CN101492685A - 一种重组表达载体的基因序列及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种重组表达载体的基因序列及其构建方法，属于生物工程技术领域，是采用高保真酶、上游引物和下游引物利用PCR方法从金黄色葡萄球菌标准菌株基因组中扩增出nEbpS蛋白目的基因克隆到克隆载体中得到重组克隆载体，将重组克隆载体转化感受态宿主细胞后筛选和鉴定得重组质粒，将重组质粒整合到表达载体上得到重组表达载体，再转化到大肠杆菌M15中，在IPTG的诱导下获得EbpS蛋白，利用亲和层析将EbpS蛋白进行纯化后制备乳化抗原，将乳化抗原免疫宿主，收集宿主血清，制备EbpS抗体制剂。本发明采用高保真酶所得基因序列没有任何突变，得到高度准确的基因片段，保证了精确性。

Description

一种重组表达载体的基因序列及其构建方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体地说是一种重组表达载体的基因序列及其构建方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌是一种常见的革兰氏阳性菌，具有强致病性，是继发感染和败血症、胃肠道感染、爆发性食物中毒等人兽共患疾病的主要致病菌。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶。

研究已经发现金黄色葡萄球菌主要通过其表面的弹性纤维结合蛋白(EbpS)与宿主的细胞外基质结合，从而引起宿主的感染。

现有技术条件下，利用PCR技术扩增该弹性纤维结合蛋白(EbpS)的表达基因时，普遍采用普通的Taq酶，进而进行PCR得到的基因序列与基因库中的基因序列测序比对的结果说明其扩增出的目的基因产生了突变的序列，该过程的突变率往往比较高，如此导致目的基因的获得比较困难，无形的增加了实验和材料的经济投入。怎样设计和进一步完善实验以高效的得到稳定的目的基因以及其重组表达载体，是现阶段生物工程技术领域或免疫医学领域科技发展有待解决的重要课题之一。

发明内容

本发明的技术任务是针对金黄色葡萄球菌的致病主要因素，提供一种含有金黄色葡萄球菌nEbpS蛋白基因的重组表达载体及其构建方法，可通过免疫学技术来实现获得对金黄色葡萄球菌的抗体制剂。

本发明的技术方案是按以下方式实现的，一种重组表达载体，该重组表达载体的基因序列中含有能够表达金黄色葡萄球菌nEbpS蛋白的目的基因序列。

该重组表达载体的基因序列具有序列表中SEQ ID NO.4所述的碱基序列。

一种含有金黄色葡萄球菌nEbpS蛋白基因的重组表达载体的构建方法，其步骤包括：

(1)根据Genbank中ATCC25923标准菌株nEbpS基因序列，合成在5’端引入BamH I酶切位点的具有序列表中SEQ ID NO.1所述的碱基序列的上游引物；合成在5’端引入HindIII酶切位点的具有序列表中SEQ ID NO.2所述的碱基序列的下游引物；

(2)采用高保真酶、上游引物和下游引物利用PCR方法从金黄色葡萄球菌ATCC25923标准菌株基因组中扩增出nEbpS蛋白目的基因；

(3)PCR产物的回收和纯化；

(4)PCR产物的双酶切处理和纯化；

(5)克隆载体的双酶切处理及纯化；

(6)目的片段与克隆载体的连接；

(7)连接产物诱导转化宿主细胞感受态；

(8)培养转化后的宿主细胞，筛选、鉴定、扩培，抽提得重组质粒；

(9)重组质粒双酶切处理和纯化；

(10)表达载体双酶切处理和纯化；

(11)目的片段与表达载体的连接，得重组表达载体。

所述的克隆载体采用pMD19-T。

所述的宿主感细胞选用DH5α大肠杆菌。

所述的筛选是对转化宿主细胞进行氨苄青霉素抗性菌株的筛选。

所述的表达载体采用pQE30。

该含有金黄色葡萄球菌nEbpS蛋白基因的重组表达载体的用途，是将该重组表达载体转化到大肠杆菌M15中，在IPTG的诱导下获得EbpS蛋白，利用亲和层析将EbpS蛋白进行纯化后制备乳化抗原，将乳化抗原免疫宿主，收集宿主血清，制备EbpS抗体制剂。

本发明的含有金黄色葡萄球菌nEbpS蛋白基因的重组表达载体及其构建方法与现有技术相比所产生的有益效果是：

(1)本发明采用高保真酶Pyrobest DNA Polymerase替代通常技术的Taq酶。Taq酶在PCR扩增得到的基因序列经常有序列的突变，并且由于碱基A的插入而引起插入突变，影响实验效果。采用高保真酶所得基因序列没有任何突变，高保真酶扩增得到的片段全部为平滑末端，所以在后续的连接中并未采取A-T连接，而是利用双酶切后通过连接酶连接。采用了高保真酶，得到了高度准确的平末端基因片段。这一步保证了克隆基因片段的精确性。

(2)本发明采用pQE30作为表达载体，其自身带有6×His标签，含有β-内酰胺酶基因，因此具有氨苄霉素抗性，还具有优化的启动子-操纵元模式，以T5启动子起始转录-翻译系统；本身带有启动子和终止子，可以高效翻译外源基因。

(3)在一般的构建载体方法中，会在平末端基因片段后面加上PolyA，再与T载体连接，但是这样会产生插入突变，所以我在引物设计中分别加上BamH I和HindIII酶切位点，将得到的克隆目的基因片段与T载体以及表达载体pQE30连接时均采用了双酶切方法，既保证了插入片段的完整性，又保证了其顺序性。

(4)本发明采用大肠杆菌M15作为表达菌株，其含有卡那霉素抗性质粒pREP4，同时带有表达lac抑制子的基因，高效表达lac抑制子，可以编码lac阻抑蛋白以便IPTG诱导时更容易表达。

附图说明

附图1是本发明的实验方法和步骤流程示意图；

附图2是本发明的实验过程中金黄色葡萄球菌基因组及nEbpS基因PCR扩增图谱；图中：M.Takara DL 15,000；1.金葡菌基因组片段；2.nebps基因；

附图3是本发明的实验过程中蓝白斑筛选含有重组质粒pMD19-T(+)/nEbpS的DH5α菌株；

附图4是本发明的实验过程中重组质粒pMD19-T(+)/nEbpS的PCR鉴定图谱；图中：M₁.Maker II；1、2.nebps的PCR产物；

附图5是本发明的实验过程中重组质粒pMD19-T(+)/nEbpS的双酶切鉴定图谱；图中：M₂.Takara DL 15,000；3.pMD19-T DNA；4.双酶切处理的重组质粒pMD19-T(+)/nebps；

附图6是本发明的实验过程中重组质粒pQE30(+)/nEbpS的PCR鉴定图谱；图中：1.nebps的PCR产物；M1.Maker II；

附图7是本发明的实验过程中重组质粒pQE30(+)/nEbpS的双酶切鉴定图谱；图中：M2.Takara DL 15,000；2.双酶切处理的重组表达质粒pQE30(+)/nebps；3.pQE30DNA；

附图8是本发明的实验过程中pMD19-T(+)/nEbpS的测序结果示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的含有金黄色葡萄球菌nEbpS蛋白基因的重组表达载体及其构建方法作以下详细说明。

下面提供本发明的一个最佳实施例：

实施例1：

(1)引物设计及合成

根据Genbank中ATCC25923标准菌株nEbpS基因序列，设计出针对nEbpS蛋白，合成在5’端引入BamH I酶切位点的具有序列表中SEQID NO.1所述的碱基序列的上游引物；合成在5’端引入HindIII酶切位点的具有序列表中SEQIDNO.2所述的碱基序列的下游引物；并纯化。上游引物序列长度为37bp，下游引物序列长度为26bp。

(2)PCR反应

利用PCR方法采用高保真酶从提取的标准菌株基因组中扩增出nEbpS蛋白基因片段，建立以下PCR反应体系：

总反应体积为50μl：

10×Pyrobest DNA Polymerase Buffer 5μl，dNTP 4μl，

引物(10pmol/μl)各1μl，模板(100ng/μl)1μl，

Pyrobest DNA Polymerase 0.25μl，ddH₂O 37.5μl。

PCR条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸5min。

琼脂糖凝胶电泳检测：

PCR结束后，制备1％的琼脂糖凝胶，每孔点样10μl，以Takara DL 15000(250bp，1000bp，2500bp，5000bp，7500bp，10000bp，15000bp)为参照，施加100伏电压，在1×TAE电泳缓冲液中电泳20分钟，于紫外灯下观察扩增片段大小，并用凝胶成像系统拍照。

(3)PCR产物的回收和纯化

目的片段经PCR扩增后，产物由宝生物工程(大连)有限公司的Agarose GelDNA Purification Kit回收纯化，具体步骤如下：

A在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。

B切碎胶块，称量胶块重量。

C向胶块中加入胶块融化液DR-I Buffer.

D均匀混合后75℃加热融化胶块。此时应间断振荡混合，使胶块充分融化。

E向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer量的1/2体积量的DR-IIBuffer.，均匀混合。

F将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

G将上述步骤E的溶液转移至Spin Column中，3600rpm离心1分钟，弃滤液。

H重复操作步骤G，然后12000rpm再离心1分钟。

I将Spin Column安置于新的1.5ml EP管上，在Spin Column膜中央处加入25μl水，室温静置1分钟。

J 12000rpm离心1分钟洗脱DNA。

PCR产物末端加A处理：凝胶回收纯化后的PCR产物末端加A。

末端加A体系：胶回收的平端PCR产物14μl，10×PCR Buffer(Mg²⁺plus)2μl，dATP 0.04μl，rTaq DNA polymerase2μl，H₂O 2μl，70℃30min。

(4)PCR产物的双酶切处理和纯化

PCR产物末端加A后的双酶切及纯化(末端加A的目的是为了更好地酶切)

将纯化后PCR产物分别用限制性内切酶BamH I、HindIII进行双酶切，建立50μl的酶切反应体系：水20μl，10×K Buffer 5μl，纯化后末端加A的PCR产物20μl，BamH I、HindIII各2.5μl。37℃酶切1h.

琼脂糖凝胶电泳检测：制备1％的琼脂糖凝胶，每孔点样10μl，以Maker II(100bp，300bp，500bp，700bp，900bp，1200bp)为参照，施加100伏电压，在1×TAE电泳缓冲液中电泳20分钟，于紫外灯下观察扩增片段大小，并用凝胶成像系统拍照。

将双酶切后的PCR产物用宝生物工程(大连)有限公司的Agarose Gel DNAPurification Kit回收纯化。

(5)克隆载体的双酶切及纯化

将pMD19-T质粒用限制性内切酶BamH I、HindIII进行双酶切；建立20μl的酶切反应体系：

质粒1.5μl，10×K Buffer 2μl，BamH I 1μl，HindIII 1μl，ddH₂O14.5μl。

37℃酶切1h。

琼脂糖凝胶电泳检测：制备1％的琼脂糖凝胶，每孔点样10μl，以Maker II为参照，施加100伏电压，在1×TAE电泳缓冲液中电泳30分钟，于紫外灯下观察扩增片段大小，并用凝胶成像系统拍照。

将双酶切后的产物用宝生物工程(大连)有限公司的Agarose Gel DNAPurification Kit回收纯化。

(6)目的片段与克隆载体的连接

取双酶切并纯化后的PCR产物及经双酶切并纯化的pMD19-T克隆载体，分别建立以下20μl的连接反应体系：末端加A产物8μl，pMD19-T 2μl，Ligmix10μl。16℃连接过夜。将连接产物于4℃保存备用。

克隆载体pMD19-T(+)/nEbpS具有序列表中SEQID NO.3所述的碱基序列。

克隆载体pMD19-T(+)/nEbpS中的基因序列与基因库中的ebps基因序列比对结果：

测序结果与ATCC25923nebps基因序列比对的结果：

Score＝1273bits(662)，Expect＝0.0

dentities＝676/676(100％)，Gaps＝0/676(0％)

Strand＝Plus/Plus

经比对，扩增基因的DNA测序结果与Genbank中报道的nebps基因序列完全一致，二者的同源性为100％。

(7)连接产物诱导转化宿主细胞感受态

(a)制备大肠杆菌DH5α感受态：

A把保存于-20℃的DH5α菌种于LB平板上划线，于37℃培养约12h，然后挑取单菌落于含10ml LB培养液的试管中，37℃条件下在全温振荡器中以200rpm的转速摇床振荡培养约12h。

B按1∶100比例扩大培养，即从上述菌液中取2ml转接到一个装有200mlLB的液体培养基的500ml的三角瓶中。37℃条件下在全温振荡器中以260rpm的转速摇床振荡培养2h至菌生长对数期，测OD₆₀₀为0.4-0.5。

C将细菌转移到一个无菌、用冰预冷的50ml的离心管中，在冰上放置10min，使培养物冷却到0℃。

D在4℃条件下以4000rpm离心10min收集细菌，去掉上清液，将离心管倒置1min，使培养液流尽。

E每50ml的初始培养液用冰冷的0.1M CaCl₂约30ml重悬菌体沉淀。

F在4℃条件下以4000rpm离心10min收集细菌，去掉上清液。

G重复操作步骤E、F，并将离心管倒置1min使液体流尽。

H每50ml初始培养液用200μl预冷的0.1M的CaCl₂重悬菌体沉淀，将悬好的菌液移入预冷的1.5ml EP管中，做好标记。每管加入0.5ml冻存液于-70℃保存。

(b)转化：

LB固体培养基平板准备：含100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基平板上均匀涂抹IPTG4μl(200mg/ml)，X-gal 40μl(20mg/ml)，直至完全吸收备用。

把-70℃保存的DH5a感受态细菌取出，室温下解冻，然后放入冰浴中，把200μl感受态细菌分别加入10μl连接产物，混匀，在冰浴上放置30min，然后于42℃热激90秒，快速将其放入冰浴2min。加入800μl LB培养液，37℃条件下在全温振荡器中以50rpm的转速摇床振荡45min，然后4000rpm离心1min，吸去800μl培养液，再次悬浮菌液。将含连接产物的pMD19-T(+)菌液转移到含100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基平板，将平板置于室温直至液体被吸收。倒置平板，于37℃条件下培养至长出单克隆(约16小时)。

(8)培养转化后的宿主细胞，筛选、鉴定、扩培，抽提得重组质粒；

(a)应用碱裂解法小量抽提质粒，具体步骤如下：

A取出上述4个长出单克隆的平板。每一个平板挑取6个单克隆分别接入含50μg/ml硫酸卡那霉素/含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃条件下在全温振荡器中以200rpm的转速摇床振荡12-14h。

B取培养好的1-2ml菌液转移到1.5ml EP管中，以12000rpm的速度离心30秒，去上清。

C沉淀用100μl溶液I悬浮，剧烈振荡。

D加入200μl溶液II，轻轻颠倒EP管，使溶液与EP管的整个内表面接触，于冰上放置5min

E加入150μl溶液III，在漩涡混合器上振荡2秒混匀。于冰上放置5min。

F 4℃，12000rpm离心5min，将上清液转入另一个EP管中，加等量酚/氯仿抽提一次。

G转移上清液至另一个EP管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡，放置2min。，

H 4℃，12000rpm离心5min，去净上清液。用70％乙醇洗涤，干燥，乙醇挥尽。

I加入20μl三蒸水和1μl RNA酶溶解沉淀，于37℃放置30min，做好标记-20℃保存。

(b)PCR及双酶切鉴定

在蓝白斑上选择阳性(白斑)克隆，首先进行PCR反应检测。

PCR检测阳性的克隆进一步做双酶切检测。

将阳性克隆菌落扩大培养后提取质粒，建立20μl酶切体系：水12μl，10×Buffer 2μl，重组质粒DNA 5μl，BamH I、HindIII各0.5μl，37℃保温1h。

琼脂糖凝胶电泳检测：制备1％的琼脂糖凝胶，每孔点样10μl，以Maker II以及Takara DL 15000为参照，施加100伏电压，在1×TAE电泳缓冲液中电泳20分钟，于紫外灯下观察扩增片段大小，并用凝胶成像系统拍照。

(c)测序鉴定：将双酶切鉴定正确的重组质粒DNA送交大连Takara生物技术有限公司进行测序，并对测序结果进行分析。

(9)重组质粒双酶切处理和纯化

(a)应用碱裂解法小量抽提重组质粒，具体步骤如下：

A取出上述4个长出单克隆的平板。每一个平板挑取6个单克隆分别接入含50μg/ml硫酸卡那霉素/含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃条件下在全温振荡器中以200rpm的转速摇床振荡12-14h。

B取培养好的1-2ml菌液转移到1.5ml EP管中，以12000rpm的速度离心30秒，去上清。

C沉淀用100μl溶液I悬浮，剧烈振荡。

D加入200μl溶液II，轻轻颠倒EP管，使溶液与EP管的整个内表面接触，于冰上放置5min。

E加入150μl溶液III，在漩涡混合器上振荡2秒混匀。于冰上放置5min。

F 4℃，12000rpm离心5min，将上清液转入另一个EP管中，加等量酚/氯仿抽提一次。

G转移上清液至另一个EP管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡，放置2min。，

H 4℃，12000rpm离心5min，去净上清液。用70％乙醇洗涤，干燥，乙醇挥尽。

I加入20μl三蒸水和1μlRNA酶溶解沉淀，于37℃放置30min，做好标记-20℃保存。

(b)将重组质粒进行双酶切：

建立以下50μl的酶切反应体系：

水20μl，10×K Buffer 5μl，重组质粒20μl，BamH I、HindIII各2.5μl。37℃酶切1h.琼脂糖凝胶电泳检测：制备1％的琼脂糖凝胶，每孔点样10μl，以Maker II(100bp，300bp，500bp，700bp，900bp，1200bp)为参照，施加100伏电压，在1×TAE电泳缓冲液中电泳20分钟，于紫外灯下观察扩增片段大小，并用凝胶成像系统拍照。

切取目的片段所在的胶块，用宝生物工程(大连)有限公司的Agarose GelDNA Purification Kit回收纯化，具体步骤如2.2.1(4)。

(10)表达载体双酶切处理和纯化

将pQE质粒用限制性内切酶BamH I、HindIII进行双酶切；为防自连，同时加入牛肠碱性磷酸酶(CIAP)，建立20μl的酶切反应体系：

质粒1μl，10×K Buffer 2μl，BamH I 1μl，HindIII 1μl，CIAP 0.5μl，ddH₂O14.5μl。

37℃酶切1h。

琼脂糖凝胶电泳检测：制备1％的琼脂糖凝胶，每孔点样10μl，以Maker II以及Takara DL 15000为参照，施加100伏电压，在1×TAE电泳缓冲液中电泳20分钟，于紫外灯下观察扩增片段大小，并用凝胶成像系统拍照。

切取目的片段所对应的胶块，用宝生物工程(大连)有限公司的AgaroseGel DNA Purification Kit回收纯化。

(11)目的片段与表达载体的连接，得重组表达载体

将测序正确的重组质粒转化表达载体pQE30。取双酶切并纯化后的目的片段产物及经双酶切并纯化的pQE30克隆载体，分别建立以下20μl的连接反应体系：目的片段产物8μl，pQE302μl，Li gmix 10μl。16℃连接过夜。将连接产物于4℃保存备用。

重组表达载体转化大肠杆菌M15

(1)制备大肠杆菌M15感受态：

A把保存于-20℃的M15菌种于LB平板上划线，于37℃培养约12h，然后挑取单菌落于含10ml LB培养液的试管中，37℃条件下在全温振荡器中以200rpm的转速摇床振荡培养约12h。

B按1∶100比例扩大培养，即从上述菌液中取2ml转接到一个装有200mlLB的液体培养基的500ml的三角瓶中。37℃条件下在全温振荡器中以260rpm的转速摇床振荡培养2h至菌生长对数期，至OD₆₀₀为0.4-0.5。

C将细菌转移到一个无菌、用冰预冷的50ml的离心管中，在冰上放置10min，使培养物冷却到0℃。

D在4℃条件下以4000rpm离心10min收集细菌，去掉上清液，将离心管倒置1min，使培养液流尽。

E每50ml的初始培养液用冰冷的0.1M CaCl₂约30ml重悬菌体沉淀。

F在4℃条件下以4000rpm离心10min收集细菌，去掉上清液。

G重复操作步骤E、F，并将离心管倒置1min使液体流尽。

H每50ml初始培养液用200μl预冷的0.1M的CaCl₂重悬菌体沉淀，将悬好的菌液移入预冷的1.5ml EP管中，做好标记。每管加入0.5ml冻存液于-70℃保存。

(2)转化：

LB固体培养基平板准备：LB琼脂糖平板含有100g/ml氨苄青霉素和50g/ml硫酸卡那霉素。

把-70℃保存的M15感受态细菌取出，室温下解冻，然后放入冰浴中，把200μl感受态细菌分别加入10μl连接产物，混匀，在冰浴上放置30min，然后于42℃热激90秒，快速将其放入冰浴2min。加入800μl LB培养液，37℃条件下在全温振荡器中以50rpm的转速摇床振荡45min，然后4000rpm离心1min，吸去800μl培养液，再次悬浮菌液。将含连接产物的pQE30(+)/nebps菌液转移到100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml硫酸卡那霉素的LB固体培养基平板，将平板置于室温直至液体被吸收。倒置平板，于37℃条件下培养至长出单菌落(约16小时)。

(3)PCR及双酶切鉴定

挑选阳性克隆，首先进行PCR反应检测。选择PCR检测阳性的克隆进一步做双酶切检测。

将阳性克隆菌落扩大培养后提取质粒，建立20μl酶切体系：水12μl，10×KBuffer 2μl，重组质粒DNA 5μl，BamH I、HindIII各0.5μl，37℃保温1h。

琼脂糖凝胶电泳检测：制备1％的琼脂糖凝胶，每孔点样10μl，以Maker II以及Takara DL 15000为参照，施加100伏电压，在1×TAE电泳缓冲液中电泳20分钟，于紫外灯下观察扩增片段大小，并用凝胶成像系统拍照。

将该重组表达载体转化到大肠杆菌M15中，在IPTG的诱导下获得EbpS蛋白，利用Ni-NTA亲和层析将EbpS蛋白进行纯化后制备乳化抗原，将乳化抗原免疫宿主(新西兰兔子)，收集宿主血清，制备EbpS抗体制剂。

SEQUENCE LISTING

<110>胡成进；李传芬

<120>一种重组表达载体的基因序列及其构建方法

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

ggatccgtgt ctaataattt taaagatgac tttgaaa                37

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

ctggtgcaat gggtgtttct aagctt                            26

<210>3

<211>1052

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>含有金黄色葡萄球菌nEbpS蛋白基因

<400>3

ccaagcttgc atgcctgcag gtcgacgatt ggatccgtgt ctaataattt taaagatgac    60

tttgaaaaaa atcgtcaatc gatagacaca aattcacatc aagaccatac ggaagatgtt    120

gaaaaagacc aatcagaatt agaacatcag gatacaatag agaatacgga gcaacagttt    180

ccgccaagaa atgcccaaag aagaaaaaga cgccgtgatt tagcaacgaa tcataataaa    240

caagttcaca atgaatcaca aacatctgaa gacaatgttc aaaatgaggc tggcacaata    300

gatgatcgtc aagtcgaatc atcacacagt actgaaagtc aagaacctag ccatcaagac    360

agtacacctc aacatgaaga gggatattat aataagaatg cttttgcaat ggataaatca    420

catccagaac caatcgaaga caatgataaa cacgagacta ttaaagaagc agaaaataac    480

actgagcatt caacagtttc tgataagagt gaagctgaac aatctcagca acctaaacca    540

tattttgcaa caggtgctaa ccaagcaaat acatcaaaag ataaacatga tgatgtaact    600

gttaagcaag acaaagatga atctaaagat catcatagtg gtaaaaaagg cgcagcaatt    660

ggtgctggaa cagcgggtgt tgcaggtgca gctggtgcaa tgggtgtttc taagcttaat   720

ctctagagga tccccgggta ccgagctcga attcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg  780

actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca  840

gctggcgtaa tagcgaagag gctcgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga  900

atgcgaatgc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat tcacaccgca  960

tatggtgcac tctcagtaca tctgctctga tgcgcatagt tagcagcccg acacccgcca  1020

caccgctgac gcgccttgac ggctgtctgc tc                                1052

<210>4

<211>4100

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>含有金黄色葡萄球菌nEbpS蛋白基因

<400>4

ctcgagaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatagattca    60

attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag aggagaaatt aactatgaga    120

ggatcgcatc accatcacca tcacggatcc gtgtctaata attttaaaga tgactttgaa    180

aaaaatcgtc aatcgataga cacaaattca catcaagacc atacggaaga tgttgaaaaa    240

gaccaatcag aattagaaca tcaggataca atagagaata cggagcaaca gtttccgcca    300

agaaatgccc aaagaagaaa aagacgccgt gatttagcaa cgaatcataa taaacaagtt    360

cacaatgaat cacaaacatc tgaagacaat gttcaaaatg aggctggcac aatagatgat    420

cgtcaagtcg aatcatcaca cagtactgaa agtcaagaac ctagccatca agacagtaca    480

cctcaacatg aagagggata ttataataag aatgcttttg caatggataa atcacatcca    540

gaaccaatcg aagacaatga taaacacgag actattaaag aagcagaaaa taacactgag    600

cattcaacag tttctgataa gagtgaagct gaacaatctc agcaacctaa accatatttt    660

gcaacaggtg ctaaccaagc aaatacatca aaagataaac atgatgatgt aactgttaag    720

caagacaaag atgaatctaa agatcatcat agtggtaaaa aaggcgcagc aattggtgct    780

ggaacagcgg gtgttgcagg tgcagctggt gcaatgggtg tttctaagct taattagctg    840

agcttggact cctgttgata gatccagtaa tgacctcaga actccatctg gatttgttca    900

gaacgctcgg ttgccgccgg gcgtttttta ttggtgagaa tccaagctag cttggcgaga    960

ttttcaggag ctaaggaagc taaaatggag aaaaaaatca ctggatatac caccgttgat    1020

atatcccaat ggcatcgtaa agaacatttt gaggcatttc agtcagttgc tcaatgtacc    1080

tataaccaga ccgttcagct ggatattacg gcctttttaa agaccgtaaa gaaaaataag    1140

cacaagtttt atccggcctt tattcacatt cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccggaa    1200

tttcgtatgg caatgaaaga cggtgagctg gtgatatggg atagtgttca cccttgttac    1260

accgttttcc atgagcaaac tgaaacgttt tcatcgctct ggagtgaata ccacgacgat    1320

ttccggcagt ttctacacat atattcgcaa gatgtggcgt gttacggtga aaacctggcc    1380

tatttcccta aagggtttat tgagaatatg tttttcgtct cagccaatcc ctgggtgagt    1440

ttcaccagtt ttgatttaaa cgtggccaat atggacaact tcttcgcccc cgttttcacc    1500

atgggcaaat attatacgca aggcgacaag gtgctgatgc cgctggcgat tcaggttcat    1560

catgccgttt gtgatggctt ccatgtcggc agaatgctta atgaattaca acagtactgc    1620

gatgagtggc agggcggggc gtaatttttt taaggcagtt attggtgccc ttaaacgcct    1680

ggggtaatga ctctctagct tgaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg    1740

ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga caaatccgcc    1800

ctctagagct gcctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc    1860

ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc    1920

gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc gcagccatga cccagtcacg tagcgatagc    1980

ggagtgtata ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata    2040

tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgctcttccg    2100

cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc    2160

actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt    2220

gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc    2280

ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa    2340

acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc    2400

ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg    2460

cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc    2520

tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc    2580

gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca    2640

ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact    2700

acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg    2760

gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt    2820

ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct    2880

tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga    2940

gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa    3000

tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac    3060

ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga    3120

taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc    3180

cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca    3240

gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta    3300

gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg    3360

tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc    3420

gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg    3480

ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt    3540

ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt    3600

cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata    3660

ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc    3720

gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac    3780

ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa    3840

ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct    3900

tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat    3960

ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc    4020

cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca    4080

cgaggccctt tcgtcttcac                                                4100

Claims (7)

1、一种重组表达载体的基因序列，其特征在于该重组表达载体的基因序列中含有能够表达金黄色葡萄球菌nEbpS蛋白的基因序列。

2、根据权利要求1所述的重组表达载体的基因序列，其特征在于该重组表达载体的基因序列具有序列表中SEQ ID NO.4所述的碱基序列。

3、该重组表达载体的基因序列的构建方法，其特征在于构建方法的步骤包括：

(1)根据Genbank中ATCC25923标准菌株nEbpS基因序列，合成在5’端引入BamH I酶切位点的具有序列表中SEQ ID NO.1所述的碱基序列的上游引物；合成在5’端引入HindIII酶切位点的具有序列表中SEQ ID NO.2所述的碱基序列的下游引物；

(2)采用高保真酶、上游引物和下游引物利用PCR方法从金黄色葡萄球菌ATCC25923标准菌株基因组中扩增出nEbpS蛋白目的基因；

(3)PCR产物的回收和纯化；

(4)PCR产物的双酶切处理和纯化；

(5)克隆载体的双酶切处理及纯化；

(6)目的片段与克隆载体的连接；

(7)连接产物诱导转化宿主细胞感受态；

(8)培养转化后的宿主细胞，筛选、鉴定、扩培，抽提得重组质粒；

(9)重组质粒双酶切处理和纯化；

(10)表达载体双酶切处理和纯化；

(11)目的片段与表达载体的连接，得重组表达载体。

4、根据权利要求3所述的重组表达载体的基因序列的构建方法，其特征在于克隆载体采用pMD19-T。

5、根据权利要求3所述的重组表达载体的基因序列的构建方法，其特征在于宿主细胞选用DH5α大肠杆菌。

6、根据权利要求3所述的重组表达载体的基因序列的构建方法，其特征在于所述的筛选是对转化宿主细胞进行氨苄青霉素抗性菌株的筛选。

7、根据权利要求3所述的重组表达载体的基因序列的构建方法，其特征在于表达载体采用pQE30。

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