CN110055278B

CN110055278B - 一种新型腺病毒包装方法在CRISPR/Cas9基因编辑方法中的应用

Info

Publication number: CN110055278B
Application number: CN201910327804.5A
Authority: CN
Inventors: 姬广聚; 杨智广; 顾磊; 王会文; 黄雪; 黄海军; 李静
Original assignee: Shenzhen Hongji Biotechnology Co ltd
Current assignee: Yuansheng Biotechnology Qingdao Co ltd
Priority date: 2019-04-23
Filing date: 2019-04-23
Publication date: 2021-10-15
Anticipated expiration: 2039-04-23
Also published as: CN110055278A

Abstract

本发明实施例涉及生物技术领域，具体涉及一种新型腺病毒包装方法在CRISPR/Cas9基因编辑方法中的应用。本发明提供的腺病毒包装方法采用在体外进行连接的方法得到重组载体，避免了传统pAdEasy系统使用电转法使pAdEasy和穿梭质粒在细菌内发生同源重组的步骤，步骤简单，成功率高，且节省了腺病毒包装的时间，包装效率高，省时高效。本发明针对CRISPR/Cas9技术，设计了可用于新型腺病毒包装方法的pBlue‑DsRed‑Cas9和pBlue‑EGFP‑sgRNA等载体。对不同基因进行编辑时，只需改变pBlue‑EGFP‑sgRNA载体中sgRNA序列，pBlue‑DsRed‑Cas9载体可作为通用载体用于不同基因的编辑。本发明提供的新型腺病毒包装方法包装得到的腺病毒，用于CRISPR/Cas9技术，基因编辑效率高。

Description

一种新型腺病毒包装方法在CRISPR/Cas9基因编辑方法中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新型腺病毒包装方法在CRISPR/Cas9基因编辑方法中的应用。

背景技术

重组腺病毒具有广泛的应用，例如作为载体其可以高效运输、表达目的基因。与其它类型的病毒相比，腺病毒具有以下特点。首先，腺病毒可以感染不同类型的细胞，无论细胞处于分裂期或静息期。其次，腺病毒感染细胞后，其基因组不会整合到宿主细胞，因此致癌风险较低。第三，腺病毒经过一系列改造后包装容量比较大，可包装达到7.5kb的外源基因。另外，腺病毒的扩增比较简单，且容易得到高滴度的病毒进而获得理想的外源基因的表达。最近的研究表明利用腺病毒作为载体，可以将CRISPR/Cas9系统表达于宿主细胞，对宿主细胞进行高效的基因编辑。

常用的构建重组腺病毒的方法主要有两种，一种方法是直接将目的基因连接至腺病毒基因组，但因腺病毒基因组较大，可用的酶切位点较少，酶切位点选择受限制，限制了此方法的应用。另一种方法是将目的基因先克隆至中间质粒，然后利用细菌内的同源重组将中间质粒中外源基因整合到腺病毒基因组，此方法目前应用较为广泛，如AdEasy系统、AdMax系统等。

AdEasy系统是目前重组腺病毒的最常用体系，其操作步骤主要为：首先将目的基因通过酶切连接方式连接到穿梭载体(pShuttle，卡那霉素抗性)中，转化到DH5α、Top10等感受态细胞中；卡那霉素抗性LB培养基生长，酶切鉴定，阳性质粒应用PmeⅠ线性化再电击转化BJ5183-AD-1细菌(携带有pAdEasy-1质粒)，在细菌内pAdEasy-1和穿梭质粒发生同源重组；高浓度卡那霉素抗性LB培养基过夜生长后，出现大克隆和小克隆；挑选小克隆，酶切鉴定为阳性的质粒再经过转化XL10-Gold细胞，提取质粒，PacⅠ酶切线性化；转染AD-293细胞系，再经1-2周包装出病毒。该系统避免了在体外构建过大DNA腺病毒质粒的过程，与之前技术相比节省了数周时间。然而利用细菌内的同源重组过程耗时较长，阳性克隆筛选效率低，构建腺病毒时需要消耗大量劳动。

CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeatsassociated protein 9)是一类新型基因编辑技术，相较于ZFN、TALEN等基因编辑技术具有编辑效率高、脱靶率低、设计简便等诸多优点。应用重组病毒为载体将Cas9和针对特定位点设计的sgRNA导入细胞内进行高效基因编辑具有重要意义。由于传统AdEasy系统包装腺病毒有上述缺陷，开发一种新型腺病毒包装体系在CRISPR/Cas9基因编辑技术中显得十分重要。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

发明目的

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种新型腺病毒包装方法在CRISPR/Cas9基因编辑方法中的应用。本发明提供的腺病毒包装方法，采用在体外进行连接的方法得到重组载体，避免了传统pAdEasy系统使用电转法使pAdEasy和穿梭质粒在细菌内发生同源重组的步骤，步骤简单，成功率高，且节省了腺病毒包装的时间，腺病毒包装效率提高，省时高效。本发明使用的pAd-Blue载体是根据pAdEasy-1载体改造而成的新载体，pBlue载体(或pBlue载体的衍生载体)是根据pShuttle载体改造而成的新载体，二者可通过酶连接的方法连接到一起，操作简单，连接成功率高，可用于上述腺病毒包装方法。

本发明针对CRISPR/Cas9技术，设计了可用于新型腺病毒包装方法的pBlue-DsRed-Cas9和pBlue-EGFP-sgRNA等载体。对不同基因进行编辑时，只需改变pBlue-EGFP-sgRNA载体中sgRNA序列，pBlue-DsRed-Cas9载体可作为通用载体用于不同基因的编辑；还可将Cas9和sgRNA构建到同一个pBlue载体(或其衍生载体上)，利用本发明提供的腺病毒包装方法将Cas9和sgRNA包装到同一个腺病毒中。本发明提供的新型腺病毒包装方法包装得到的腺病毒，用于CRISPR/Cas9技术，基因编辑效率高。

解决方案

为实现本发明目的，本发明实施例提供了一种pAd-Blue载体，该载体是根据pAdEasy-1载体改造而成的新载体，其包括pAdEasy-1载体序列，和依次位于pAdEasy-1载体的Pac1酶切位点和pBR322Ori位点之间的LacZ基因和Cla1酶切位点。Pac1酶切位点、LacZ基因、Cla1酶切位点和pBR322Ori位点之间还可分别包含0-数百个bp的连接序列。

上述pAd-Blue载体在一种可能的实现方式中，所述pAd-Blue载体中，位于pAdEasy-1载体的Pac1酶切位点和pBR322Ori位点之间的序列包括SEQ ID NO.1所示序列或其互补序列或其反向互补序列。

本发明实施例还提供了一种pAd-Blue载体的构建方法，pAd-Blue载体通过改造pAdEasy-1载体得到，包括：在pAdEasy-1载体的Pac1酶切位点和pBR322Ori位点之间插入依次包含LacZ基因和Cla1酶切位点的序列。Pac1酶切位点、LacZ基因、Cla1酶切位点和pBR322Ori位点之间还可分别包含0-数百个bp的连接序列。

上述pAd-Blue载体的构建方法在一种可能的实现方式中，包括：

用Pac1和Cla1双酶切pAdEasy-1载体，取得到的pAdEasy-1大片段；

获得包括LacZ基因、Cla1酶切位点、pBR322Ori位点和氨苄霉素抗性基因序列的融合片段I；其中，融合片段I中，LacZ基因左侧，氨苄霉素抗性基因右侧，以及LacZ基因、Cla1酶切位点、pBR322Ori位点和氨苄霉素抗性基因之间，还可分别包含0-数百个bp的连接序列；融合片段I两侧末端序列采用本领域常用方法进行设计以使其能与pAdEasy-1大片段通过Gibson法连接即可，即融合片段I两侧末端序列分别包括与pAdEasy-1大片段的两侧末端序列同源的序列，如融合片段I两侧末端序列分别与pAdEasy-1大片段的两侧末端序列同源，单侧同源序列长度为25-300bp；因Gibson法连接效率极高，上述单侧同源序列存在数个碱基的差异时，也可以通过Gibson法连接；

将融合片段I与pAdEasy-1大片段通过Gibson法连接，得到pAd-Blue载体。

Gibson法为Daniel D Gibson等人开发的一种用于DNA大片段拼接的技术，其主要思路是：对两段具有末端同源序列的DNA片段，通过核酸外切酶降解，切出粘性末端，两段DNA片段同源的粘性末端互补配对，再通过DNA聚合酶聚合、连接酶连接，便可将任意两段合适大小的DNA片段拼接起来。

上述pAd-Blue载体的构建方法在一种可能的实现方式中，获得融合片段I的方法为本领域常规技术手段，有多种方法可选，如采用融合PCR法：将LacZ基因、Cla1酶切位点、pBR322Ori位点和氨苄霉素抗性基因序列及连接序列通过多重PCR得到融合片段I，多重PCR时，片段之间互相重合15-25bp；或直接人工合成融合片段I。

上述pAd-Blue载体的构建方法在一种可能的实现方式中，还包括pAd-Blue载体的鉴定步骤：将融合片段I与pAdEasy-1大片段通过Gibson法连接后，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，蓝白斑筛选蓝色的包含pAd-Blue载体的阳性克隆；从阳性克隆中提取质粒，Cla1酶切进行鉴定：Cla1酶切后可得到约30kb大片段和约3-4kb小片段的质粒，即确定为pAd-Blue载体。

本发明实施例还提供了一种pBlue载体，该载体为pShuttle载体改造而成的新载体，其与pShuttle载体的区别在于：位于BamH1酶切位点和Xba1酶切位点之间的序列替换为依次包括L序列、限制性内切酶B酶切位点和R序列的序列；其中，限制性内切酶B酶切位点包括pBlue载体上自带的酶切位点之外的酶切位点；可选地包括：EcoR1，Bcl2，Bgl2，Xba1或Sal1中的至少一种；进一步可选地为EcoR1；

L序列大小为10-300bp，包括与pAd-Blue载体上位于pBR322Ori位点左侧的Cla1酶切位点的左侧序列同源的序列；R序列大小为10-300bp，包括与pAd-Blue载体上位于氨苄霉素基因右侧的Cla1酶切位点的右侧序列同源的序列；可选地，L序列大小为10-40bp，40-150bp或150-250bp；R序列大小为10-40bp，40-150bp或150-250bp。

pBlue载体上的L序列和R序列来源于pAd-Blue载体，后续用于包装腺病毒时，需将pBlue载体用限制性内切酶B酶切，将pAd-Blue载体用Cla1酶切，然后将酶切后的pBlue载体和pAd-Blue载体通过Gibson法连接。故pBlue载体上的L序列和R序列的设计原则以限制性内切酶B酶切后能与Cla1酶切后的pAd-Blue载体通过Gibson法连接上即可，L序列和R序列可以有多种且均能实现本发明的目的。如，Cla1酶切后的pAd-Blue载体的末端会有AT两个碱基，为实现Gibson法的“无缝”连接，可在设计L序列和R序列时，在对应位置加上AT碱基；L序列和R序列上也可以不加AT碱基，Gibson法进行“有缝”连接，同样可以得到连接正确的产物(虽然概率低，但仍可以获得正确连接的产物)。再如：限制性内切酶B(如EcoR1)酶切pBlue载体后，切口处为碱基G，那么在设计L序列时，可寻找pAdBlue载体上Cla1酶切位点左侧序列(10-300bp左右处)的G碱基位点，从该位点右侧一位碱基处开始，选取一段序列，作为L序列；这样设计的L序列，可实现酶切后的pBlue载体和pAd-Blue载体有完全一致的末端同源序列(即可实现“无缝”连接)，可避免移码；但是，不从G碱基位点右侧一位碱基开始选取设计的L序列，同样可通过Gibson法得到正确连接的产物(虽然概率低，但仍可以获得正确连接的产物)。L序列和R序列的设计为分子克隆领域常用方法，本发明对此不做特别限定。

上述pBlue载体在一种可能的实现方式中，L序列包括SEQ ID NO.9所示序列或其互补序列或其反向互补序列；R序列包括SEQ ID NO.10所示序列或其互补序列或其反向互补序列。

本发明实施例还提供了一种pBlue载体的构建方法，pBlue载体通过改造pShuttle载体得到，包括：将pShuttle载体的BamH1酶切位点和Xba1酶切位点之间的序列替换为依次包括L序列、限制性内切酶B酶切位点和R序列的序列；

其中，限制性内切酶B酶切位点包括pBlue载体上自带的酶切位点之外的酶切位点；可选地包括：EcoR1，Bcl2，Bgl2，Xba1或Sal1中的至少一种；进一步可选地为EcoR1；

L序列大小为10-300bp，包括与pAd-Blue载体上位于pBR322 Ori位点左侧的Cla1酶切位点的左侧序列同源的序列；R序列大小为10-300bp，包括与pAd-Blue载体上氨苄霉素基因右侧Cla1酶切位点右侧的序列同源的序列；可选地，L序列大小为10-40bp，40-150bp或150-250bp；R序列大小为10-40bp，40-150bp或150-250bp。

上述pBlue载体的构建方法在一种可能的实现方式中，包括：

用BamH1和Xba1双酶切pShuttle载体，取得到的pShuttle载体大片段；

获得L序列和R序列；

获得包括BamH1酶切位点、L序列、限制性内切酶B酶切位点、R序列和Xba1酶切位点序列的融合片段II；

将融合片段II用BamH1和Xba1双酶切后，与pShuttle载体大片段连接，得到pBlue载体。

上述pBlue载体的构建方法在一种可能的实现方式中，获得融合片段II的方法为本领域常规技术手段，有多种方法可选，如采用融合PCR法：将BamH1酶切位点、L序列、限制性内切酶B酶切位点、R序列和Xba1酶切位点序列通过多重PCR得到融合片段II，多重PCR时，片段之间互相重合15-25bp；或直接人工合成融合片段II。

上述pBlue载体的构建方法在一种可能的实现方式中，还包括pBlue载体的鉴定步骤：将融合片段II与pShuttle载体大片段通过DNA连接酶进行连接后，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，利用卡那霉素筛选阳性克隆；从阳性克隆中提取质粒，BamH1和Xba1双酶切进行鉴定：BamH1和Xba1双酶切后可得到约5kb大片段和约500bp小片段的质粒，即确定为pBlue载体。

本发明实施例还提供了一种pBlue载体的衍生载体，所述衍生载体为连接有外源基因的pBlue载体。所述外源基因包括标签基因，和/或目的基因。

上述pBlue载体的衍生载体在一种可能的实现方式中，所述外源基因包括EGFP基因，和/或DsRed基因，和/或Cas9基因，和/或sgRNA基因。EGFP基因，和DsRed基因为常用的标签基因。外源基因的选择可根据实际需要进行，并不局限于上述列举的EGFP、DsRed、Cas9基因及sgRNA。

上述pBlue载体的衍生载体在一种可能的实现方式中，所述衍生载体为pBlue-EGFP载体，其为连接有EGFP基因序列的pBlue载体；可选地，其为连接有SV 40-EGFP-CMVpromotor基因序列的pBlue载体，所述SV 40-EGFP-CMV promotor基因序列包括SEQ IDNO.17所示序列或其互补序列或其反向互补序列。

上述pBlue载体的衍生载体在一种可能的实现方式中，所述衍生载体为pBlue-DsRed载体，其为连接有DsRed基因序列的pBlue载体；可选地，其为连接有SV 40-dsRed-CMVpromotor基因序列的pBlue载体，所述SV 40-dsRed-CMV promotor基因序列包括SEQ IDNO.20所示序列或其互补序列或其反向互补序列。

上述pBlue载体的衍生载体在一种可能的实现方式中，所述衍生载体为pBlue-DsRed-Cas9载体，其为连接有Cas9基因序列和DsRed基因序列的pBlue载体；可选地，其为连接有Cas9基因序列的pBlue-DsRed载体；进一步可选地，其为连接有2A-NLS-Cas9基因序列的pBlue-DsRed载体，所述2A-NLS-Cas9基因序列包括SEQ ID NO.26所示序列或其互补序列或其反向互补序列。

上述pBlue载体的衍生载体在一种可能的实现方式中，所述衍生载体为pBlue-EGFP-sgRNA载体，其为连接有sgRNA基因序列和EGFP基因序列的pBlue载体；可选地，其为连接有sgRNA基因序列的pBlue-EGFP载体；进一步可选地，其为连接有sgRNA-Lib基因序列的pBlue-EGFP载体，所述sgRNA-Lib基因序列包括SEQ ID NO.37所示序列或其互补序列或其反向互补序列。

本发明实施例还提供了一种pBlue载体的衍生载体的构建方法，包括：将外源基因克隆至pBlue载体；所述外源基因插入在pBlue载体的多克隆位点区域。

本发明实施例还提供了一种腺病毒包装方法，该方法包括：将pAdEasy-1载体或根据pAdEasy-1载体改造而成的载体，与携带有目的基因的pShuttle载体或携带有目的基因的根据pShuttle载体改造而成的载体，在体外进行连接，得到重组载体；进而转染AD293细胞系包装出携带目的基因的重组腺病毒。传统的腺病毒包装体系(AdEasy系统)，需将pAdEasy-1载体与携带有目的基因的pShuttle载体在细菌内进行同源重组，该方法需电转步骤，成功率低，且耗时较长。而本发明使用体外连接的方法，省时高效。

上述腺病毒包装方法在一种可能的实现方式中，所述根据pAdEasy-1载体改造而成的载体包括：pAd-Blue载体；所述根据pShuttle载体改造而成的载体包括：pBlue载体或pBlue载体的衍生载体。

上述腺病毒包装方法在一种可能的实现方式中，在体外进行连接的方法包括：Gibson法。

上述腺病毒包装方法在一种可能的实现方式中，包括：

限制性内切酶B酶切pBlue载体或pBlue载体的衍生载体；

Cla1酶切pAd-Blue载体；

通过Gibson法将线性化的pBlue载体或pBlue载体的衍生载体和Cla1酶切后的pAd-Blue载体连接，得重组载体；

将重组载体转化至大肠杆菌感受态细胞，利用卡那霉素和蓝白斑筛选阳性克隆；从阳性克隆中提取重组质粒，Pac1酶切，线性化重组质粒；将线性化后的重组质粒转染至AD293细胞系，数日后即可包装出携带外源基因的重组腺病毒。

本发明实施例还提供了由上述腺病毒包装方法包装得到的腺病毒。

本发明实施例还提供了pAd-Blue载体、pBlue载体、pBlue载体的衍生载体或上述腺病毒包装方法在CRISPR/Cas9基因编辑技术中的应用。

上述应用在一种可能的实现方式中，所述应用包括：

使用pAd-Blue载体和pBlue-DsRed-Cas9载体通过上述腺病毒包装方法包装表达Cas9蛋白的腺病毒；

使用pAd-Blue载体和pBlue-EGFP-sgRNA载体通过上述腺病毒包装方法包装表达sgRNA的腺病毒；

使用表达Cas9蛋白的腺病毒和表达sgRNA的腺病毒进行基因编辑。

有益效果

(1)本发明实施例提供了一种腺病毒包装的新方法，该方法包括：将pAdEasy-1载体或根据pAdEasy-1载体改造而成的载体与携带有目的基因的pShuttle载体或根据pShuttle载体改造而成的载体，在体外进行连接，得到重组载体，进而转染AD293细胞系包装出携带目的基因的重组腺病毒。传统的腺病毒包装体系(AdEasy系统)，需使用电转法将pAdEasy-1载体与携带有目的基因的pShuttle载体在细菌内进行同源重组，电转成功率低，且耗时较长。本发明实施例提供的在体外进行连接的方法避免了传统pAdEasy系统中，在细菌内pAdEasy和穿梭质粒发生同源重组的步骤，与电转法相比，不需要使用电转仪，步骤简单，成功率高，且节省了腺病毒包装的时间，腺病毒包装效率提高，省时高效。

(2)本发明实施例提供了pAd-Blue载体、pBlue载体及pBlue载体的衍生载体，pAd-Blue载体和pBlue载体(或pBlue载体的衍生载体)可在体外进行连接得到重组载体。经过改造pAdEasy-1载体得到的pAd-Blue载体，和经过改造pShuttle载体得到的pBlue载体(或pBlue载体的衍生载体)，通过Gibson法即可高效、正确地连接到一起，操作简单，连接成功率高。

(3)本发明实施例提供的pAd-Blue载体，该载体中引入了LacZ基因，LacZ基因为载体常用的筛选标记，引入该基因使得利用pAd-Blue载体进行分子克隆或利用pAd-Blue载体进行腺病毒包装时，还可采用蓝白斑筛选的方法筛选阳性克隆。腺病毒包装完，筛选阳性克隆时，这种双重筛选(蓝白斑加抗性筛选)方法，提高了阳性克隆的筛选效率(双重筛选，阳性克隆率可达95％以上；而传统Ad-Easy体系，10个克隆中一般只有2-3是阳性克隆)，进一步缩短了腺病毒包装的时间，提高包装效率。

(4)本发明实施例提供的利用pAd-Blue载体和pBlue载体的衍生载体(pBlue-DsRed-Cas9载体和pBlue-EGFP-sgRNA载体)，通过本发明提供的腺病毒包装方法，制备的表达Cas9的腺病毒和表达sgRNA的腺病毒，用于CRISPR/Cas9基因编辑技术，具有高效的基因编辑效率。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

图1是本发明实施例1的pAdBlue载体结构示意图。

图2是本发明实施例1的pAdBlue载体的构建流程图。

图3是本发明实施例2的pBlue载体结构示意图。

图4是本发明实施例2的pBlue载体构建流程图。

图5是本发明实施例3的pBlue-EGFP载体结构示意图。

图6是本发明实施例3的pBlue-DsRed载体结构示意图。

图7是本发明实施例3的pBlue-DsRed-Cas9载体结构示意图。

图8是本发明实施例3的pBlue-EGFP-sgRNA载体结构示意图。

图9是本发明实施例4腺病毒Ad-EGFP包装结果。

图10是本发明的pAd-Blue体系和AdEasy-1体系的实验步骤示意图。

图11是本发明实施例5腺病毒Ad-Cas9转染AD293细胞Cas9表达结果。

图12是本发明实施例6测序结果。

图13是本发明实施例6T7E1酶切结果。

图14是本发明实施例6Western blot检测celf1蛋白结果.

图15是本发明实施例6celf1蛋白水平统计结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

本发明实施例中的分子克隆部分，如酶切、连接、PCR、凝胶电泳、胶回收、转化、转染等实验步骤，均可参照《分子克隆实验指南(第四版)》(科学出版社，J.萨姆布鲁克、M.R.格林)相关章节进行。

以下实施例中：

大肠杆菌感受态Top10购自TransGen Biotech，大肠杆菌感受态Top10的转化步骤参照其说明书；

PAdEasy-1和pShuttle载体购自Agilent；

pMD-19T载体(TaKaRa公司，T载体)；

质粒和小片段DNA的回收采用Axygen的回收试剂盒；

大片段DNA(酶切后得到的pAdEasy-1大片段和pShuttle载体大片段)的回收采用酚氯仿抽提法；

所用的各种限制性内切酶均购自NEB(New England Biolabs)公司；

AD293细胞和H9C2细胞用添加了10％胎牛血清(FBS,Gibco)的DMEM培养基培养；AD293细胞组成型表达Adeasy缺失的E1基因；细胞的转染采用Thermo Fisher的Lipo2000或Lipo3000转染试剂，步骤参照说明书；转染后共聚焦显微镜(leica sp5)观察荧光信号；

Giboson体系如下：

4.8μl Q5buffer(NEB M0491)；4.8μl 25％PEG8000(sigma)；0.6μlT5Exonuclease,(NEB M0360)；1.6μl Taq DNA Ligas(NEB M0208)；0.3μl Q5High-Fidelity DNA Polymerase(NEB M0491)；2.4μl dNTP(2.5mM each,NEB)；0.5μl NAD(NEBB9007)；9μl DNA片段(两个DNA片段的物质的量比为1:1)；50℃反应1h；

PCR所用DNA聚合酶为Q5高保真DNA聚合酶(NEB)。

实施例1

pAd-Blue载体及其构建方法

1.pAd-Blue载体，其结构示意图如图1所示，其包括pAdeasy-1载体，改动是在Pac1酶切位点和pBR322Ori位点之间插入包括LacZ基因和Cla1酶切位点的序列；本实施例pAd-Blue载体中，Pac1酶切位点和pBR322Ori位点之间的序列如SEQ ID NO.1所示。

2.所述pAd-Blue载体的构建流程图如图2所示，构建方法包括如下步骤：

(1)选用pAdEasy-1载体，使用Pac1和Cla1双酶切(NEB公司)，酶切体系为：质粒800ng，Pac1 1μl，Cla1 1μl，10x CutSmat缓冲液10μl，双蒸水补至100μl；琼脂糖凝胶电泳后，得到4.1kb条带和约30kb大条带。紫外灯下切割30kb大条带，按胶回收试剂盒(Axygen公司)说明书回收大片段，50μl双蒸水溶解，NanoDrop仪测质粒浓度，得pAdEasy-1大片段，-20℃冻存备用；

(2)获得融合片段I(包括LacZ基因序列、Cla1酶切位点序列、pBR322Ori位点、氨苄霉素抗性基因序列及连接序列)：

A、扩增LacZ基因：

所用引物序列为：

Pac-lac-F(正向引物)：GTATA TTATT GATGA TGTTA ATTAA TGGCT TAACT ATGCGGCA(SEQ ID NO.2)；

LacZ-tail-R(反向引物)：GTAAG GGGGA TTTCT GTTCA TATCG ATGCC TTTGA GTGAGCTGAT AC(SEQ ID NO.3)；

模板选用pMD-19T载体(TaKaRa公司，T载体)；

PCR体系：模板1ng，Q5聚合酶(NEB公司)0.5μl，5xQ5Reagent Buffer 25μl，10mMDNTP Mix(康为世纪公司)1μl，正向引物(10μM)2.5μl，反向引物(10μM)2.5μl，ddH₂O补至50μl。37℃酶切过夜。

PCR条件：98℃2min；98℃10s，62℃10s，72℃30s(38个循环)；72℃2min；4℃保存。

B、扩增LacZ左侧连接序列：

所用引物序列为：

HEAD-F(正向引物)：CCCAC AACTTC CTCAA ATCG(SEQ ID NO.4)；

Pac-lac-R(反向引物)：TGCCG CATAG TTAAG CCATT AATTA ACATC ATCAA TAATATAC(SEQ ID NO.5)。

模板质粒使用pAdEasy-1；PCR体系及PCR条件同上。

C、扩增LacZ以右序列：

其中，LacZ以右序列包括Cla1酶切位点序列、pBR322Ori位点、氨苄霉素抗性基因序列及连接序列；

引物序列为：

LacZ-tail-F(正向引物)：GTATC AGCTC ACTCA AAGGC ATCGA TATGA ACAGA AATCCCCCTT AC(SEQ ID NO.6)；

TAIL-R(反向引物)：GTCAA GGTAG TAGAG TTTGC(SEQ ID NO.7)。

模板质粒使用pAdEasy-1；PCR体系及PCR条件同上。

D、融合PCR得到融合片段I：

将LacZ以左序列、LacZ基因、LacZ以右序列3个片段连接在一起：

模板：LacZ以左序列、LacZ基因、Lac以右序列各1ng；

引物：选用HEAD-F、TAIL-R；

退火温度为60℃，其余条件同上；

使用HEAD-F、TAIL-R两个引物对所得片段正反两方向测序，测序正确后备用，命名为融合片段I。

融合片段I序列如SEQ ID NO.8所示。

(3)将融合片段I与pAdEasy-1大片段通过Gibson法连接：

反应体系如下：

等物质的量的DNA片段10μl，2x Gibson Assembly Master Mix(NEB公司)10μl。

反应条件：50℃下反应1h。

连接产物即为pAd-Blue载体。

(4)pAd-Blue载体的鉴定：次日将上述得到连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞中，氨苄霉素LB固体培养基37℃培养16h，挑单克隆在含有氨苄霉素LB液体培养基试管37℃中摇菌约12h，速度为220rpm/min，使用质粒提取试剂盒(天跟公司)提取质粒，将质粒进行蓝白斑筛选，蓝色菌落为包含pAd-Blue载体的阳性克隆；

从蓝色菌落中提取质粒，Cla1酶切鉴定。

酶切体系为：质粒50ng，Cla1 0.1μl，10x CutSmat缓冲液2μl，双蒸水补至20μl，37℃酶切1h。

酶切产物进行电泳，得到了约30kb大片段和约3-4kb的小片段，即确定所提质粒为pAd-Blue载体。

实施例2

pBlue载体及其构建方法

1.pBlue载体，其结构示意图如图3所示，由图3可知，pBlue载体与pShuttle载体的差别在于：BamH1酶切位点和Xba1酶切位点之间的序列替换为包括L序列、EcoR1酶切位点和R序列的序列；其中，本实施例中，L序列如SEQ ID NO.9所示；

R序列如SEQ ID NO.10所示；

BamH1酶切位点和Xba1酶切位点之间的序列如SEQ ID NO.11所示。

2.所述pBlue载体的构建流程图如图4所示，构建方法包括如下步骤：

(1)取pShuttle载体，BamH1和Xba1双酶切；电泳分离酶切产物，胶回收试剂盒回收大片段，得pShuttle载体大片段，具体方法同上；

(2)选取L序列和R序列：

本实施例中，L序列的选取规则为：由于EcoR1切割后5'-3'端有G，因此在pAdBlue载体上选取同源序列时，应在位于pBR322Ori位点左侧的Cla1酶切位点向左找到G碱基后，从G碱基右侧一位碱基开始向右选取一段序列，作为L序列；此外，pAdBlue载体在Cla1酶切后5'-3'端有A和T碱基，因此在L序列最左侧加上AT碱基。

R序列选取规则：由于EcoR1切割后5'-3'端有G，因此在Adblue载体上选取同源序列时，应在位于氨苄霉素基因右侧的Cla1酶切位点向右找到G，然后选取G左侧一位碱基开始向左选取一段序列，作为R序列；此外，Adblue载体在Cla1酶切后5'-3'端有A和T碱基，因此在R序列最右侧加上AT碱基。

(3)获得融合片段II(包括BamH1-L序列-EcoR1酶切位点-R序列-Xba1酶切位点序列及位于序列两端的保护碱基)：

A、获得L’序列(包括BamH1-L序列-EcoR1酶切位点及位于序列两端的保护碱基)

L’序列引物：

L-F：CGGGA TCCAT GCCTT TGAGT GAGCT GATAC CG(SEQ ID NO.12)；

L-R：CCCCG AATTCT AACTC ACATT AATTG CGTTG CGC(SEQ ID NO.13)；

模板使用pMD-19T，退火温度64℃，其余PCR体系及PCR条件同上。

B、获得R’序列(包括EcoR1酶切位点-R序列-Xba1酶切位点及位于序列两端的保护碱基)

R’序列引物：

R-F：GTTAG AATTC GGGGC GACCA TCAAT GCTG(SEQ ID NO.14)；

R-R：GCTCT AGAAT TTCGA AACTA GCTTA AGGGT GGG(SEQ ID NO.15)；

模板使用pAdBlue载体，退火温度64℃，其余PCR体系及PCR条件同上。

C、将PCR得到的L’序列、R’序列，跑胶，切条带，进行胶回收，NanoDrop测浓度。

使用引物L-F、R-R，模板使用L’序列、R’序列，进行融合PCR扩增，扩增退火温度为68℃，其余融合PCR体系及融合PCR条件同上。

将融合PCR产物进行跑胶，切胶，胶回收，NanoDrop测浓度，使用引物L-F、R-R双向测序，测序正确后备用，命名为融合片段II。

PCR扩增产物融合片段II序列如SEQ ID NO.16所示。

D、将融合片段II用BamH1、Xba1双酶切，酶切体系同上，酶切产物跑胶，胶回收，NanoDrop测浓度，-20℃冻存备用。

(4)将酶切后的融合片段II与pShuttle载体大片段通过DNA连接酶进行连接，连接体系为：融合片段：载体片段物质的量比3：1，T4-DNA连接酶1μl(NEB公司)，5X DNA连接buffer 2μl，双蒸水补至10μl。室温连接过夜。

次日将上述得到连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞中，卡那霉素LB固体培养基37℃培养16h，挑单克隆在含有卡那霉素LB液体培养基试管37℃中摇菌，速度为220转/分钟，使用质粒提取试剂盒(天跟公司)提取质粒。使用BamH1、Xba1酶切鉴定，鉴定体系同上，酶切产物跑胶；比对Marker，大条带约3.2kb、小条带约400bp的质粒即为pBlue载体。

实施例3

pBlue衍生载体及其构建方法

1、pBlue载体的衍生载体pBlue-EGFP，其结构示意图如图5所示，其为连接了SV40-EGFP-CMV promotor基因序列的pBlue载体；所述SV 40-EGFP-CMV promotor基因序列如SEQ ID NO.17所示；

SV 40-EGFP-CMV promotor基因插入在pBlue载体的GOI(gene of interest)区，GOI(gene of interest)区为多克隆位点区域，可用于外源基因的插入；

pBlue载体的衍生载体pBlue-EGFP的构建方法包括下述步骤：

(1)选用pAdtrack质粒(Clontech公司)作为模板，通过PCR方法得到序列两端分别添加Kpn1、Not1酶切位点和保护碱基的SV 40-EGFP-CMV promotor序列，具体如下：

使用引物：

EGFP-F：GGGGT ACCCG CGTTA AGATA CATTG ATGAG TTTG(SEQ ID NO.18)；

EGFP-R：ATTTG CGGCC GCATC GCTAT TACCA TGGTG ATGCG(SEQ ID NO.19)；

退火温度为62℃，其余PCR体系及PCR条件同上；

使用EGFP-F、EGFP-R对PCR产物进行测序，测序结果显示正确后，备用；

PCR产物Kpn1-SV 40-EGFP-CMV promotor-Not1的序列(带有保护碱基)如下：

GG(保护碱基)-GGTACC(Kpn1酶切位点)-SEQ ID NO.17所示序列-GCGGCCGC(Not1酶切位点)-AAAT(保护碱基)；即PCR产物Kpn1-SV 40-EGFP-CMV promotor-Not1的序列为在SEQ ID NO.17所示序列的3’端多了保护碱基GG和Kpn1酶切位点GGTACC，在5’端多了Not1酶切位点GCGGCCGC和保护碱基AAAT。

(2)使用KpnI、NotI分别酶切pBlue载体和上述Kpn1-SV 40-EGFP-CMV promotor-Not1序列；

酶切体系同上；电泳跑胶，切胶回收pBlue载体片段(大小约6kb的条带)、SV 40-EGFP-CMV promotor序列(大小约1.3kb的条带)；

T₄连接酶连接过夜，步骤同上；

连接产物转化大肠杆菌Top10菌，涂板，挑单克隆，摇菌，提质粒，Kpn1、Not1双酶切鉴定，电泳跑胶，能得到3.5kb条带和1.3kb条带的质粒，即为pBlue-EGFP载体；

-20℃下保存质粒，同时保存菌液。

2、pBlue载体的衍生载体pBlue-DsRed载体，其结构示意图如图6所示，其为连接有SV 40-dsRed-CMV promotor基因序列的pBlue载体；所述SV 40-dsRed-CMV promotor基因序列如SEQ ID NO.20所示。

pBlue载体的衍生载体pBlue-DsRed的构建方法包括下述步骤：

(1)获得Kpn1-SV 40-dsRed-Age1序列

选用pDsred2-N1质粒(Clontech公司)作为模板，通过PCR方法得到在序列两端分别添加Kpn1、Age1酶切位点和保护碱基的dsRed-SV 40序列，具体如下；

选用引物：

Dsred-F：GGGGT ACCCG CTTAC AATTT ACGCC TTAAG ATACA(SEQ ID NO.21)；

Dsred-R：ATCGA CCGGT CACCG GTCGC CACCA TGG(SEQ ID NO.22)；

退火温度62℃，PCR体系及PCR条件同上；

使用Dsred-F、Dsred-R对PCR产物进行测序，测序结果显示正确后，备用；

PCR产物Kpn1-SV 40-dsRed-Age1的序列(带有保护碱基)如SEQ ID NO.23所示；

(2)获得Age1-CMV promotor-Not1序列：

选用pAdtrack质粒作为模板，通过PCR方法得到在序列两端分别添加Age1、Not1酶切位点和保护碱基的CMV promotor序列，具体如下：

选用引物：

CMV-F：ATCGA CCGGT AGCGC TAGCG GATC(SEQ ID NO.24)；

CMV-R：同引物EGFP-R；

退火温度62℃，PCR体系及PCR条件同上；

使用CMV-F、CMV-R对PCR产物进行测序，测序结果显示正确后，备用；

PCR产物Age1-CMV promotor-Not1序列(带有保护碱基)如SEQ ID NO.25所示。

(3)使用Kpn1、Not1酶切pBlue载体，使用Kpn1、Age I酶切dsRed-SV 40片段，使用Age1、Not1酶切CMV promotor片段；

酶切体系同上；电泳跑胶，切胶回收pBlue载体片段(大小约6kb的条带)、dsRed-SV40片段(大小约1kb的条带)，CMV promotor片段(大小约240bp的条带)，NanoDrop测浓度备用；

T₄连接酶连接过夜，3片段连接体系如下：

载体：CMV promotor片段：dsRed-SV 40片段的摩尔比＝1:3:3，其余成分同上；

连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，涂板，挑单克隆，摇菌，提质粒，Kpn1、Not1双酶切鉴定，跑胶，电泳跑胶，能得到约3.6kb条带、约350bp条带和约900bp条带的质粒，即为pBlue-DsRed载体；

-20℃下保存质粒，同时保存菌液。

3、pBlue载体的衍生载体pBlue-DsRed-Cas9载体，其结构示意图如图7所示，其为连接了2A-NLS-Cas9基因序列的pBlue-DsRed载体；所述2A-NLS-Cas9基因序列如SEQ IDNO.26所示。

pBlue载体的衍生载体pBlue-DsRed-Cas9在pBlue-DsRed的基础上进行构建，构建方法包括下述步骤：

(1)使用pLenti-OC-IRES-BSD(Zhou Y et al.Nature，2014，PMID:24717434)作为模板，使用如下引物通过PCR方法扩增得到2A-NLS-Cas9’序列：

Cas9-F：GCCGC CACCA CCTGT TCCTG GGAAG CGGAG CTACT AACTT CAGCC(SEQ IDNO.27)；

Cas9-R：TCTAG AGTCG CGGCC GCTTA TTATT TCTTT TTCTT AGCTT GACCA GCTTT C(SEQ ID NO.28)；

退火温度66℃，PCR体系及PCR条件同上；

将PCR产物测序，测序引物如下：

Cas9-F：如SEQ ID NO.27所示；

Cas9-R：如SEQ ID NO.28所示；

800-F：TGGGG AGAAG AAGAA CGGCC(SEQ ID NO.29)；

800-R：GGGAG CTGTG CGATG AGGTT(SEQ ID NO.30)；

1600-F：ATAAA AATCT GCCTA ACGAA(SEQ ID NO.31)；

2400-F：CCAAA CTACC CAGAA GGGAC(SEQ ID NO.32)；

3200-F：ACTTC TTTTA CAGCA ATATT(SEQ ID NO.33)；

4000-F：CAGGC AGAAA ACATT ATCCA(SEQ ID NO.34)；

测序正确后备用。

PCR产物2A-NLS-Cas9’的序列如下：

GCCGC CACCA CCTGT TCCT G-SEQ ID NO.26所示序列-TAAGC GGCCG CGACTCTAGA。即PCR产物2A-NLS-Cas9’的序列为在SEQ ID NO.26所示序列的3’端多了碱基GCCGCCACCA CCTGT TCCT G，在SEQ ID NO.26所示序列的5’端多了碱基TAAGC GGCCG CGACTCTAGA。

(2)获得pBlue-DsRed线性化片段：

使用pBlue-DsRed质粒作为模板，使用如下引物扩增pBlue-DsRed线性化片段：

Blue-dsred-F：GCTGG TCAAG CTAAG AAAAA GAAAT AATAA GCGGC CGCGA CTCTA GA(SEQ ID NO.35)；

Blue-dsred-R：AAGTT AGTAG CTCCG CTTCC CAGGA ACAGG TGGTG GCGG(SEQ IDNO.36)；

退火温度60℃，PCR体系及PCR条件同上；

使用引物Blue-dsred-F、Blue-dsred-R、Dsred-F、Dsred-R、L-F、L-R、R-F、R-R对Dsred测序，确保CMV-Dsred、SV40、L序列、R序列位置无突变；测序正确后备用。

(3)将pBlue-DsRed线性化片段、2A-NLS-Cas9片段电泳跑胶，切胶回收，NanoDrop测浓度备用；

使用Gibson法连接两个片段，连接体系同上；

连接产物转化大肠杆菌Top10菌，涂板，挑单克隆，摇菌，提质粒，Kpn1、Not1双酶切鉴定，跑胶，能得到一条4.6kb条带和4.5kb条带和1kb条带(4.6kb和4.5kb不易区分，也可显示两条带)的质粒，即为pBlue-DsRed-Cas9载体；

-20℃下保存质粒，同时保存菌液。

4.pBlue载体的衍生载体pBlue-EGFP-sgRNA载体，其结构示意图如图8所示，其为连接了sgRNA-Lib基因序列的pBlue-EGFP载体；所述sgRNA-Lib基因序列如SEQ ID NO.37所示。

pBlue-EGFP-sgRNA载体在pBlue-EGFP载体的基础上构建，构建方法包括下述步骤：

(1)使用pLenti-sgRNA-Lib(Zhou Y et al.Nature，2014，PMID:24717434)作为模板，使用如下引物通过PCR方法扩增得到带有保护碱基的sgRNA-Lib’序列：

gRNA-F：GGGGT ACCAA GGTCT GGCAG GAAG(SEQ ID NO.38)；

gRNA-R：CCGCT CGAGA AAAAA AGCAC CGACT C(SEQ ID NO.39)；

PCR条件及PCR体系同上；

PCR产物sgRNA-Lib用gRNA-F、gRNA-R双向测序无误后，备用。

PCR产物sgRNA-Lib’序列(带有保护碱基)如下：

GG(保护碱基)-SEQ ID NO.37所示序列-CGG(保护碱基)。即PCR产物sgRNA-Lib’序列为在SEQ ID NO.37所示序列的3’端多了保护碱基GG，在SEQ ID NO.37所示序列的5’端多了保护碱基CGG。

(2)使用Kpn1、Xho I分别酶切sgRNA-Lib’片段和pBlue-EGFP载体；

酶切体系同上；电泳跑胶，切胶回收pBlue-EGFP载体片段(大小约3.7kb的条带)、sgRNA-Lib’序列(大小约2.7kb的条带)；

T₄连接酶连接过夜，步骤同上；

连接产物转化大肠杆菌Top10菌，涂板，挑单克隆，摇菌，提质粒，Kpn1、Xho I双酶切鉴定，电泳跑胶，能得到3.7kb条带和2.7kb条带的质粒，即为pBlue-EGFP-sgRNA载体；

-20℃下保存质粒，同时保存菌液。

实施例4

一种腺病毒包装方法

使用实施例1提供的pAd-Blue载体和实施例3提供的pBlue-EGFP载体包装表达荧光蛋白EGFP的腺病毒Ad-EGFP，具体步骤如下：

(1)EcoR1酶切pBlue-EGFP载体，使其线性化，酚氯仿法回收；

(2)Cla1酶切pAd-Blue载体，使其线性化，酚氯仿法回收；

(3)将上述回收产物置于PCR离心管中进行Gibson连接，连接体系同上，得连接产物；

(4)将连接产物转化转化至大肠杆菌Top10细胞，利用卡那霉素和蓝白斑筛选阳性克隆：从卡那抗性培养基中挑选蓝色克隆，提取质粒，Pac1酶切进行鉴定，Pac1酶切后，电泳，出现3kb小片段及约30kb大片段两条条带的，为阳性；

共24个蓝色克隆，Pac1酶切鉴定结果显示，23个为阳性；阳性对照组AdEasy-1体系10个小克隆中，只有2个为阳性；

(5)取其中1个阳性质粒，Pac1酶切使其线性化，暴露出ITRs；电泳，酚氯仿法回收大片段；

(6)将上述回收产物利用Lipo3000转染试剂转染AD293细胞系；观察荧光蛋白表达情况，约一周后，可观察到重组腺病毒出毒，见图9；其中，阳性对照为传统的在细菌体内进行同源重组的AdEasy-1体系。由图9结果可知，AdBlue体系相比于Adeasy体系，具有相似的细胞感染效率。由图10本发明的pAd-Blue体系和AdEasy-1体系的实验步骤示意图可知，本发明提供的腺病毒包装方法，节省了包装时间。

实施例5

1、包装表达Cas9的腺病毒(Ad-Cas9)

使用实施例1提供的pAd-Blue载体和实施例3提供的pBlue-DsRed-Cas9载体包装表达Cas9蛋白的腺病毒Ad-Cas9：

腺病毒包装方法的具体步骤参照实施例4。

结果验证：转染成功后，AD293细胞中可观察到红色荧光；

Cas9的表达用RT-PCR验证，结果见图11。图11中，Ad-Red为使用实施例1提供的pAd-Blue载体和实施例3提供的pBlue-DsRed载体通过腺病毒包装方法包装得到的表达DsRed蛋白的腺病毒Ad-DsRed。

2、包装表达sgRNA的腺病毒(Ad-sgRNA)

使用实施例1提供的pAd-Blue载体和实施例3提供的pBlue-EGFP-sgRNA载体包装表达sgRNA的腺病毒Ad-sgRNA：

腺病毒包装方法的具体步骤参照实施例4。

结果验证：转染成功后，AD293细胞中可观察到绿色荧光。

实施例6

验证实施例5的表达Cas9的腺病毒(Ad-Cas9)和实施例5的表达sgRNA的腺病毒(Ad-sgRNA)的基因编辑效率

实验组：用腺病毒Ad-Cas9和腺病毒Ad-sgRNA注射H9C2细胞；其中，sgRNA结合位点位于celf1的第六外显子内；

对照组：只用腺病毒Ad-sgRNA注射H9C2细胞。

腺病毒感染7天后，提取细胞基因组作为模板，通过PCR扩增目标位点周围的序列(～1000bp)并测序，结果如图12所示。由图12可以看出，实验组在预测切割位点下游发现了DNA缺失。此外，通过T7E1酶切法在实验组检测到了indel突变，见图13。进一步，通过Western blot检测celf1蛋白水平，结果见图14和图15，由图14和15可知，实验组celf1蛋白水平显著下降。

而对照组未见DNA缺失或indel突变。

上述结果说明，本发明的pAdBlue体系包装的表达Cas9的腺病毒(Ad-Cas9)和表达sgRNA的腺病毒(Ad-sgRNA)在H9C2细胞中具有高效的基因编辑效率。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 中科广聚（北京）生物医学技术中心有限公司

<120> 一种新型腺病毒包装方法在CRISPR/Cas9 基因编辑方法中的应用

<130> 1050-180163F同

<160> 39

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1369

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa 60

ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gccattcgcc attcaggctg 120

cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa 180

gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt 240

tgtaaaacga cggccagtgc caagcttgca tgcctgcagg tcgacgatta tctctagagg 300

atccccgggt accgagctcg aattcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt 360

gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg 420

gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt 480

cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt 540

tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 600

tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg catcgatatg aacagaaatc ccccttacac 660

ggaggcatca gtgaccaaac aggaaaaaac cgcccttaac atggcccgct ttatcagaag 720

ccagacatta acgcttctgg agaaactcaa cgagctggac gcggatgaac aggcagacat 780

ctgtgaatcg cttcacgacc acgctgatga gctttaccgc agctgcctcg cgcgtttcgg 840

tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta 900

agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg 960

gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga tagcggagtg tatactggct taactatgcg 1020

gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc 1080

gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc 1140

tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc 1200

acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg 1260

aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat 1320

cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactat 1369

<210> 2

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

gtatattatt gatgatgtta attaatggct taactatgcg gca 43

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

gtaaggggga tttctgttca tatcgatgcc tttgagtgag ctgatac 47

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

cccacaactt cctcaaatcg 20

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

tgccgcatag ttaagccatt aattaacatc atcaataata tac 43

<210> 6

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

gtatcagctc actcaaaggc atcgatatga acagaaatcc cccttac 47

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

gtcaaggtag tagagtttgc 20

<210> 8

<211> 3528

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

cccacaactt cctcaaatcg tcacttccgt tttcccacgt tacgtcactt cccattttaa 60

gaaaactaca attcccaaca catacaagtt actccgccct aaaacctacg tcacccgccc 120

cgttcccacg ccccgcgcca cgtcacaaac tccaccccct cattatcata ttggcttcaa 180

tccaaaataa ggtatattat tgatgatgtt aattaatggc ttaactatgc ggcatcagag 240

cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga 300

aaataccgca tcaggcgcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg 360

gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta 420

agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgccaag 480

cttgcatgcc tgcaggtcga cgattatctc tagaggatcc ccgggtaccg agctcgaatt 540

cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca 600

acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca 660

cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc 720

attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt 780

cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 840

caaaggcatc gatatgaaca gaaatccccc ttacacggag gcatcagtga ccaaacagga 900

aaaaaccgcc cttaacatgg cccgctttat cagaagccag acattaacgc ttctggagaa 960

actcaacgag ctggacgcgg atgaacaggc agacatctgt gaatcgcttc acgaccacgc 1020

tgatgagctt taccgcagct gcctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca 1080

catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc 1140

ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc gcagccatga cccagtcacg 1200

tagcgatagc ggagtgtata ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga 1260

gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg 1320

cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg 1380

gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga 1440

aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 1500

gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 1560

aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 1620

gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 1680

ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 1740

cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 1800

ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 1860

actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 1920

tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 1980

gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 2040

ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 2100

cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 2160

ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt 2220

tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc 2280

agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc 2340

gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata 2400

ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg 2460

gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc 2520

cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct 2580

gcaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa 2640

cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt 2700

cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca 2760

ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac 2820

tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca 2880

acacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt 2940

tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc 3000

actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca 3060

aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata 3120

ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc 3180

ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc 3240

cgaaaagtgc cacctgtcta gctacgaatt cttcgacagc ttcgaaacta gaatcgattt 3300

cgaaactagc ttaagggtgg gaaagaatat ataaggtggg ggtcttatgt agttttgtat 3360

ctgttttgca gcagccgccg ccgccatgag caccaactcg tttgatggaa gcattgtgag 3420

ctcatatttg acaacgcgca tgcccccatg ggccggggtg cgtcagaatg tgatgggctc 3480

cagcattgat ggtcgccccg tcctgcccgc aaactctact accttgac 3528

<210> 9

<211> 197

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

atgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag 60

tgagcgagga agcggaagag cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga 120

ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg 180

caattaatgt gagttag 197

<210> 10

<211> 204

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

cggggcgacc atcaatgctg gagcccatca cattctgacg caccccggcc catgggggca 60

tgcgcgttgt caaatatgag ctcacaatgc ttccatcaaa cgagttggtg ctcatggcgg 120

cggcggctgc tgcaaaacag atacaaaact acataagacc cccaccttat atattctttc 180

ccacccttaa gctagtttcg aaat 204

<210> 11

<211> 405

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

atgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag 60

tgagcgagga agcggaagag cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga 120

ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg 180

caattaatgt gagttagaat tcggggcgac catcaatgct ggagcccatc acattctgac 240

gcaccccggc ccatgggggc atgcgcgttg tcaaatatga gctcacaatg cttccatcaa 300

acgagttggt gctcatggcg gcggcggctg ctgcaaaaca gatacaaaac tacataagac 360

ccccacctta tatattcttt cccaccctta agctagtttc gaaat 405

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

cgggatccat gcctttgagt gagctgatac cg 32

<210> 13

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

ccccgaattc taactcacat taattgcgtt gcgc 34

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

gttagaattc ggggcgacca tcaatgctg 29

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

gctctagaat ttcgaaacta gcttaagggt ggg 33

<210> 16

<211> 421

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

cgggatccat gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag 60

cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg 120

ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga 180

gcgcaacgca attaatgtga gttagaattc ggggcgacca tcaatgctgg agcccatcac 240

attctgacgc accccggccc atgggggcat gcgcgttgtc aaatatgagc tcacaatgct 300

tccatcaaac gagttggtgc tcatggcggc ggcggctgct gcaaaacaga tacaaaacta 360

cataagaccc ccaccttata tattctttcc cacccttaag ctagtttcga aattctagag 420

c 421

<210> 17

<211> 1245

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 17

cgcgttaaga tacattgatg agtttggaca aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg 60

ctttatttgt gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa 120

acaagttaac aacaacaatt gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga 180

ggttttttaa agcaagtaaa acctctacaa atgtggtatg gctgattatg atcagttatc 240

tagatccggt ggatctgagt ccggacttgt acagctcgtc catgccgaga gtgatcccgg 300

cggcggtcac gaactccagc aggaccatgt gatcgcgctt ctcgttgggg tctttgctca 360

gggcggactg ggtgctcagg tagtggttgt cgggcagcag cacggggccg tcgccgatgg 420

gggtgttctg ctggtagtgg tcggcgagct gcacgctgcc gtcctcgatg ttgtggcgga 480

tcttgaagtt caccttgatg ccgttcttct gcttgtcggc catgatatag acgttgtggc 540

tgttgtagtt gtactccagc ttgtgcccca ggatgttgcc gtcctccttg aagtcgatgc 600

ccttcagctc gatgcggttc accagggtgt cgccctcgaa cttcacctcg gcgcgggtct 660

tgtagttgcc gtcgtccttg aagaagatgg tgcgctcctg gacgtagcct tcgggcatgg 720

cggacttgaa gaagtcgtgc tgcttcatgt ggtcggggta gcggctgaag cactgcacgc 780

cgtaggtcag ggtggtcacg agggtgggcc agggcacggg cagcttgccg gtggtgcaga 840

tgaacttcag ggtcagcttg ccgtaggtgg catcgccctc gccctcgccg gacacgctga 900

acttgtggcc gtttacgtcg ccgtccagct cgaccaggat gggcaccacc ccggtgaaca 960

gctcctcgcc cttgctcacc atggtggcga ccggtagcgc tagcggatct gacggttcac 1020

taaaccagct ctgcttatat agacctccca ccgtacacgc ctaccgccca tttgcgtcaa 1080

tggggcggag ttgttacgac attttggaaa gtcccgttga ttttggtgcc aaaacaaact 1140

cccattgacg tcaatggggt ggagacttgg aaatccccgt gagtcaaacc gctatccacg 1200

cccattgatg tactgccaaa accgcatcac catggtaata gcgat 1245

<210> 18

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 18

ggggtacccg cgttaagata cattgatgag tttg 34

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 19

atttgcggcc gcatcgctat taccatggtg atgcg 35

<210> 20

<211> 1202

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 20

cgcttacaat ttacgcctta agatacattg atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc 60

agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta 120

taagctgcaa taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg 180

gggaggtgtg ggaggttttt taaagcaagt aaaacctcta caaatgtggt atggctgatt 240

atgatctaga gtcgcggccg cttacaggaa caggtggtgg cggccctcgg tgcgctcgta 300

ctgctccacg atggtgtagt cctcgttgtg ggaggtgatg tccagcttgg cgtccacgta 360

gtagtagccg ggcagctgca cgggcttctt ggccatgtag atggacttga actccaccag 420

gtagtggccg ccgtccttca gcttcagggc cttgtgggtc tcgcccttca gcacgccgtc 480

gcgggggtac aggcgctcgg tggaggcctc ccagcccatg gtcttcttct gcatcacggg 540

gccgtcggag gggaagttca cgccgatgaa cttcaccttg tagatgaagc agccgtcctg 600

cagggaggag tcctgggtca cggtcgccac gccgccgtcc tcgaagttca tcacgcgctc 660

ccacttgaag ccctcgggga aggacagctt cttgtagtcg gggatgtcgg cggggtgctt 720

cacgtacacc ttggagccgt actggaactg gggggacagg atgtcccagg cgaagggcag 780

ggggccgccc ttggtcacct tcagcttcac ggtgttgtgg ccctcgtagg ggcggccctc 840

gccctcgccc tcgatctcga actcgtggcc gttcacggtg ccctccatgc gcaccttgaa 900

gcgcatgaac tcggtgatga cgttctcgga ggaggccatg gtggcgaccg gtagcgctag 960

cggatctgac ggttcactaa accagctctg cttatataga cctcccaccg tacacgccta 1020

ccgcccattt gcgtcaatgg ggcggagttg ttacgacatt ttggaaagtc ccgttgattt 1080

tggtgccaaa acaaactccc attgacgtca atggggtgga gacttggaaa tccccgtgag 1140

tcaaaccgct atccacgccc attgatgtac tgccaaaacc gcatcaccat ggtaatagcg 1200

at 1202

<210> 21

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 21

ggggtacccg cttacaattt acgccttaag ataca 35

<210> 22

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 22

atcgaccggt caccggtcgc caccatgg 28

<210> 23

<211> 971

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 23

ggggtacccg cttacaattt acgccttaag atacattgat gagtttggac aaaccacaac 60

tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt 120

aaccattata agctgcaata aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca 180

ggttcagggg gaggtgtggg aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca aatgtggtat 240

ggctgattat gatctagagt cgcggccgct tacaggaaca ggtggtggcg gccctcggtg 300

cgctcgtact gctccacgat ggtgtagtcc tcgttgtggg aggtgatgtc cagcttggcg 360

tccacgtagt agtagccggg cagctgcacg ggcttcttgg ccatgtagat ggacttgaac 420

tccaccaggt agtggccgcc gtccttcagc ttcagggcct tgtgggtctc gcccttcagc 480

acgccgtcgc gggggtacag gcgctcggtg gaggcctccc agcccatggt cttcttctgc 540

atcacggggc cgtcggaggg gaagttcacg ccgatgaact tcaccttgta gatgaagcag 600

ccgtcctgca gggaggagtc ctgggtcacg gtcgccacgc cgccgtcctc gaagttcatc 660

acgcgctccc acttgaagcc ctcggggaag gacagcttct tgtagtcggg gatgtcggcg 720

gggtgcttca cgtacacctt ggagccgtac tggaactggg gggacaggat gtcccaggcg 780

aagggcaggg ggccgccctt ggtcaccttc agcttcacgg tgttgtggcc ctcgtagggg 840

cggccctcgc cctcgccctc gatctcgaac tcgtggccgt tcacggtgcc ctccatgcgc 900

accttgaagc gcatgaactc ggtgatgacg ttctcggagg aggccatggt ggcgaccggt 960

gaccggtcga t 971

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 24

atcgaccggt agcgctagcg gatc 24

<210> 25

<211> 272

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 25

atcgaccggt agcgctagcg gatctgacgg ttcactaaac cagctctgct tatatagacc 60

tcccaccgta cacgcctacc gcccatttgc gtcaatgggg cggagttgtt acgacatttt 120

ggaaagtccc gttgattttg gtgccaaaac aaactcccat tgacgtcaat ggggtggaga 180

cttggaaatc cccgtgagtc aaaccgctat ccacgcccat tgatgtactg ccaaaaccgc 240

atcaccatgg taatagcgat gcggccgcca at 272

<210> 26

<211> 4240

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 26

ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60

ggacctatgg ccccaaagaa gaagcggaag gtcggtatcc acggttccca gcagccatgg 120

acaagaagta ctccattggg ctcgatatcg gcacaaacag cgtcggctgg gccgtcatta 180

cggacgagta caaggtgccg agcaaaaaat tcaaagttct gggcaatacc gacgccacag 240

cataaagaag aacctcattg gcgccctcct gttcgactcc ggggagacgg ccgaagccac 300

gcggctcaaa agaacagcac ggcgcagata tacccgcaga aagaatcgga tctgctaccg 360

caggagatct ttagtaatga gatggctaag gtggatgact ctttcttcca taggctggag 420

gagtcctttt tggtggagga ggataaaaag cacgagcgcc acccaatctt tggcaatatc 480

gtggacaggt ggcgtaccat gaaaagtacc caaccatata tcatctgagg aagaagcttg 540

tagacagtac tgataaggct gacttgcggt tgatctatct cgcgctggcg catatgatca 600

aatttcgggg acattcctca tcgaggggga cctgaaccca gacaacagcg atgtcgacaa 660

actctttatc caactggttc agacttacaa tcagcttttc gaagagaacc cgatcaacgc 720

atccggagtt gacgccaaag aatcctgagc gctaggctgt ccaaatcccg gcggctcgaa 780

aacctcatcg cacagctccc tggggagaag aagaacggcc tgtttggtaa tcttatcgcc 840

ctgtcactcg ggctgacccc caactttaat ctaacttcga cctggccgaa gatgccaagc 900

ttcaactgag caaagacacc tacgatgatg atctcgacaa tctgctggcc cagatcggcg 960

accagtacgc agaccttttt ttggcggcaa agaacctgtc agacgccatt ctgctgagtg 1020

atattctgcg agtgaacacg gagatcacca aagcccgctg agcgctagta tgatcaagcg 1080

ctatgatgag caccaccaag acttgacttt gctgaaggcc cttgtcagac agcaactgcc 1140

tgagaagtac aaggaaattt tcttcgatca gtctaaaaat gctacgccgg atacattgac 1200

ggcggagcaa gccaggagga attttacaaa tttattaagc ccatcttgga aaaaatggac 1260

ggcaccgagg agctgctggt aaagcttaac agagaagatc tgttgcgcaa cagcgcactt 1320

tcgacaatgg aagcatcccc caccagattc acctgggcga actgcacgct atactcaggc 1380

ggcaagagga tttctacccc tttttgaaag ataacaggga aaagattgag aaaatctcac 1440

atttcggata ccctactatg taggccccct cgcccgggga aattccagat tcgcgtggat 1500

gactcgcaaa tcagaagaga ccatcactcc ctggaacttc gaggaagtcg tggataaggg 1560

ggctctgccc agtccttcat cgaaaggatg actaactttg ataaaaatct gcctaacgaa 1620

aaggtgcttc ctaaacactc tctgctgtac gagtacttca cagtttataa cgagctcacc 1680

aaggtcaaaa cgtcacagaa gggatgagaa agccagcatt cctgtctgga gagcagaaga 1740

aagctatcgt ggacctcctc ttcaagacga accggaaagt taccgtgaaa cagctcaaag 1800

aagactattt caaaaaattg aatgtttcga ctctgttgaa atcagcggag tggaggatcg 1860

cttcaacgca tccctgggaa cgtatcacga tctcctgaaa atcattaaag acaaggactt 1920

cctggacaat gaggagaacg aggcattctt gaggacattg tcctcaccct tacgttgttt 1980

gaagataggg agatgattga agaacgcttg aaaacttacg ctcatctctt cgacgacaaa 2040

gtcatgaaac agctcaagag gcgccgatat caggatgggg gcggctgtca agaaaactga 2100

tcaatgggat ccgagacaag cagagtggaa agacaatcct ggattttctt aagtccgatg 2160

gatttgccaa ccggaacttc atgcagttga tccatgagac tctctcacct ttaaggagga 2220

catccagaaa gcacaagttt ctggccaggg ggacagtctt cacgagcaca tcgctaatct 2280

tgcaggtagc ccagctatca aaaagggaat actgcagacc gttaggtcgt ggatgaactc 2340

gtcaaagtaa tgggaaggca taagcccgag aatatcgtta tcgagatggc ccgagagaac 2400

caaactaccc agaagggaca gaagaacagt agggaaagga tgaagaggat taagagggta 2460

taaaagaact ggggtcccaa atccttaagg aacacccagt tgaaaacacc cagcttcaga 2520

atgagaagct ctacctgtac tacctgcaga acggcaggga catgtacgtg gatcaggact 2580

ggacatcaat cggctctccg actacgacgt ggatcatatc gtgccccagt cttttctcaa 2640

agatgattct attgataata aagtgttgac aagatccgat aaaaatagag ggaagagtga 2700

taacgcccct cagaagaagt tgtcaagaaa atgaaaaatt attggcggca gctgctgaac 2760

gccaaactga tcacacaacg gaagttcgat aatctgacta aggctgaacg aggtggcctg 2820

tctgagttgg ataagcaggc ttcatcaaaa ggcagcttgt tgagacacgc cagatcacca 2880

agcacgtggc ccaaattctc gattcacgca tgaacaccaa gtacgatgaa aatgacaaac 2940

tgattcgaga ggtgaaagta ttactctgaa gtctaagctg gtctcagatt tcagaaagga 3000

ctttcagttt tataaggtga gagagatcaa caattaccac catgcgcatg atgcctacct 3060

gaatgcagtg gtaggcactg cacttatcaa aaaatatccc aagcttgaat ctgaatttgt 3120

ttacggagac tataaagtgt acgatgtagg aaaatgatcg caaagtctga gcaggaaata 3180

ggcaaggcca ccgctaagta cttcttttac agcaatatta tgaatttttt caagaccgag 3240

attacactgg ccaatggaga gattcggaag cgacacttat cgaaacaaac ggagaaacag 3300

gagaaatcgt gtgggacaag ggtagggatt tcgcgacagt ccggaaggtc ctgtccatgc 3360

cgcaggtgaa catcgttaaa aagaccgaag tacagaccgg ggcttctcca aggaaagtat 3420

cctcccgaaa aggaacagcg acaagctgat cgcacgcaaa aaagattggg accccaagaa 3480

atacggcgga ttcgattctc ctacagtcgc ttacagtgta ctggttgggc caaagtggag 3540

aaagggaagt ctaaaaaact caaaagcgtc aaggaactgc tgggcatcac aatcatggag 3600

cgatcaagct tcgaaaaaaa ccccatcgac tttctcgagg cgaaaggata taaaaggtca 3660

aaaaagacct catcattaag cttcccaagt actctctctt tgagcttgaa aacggccgga 3720

aacgaatgct cgctagtgcg ggcgagctgc agaaaggtaa cgagctggca ctgccctcta 3780

atacgttaat ttcttgtatc tggccagcca ctatgaaaag ctcaaagggt ctcccgaaga 3840

taatgagcag aagcagctgt tcgtggaaca acacaaacac taccttgatg agatcatcga 3900

gcaaataacg aattctccaa aagagtgatc ctcgccgacg ctaacctcga taaggtgctt 3960

tctgcttaca ataagcacag ggataagccc atcagggagc aggcagaaaa cattatccac 4020

ttgtttactc tgaccacttg ggcgcgcctg cagccttcaa gtacttcgac accaccatag 4080

acagaaagcg gtacacctct acaaaggagg tcctggacgc cacactgatt catcagtcaa 4140

ttacggggct ctatgaaaca agatcgacct ctctcagctc ggtggagaca agcgtcctgc 4200

tgctactaag aaagctggtc aagctaagaa aaagaaataa 4240

<210> 27

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 27

gccgccacca cctgttcctg ggaagcggag ctactaactt cagcc 45

<210> 28

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 28

tctagagtcg cggccgctta ttatttcttt ttcttagctt gaccagcttt c 51

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 29

tggggagaag aagaacggcc 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 30

gggagctgtg cgatgaggtt 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 31

ataaaaatct gcctaacgaa 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 32

ccaaactacc cagaagggac 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 33

acttctttta cagcaatatt 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 34

caggcagaaa acattatcca 20

<210> 35

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 35

gctggtcaag ctaagaaaaa gaaataataa gcggccgcga ctctaga 47

<210> 36

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 36

aagttagtag ctccgcttcc caggaacagg tggtggcgg 39

<210> 37

<211> 2729

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 37

ggtaccaagg tctggcagga agagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata 60

cgatacaagg ctgttagaga gataattaga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta 120

gtacaaaata cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta 180

tgttttaaaa tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct 240

ttatatatct tgtggaaagg acgaaacacc gagagacgct ggcttatcga aattaatacg 300

actcactata gggagaccca agctggctag ttaagctatc aacaagtttg tacaaaaaag 360

ctgaacgaga aacgtaaaat gatataaata tcaatatatt aaattagatt ttgcataaaa 420

aacagactac ataatactgt aaaacacaac atatccagtc actatgaatc aactacttag 480

atggtattag tgacctgtag tcgaccgaca gccttccaaa tgttcttcgg gtgatgctgc 540

caacttagtc gaccgacagc cttccaaatg ttcttctcaa acggaatcgt cgtatccagc 600

ctactcgcta ttgtcctcaa tgccgtatta aatcataaaa agaaataaga aaaagaggtg 660

cgagcctctt ttttgtgtga caaaataaaa acatctacct attcatatac gctagtgtca 720

tagtcctgaa aatcatctgc atcaagaaca atttcacaac tcttatactt ttctcttaca 780

agtcgttcgg cttcatctgg attttcagcc tctatactta ctaaacgtga taaagtttct 840

gtaatttcta ctgtatcgac ctgcagactg gctgtgtata agggagcctg acatttatat 900

tccccagaac atcaggttaa tggcgttttt gatgtcattt tcgcggtggc tgagatcagc 960

cacttcttcc ccgataacgg agaccggcac actggccata tcggtggtca tcatgcgcca 1020

gctttcatcc ccgatatgca ccaccgggta aagttcacgg gagactttat ctgacagcag 1080

acgtgcactg gccaggggga tcaccatccg tcgcccgggc gtgtcaataa tatcactctg 1140

tacatccaca aacagacgat aacggctctc tcttttatag gtgtaaacct taaactgcat 1200

ttcaccagcc cctgttctcg tcagcaaaag agccgttcat ttcaataaac cgggcgacct 1260

cagccatccc ttcctgattt tccgctttcc agcgttcggc acgcagacga cgggcttcat 1320

tctgcatggt tgtgcttacc agaccggaga tattgacatc atatatgcct tgagcaactg 1380

atagctgtcg ctgtcaactg tcactgtaat acgctgcttc atagcatacc tctttttgac 1440

atacttcggg tatacatatc agtatatatt cttataccgc aaaaatcagc gcgcaaatac 1500

gcatactgtt atctggcttt tagtaagccg gatccacgcg gcgtttacgc cccccctgcc 1560

actcatcgca gtactgttgt aattcattaa gcattctgcc gacatggaag ccatcacaaa 1620

cggcatgatg aacctgaatc gccagcggca tcagcacctt gtcgccttgc gtataatatt 1680

tgcccatggt gaaaacgggg gcgaagaagt tgtccatatt ggccacgttt aaatcaaaac 1740

tggtgaaact cacccaggga ttggctgaga cgaaaaacat attctcaata aaccctttag 1800

ggaaataggc caggttttca ccgtaacacg ccacatcttg cgaatatatg tgtagaaact 1860

gccggaaatc gtcgtggtat tcactccaga gcgatgaaaa cgtttcagtt tgctcatgga 1920

aaacggtgta acaagggtga acactatccc atatcaccag ctcaccgtct ttcattgcca 1980

tacggaattc cggatgagca ttcatcaggc gggcaagaat gtgaataaag gccggataaa 2040

acttgtgctt atttttcttt acggtcttta aaaaggccgt aatatccagc tgaacggtct 2100

ggttataggt acattgagca actgactgaa atgcctcaaa atgttcttta cgatgccatt 2160

gggatatatc aacggtggta tatccagtga tttttttctc cattttagct tccttagctc 2220

ctgaaaatct cgataactca aaaaatacgc ccggtagtga tcttatttca ttatggtgaa 2280

agttggaacc tcttacgtgc cgatcaacgt ctcattttcg ccaaaagttg gcccagggct 2340

tcccggtatc aacagggaca ccaggattta tttattctgc gaagtgatct tccgtcacag 2400

gtatttattc ggcgcaaagt gcgtcgggtg atgctgccaa cttagtcgac tacaggtcac 2460

taataccatc taagtagttg attcatagtg actggatatg ttgtgtttta cagtattatg 2520

tagtctgttt tttatgcaaa atctaattta atatattgat atttatatca ttttacgttt 2580

ctcgttcagc tttcttgtac aaagtggttg atctagaggg cccgcggttc gaacgtctct 2640

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 2700

ggcaccgagt cggtgctttt tttctcgag 2729

<210> 38

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 38

ggggtaccaa ggtctggcag gaag 24

<210> 39

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 39

ccgctcgaga aaaaaagcac cgactc 26

Claims

1.一种腺病毒包装方法在CRISPR/Cas9基因编辑方法中的应用，所述腺病毒包装方法包括：将根据pAdEasy-1载体改造而成的载体，与携带有目的基因的根据pShuttle载体改造而成的载体，在体外进行连接，得到重组载体；进而转染AD293细胞系包装出携带目的基因的重组腺病毒；其中：

在体外进行连接的方法为：Gibson法；

根据pAdEasy-1载体改造而成的载体为：pAd-Blue载体；所述pAd-Blue载体，其包括pAdEasy-1载体序列，和依次位于pAdEasy-1载体的Pac1酶切位点和pBR322 Ori位点之间的LacZ基因和Cla1酶切位点；位于pAdEasy-1载体的Pac1酶切位点和pBR322 Ori位点之间的序列包括SEQ ID NO.1所示序列或其互补序列或其反向互补序列；

pAd-Blue载体的构建方法包括：用Pac1和Cla1双酶切pAdEasy-1载体，取得到的pAdEasy-1大片段；获得包括LacZ基因、Cla1酶切位点、pBR322 Ori位点和氨苄霉素抗性基因序列的融合片段I；其中，融合片段I中，LacZ基因左侧，氨苄霉素抗性基因右侧，以及LacZ基因、Cla1酶切位点、pBR322 Ori位点和氨苄霉素抗性基因之间，还分别包含0-数百个bp的连接序列；融合片段I两侧末端序列分别包括与pAdEasy-1大片段的两侧末端序列同源的序列；将融合片段I与pAdEasy-1大片段通过Gibson法连接，得到pAd-Blue载体；

根据pShuttle载体改造而成的载体为：pBlue载体的衍生载体；

所述pBlue载体，其与pShuttle载体的区别在于：位于BamH1酶切位点和Xba1酶切位点之间的序列替换为依次包括L序列、限制性内切酶B酶切位点和R序列的序列；

其中，限制性内切酶B酶切位点包括pBlue载体上自带的酶切位点之外的酶切位点；所述限制性内切酶B酶切位点包括：EcoR1，Bcl2，Bgl2，Xba1或Sal1中的至少一种；L序列包括SEQ ID NO.9所示序列或其互补序列或其反向互补序列；R序列包括SEQ ID NO.10所示序列或其互补序列或其反向互补序列；

pBlue载体的构建方法包括：用BamH1和Xba1双酶切pShuttle载体，取得到的pShuttle载体大片段；获得L序列和R序列；获得包括BamH1酶切位点、L序列、限制性内切酶B酶切位点、R序列和Xba1酶切位点序列的融合片段II；将融合片段II用BamH1和Xba1双酶切后，与pShuttle载体大片段连接，得到pBlue载体；

所述pBlue载体的衍生载体为：连接有外源基因的pBlue载体；所述外源基因包括：EGFP基因，和/或DsRed基因，和/或Cas9基因，和/或sgRNA基因；

所述pBlue载体的衍生载体为连接有SV 40-EGFP-CMV promotor基因序列的pBlue载体，所述SV 40-EGFP-CMV promotor基因序列包括SEQ ID NO.17所示序列或其互补序列或其反向互补序列；或，所述衍生载体为连接有SV 40-dsRed-CMV promotor基因序列的pBlue载体，所述SV 40-dsRed-CMV promotor基因序列包括SEQ ID NO.20所示序列或其互补序列或其反向互补序列；或，所述衍生载体为连接有Cas9基因序列的pBlue-DsRed载体；或，所述衍生载体为pBlue-DsRed-Cas9载体，其为连接有2A-NLS-Cas9基因序列的pBlue-DsRed载体，所述2A-NLS-Cas9基因序列包括SEQ ID NO.26所示序列或其互补序列或其反向互补序列；或，所述衍生载体为连接有sgRNA-Lib基因序列的pBlue-EGFP载体，所述sgRNA-Lib基因序列包括SEQ ID NO.37所示序列或其互补序列或其反向互补序列；

所述腺病毒包装方法包括下述步骤：限制性内切酶B酶切pBlue载体的衍生载体；Cla1酶切pAd-Blue载体；通过Gibson法将线性化的pBlue载体的衍生载体和Cla1酶切后的pAd-Blue载体连接，得重组载体；将重组载体转化至大肠杆菌感受态细胞，利用卡那霉素和蓝白斑筛选阳性克隆；从阳性克隆中提取重组质粒，Pac1酶切，线性化重组质粒；将线性化后的重组质粒转染至AD293细胞系，数日后即可包装出携带外源基因的重组腺病毒；

CRISPR/Cas9基因编辑方法包括：

使用pAd-Blue载体和pBlue-DsRed-Cas9载体通过所述腺病毒包装方法包装表达Cas9蛋白的腺病毒；

使用pAd-Blue载体和pBlue-EGFP-sgRNA载体通过所述腺病毒包装方法包装表达sgRNA的腺病毒；