CN111089972B - 一种用于检测抗人体髓鞘碱性蛋白抗体的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测抗人体髓鞘碱性蛋白(MBP)抗体的试剂盒及其应用以及所述试剂盒用于抗人体髓鞘碱性蛋白抗体检测的方法，属于免疫检测领域。本发明提供了一种全新的患者血清或脑脊液中抗MBP自身抗体的检测方法，该方法通过MBP过表达载体构建、细胞转染、细胞免疫荧光检测等技术，进行抗体定性和滴度测定。本方法具有检测效率高，特异性强等特点。成功地解决了免疫印迹和酶联免疫吸附法中常见的检测结果假阳性或假阴性的问题，具有十分重要的临床应用价值。

Description

一种用于检测抗人体髓鞘碱性蛋白抗体的试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于免疫检测领域，具体涉及一种基于细胞免疫荧光技术检测人体髓鞘碱性蛋白自身抗体的试剂盒及其应用，还涉及一种所述试剂盒用于抗人体髓鞘碱性蛋白抗体检测的方法。

背景技术

髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)是构成神经髓鞘的主要成分之一，约占髓鞘蛋白总量的30％，是髓鞘中抗原性最强的蛋白质，它在中枢和周围神经系统内分别由少突胶质细胞、雪旺氏细胞进行合成、分泌。

MBP属于隐蔽性封闭自身抗原，当暴露或释放至脑脊液(Cerebrospinal Fluid，CSF)中时，可引起免疫应答，并刺激机体产生髓鞘特异性自身抗MBP抗体。该抗体在体内以游离和结合两种形式存在，游离抗体主要识别MBP的61-106肽段，结合抗体主要识别75-106肽段，最常见的是85-95肽段。抗MBP抗体诱发的自身免疫性炎症反应，被认为是包括多发性硬化(multiple sclerosis，MS)在内的多种神经系统疾病的重要病因。

MS患者存在多种髓鞘特异性抗体，其中重要抗体之一为抗MBP抗体。已有研究报道抗MBP抗体阳性的患者较抗体阴性的患者，缓解期短、复发率高，可作为单一脱髓鞘病灶患者诊断MS的有力佐证；抗MBP抗体阳性的临床确诊孤立综合征患者较抗体阴性患者发展为MS的时间短；因此，可将抗MBP抗体作为诊断脱髓鞘疾病的重要指标。然而，国内外关于抗MBP抗体的检测结果争议较大。有研究发现MS急性期血清中抗MBP抗体阳性率为77％；亦有研究阐明抗MBP抗体与MS的临床类型和病程有关，在首次发作阳性率仅为28％，随病情进展阳性率增高可达60％。针对上述问题，抗MBP抗体在MS等多种神经系统疾病中的作用过程达成一致尤为关键。

早在1987年Panitch等采用放射免疫法在MS患者脑脊液中检测到抗MBP抗体；1995年Warren等用固相放射免疫法在复发和进展型MS患者脑脊液中滴度升高；上述两种方法检测效率低，且放射性污染可对环境造成伤害。

目前，患者血清或脑脊液内的MBP自身抗体检测方法包括以下几类，现将检测方法及其缺陷总结如下：1、使用高表达MBP抗原的神经组织切片进行染色检测，此方法存在诸多问题如由于切片组织部位难以控制，致使批次之间差异较大；组织切片多为动物来源(如欧盟公司用的猴神经组织切片)，抗原存在种属差异，降低检测的灵敏度和特异性；组织中存在除MBP的其他抗原，检测的阳性结果可能并非为MBP抗体阳性。2、Western或Elisa方法检测，虽然两种技术已较为成熟，但由于其难以维持MBP抗原的空间构象，致使其特异性不高，且费用昂贵，极大的限制了这些检测手段的推广。

生物素-亲和素系统，亲和素(avidin，AV)亦称抗生物素蛋白，由四个相同亚基组成的碱性糖蛋白，四个相同的亚基使每个亲和素能最多可结合四个分子的生物素。生物素与亲和素之间具有极强的亲和力，亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍，稳定性好。生物素易与蛋白质等生物大分子结合，形成的生物素衍生物，不仅保持了大分子物质的原有生物活性，而且具有多价性。此外，每个亲和素分子有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合生物素化的大分子衍生物和标记物。因此，生物素-亲和素系统(Biotin-AvidinSystem，BAS)具有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。亲和素与生物素间的结合呈高度特异性。因此，BAS的多层次放大作用在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰。而且，BAS结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响。因此，在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。

酪酰胺信号放大技术(TSA，Tyramide Signal Amplification)，又称作催化信号放大技术(CSA，Catalyzed Signal Amplification)，其从发明至今已有约二十年的历程。TSA技术是一类利用辣根过氧化物酶(HRP，Horseradish Peroxidase)对目标抗原进行高密度原位标记的酶学检测手段。目前应用较为广泛，包括免疫荧光(Immunofluorescence，IF)、免疫组化(Immunohistochemistry，IHC)、酶联免疫吸附实验(Enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA)、原位杂交(In Situ Hybridization，ISH)等检测的信号放大。该法可与传统荧光染料、高效荧光染料Alexa Fluor、酶系统、比色检测系统相容。TSA技术的原理为酪胺-荧光化合物在HRP的催化下与靶标原位及附近的酪氨酸残基以共价键结合，生成稳定的荧光化合物。也可通过HRP催化将酪胺-半抗原化合物(如酪胺-生物素)以共价键结合在靶标原位及附近的酪氨酸残基上，再与随后加入的Streptavidin-HRP/荧光基团结合，经几轮循环放大，可以结合大量的酶分子或荧光基团，结果使其检测信号得到100-1000倍放大。该法的优点为放大的荧光信号具有理想的光、热、pH稳定性，样品可长时间保存，且利用TSA进行的多色荧光标记不受一抗种属的限制。

发明内容

发明要解决的问题

为解决上述抗人体MBP抗体检测中存在的问题，提高抗MBP抗体检测的灵敏度和准确性，本发明提供了一种用于检测抗人体髓鞘碱性蛋白抗体的试剂盒，以及所述试剂盒用于抗人体髓鞘碱性蛋白抗体检测的方法，通过制备携带MBP基因的慢病毒过表达载体的细胞，结合了条件优化的细胞免疫荧光检测方法，从而提高了人体抗MBP抗体检测的灵敏度，特异性和准确性。

所述慢病毒过表达载体为pLV-EGFP(2A)Puro载体是基于HIV1的慢病毒基因过表达载体，该载体保留了EGFP蛋白便利性，避免了融合标签蛋白对目的基因功能产生影响。载体包含了生产慢病毒所必须的病毒原件以及提高病毒滴度及基因表达效率的原件。结构紧凑，在保证产生高滴度病毒的同时，外源基因片段的容量达到大，多数哺乳动物基因都可以在pLV-EGFP(2A)Puro中成功表达。该病毒载体易于检测转染是否成功，同时能够确保BMP基因高质量的表达，产生足量的MBP蛋白，用于与检测样品中抗MBP抗体。

本发明采用细胞免疫荧光技术，结合抗原与抗体具有特异性结合的特性，同时本发明未对样品中抗原或细胞产生的抗体进行修饰或固定，较好的保持了抗原和抗体的空间结构，进而确保了灵敏度和特异性。

优选的，本发明结合了生物素-链霉亲和素系统，生物素与亲和素之间具有极强的亲和力，亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍，该系统具有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。

优选的，本发明结合了“一抗-HRP二抗-TSA”系统，与传统荧光相比可对信号放大100-1000倍，结合物极为稳定，保存时间长，极大地提高检测方法的灵敏度。

用于解决问题的方案

定义

在本发明的权利要求和/或说明书中，除非上下文中另有说明，否则例如“一个/种(a,an)”、“所述(said)”或“所述(the)”等指示对象旨在支持单数和/或复数情况二者。

如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。

如本发明所使用的，术语“约”表示：一个数值包括测定该数值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。示例性的，前述标准偏差一般为原始数值相差5％的范围之内。

虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。

如本发明所使用的，术语“接触”既可以表示两种或多种组份发生物理上的接触，也可以表示两种或多种组份由于发生化学反应而发生的“接触”。对于后一种情形，一种示例性的方式是标记物，例如荧光标记物之间发生的接触，导致产生荧光或者导致原有荧光猝灭。

在一种实施方式中，本发明提供了一种用于检测抗人体髓鞘碱性蛋白抗体的试剂盒，包括表达髓鞘碱性蛋白基因的细胞、第二抗体、标记物；其中，所述第二抗体为抗人抗体，

所述标记物可与所述第二抗体直接相连或间接相连；并且，

当所述标记物与所述第二抗体接触时，所述标记物产生荧光或发生荧光猝灭。

在本发明中，待测样品中含有的抗髓鞘碱性蛋白抗体为第一抗体，其能够与本发明试剂盒中所表达髓鞘碱性蛋白基因的细胞产生的髓鞘碱性蛋白蛋白(非抗体性抗原)发生抗原-抗体特异性结合。所述第一抗体(抗体性抗原)又能够与本发明试剂盒中所述第二抗体发生抗原-抗体特异性结合。

作为本发明实施方式之一，所述第二抗体包括但不限于山羊抗人抗体，大鼠抗人抗体，小鼠抗人抗体，猪抗人抗体，驴抗人抗体，绵羊抗人抗体，鸡抗人抗体，马抗人抗体，兔抗人抗体，仓鼠抗人抗体，狗抗人抗体，牛抗人抗体等；优选山羊抗人抗体。来源包括但不限于实验室制备或市售。

作为本发明实施方式之一，所述第二抗体的类型包括但不限于IgG，IgA，IgM，IgG(Fc)，IgG(ab’)2等；优选IgG。

作为本发明实施方式之一，所述标记物包括但不限于荧光素、酶。

作为本发明实施方式之一，所述标记物为荧光素，所述荧光素包括但不限于单分子荧光素、枝杈状多分子荧光素。优选枝杈状多分子荧光素。

作为本发明实施方式之一，所述标记物为荧光素，所述荧光素包括但不限异硫氰酸荧光素，罗丹明，四甲基罗丹明异硫氰酸盐，Texas Red，藻红蛋白，碘化丙啶，AlexaFluor系列，Dylight系列，iFluor系列；优选为酪胺偶联的枝杈状异硫氰酸荧光素。所述荧光素与第二抗体直接相连或间接相连，当第二抗体与抗人体髓鞘碱性蛋白抗体结合后，标记物产生荧光或产生荧光猝灭。

作为本发明实施方式之一，所述标记物为酶，所述酶包括但不限于辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)或其衍生物等。所述酶与第二抗体直接相连或间接相连，当第二抗体与抗人体髓鞘碱性蛋白抗体结合后，酶作用生物质发挥酶的催化作用，可以催化无荧光的底物产生荧光，或者催化荧光底物生成可与样本共价结合的荧光素，或者催化有荧光的底物产生荧光猝灭。

作为本发明实施方式之一，荧光底物包括但不限于酪胺-荧光素化合物。

作为本发明实施方式之一，所述标记物或酶与第二抗体直接相连，当第二抗体与抗人体髓鞘碱性蛋白抗体结合后标记物产生荧光，或产生荧光猝灭。

作为本发明实施方式之一，所述标记物与第二抗体间接相连，第二抗体通过偶联基团与标记物偶联的基团发生结合，进而产生荧光，或产生荧光猝灭。

在本发明中，所述“间接连接”指的是标记物或酶不直接与第二抗体相连，而是通过其他的基团，与标记物或酶相连的基团特异性结合，间接与第二抗体产生连接关系。

作为本发明实施方式之一，所述第二抗体与生物素偶联，所述标记物与亲和素偶联；所述亲和素优选为链霉亲和素。所述偶联生物素的第二抗体与抗人体髓鞘碱性蛋白抗体结合后，偶联标记物的链霉亲和素与生物素结合，所述标记物产生荧光，或产生荧光猝灭，或发生酶催化反应。

作为本发明实施方式之一，所述表达髓鞘碱性蛋白基因的细胞表达髓鞘碱性蛋白基因，所述髓鞘碱性蛋白基因的序列为如SEQ ID NO：4所示的序列。

作为本发明实施方式之一，所述载体为pLV-EGFP(2A)Puro载体，是一种基于HIV1的慢病毒基因过表达载体，载体包含了生产慢病毒所必须的病毒原件以及提高病毒滴度及基因表达效率的原件，在保证产生高滴度病毒的同时，载体对外源基因片段的容量较大，多数哺乳动物的基因都可以在pLV-EGFP(2A)Puro载体中表达。

作为本发明实施方式之一，所述表达髓鞘碱性蛋白基因的细胞为转有携带髓鞘碱性蛋白基因表达载体pLV-EGFP(2A)Puro-MBP-V1的细胞。

作为本发明实施方式之一，所述表达髓鞘碱性蛋白基因的细胞的制备方法包括：

髓鞘碱性蛋白基因载体构建；

准备细胞用于转染；

质粒转染细胞；

病毒培养、搜集及病毒滴度测定；

病毒感染及细胞筛选。

作为本发明实施方式之一，所述髓鞘碱性蛋白基因载体构建步骤包括但不限于以人少突胶质细胞为模板，扩增髓鞘碱性蛋白序列的步骤。

作为本发明实施方式之一，所述髓鞘碱性蛋白基因载体构建步骤包括：通过PCR方法，获得人体髓鞘碱性蛋白基因的全长序列，并将髓鞘碱性蛋白基因连接到载体上得到目标质粒的步骤。

作为本发明实施方式之一，所述髓鞘碱性蛋白基因载体构建步骤进一步包括：人体髓鞘碱性蛋白基因的全长序列和所述载体用限制性内切酶酶切后连接的步骤，所述限制性内切酶包括但不限于用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切。在所述髓鞘碱性蛋白基因载体构建质粒的步骤中，使用PCR法获取所述髓鞘碱性蛋白基因，在所述PCR法中使用的引物对的序列为如SEQ ID NO：1所示的序列和如SEQ ID NO：2所示的序列。

作为本发明实施方式之一，所述准备细胞用于转染步骤中用于转染的细胞包括但不限于HEK293，CHO，Sp2/0，Hela，HepG2，H1299，A549，HT1080，MCF-7，Human ES细胞，MC3T3-E1，B16，及其衍生株等；优选HEK293T；进一步优选经过传代的贴壁生长的人胚肾细胞HEK293T。

作为本发明实施方式之一，所述质粒转染细胞步骤中转染的方法包括但不限于电击法，磷酸钙法，脂质体介导法，病毒介导法，基因枪法，显微注射法，阳离子聚合物法等；优选脂质体介导法。

作为本发明实施方式之一，所述质粒转染细胞步骤中转染使用的脂质体为阳离子脂质体；优选Lipofectamine 2000。

作为本发明实施方式之一，所述质粒转染细胞步骤中进一步包括加入混合质粒和及脂质体。

作为本发明实施方式之一，所述质粒转染细胞步骤中进一步包括加入混合质粒的步骤；由于混合质粒各成分的比例影响慢病毒包装效率，在本发明中所述混合质粒的质量比优选为目标质粒:VSVG质粒:REV质粒＝5:3:2，其中所述目标质粒为携带髓鞘碱性蛋白基因的质粒，所述VSVG质粒为表达VSVG基因的包装质粒，所述REV质粒为表达Rev基因的包装质粒。

作为本发明实施方式之一，所述病毒培养、收集及病毒滴度测定步骤中病毒滴度测定的方法为：在荧光显微镜下准确数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数X和Y(X、Y以×10¹个为计)，滴度TU/ml＝(X+Y×10)×1000/2/X孔的病毒液的含量μl。作为本发明实施方式之一，所述病毒感染及细胞筛选步骤中进一步包括：用病毒感染处于对数生长期的HEK293T细胞的步骤。

作为本发明实施方式之一，所述病毒感染及细胞筛选步骤中包括：通过药物和/或单细胞克隆分选技术，筛选，获得表达髓鞘碱性蛋白基因的稳定细胞。可通过药物(包括G418、潮霉素B或嘌呤霉素，首选嘌呤霉素)和/或单细胞克隆分选，筛选至大约7-14天，细胞不再死亡。扩大培养筛选得到的细胞，鉴定是否目标蛋白的表达，从而获得表达髓鞘碱性蛋白基因的稳定细胞。

本发明进一步提供了一种用于检测抗人体髓鞘碱性蛋白抗体的试剂盒在制备诊断多发性硬化的试剂盒中的应用。

本发明进一步提供了一种试剂盒用于抗人体髓鞘碱性蛋白抗体的检测方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤1)接种所述表达髓鞘碱性蛋白基因的细胞；

步骤2)加入待测样品，使得待测样品和所述表达髓鞘碱性蛋白基因的细胞接触第二抗体；

步骤3)加入标记物；

步骤4)通过所述检测细胞和所述待测样品产生的荧光强度，和对荧光强度强弱进行分析，诊断是否发生多发性硬化。

作为本发明实施方式之一，所述步骤1)进一步包括：将转有携带髓鞘碱性蛋白基因表达载体的NEK293T细胞和转染空载体的细胞按照7:3的比例混合并传代，用细胞贴壁试剂处理，待细胞达到80％融合度时，用于后续检测用。

作为本发明实施方式之一，所述步骤2)中待测样品包括但不限于血清，脑脊液；优选为血清。

作为本发明实施方式之一，所述步骤2)中进行免疫荧光反应的一抗为抗人体髓鞘碱性蛋白抗体。

作为本发明实施方式之一，所述步骤2)中进行免疫荧光反应的第二抗体为生物素标记山羊抗人抗体。

作为本发明实施方式之一，所述步骤2)中进行免疫荧光反应的标记物为荧光标记链霉亲和素。

作为本发明实施方式之一，所述步骤2)中进行的抗原抗体反应的标记物HRP标记的山羊抗人IgG。

作为本发明实施方式之一，所述步骤2)中操作步骤为：用缓冲液洗涤细胞，抗体封闭。加入患者血清，孵育，缓冲液洗涤，加入生物素标记山羊抗人抗体孵育，PBST缓冲液洗涤，加入荧光标记链霉亲和素，洗涤，封片。

作为本发明实施方式之一，所述步骤2)中操作步骤为：用缓冲液洗涤细胞，抗体封闭。加入患者血清，孵育，缓冲液洗涤，加入HRP标记的山羊抗人IgG孵育，PBST缓冲液洗涤，封片。

作为本发明实施方式之一，所述步骤4)进一步包括以转染空载体的细胞对照，在显微镜视野下根据荧光的信号强弱来标示抗体浓度的相对量。

作为本发明实施方案之一，携带髓鞘碱性蛋白基因表达载体的细胞的制备方法包括：

以人视神经cDNA为模板，扩增髓鞘碱性蛋白序列，获取髓鞘碱性蛋白全长目的基因，通过pLV-EGFP(2A)Puro质粒载体将目的基因构建到慢病毒载体中；

通过与慢病毒骨架质粒共转染HEK293T细胞，获得含有髓鞘碱性蛋白基因的慢病毒颗粒。随后将浓缩的慢病毒颗粒感染HEK293T细胞，通过药物和/或单细胞克隆分选技术获得稳定高表达髓鞘碱性蛋白基因的稳定细胞。

作为本发明实施方案之一，所述试剂盒用于抗人体髓鞘碱性蛋白抗体检测的方法包括：

将转有携带髓鞘碱性蛋白基因表达载体的NEK293T细胞和转染空载体的细胞按照7:3的比例混合并传代，用细胞贴壁试剂处理，待细胞达到80％融合度时，用于后续检测用；

用缓冲液洗涤细胞，抗体封闭。加入患者血清，孵育，缓冲液洗涤，加入生物素标记山羊抗人抗体孵育，PBST缓冲液洗涤，加入荧光标记链霉亲和素，洗涤，封片；

用缓冲液洗涤细胞，抗体封闭，加入患者血清，孵育，缓冲液洗涤，加入HRP标记的山羊抗人IgG孵育，PBST缓冲液洗涤，封片。

以转染空载体的细胞对照，在显微镜视野下根据荧光的信号强弱来标示抗体浓度的相对量。

发明的效果

在一个实施方式中，本发明通过细胞免疫荧光技术，并结合生物素-链霉亲和素系统，并结合“一抗-HRP二抗-TSA”系统，建立高灵敏性检测样品中MBP抗体的方法，用于临床定性及MBP自身抗体滴度测定。采用灵敏度和特异性较高的细胞免疫荧光染色法(CBA)检测技术，不需进行电泳，也不需要对抗原和抗体进行化学修饰和固定，较完整的保证抗原的空间构象。

在一个实施方式中，通过与现有欧盟检测方法比较，确定本检测方法的灵敏度和特异性。本发明涉及的检测方法具有检测灵敏度高，特异性强的特点(图5)，成功解决了免疫印迹和酶联免疫吸附法中常见的检测结果假阳性或假阴性的问题，具有十分重要的临床应用价值。

附图说明

图1：本发明实施例中构建的pLV-EGFP(2A)Puro-MBP-V1的基因图谱；

图2：本发明实施例中转有pLV-EGFP(2A)Puro空载体的细胞和转有携带MBP基因表达载体pLV-EGFP(2A)Puro-MBP-V1的细胞(转有携带BMP基因的载体)中MBP蛋白的表达水平，图2A为western blot的分析结果，图2B为免疫荧光技术的分析结果；

图3：本发明实施例中构建的表达MBP基因的细胞通过本发明的方法检测病人血清中抗MBP抗体的检测结果，检测结果依次为阴性、弱阳性、强阳性；

图4：本发明实施例中方法与其他方法检出率比较，图中分别为本发明实施例中免疫荧光技术的分析结果为阴性、阳性1和阳性2；

图5：应用受试者工作曲线ROC曲线对本发明实施例中方法与欧蒙试剂盒方法的灵敏度与特异性进行比较，结果显示本发明实施例中方法诊断准确性更高。

具体实施方式

本发明的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本发明的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本发明的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。

实施例中采用的所有试剂，除非另有强调，否则均可以通过商业途径购买获得。

实施例1：检测抗人体髓鞘碱性蛋白抗体的试剂盒的制备

pLV-EGFP(2A)Puro-MBP-V1基因载体质粒构建

1)通过PCR法，获得人体MBP基因的全长序列。以人少突胶质细胞(购买自ATCC细胞库，

CRL-3216^TM)cDNA为模板，扩增MBP序列，所用引物为：

F:5’-TTTCTAGAAATGTACAAGGAATTCGCCACCATGGCGTCACAGAAGA-3’(SEQ ID NO：1)；

R:5’-TCTAGGGATCCGGGCCCGGGTTCGAACTCGAGTCAGCGTCTAGCCATGGGT-3’(SEQ IDNO：2)。

扩增片段经电泳后，切胶回收，回收后连入T载体(6013，TAKARA)，经测序比对，确认序列正确(序列与SEQ ID NO.3相同)后将其用EcoRI和XhoI双酶切后与经EcoRI(R0101,NEB)和XhoI(R0146,NEB)双酶切后的pLV-EGFP(2A)Puro(VL3402，Inovogen)质粒载体相连接(见图1)。得到过表达人MBP全长基因的慢病毒质粒载体，序列如SEQ ID NO.1所示。

病毒包装及HEK293T稳定转染细胞的获得：

1)细胞培养：人胚肾HEK293T细胞由本室常规培养，细胞置于含有10％灭活胎牛血清(FBS，SH30084.03，Hyclone)的DMEM培养基中，放入37℃，5％CO₂孵箱(371，ThermoFisher Scientific)，按常规方法培养，取处于对数生长期的细胞用于实验。

2)细胞的复苏和传代：预先向50ml离心管中加入20ml DMEM培养基，从液氮罐取出冻存的细胞迅速投入37℃水浴中并不断摇动使其在最短时间内解冻，用70％酒精消毒冻存管外表后，将细胞存储液转移至上述离心管中，1000rmp离心5分钟，弃上清，重悬细胞置于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，37℃，5％CO₂、饱和湿度下培养。

3)准备细胞：用1ml胰酶(25200-056，Gibco)消化HEK293T细胞1-2分钟，用含10％FBS(FBS，SH30084.03，Hyclone)的DMEM培养基重悬HEK293T细胞。将细胞置于含5％CO₂，37℃孵箱中孵育8-24小时，当细胞贴壁完全后即可开始转染。转染前2小时换液(用1.5ml完全培养基置换旧的培养基)。

4)质粒转染：混匀目标质粒(即步骤(1)得到的如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的质粒)和包装质粒(VSVG质粒和REV质粒，Invitrogen)取无菌1.5ml EP管，加入400μl无血清DMEM培养基，加入混合质粒(目标质粒:VSVG质粒:REV质粒＝5:3:2(质量比)，及6μlLipofectamine 2000(11668019，Life)脂质体(Lipofectamine 2000:质粒＝1:1(体积比)，充分混匀，静置15-20分钟。将这400μl的混合液逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀后置于含5％CO₂的37℃孵箱中孵育。

5)病毒收集：6-10小时后吸去培养基，加入2.5ml 37℃预热的完全培养基，继续将细胞放置孵箱孵育，40小时左右收集上清到1.5ml离心管中，3000rpm离心20分钟,将上清液用0.45μm滤头过滤。分装后置于-80℃冰箱中储存待用。

6)病毒滴度测定(稀释计数法)：

滴度单位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。“TU”为”transducing units”的缩写，中文为“转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。

第一天细胞准备：将生长状态良好的HEK293T细胞消化计数后稀释至1×10⁵/ml，加入96孔板，100μl/孔，包括目标质粒和包装质粒在内的每种病毒准备10个孔。放入37℃，5％CO₂培养箱中培养。

第二天加病毒：在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。稀释方法如下：每种病毒准备10个1.5ml EP管，每管加入90μl培养液，往第一个管中加入10μl病毒原液，混匀后，吸取10μl加入第二个管混匀。依此类推，做十个稀释度(10～10^-8)。吸取96孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。并做好标记。

第三天追加培养液：在每个孔再加入100μl完全培养液，利于细胞的生长。

第五天观察结果并计算滴度：在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为X和Y，则滴度(TU/ml)＝(X+Y×10)×1000/2/X孔的病毒液的含量(μl)。

7)病毒感染及稳定细胞筛选：将一定量的病毒浓缩液(含有6μg/ml Polybrene)感染处于对数生长期的HEK293T。

细胞中，48小时后加入15μg/ml嘌呤霉素(P8230，Solarbio)，约每2天更换一次新鲜筛选培养基(10％FBS，1％双抗及15ug/ml嘌呤霉素的DMEM培养基)，培养10天左右，利用单细胞克隆分选阳性稳定高表达MBP蛋白的转染细胞，并利用定量PCR和western blot技术测定筛选的细胞与未转染HEK293T细胞中MBP转录本的相对表达量及蛋白水平的表达。结果显示在稳定转染细胞中MBP转录本比未转染的HEK293T细胞中MBP转录本显著增加(见图2)。

实施例2：抗人体髓鞘碱性蛋白抗体的试剂盒用于样品的检测检测

实施例1中制备得到的试剂盒用于抗人体髓鞘碱性蛋白抗体检测的方法如下

1)接种细胞：将转有MBP基因的稳定HEK293T细胞和转染空载体的细胞按照7:3的比例混合，传代于含有盖玻片的6孔板中，盖玻片预先用细胞贴壁试剂(1027，北京细工生物)处理1小时。待细胞融合度达到80％时，用于后续检测用。

2)细胞免疫荧光：用金刚石刻字笔切割盖玻片至边长为5mm小正方形，细胞面朝上，无影胶粘贴于载玻片上，紫外线照射30秒粘牢。PBST缓冲液洗涤细胞，每反应区50μl，洗涤5分钟。用3％牛血清蛋白(BSA)50μl/反应区封闭30分钟，弃去。加入经PBST缓冲液稀释后的患者血清(1:10，总体积50μl)在室温条件下孵育1小时。PBST缓冲液洗涤3次，每次5分钟。加入HRP标记山羊抗人IgG(HRP-conjugated affinipure goat anti-human IgG,

109-035-003,Jackson)(1:700，PBST缓冲液稀释，总体积50μl)室温条件下孵育30分钟。PBST缓冲液洗涤3次，每次5分钟。加入Alexa fluor 555偶联链霉亲和素(Alexafluor 555-conjugated streptavidin,S21381,ThermoFisher)

(1:700，PBST缓冲液稀释，总体积50μl)。PBST缓冲液洗涤3次，每次5分钟。封片剂封片。

3)荧光显微镜(EVOS Auto2,Invitrogen)分析：以转染空载体的细胞对照，在20倍物镜视野下依据激发荧光(激发波长555nm)的信号强弱来标示抗体浓度的相对量。

4)统计分析：使用GraphPad Prism 6软件对数据进行绘图及统计分析得出结果，受试者工作曲线ROC曲线用于灵敏度与特异性的相关性分析。

结果显示，依据荧光强度进行半定量计算，本发明方法可以区分MBP强阳性病人(80％阳性细胞)、弱阳性病人(可见阳性细胞)及阴性病人(未见阳性细胞)中MBP抗体的相对量(见图3)。

实施例3：抗人体髓鞘碱性蛋白抗体的试剂盒的敏感性、特异性检测

MBP是多发性硬化鉴别诊断的重要自身抗体。MBP抗体与多发性硬化的临床类型和病程有关，在首次发作阳性率仅为28％，随病情进展阳性率增高可达60％；而且MBP抗体主要存在于血清AQP4抗体阴性的患者中，因此阳性率低。为进一步促进本发明方法的临床应用，我们多中心选取了120例神经系统疾病患者的血清，分别送到欧盟第三方公司检测，同时用我们的检测方法盲法检测。通过与欧盟检测方法比较，分析本发明方法的MBP阳性抗体检出率。

选取150例神经系统疾病患者血清(含脱髓鞘病人120例)，用欧蒙检测方法(欧蒙第三方实验室)的检出率和本发明方法的检出率进行对比。结果显示，在120例脱髓鞘患者中，欧蒙(Euroimmun)测出MBP抗体阳性血清16例，本检测方法检出24例阳性血清(见图4)且检出的MBP阳性血清的患者为中枢脱髓鞘疾病，与临床症状相符合。其余30例非脱髓鞘患者，欧蒙检测结果与本方法检测均为阴性。

对本发明方法与欧蒙检测的结果进行分析，确定测定值的上下限、组距以及截断点(cut-off point)，按选择的组距间隔列出累积频数分布表，分别计算出所有截断点的敏感性、特异性和假阳性率(1-特异性)。以敏感性为纵坐标代表真阳性率，(1-特异性)为横坐标代表假阳性率，作图绘成受试者工作特征曲线(ROC)曲线。ROC曲线下的面积(AUC)值越接近于1，说明诊断效果越好。结果可见本发明方法(CBA-TSA)较欧蒙法具有更高的敏感性、更高的诊断准确性，二者特异性均为100％。

本说明书公开的所有技术特征都可以任何组合方式进行组合。本说明所公开的每个特征也可以被其它具有相同、相等或相似作用的特征所替换。因此，除非特殊说明，所公开的每一特征仅仅是一系列相等或相似特征的实例。

此外，从上述描述中，本领域技术人员可从本发明中很容易清楚本发明的关键特征，在不脱离本发明的精神及范围的情况下，可对发明进行很多修改以适应各种不同的使用目的及条件，因此这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。

序列表

<110> 天津天海新域生物科技有限公司

<120> 一种用于检测抗人体髓鞘碱性蛋白抗体的试剂盒及其应用

<130> 6961-181523I

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tttctagaaa tgtacaagga attcgccacc atggcgtcac agaaga 46

<210> 2

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tctagggatc cgggcccggg ttcgaactcg agtcagcgtc tagccatggg t 51

<210> 3

<211> 9496

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60

cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 120

tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180

ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240

agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300

agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360

ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420

cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480

gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540

tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600

agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 660

cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 720

caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780

aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg 840

aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 900

caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct 960

gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat 1020

cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 1080

ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 1140

aagcggccgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag 1200

tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc 1260

aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg 1320

gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc 1380

cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc 1440

gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct 1500

ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa 1560

actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca 1620

gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt acacaagctt 1680

aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt 1740

ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta 1800

tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 1860

actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct 1920

cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga 1980

cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccttt aaaagaaaag 2040

gggggattgg ggggtacagt gcaggggaaa gaatagtaga cataatagca acagacatac 2100

aaactaaaga attacaaaaa caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg 2160

acagcagaga tccagtttat cgataagctt gggagttccg cgttacataa cttacggtaa 2220

atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 2280

ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 2340

aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 2400

tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 2460

ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 2520

agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 2580

ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta 2640

acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa 2700

gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc 2760

tccatagaag acaccgactc tactagagga tcgctagcgc taccggactc agatctcgaa 2820

tttctagaaa tgtacaagga attcgccacc atggcgtcac agaagagacc ctcccagagg 2880

cacggatcca agtacctggc cacagcaagt accatggacc atgccaggca tggcttcctc 2940

ccaaggcaca gagacacggg catccttgac tccatcgggc gcttctttgg cggtgacagg 3000

ggtgcgccca agcggggctc tggcaaggta ccctggctaa agccgggccg gagccctctg 3060

ccctctcatg cccgcagcca gcctgggctg tgcaacatgt acaaggactc acaccacccg 3120

gcaagaactg ctcactacgg ctccctgccc cagaagtcac acggccggac ccaagatgaa 3180

aaccccgtag tccacttctt caagaacatt gtgacgcctc gcacaccacc cccgtcgcag 3240

ggaaagggga gaggactgtc cctgagcaga tttagctggg gggccgaagg ccagagacca 3300

ggatttggct acggaggcag agcgtccgac tataaatcgg ctcacaaggg attcaaggga 3360

gtcgatgccc agggcacgct ttccaaaatt tttaagctgg gaggaagaga tagtcgctct 3420

ggatcaccca tggctagacg ctgactcgag ttcgaacccg ggcccggatc cctagataat 3480

tctaccgggt aggggaggcg cttttcccaa ggcagtctgg agcatgcgct ttagcagccc 3540

cgctgggcac ttggcgctac acaagtggcc tctggcctcg cacacattcc acatccaccg 3600

gtaggcgcca accggctccg ttctttggtg gccccttcgc gccaccttct actcctcccc 3660

tagtcaggaa gttccccccc gccccgcagc tcgcgtcgtg caggacgtga caaatggaag 3720

tagcacgtct cactagtctc gtgcagatgg acagcaccgc tgagcaatgg aagcgggtag 3780

gcctttgggg cagcggccaa tagcagcttt gctccttcgc tttctgggct cagaggctgg 3840

gaaggggtgg gtccgggggc gggctcaggg gcgggctcag gggcggggcg ggcgcccgaa 3900

ggtcctccgg aggcccggca ttctgcacgc ttcgaagcgc acgtctgccg cgctgttctc 3960

ctcttcctca tctccgggcc tttcgacctg cagcccaagc ttaccgccac catggtgagc 4020

aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta 4080

aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg 4140

accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc 4200

accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac 4260

ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac 4320

gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc 4380

atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag 4440

tacaactaca acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag 4500

gtgaacttca agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac 4560

cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc 4620

acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag 4680

ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagga atttggcagc 4740

ggccagtgca ccaactatgc cctgctgaaa ctggctggcg atgtggaaag caaccccgga 4800

cccatgaccg agtacaagcc cacggtgcgc ctcgccaccc gcgacgacgt ccccagggcc 4860

gtacgcaccc tcgccgccgc gttcgccgac taccccgcca cgcgccacac cgtcgatccg 4920

gaccgccaca tcgagcgggt caccgagctg caagaactct tcctcacgcg cgtcgggctc 4980

gacatcggca aggtgtgggt cgcggacgac ggcgccgcgg tggcggtctg gaccacgccg 5040

gagagcgtcg aagcgggggc ggtgttcgcc gagatcggcc cgcgcatggc cgagttgagc 5100

ggttcccggc tggccgcgca gcaacagatg gaaggcctcc tggcgccgca ccggcccaag 5160

gagcccgcgt ggttcctggc caccgtcggc gtctcgcccg accaccaggg caagggtctg 5220

ggcagcgccg tcgtgctccc cggagtggag gcggccgagc gcgccggggt gcccgccttc 5280

ctggagacct ccgcgccccg caacctcccc ttctacgagc ggctcggctt caccgtcacc 5340

gccgacgtcg aggtgcccga aggaccgcgc acctggtgca tgacccgcaa gcccggtgcc 5400

tgaccgcgtc tggaacaatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat 5460

tcttaactat gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca 5520

tgctattgct tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc 5580

tctttatgag gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc 5640

tgacgcaacc cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt 5700

cgctttcccc ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg 5760

gacaggggct cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga agctgacgtc 5820

ctttccatgg ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta 5880

cgtcccttcg gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg 5940

gcctcttccg cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc 6000

cccgcctgga attaattctg cagtcgagac ctagaaaaac atggagcaat cacaagtagc 6060

aatacagcag ctaccaatgc tgattgtgcc tggctagaag cacaagagga ggaggaggtg 6120

ggttttccag tcacacctca ggtaccttta agaccaatga cttacaaggc agctgtagat 6180

cttagccact ttttaaaaga aaagagggga ctggaagggc taattcactc ccaacgaaga 6240

caagatatcc ttgatctgtg gatctaccac acacaaggct acttccctga ttagcagaac 6300

tacacaccag ggccaggggt cagatatcca ctgacctttg gatggtgcta caagctagta 6360

ccagttgagc cagataaggt agaagaggcc aataaaggag agaacaccag cttgttacac 6420

cctgtgagcc tgcatgggat ggatgacccg gagagagaag tgttagagtg gaggtttgac 6480

agccgcctag catttcatca cgtggcccga gagctgcatc cggagtactt caagaactgc 6540

tgatatcgag cttgctacaa gggactttcc gctggggact ttccagggag gcgtggcctg 6600

ggcgggactg gggagtggcg agccctcaga tcctgcatat aagcagctgc tttttgcctg 6660

tactgggtct ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa 6720

cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct 6780

gttgtgtgac tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc 6840

tagcagtagt agttcatgtc atcttattat tcagtattta taacttgcaa agaaatgaat 6900

atcagagagt gagaggcctt gacattgcta gcgttttacc gtcgacctct agctagagct 6960

tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac 7020

acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac 7080

tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc 7140

tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg 7200

cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 7260

actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt 7320

gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 7380

ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 7440

acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 7500

ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 7560

cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc 7620

tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 7680

gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca 7740

ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact 7800

acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg 7860

gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt 7920

ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 7980

tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 8040

gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 8100

tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac 8160

ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga 8220

taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc 8280

cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca 8340

gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta 8400

gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg 8460

tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc 8520

gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg 8580

ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt 8640

ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt 8700

cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata 8760

ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc 8820

gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac 8880

ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa 8940

ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct 9000

tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat 9060

ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc 9120

cacctgacgt cgacggatcg ggagatcaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa 9180

taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt 9240

ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctgga tcaactggat aactcaagct 9300

aaccaaaatc atcccaaact tcccacccca taccctatta ccactgccaa ttacctgtgg 9360

tttcatttac tctaaacctg tgattcctct gaattatttt cattttaaag aaattgtatt 9420

tgttaaatat gtactacaaa cttagtagtt tttaaagaaa ttgtatttgt taaatatgta 9480

ctacaaactt agtagt 9496

<210> 4

<211> 591

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 4

atggcgtcac agaagagacc ctcccagagg cacggatcca agtacctggc cacagcaagt 60

accatggacc atgccaggca tggcttcctc ccaaggcaca gagacacggg catccttgac 120

tccatcgggc gcttctttgg cggtgacagg ggtgcgccca agcggggctc tggcaaggta 180

ccctggctaa agccgggccg gagccctctg ccctctcatg cccgcagcca gcctgggctg 240

tgcaacatgt acaaggactc acaccacccg gcaagaactg ctcactacgg ctccctgccc 300

cagaagtcac acggccggac ccaagatgaa aaccccgtag tccacttctt caagaacatt 360

gtgacgcctc gcacaccacc cccgtcgcag ggaaagggga gaggactgtc cctgagcaga 420

tttagctggg gggccgaagg ccagagacca ggatttggct acggaggcag agcgtccgac 480

tataaatcgg ctcacaaggg attcaaggga gtcgatgccc agggcacgct ttccaaaatt 540

tttaagctgg gaggaagaga tagtcgctct ggatcaccca tggctagacg c 591

Claims (9)

1.一种用于检测抗人体髓鞘碱性蛋白抗体的试剂盒，其特征在于，包括表达髓鞘碱性蛋白基因的细胞、第二抗体和标记物；其中，

所述第二抗体为抗人抗体，所述标记物与第二抗体间接连接；所述第二抗体与生物素或链霉亲和素相连，所述标记物与链霉亲和素或生物素相连，所述标记物为Alexa fluor555；并且，

当所述标记物与所述第二抗体接触时，所述标记物产生荧光；

所述表达髓鞘碱性蛋白基因的细胞表达髓鞘碱性蛋白基因，所述髓鞘碱性蛋白基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO：4所示的序列；

所述表达髓鞘碱性蛋白基因的细胞为转有携带髓鞘碱性蛋白基因表达载体pLV-EGFP(2A)Puro-MBP-V1的细胞；其中，所述基因表达载体的核苷酸序列为如SEQ ID NO：3所示的序列。

2.根据权利要求1所述用于检测抗人体髓鞘碱性蛋白抗体的试剂盒，其特征在于，所述表达髓鞘碱性蛋白基因的细胞的制备方法包括以下步骤：

髓鞘碱性蛋白基因载体构建质粒；

准备细胞用于转染；

质粒转染细胞；

病毒培养、收集及病毒滴度测定；

病毒感染及细胞筛选。

3.根据权利要求2所述用于检测抗人体髓鞘碱性蛋白抗体的试剂盒，其特征在于，在所述髓鞘碱性蛋白基因载体构建质粒的步骤中，使用PCR法获取所述髓鞘碱性蛋白基因，在所述PCR法中使用的引物对的序列为如SEQ ID NO：1所示的序列和如SEQ ID NO：2所示的序列。

4.根据权利要求3所述用于检测抗人体髓鞘碱性蛋白抗体的试剂盒，其特征在于，所述质粒转染细胞的步骤进一步包括加入混合质粒的步骤；所述混合质粒为质量比为目标质粒：VSVG质粒：REV质粒＝5：3：2的混合质粒。

5.根据权利要求3所述用于检测抗人体髓鞘碱性蛋白抗体的试剂盒，其特征在于，所述病毒感染及细胞筛选的步骤包括：通过药物和/或单细胞克隆分选，筛选，获得表达髓鞘碱性蛋白基因的稳定细胞。

6.根据权利要求5所述用于检测抗人体髓鞘碱性蛋白抗体的试剂盒，其特征在于，所述药物包括G418、潮霉素B或嘌呤霉素中的一种或两种以上的组合。

7.根据权利要求5所述用于检测抗人体髓鞘碱性蛋白抗体的试剂盒，其特征在于，所述药物为嘌呤霉素。

8.一种根据权利要求1-7任一项所述的试剂盒在制备用于诊断多发性硬化的试剂盒中的应用。

9.一种根据权利要求1-7任一项所述试剂盒在制备通过以下方法诊断多发性硬化的试剂中的用途，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

接种所述表达髓鞘碱性蛋白基因的细胞；

加入待测样品，使得待测样品和所述表达髓鞘碱性蛋白基因的细胞接触第二抗体；

加入标记物；

通过检测所述细胞和所述待测样品产生的荧光强度，和对荧光强度强弱进行分析，诊断是否发生多发性硬化。

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