CN108059675B

CN108059675B - 重组pg9-car分子的构建及其在清除hiv-1感染细胞中的应用

Info

Publication number: CN108059675B
Application number: CN201711320360.XA
Authority: CN
Inventors: 张同存; 顾潮江; 刘慧宁; 胡曦
Original assignee: Wuhan Bio Raid Biotechnology Co ltd
Current assignee: Wuhan Bio Raid Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-12-12
Filing date: 2017-12-12
Publication date: 2021-09-10
Anticipated expiration: 2037-12-12
Also published as: CN108059675A

Abstract

本发明涉及感染性疾病免疫治疗技术领域，具体涉及重组PG9‑CAR分子的构建及其在清除HIV‑1感染细胞中的应用，本发明的技术方案为抗HIV技术领域提供了新的有效选择。本发明的技术方案是提供一种能够识别HIV病毒感染细胞表面的gp120的单链抗体，并通过基因工程技术手段将该单链抗体进一步设计构建成能清除HIV‑1感染细胞的嵌合型抗原受体PG9‑CAR，将PG9‑CAR分子转导至CD8⁺T淋巴细胞，从而获得能表达嵌合型抗原受体PG9‑CAR分子的基因工程化的T‑淋巴细胞，所得的CAR‑T淋巴细胞在体外实验和体内实验中均发现具有显著的抑制、杀灭HIV感染细胞的活性，能够作为活性成份制备清除HIV‑1感染细胞的药物，具有良好的应用前景。

Description

重组PG9-CAR分子的构建及其在清除HIV-1感染细胞中的应用

技术领域

本发明涉及感染性疾病免疫治疗技术领域，具体涉及重组PG9-CAR分子的构建及其在清除HIV-1感染细胞中的应用。

背景技术

到目前为止，还没有有效的抗HIV疫苗，国际上对AIDS的治疗方案趋向于高效抗逆转录病毒治疗，即HAART。随着高效抗逆转录病毒疗法的应用，大大提高了抗HIV的疗效，显著改善了AIDS病人的生活质量和预后，使AIDS的治疗前进了一大步。它能迅速降低病毒载量，延长HIV感染者进入AIDS期的发病时间，延长病人的生存期，从而使与AIDS相关的并发症和死亡率下降。但一方面由于药物联合的发展受到许多限制，有高达60％的患者由于持续性、毒性、药物抵抗等原因导致抗病毒治疗失败；另一方面，HAART不能彻底清除病毒，主要是因为药物仅对复制中的病毒有效，而对HIV在感染早期建立的潜伏性病毒“储藏库”(reservoir)是无效的，一旦抗逆转录病毒治疗中断，病毒储藏库中的整合前病毒再度激活，几乎所有患者体内病毒血症会迅速反弹。

联合抗逆转录病毒疗法(cART)可以有效的抑制病毒复制，然而由于病毒整合在被感染细胞中形成一个稳定的潜伏感染储存库，被感染者一旦停cART治疗，病毒血症即在短时间内再次爆发，这构成了治愈HIV-1感染的主要障碍。

要找到治愈艾滋病的一个重大挑战，就是如何能够重新激活潜伏的HIV从而被机体的免疫系统自发识别和清除(shock and kill)。同时，研究发现，即使在接受cART治疗的感染者体内，也出现不可逆转的免疫损伤，特别是细胞毒性T细胞(CTL)的数量减少和功能缺陷,这表明通过抗逆转录病毒治疗重建的机体免疫系统将不能有效的清除那些被激活的细胞，需要通过联合增强机体HIV特异性免疫应答的方法来增强对HIV储藏库的清除效果。因此，对HIV潜伏性病毒“储藏库”的形成及激活策略和以重建机体免疫功能的探索都是迈向治愈HIV时代极有价值的研究方向。

近年来，由于具有高亲和力、TCR非依赖和MHC非依赖性等优点，嵌合抗原受体的免疫细胞疗法成为了杀伤肿瘤细胞的全新途径。特别是由两个CD28及4-1BB、CD3ζ偶联形成的3代CAR可增强T细胞的杀瘤能力并延长了其在体内的存活时间，从而在白血病和淋巴瘤等肿瘤免疫治疗中取得了令人鼓舞的成效。CAR是由抗体靶向区域与T细胞激活胞内信号区融合而成，从而赋予细胞特异性抗原识别能力，能在患者自体免疫细胞中表达识别肿瘤天然抗原的CAR分子并对进行过继免疫回输，可以特异性的靶向杀伤患者体内的肿瘤细胞。

在HIV感染靶细胞的过程中，首先是HIV包膜与靶细胞的细胞膜发生融合，HIV与靶细胞融合主要由包膜糖蛋白gp120和跨膜亚基gp41介导。第一步由gp120与靶细胞上的CD4受体和辅助受体先后结合，导致gp41的构型发生改变，形成6股α-螺旋束核心结构，将病毒包膜与靶细胞膜拉近并发生融合，完成病毒进入宿主细胞的感染过程。因此，抑制融合过程的第一步，即在病毒感染的初级阶段抑制病毒的感染，被认为是最有前景的药物治疗方法。

Roberts等人尝试用CAR-T细胞治疗HIV感染，他们选取CD4序列作为单链抗体用于结合感染细胞表面的gp120，虽然具有部分杀感染细胞功能且经过多年的努力，但最终以失败而告终。其主要原因有以下几个方面：1.使用逆转录病毒载体转导效率较低，为了获得足够的可回输CAR-T细胞，过度的体外扩增导致回输后细胞死亡和CAR分子的丢失。2.CAR分子设计本身存在缺陷，其中CD4结构域可能引起转导的CTLs被HIV感染或者病毒感染细胞通过下调CD4分子的表达而逃脱CAR-T细胞的杀伤。

发明内容

本发明为了克服现有技术的上述不足，提供了一种新的能识别HIV病毒感染细胞表面gp120的单链抗体以及由此单链抗体制成的嵌合型抗原受体(CAR)，称为PG9-CAR分子。

本发明的另一目的是提供一种PG9-CAR载体基因修饰的CD8⁺T淋巴细胞。

本发明的再一个目的是提供PG9-CAR分子修饰的CD8⁺T淋巴细胞在制备清除HIV感染细胞药物方面的用途。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

提供了一种用于清除HIV-1感染细胞的嵌合型抗原受体PG9-CAR，该嵌合型抗原受体是通过N端到C端顺次拼接信号肽、PG9单链抗体、CD8 hinge、白细胞抗原分化群分子跨膜区CD28-TM及其细胞内结构域(ICD)、4-1BB和白细胞抗原分化群3的ζ链CD3得到的，所得到的嵌合型抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

作为本发明的进一步方案，所述PG9单链抗体是通过串联针对感染HIV病毒细胞表面gp120的抗体轻链、重链可变区而得，得到的单链抗体作为整个CAR分子的胞外结合结构域能够识别HIV病毒感染细胞表面的gp120，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

作为本发明的进一步方案，编码所述PG9单链抗体基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

本发明也提供了编码上述用于清除HIV-1感染细胞的嵌合型抗原受体PG9-CAR的基因，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种工程化的基因修饰的CD8⁺T淋巴细胞，该细胞是嵌合型抗原受体PG9-CAR修饰的CD8⁺T淋巴细胞。

制备上述基因修饰的CD8⁺T淋巴细胞的方法，是将上述的嵌合型抗原受体PG9-CAR分子转导至CD8⁺T淋巴细胞，从而获得能表达嵌合型抗原受体PG9-CAR分子的基因工程化的T-淋巴细胞。

本发明最后还提供了基因修饰的CD8⁺T淋巴细胞的用途，所述基因修饰的CD8⁺T淋巴细胞应用于制备清除HIV-1感染细胞的药物。

作为本发明的进一步方案，所述清除HIV-1感染细胞的药物是以基因修饰的CD8⁺T淋巴细胞作为主要活性成分。

本发明的有益效果：(1)本发明中克服早期设计的缺陷，利用能与病毒蛋白Gp120高度特异性结合的广谱中和抗体作为单链抗体，能与98％的HIV-1的病毒株结合，增加该CAR-T细胞的广谱性；(2)本发明PG9-CAR制备的CD8⁺T细胞表达CAR分子的能力强，且明显高于N6-CAR制备的CD8⁺T细胞，因此为临床上降低药物副作用和药物成本提供了依据；(3)本发明中的能表达嵌合型抗原受体的基因修饰CD8⁺T淋巴细胞在体外实验和体内实验中均发现具有显著的抑制、杀灭HIV病毒的活性，能够作为活性成份制备抗HIV感染药物。

附图说明

图1为本发明构建的抗HIV感染的嵌合型抗原受体的结构示意图；

图2为本发明构建的PTK-EF1α-PG9慢病毒载体结构示意图；

图3为本发明中PG9-CAR在被转导的CD8⁺T淋巴细胞中的表达水平(A)及其刺激后功能性增殖能力(B)检测；

图4为本发明中PG9-CAR转导的CD8⁺T淋巴细胞体外杀灭HIV感染细胞活性检测；

图5为共培养条件下本发明中PG9-CAR转导的CD8⁺T淋巴细胞抑制病毒的活性检测；

图6为本发明中PG9-CAR转导的CD8⁺T淋巴细胞杀灭重度免疫缺陷小鼠体内的HIV感染细胞活性检测。

具体实施方式

展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。

实施例1：

本发明提供了一种单链抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，该单链抗体是通过串联针对感染HIV病毒细胞表面gp120的抗体轻链、重链可变区而得，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

以上述的单链抗体ScFv为来源可以构建一种治疗HIV感染的嵌合抗原受体PG9-CAR分子，具体的拼接方法为：顺次拼接信号肽、能识别感染HIV病毒细胞表面的gp120单链抗体、CD8 hinge、白细胞抗原分化群分子跨膜区CD28-TM+ICD、4-1BB和CD3(白细胞抗原分化群分子3)的ζ链，最后得到完整的能治疗HIV的嵌合型抗原受体(CAR)分子，其氨基酸序列见SEQ ID NO.2，其结构如图1所示，编码该嵌合型抗原受体PG9-CAR分子的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

以SEQ ID NO.2所示的嵌合型抗原受体PG9-CAR分子详细介绍本发明CAR分子的结构设计。PG9-CAR分子的序列氮端是CAR来源的单链抗体序列，可特异性识别感染HIV病毒细胞表面的gp120；CAR分子的序列碳端是以三代CAR结构为基础，包括CD8hinge、CD28TM+ICD、4-1BB和CD3ζ胞内结构域串联组成，通过CD28分子的跨膜结构域将ScFv和胞内信号分子相连。在上述的结构下各个片段能发挥如下的功能：信号肽可以将CAR分泌到胞外，CD28TM+ICD将本发明的CAR锚钉在细胞膜上；ScFv特异性识别识别感染HIV病毒细胞表面的gp120；CD3ζ为胞内信号激活序列，在ScFv结合抗原后CD3ζ激活信号，启动淋巴细胞的杀伤活性。

实施例2：CAR分子重组构建PTK-EF-1α-PG9质粒表达载体

按照SEQ ID NO.4所示序列合成PG9-CAR分子，将全长PG9-CAR分子的编码基因通过基于无缝重组克隆技术插入目的表达载体(见图2)。经过多次试验，首选的质粒载体为以PTK881载体为骨架，将CMV启动子替换成EF1α启动子后改造成的PTK-EF1α载体，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，最终获得了插入CAR基因并能表达CAR的重组质粒PTK-EF1α-PG9载体。

病毒包装步骤如下：

1)取两个均装有16ml DMEM培养液的离心管，向其中一管加入960μg PEI，另一管加入320μg预混的PTK881载体质粒，漩涡震荡,室温平衡10分钟。

2)取一个10ml的移液管将混有PEI的培养基吹起来，将混有质粒的培养基一滴一滴地加入PEI中，室温温育30分钟。

3)取一个T175瓶，向其中加入3ml胎牛血清，将和PEI混合的PTK-EF1α-PG9载体质粒加入其中，然后将多层细胞培养瓶中的培养基倒入到T175瓶，上下左右颠倒与质粒混匀，最后将T175瓶中的培养基倒回到多层细胞培养瓶中。37℃，5％CO₂培养箱培养3天，收获上清。收集的上清4000rpm(3000g)，30min离心去除293T细胞碎片。

4)将慢病毒液上清用0.22μm滤膜过滤后，分装到250ml的离心瓶中，于4℃，30000g离心2.5小时，离心后将离心瓶小心转移至生物安全柜，用真空泵去上清，留沉淀，加入T细胞培养基500μl/离心瓶，用枪将沉淀吹散混匀，即得到含PG9-CAR分子的慢病毒载体，立即使用或分装后于-80℃保存。

实施例3：制备能表达嵌合型抗原受体的CD8⁺T细胞

步骤1：分离患者PBMC细胞

(1)采集人外周血样本60-80ml，边采集边摇晃使得外周血与抗凝剂充分混合；

(2)将外周血转入50ml离心管中，用DPBS缓冲液按1:1稀释外周血，混匀。将稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中。方法如下：用10ml移液管吸取血样，伸至分离液液面上方0.5cm处，血样自然滑落铺至分离液面上，然后轻轻加入血样，注意不要冲破液面；

(3)配平离心30min，慢升慢降；

(4)离心完成后，离心管出现明显分层由下至上：红细胞层，粒细胞层，Ficoll层、单个核细胞层和血浆层。吸取血浆层至距白膜层5mm左右处弃之。小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中，PBS稀释，与细胞悬液体积比应大于1:3，混匀。

(5)离心(1600r/min)5min，PBS重悬细胞混匀，取少量细胞计数。

(6)离心300g(1200r/min)5min，上清液送检无菌检测。

步骤2：分选CD8⁺T细胞

(1)步骤1中的PBMC细胞，用30ml生理盐水重悬后取样计数(取样完后，补加至50ml混匀，500g、10min、18℃、升快、降快离心，去上清)，计数后按每10⁷/80μL buffer混匀(如果上清没有去干净，建议不用加buffer)，加入按每10⁷/20μL CD8 Microbeads重悬，4-8℃孵育15min。

(2)孵育完成后，使用按每10⁷个1～2ml buffer洗细胞，500g、10min离心。

(3)用500μL buffer重悬多达10⁸个细胞(若细胞数目比较多，buffer使用的也会多)。

(4)将美天旎专用LS柱，置于磁力架上，使用3ml buffer冲洗LS柱后，将细胞重悬液加入到LS柱里，使之流尽。用3ml buffer洗LS柱三次，每次需要流尽。将LS柱离开磁力架，使用5ml buffer，加入到LS柱中，用活塞将标记后的细胞冲洗出来(可以冲洗两次，确保标记的细胞均可以冲洗出来)。

(5)CD8⁺T细胞冲洗出来后，用生理盐水重悬至30ml，取样计数，500g、10min、18℃离心，得细胞沉淀，即可用于培养。

步骤3：CD8⁺T细胞激活

(1)将步骤2中CD8⁺T细胞，计数，按密度为2x10⁶/ml加入培养瓶中，混匀放入CO₂培养箱培养2小时。

(2)取出培养瓶，轻摇，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，移液管吸取培养基转入离心管中，少许培养基洗培养瓶将悬浮细胞全部收集，混匀计数。

(3)根据细胞计数调整细胞浓度，按1.2x10⁶/ml的浓度接种培养瓶中(100～120mlin a T150，50～60ml in a T75，15～29ml in a T25)，加CD3/CD28磁珠，按细胞与磁珠比例为1:3(加之前磁珠用培养基洗涤3次，去除保存液)，加入IL-2100U/mL，混匀放入CO₂培养箱培养，收集细胞。

步骤4：CD8⁺T细胞被转导PG9-CAR分子制备CAR-T细胞

加入磁珠12小时后，取适量步骤3中生长状态良好的CD8⁺T细胞悬液，放入离心管中300g离心5分钟。弃去上清液，以1x10⁶/ml细胞的比例加入嵌合型抗原受体(CAR)病毒载体，同时加入终浓度4μg/ml的Polybrene，混匀。将细胞悬液在37℃条件下小体积孵育。孵育4小时后补加适量T细胞完全培养基进行培养。细胞培养的第3天，细胞计数并根据细胞状态和增殖情况补加培养基，细胞浓度调整至0.6x10⁶/ml，并补充IL-2100U/mL。细胞培养的第5天，细胞混匀转离心管中，在磁力架上去除磁珠，细胞计数并补加培养基，并补充IL-2100U/mL，细胞密度调整至0.6x10⁶/ml继续培养。并利用流式检测SCFV的表达，同时，取部分CD8+T淋巴细胞经goat anti-human Fab antibody抗体刺激并连续传代，以确定anti-gp120CAR转导的CD8+T淋巴细胞自扩增能力，结果如图3所示。

结果表明，Anti-gp120CAR病毒转导细胞培养到五天后，有70％的CD8+T细胞表达CAR分子,当抗体goat anti-human Fab antibody特异性地与CD8+T细胞表达CAR分子结合后，能有效和剂量依赖地激活细胞的增殖，随着传代次数增加，CAR分子阳性细胞种群比例也逐渐升高。本发明的PG9-CAR制备的CD8⁺T细胞表达CAR分子的能力强，且明显高于N6-CAR制备的CD8⁺T细胞，因此为临床上降低药物副作用和药物成本提供了依据。

实施例4：CAR-T细胞体外杀灭HIV感染细胞活性的检测

为了进一步检测PG9-CAR的功能，我们将PG9-CAR-T细胞与两株HIV-1感染的细胞系H9-NL4-3和H9-NDK分别进行混合培养，在U形底的96孔板中进行细胞杀伤实验。首先利用Calcein-AM标记HIV感染细胞系H9和阴性对照细胞，取100μl(含靶细胞数量10⁴)于96孔板中，取100μl梯度稀释的CAR-T细胞加入相应的96孔板中，确保效靶比范围为5：1到10：1，每孔终体积为200μl。室温200g离心30分钟，37℃孵育2-3小时。离心取上清测定荧光并计算出裂解百分数并用于判断PG9-CAR-T细胞对HIV感染细胞的细胞毒性，实验结果如图4所示。

结果显示，从5:1到10:1效靶比区间范围内，PG9-CAR-T细胞以剂量依赖的方式显著杀伤两个毒株HIV感染的靶细胞系，而对对照靶细胞没有明显的杀伤效果，且杀伤HIV感染靶细胞系的能力明显优于N6-CAR-T细胞,说明PG9-CAR-T细胞杀伤靶细胞作用是HIV-gp120特异性的。

实施例5：共培养条件下CAR-T细胞体外抑制病毒复制活性的检测

为了进一步证明PG9-CAR-T细胞在清除野生型HIV-1感染的原代CD4+T细胞方面的有效性，利用野生型HIV-1NL4-3-EGFP和NDK-EGEP两个毒株分别感染健康人血液样本中分离的CD4+T淋巴细胞，感染后3小时换液。感染后的第8天，该细胞与PG9-CAR改造的同源CD8+T淋巴细胞以1：4的比例混合,在24孔板中进行细胞杀伤实验。靶细胞数量为10⁶/孔，RMPI1640完全培养基体积为500μl/孔。48小时后，通过流式细胞术检测EGFP+CD4+T淋巴细胞的比例，验证PG9-CAR-T细胞的杀伤作用，实验结果如图5所示。

结果表明，以未经CAR分子改造的CD8+T细胞组为参照，PG9-CAR-T细胞组能清除其中99％的HIV-1感染的细胞，表现出显著的杀伤效果，充分展示了PG9-CAR-T细胞的特异性和高效性。

实施例6：CAR-T淋巴细胞在体内杀灭感染HIV病毒细胞的活性检测

为了进一步证明Anti-gp120 CAR-T淋巴细胞能否在体内清除HIV感染的细胞，我们将感染有荧光素酶基因的NL4-3-Luc病毒(1x10⁶pg p24/mouse)的人CD4+T细胞通过静脉注射到重度免疫缺陷小鼠体内，感染小鼠同时，从健康志愿者分离PBMC然后分离CD8⁺T细胞，转导PG9-CAR慢病毒，体外扩增8天后，计数后用500μl PBS重悬，按1x10⁷CD8+T/kg的剂量静脉回输。在第十天和二十一天，以150mg/kg的剂量腹腔注射D-luciferin(MolecularImaging Products,Bend,USA).10min后,腹腔注射75mg/kg的戊巴比妥钠麻醉小鼠.麻醉后5min,使用IVIS小动物活体成像系统(Xenogen,Hopkinton,USA)收集10s光信号,进行活体成像，如图6所示，图6(A)和图6(B)分别为向小鼠体内回输了转导PG9-CAR慢病毒后的第10天和第21天进行活体成像的图像。

结果表明，与未接受CAR-T细胞治疗的对照组相比，PG9-CAR-T细胞能在体内进行有效地裂解和清除HIV感染的细胞，为CAR-T细胞进行人体临床测试奠定理论基础。

序列表

<110> 武汉云谷生物医药科技有限公司

<120> 重组PG9-CAR分子的构建及其在清除HIV-1感染细胞中的应用

<130> 2017

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1653

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc cttcctgctg 60

atcccccagc gattagtgga gtctggggga ggcgtggtcc agcctgggtc gtccctgaga 120

ctctcctgtg cagcgtccgg attcgacttc agtagacaag gcatgcactg ggtccgccag 180

gctccaggcc aggggctgga gtgggtggca tttattaaat atgatggaag tgagaaatat 240

catgctgact ccgtatgggg ccgactcagc atctccagag acaattccaa ggatacgctt 300

tatctccaaa tgaatagcct gagagtcgag gacacggcta catatttttg tgtgagagag 360

gctggtgggc ccgactaccg taatgggtac aactattacg atttctatga tggttattat 420

aactaccact atatggacgt ctggggcaaa gggaccacgg tcaccgtctc gagcggcgga 480

gggggttcag gtggaggagg ctctggcggt ggcggaagcc agtctgccct gactcagcct 540

gcctccgtgt ctgggtctcc tggacagtcg atcaccatct cctgcaatgg aaccagcaat 600

gatgttggtg gctatgaatc tgtctcctgg taccaacaac atcccggcaa agcccccaaa 660

gtcgtgattt atgatgtcag taaacggccc tcaggggttt ctaatcgctt ctctggctcc 720

aagtccggca acacggcctc cctgaccatc tctgggctcc aggctgagga cgagggtgac 780

tattactgca agtctctgac aagcacgaga cgtcgggttt tcggcactgg gaccaagctg 840

accgttctaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 900

cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 960

agggggctgg acttcgcctg tgatttttgg gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggct 1020

tgctatagct tgctagtaac agtggccttt attattttct gggtgaggag taagaggagc 1080

aggctcctgc acagtgacta catgaacatg actccccgcc gccccgggcc cacccgcaag 1140

cattaccagc cctatgcccc accacgcgac ttcgcagcct atcgctccaa acggggcaga 1200

aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 1260

gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg 1320

aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 1380

gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1440

cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1500

cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1560

ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1620

gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc taa 1653

<210> 2

<211> 550

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gln Arg Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val

20 25 30

Val Gln Pro Gly Ser Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

35 40 45

Asp Phe Ser Arg Gln Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Val Ala Phe Ile Lys Tyr Asp Gly Ser Glu Lys Tyr

65 70 75 80

His Ala Asp Ser Val Trp Gly Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser

85 90 95

Lys Asp Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Glu Ala Gly Gly Pro Asp Tyr Arg Asn

115 120 125

Gly Tyr Asn Tyr Tyr Asp Phe Tyr Asp Gly Tyr Tyr Asn Tyr His Tyr

130 135 140

Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

145 150 155 160

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala

165 170 175

Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr

180 185 190

Ile Ser Cys Asn Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Gly Tyr Glu Ser Val

195 200 205

Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Tyr

210 215 220

Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser

225 230 235 240

Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu

245 250 255

Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Lys Ser Leu Thr Ser Thr Arg Arg Arg

260 265 270

Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Thr Thr Thr Pro Ala

275 280 285

Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser

290 295 300

Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

305 310 315 320

Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly

325 330 335

Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile

340 345 350

Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met

355 360 365

Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro

370 375 380

Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg

385 390 395 400

Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln

405 410 415

Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu

420 425 430

Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

435 440 445

Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

450 455 460

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

465 470 475 480

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

485 490 495

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

500 505 510

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

515 520 525

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

530 535 540

Gln Ala Leu Pro Pro Arg

545 550

<210> 3

<211> 849

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc cttcctgctg 60

atcccccagc gattagtgga gtctggggga ggcgtggtcc agcctgggtc gtccctgaga 120

ctctcctgtg cagcgtccgg attcgacttc agtagacaag gcatgcactg ggtccgccag 180

gctccaggcc aggggctgga gtgggtggca tttattaaat atgatggaag tgagaaatat 240

catgctgact ccgtatgggg ccgactcagc atctccagag acaattccaa ggatacgctt 300

tatctccaaa tgaatagcct gagagtcgag gacacggcta catatttttg tgtgagagag 360

gctggtgggc ccgactaccg taatgggtac aactattacg atttctatga tggttattat 420

aactaccact atatggacgt ctggggcaaa gggaccacgg tcaccgtctc gagcggcgga 480

gggggttcag gtggaggagg ctctggcggt ggcggaagcc agtctgccct gactcagcct 540

gcctccgtgt ctgggtctcc tggacagtcg atcaccatct cctgcaatgg aaccagcaat 600

gatgttggtg gctatgaatc tgtctcctgg taccaacaac atcccggcaa agcccccaaa 660

gtcgtgattt atgatgtcag taaacggccc tcaggggttt ctaatcgctt ctctggctcc 720

aagtccggca acacggcctc cctgaccatc tctgggctcc aggctgagga cgagggtgac 780

tattactgca agtctctgac aagcacgaga cgtcgggttt tcggcactgg gaccaagctg 840

accgttcta 849

<210> 4

<211> 283

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gln Arg Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val

20 25 30

Val Gln Pro Gly Ser Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

35 40 45

Asp Phe Ser Arg Gln Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Val Ala Phe Ile Lys Tyr Asp Gly Ser Glu Lys Tyr

65 70 75 80

His Ala Asp Ser Val Trp Gly Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser

85 90 95

Lys Asp Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Glu Ala Gly Gly Pro Asp Tyr Arg Asn

115 120 125

Gly Tyr Asn Tyr Tyr Asp Phe Tyr Asp Gly Tyr Tyr Asn Tyr His Tyr

130 135 140

Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

145 150 155 160

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala

165 170 175

Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr

180 185 190

Ile Ser Cys Asn Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Gly Tyr Glu Ser Val

195 200 205

Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Tyr

210 215 220

Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser

225 230 235 240

Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu

245 250 255

Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Lys Ser Leu Thr Ser Thr Arg Arg Arg

260 265 270

Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

275 280

<210> 5

<211> 9251

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420

attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagcgcgtt ttgcctgtac tgggtctctc 840

tggttagacc agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc actgcttaag 900

cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg cccgtctgtt gtgtgactct 960

ggtaactaga gatccctcag acccttttag tcagtgtgga aaatctctag cagtggcgcc 1020

cgaacaggga cctgaaagcg aaagggaaac cagagctctc tcgacgcagg actcggcttg 1080

ctgaagcgcg cacggcaaga ggcgaggggc ggcgactggt gagtacgcca aaaattttga 1140

ctagcggagg ctagaaggag agagatgggt gcgagagcgt cagtattaag cgggggagaa 1200

ttagatcgcg atgggaaaaa attcggttaa ggccaggggg aaagaaaaaa tataaattaa 1260

aacatatagt atgggcaagc agggagctag aacgattcgc agttaatcct ggcctgttag 1320

aaacatcaga aggctgtaga caaatactgg gacagctaca accatccctt cagacaggat 1380

cagaagaact tagatcatta tataatacag tagcaaccct ctattgtgtg catcaaagga 1440

tagagataaa agacaccaag gaagctttag acaagataga ggaagagcaa aacaaaagta 1500

agaccaccgc acagcaagcg gccgctgatc ttcagacctg gaggaggaga tatgagggac 1560

aattggagaa gtgaattata taaatataaa gtagtaaaaa ttgaaccatt aggagtagca 1620

cccaccaagg caaagagaag agtggtgcag agagaaaaaa gagcagtggg aataggagct 1680

ttgttccttg ggttcttggg agcagcagga agcactatgg gcgcagcctc aatgacgctg 1740

acggtacagg ccagacaatt attgtctggt atagtgcagc agcagaacaa tttgctgagg 1800

gctattgagg cgcaacagca tctgttgcaa ctcacagtct ggggcatcaa gcagctccag 1860

gcaagaatcc tggctgtgga aagataccta aaggatcaac agctcctggg gatttggggt 1920

tgctctggaa aactcatttg caccactgct gtgccttgga atgctagttg gagtaataaa 1980

tctctggaac agatctggaa tcacacgacc tggatggagt gggacagaga aattaacaat 2040

tacacaagct taatacactc cttaattgaa gaatcgcaaa accagcaaga aaagaatgaa 2100

caagaattat tggaattaga taaatgggca agtttgtgga attggtttaa cataacaaat 2160

tggctgtggt atataaaatt attcataatg atagtaggag gcttggtagg tttaagaata 2220

gtttttgctg tactttctat agtgaataga gttaggcagg gatattcacc attatcgttt 2280

cagacccacc tcccaacccc gaggggaccc gacaggcccg aaggaataga agaagaaggt 2340

ggagagagag acagagacag atccattcga ttagtgaacg gatcttccat cgaattcctg 2400

cagcccgggg gatctaaaag aaaagggggg attggggggt acagtgcagg ggaaagaata 2460

gtagacataa tagcaacaga catacaaact aaagaattac aaaaacaaat tacaaaaatt 2520

caaaattttc gggtttatta cagggacagc agagatccag tttatcgatg agtaattcat 2580

acaaaaggac tcgcccctgc cttggggaat cccagggacc gtcgttaaac tcccactaac 2640

gtagaaccca gagatcgctg cgttcccgcc ccctcacccg cccgctctcg tcatcactga 2700

ggtggagaag agcatgcgtg aggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc 2760

acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg 2820

cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg 2880

ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc 2940

gccagaacac aggtaagtgc cgtgtgtggt tcccgcgggc ctggcctctt tacgggttat 3000

ggcccttgcg tgccttgaat tacttccacg cccctggctg cagtacgtga ttcttgatcc 3060

cgagcttcgg gttggaagtg ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc 3120

gcctcgtgct tgagttgagg cctggcttgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg 3180

gcaccttcgc gcctgtctcg ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg 3240

acctgctgcg acgctttttt tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca 3300

cactggtatt tcggtttttg gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac 3360

atgttcggcg aggcggggcc tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca 3420

agctggccgg cctgctctgg tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc 3480

ggcaaggctg gcccggtcgg caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc 3540

tgctgcaggg agctcaaaat ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc 3600

cacacaaagg aaaagggcct ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccacggagta 3660

ccgggcgccg tccaggcacc tcgattagtt ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg 3720

ttggggggag gggttttatg cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt 3780

taggccagct tggcacttga tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc 3840

ttggttcatt ctcaagcctc agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc 3900

gtgaggatct atttccggtg aattcgccac cacgcgtctg gaacaatcaa cctctggatt 3960

acaaaatttg tgaaagattg actggtattc ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg 4020

gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct 4080

cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc gttgtcaggc 4140

aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc cactggttgg ggcattgcca 4200

ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg ctttccccct ccctattgcc acggcggaac 4260

tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc actgacaatt 4320

ccgtggtgtt gtcggggaag ctgacgtcct ttccatggct gctcgcctgt gttgccacct 4380

ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc cctcaatcca gcggaccttc 4440

cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg tcttcgcctt cgccctcaga 4500

cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc cgcatcgata ccgtcgagac ctggaaaaac 4560

atggagcaat cacaagtagc aacacagcag ctaccaatgc tgcttgtgcc tggctagaag 4620

cacaagagga ggaggaggtg ggttttccag tcacacctca ggtaccttta agaccaatga 4680

cttacaaggc agctgtagat cttagccact ttttaaaaga aaagggggga ctggaagggc 4740

taattcactc ccaacgaaga caagatatcc ttgatctgtg gatctaccac acacaaggct 4800

acttccctga ttggcagaac tacacaccag ggccagggat cagatatcca ctgacctttg 4860

gatggtgcta caagctagta ccagttgagc aagagaaggt agaagaagcc aatgaaggag 4920

agaacacccg cttgttacac cctgtgagcc tgcatgggat ggatgacccg gagagagaag 4980

tattagagtg gaggtttgac agccgcctag catttcatca catggcccga gagctgcatc 5040

cggactgtac tgggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc tctggctaac 5100

tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg 5160

cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag tcagtgtgga 5220

aaatctctag cagggcccgt ttaaacccgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc 5280

cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc 5340

actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct 5400

attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg 5460

catgctgggg atgcggtggg ctctatggct tctgaggcgg aaagaaccag ctggggctct 5520

agggggtatc cccacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg 5580

cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct 5640

tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg catcccttta 5700

gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt 5760

tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg 5820

ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat 5880

tcttttgatt tataagggat tttggggatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt 5940

taacaaaaat ttaacgcgaa ttaattctgt ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt 6000

ccccaggctc cccaggcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc 6060

aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat 6120

tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt 6180

tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc 6240

gcctctgcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt 6300

tgcaaaaagc tcccgggagc ttgtatatcc attttcggat ctgatcagca cgtgttgaca 6360

attaatcatc ggcatagtat atcggcatag tataatacga caaggtgagg aactaaacca 6420

tggccaagtt gaccagtgcc gttccggtgc tcaccgcgcg cgacgtcgcc ggagcggtcg 6480

agttctggac cgaccggctc gggttctccc gggacttcgt ggaggacgac ttcgccggtg 6540

tggtccggga cgacgtgacc ctgttcatca gcgcggtcca ggaccaggtg gtgccggaca 6600

acaccctggc ctgggtgtgg gtgcgcggcc tggacgagct gtacgccgag tggtcggagg 6660

tcgtgtccac gaacttccgg gacgcctccg ggccggccat gaccgagatc ggcgagcagc 6720

cgtgggggcg ggagttcgcc ctgcgcgacc cggccggcaa ctgcgtgcac ttcgtggccg 6780

aggagcagga ctgacacgtg ctacgagatt tcgattccac cgccgccttc tatgaaaggt 6840

tgggcttcgg aatcgttttc cgggacgccg gctggatgat cctccagcgc ggggatctca 6900

tgctggagtt cttcgcccac cccaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa 6960

gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt 7020

tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctgtatacc gtcgacctct agctagagct 7080

tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac 7140

acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac 7200

tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc 7260

tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg 7320

cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 7380

actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt 7440

gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 7500

ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 7560

acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 7620

ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 7680

cgctttctca atgctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc 7740

tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 7800

gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca 7860

ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact 7920

acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg 7980

gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt 8040

ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 8100

tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 8160

gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 8220

tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac 8280

ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga 8340

taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc 8400

cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca 8460

gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta 8520

gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg 8580

tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc 8640

gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg 8700

ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt 8760

ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt 8820

cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata 8880

ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc 8940

gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac 9000

ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa 9060

ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct 9120

tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat 9180

ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc 9240

cacctgacgt c 9251

Claims

1.一种用于清除HIV-1感染细胞的嵌合型抗原受体PG9-CAR，其特征在于：该嵌合型抗原受体是通过N端到C端顺次拼接信号肽、PG9单链抗体、CD8hinge、白细胞抗原分化群分子跨膜区CD28-TM及其细胞内结构域(ICD)、4-1BB和白细胞抗原分化群3的ζ链CD3得到的，所得到的嵌合型抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的一种用于清除HIV-1感染细胞的嵌合型抗原受体PG9-CAR，其特征在于：所述PG9单链抗体是通过串联针对感染HIV病毒细胞表面gp120的抗体轻链、重链可变区而得，得到的单链抗体作为整个CAR分子的胞外结合结构域能够识别HIV病毒感染细胞表面的gp120，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求2所述的一种用于清除HIV-1感染细胞的嵌合型抗原受体PG9-CAR，其特征在于：编码所述PG9单链抗体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.编码权利要求1所述的用于清除HIV-1感染细胞的嵌合型抗原受体PG9-CAR的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.一种工程化的基因修饰的CD8+T淋巴细胞，其特征在于：该细胞是嵌合型抗原受体PG9-CAR修饰的CD8+T淋巴细胞。

6.制备权利要求5所述的基因修饰的CD8+T淋巴细胞的方法，其特征在于：将权利要求1所述的嵌合型抗原受体PG9-CAR分子转导至CD8+T淋巴细胞，从而获得能表达嵌合型抗原受体PG9-CAR分子的基因工程化的T-淋巴细胞。

7.权利要求5所述的基因修饰的CD8+T淋巴细胞的用途，其特征在于：所述基因修饰的CD8+T淋巴细胞应用于制备清除HIV-1感染细胞的药物。

8.根据权利要求7所述的基因修饰的CD8+T淋巴细胞的用途，其特征在于：所述清除HIV-1感染细胞的药物是以基因修饰的CD8+T淋巴细胞作为主要活性成分。