CN109957551A - 表达人β-防御素2的重组痘苗病毒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达人β‑防御素2(hBD2)的重组痘苗病毒(VV‑HBD2‑lacZ)和相关痘苗载体表达质粒及其应用。所述重组痘苗病毒的TK基因区包含hBD2表达盒，即由人工合成的痘苗病毒早/晚期启动子驱动人工合成的、痘苗病毒密码子优化的hBD2基因表达。在小鼠肿瘤模型中，该VV‑HBD2‑lacZ病毒可通过增强机体抗肿瘤免疫反应和激发凋亡反应而抑制肿瘤生长。

Description

表达人β-防御素2的重组痘苗病毒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种表达人β-防御素2(hBD2)的重组痘苗病毒(VV-HBD2-lacZ)及其应用。

背景技术

痘苗病毒(vaccinia virus)是迄今发现的最大、最复杂的病毒之一，它是预防天花的活疫苗病毒。天花在全球根除后，痘苗病毒作为基因工程表达载体得到深入研究和广泛应用。基于该病毒以下特点，使得它在肿瘤基因治疗领域得到越来越广泛的应用：①安全：痘苗病毒是唯一能在胞浆内复制的DNA病毒，它不会整合进宿主细胞基因组，无致癌性等安全问题；②表达效率高：痘苗病毒可培养到很高滴度(＞10⁹pfu/ml)，通常感染1-3小时，无需任何药物抗性筛选，可使90％以上的受感染细胞表达目的基因产物；③感染细胞范围广泛：可感染几乎所有类型的哺乳动物细胞；④对分裂和非分裂细胞均能感染/转导；⑤基因组容量大：至少可插入25kb的外源基因而不影响其遗传稳定性；⑥对热稳定：方便现场使用和运输；⑦成本低廉；⑧表达产物近乎天然构型：它表达的产物能经历正确的糖基化，翻译后加工，接近天然构型，而这些对于疫苗载体激发免疫反应是至关重要的；⑨产生有效免疫应答：重组痘苗病毒产生活病毒自然感染过程，使所表达的外源抗原连同病毒自身蛋白一起，为宿主MHC共提呈，不但能产生体液免疫，还能激发细胞免疫，且免疫应答强效、持久，一般不需复种。更重要的是，痘苗病毒感染能给宿主提供“危险信号”，激发机体有效产生针对载体本身及其所表达抗原的T细胞免疫反应，甚至还能激发机体对原本天然抗原性很弱的免疫原(如CEA)也产生强烈的免疫反应。

然而，未经改造的野型痘苗病毒的抗肿瘤效能有限，这主要是因为病毒与宿主机体之间在相互作用和适应过程中，经过长年进化，一方面机体产生抗病毒免疫清除机制，另一方面，病毒也进化出抑制机体免疫的抗清除免疫逃逸机制，凡此种种，均可影响到痘苗病毒的抗肿瘤效能。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提出了一种表达人β-防御素2的重组痘苗病毒及其应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种表达人β-防御素2的重组痘苗病毒，人β-防御素2基因被插入痘苗病毒TK基因区，由人工合成的痘苗病毒早/晚期启动子驱动其表达。

进一步地，所述人β-防御素2基因基于痘苗病毒偏爱的优化密码子人工合成，其核酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步地，所述表达人β-防御素2的重组痘苗病毒的母体病毒是痘苗病毒WR株。

进一步地，所述表达人β-防御素2的重组痘苗病毒是基于重组痘苗载体质粒pCBlacZ-hBD2，通过同源重组机制构建的。重组痘苗载体质粒pCBlacZ-hBD2的核酸全序列如SEQ ID No.2所示。

进一步地，所述重组痘苗载体质粒pCBlacZ-hBD2的结构包含痘苗病毒密码子优化的hBD2基因及其上游的人工合成的痘苗病毒早/晚期启动子P-se/l，以及与目的基因表达盒串联的可选择标志基因。

进一步地，所述可选择标志基因为β-半乳糖苷酶基因与G-418药物抗性基因融合而成。可选择标志基因由痘苗病毒P7.5早/晚期启动子驱动表达。可选择标志基因的核酸序列如SEQ ID No.3所示。

进一步地，在所述可选择标志基因lacZ的前、后两末端分别设置有翻转重组酶(flippase)识别序列FRT和FRT5。FRT的核酸序列如SEQ ID No.4所示，FRT5的核酸序列如SEQ ID No.5所示。

进一步地，所述人β-防御素2基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；可选择标志基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。

一种上述任一重组痘苗病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步地，所述肿瘤为肺癌、黑色素瘤和乳腺癌。

本发明的有益效果是：本发明首先人工合成痘苗病毒密码子优化的hBD2基因，构建重组痘苗病毒载体质粒pCBlacZ-hBD2，采用该质粒转染野型痘苗病毒WR株感染的A549细胞，通过细胞内同源重组机制产生重组痘苗病毒，再通过与目的基因表达盒串联的可选择标志基因lacZ的表达，基于其表达产物产生的双表型，即β-半乳糖苷酶作用于底物X-gal(5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-α-D-galactopyranoside，5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷)产生蓝斑表型，和表达药物抗性蛋白产生G418抗性表型，可方便地筛选出重组痘苗病毒。本发明产生的重组痘苗病毒VV-HBD2-lacZ感染细胞后，可有效表达产生人β-防御素2蛋白。上述重组痘苗病毒VV-HBD2-lacZ在小鼠肿瘤模型中具有抗肿瘤效应。小鼠肿瘤模型研究证明，本发明的重组痘苗病毒VV-HBD2-lacZ注射荷瘤小鼠后能够活化和招募树突状(DC)细胞，增加CD4⁺和CD8⁺T细胞向肿瘤内浸润，从而诱导强效抗肿瘤免疫反应并激发肿瘤细胞凋亡反应，从而抑制肿瘤生长。

附图说明

图1是重组痘苗病毒载体质粒pCBlacZ-hBD2图谱；

图2是重组痘苗病毒VV-HBD2-lacZ及VV-lacZ核心成分模式图，图中，hBD2为痘苗病毒密码子优化的人β-防御素2基因，P-se/l为合成的痘苗病毒早/晚期启动子，lacZ为β-半乳糖苷酶基因，G418为抗生素药物G418抗性基因，P7.5为痘苗病毒P7.5早/晚期启动子，FRT和FRT5均为翻转重组酶识别序列；

图3是重组痘苗病毒感染细胞裂解液表达人β-防御素2(hBD2)的ELISA检测示意图；

图4是重组痘苗病毒感染细胞裂解液上清对小鼠免疫细胞树突状(DC)细胞的趋化实验图(Transwell检测)；图中，(a)为表达人β-防御素2的重组痘苗病毒(VV-HBD2-lacZ)处理后的结果；(b)为仅表达标志基因lacZ的重组痘苗病毒(VV-lacZ)处理后的结果；(c)为空白对照；(d)为VV-HBD2-lacZ病毒与VV-lacZ处理后的趋化指数％比较；

图5是重组痘苗病毒对人肺癌A549细胞的体外杀伤实验结果柱状图，图中，MOI为感染复数；

图6是重组痘苗病毒对小鼠黑色素瘤B16F10细胞的体外杀伤实验结果柱状图；

图7是重组痘苗病毒对小鼠乳腺癌4T1细胞的体外杀伤实验结果柱状图；

图8是重组痘苗病毒对NIH3T3小鼠胚胎成纤维细胞的体外杀伤实验结果柱状图；

图9是重组痘苗病毒感染人肺癌A549细胞后的凋亡检测结果柱状图；

图10是重组痘苗病毒治疗荷瘤(B16F10)小鼠与对照处理后肿瘤体积动态变化比较图；

图11是重组痘苗病毒治疗荷瘤(B16F10)小鼠与对照处理后切除肿瘤块重量(克)比较图；

图12是重组痘苗病毒治疗与对照处理后荷瘤(B16F10)小鼠存活率比较图；

图13是重组痘苗病毒免疫小鼠与对照处理后再接种B16F10肿瘤细胞(肿瘤细胞“攻击”试验)检测肿瘤体积动态变化比较图；

图14是重组痘苗病毒免疫荷瘤(B16F10)小鼠后肿瘤组织内T细胞的流式细胞术检测图；

图15是重组痘苗病毒免疫荷瘤(B16F10)小鼠后肿瘤组织内细胞毒T细胞活性的流式细胞术检测图；

图16是重组痘苗病毒免疫荷瘤(B16F10)小鼠后的细胞毒T细胞活性抗体阻断实验柱状图。

具体实施方式

本发明重组痘苗病毒VV-HBD2-lacZ，其构成是以痘苗病毒WR株为母体，在该病毒的TK基因区插入hBD2基因，该hBD2基因系基于痘苗病毒偏爱的优化密码子人工合成，在该基因上游安置有驱动外源基因表达的人工合成的痘苗病毒早/晚期启动子P-se/l，与hBD2表达盒串联的有用于重组痘苗病毒筛选的可选择标志基因lacZ，该基因为β-半乳糖苷酶基因(lacZ)与G-418药物抗性基因(G)融合而成，该标志基因的表达产物作用于底物具有蓝斑显色与G-418药物抗性双重表型，以方便重组痘苗病毒筛选。lacZ融合基因由痘苗病毒P7.5早/晚期启动子驱动表达。

本发明重组痘苗病毒载体质粒pCBlacZ-hBD2，其结构包含痘苗病毒密码子优化的hBD2基因及其上游的人工合成的痘苗病毒早/晚期启动子P-se/l，以及与目的基因表达盒串联的、用于重组病毒筛选的可选择标志基因lacZ，在lacZ融合基因的前、后两末端分别设置有翻转重组酶识别序列FRT和FRT5，用于通过重组工程而以其它外源基因替换lacZ标志基因。上述结构如图1和2所示。

本发明采用经典的同源重组方法构建重组痘苗病毒。首先，基于痘苗病毒偏爱的优化密码子人工合成人β-防御素2基因，克隆进痘苗表达载体质粒pCBlacZ，构建重组痘苗载体质粒pCBlacZ-hBD2，再以质粒pCBlacZ-hBD2转染已经被野型痘苗病毒WR株感染的人肺癌A549细胞，通过标志基因lacZ表达作用于底物X-gal蓝斑显色和G418抗性双表型噬斑纯化筛选重组病毒。

实施例1：人β-防御素2基因(hBD2)的痘苗密码子优化人工合成和载体质粒构建(1)PCR引物

根据人β-防御素2基因的GenBank登录号NM_004942，获得其氨基酸序列为MRVLYLLFSFLFIFLMPLPGVFGGIGDPVTCLKSGAICHPVFCPRRYKQIGTCGLPGTKCCKKP(SEQ ID No.6)

根据上述氨基酸序列并采用痘苗病毒优化的密码子，合成如下PCR引物。

BDF1(SEQ ID No.8)：ATGAGAGTATTATATTTATTATTTTCTTTcTTATTTATTTTCTTAATGCCATTACCAGG

BD1R(SEQ ID No.9)：TTTAAACAAGTTACTGGATCTCCAATTCCTCCAAATACTCCTGGTAATGGCATTAAG

BDF2(SEQ ID No.10)：ATCTGGAGCTATTTGTCATCCAGTATTTTGTCCAAGAAGATATAAACAAATTGGAACTT

BDF2R(SEQ ID No.11)：ATTATGGTTTTTTACAACATTTAGTTCCTGGTAATCCACAAGTTCCAATTTGTTTATAT

首先应用T4多聚核苷酸激酶(T4PNK)将引物BDF1R和BDF2进行磷酸化。具体操作为：50ul反应体系中加入5μl 10×T4连接酶缓冲液，30μl浓度为100μM的引物，1μl T4PNK酶，14μl H₂O，37℃温浴30min，待反应完毕65℃热失活20min。

(2)一般PCR反应体系如下：

10×缓冲液(含有Mg<sup>2+</sup>)：	5μL
		dNTP(2.5M)	4μL
Pfu聚合酶	1μL
		上游引物(10μM)	2.5μL
下游引物(10μM)	2.5μL
		模板	0.2μL
ddH<sub>2</sub>O	补充至50μL

(3)PCR反应与克隆

94℃预变性2min；94℃变性50s，55℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃延伸10min。取PCR产物跑1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析仪观察记录结果，目的条带切胶回收。使用胶回收试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)回收目的基因片段。分别用引物BDF1与BD1R，引物BDF2与BDF2R互补延伸，获得两个短片段，然后用T4连接酶连接作为模板，最后用外侧引物BDF1与BDF2R和pfu酶作PCR，扩增出约0.2kb片段，插入痘苗载体质粒pCBlacZG，挑选插入方向正确的克隆，测序验证正确，即获得重组痘苗载体质粒pCBlacZ-hBD2，质粒图谱见图1。

实施例2：重组痘苗病毒VV-HBD2-lacZ的构建与筛选

在6孔板接种A549细胞，使其次日长至80％成片。每孔加入100μl野型痘苗病毒WR株(按0.05-0.1pfu病毒/细胞接种，用含2％FCS培养基稀释)，37℃、5％CO₂培养箱中孵育2h，期间每15min摇动1次以分散病毒和防止细胞面局部干燥。然后采用Lipofectamine2000脂质体转染pCBlacZG-hBD2重组质粒，取4μg pCBlacZG-hBD2质粒稀释于250μl无血清的1640培养基中，作为A液，取10μL脂质体稀释于250μl无血清的1640培养基中，作为B液，将A液和B液混匀后，室温下孵育20min，再加入300μl无血清1640，混匀，混合液加入经HanKs液洗过2遍的细胞中，37℃、5％CO₂培养箱中培养4h后，每孔加入2ml含2％FCS的1640培养基，37℃、5％CO₂培养箱中继续培养，48h后收集感染痘苗病毒的细胞，于－80℃和37℃反复冻融3次，即为含重组病毒的感染细胞裂解液，保存于－80℃，备用。

随后，首先盲筛重组病毒2次。在6孔板中接种A549细胞，待次日细胞生长至80％-90％时弃去培养基，用Hank’s液洗两遍，加入500μl上述步骤中产生的病毒裂解液，37℃、5％CO₂培养箱中培养2h弃上清，用Hank’s液洗两遍，加入G418至终浓度400μg/ml于含2％FCS的1640培养基。于显微镜下观察A549细胞病变表达情况，待细胞完全病变后，收集病毒液。重复上述步骤一次。

随后，进行重组病毒噬斑纯化筛选。在6孔板中接种A549细胞，待次日细胞生长至80-90％时弃去培养基，用Hank’s液洗两遍，加入经10倍系列稀释的病毒液200μl，37℃、5％CO₂培养箱中培养2h，期间每隔15min晃动数秒，以分散病毒团块，然后弃上清，用Hank’s液洗两遍，加入含400μg/ml G418的2％FCS的1640培养基。于显微镜下观察A549细胞噬斑表达情况，待有典型蚀斑形成后用琼脂固定。预设45℃水浴备用，将浓度为2％的低熔点琼脂糖置微波炉融化后，与等体积1640培养液混匀，加入1:100稀释的2％X-gal，置45℃水浴待用。将上述配制好的琼脂糖每孔2ml小心加入各孔，室温或4℃凝固后，挑取蓝色单个噬斑于500μl 2％FCS的1640培养基中，于-80℃和37℃反复冻融3次。此后，每个蚀斑感染一个孔，其余步骤同上，重复以上步骤，直至得到纯化的重组痘苗病毒，命名为VV-HBD2-lacZ。另外，作为对照，用类似方法构建不含HBD2基因而仅含标志基因的重组痘苗病毒VV-lacZ，上述重组病毒的核心成分模式图见图2。

实施例3：重组痘苗病毒VV-HBD2-lacZ的体外验证

(1)ELISA检测重组病毒液中hBD2表达

按照欣博盛公司hBD2ELISA试剂盒说明操作，将稀释好的酶结合物和TMB显色液预先在37℃中平衡至少30分钟。将1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.3pg/ml，15.6pg/ml，7.8pg/ml的标准品各100μl依次加入一排8孔中，一孔加100μl样品稀释液作为零孔，做复孔。一孔加入100μl样品，做复孔。酶标板封膜，37℃反应90分钟。反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体，将准备好的生物素化抗人hBD2抗体工作液按每孔100μl依次加入(TMB空白显色孔除外)。酶标板封膜，37℃反应60分钟。反应后1×洗涤液洗涤5次。每孔加入100μl酶结合物工作液(TMB空白显色孔除外)。酶标板封膜，37℃反应30分钟。反应后1×洗涤液洗涤5次，按每孔加入100μl已在37℃平衡30分钟的TMB显色液，37℃避光反应30分钟。按每孔100ul依次加入TMB终止液，用酶标仪在450nm测定OD值。结果如图3所示，与对照组相比，重组痘苗病毒VV-HBD2-lacZ表达高水平的目的蛋白hBD2。

(2)抑菌试验检测痘苗载体表达的HBD2蛋白生物学活性

制备普通琼脂培养基，经120℃30min高压灭菌后，在超净工作台内，制备普通琼脂平板，待平板凝固，将液体培养基培养的不同菌株均匀涂布于平板表面，利用无菌的直径5mm的打孔器在平板上均匀打孔，将同滴度的VV-HBD2-lacZ病毒和VV-lacZ病毒(阴性对照)感染细胞裂解液通过0.45μl滤器过滤后阻拦病毒颗粒，获得不含病毒颗粒的病毒表达产物上清液以及100mg/ml氨苄青霉素(阳性对照)、灭菌生理盐水(阴性对照)各取10μl加入不同的孔中，放置37℃培养箱中培养过夜，测定各孔的抑菌环直径。结果如表1所示，重组痘苗病毒VV-HBD2-lacZ感染细胞裂解液上清中表达的hBD2蛋白分别对大肠杆菌DH5α菌株和BL21菌株、减毒沙门菌ZJ111菌株及金黄色葡萄球菌均有明显的抑菌作用，且抑菌效能呈现hBD2浓度依赖关系。以上实验证明，重组痘苗病毒VV-HBD2-lacZ表达的产物hBD2不但具有正确的免疫学结构，而且具有抑制细菌生长的特质性生物学活性。

表1：重组痘苗病毒VV-HBD2-lacZ表达β-防御素2(hBD2)的抑菌活性

数据表为平均值±标准差,n＝3次独立实验.每次实验在同等条件下重复3个平板。

Amp：氨苄青霉素；PBS：磷酸缓冲液；ZJ111：减毒沙门菌

(3)CCK-8检测VV-HBD2-lacZ对肿瘤细胞的杀伤作用

制备约5×10⁴/ml的A549细胞悬液，在96孔板各孔中分别接种100μl肿瘤细胞A549细胞(人肺癌细胞)、B16细胞(小鼠黑色素瘤细胞)、4T1细胞(小鼠乳腺癌细胞)及非肿瘤细胞NIH3T3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)，放入37℃培养箱培养。待细胞占满后，每孔分别加入10μl同滴度(MOI＝0.01～10)的VV-HBD2-lacZ病毒和vv-lacZ病毒，将96孔板分别在培养箱中培养48小时后，向每孔加入10μlCCK-8溶液，在培养箱中继续培养1小时。用酶标仪在450nm测定OD值。另外，如上处理24小时后采用Annexin V/PI染色流式细胞术检测重组痘苗病毒感染后的细胞凋亡。结果如图5-8所示，重组痘苗病毒VV-HBD2-lacZ可明显抑制各肿瘤细胞的生长，其中对B16F10细胞的抑制最为显著，可使其存活率降低至12.8％±3.74％，反之，VV-HBD2-lacZ对非肿瘤的NIH3T3细胞则无明显抑制作用。

(4)流式细胞术检测细胞凋亡

A549细胞铺板，分别用病毒VV-HBD2-lacZ-lacZ或VV-lacZ感染24h后，消化细胞，调整细胞浓度为10⁶/ml，离心弃上清，加入500μl Binding Buffer重悬细胞，加入10μlAnnexin V-FITC和5μl PI，混匀，室温下避光孵育15min，流式细胞仪上机检测。如图9所示，Annexin V/PI实验显示VV-HBD2-lacZ处理的肿瘤细胞出现明显的凋亡指征，其染色强度约为对照VV-lacZ病毒的两倍。

(5)Transwell试验检测hBD2蛋白对免疫系统DC细胞的趋化作用

将所有细胞培养液与Transwell小室于37℃预热。培养小鼠DC细胞至对数生长期，消化细胞，并调整细胞悬液浓度至2×10⁵/ml。分别在下室加入600μl同滴度的VV-HBD2-lacZ病毒感染细胞裂解液上清或作为对照的vv-lacZ病毒感染细胞裂解液上清，上室加入200μl细胞悬液，37℃培养箱培养24h。取出Transwell小室，弃去孔中液体，用PBS洗3次，甲醛固定30分钟，适当风干。0.1％结晶紫染色20min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，显微镜下随机观察5个视野，计数取平均值。结果如图所示，VV-HBD2-lacZ处理的试验组的趋化指数(试验组细胞计数/对照组细胞计数×100％)明显高于vv-lacZ处理的对照组，前者是后者的8倍。

实施例4：重组痘苗病毒VV-HBD2-lacZ的小鼠肿瘤模型体内验证

(1)体内肿瘤抑制实验

30只C57BL/6小鼠，右腋下接种1×10⁵个B16F10细胞，当肿瘤体积达到50mm³后，随机、盲法将小鼠分为3组(n＝10)，分别腹腔内注射PBS或10⁹PFU的VV-HBD2-lacZ或VV-lacZ，隔天注射一次，观察肿瘤体积并记录小鼠存活状况。

再取30只C57BL/6小鼠，随机、盲法分为3组(n＝10)，右腋下分别接种PBS或10⁹PFU的VV-HBD2-lacZ或VV-lacZ，每隔5天接种一次，3次接种完成后，在小鼠左腋下注射1×10⁵B16F10细胞，观察肿瘤体积并记录小鼠存活。结果如图10-13所示，与对照的VV-lacZ和PBS处理组相比，VV-HBD2-lacZ治疗组能够显著抑制肿瘤在小鼠体内的生长(图10-11)，明显提高荷瘤小鼠的存活率(图12)，观察到肿瘤接种第25天VV-HBD2-lacZ治疗组动物仍100％存活，而对照的VV-lacZ处理组在第25天50％死亡，PBS组则在第18天100％死亡。重组痘苗病毒免疫动物或PBS模拟免疫动物后用肿瘤细胞接种的攻击实验也显示，VV-HBD2-lacZ治疗组能够显著抑制肿瘤在被免疫小鼠体内的生长(图13)。

(2)流式细胞术测细胞毒性T细胞

分别取VV-HBD2-lacZ病毒和VV-lacZ病毒处理组小鼠肿瘤组织，机械研磨后过200目筛网，400×g离心5分钟，弃上清，加入红细胞裂解液，室温放置5分钟，离心洗涤两次。调整细胞浓度为10⁶/ml，抗小鼠CD4-PerCp,和抗小鼠CD8-PE抗体孵育，500μl细胞染色缓冲液重悬，上流式细胞仪分析。结果如图14所示，VV-HBD2-lacZ病毒处理组的CD4T细胞和CD8T细胞阳性率明显高于VV-lacZ病毒处理组。

(3)细胞毒性T细胞活性检测

小鼠3次免疫结束后14天，无菌处死取脾，机械研磨后过200目筛网，分离脾细胞，400×g离心5分钟，弃上清，加入红细胞裂解液，室温放置5分钟，离心洗涤两次。所得脾细胞与B16F10细胞(10⁴/孔)按12：1、25：1、50：1、100：1比率共培养。设定无脾细胞孔为最小杀伤对照，设定肿瘤细胞加1％Triton X-100共培养孔为最大杀伤对照。37℃、5％CO₂培养48h，加入10μlCCK-8溶液，在培养箱中继续培养1小时。用酶标仪在450nm测定OD值。CTL杀伤活性＝[(实验组OD值一最小杀伤对照组OD值)/(最大杀伤对照组OD值一最小杀伤对照组A值)]×100％。此外，采用抗-CD4、抗-CD8和抗INF--γ抗体阻断实验，验证CD4⁺T细胞或者CD8⁺T细胞在重组痘苗病毒激发的抗肿瘤免疫反应中的贡献。结果如图15所示，VV-HBD2-lacZ病毒免疫小鼠的脾细胞对肿瘤细胞的裂解活性远高于对照的VV-lacZ或PBS处理组，且抗-CD4、抗-CD8和抗INF—γ抗体都能够部分阻断该裂解活性，但抗-CD8和抗INF—γ抗体的阻断更明显(图16)，提示CD8⁺T细胞在介导重组痘苗病毒的抗肿瘤效应中可能发挥更重要作用。

序列表

<110> 浙江省医学科学院

<120> 表达人β-防御素2的重组痘苗病毒及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 192

<212> DNA

<213> 人工设计(unknown)

<400> 1

atgagagtat tatatttatt attttctttc ttatttattt tcttaatgcc attaccagga 60

gtatttggag gaattggaga tccagtaact tgtttaaaat ctggagctat ttgtcatcca 120

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tgtaaaaaac ca 192

<210> 2

<211> 8395

<212> DNA

<213> 人工设计(unknown)

<400> 2

cgcgcgtaat acgactcact atagggcgaa ttggagctct ttttatctgc gcggttaacc 60

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ctgggtcggt tacggccagg acagtcgttt gccgtctgaa tttgacctga gcgcattttt 1140

acgcgccgga gaaaaccgcc tcgcggtgat ggtgctgcgt tggagtgacg gcagttatct 1200

ggaagatcag gatatgtggc ggatgagcgg cattttccgt gacgtctcgt tgctgcataa 1260

accgactaca caaatcagcg atttccatgt tgccactcgc tttaatgatg atttcagccg 1320

cgctgtactg gaggctgaag ttcagatgtg cggcgagttg cgtgactacc tacgggtaac 1380

agtttcttta tggcagggtg aaacgcaggt cgccagcggc accgcgcctt tcggcggtga 1440

aattatcgat gagcgtggtg gttatgccga tcgcgtcaca ctacgtctga acgtcgaaaa 1500

cccgaaactg tggagcgccg aaatcccgaa tctctatcgt gcggtggttg aactgcacac 1560

cgccgacggc acgctgattg aagcagaagc ctgcgatgtc ggtttccgcg aggtgcggat 1620

tgaaaatggt ctgctgctgc tgaacggcaa gccgttgctg attcgaggcg ttaaccgtca 1680

cgagcatcat cctctgcatg gtcaggtcat ggatgagcag acgatggtgc aggatatcct 1740

gctgatgaag cagaacaact ttaacgccgt gcgctgttcg cattatccga accatccgct 1800

gtggtacacg ctgtgcgacc gctacggcct gtatgtggtg gatgaagcca atattgaaac 1860

ccacggcatg gtgccaatga atcgtctgac cgatgatccg cgctggctac cggcgatgag 1920

cgaacgcgta acgcgaatgg tgcagcgcga tcgtaatcac ccgagtgtga tcatctggtc 1980

gctggggaat gaatcaggcc acggcgctaa tcacgacgcg ctgtatcgct ggatcaaatc 2040

tgtcgatcct tcccgcccgg tgcagtatga aggcggcgga gccgacacca cggccaccga 2100

tattatttgc ccgatgtacg cgcgcgtgga tgaagaccag cccttcccgg ctgtgccgaa 2160

atggtccatc aaaaaatggc tttcgctacc tggagagacg cgcccgctga tcctttgcga 2220

atacgcccac gcgatgggta acagtcttgg cggtttcgct aaatactggc aggcgtttcg 2280

tcagtatccc cgtttacagg gcggcttcgt ctgggactgg gtggatcagt cgctgattaa 2340

atatgatgaa aacggcaacc cgtggtcggc ttacggcggt gattttggcg atacgccgaa 2400

cgatcgccag ttctgtatga acggtctggt ctttgccgac cgcacgccgc atccagcgct 2460

gacggaagca aaacaccagc agcagttttt ccagttccgt ttatccgggc aaaccatcga 2520

agtgaccagc gaatacctgt tccgtcatag cgataacgag ctcctgcact ggatggtggc 2580

gctggatggt aagccgctgg caagcggtga agtgcctctg gatgtcgctc cacaaggtaa 2640

acagttgatt gaactgcctg aactaccgca gccggagagc gccgggcaac tctggctcac 2700

agtacgcgta gtgcaaccga acgcgaccgc atggtcagaa gccgggcaca tcagcgcctg 2760

gcagcagtgg cgtctggcgg aaaacctcag tgtgacgctc cccgccgcgt cccacgccat 2820

cccgcatctg accaccagcg aaatggattt ttgcatcgag ctgggtaata agcgttggca 2880

atttaaccgc cagtcaggct ttctttcaca gatgtggatt ggcgataaaa aacaactgct 2940

gacgccgctg cgcgatcagt tcacccgtgc accgctggat aacgacattg gcgtaagtga 3000

agcgacccgc attgacccta acgcctgggt cgaacgctgg aaggcggcgg gccattacca 3060

ggccgaagca gcgttgttgc agtgcacggc agatacactt gctgatgcgg tgctgattac 3120

gaccgctcac gcgtggcagc atcaggggaa aaccttattt atcagccgga aaacctaccg 3180

gattgatggt agtggtcaaa tggcgattac cgttgatgtt gaagtggcga gcgatacacc 3240

gcatccggcg cggattggcc tgaactgcca gctggcgcag gtagcagagc gggtaaactg 3300

gctcggatta gggccgcaag aaaactatcc cgaccgcctt actgccgcct gttttgaccg 3360

ctgggatctg ccattgtcag acatgtatac cccgtacgtc ttcccgagcg aaaacggtct 3420

gcgctgcggg acgcgcgaat tgaattatgg cccacaccag tggcgcggcg acttccagtt 3480

caacatcagc cgctacagtc aacagcaact gatggaaacc agccatcgcc atctgctgca 3540

cgcggaagaa ggcacatggc tgaatatcga cggtttccat atggggattg gtggcgacga 3600

ctcctggagc ccgtcagtat cggcggaatt ccagctgagc gccggtcgct accattacca 3660

gttggtctgg tgtcagggga tcccccgggc tgcagccaat atgggatcgg ccattgaaca 3720

agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg gctatgactg 3780

ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg 3840

cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc aggacgaggc 3900

agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt 3960

cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc 4020

atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca 4080

tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc 4140

acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg 4200

gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc atgcccgacg gcgaggatct 4260

cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc 4320

tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc 4380

tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta 4440

cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg acgagttctt 4500

ctgagaagtt cctattcttc aaaaggtata ggaacttcag ttatagtagc cgcactcgat 4560

gggacatttc aacgtaaacc gtttaataat attttgaatc ttattccatt atctgaaatg 4620

gtggtaaaac taactgctgt gtgtatgaaa tgctttaagg aggcttcctt ttctaaacga 4680

ttgggtgagg aaaccgagat agaaataata ggaggtaatg atatgtatca atcggtgtgt 4740

agaaagtgtt acatcgactc ataatattat attttttatc taaaaaacta aaaataaaca 4800

ttgattaaat tttaatataa tacttaaaaa tggatgttgt gtcgttagat aaaccgttta 4860

tgtattttga ggaaattgat aatgagttag attacgaacc agaaagtgca aatgaggtcg 4920

caaaaaaact gccgtatcaa ggacagttaa aactattact aggagaatta ttttttctta 4980

gtaagttaca gcgacacggt atattagatg gtgccaccgt agtgtatata ggatctgctc 5040

ccggtacaca tatacgttat ttgagagatc atttctataa tttaggagtg atcatcaaat 5100

ggatgctaat tgacggccgc catcatgatc ctattttaaa tggattgcgt gatgtgactc 5160

tagtgactcg gttcgttgat gaggaatatc tacgatccat caaaaaacaa ctgcatcctt 5220

ctaagattat tttaatttct gatgtgagat ccaaacgagg aggaaatgaa cctagtacgg 5280

cggatttact aagtaattac gctctacaaa atgtcatgat tagtatttta aaccccgtgg 5340

cgtctagtct taaatggaga tgcccgtttc cagatcaatg gatcaaggac ttttatatcc 5400

cacacggtaa taaaatgtta caaccttttg ctccttcata ttcagctgaa atgagattat 5460

taagtattta taccggtgag aacatgagac tgactcgggc cgcgttgctg gcgtttttcc 5520

ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 5580

acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 5640

ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 5700

cgctttctca atgctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc 5760

tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 5820

gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca 5880

ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact 5940

acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg 6000

gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt 6060

ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 6120

tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 6180

gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 6240

tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac 6300

ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga 6360

taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc 6420

cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca 6480

gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta 6540

gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct gcaggcatcg 6600

tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc 6660

gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg 6720

ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt 6780

ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt 6840

cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca acacgggata 6900

ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc 6960

gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac 7020

ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa 7080

ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct 7140

tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat 7200

ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc 7260

cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca 7320

cgaggccctt tcgtcttcga ataaatacct gtgacggaag atcacttcgc agaataaata 7380

aatcctggtg tccctgttga taccgggaag ccctgggcca acttttggcg aaaatgagac 7440

gttgatcggc acgtaagagg ttccaacttt caccataatg aaataagatc actaccgggc 7500

gtattttttg agttatcgag attttcagga gctaaggaag ctaaaatgga gaaaaaaatc 7560

actggatata ccaccgttga tatatcccaa tggcatcgta aagaacattt tgaggcattt 7620

cagtcagttg ctcaatgtac ctataaccag accgttcaga gcttttggga tcaataaatg 7680

gatcacaacc agtatctctt aacgatgttc ttcgcagatg atgattcatt ttttaagtat 7740

ttggctagtc aagatgatga atcttcatta tctgatatat tgcaaatcac tcaatatgta 7800

gctagacttt ctgttattat tattgatcca atcaaaaaat aaattagaag ccgtgggtca 7860

ttgttatgaa tctctttcag aggaatacag acaattgaca aaattcacag actttcaaga 7920

ttttaaaaaa ctgtttaaca aggtccctat tgacagatgg aagggtcaaa cttaataaag 7980

gatatttgtt cgactttgtg attagtttga tgcgattcaa aaaagaatcc tctctagcta 8040

ccaccgcaat agatcctgtt agatacatag atcctcgtcg caatatcgca ttttctaacg 8100

tgatggatat attaaagtcg aataaagtga acaataatta attctttatt gtcatcatga 8160

acggcggaca tattcagttg ataatcggcc ccatgttttc aggtaaaagt acagaattaa 8220

ttagacgagt tagacgttat caaatagctc aatataaatg cgtgactata aaatattcta 8280

acgataatag atacggaacg ggactatgga cgcatgataa gaataatttt gaagcattgg 8340

aagcaactaa actatgtgat ctcttggaat caattacaga tttctccgtg atagg 8395

<210> 3

<211> 3878

<212> DNA

<213> 人工设计(unknown)

<400> 3

atgatctgtg acatggcgga tcccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc 60

gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa 120

gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atggcgcttt 180

gcctggtttc cggcaccaga agcggtgccg gaaagctggc tggagtgcga tcttcctgag 240

gccgatactg tcgtcgtccc ctcaaactgg cagatgcacg gttacgatgc gcccatctac 300

accaacgtga cctatcccat tacggtcaat ccgccgtttg ttcccacgga gaatccgacg 360

ggttgttact cgctcacatt taatgttgat gaaagctggc tacaggaagg ccagacgcga 420

attatttttg atggcgttaa ctcggcgttt catctgtggt gcaacgggcg ctgggtcggt 480

tacggccagg acagtcgttt gccgtctgaa tttgacctga gcgcattttt acgcgccgga 540

gaaaaccgcc tcgcggtgat ggtgctgcgt tggagtgacg gcagttatct ggaagatcag 600

gatatgtggc ggatgagcgg cattttccgt gacgtctcgt tgctgcataa accgactaca 660

caaatcagcg atttccatgt tgccactcgc tttaatgatg atttcagccg cgctgtactg 720

gaggctgaag ttcagatgtg cggcgagttg cgtgactacc tacgggtaac agtttcttta 780

tggcagggtg aaacgcaggt cgccagcggc accgcgcctt tcggcggtga aattatcgat 840

gagcgtggtg gttatgccga tcgcgtcaca ctacgtctga acgtcgaaaa cccgaaactg 900

tggagcgccg aaatcccgaa tctctatcgt gcggtggttg aactgcacac cgccgacggc 960

acgctgattg aagcagaagc ctgcgatgtc ggtttccgcg aggtgcggat tgaaaatggt 1020

ctgctgctgc tgaacggcaa gccgttgctg attcgaggcg ttaaccgtca cgagcatcat 1080

cctctgcatg gtcaggtcat ggatgagcag acgatggtgc aggatatcct gctgatgaag 1140

cagaacaact ttaacgccgt gcgctgttcg cattatccga accatccgct gtggtacacg 1200

ctgtgcgacc gctacggcct gtatgtggtg gatgaagcca atattgaaac ccacggcatg 1260

gtgccaatga atcgtctgac cgatgatccg cgctggctac cggcgatgag cgaacgcgta 1320

acgcgaatgg tgcagcgcga tcgtaatcac ccgagtgtga tcatctggtc gctggggaat 1380

gaatcaggcc acggcgctaa tcacgacgcg ctgtatcgct ggatcaaatc tgtcgatcct 1440

tcccgcccgg tgcagtatga aggcggcgga gccgacacca cggccaccga tattatttgc 1500

ccgatgtacg cgcgcgtgga tgaagaccag cccttcccgg ctgtgccgaa atggtccatc 1560

aaaaaatggc tttcgctacc tggagagacg cgcccgctga tcctttgcga atacgcccac 1620

gcgatgggta acagtcttgg cggtttcgct aaatactggc aggcgtttcg tcagtatccc 1680

cgtttacagg gcggcttcgt ctgggactgg gtggatcagt cgctgattaa atatgatgaa 1740

aacggcaacc cgtggtcggc ttacggcggt gattttggcg atacgccgaa cgatcgccag 1800

ttctgtatga acggtctggt ctttgccgac cgcacgccgc atccagcgct gacggaagca 1860

aaacaccagc agcagttttt ccagttccgt ttatccgggc aaaccatcga agtgaccagc 1920

gaatacctgt tccgtcatag cgataacgag ctcctgcact ggatggtggc gctggatggt 1980

aagccgctgg caagcggtga agtgcctctg gatgtcgctc cacaaggtaa acagttgatt 2040

gaactgcctg aactaccgca gccggagagc gccgggcaac tctggctcac agtacgcgta 2100

gtgcaaccga acgcgaccgc atggtcagaa gccgggcaca tcagcgcctg gcagcagtgg 2160

cgtctggcgg aaaacctcag tgtgacgctc cccgccgcgt cccacgccat cccgcatctg 2220

accaccagcg aaatggattt ttgcatcgag ctgggtaata agcgttggca atttaaccgc 2280

cagtcaggct ttctttcaca gatgtggatt ggcgataaaa aacaactgct gacgccgctg 2340

cgcgatcagt tcacccgtgc accgctggat aacgacattg gcgtaagtga agcgacccgc 2400

attgacccta acgcctgggt cgaacgctgg aaggcggcgg gccattacca ggccgaagca 2460

gcgttgttgc agtgcacggc agatacactt gctgatgcgg tgctgattac gaccgctcac 2520

gcgtggcagc atcaggggaa aaccttattt atcagccgga aaacctaccg gattgatggt 2580

agtggtcaaa tggcgattac cgttgatgtt gaagtggcga gcgatacacc gcatccggcg 2640

cggattggcc tgaactgcca gctggcgcag gtagcagagc gggtaaactg gctcggatta 2700

gggccgcaag aaaactatcc cgaccgcctt actgccgcct gttttgaccg ctgggatctg 2760

ccattgtcag acatgtatac cccgtacgtc ttcccgagcg aaaacggtct gcgctgcggg 2820

acgcgcgaat tgaattatgg cccacaccag tggcgcggcg acttccagtt caacatcagc 2880

cgctacagtc aacagcaact gatggaaacc agccatcgcc atctgctgca cgcggaagaa 2940

ggcacatggc tgaatatcga cggtttccat atggggattg gtggcgacga ctcctggagc 3000

ccgtcagtat cggcggaatt ccagctgagc gccggtcgct accattacca gttggtctgg 3060

tgtcagggga tcccccgggc tgcagccaat atgggatcgg ccattgaaca agatggattg 3120

cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg gctatgactg ggcacaacag 3180

acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt 3240

tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc aggacgaggc agcgcggcta 3300

tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg 3360

ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt 3420

gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat 3480

ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg 3540

atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca 3600

gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc atgcccgacg gcgaggatct cgtcgtgacc 3660

catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc 3720

gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat 3780

attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc 3840

gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttct 3878

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工设计(unknown)

<400> 4

gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttc 34

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工设计(unknown)

<400> 5

gaagttccta ttcttcaaaa ggtataggaa cttc 34

<210> 6

<211> 64

<212> PRT

<213> 人工设计(unknown)

<400> 6

Met Arg Val Leu Tyr Leu Leu Phe Ser Phe Leu Phe Ile Phe Leu Met

1 5 10 15

Pro Leu Pro Gly Val Phe Gly Gly Ile Gly Asp Pro Val Thr Cys Leu

20 25 30

Lys Ser Gly Ala Ile Cys His Pro Val Phe Cys Pro Arg Arg Tyr Lys

35 40 45

Gln Ile Gly Thr Cys Gly Leu Pro Gly Thr Lys Cys Cys Lys Lys Pro

50 55 60

<210> 7

<211> 1292

<212> PRT

<213> 人工设计(unknown)

<400> 7

Met Ile Cys Asp Met Ala Asp Pro Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Trp

1 5 10 15

Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro Pro

20 25 30

Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Glu Glu Ala Arg Thr Asp Arg Pro Ser

35 40 45

Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe Pro

50 55 60

Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Trp Leu Glu Cys Asp Leu Pro Glu

65 70 75 80

Ala Asp Thr Val Val Val Pro Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr Asp

85 90 95

Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro Pro

100 105 110

Phe Val Pro Thr Glu Asn Pro Thr Gly Cys Tyr Ser Leu Thr Phe Asn

115 120 125

Val Asp Glu Ser Trp Leu Gln Glu Gly Gln Thr Arg Ile Ile Phe Asp

130 135 140

Gly Val Asn Ser Ala Phe His Leu Trp Cys Asn Gly Arg Trp Val Gly

145 150 155 160

Tyr Gly Gln Asp Ser Arg Leu Pro Ser Glu Phe Asp Leu Ser Ala Phe

165 170 175

Leu Arg Ala Gly Glu Asn Arg Leu Ala Val Met Val Leu Arg Trp Ser

180 185 190

Asp Gly Ser Tyr Leu Glu Asp Gln Asp Met Trp Arg Met Ser Gly Ile

195 200 205

Phe Arg Asp Val Ser Leu Leu His Lys Pro Thr Thr Gln Ile Ser Asp

210 215 220

Phe His Val Ala Thr Arg Phe Asn Asp Asp Phe Ser Arg Ala Val Leu

225 230 235 240

Glu Ala Glu Val Gln Met Cys Gly Glu Leu Arg Asp Tyr Leu Arg Val

245 250 255

Thr Val Ser Leu Trp Gln Gly Glu Thr Gln Val Ala Ser Gly Thr Ala

260 265 270

Pro Phe Gly Gly Glu Ile Ile Asp Glu Arg Gly Gly Tyr Ala Asp Arg

275 280 285

Val Thr Leu Arg Leu Asn Val Glu Asn Pro Lys Leu Trp Ser Ala Glu

290 295 300

Ile Pro Asn Leu Tyr Arg Ala Val Val Glu Leu His Thr Ala Asp Gly

305 310 315 320

Thr Leu Ile Glu Ala Glu Ala Cys Asp Val Gly Phe Arg Glu Val Arg

325 330 335

Ile Glu Asn Gly Leu Leu Leu Leu Asn Gly Lys Pro Leu Leu Ile Arg

340 345 350

Gly Val Asn Arg His Glu His His Pro Leu His Gly Gln Val Met Asp

355 360 365

Glu Gln Thr Met Val Gln Asp Ile Leu Leu Met Lys Gln Asn Asn Phe

370 375 380

Asn Ala Val Arg Cys Ser His Tyr Pro Asn His Pro Leu Trp Tyr Thr

385 390 395 400

Leu Cys Asp Arg Tyr Gly Leu Tyr Val Val Asp Glu Ala Asn Ile Glu

405 410 415

Thr His Gly Met Val Pro Met Asn Arg Leu Thr Asp Asp Pro Arg Trp

420 425 430

Leu Pro Ala Met Ser Glu Arg Val Thr Arg Met Val Gln Arg Asp Arg

435 440 445

Asn His Pro Ser Val Ile Ile Trp Ser Leu Gly Asn Glu Ser Gly His

450 455 460

Gly Ala Asn His Asp Ala Leu Tyr Arg Trp Ile Lys Ser Val Asp Pro

465 470 475 480

Ser Arg Pro Val Gln Tyr Glu Gly Gly Gly Ala Asp Thr Thr Ala Thr

485 490 495

Asp Ile Ile Cys Pro Met Tyr Ala Arg Val Asp Glu Asp Gln Pro Phe

500 505 510

Pro Ala Val Pro Lys Trp Ser Ile Lys Lys Trp Leu Ser Leu Pro Gly

515 520 525

Glu Thr Arg Pro Leu Ile Leu Cys Glu Tyr Ala His Ala Met Gly Asn

530 535 540

Ser Leu Gly Gly Phe Ala Lys Tyr Trp Gln Ala Phe Arg Gln Tyr Pro

545 550 555 560

Arg Leu Gln Gly Gly Phe Val Trp Asp Trp Val Asp Gln Ser Leu Ile

565 570 575

Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Asn Pro Trp Ser Ala Tyr Gly Gly Asp Phe

580 585 590

Gly Asp Thr Pro Asn Asp Arg Gln Phe Cys Met Asn Gly Leu Val Phe

595 600 605

Ala Asp Arg Thr Pro His Pro Ala Leu Thr Glu Ala Lys His Gln Gln

610 615 620

Gln Phe Phe Gln Phe Arg Leu Ser Gly Gln Thr Ile Glu Val Thr Ser

625 630 635 640

Glu Tyr Leu Phe Arg His Ser Asp Asn Glu Leu Leu His Trp Met Val

645 650 655

Ala Leu Asp Gly Lys Pro Leu Ala Ser Gly Glu Val Pro Leu Asp Val

660 665 670

Ala Pro Gln Gly Lys Gln Leu Ile Glu Leu Pro Glu Leu Pro Gln Pro

675 680 685

Glu Ser Ala Gly Gln Leu Trp Leu Thr Val Arg Val Val Gln Pro Asn

690 695 700

Ala Thr Ala Trp Ser Glu Ala Gly His Ile Ser Ala Trp Gln Gln Trp

705 710 715 720

Arg Leu Ala Glu Asn Leu Ser Val Thr Leu Pro Ala Ala Ser His Ala

725 730 735

Ile Pro His Leu Thr Thr Ser Glu Met Asp Phe Cys Ile Glu Leu Gly

740 745 750

Asn Lys Arg Trp Gln Phe Asn Arg Gln Ser Gly Phe Leu Ser Gln Met

755 760 765

Trp Ile Gly Asp Lys Lys Gln Leu Leu Thr Pro Leu Arg Asp Gln Phe

770 775 780

Thr Arg Ala Pro Leu Asp Asn Asp Ile Gly Val Ser Glu Ala Thr Arg

785 790 795 800

Ile Asp Pro Asn Ala Trp Val Glu Arg Trp Lys Ala Ala Gly His Tyr

805 810 815

Gln Ala Glu Ala Ala Leu Leu Gln Cys Thr Ala Asp Thr Leu Ala Asp

820 825 830

Ala Val Leu Ile Thr Thr Ala His Ala Trp Gln His Gln Gly Lys Thr

835 840 845

Leu Phe Ile Ser Arg Lys Thr Tyr Arg Ile Asp Gly Ser Gly Gln Met

850 855 860

Ala Ile Thr Val Asp Val Glu Val Ala Ser Asp Thr Pro His Pro Ala

865 870 875 880

Arg Ile Gly Leu Asn Cys Gln Leu Ala Gln Val Ala Glu Arg Val Asn

885 890 895

Trp Leu Gly Leu Gly Pro Gln Glu Asn Tyr Pro Asp Arg Leu Thr Ala

900 905 910

Ala Cys Phe Asp Arg Trp Asp Leu Pro Leu Ser Asp Met Tyr Thr Pro

915 920 925

Tyr Val Phe Pro Ser Glu Asn Gly Leu Arg Cys Gly Thr Arg Glu Leu

930 935 940

Asn Tyr Gly Pro His Gln Trp Arg Gly Asp Phe Gln Phe Asn Ile Ser

945 950 955 960

Arg Tyr Ser Gln Gln Gln Leu Met Glu Thr Ser His Arg His Leu Leu

965 970 975

His Ala Glu Glu Gly Thr Trp Leu Asn Ile Asp Gly Phe His Met Gly

980 985 990

Ile Gly Gly Asp Asp Ser Trp Ser Pro Ser Val Ser Ala Glu Phe Gln

995 1000 1005

Leu Ser Ala Gly Arg Tyr His Tyr Gln Leu Val Trp Cys Gln Gly Ile

1010 1015 1020

Pro Arg Ala Ala Ala Asn Met Gly Ser Ala Ile Glu Gln Asp Gly Leu

1025 1030 1035 1040

His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp

1045 1050 1055

Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu

1060 1065 1070

Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly

1075 1080 1085

Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala

1090 1095 1100

Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val Leu Asp Val Val Thr Glu Ala

1105 1110 1115 1120

Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu

1125 1130 1135

Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys Val Ser Ile Met Ala Asp Ala

1140 1145 1150

Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro Ala Thr Cys Pro Phe Asp His

1155 1160 1165

Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly

1170 1175 1180

Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu Glu His Gln Gly Leu Ala Pro

1185 1190 1195 1200

Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala Arg Met Pro Asp Gly Glu Asp

1205 1210 1215

Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys Leu Pro Asn Ile Met Val Glu

1220 1225 1230

Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala

1235 1240 1245

Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu

1250 1255 1260

Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala

1265 1270 1275 1280

Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe Tyr Arg Leu

1285 1290

<210> 8

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工设计(unknown)

<400> 8

atgagagtat tatatttatt attttctttc ttatttattt tcttaatgcc attaccagg 59

<210> 9

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工设计(unknown)

<400> 9

tttaaacaag ttactggatc tccaattcct ccaaatactc ctggtaatgg cattaag 57

<210> 10

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工设计(unknown)

<400> 10

atctggagct atttgtcatc cagtattttg tccaagaaga tataaacaaa ttggaactt 59

<210> 11

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工设计(unknown)

<400> 11

attatggttt tttacaacat ttagttcctg gtaatccaca agttccaatt tgtttatat 59

Claims (10)

1.一种表达人β-防御素2的重组痘苗病毒，其特征在于，人β-防御素2基因被插入痘苗病毒TK基因区，由人工合成的痘苗病毒早/晚期启动子驱动其表达。

2.如权利要求1所述表达人β-防御素2的重组痘苗病毒，其特征在于，所述人β-防御素2基因基于痘苗病毒偏爱的优化密码子人工合成，其核酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.如权利要求1所述表达人β-防御素2的重组痘苗病毒，其特征在于，所述表达人β-防御素2的重组痘苗病毒的母体病毒是痘苗病毒WR株。

4.如权利要求1所述表达人β-防御素2的重组痘苗病毒，其特征在于，所述表达人β-防御素2的重组痘苗病毒是基于重组痘苗载体质粒pCBlacZ-hBD2，通过同源重组机制构建的。重组痘苗载体质粒pCBlacZ-hBD2的核酸全序列如SEQ ID No.2所示。

5.如权利要求4所述表达人β-防御素2的重组痘苗病毒，其特征在于，所述重组痘苗载体质粒pCBlacZ-hBD2的结构包含痘苗病毒密码子优化的hBD2基因及其上游的人工合成的痘苗病毒早/晚期启动子，以及与目的基因表达盒串联的可选择标志基因。

6.如权利要求5所述表达人β-防御素2的重组痘苗病毒，其特征在于，所述可选择标志基因为β-半乳糖苷酶基因与G-418药物抗性基因融合而成。可选择标志基因由痘苗病毒P7.5早/晚期启动子驱动表达。可选择标志基因的核酸序列如SEQ ID No.3所示。

7.如权利要求6所述表达人β-防御素2的重组痘苗病毒，其特征在于，在所述可选择标志基因lacZ的前、后两末端分别设置有翻转重组酶识别序列FRT和FRT5。FRT的核酸序列如SEQ ID No.4所示，FRT5的核酸序列如SEQ ID No.5所示。

8.如权利要求2所述表达人β-防御素2的重组痘苗病毒，其特征在于，所述人β-防御素2基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；可选择标志基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。

9.一种权利要求1-8任一项所述重组痘苗病毒元件在制备抗肿瘤药物中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌、黑色素瘤和乳腺癌。