CN106916789A - 一种制备分泌il‑12cd19car‑t细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫学和分子生物学T淋巴细胞技术领域，尤其涉及一种制备分泌IL‑12 CD19 CAR‑T细胞的方法。具体步骤为：制备一种抗CD19嵌合抗原受体和分泌IL‑12的质粒，将这两种质粒、转座酶质粒与电转试剂混合，加入PBMC细胞中电转染，然后采用偶联CD3/CD/28抗体的磁珠富集CD3阳性T细胞，筛选并培养扩增转染后的T细胞制备分泌IL‑12 CD19 CAR‑T细胞。本发明采用第三代CAR，使用PiggyBac转座子系统电转染提高了转染效率和转基因表达效率，同时，采用人自身EF1α启动子制备抗CD19嵌合抗原受体，使CAR基因在人体内长时间持续表达；本发明所制备的T细胞还能分泌IL‑12，利于T细胞和NK细胞的活化。因此，本发明提供了一种制备效率更高、工艺相对简单、可塑性高、安全性好的分泌IL‑12的CD19 CAR‑T细胞制备方法。

Description

一种制备分泌IL-12 CD19 CAR-T细胞的方法
技术领域
本发明涉及免疫学和分子生物学，T淋巴细胞技术领域，尤其涉及一种利用PiggyBac系统制备分泌IL-12 CD19 CAR-T细胞的方法。
背景技术
白血病俗称“血癌”，是一类起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞不断增生，浸润其他非造血组织和器官，并抑制正常造血功能。在中国每年大约有上万名患者被诊断为B系急性淋巴白血病(B-ALL)，美国大约有80％的人急性白血病都是B-ALL，其中80％的B-ALL患者被一线化化疗所缓解，但仍有60％的B-ALL会复发。由于白血病分型和预后分层复杂，如按起病的缓急可分为急、慢性白血病，按病变细胞种类分类，包括髓系和淋巴系，淋巴系又包括T和B细胞系，因此没有千篇一律的治疗方法。治疗这些患者的一个方法是基因修饰T细胞以通过嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor,CAR)的表达，靶向并结合在肿瘤细胞上表达的抗原，将信号传递至细胞内，引起T细胞增殖活化，从而靶向杀伤肿瘤细胞。
CAR分子主要包括胞外抗原结合区、穿膜区和胞内信号区。第一代CAR由scFV、穿膜区、CD3ζ链或FcεRIγ链组成，但表现出有限的扩增性和持久性，以及有限的抗肿瘤效应。第二、三代CAR则在第一代的基础上分别引入一个或者两个共刺激信号域(如CD28、4-1BB)，显著提高了CAR-T细胞的增值能力和抗肿瘤作用，延长了CAR-T细胞在体内的持续存在时间。
CD19作为B-ALL的一个理想治疗靶点，在治疗难治性B细胞恶性肿瘤获得了较高的缓解率。目前CD19 CAR-T在治疗儿童和成人复发B-ALL，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，和B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)表现出稳定高效的抗肿瘤效力。在Peter研究小组中，给复发难治的CLL病人输注自体含有4-1BB共刺激信号的CD19-CAR-T细胞后，观察到持续超过两年的缓解，大多数病人低剂量CD19 CAR-T细胞输注后，观察到CAR-T细胞在体内大量增殖、伴随着肿瘤溶解和正常B细胞的缺乏。
靶向CD19分子的CAR-T细胞在针对难治、复发的B细胞来源的血液肿瘤的治疗上，获得了传统疗法无法达到的临床疗效，完全缓解率(CR)普遍达到了80％，有些临床试验甚至高达100％，成为当下肿瘤免疫治疗中最为引人关注的领域。不过也暴露出在CAR-T细胞持久性较差、抗原逃逸导致肿瘤复发及安全性隐患等问题：(1)存活时间短。存活时间的长短已被证明与疗效密切相关，确保回输后的CAR-T细胞在患者体内的存活时间成为关键；(2)易复发。CAR-T细胞体内存活时间不够长，抗原丢失产生免疫逃逸机制，最终导致复发；(3)制备成功率不高。常用逆转录病毒系统来制备CAR-T，能有效感染宿主细胞，但其装载量有限，且重组病毒颗粒制备工艺较复杂。并且患者由于进行过多种治疗，会使其T细胞活性过低，体外培养无法保证回输CAR-T的量。
IL-12是细胞免疫应答过程中的关键调节因子，具有重要的生物活性。IL-12能够激活自然杀伤细胞、巨噬细胞和T细胞，促进其分泌大量的IFN-γ，以抑制并杀伤肿瘤细胞，专利号201510979423.7中利用含IL-12/突变型CD62L融合基因的慢病毒修饰抗肿瘤T细胞，可以增加T细胞对肿瘤的毒杀效应，然而该方法使用的慢病毒载体感染T细胞，存在一定的致癌内险，同时所设计的T细胞没有特异性，具有一定的毒副作用。为了进一步改良CAR的设计，建立一种克服上述缺陷的制备CD19 CAR-T细胞的方法，特提出本发明。针对CAR-T细胞存活时间短、血液肿瘤易复发的问题，本发明在CD19 CAR-T所涉及的CAR表达载体上加入内部核糖体进入位点(IRES)和IL-12基因序列，从而使设计的CD19 CAR T能够表达分泌IL-12，增强肿瘤的杀伤效应；针对CD19 CAR-T细胞制备成功率不高的问题，本发明使用PiggyBac转座子系统，制备工艺相对简单，可塑性高，通过与其他功能蛋白融合或改变转座酶的功能区域等，不仅能够改变转座酶的活性和作用方式，最重要的是可以提高外源基因转座的靶向性；同时，本发明避免使用病毒载体，降低了致癌风险。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种制备分泌IL-12 CD19 CAR-T细胞的方法，该方法简单易行，分泌IL-12 CD19 CAR-T细胞有效性更好，安全性更高。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种制备分泌IL-12 CD19 CAR-T细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)PBMC细胞制备；
(2)制备表达抗CD19嵌合抗原受体和分泌IL-12的质粒；
(3)将步骤(2)中制备的表达抗CD19嵌合抗原受体和分泌IL-12的质粒、转座酶质粒和Amaxa电转试剂盒中的电转试剂混合，加入PBMC细胞中进行电转染，然后采用偶联CD3/CD/28抗体的磁珠富集CD3阳性T细胞，筛选并培养扩增转染后的T细胞制备分泌IL-12 CD19CAR-T细胞。
进一步地，所述PBMC细胞是由外周血中制得，PBMC细胞制备具体步骤为：(1)用抗凝管采集外周血，边采集边摇晃使外周血与抗凝剂充分混合；(2)外周血细胞与淋巴细胞分离液等体积混合，离心，吸取离心后的白膜层细胞；(3)将得到的白膜层细胞与PBS或者无血清细胞培养基1640混合后离心，沉淀即为所述PBMC细胞，重复三遍。
进一步的，所述表达抗CD19嵌合抗原受体和分泌IL-12的质粒是利用PiggyBac-transposon载体依次串联人启动子、CSF2RA嵌合受体信号肽、胞膜外抗原结合区、铰链区、胞内信号传导区、T 2A短肽连接的抗性基因puromycin和IRES连接的h IL-12f制备而成的。
进一步地，所述胞膜外抗原结合区为用于结合CD19蛋白的CD19单链抗体(scFv)，依次串联c-myc表位标记、CD8 Hinge嵌合受体铰链、CD8 Transmembrane嵌合受体跨膜区。
进一步地，所述胞内信号传导区为CD28-4-1BB-ITAM，CD28和4-1BB为嵌合受体共刺激分子。
本发明的有益效果：相对于现有技术，本发明优选采用第三代CAR，使用PiggyBac转座子系统提高了转染效率和转基因的表达效率；采用人自身的EF1α启动子，使CAR基因能够在人体内长时间持续表达；此外，本发明所制备的T细胞还能分泌IL-12，有利于T细胞和NK细胞的活化，增强了T细胞的抗肿瘤能力。可见，本发明所述的分泌IL-12 CD19 CAR-T细胞的制备将给淋巴细胞白血病的免疫治疗提供可靠的保障。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为使用的PB-CD19 CAR-T-BBZ-puro表达载体的基因结构图；
图2为分泌IL-12 CD19 CAR-T细胞和CD19 CAR-T细胞中CAR表达率的对比结果图；
图3为分泌IL-12 CD19 CAR-T细胞和CD19 CAR-T细胞，分别与Raji人淋巴瘤细胞和K562白血病细胞系共培养后，细胞毒杀伤能力检测的对比图。
图4为分泌IL-12 CD19 CAR-T细胞和CD19 CAR-T细胞IL-12分泌量检测结果图；
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。
实施例1：
PBMC细胞制备
用抗凝管采集健康人外周血，边采集边摇晃使得外周血与抗凝剂充分混合；将抗凝血缓慢加入装有等体积的淋巴细胞分离液(Ficoll)的50mL离心管中，450g，慢升慢降离心25min，中间不能停止离心；离心结束后，小心吸取淋巴细胞分离液上方的白膜层细胞，转入一个新的50mL离心管中，加入PBS，300g，慢升慢降离心10min，弃上清，保留离心管底部的细胞沉淀；再次加入PBS，160g，慢升慢降离心15min，弃上清；最后加入PBS，300g，慢升慢降离心10min，弃上清，即得到PBMC细胞。
实施例2：
制备CAR-T细胞
将PBMC用含10％FBS的AIM-V培养基(含IL-12细胞因子)进行培养。待细胞激活一段时间后细胞数目达到2-3×107个。
如图1所示PiggyBac-transposon载体结构图(PB-CD19 CAR-BBZ-puro-h IL-12f)，包括依次串联的人EF1α启动子、CSF2RA嵌合受体信号肽、胞膜外抗原结合区、铰链区、胞内信号传导区、T2A短肽连接的抗性基因puromycin和IRES连接的h IL-12f制备而成的。具体步骤为：将PiggyBac-transposon载体、转座酶质粒各5μg与Amaxa电转试剂盒中的电转试剂混合，获得包含该2种质粒的100μL电转混合液，其中原始质粒PB-CD19 CAR-BBZ-puro和转座酶2个质粒作为对照；将所述两组电转混合液加入2-3×107个PBMC细胞中进行电转，细胞转染2h后换液，采用偶联CD3/CD/28抗体的磁珠富集CD3阳性T细胞；转染5-6天后加入0.5μg/mL的puromycin，筛选并培养扩增转染后的T细胞，而获得CAR-T细胞。
实施例3：
分泌IL-12 CD19-CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效果评估
分别培养K562细胞、Raji细胞和效应细胞IL-12 CD19-CAR-T、CD19-CAR-T。
收集靶细胞(K562、Raji)各4×105cells和效应细胞(CAR T细胞)各3×106cells，300g，离心10min，慢升慢降，弃上清；用1ml PBS溶液分别重悬靶细胞和效应细胞，300g，离心10min，慢升慢降，弃上清；重复一次；用700μL培养基(AIM-V培养基+10％FBS)重悬效应细胞，用2mL培养基(1640培养基+10％FBS)重悬靶细胞。
设置效靶比为0.5:1、1:1、5:1、10:1的实验孔，将分泌IL-12 CD19 CAR-T、CD19CAR-T以及未修饰的T细胞与靶细胞共培养，应用LDH乳酸脱氢酶-细胞毒性检测分析试剂盒(LDH-Cytotoxicity Assay Kit,Biovision)检测遗传修饰前后的T细胞对靶细胞的体外杀伤能力，方法如下：靶细胞铺96孔板((5×103/孔)，设培养基背景、体积校正、靶细胞自发LDH释放、靶细胞最大LDH释放、效应细胞自发LDH释放对照孔，实验组孔，每组重复3孔，每个孔的终体积相同且不少于100μL。250g离心4min，在37℃，5％CO2孵育至少4h。在离心前45min，向靶细胞最大释放孔加入10×裂解液，体积校正孔加入等量的裂解液。再次离心，从每孔转移50μL上清至新的96孔板中，再加入50μL底物溶液，室温避光孵育30min。每孔加入50μL终止液，1h内测定D490。细胞毒性(％)＝[(D实验孔―D培养基背景孔)―(D效应细胞自发LDH释放孔―D培养基背景孔)―(D靶细胞自发LDH释放孔―D培养基背景孔)]/[(D靶细胞最大LDH释放孔―D体积校正孔)―(D靶细胞自发LDH释放孔―D培养基背景孔)]×100％。结果如图3所示，分泌IL-12 CD19-CAR-T细胞在Raji靶细胞中不同效靶比条件下杀伤效率明显高于普通的CD19-CAR-T细胞。
实施例4：
Elisa检测共培养条件下分泌IL-12 CD19-CAR-T细胞IL-12的分泌
包被：将5×的包被缓冲液用双蒸水稀释成1×，按IL-12ELISA试剂盒说明书将Capture抗体稀释于1×的包被缓冲液中，在试剂盒中提供的96孔板中各反应孔加入100μL，用塑料贴纸覆盖96孔板，4℃过夜。
封闭：次日，用自动ELISA洗板机洗涤4次后，抛干，用1×分析缓冲液200μL进行封闭1小时。
加样：洗涤4次后，抛干，各反应孔加入待检测CA19CAR T细胞与靶细胞(K562、Raji)共培养的上清100μL或相应倍数的稀释上清及IL-12标准品(1000pg/ml，倍比稀释至15.6pg/ml)，室温孵育2小时。
加检测抗体：洗涤4次后，抛干，按说明书指定将Detection抗体用1×分析缓冲液稀释，取100μL加入各反应孔中，室温孵育1小时。
加HRP标记的二抗：洗涤4次后，抛干，按说明书指定将HRP标记的抗体用1×分析缓冲液稀释，取100μL加入各反应孔中，室温孵育0.5小时。
加底物反应液：洗涤4次后，抛干，于各反应孔中加入新鲜配制的TMB底物溶液100μL，避光孵育15分钟。
终止反应：于各反应孔中加入1M硫酸100μL。
结果判断：在ELISA检测仪上，空白孔调零，于450nm处测各孔吸光值(OD值)，计算IL-12浓度值。
从检测结果图4可以看出，当K562、Raji细胞与IL-12 CA19 CAR-T细胞共培养时，可以检测到细胞内大量分泌IL-2细胞因子，而与CA19 CAR-T细胞共培养时，细胞培养液上清中只能检测到少量的IL-2，但相比之下与对照组T细胞共培养时，细胞培养液上清中只能检测到微量的IL-2分泌，表明分泌IL-12 CA19 CAR-T细胞中IL-12的分泌量要高于普通CA19 CAR-T细胞。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 尚小云
<120> 一种制备分泌IL-12 CD19 CAR-T细胞的方法
<130> 2017
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 7704
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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catctctcct tcacgcgccc gccgccctac ctgaggccgc catccacgcc ggttgagtcg 1680
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<210> 2
<211> 8531
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc 7860
cacctgacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg 7920
tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc 7980
tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc 8040
gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta 8100
gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta 8160
atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg 8220
atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa 8280
aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa cgcttacaat ttccattcgc cattcaggct 8340
gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa 8400
agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 8460
ttgtaaaacg acggccagtg agcgcgcgta atacgactca ctatagggcg aattggagct 8520
ccaccgcggt g 8531
<210> 3
<211> 1623
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60
gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120
gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180
accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240
gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300
ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360
aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420
acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480
ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540
agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600
gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660
gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac 720
ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780
acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840
agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900
cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960
gaatgggcat ctgtgccctg caggggcgga ggcggaagcg gaggcggagg aagcggcggt 1020
ggcggcagca gaaacctccc cgtggccact ccagacccag gaatgttccc atgccttcac 1080
cactcccaaa acctgctgag ggccgtcagc aacatgctcc agaaggccag acaaactcta 1140
gaattttacc cttgcacttc tgaagagatt gatcatgaag atatcacaaa agataaaacc 1200
agcacagtgg aggcctgttt accattggaa ttaaccaaga atgagagttg cctaaattcc 1260
agagagacct ctttcataac taatgggagt tgcctggcct ccagaaagac ctcttttatg 1320
atggccctgt gccttagtag tatttatgaa gacttgaaga tgtaccaggt ggagttcaag 1380
accatgaatg caaagcttct gatggatcct aagaggcaga tctttctaga tcaaaacatg 1440
ctggcagtta ttgatgagct gatgcaggcc ctgaatttca acagtgagac tgtgccacaa 1500
aaatcctccc ttgaagaacc ggatttttat aaaactaaaa tcaagctctg catacttctt 1560
catgctttca gaattcgggc agtgactatt gatagagtga tgagctatct gaatgcttcc 1620
taa 1623

Claims (5)

1.一种制备分泌IL-12CD19CAR-T细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)PBMC细胞制备；
(2)制备抗CD19嵌合抗原受体和分泌IL-12的质粒；
(3)将步骤(2)中制备的抗CD19嵌合抗原受体和分泌IL-12质粒、转座酶质粒和Amaxa电转试剂盒中的电转试剂混合，加入PBMC细胞中进行电转染，然后采用偶联CD3/CD/28抗体的磁珠富集CD3阳性T细胞，筛选并培养扩增转染后的T细胞制备分泌IL-12CD19CAR-T细胞。
2.根据权利要求1所述的一种制备分泌IL-12CD19CAR-T细胞的方法，其特征在于：所述PBMC细胞是由外周血中制得，PBMC细胞制备具体步骤为：(1)用抗凝管采集外周血，边采集边摇晃使外周血与抗凝剂充分混合；(2)外周血细胞与淋巴细胞分离液等体积混合，离心，吸取离心后的白膜层细胞；(3)将得到的白膜层细胞与PBS或者无血清细胞培养基1640混合后离心，沉淀即为所述PBMC细胞，重复三遍。
3.根据权利要求1所述的一种制备分泌IL-12CD19CAR-T细胞的方法，其特征在于：所述的表达抗CD19嵌合抗原受体和分泌IL-12的质粒是利用PiggyBac-transposon载体依次串联人启动子、CSF2RA嵌合受体信号肽、胞膜外抗原结合区、铰链区、胞内信号传导区、T 2A短肽连接的抗性基因puromycin和IRES连接的h IL-12f制备而成的。
4.根据权利要求3所述的一种制备分泌IL-12CD19CAR-T细胞的方法，其特征在于：所述胞膜外抗原结合区为用于结合CD19蛋白的CD19单链抗体(scFv)，依次串联c-myc表位标记、CD8Hinge嵌合受体铰链、CD8嵌合受体跨膜区。
5.根据权利要求3所述的一种制备分泌IL-12CD19CAR-T细胞的方法，其特征在于：所述胞内信号传导区为CD28-4-1BB-ITAM，CD28和4-1BB为嵌合受体共刺激分子。
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