccatg ttttcagcat tatcagaagg 5460
agccacccca caagatttaa acaccatgct aaacacagtg gggggacatc aagcagccat 5520
gcaaatgtta aaagagacca tcaatgagga agctgcagaa tgggatagag tgcatccagt 5580
gcatgcaggg cctattgcac caggccagat gagagaacca aggggaagtg acatagcagg 5640
aactactagt acccttcagg aacaaatagg atggatgaca cataatccac ctatcccagt 5700
aggagaaatc tataaaagat ggataatcct gggattaaat aaaatagtaa gaatgtatag 5760
ccctaccagc attctggaca taagacaagg accaaaggaa ccctttagag actatgtaga 5820
ccgattctat aaaactctaa gagccgagca agcttcacaa gaggtaaaaa attggatgac 5880
agaaaccttg ttggtccaaa atgcgaaccc agattgtaag actattttaa aagcattggg 5940
accaggagcg acactagaag aaatgatgac agcatgtcag ggagtggggg gacccggcca 6000
taaagcaaga gttttggctg aagcaatgag ccaagtaaca aatccagcta ccataatgat 6060
acagaaaggc aattttagga accaaagaaa gactgttaag tgtttcaatt gtggcaaaga 6120
agggcacata gccaaaaatt gcagggcccc taggaaaaag ggctgttgga aatgtggaaa 6180
ggaaggacac caaatgaaag attgtactga gagacaggct aattttttag ggaagatctg 6240
gccttcccac aagggaaggc cagggaattt tcttcagagc agaccagagc caacagcccc 6300
accagaagag agcttcaggt ttggggaaga gacaacaact ccctctcaga agcaggagcc 6360
gatagacaag gaactgtatc ctttagcttc cctcagatca ctctttggca gcgacccctc 6420
gtcacaataa agataggggg gcaattaaag gaagctctat tagatacagg agcagatgat 6480
acagtattag aagaaatgaa tttgccagga agatggaaac caaaaatgat agggggaatt 6540
ggaggtttta tcaaagtaag acagtatgat cagatactca tagaaatctg cggacataaa 6600
gctataggta cagtattagt aggacctaca cctgtcaaca taattggaag aaatctgttg 6660
actcagattg gctgcacttt aaattttccc attagtccta ttgagactgt accagtaaaa 6720
ttaaagccag gaatggatgg cccaaaagtt aaacaatggc cattgacaga agaaaaaata 6780
aaagcattag tagaaatttg tacagaaatg gaaaaggaag gaaaaatttc aaaaattggg 6840
cctgaaaatc catacaatac tccagtattt gccataaaga aaaaagacag tactaaatgg 6900
agaaaattag tagatttcag agaacttaat aagagaactc aagatttctg ggaagttcaa 6960
ttaggaatac cacatcctgc agggttaaaa cagaaaaaat cagtaacagt actggatgtg 7020
ggcgatgcat atttttcagt tcccttagat aaagacttca ggaagtatac tgcatttacc 7080
atacctagta taaacaatga gacaccaggg attagatatc agtacaatgt gcttccacag 7140
ggatggaaag gatcaccagc aatattccag tgtagcatga caaaaatctt agagcctttt 7200
agaaaacaaa atccagacat agtcatctat caatacatgg atgatttgta tgtaggatct 7260
gacttagaaa tagggcagca tagaacaaaa atagaggaac tgagacaaca tctgttgagg 7320
tggggattta ccacaccaga caaaaaacat cagaaagaac ctccattcct ttggatgggt 7380
tatgaactcc atcctgataa atggacagta cagcctatag tgctgccaga aaaggacagc 7440
tggactgtca atgacataca gaaattagtg ggaaaattga attgggcaag tcagatttat 7500
gcagggatta aagtaaggca attatgtaaa cttcttaggg gaaccaaagc actaacagaa 7560
gtagtaccac taacagaaga agcagagcta gaactggcag aaaacaggga gattctaaaa 7620
gaaccggtac atggagtgta ttatgaccca tcaaaagact taatagcaga aatacagaag 7680
caggggcaag gccaatggac atatcaaatt tatcaagagc catttaaaaa tctgaaaaca 7740
ggaaagtatg caagaatgaa gggtgcccac actaatgatg tgaaacaatt aacagaggca 7800
gtacaaaaaa tagccacaga aagcatagta atatggggaa agactcctaa atttaaatta 7860
cccatacaaa aggaaacatg ggaagcatgg tggacagagt attggcaagc cacctggatt 7920
cctgagtggg agtttgtcaa tacccctccc ttagtgaagt tatggtacca gttagagaaa 7980
gaacccataa taggagcaga aactttctat gtagatgggg cagccaatag ggaaactaaa 8040
ttaggaaaag caggatatgt aactgacaga ggaagacaaa aagttgtccc cctaacggac 8100
acaacaaatc agaagactga gttacaagca attcatctag ctttgcagga ttcgggatta 8160
gaagtaaaca tagtgacaga ctcacaatat gcattgggaa tcattcaagc acaaccagat 8220
aagagtgaat cagagttagt cagtcaaata atagagcagt taataaaaaa ggaaaaagtc 8280
tacctggcat gggtaccagc acacaaagga attggaggaa atgaacaagt agataaattg 8340
gtcagtgctg gaatcaggaa agtactattt ttagatggaa tagataaggc ccaagaagaa 8400
catgagaaat atcacagtaa ttggagagca atggctagtg attttaacct accacctgta 8460
gtagcaaaag aaatagtagc cagctgtgat aaatgtcagc taaaagggga agccatgcat 8520
ggacaagtag actgtagccc aggaatatgg cagctagttt gtacacattt agaaggaaaa 8580
gttatcttgg tagcagttca tgtagccagt ggatatatag aagcagaagt aattccagca 8640
gagacagggc aagaaacagc atacttcctc ttaaaattag caggaagatg gccagtaaaa 8700
acagtacata cagacaatgg cagcaatttc accagtacta cagttaaggc cgcctgttgg 8760
tgggcgggga tcaagcagga atttggcatt ccctacaatc cccaaagtca aggagtaata 8820
gaatctatga ataaagaatt aaagaaaatt ataggacagg taagagatca ggctgaacat 8880
cttaagacag cagtacaaat ggcagtattc atccacaatt ttaaaagaaa aggggggatt 8940
ggggggtaca gtgcagggga aagaatagta gacataatag caacagacat acaaactaaa 9000
gaattacaaa aacaaattac aaaaattcaa aattttcggg tttattacag ggacagcaga 9060
gatccagttt ggaaaggacc agcaaagctc ctctggaaag gtgaaggggc agtagtaata 9120
caagataata gtgacataaa agtagtgcca agaagaaaag caaagatcat cagggattat 9180
ggaaaacaga tggcaggtga tgattgtgtg gcaagtagac aggatgagga ttaacacatg 9240
gaattctgca acaactgctg tttatccatt tcagaattgg gtgtcgacat agcagaatag 9300
gcgttactcg acagaggaga gcaagaaatg gagccagtag atcctagact agagccctgg 9360
aagcatccag gaagtcagcc taaaactgct tgtaccaatt gctattgtaa aaagtgttgc 9420
tttcattgcc aagtttgttt catgacaaaa gccttaggca tctcctatgg caggaagaag 9480
cggagacagc gacgaagagc tcatcagaac agtcagactc atcaagcttc tctatcaaag 9540
cagtaagtag tacatgtaat gcaacctata atagtagcaa tagtagcatt agtagtagca 9600
ataataatag caatagttgt gtggtccata gtaatcatag aatataggaa aatggccgct 9660
gatcttcaga cctggaggag gagatatgag ggacaattgg agaagtgaat tatataaata 9720
taaagtagta aaaattgaac cattaggagt agcacccacc aaggcaaaga gaagagtggt 9780
gcagagagaa aaaagagcag tgggaatagg agctttgttc cttgggttct tgggagcagc 9840
aggaagcact atgggcgcag cgtcaatgac gctgacggta caggccagac aattattgtc 9900
tggtatagtg cagcagcaga acaatttgct gagggctatt gaggcgcaac agcatctgtt 9960
gcaactcaca gtctggggca tcaagcagct ccaggcaaga atcctggctg tggaaagata 10020
cctaaaggat caacagctcc tggggatttg gggttgctct ggaaaactca tttgcaccac 10080
tgctgtgcct tggaatgcta gttggagtaa taaatctctg gaacagattt ggaatcacac 10140
gacctggatg gagtgggaca gagaaattaa caattacaca agcttaatac actccttaat 10200
tgaagaatcg caaaaccagc aagaaaagaa tgaacaagaa ttattggaat tagataaatg 10260
ggcaagtttg tggaattggt ttaacataac aaattggctg tggtatataa aattattcat 10320
aatgatagta ggaggcttgg taggtttaag aatagttttt gctgtacttt ctatagtgaa 10380
tagagttagg cagggatatt caccattatc gtttcagacc cacctcccaa ccccgagggg 10440
acccgacagg cccgaaggaa tagaagaaga aggtggagag agagacagag acagatccat 10500
tcgattagtg aacggatcct tggcacttat ctgggacgat ctgcggagcc tgtgcctctt 10560
cagctaccac cgcttgagag acttactctt gattgtaacg aggattgtgg aacttctggg 10620
acgcaggggg tgggaagccc tcaaatattg gtggaatctc ctacaatatt ggagtcagga 10680
gctaaagaat agtgctgtta gcttgctcaa tgccacagcc atagcagtag ctgaggggac 10740
agatagggtt atagaagtag tacaaggagc ttgtagagct attcgccaca tacctagaag 10800
aataagacag ggcttggaaa ggattttgct ataagctcga aacaaccggt acctctagaa 10860
ctatagctag cagatctttt tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat gaagcccctt 10920
gagcatctga cttctggcta ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat 10980
tttttgtgtc tctcactcgg aaggacatat gggagggcaa atcatttaaa acatcagaat 11040
gagtatttgg tttagagttt ggcaacatat gcccatatgc tggctgccat gaacaaaggt 11100
tggctataaa gaggtcatca gtatatgaaa cagccccctg ctgtccattc cttattccat 11160
agaaaagcct tgacttgagg ttagattttt tttatatttt gttttgtgtt atttttttct 11220
ttaacatccc taaaattttc cttacatgtt ttactagcca gatttttcct cctctcctga 11280
ctactcccag tcatagctgt ccctcttctc ttatggagat ccctcgacct gcagcccaag 11340
cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc 11400
acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta 11460
actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca 11520
gcggatcc 11528
<210> 6
<211> 692
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gttcccgtgt cagtggctat gatgacacct caagttatca ctccccagca aatgcagcag 60
atcctccagc aacaagtgct gagccctcag cagctccagg ttctcctcca gcagcagcag 120
gccctcatgc ttcaacagca gcagcttcaa gagttttata aaaaacaaca ggaacagttg 180
cagcttcaac ttttacaaca acaacatgct ggaaaacagc ctaaagagca acagcaggtg 240
gctacccagc agttggcttt tcagcagcag cttttacaga tgcagcagtt acagcagcag 300
cacctcctgt ctttgcagcg ccaaggcctt ctgacaattc agcccgggca gcctgccctt 360
ccccttcaac ctcttgctca aggcatgatt ccaacagaac tgcagcagct ctggaaagaa 420
gtgacaagtg ctcatactgc agaagaaacc acaggcaaca atcacagcag tttggatctg 480
accacgacat gtgtctcctc ctctgcacct tccaagacct ccttaataat gaacccacat 540
gcctctacca atggacagct ctcagtccac actcccaaaa gggaaagttt gtcccatgag 600
gagcaccccc atagccatcc tctctatgga catggtgtat gcaagtggcc aggctgtgaa 660
gcagtgtgcg aagatttcca atcatttcta aa 692

Claims (10)

1.一种circle FOXP1 RNA分子的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以线性化的FOXP1 DNA为模板，进行转录，得到线性化的FOXP1RNA；
(2)将线性化的FOXP1 RNA进行连接，得到circle FOXP1 RNA；
circle FOXP1 RNA的序列如SEQ ID NO.1所示；
circle FOXP1 RNA的序列长度为692nt。
2.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，转录的体系包括：2.0μL的10×NTPlabeling mixture；2.0μL的10×Transcription buffer；1.0μL的Protector RNaseinhibitor；2.0μL的20U/μl的RNA转录酶；线性化的FOXP1DNA 1μg；DEPC-treated ddH2O；
RNA转录酶为SP6、T7或T3中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，转录的温度为36～38℃；
转录的时间为1.5～2.5h。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，连接的体系包括：0.0125U/μL T4 RNA连接酶；50mM Tris-HCl缓冲液；2mM MgCl2；1mM DTT；0.4mMATP；1μM搭桥引物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，搭桥引物的序列如SEQ ID NO.2所示。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，连接的温度为36～38℃；连接的时间为3～4h。
7.权利要求1～6任意一项所述的方法合成得到的circle FOXP1 RNA分子。
8.包含权利要求7所述的circle FOXP1 RNA分子的包裹体，其特征在于，包裹体为脂质体LNP包裹的circle FOXP1 RNA分子或类病毒载体包裹的circle FOXP1 RNA分子。
9.权利要求7所述的circle FOXP1 RNA分子在制备促进FOXP1基因表达药物、促进间充质干细胞增殖药物、延缓间充质干细胞衰老药物或抑制骨关节炎药物中的应用。
10.权利要求8所述的circle FOXP1 RNA分子的包裹体在制备促进FOXP1基因表达药物、促进间充质干细胞增殖药物、延缓间充质干细胞衰老药物或抑制骨关节炎药物中的应用。
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