CN107429263A

CN107429263A - 调控基因组编辑的方法

Info

Publication number: CN107429263A
Application number: CN201680016284.0A
Authority: CN
Inventors: 亓磊; 丁胜; 于晨
Original assignee: University of California; Leland Stanford Junior University; J David Gladstone Institutes
Current assignee: University of California; Leland Stanford Junior University; J David Gladstone Institutes
Priority date: 2015-01-15
Filing date: 2016-01-14
Publication date: 2017-12-01
Also published as: WO2016115326A1; US20180016601A1

Abstract

本文提供了用于调控靶DNA基因组编辑的方法和试剂盒。本发明包括利用小分子增强或抑制靶DNA序列中同源介导修复(HDR)和/或非同源性末端接合(NHEJ)途径的双链断裂修复。本文还提供了预防或治疗对象的基因疾病的方法，该方法通过增强精确的基因组编辑来校正与该基因疾病相关的靶基因突变。本发明还提供了筛选小分子文库以鉴定基因组编辑新型调节剂的系统和方法。本发明可用于任何类型的细胞，以及适用于核酸酶介导的基因组编辑技术的任何基因位点。

Description

调控基因组编辑的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年1月15日提交的美国临时专利申请号为62/104,035的优先权，其全部内容通过引用并入本文用于所有目的。

关于联合资助的研究与开发的专利权声明

本发明在国立卫生研究院提供的DP5OD017887、OD017887、DA036858号和国家心肺血液研究院提供的U01HL107436号的政府资助下完成。政府拥有本发明的某些权利。

发明背景

已经发现，细菌和古细菌可以利用短RNA来靶向和指导外源核酸的降解。这种RNA引导的防御系统被称为成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR/CRISPR相关的(Cas))系统，其涉及获取并整合来自外源DNA的靶向间隔序列到CRISPR基因位点，表达和处理含有间隔重复单元的短引导CRISPR RNAs，并切割与间隔序列互补的DNA，以使外源DNA沉默。目前，CRISPR/Cas系统已经被改造成用于细胞和动物模型的靶向基因组编辑的工具。核酸引导的Cas核酸酶可以通过指定其引导核酸(例如靶向DNA的RNA)中的短核苷酸序列，在目标基因组位点诱导双链断裂(DSB)。在目标位点进行切割后，可以通过非同源性末端接合(NHEJ)和/或同源介导修复(HDR)途径发生DNA损伤修复。在没有修复模板的情况下，DSB可以通过NHEJ重新连接，其遗留插入/缺失(indel)突变。或者，在外源引入的修复模板的存在下，发生HDR。修复模板可以是具有位于插入位点两侧的同源臂的靶向双链DNA的构建物,或是具有同源臂的单链寡核苷酸。

虽然CRISPR/Cas系统是一种高特异性且高效的基因工程方法，但是它很容易产生脱靶修饰。最小化脱靶DNA修饰发生的策略可以包括优化系统中Cas9酶的浓度，选择目标基因组中具有最少相似序列数量的靶序列，并利用双缺口策略在目标位点引入双链断裂。本领域需要一种用于调控CRISPR/Cas系统以及其他核酸酶介导的方法中的HDR和/或NHEJ介导的修复的简单而有效的方法。本发明满足了这一需求及其它需求。

发明的简要描述

本发明提供了用于调控靶DNA基因组编辑的方法和试剂盒。本发明包括利用小分子增强或抑制靶DNA序列中同源介导修复(HDR)和/或非同源性末端接合(NHEJ)途径的双链断裂修复。本发明还提供了预防或治疗对象疾病的方法，该方法通过增强精确的基因编辑来校正与该疾病相关的靶基因突变。本发明还提供了筛选小分子文库以鉴定基因组编辑新型调节剂的系统和方法。本发明可用于任何类型的细胞，以及任何适用于核酸酶介导的基因组编辑技术的基因位点。

本文中所公开的方法、试剂盒和系统可用于离体治疗。离体治疗包括向对象(例如，患者)施用体外产生或修饰的组合物(例如，细胞)。在一些实施方式中，所述的组合物(例如，细胞)通过本文公开的方法产生或修饰。例如，筛选基因组编辑调节剂的方法可用于发现增强同源重组(例如，在CRISPR/Cas系统中)的新型组合物(例如，小分子)，其可反过来用于离体治疗(例如，利用筛选方法发现的新型组合物修饰的细胞)。例如，所述的离体治疗包括向对象(例如，患者)施用体外产生或修饰的组合物(例如，细胞)。

在一些实施方式中，所述的组合物(例如，细胞)来自需进行离体治疗的对象(例如，患者)。在一些实施方式中，所述的离体治疗包括基于细胞的疗法，例如过继免疫治疗。

在第一方面，本发明提供了一种调控细胞中靶DNA基因组编辑的方法，所述方法包括：

(a)向细胞中导入DNA核酸酶或编码DNA核酸酶的核苷酸序列，其中，DNA核酸酶能够在靶DNA中产生双链断裂，从而诱导靶DNA的基因组编辑；和

(b)在调控DNA核酸酶诱导的靶DNA基因组编辑的条件下，将细胞与小分子化合物接触。

在第二方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含：(a)DNA核酸酶或编码DNA核酸酶的核苷酸序列；和(b)调控细胞中靶DNA基因组编辑的小分子化合物。

在第三方面，本发明提供了一种预防或治疗对象的基因疾病的方法，所述方法包括：

(a)向所述对象施用足够量的DNA核酸酶或编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列，从而校正与所述基因疾病相关的靶基因突变；和

(b)向对象施用足够量的小分子化合物以增强DNA核酸酶的作用。

在第四方面，本发明提供了一种鉴定调控细胞中靶DNA基因组编辑的小分子化合物的系统，所述系统包括：

(a)第一重组表达载体，其包含编码Cas9多肽或其变体的核苷酸序列；

(b)第二重组表达载体，其包含与启动子可操作地连接的编码靶向DNA的RNA的核苷酸序列，其中，所述的核苷酸序列包含：

(i)与靶DNA互补的第一核苷酸序列；和

(ii)与Cas9多肽或其变体相互作用的第二核苷酸序列；和

(c)重组供体修复模板，其包含：

(i)报告盒，其包含与编码自切割肽的核苷酸序列可操作地连接的编码报告多肽的核苷酸序列；和

(ii)包含靶DNA的两个非重叠同源部分的两条核苷酸序列，其中，所述的核苷酸序列位于报告盒的5’端和3’端。

在第五方面，本发明提供了一种包括上述系统和使用说明书的试剂盒。

在第六方面，本发明提供了一种鉴定调控细胞中靶DNA基因组编辑的小分子化合物的方法，所述方法包括：

(a)向细胞中导入：

(i)第一重组表达载体，其包含编码Cas9多肽或其变体的核苷酸序列，

(ii)第二重组表达载体，其包含与启动子可操作地连接的编码靶向DNA的RNA的核苷酸序列，其中，所述的核苷酸序列包含与靶DNA互补的第一核苷酸序列和与Cas9多肽或其变体相互作用的第二核苷酸序列，和

(iii)重组供体修复模板，其包含一报告盒，所述报告盒包含与编码自切割肽的核苷酸序列可操作地连接的编码报告多肽的核苷酸序列，和包含靶DNA的两个非重叠同源部分的两条核苷酸序列，其中，所述两条核苷酸序列位于报告盒的5’端和3’端。

从而产生一修饰的细胞；

(b)将修饰的细胞与小分子化合物接触；

(c)检测修饰的细胞中报告多肽的水平；和

(d)与步骤(b)之前的水平相比，如果报告多肽的水平增加或降低，则确定小分子化合物调控基因组编辑。

在另一方面，本发明提供了筛选基因组编辑调节剂的方法，包括：(a)将经由核酸酶介导的基因组编辑的细胞与小分子化合物接触；和(b)比较接触的细胞中核酸酶介导的靶DNA序列的基因组编辑效率与未与小分子化合物接触的对照细胞的效率，其中小分子化合物提高核酸酶介导的基因组编辑的效率至少1.1倍。在一些实施方式中，基因编辑的调节剂可用于增加基因组编辑的效率。在一些情况下，基因组编辑的调节剂可用于降低细胞毒性。

在一些实施方式中，筛选基因组编辑调节剂的方法可用于离体治疗。例如，筛选基因组编辑调节剂的方法可用于发现增强同源重组(例如，在CRISPR/Cas系统中)的新型组合物(例如，小分子)，其可反过来用于离体治疗(例如，利用筛选方法发现的新型组合物修饰的细胞)。离体治疗包括向对象(例如，患者)施用体外产生或修饰的组合物(例如，细胞)。在一些实施方式中，所述的组合物(例如，细胞)通过本文公开的方法产生或修饰。在一些实施方式中，所述的组合物(例如，细胞)来自需进行离体治疗的对象(例如，患者)。在一些实施方式中，所述的离体治疗包括基于细胞的疗法，例如过继免疫治疗。

在一些实施方式中，用于离体治疗的组合物可以是细胞。所述的细胞可以是初级细胞，包括但不限于，外周血单核细胞(PBMC)，外周血淋巴细胞(PBL)和其他血细胞亚群。所述的细胞可以是免疫细胞。所述的细胞可以是T细胞、天然杀伤细胞、单核细胞、天然杀伤T细胞、单核前体细胞、造血干细胞或非多能干细胞、干细胞、或祖细胞。所述的细胞可以是造血祖细胞。所述的细胞可以是人细胞。所述的细胞可以经筛选的。所述的细胞可以在体外扩增。所述的细胞可以在体内扩增。所述的细胞可以是CD45RO(-)、CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L(+)、CD27(+)、CD28(+)、或IL-7Rα(+)。所述的细胞可以是相对有需要的对象的自体细胞。所述的细胞可以是相对有需要的对象的异体细胞。所述的细胞可以是良好生产规范(GMP)兼容的试剂。对于有需要的对象，所述细胞可以是治疗疾病的组合治疗的一部分，所述的疾病包括癌症，感染，自身免疫性疾病、或移植物抗宿主病(GVHD)。

在一些实施方式中，所述的小分子化合物可以增强核酸酶介导的基因组编辑中的同源介导修复(HDR)效率和/或非同源性末端接合(NHEJ)效率。在一些情况下，核酸酶介导的基因组编辑可以使用选自下组的核酸酶：CRISPR相关蛋白(Cas)多肽、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、其变体、其片段、或其任意组合。如果使用Cas多肽，则Cas多肽可以是Cas9多肽、其变体、或其片段。在一些实施方式中，核酸酶介导的基因组编辑可以使用CRISPR/Cas系统。

在一些实施方式中，方法(a)还包括将细胞与重组供体修复模板接触。在一些情况下，方法(a)还包括将细胞与核酸，例如靶向DNA的RNA、或编码引导核酸的核苷酸序列(例如靶向DNA的RNA)接触。在一些情况下，方法(a)还包括将细胞与DNA复制酶抑制剂接触。在一些情况下，DNA复制酶抑制剂选自DNA连接酶抑制剂、DNA旋转酶抑制剂、DNA解旋酶抑制剂、或其任意组合。

在一些实施方式中，相比将细胞与小分子化合物或DNA复制酶抑制剂接触，将细胞与包含小分子化合物和DNA复制酶抑制剂的组合物接触可以增加核酸酶介导的基因组编辑的效率。在一些情况下，使用选自纳米颗粒、脂质体、胶束、病毒颗粒、核酸复合物、转染剂、电穿孔剂、核转染剂、脂转染剂、或其任意组合的递送系统，将核酸酶介导的基因组编辑的至少一种成分引入细胞。在一些实施方式中，所述的小分子化合物选自β肾上腺素受体激动剂、布雷菲德菌素A(Brefeldin A)、核苷、其衍生物、其类似物、或其任意组合。在某些情况下，所述的小分子化合物的浓度可以是约0.01μM-10μM,例如，约0.01μM-0.05μM、约0.01μM-0.1μM、约0.01μM-0.2μM、约0.01μM-0.4μM、约0.01μM-0.6μM、约0.01μM-0.8μM、约0.01μM-1μM、约0.01μM-2μM、约0.01μM-3μM、约0.01μM-4μM、约0.01μM-5μM、约0.01μM-6μM、约0.01μM-7μM、约0.01μM-8μM、约0.01μM-9μM、约0.1μM-1μM、约0.1μM-2μM、约0.1μM-3μM、约0.1μM-4μM、约0.1μM-5μM、约0.1μM-6μM、约0.1μM-7μM、约0.1μM-8μM、约0.1μM-9μM、约0.1μM-10μM、约0.5μM-1μM、约0.5μM-2μM、约0.5μM-4μM、约0.5μM-6μM、约0.5μM-8μM、约0.5μM-10μM、约1μM-2μM、约1μM-4μM、约1μM-6μM、约1μM-8μM、约1μM-10μM、约2μM-4μM、约2μM-6μM、约2μM-8μM、约2μM-10μM、约4μM-6μM、约4μM-8μM、约4μM-10μM、约6μM-8μM、约6μM-10μM、或约8μM-10μM。在一些情况下，所述细胞与小分子化合物接触约2、4、6、8、10、12、24、36、48、60、或72小时。

在一些实施方式中，所述细胞选自干细胞、人细胞、哺乳动物细胞、非哺乳动物细胞、脊椎动物细胞、无脊椎动物细胞、植物细胞、真核细胞、细菌细胞、免疫细胞、T细胞、或古细胞。在一些情况下，所述方法还包括分离、挑选、培养、和/或扩增细胞。

在另一方面，本发明提供了一种核酸酶介导的靶DNA序列的基因组编辑的调节剂，其包含使用上述方法中的任一种鉴定小分子化合物。

根据下面的详细描述和附图，本发明的其它目的、特征和优点对本领域技术人员是显而易见的。

附图简要说明

图1A-1G显示了用于调控CRISPR介导的HDR效率的高通量化学筛选平台的建立。图1A显示了E14小鼠ES细胞中表征HDR效率的荧光报告系统。在Nanog位点插入一个sfGFP编码模板(5’-CTCCACCAGGTGAAATATGAGACTTACGCAACAT-3’(SEQ ID NO:26)；5’-ATGTTGAGTAAGTCTCATATTTCACCTGGTGGAG-3’(SEQ ID NO:27))。包括终止密码子(TGA)的sgRNA靶位点呈灰色阴影。在这种情况下，切割位点(剪刀)在CCA下游3bp。两对引物的结合位点用箭头表示。引物对#1与同源臂外的序列结合，引物对#2含有与sfGFP序列结合的正向引物和与3’同源臂外序列结合的反向引物。图1B显示了使用流式细胞术分析不同质粒组合转染的小鼠ES细胞的荧光直方图。图1C显示了GFP阳性细胞中Nanog位点的测序结果。图1D显示了化学筛选平台的方案，以及依据CRISPR介导的基因插入活性对3,918个小分子进行筛选的瀑布图。高亮点是显示出增加或降低的插入效率的经验证的化合物。虚线显示了所有筛选化合物的平均值。图图1E显示了使用流式细胞术对两种增强的和两种抑制的化合物的验证。图1F显示了sfGFP插入到Nanog位点的效率。凝胶图片显示了sfGFP标记，利用图1A所示的两对引物。图1G显示了调控CRISPR基因编辑的四种化合物的剂量依赖性作用。将所有数据归一化为DMSO处理的细胞的敲入效率(虚线)。误差线表示三个生物重复的标准偏差。

图2A-2G显示能够增强HDR或NHEJ介导的CRISPR基因组编辑的不同的经鉴定的小分子。图2A显示了人ACTA2位点的插入策略的方案(5’-GAAGCCGGGCCTTCCATTGTCCACCGCAAATGCT-3’(SEQ ID NO:28)；5’-AGCATTTGCGGTGGACAATGGAAGGCCCGGCTTC-3’(SEQ ID NO:29))。单链向导RNA的靶位点呈灰色阴影。图2B显示了Venus阳性的HeLa细胞中ACTA2位点的测序结果。图2C显示了通过流式细胞测定的Venus插入效率。误差线表示三个样本的标准偏差，使用双尾student t检验计算p值(*，p<0.05；**，p<0.01)。图2D提供了在人iPS细胞中人SOD1位点引入A4V点突变的策略(5’-GAAGGCCGTGGCGTGCTGCTGAAGGGCGACGGCC-3’(SEQ ID NO:30)；5’-GGCCGTCGCCCTTCAGCACGCACACGGCCTTC-3’(SEQ ID NO:31)；5’-GAAGGTCGTGTGTGCGTGCTGAAGGGCGACGGCC-3’(SEQ ID NO:32))。sgRNA的靶位点呈灰色阴影。图2E显示了SOD1位点的测序结果。图2F提供了人iPS细胞中A4V等位基因突变频率和等位基因插入缺失频率的比较，通过无模板、DMSO或L755507的菌落测序和PCR克隆。图2G显示了在L755705和AZT存在的情况下，利用Nanog位点上携带有单等位基因sfGFP插入的克隆鼠ES细胞系，检测敲除效率。顶部显示了用非同源sgRNA(sgGAL4)转染的细胞的点状图。平面显示了在DMSO(左)，L755507(中)和AZT(右)存在的情况下，用三种不同sgRNA(其靶位点在方案中显示)转染的细胞。

图3A-3F显示了用于调控CRISPR介导的HDR效率的高通量化学筛选平台。图3A提供了用Cas9、sgNanog、和/或不含同源臂(HAs)且含有p2A-sfGFP的对照模板转染的小鼠ES细胞的荧光直方图。图3B显示了高通量化学筛选平台的方案。图3C提供了小鼠ES细胞中Nanog位点处的GFP插入效率的表征，针对四个小分子的不同处理窗口。图3D显示了小鼠ES细胞中Nanog位点处的GFP插入效率的表征，针对四个小分子的不同处理窗口。图3E显示了电穿孔后第3天的细胞数。在第一个24小时，用小分子处理细胞。图3F显示了通过MTS分析(Promega)测定细胞活力。E14细胞在490nm处的吸光度进行归一化。图3C-3E中，误差线表示三个生物学重复的标准偏差。

图4A-4G显示了使用Nanog-sfGFP小鼠ES细胞鉴定调控CRISPR介导的基因组编辑的小分子。图4A提供了产生Nanog位点处携带单等位基因sFGFP插入的克隆小鼠ES细胞系的方案。两对引物的结合位点用箭头表示。一对引物(#1)与同源臂外的序列结合，另一对引物(#2)包含与sfGFP序列结合的正向引物和与3’同源臂外序列结合的反向引物。图4B提供了利用两对引物验证单等位基因标记的凝胶图。图4C显示了10代后用小分子处理的E14细胞的Oct4和Sox2的免疫荧光。细胞在分裂后的第一个24小时用小分子处理。图4D显示小分子处理的E14细胞的Nanog的流式细胞分析。图4E提供了利用不同sgRNA电穿孔的Nanog-sfGFPES细胞的显微图像。图4F提供了在DMSO、L755507(5μM)或AZT(1μM)存在下，用sgsfGFP-1电穿孔的Nanog-sfGFP小鼠ES细胞的显微图像。图4G显示了AZT处理10代的Nanog-sfGFP小鼠ES细胞的显微镜图像。细胞在各自分裂后的第一个24小时用小分子处理。比例尺表示50μm.

图5提供了sfGFP靶向sgGFP-2的深度测序分析。

图6显示了与仅使用任一化合物的HDR的效率相比，使用DNA连接酶抑制剂(“SCR7a”)和β3-肾上腺素能受体激动剂(“L755507”)组合的同源介导修复(HDR)效率。。

发明详述

I.简介

本文提供了用于调控靶DNA基因组编辑的方法和试剂盒。本发明包括利用小分子增强或抑制靶DNA序列中同源介导修复(HDR)或非同源性末端接合(NHEJ)途径的双链断裂修复。本文还提供了预防或治疗对象疾病例如基因疾病的方法，该方法通过增强精确的基因组编辑来校正与该基因疾病相关的靶基因突变。本文还提供了预防或治疗对象疾病(例如癌症)的方法，该方法通过增强精确的基因组编辑对细胞和核酸进行遗传修饰，用于治疗应用。本文还提供了筛选小分子文库以鉴定基因组编辑的新型调节剂的系统和方法。本发明可用于任何类型的细胞，以及适用于核酸酶介导的基因组编辑技术的任何基因位点。

II.通用

利用分子生物学领域的常规技术实践本发明。本发明使用的通用方法由基本文献所公开，包括Sambrook和Russell，分子克隆，实验手册(第三版.2001)；克里格勒，基因转化和表达：实验手册(1990)；和分子生物学实验指南(Ausubel等，eds.，1994))。

对于核酸，大小以千碱基(kb)，碱基对(bp)或核苷酸(nt)给出。单链DNA和/或RNA的大小以核苷酸给出。这些是从琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳，测序的核酸或公开的DNA序列中得出的估计值。对于蛋白质，大小以千道尔顿(kDa)或氨基酸残基数给出。蛋白质大小从凝胶电泳、测序的蛋白质、衍生的氨基酸序列、或已公开的蛋白质序列中进行估值。

不可商业上购买的寡核苷酸可以化学合成，例如，根据“Beaucage和Caruthers，四面体通讯22:1859-1862(1981)”中，首次记载的固相亚磷酰胺三酯法。，使用自动合成仪，如“Van Devanter等，核酸研究，12:6159-6168(1984)”中的记载。可以使用本领域公认的任何策略进行寡核苷酸的纯化，例如，如“Pearson和Reanier，J.Chrome.255:137-149(1983)”中的记载的天然丙烯酰胺凝胶电泳或阴离子交换高效液相色谱(HPLC)。

III.定义

除非另有特别定义，本文所用的所有技术和科学术语与在本发明所属领域中的普通技术人员通常理解的具有相同的含义。此外，在本发明的实践中，可以使用与本文所述的方法或材料相似或等同的任何方法或材料。为了本发明的目的，定义以下术语。

如本文所用，术语“一”，“一个”或“该”不仅包括单个指代，而且包括多个指代。例如，除非上下文另有明确规定，单数形式的“一”，“一”和“该”包括复数指代物。因此，例如，提及的“一细胞”包括多个所述细胞，并且提及的“该制剂”包括本领域技术人员已知的一种或多种制剂等。

术语“基因编辑”是指利用一个或多个核酸酶和/或切口酶，向靶DNA(例如细胞的基因组)插入、替换或去除DNA的一种基因工程。核酸酶在基因组需要的位置产生特异性双链断裂(DSB)，并利用细胞的内源机制通过同源性介导修复(HDR)(例如同源重组)或非同源性末端接合(NHEJ)，修复诱导的断裂。切口酶在基因组需要的位置产生特异性单链断裂。在一个非限制性实例中，可以使用两种切口酶,在靶DNA的相反链上产生两条单链断裂，从而产生平或粘性末端。可以将任何合适的核酸酶引入细胞以诱导靶DNA序列的基因组编辑，包括但不限于，CRISPR相关蛋白(Cas)核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、其他内切或外切核酸酶、其变体、其片段、及其组合。在具体实施方式中，可以仅使用本文所述的小分子化合物或与DNA复制酶抑制剂组合使用“调控”(例如，增强或抑制)靶DNA序列的核酸酶介导的基因组编辑，以提高通过同源性介导修复(HDR)进行的精确的基因组编辑的效率。

术语“同源介导修复”或“HDR”是指细胞中利用引导修复的同源模板，精准和精确地修复双链DNA断裂的机制。最常见的HDR形式是同源重组(HR)，其是一种核苷酸序列在两个相似或相同的DNA分子之间进行交换的基因重组。

术语“非同源性末端接合”或“NHEJ”是指修复双链DNA断裂的途径，其中断裂末端直接连接而不需要同源模板。

术语“核酸”、“核苷酸”或“多核苷酸”是指单链、双链或多链形式的脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及其聚合物。该术语包括但不限于，单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体、或包含嘌呤和/或嘧啶碱基或其它天然的、化学修饰的、生物化学修饰的、非天然的、合成的、或衍生的核苷酸碱基的聚合物。在一些实施方式中，核酸可以包含DNA、RNA及其类似物的混合物。除非特别限定，该术语包括含有已知天然核苷酸类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合特性，并以与天然存在的核苷酸类似的方式被代谢。除非另有说明，特定的核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)，等位基因，直向同源物，单核苷酸多态性(SNP)和互补序列以及明确指出的序列。特别地，简并密码子取代可以通过下述方式实现，产生一个或多个选定的(或全部)密码子第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列(Batzer等，核算资源19：5081(1991)；Ohtsuka等，生物化学杂志.260：2605-2608(1985)；和Rossolini等，分子和细胞探针8：91-98(1994))。术语核酸、基因、cDNA和基因编码的mRNA可互换使用。

术语“基因”或“编码多肽的核苷酸序列”是指参与多肽链产生的DNA片段。DNA片段可以包含涉及基因产物的转录/翻译以及转录/翻译调节的编码区之前和之后的区域(前导区和尾巴)，和个体编码区段(外显子)内的中间序列(内含子)。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可以互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。如本文所用，该术语包括任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。

“重组表达载体”是重组或合成产生的，具有一系列特定核酸元件(允许特定多核苷酸序列在宿主细胞中转录)的核酸构建物。表达载体可以是质粒、病毒基因组或核酸片段的一部分。典型地，表达载体包括可操作地连接于启动子的待转录多核苷酸。在本文中,“可操作地连接”是指两个或多个遗传元件(例如多核苷酸编码序列和启动子)置于支持元件合适生物功能的相对位置，例如启动子引导编码序列转录。如本文所用，术语“启动子”是指引导核酸转录的一系列核酸控制序列。如本文所用，启动子包括在转录起始位点附近的必需核酸序列，例如对于聚合酶II型启动子，是TATA元件。启动子还可任选地包括远端的增强子或阻遏物元件，其可以距转录起始位点多达数千个碱基对。表达载体中可能存在其它元件，包括那些增强转录(例如增强子)和终止转录(例如终止子)的元件，以及赋予表达载体产生的重组蛋白特定结合亲和力或抗原性的元件。

“重组体”是指遗传修饰的多核苷酸、多肽、细胞、组织或生物体。例如，重组多核苷酸(或重组多核苷酸的拷贝或互补序列)是使用熟知方法进行操作的重组多核苷酸。重组表达盒包含可操作地连接到第二多核苷酸(例如，编码序列)的启动子，作为人工操作的结果，其可以包含与第二多核苷酸异源的启动子(例如，根据Sambrook等，分子克隆-实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，(1989)或新编分子生物学实验指南Vol 1-3，约翰·威利父子出版公司(1994-1998)中描述的方法)。重组表达盒(或表达载体)通常包含在自然界中未发现的多核苷酸组合。例如，人工操作的限制性位点或质粒载体序列可以位于侧边，或将启动子与其他序列分开。重组蛋白由重组多核苷酸，以及包含重组序列(多核苷酸和/或多肽)的重组细胞、组织和生物体表达。

“报告盒”是指包含与编码报告多肽的序列可操作地连接的启动子或其他调节序列的多核苷酸。

术语“单核苷酸多态性”或“SNP”是指多核苷酸中单个核苷酸的变化，包括在等位基因内。这可以包括将一个核苷酸替换为另一个，以及单个核苷酸的缺失或插入。最典型地，SNP是双重标记，尽管也可以存在三等位基因和四等位基因标记。作为非限制性实例，包含SNP A\C的核酸分子在多态性位点处可包括C或A。

术语“培养”、“培养中”、“生长”、“生长中”、“维持”、“维持中”、“扩增”、“扩增中”等，在涉及细胞培养本身或培养过程时，可互换使用，是指细胞在受控条件下，例如在适合于存活的条件下，在其正常环境之外维持。培养的细胞能够存活，培养可导致细胞生长、停滞、分化或分裂。该术语并不意味着所有培养的细胞都会存活、生长或分裂，因为部分会自然死亡或衰老。细胞通常是在培养基中培养，培养基可以在培养过程中变化。

术语“对象”、“患者”和“个体”在本文中可互换使用，包括人或动物。例如，动物对象可以是哺乳动物、灵长类(例如猴子)、家畜动物(例如马、牛、绵羊、猪或山羊)、伴侣动物(例如狗、猫)、实验室测试动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、鸟)，具有兽医意义的动物、或具有经济意义的动物。

如本文所用，术语“给药”包括口服给药、局部接触、栓剂给药、静脉内、腹膜内、肌内、病灶内、鞘内、鼻内或皮下给药于对象。可以通过任何途径给药，包括非经肠途径和经粘膜途径(例如颊、舌下、腭、牙龈、鼻、阴道、直肠或经皮)。非经肠给药包括，例如静脉内、肌内、小动脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内给药。其他递送方式包括但不限于使用脂质体制剂，静脉输注，透皮贴剂等。

术语“治疗”是指用于获得有益或期望结果的方法，包括但不限于治疗性益处和/或预防性益处。治疗性益处是指接受治疗的一种或多种疾病、病症或症状的任何治疗相关的改善或影响。为了预防性益处，可以将组合物施用于具有发展成特定疾病、病症或症状风险的对象，或者表现出一种或多种疾病的生理症状的对象，即使该疾病、病症或症状还没有被证明。

术语“有效量”或“足够量”是指足以实现有益或期望结果的试剂(例如DNA核酸酶，小分子化合物等)的剂量。治疗有效量可以根据以下的一种或多种而变化：待治疗的对象和疾病状况、对象的体重和年龄、疾病状况的严重程度、给药方式等，其可以容易地由本领域普通技术人员决定。特殊剂量可以根据以下的一种或多种而变化：具体试剂的选择、靶细胞的类型、对象靶细胞的位置、遵循的给药方案、是否与其它化合物组合施用、给药时间、以及运载其的物理运载系统。

术语“药学上可接受的载体”是指有助于向细胞、生物体或对象施用试剂(例如DNA核酸酶，小分子化合物等)的物质。“药学上可接受的载体”是指组合物或制剂中包含的，对患者没有显著的不利毒性作用的载体或赋形剂。药学上可接受的载体的非限制性实例包括水、NaCl、生理盐水溶液、乳酸林格氏液、标准蔗糖、标准葡萄糖、粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、涂层、甜味剂、调味剂和色素等。本领域技术人员可以认识到，其它药物载体可用于本发明。

关于参考数值的术语“约”可以包括相对该值的±10％的值的范围。例如，数量“约10”包括数量9至11，包括参考值9,10和11。关于参考数值的术语“约”也可以包括相对该值的±10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、或1％的值的范围。

IV实施方式的描述

(b)在调控DNA核酸酶诱导的靶DNA的基因组编辑的条件下，将细胞与小分子化合物接触。

在一些实施方式中，DNA核酸酶选自下组：CRISPR相关蛋白(Cas)多肽、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、其变体、其片段、及其组合。在具体实例中，Cas多肽可以是Cas9多肽、其变体、或其片段。

在一些实施方式中，该方法的步骤(a)还包括向细胞中引入引导核酸，例如靶向DNA的RNA(例如，单链向导RNA或sgRNA或双链向导核酸)或编码引导核酸(例如，靶向DNA的RNA)的核苷酸序列。在某些情况下，该靶向DNA的RNA包含至少两种不同的靶向DNA的RNA，其中各靶向DNA的RNA被引导至不同的靶DNA。

在一些实施方式中，调控基因组编辑的小分子化合物选自下组：β肾上腺素受体激动剂或其类似物、布雷菲德菌素A或其类似物，核苷类似物，其衍生物，及其组合。

在一些实施方式中，与未与小分子化合物接触的对照细胞相比，小分子化合物增强或抑制靶DNA的基因组编辑。

在一些实施方式中，基因组编辑包括靶DNA的同源介导修复(HDR)。在某些实施方式中，该方法的步骤(a)还包括向细胞中引入重组供体修复模板。在一些情况下，重组供体修复模板包含了包括靶DNA的两个非重叠同源部分的两条核苷酸序列，其中，核苷酸序列位于对应于靶DNA的核苷酸序列的5’和3’末端，以进行基因组编辑。在一些情况下，重组供体修复模板包含一条合成的单链寡脱氧核苷酸(ssODN)模板，和包括靶DNA的两个非重叠同源部分的两条核苷酸序列，其中，核苷酸序列位于编码突变的核苷酸序列的5’和3’末端。在具体实施方式中，增强HDR的小分子化合物为β肾上腺素受体激动剂(例如，L755507)、布雷菲德菌素A(Brefeldin A)、其衍生物、其类似物、或其组合。在具体实施方式中，抑制HDR的小分子化合物为核苷类似物(例如叠氮胸苷(AZT)、三氟尿苷(TFT)等)、其衍生物、或其组合。

在其他实施方式中，基因组编辑包括靶DNA的非同源性末端接合(NHEJ)。在具体实施方式中，增强NHEJ的小分子化合物为核苷类似物(例如叠氮胸苷(AZT))或其衍生物。在具体实施方式中，抑制NHEJ的小分子化合物为β肾上腺素受体激动剂(例如L755507)、其衍生物、或其类似物。

在某些实施方式中，小分子化合物增强靶DNA的HDR效率，并降低靶DNA的NHEJ效率。这种小分子化合物的非限制性实例是L755507。在某些其他实施方式中，小分子化合物增强靶DNA的NHEJ效率，并降低靶DNA的HDR效率。这种小分子化合物的非限制性实例是叠氮胸苷(AZT)。

在一些实施方式中，该方法的步骤(b)还包括将细胞与DNA复制酶抑制剂接触。在某些情况下，DNA复制酶抑制剂选自下组：DNA连接酶抑制剂、DNA旋转酶抑制剂、DNA解旋酶抑制剂、及其组合。DNA连接酶抑制剂的非限制性实例包括抑制一种或多种类型的DNA连接酶(I、III、IV)的化合物，如Scr7(5,6-二((E)-苯亚甲基氨基)-2-硫代-23-二氢嘧啶-4(1H)-酮；CAS 159182-43-1)、L189(6-氨基-2,3-二氢-5-[(苯基亚甲基)氨基]-2-4(1H)-嘧啶酮；CAS 64232-83-3)、其衍生物、其类似物、及其组合。DNA旋转酶抑制剂的非限制性实例包括喹诺酮类(例如萘啶酸)、氟喹诺酮类(例如环丙沙星)、香豆素(例如新生霉素)、环唾液酸、CcdB毒素、小菌素B17、其衍生物、其类似物、及其组合。DNA解旋酶抑制剂的非限制性实例包括ML216(N-[4-氟-3-(三氟甲基)苯基]-N’-[5-(4-吡啶基)-1,3,4-噻二唑-2-基]-脲；CAS1430213-30-1)、NSC19630(1-(丙氧基甲基)-马来酰亚胺；CAS 72835-26-8)、二苯并硫代嘌呤(dibenzothiepins)、其衍生物、其类似物、及其组合。

在一些实施方式中，与接触小分子化合物或者DNA复制酶抑制剂的对照细胞相比，小分子化合物和DNA复制酶抑制剂的组合增强或抑制靶DNA的基因组编辑。在某些实施方式中，小分子化合物和DNA复制酶抑制剂的组合增强靶DNA的同源介导修复(HDR)。在具体实施方式中，该组合包含β肾上腺素受体激动剂(例如L755507)或其衍生物或类似物，以及DNA连接酶抑制剂(例如Scr7)或其衍生物或类似物。

在一些实施方式中，细胞与浓度约0.1μM-10μM的小分子化合物接触。在其他实施方式中，细胞与小分子化合物接触约24小时。在其他实施方式中，细胞与小分子化合物接触约2、4、6、8、10、12、24、36、48、60、或72小时。例如，细胞与小分子化合物接触约2-4、4-6、6-8、8-10、10-12、12-18、18-24、2-24、24-36、36-48、48-60、或60-72小时。在某些实施方式中，该细胞选自下组：干细胞、人细胞、哺乳动物细胞、非哺乳动物细胞、脊椎动物细胞、无脊椎动物细胞、植物细胞、真核细胞、细菌细胞、免疫细胞、T细胞、和古细胞。在某些其他实施方式中，该方法进一步包括：(c)分离、筛选、培养、和/或扩增该细胞。

在一些实施方式中，该试剂盒还包含一种或多种以下组件：引导核酸(例如靶向DNA的RNA)或编码引导核酸(例如靶向DNA的RNA)的核苷酸序列；重组供体修复模板；和DNA复制酶抑制剂。

在一些实施方式中，基因疾病选自下组：X-连锁严重联合免疫缺陷病、镰状细胞性贫血、地中海贫血、血友病、瘤变、癌症、年龄相关性黄斑变性、精神分裂症、三核苷酸重复病症、脆性X综合征、朊病毒相关病症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、药物成瘾、自闭症、阿尔茨海默病、帕金森病、囊性纤维化、血液和凝血疾病或病症、炎症、免疫相关疾病或病症、代谢疾病和病症、肝脏疾病和病症、肾脏疾病和病症、肌肉/骨骼疾病和病症、神经和神经元疾病和病症、心血管疾病和病症、肺部疾病和病症、以及眼部疾病和病症。

在一些实施方式中，DNA核酸酶选自下组：CRISPR相关蛋白(Cas)多肽、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、其变体、其片段、及其任意组合。在具体实例中，Cas多肽可以是Cas9多肽、其变体、或其片段。

在一些实施方式中，该方法的步骤(a)还包括向对象施用重组供体修复模板。在其他实施方式中，该方法的步骤(a)还包括向对象施用靶向DNA的RNA或编码靶向DNA的RNA的核苷酸序列。

在一些实施方式中，小分子化合物选自下组：β肾上腺素受体激动剂(例如，L755507)、布雷菲德菌素A(Brefeldin A)、其衍生物、其类似物、及其组合。

在一些实施方式中，该方法的步骤(b)还包括向对象施用DNA复制酶抑制剂。本文描述了DNA复制酶抑制剂的非限制性实例，包括DNA连接酶抑制剂(例如Scr7或其类似物)、DNA旋转酶抑制剂、DNA解旋酶抑制剂、及其组合。

在具体实施方式中，与施用小分子化合物或者DNA复制酶抑制剂相比，施用小分子化合物和DNA复制酶抑制剂的组合增强DNA核酸酶纠正靶基因突变的作用。

在一些实施方式中，该方法的步骤(a)包括利用选自下组的递送系统施用于对象：纳米颗粒、脂质体、胶束、病毒体、核酸复合物、及其组合。

在一些实施方式中，该方法的步骤(b)包括利用选自下组的递送方式施用于对象：口服、静脉内、腹膜内、肌内、皮内、皮下、小动脉内、心室内、颅内、病灶内、鞘内、局部、经粘膜、鼻内、及其组合。

(a)第一重组表达载体，其包含编码DNA核酸酶或其变体的核苷酸序列；

(b)第二重组表达载体，其包含与启动子操作性连接的编码靶向DNA的RNA的核苷酸序列，其中，所述的核苷酸序列包含：

(i)与靶DNA互补的第一个核苷酸序列；和

(ii)与DNA核酸酶或其变体相互作用的第二核苷酸序列；和

(c)重组的供体修复模板，其包含：

(i)包含编码报告多肽的核苷酸序列的报告盒；和

(ii)包含靶DNA的两个或多个非重叠同源部分的两条或多条核苷酸序列，其中，所述的核苷酸序列位于报告盒的5’端和3’端。

鉴定调控细胞中靶DNA基因组编辑的小分子化合物的系统可用于体外治疗。例如，筛选基因编辑调节剂的方法可用于发现增强同源重组(例如，利用CRISPR/Cas系统的基因工程)的新型组合物(例如，小分子)，其可反过来用于离体治疗(例如，利用筛选方法发现的新型组合物修饰的细胞)。例如，离体治疗包括向对象(例如，患者)施用体外产生或修饰的组合物(例如，细胞)。在一些实施方式中，所述的组合物(例如，细胞)通过本文公开的方法产生或修饰。在一些实施方式中，组合物(例如，细胞)来自进行离体治疗的对象(例如，患者)。在一些实施方式中，离体治疗包括基于细胞的疗法，例如过继免疫治疗。

在一些实施方式中，所述细胞包含第一重组表达载体、第二重组表达载体、重组供体修复模板、或其任意组合。

在一些实施方式中，第一重组表达载体包含DNA核酸酶。DNA核酸酶选自但不限于CRISPR相关蛋白(Cas)核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、其他内切或外切核酸酶、其变体、其片段、及其组合。例如，DNA核酸酶可以是Cas9多肽、其变体、或其片段。在一些实施方式中，该系统还包含一细胞。所述的细胞可以是初级细胞，包括但不限于外周血单核细胞(PBMC)，外周血淋巴细胞(PBL)和其他血细胞亚群。所述的细胞可以是免疫细胞。所述的细胞可以是T细胞、天然杀伤细胞、单核细胞、天然杀伤T细胞、单核前体细胞、造血干细胞或非多能干细胞、干细胞、或祖细胞。所述的细胞可以是造血祖细胞。所述的细胞可以是人细胞。所述的细胞可以经筛选的。所述的细胞可以在体外扩增。所述的细胞可以在体内扩增。所述的细胞可以是CD45RO(-)、CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L(+)、CD27(+)、CD28(+)、或IL-7Rα(+)。所述的细胞可以是有需要的对象的自体细胞。所述的细胞可以是相对有需要的对象的异体细胞。所述的细胞可以是良好生产规范(GMP)兼容的试剂.所述的细胞可以是组合疗法的一部分，用于治疗需要对象的癌症、感染、自身免疫疾病、或移植物抗宿主病(GVHD)。在一些实施方式中，该系统还包含小分子化合物文库。

在一些实施方式中，重组供体修复模板位于第三重组表达载体中。重组供体修复模板可包含一报告盒，所述报告盒包含编码报告多肽的核苷酸序列，和包含靶DNA的两个或多个非重叠同源部分的两条或多条核苷酸序列，其中，所述的核苷酸序列位于报告盒的5’端和3’端。编码报告多肽的核苷酸序列可操作地连接至少一个核定位信号。在其它实施方式中，编码报道多肽的核苷酸序列可操作地连接到编码自切割肽的核苷酸序列。自切割肽可以是病毒2A肽，例如E2A肽、F2A肽、P2A肽和T2A肽。重组供体修复模板的报告肽可以是可检测的多肽、荧光多肽或选择性标记。例如，重组供体修复模板的报告肽可以是超级折叠GFP(sfGFP)。重组供体修复模板可包含靶DNA的两个或多个非重叠同源部分，其中，所述的核苷酸序列位于报告盒的5’端和3’端。

在一些实施方式中，系统的第二重组表达载体至少包含两条引导核酸(例如，靶向DNA的RNA)，其中各引导核酸(例如，靶向DNA的RNA)被引导到不同的靶DNA序列。在一些实施方式中，系统的第二重组表达载体包含编码靶向DNA的RNA的核苷酸序列,其与启动子可操作地连接，例如在邻近或接近启动子处插入。该启动子可以是普遍存在的、组成型的(不受调控的启动子，其允许相关基因连续转录)、组织特异性启动子或诱导型启动子。在邻近或接近启动子处插入的，编码引导核酸(例如靶向DNA的RNA)的核苷酸序列的表达可以被调节。例如，核苷酸序列可以在普遍存在的启动子附近或旁边插入。普遍存在的启动子的一些非限制性实例可以是CAGGS启动子、hCMV启动子、PGK启动子、SV40启动子、或ROSA26启动子。启动子也可以是内源的或外源的。例如，编码靶向DNA的RNA的核苷酸序列可以在邻近或接近内源或外源ROSA26启动子处插入。此外，可以使用组织特异性启动子或细胞特异性启动子控制表达位置。例如，编码靶向DNA的RNA的核苷酸序列可以在邻近或接近组织特异性启动子处插入。该组织特异性启动子可以是FABP启动子、Lck启动子、CamKII启动子、CD19启动子、角蛋白启动子、白蛋白启动子、aP2启动子、胰岛素启动子、MCK启动子、MyHC启动子、WAP启动子、或aCol2A启动子。也可以使用诱导型启动子。可以通过添加或移除诱导剂，在需要时打开和关闭这些诱导型启动子。预期的诱导型启动子可以是但不限于Lac、tac、trc、trp、araBAD、phoA、recA、proU、cst-1、tetA、cadA、nar、PL、cspA、T7、VHB、Mx、和/或Trex。

在一些实施方式中，核苷酸序列包含与靶DNA互补的第一核苷酸序列和与DNA核酸酶或其变体相互作用的第二核苷酸序列。靶DNA序列可以与引导核酸(例如靶向DNA的RNA)的片段(例如引导序列)互补，并且可以紧靠前间区序列邻近基序(protospacer adjacentmotif,PAM)序列。靶DNA位点可以紧靠着PAM序列的5’端，PAM序列特定于使用的Cas9的细菌种类。例如，衍生自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9的PAM序列是NGG；衍生自脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)的Cas9的PAM序列为NNNNGATT；衍生自嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的Cas9的PAM序列是NNAGAA；和衍生自齿垢密螺旋体(Treponema denticola)的Cas9的PAM序列是NAAAAC。在一些实施方式中，PAM序列可以是5’-NGG，其中N是任意核苷酸；5’-NRG，其中N是任意核苷酸且R是嘌呤；或5’-NNGRR，其中N是任意核苷酸且R是嘌呤。对于酿脓链球菌系统，选定的靶DNA序列紧靠在(例如，位于5’)5’NGG PAM之前，其中N是任意核苷酸，使得靶向DNA的RNA的引导序列与相反链配对，从而在PAM序列上游约3碱基对处介导切割。在一些实施方式中，当使用合适的比对算法进行最佳比对时，靶向DNA的RNA的引导序列与相应靶DNA序列之间的互补程度为约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或以上。与靶DNA互补的第一核苷酸序列在5’端包含约10-2000个核酸，例如约10-100个核酸、约10-500个核酸、约10-1000个核酸、约10-1500个核酸、约10-2000个核酸、约50-100个核酸、约50-500个核酸、约50-1000个核酸、约50-1500个核酸、约50-2000个核酸、约100-500个核酸、约100-1000个核酸、约100-1500个核酸、约100-2000个核酸、约500-1000个核酸、约500-1500个核酸、约500-2000个核酸、约1000-1500个核酸、约1000-2000个核酸、或约1500-2000个核酸，其可利用RNA-DNA互补碱基配对将Cas9引导至靶DNA位点。在一些实施方式中，第一核苷酸序列在5’端包含，例如20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、或10个核酸，其可利用RNA-DNA互补碱基配对将Cas9引导至靶DNA位点。在一些实施方式中，第一核苷酸序列包含至少20个，例如19、18、17、16、15、14、13、12、11、10个或更少核酸，其可与靶DNA位点互补。在一些情况下，第一核苷酸序列在靶向区域5’端的互补区中含有1至10个核酸错配。在其他情况下，第一核苷酸序列在目标区域3’端的最后约5-12个核酸处的互补区中不存在错配。

在一些实施方式中，与DNA核酸酶(例如Cas9)或其变体相互作用的第二核苷酸序列可以是引导核酸(例如靶向DNA的RNA)的蛋白结合序列。在一些实施方式中，靶向DNA的RNA的蛋白质结合序列包含彼此杂交以形成双链RNA双螺旋(dsRNA duplex)的两个互补延伸的核苷酸。所述的蛋白结合序列可以是约30-200个核苷酸，例如，约40-200个核苷酸、约50-200个核苷酸、约60-200个核苷酸、约70-200个核苷酸、约80-200个核苷酸、约90-200个核苷酸、约100-200个核苷酸、约110-200个核苷酸、约120-200个核苷酸、约130-200个核苷酸、约140-200个核苷酸、约150-200个核苷酸、约160-200个核苷酸、约170-200个核苷酸、约180-200个核苷酸、或约190-200个核苷酸。在某些方面，所述的蛋白结合序列可以是约30-190个核苷酸，例如，约30-180个核苷酸、约30-170个核苷酸、约30-160个核苷酸、约30-150个核苷酸、约30-140个核苷酸、约30-130个核苷酸、约30-120个核苷酸、约30-110个核苷酸、约30-100个核苷酸、约30-90个核苷酸、约30-80个核苷酸、约30-70个核苷酸、约30-60个核苷酸、约30-50个核苷酸、或约30-40个核苷酸。

在一些实施方式中，第一重组表达载体和第二重组表达载体位于单个表达载体中。

在一些实施方式中，本文提供的用于调控基因组编辑的系统包括增强和/或降低(抑制)基因编辑的效率。在一些情况下，基因组编辑为靶DNA的同源介导修复(HDR)或非同源性末端接合(NHEJ)。在某些情况下，小分子化合物增强HDR效率、增强NHEJ效率、降低HDR效率、降低NHEJ效率、或其组合。在一些情况下，小分子化合物增强靶DNA的HDR效率，并降低靶DNA的NHEJ效率。在一些情况下，小分子化合物增强靶DNA的NHEJ效率，并降低靶DNA的HDR效率。

(a)向细胞中导入：

(i)第一重组表达载体，其包含编码Cas9多肽或其变体的核苷酸序列；

(b)第二重组表达载体，其包含与启动子可操作地连接的编码靶向DNA的RNA的核苷酸序列，其中，所述的核苷酸序列包含与靶DNA互补的第一核苷酸序列；和与Cas9多肽或其变体相互作用的第二核苷酸序列，和

(iii)重组的供体修复模板，其包含一报告盒，所述报告盒包含与编码自切割肽的核苷酸序列可操作地连接的编码报告多肽的核苷酸序列，和包含靶DNA的两个非重叠同源部分的两条核苷酸序列，其中，所述两条核苷酸序列位于报告盒的5’端和3’端。

从而产生一修饰的细胞；

(b)将修饰的细胞与小分子化合物接触；

(c)检测修饰的细胞中报告多肽的水平；和

(d)与进行步骤(b)之前的水平相比，如果报告多肽的水平增加或降低，则确定小分子化合物调控基因组编辑。

在一些实施方式中，该方法的重组供体修复模板位于第三重组表达载体中。编码报告多肽的核苷酸序列可以可操作地连接至少一个核定位信号。自切割肽可以是病毒2A肽，例如E2A肽、F2A肽、P2A肽和T2A肽。重组供体修复模板的报告肽可以是荧光多肽。

在一些实施方式中，该方法的第二重组表达载体至少包含两条靶向DNA的RNA，其中各靶向DNA的RNA被引导到不同的靶DNA序列。第一重组表达载体和第二重组表达载体位于单个表达载体中。

在一些实施方式中，本文提供的用于调控基因组编辑的方法包括增强和/或降低(抑制)基因编辑的效率。在一些情况下，基因组编辑包含靶DNA的同源介导修复(HDR)或非同源性末端接合(NHEJ)。在某些情况下，小分子化合物增强HDR效率、增强NHEJ效率、降低HDR效率、降低NHEJ效率、或其组合。在一些情况下，小分子化合物增强靶DNA的HDR效率，并降低靶DNA的NHEJ效率。在一些情况下，小分子化合物增强靶DNA的NHEJ效率，并降低靶DNA的NHEJ效率。

在一些实施方式中，该方法的细胞选自下组：干细胞、人细胞、哺乳动物细胞、非哺乳动物细胞、脊椎动物细胞、无脊椎动物细胞、植物细胞、真核细胞、细菌细胞、和古细胞。

A.核酸

本发明包括利用DNA核酸酶，如工程化的(例如，可编辑的或可靶向的)DNA核酸酶，来诱导靶DNA序列的基因组编辑。可以使用任何合适的DNA核酸酶，包括但不限于CRISPR相关蛋白(Cas)核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、其他内切或外切核酸酶、其变体、其片段、及其组合。

在一些实施方式中，编码DNA核酸酶的核苷酸序列存在于重组表达载体中。在某些情况下，重组表达载体是病毒构建体，例如重组腺相关病毒构建体、重组腺病毒构建体、重组慢病毒构建体等。例如基于牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺相关病毒、SV40、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒等的病毒载体。逆转录病毒载体可以基于鼠白血病病毒、脾坏死病毒，以及衍生自逆转录病毒如劳斯氏肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、慢病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒、乳腺肿瘤病毒等的载体。可用的表达载体是本领域技术人员已知的，许多是可商购的。通过实例提供用于真核宿主细胞的以下载体：pXT1、pSG5、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVLSV40。然而，如果与宿主细胞相容，则可以使用任何其它载体。例如，含有编码Cas9酶的核苷酸序列的可用的表达载体购自，例如Addgene、美国生命技术公司(Life Technologies)、Sigma-Aldrich和傲锐基因(Origene)。

根据所使用的靶细胞/表达系统，表达载体中可以使用多种转录和翻译控制元件中的任何一种，包括启动子、转录增强子、转录终止子等。可用的启动子可以衍生自病毒或任何生物体，例如原核或真核生物体。合适的启动子包括但不限于，SV40早期启动子、鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复(LTR)启动子、腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)、单纯疱疹病毒(HSV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子，如CMV立即早期启动子区(CMV immediate earlypromoter region，CMVIE)，劳斯氏肉瘤病毒(RSV)启动子、人U6小型核启动子(U6)、增强型U6启动子、人H1启动子(H1)等

1.CRISPR/Cas系统

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，规律成簇的间隔短回文重复)/Cas(CRISPR-相关蛋白)核酸酶系统是一种可用于基因工程的基于细菌系统的工程化核酸酶系统。其基于许多细菌和古细菌的适应性免疫反应的一部分。当病毒或质粒侵入细菌时，侵入者的DNA片段通过“免疫”反应转化为CRISPR RNA(crRNA)。然后，crRNA通过部分互补区域与称为tracrRNA的另一种类型的RNA缔合，将Cas(例如Cas9)核酸酶引导到与靶DNA中称为“前间区序列”的与crRNA同源的区域。Cas(例如Cas9)核酸酶切割DNA，通过crRNA转录物中包含的20-核苷酸引导序列指定的双链断裂位点产生平末端。Cas(例如Cas9)核酸酶需要crRNA和tracrRNA两者，以实现位点特异性DNA识别和切割。目前，该系统被设计成使得crRNA和tracrRNA组合成一个分子(“单链向导RNA”或“sgRNA”)，并且单链向导RNA的crRNA等同部分被设计成引导Cas(例如Cas9)核酸酶靶向任何所需序列(参见，例如Jinek等(2012)科学337：816-821；Jinek等(2013)eLife 2：e00471；Segal(2013)eLife 2：e00563)。因此，CRISPR/Cas系统设计成在细胞基因组的预期靶点产生双链断裂，并利用细胞的内源机制通过同源介导修复(HDR)或非同源性末端接合(NHEJ)修复诱导的断裂。

在一些实施方式中，Cas核酸酶具有DNA切割活性。Cas核酸酶可以在靶DNA序列的某一位置引导一条或两条链的切割。例如，Cas核酸酶可以是具有的一个或多个灭活的催化结构域的切口酶，其切割靶DNA序列的单链。

Cas核酸酶的非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、其同源物，其变体，其突变体及其衍生物。Cas核酸酶有三种大类型(I型、II型和III型)和10种亚型，包括5种I型、3种II型和2种III型蛋白(参见，例如Hochstrasser和Doudna，生物化学科学前沿，2015：40(1)：58-66)。II型Cas核酸酶包括Cas1、Cas2、Csn2和Cas9。这些Cas核酸酶是本领域技术人员已知的。例如，野生型酿脓链球菌Cas9多肽的氨基酸序列公布在，例如NBCIRef.Seq.No.NP_269215，野生型嗜热链球菌Cas9多肽的氨基酸序列公布在，例如NBCIRef.Seq.No.WP_011681470。本发明使用的CRISPR相关内切核酸酶公开于公开号为2014/0068797、2014/0302563、和2014/0356959的美国专利申请。

Cas核酸酶，例如Cas9多肽可以衍生自多种细菌类型，包括但不限于，非典型韦永氏球菌属(Veillonella atypical)，具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)，龈沟产线菌(Filifactor alocis)，鼠尾草杆菌(Solobacterium moorei)、灵巧粪球菌(Coprococcuscatus)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、嗜胨菌属(Peptoniphilus duerdenii)、链杆菌属(Catenibacterium mitsuokai)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、无毒李斯特氏菌(Listeria innocua)、假性中间葡萄球菌(Staphylococcus pseudintermedius)、肠道氨基酸肠杆菌(Acidaminococcus intestine)、齿龈欧氏菌(Olsenella uli)、欧奈氏球菌(Oenococcus kitaharae)、双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、运动支原体(Mycoplasma mobile)、鸡败血支原体(Mycoplasmagallisepticum)、绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)、犬支原体(Mycoplasmacanis)、滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae)、直肠真杆菌(Eubacterium rectale)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、细长真杆菌(Eubacterium dolichum)、棒状乳杆菌亚种Torquens(Lactobacillus coryniformis subsp.Torquens)、营养泥杆菌(Ilyobacter polytropus)、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)、

嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)、解纤维热酸菌(Acidothermuscellulolyticus)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、微小亚历山大藻(Elusimicrobium minutum)、Nitratifractor salsuginis、螺旋菌属(Sphaerochaetaglobus)、产琥珀酸丝似状杆菌亚种丝状杆菌(Fibrobacter succinogenessubsp.Succinogenes)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、黄褐二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga ochracea)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、普氏菌藻(Prevotella micans)、栖瘤胃普雷沃菌(Prevotella ruminicola)、柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)、少食氨基单胞菌(Aminomonas paucivorans)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、SAR116(Candidatus Puniceispirillum marinum)、艾森虹蝴肾杆菌(Verminephrobacter eiseniae)、罗尔斯顿菌属(Ralstonia syzygii)、沟鞭玫瑰杆属(Dinoroseobacter shibae)、固氮螺菌(Azospirillum)、硝化菌(Nitrobacterhamburgensis)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)、产琥珀酸沃廉菌(Wolinellasuccinogenes)、空肠弯曲菌亚种曲菌(Campylobacter jejuni subsp.Jejuni)、雪貂螺杆菌(Helicobacter mustelae)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、食酸菌属(Acidovoraxebreus)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculumlavamentivorans)、罗氏菌(Roseburia intestinalis)、脑膜炎奈瑟氏菌(Nisseriameningitidis)、多杀巴斯德氏菌多杀亚种(Pasteurella multocida subsp.Multocida)、华德萨特菌(Sutterella wadsworthensis)、变形细菌(proteobacterium)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、副萨特菌(Parasutterella excrementihominis)、牛瘤胃沃林菌(Wolinella succinogenes)、和弗朗西斯氏菌(Francisella novicida)。

“Cas9”是指RNA引导的双链DNA结合核酸酶蛋白或切口酶蛋白。野生型Cas9核酸酶具有切割不同DNA链的两个功能结构域，例如RuvC和HNH。当两个功能结构域均激活时，Cas9可诱导基因组DNA(靶DNA)中的双链断裂。Cas9酶可以包含一种或多种衍生自选自下组的细菌的Cas9蛋白的催化结构域：棒杆菌属(Corynebacter)、萨特氏菌属(Sutterella)、军团菌属(Legionella)、密螺旋体属(Treponema)、产线菌属(Filifactor)、真杆菌属(Eubacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、支原体属(Mycoplasma)、拟杆菌属(Bacteroides)、Flaviivola、黄杆菌属(Flavobacterium)、螺旋体属(Sphaerochaeta)、固氮螺菌属(Azospirillum)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、罗氏菌属(Roseburia)、细小棒菌属(Parvibaculum)、葡萄球菌(Staphylococcus)、互营菌属(Nitratifractor)和弯曲菌属(Campylobacter)。在一些实施方式中，Cas9是融合蛋白，例如，两个催化结构域来源于不同的细菌种类。

Cas9核酸酶的可用变体可包括单个无活性催化结构域，例如RuvC-或HNH-酶或切口酶。Cas9切口酶仅具有一个活性功能结构域，并且可以仅切割靶DNA的一条链，从而产生单链断裂或缺口。在一些实施方式中，至少具有D10A突变的突变型Cas9核酸酶是Cas9切口酶。在其他实施方式中，至少具有H840A突变的突变型Cas9核酸酶是Cas9切口酶。存在于Cas9切口酶中的突变的其它实例包括但不限于N854A和N863A。如果使用至少两个靶向DNA的RNA靶向相对的DNA链，则可以使用Cas9切口酶引入双链断裂。双链断裂诱导的双切口可以由NHEJ或HDR修复(Ran等，2013，细胞，154：1380-1389)。该基因编辑策略有助于HDR，并减少非靶DNA位点的indel突变频率。Cas9核酸酶或切口酶的非限制性实例描述于例如专利号8,895,308；8889418和8,865,406的美国专利，以及公开号2014/0356959，2014/0273226和2014/0186919美国专利申请。Cas9核酸酶或切口酶可以针对靶细胞或靶生物进行密码子优化。

在一些实施方式中，Cas核酸酶可以是包含两个沉默突变：RuvC1和HNH核酸酶结构域(D10A和H840A)的Cas9多肽，其被称为dCas9(Jinek等，科学，2012,337：816-821；Qi等，细胞，152(5)：1173-1183)。在一个实施方式中，来自酿脓链球菌的dCas9多肽在以下位点包含至少一个突变：D10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986、A987、或其任意组合。该dCas9多肽及其变体的描述提供在，例如公开号WO 2013/176772的国际专利中。dCas9酶可以在D10，E762，H983或D986包含一个突变，并在H840或N863包含一个突变。在某些情况下，dCas9酶包含D10A或D10N突变。同样，dCas9酶可以包含H840A，H840Y或H840N。在一些实施方式中，本发明的dCas9酶包含以下取代：D10A和H840A；D10A和H840Y；D10A和H840N；D10N和H840A；D10N和H840Y；或D10N和H840N。取代可以是保守的或非保守的取代，以使Cas9多肽催化无活性并且能够结合靶DNA。

对于基因组编辑方法，Cas核酸酶可以是Cas9融合蛋白，例如包含与dCas9连接的IIS型限制酶FokI的催化结构域的多肽。FokI-dCas9融合蛋白(fCas9)可以利用两条引导RNA，去结合靶DNA单链，以产生双链断裂。

2.锌指核酸酶(ZFN)

“锌指核酸酶”或“ZFN”是FokI的切割结构域和含有3个或更多个锌指基序的DNA识别结构域之间的融合物。两个单独ZFN的DNA中特定位置的异源二聚体,以精确方向和间隔，导致DNA中的双链断裂。在一些情况下，ZFN将切割结构域融合到各锌指结构域的C末端。为使两个切割结构域二聚化并切割DNA，两个单独的ZFN在相隔一定距离处，以其C末端结合DNA的相反链。在一些情况下，锌指结构域和切割结构域之间的接头序列需要将各结合位点的5’端分开约5-7bp。可用于本发明的示例性ZFN包括但不限于，Urnov等，遗传学自然评论，2010,11：636-646；Gaj等，自然方法，2012,9(8)：805-7；专利号6,534,261、6,607,882、6746838、6794136、6,824,978、6866997、6,933,113、6,979,539、7,013,219、7030215、7220719、7241573、7241574、7585849、7595376、6,903,185、6479626的美国专利；和公开号2003/0232410和2009/0203140的美国申请中描述的ZFN。

ZFN可以在靶DNA中产生双链断裂，导致DNA断裂修复，而修复允许基因修饰的引入。DNA断裂修复可以通过非同源末端结合(NHEJ)或同源介导修复(HDR)发生。在HDR中，可以提供包含靶DNA位点侧翼同源臂的供体DNA修复模板。

在一些实施方式中，ZFN是锌指切口酶，其是诱导位点特异性单链DNA断裂或缺口，从而导致HDR的工程化ZFN。锌指切口酶的描述可以在例如Ramirez等，核酸研究，2012,40(12)：5560-8；Kim等，基因组研究，2012,22(7)：1327-33中找到。

3.TALENs

“TALEN”或“TAL效应核酸酶”是包含DNA结合串联重复的核心结构域，核定位信号和C-末端转录激活结构域的工程转录激活因子样效应物核酸酶。在一些情况下，DNA结合串联重复序列的长度为33-35个氨基酸，并且在12和13位含有两个高变性氨基酸残基，其可以识别一个或多个特异性DNA碱基对。TALEN可以通过将TAL效应子DNA结合结构域融合到DNA切割结构域产生。例如，TALE蛋白可以融合到核酸酶，如野生型或突变的FokI内切核酸酶或FokI催化结构域。FokI的几种突变已经用于TALEN，例如，其提高了切割特异性或活性。这样的TALEN可以被工程化以结合任何所需的DNA序列。

TALEN可用于产生基因修饰，通过在靶DNA序列中产生双链断裂，其又反过来经受NHEJ或HDR。在某些情况下，提供单链供体DNA修复模板以促进HDR。

TALEN的详细描述及其基因编辑的用途可以在，例如专利号8,440,431、8440432、8450471、8586363和8,697,853的美国专利；Scharenberg等，当代基因治疗，2013,13(4)：291-303；Gaj等，自然方法，2012,9(8)：805-7；Beurdeley等，自然通信，2013,4：1762；以及Joung和Sander，自然分子细胞生物学评论，2013,14(1)：49-55中找到。

4.大范围核酸酶

“大范围核酸酶”是罕见切割内切核酸酶(rare-cutting endonucleases)或归巢内切核酸酶(homing endonucleases)，其可以高度特异性的识别DNA靶位点，其长度至少为12个碱基对，例如12-40个碱基对或12-60个碱基对。大范围核酸酶可以是模块化的DNA结合核酸酶，例如包含至少一个内切核酸酶的催化结构域，和至少一个DNA结合结构域或蛋白特异性核酸靶序列的任何融合蛋白。DNA结合结构域可以含有至少一个识别单链或双链DNA的基序。大范围核酸酶可以是单体或二聚体。

在某些情况下，大范围核酸酶是天然存在的(自然中发现)或野生型，而在其他情况下，大范围核酸酶是非天然的、人工的、工程化的、合成的、理性设计的、或人造的。在某些实施方式中，本发明的大范围核酸酶包括I-CreI大范围核酸酶、I-CeuI大范围核酸酶、I-MsoI大范围核酸酶、I-SceI大范围核酸酶、其变体、其突变体、及其衍生物。

有用的大范围核酸酶及其在基因编辑中的应用的详细描述可以在例如Silva等，当代基因治疗，2011,11,11(1)：11-27；Zaslavoskiy等，BMC生物信息学，2014,15：191；Takeuchi等，美国科学学院学报，2014,111(11)：4061-4066；和专利号7,842,489、7897372、8021867、8163514、8133697、8021867、8119361、8119381、8,124,36、和8,129,134的美国专利中找到。

B.小分子化合物

本发明部分地基于意外发现，即利用核酸酶介导的基因编辑方法，例如CRISPR/Cas系统，小分子化合物例如β肾上腺素受体激动剂(例如L755507)和布雷菲德菌素A可以增强敲入或HDR效率和/或抑制敲除或NHEJ效率。此外，意外地发现利用核酸酶介导的基因编辑方法，例如CRISPR/Cas系统，核苷类似物如胸苷类似物(例如叠氮胸苷(AZT)和三氟尿苷(TFT))可以降低敲入或HDR效率和/或增强敲除或NHEJ效率。

术语“β肾上腺素受体激动剂”或“β-肾上腺素能受体激动剂”是指可以结合β1，β2或β3肾上腺素受体并刺激反应的化合物、分子、药剂或药物。β肾上腺素受体激动剂的非限制性实例包括L755507(CAS 159182-43-1)、阿贝特龙(abediterol)、阿米膦格因(amibegron)、阿布他明(arbutamine)、福莫特罗(arformoterol)、阿罗洛尔(arotinolol)、班布特罗(bambuterol)、苯呋洛尔(befunolol)、比托特罗(bitolterol)、溴乙酰烯丙心安甲烧(bromoacetylalprenololmenthane)、溴沙特罗(broxaterol)、布酚宁(buphenine)、卡布特罗(carbuterol)、卡莫特罗(carmoterol)、西马特罗(cimaterol)、克仑特罗(clenbuterol)、得诺巴明(denopamine)、地特诺(deterenol)、地匹福林(dipivefrine)、多巴酚丁胺(dobutamine)、多巴胺(dopamine)、多培沙明(dopexamine)、麻黄素、肾上腺素、乙基麻黄碱(etafedrine)、依替福林(etilefrine)、乙基去甲肾上腺素(ethylnorepinephrine)、非诺特罗(fenoterol)、2-氟去甲肾上腺素(2-fluoronorepinephrine)、5-氟去甲肾上腺素(5-fluoronorepinephrine)、福莫特罗(formoterol)、海索那林(hexoprenaline)、去甲乌药碱(higenamine)、茚达特罗(indacaterol)、异他林(isoetarine)、isoetherine、异丙基肾上腺素(isoproterenol)、异丙肾上腺素(isoprenaline)、N-异丙基章鱼胺(N-isopropyloctopamine)、异舒普林(isoxuprine)、拉贝洛尔(labetalol)、左沙丁胺醇(levalbuterol)、左旋异肾上腺素(levonordefrin)、左旋沙丁胺醇(levosalbutamol)、马布特罗(mabuterol)、奥西那林(metaproterenol)、间羟胺(metaraminol)、甲氧那明(methoxyphenamine)、甲基多巴(methyldopa)、正肾上腺素(norepinephrine)、间羟异丙肾上腺素(orciprenaline)、奥达特罗(olodaterol)、奥昔非君(oxyfedrine)、苯丙醇胺(phenylpropanolamine)、吡布特罗(pirbuterol)、普瑞特罗(prenalterol)、丙卡特罗(procaterol)、伪麻黄碱(pseudoephedrine)、莱克多巴胺(ractopamine)、瑞普特罗(reproterol)、利米特罗(rimiterol)、羟苄羟麻黄碱(ritodrine)、沙丁胺醇(salbutamol)、沙美特罗(salmeterol)、间苯三酚(sinterol)、β3-肾上腺受体激动剂GW427353(solabegron)、特布他林(terbulaline)、曲托喹酚(tretoquinol)、妥洛特罗(tulobuterol)、维兰特罗(vilanterol)、扎莫特罗(xamoterol)、齐帕特罗(zilpaterol)、齐帕特罗(zinterol)、LAS100977、PF-610355、L748337、BRL37344、其衍生物、其类似物及其组合。

布雷菲德菌素A(BFA)是从棕榈酸酯(C₁₆)合成的大环内酯抗生素。BFA类似物的非限制性实例包括BFA内酰胺、6(R)-羟基-BFA、7-脱氢布雷菲德苷A(7-氧代-BFA)、及其组合。

术语“核苷类似物”是指作为嘧啶(例如胞嘧啶，尿嘧啶或胸腺嘧啶)或嘌呤(例如腺嘌呤或鸟嘌呤)类似物的化合物、分子、试剂或药物。核苷类似物的非限制性实例包括叠氮胸苷(AZT)、三氟尿嘧啶(三氟胸苷或TFT)、氟尿苷(5-氟-2’-脱氧尿苷(FdU))、碘苷、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)、吉西他滨、去羟肌苷(2’、3’-二脱氧肌苷，ddI)、扎西他宾(双脱氧胞苷；2’，3’-双脱氧胞苷，ddC)、司他夫定(2’，3’-二脱氢-2’，3’-二脱氧胸苷，d4T)、拉米夫定(2’，3’-二脱氧-3’-硫杂胞苷，3TC)、阿巴卡韦、阿立他滨、恩曲他滨(FTC)、恩替卡韦、阿拉伯糖基腺苷(arabinosyl adenosine,Ara-A)、氟尿嘧啶阿拉伯糖苷、巯嘌呤核苷、5-氮杂-2’-脱氧胞苷、阿糖基5-氮杂胞嘧啶、6-氮尿苷、阿扎立平、6-氮杂胞苷、三氟甲基-2’-脱氧尿苷、胸苷、硫鸟苷、3-脱氮咔啶、2-氯-2’-脱氧腺苷(2-CdA)、5-溴脱氧尿苷5’-甲基膦酸酯、氟达拉滨(2-F-ara-AMP)、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、2-氯脱氧腺苷(CdA)、4’-硫代-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶、8-氨基-腺苷、阿昔洛韦、阿德福韦酯、别嘌呤醇、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、咖啡因、卡培他滨、西多福韦、克拉屈滨、氯倍他滨、地西他滨、去羟肌苷、二苯丙氨酸、恩曲他滨、恩替卡韦、康昔洛韦、氟胞嘧啶、氟达拉滨、氟尿苷、丙氧鸟苷、吉西他滨、拉米夫定、巯嘌呤、奈拉滨、喷西洛维(penicyclovir)、己酮可可碱(pentoxyfylline)、培美曲塞、三唑核苷、司他夫定、替比夫定、替诺福韦、可可碱、茶碱、硫鸟嘌呤、三氟尿苷、伐昔洛韦、替康昔洛韦(valgancyclovir)、阿糖腺苷、扎西他宾、齐多夫定、吡唑并嘧啶核苷、其盐、其衍生物及其组合。

本文所述的小分子可以与进行核酸酶介导的基因组编辑，例如基于CRISPR/Cas的基因修饰的细胞接触。使用的小分子化合物的浓度可以是约0.01μM-10μM,例如，约0.01μM-0.05μM、约0.01μM-0.1μM、约0.01μM-0.2μM、约0.01μM-0.4μM、约0.01μM-0.6μM、约0.01μM-0.8μM、约0.01μM-1μM、约0.01μM-2μM、约0.01μM-3μM、约0.01μM-4μM、约0.01μM-5μM、约0.01μM-6μM、约0.01μM-7μM、约0.01μM-8μM、约0.01μM-9μM、约0.1μM-1μM、约0.1μM-2μM、约0.1μM-3μM、约0.1μM-4μM、约0.1μM-5μM、约0.1μM-6μM、约0.1μM-7μM、约0.1μM-8μM、约0.1μM-9μM、约0.1μM-10μM、约0.5μM-1μM、约0.5μM-2μM、约0.5μM-4μM、约0.5μM-6μM、约0.5μM-8μM、约0.5μM-10μM、约1μM-2μM、约1μM-4μM、约1μM-6μM、约1μM-8μM、约1μM-10μM、约2μM-4μM、约2μM-6μM、约2μM-8μM、约2μM-10μM、约4μM-6μM、约4μM-8μM、约4μM-10μM、约6μM-8μM、约6μM-10μM、或约8μM-10μM。使用的小分子的浓度至少为约0.01μM，例如，至少约0.02μM、至少约0.04μM、至少约0.06μM、至少约0.08μM、至少约0.1μM、至少约0.2μM、至少约0.4μM、至少约0.6μM、至少约0.8μM、至少约1μM、至少约2μM、至少约4μM、至少约6μM、至少约8μM、或至少约10μM。经基因编辑的细胞可以用小分子化合物处理约0-72小时，例如约0-72小时、约0-12小时、约0-24小时、约0-36小时、约0-48小时、约0-60小时、约12-24小时、约12-36小时、约12-48小时、约12-60小时、约12-72小时、约24-36小时、约24-48小时、约24-60小时、约24-72小时、约36-48小时、约36-60小时、约36-72小时、约48-60小时、约48-72小时、或约60-72小时，在核酸酶介导的基因编辑方法如CRISPR/Cas系统的组分引入细胞后。在一些实施方式中，该细胞与小分子化合物接触约1-72小时，例如约1-12小时、约1-24小时、约1-36小时、约1-48小时、约1-60小时、约1-72小时、约12-24小时、约12-36小时、约12-48小时、约12-60小时、约12-72小时、约24-36小时、约24-48小时、约24-60小时、约24-72小时、约36-48小时、约36-72小时、或约48-72小时。

在具体实施方式中，本发明的小分子化合物可用于调控利用任何CRISPR/Cas系统的基因组编辑，该CRISPR/Cas系统包括从例如美国生命技术公司、Sigma-Aldrich、Addgene、傲锐基因、Clontech商购的，以及专利号8,697,359、8,795,965、8,865,406、8,889,356和8,906,616的美国专利和公开号2014/0068797、2014/0342456和2014/0356959的美国申请中描述的。

C.用于HDR的供体修复模板

本文提供了包含报告盒的重组供体修复模板，所述报告盒包含编码报告多肽(例如，可检测多肽，荧光多肽或选择性标记)的核苷酸序列和位于报告盒侧翼的两个同源臂，并与在DNA核酸酶(如Cas9核酸酶)剪切位点的任一侧的部分靶DNA(如靶基因或位点)同源。报告盒可以进一步包含编码自我剪切肽、一个或多个核定位信号和/或荧光多肽(如超级GFP(sfGFP))的序列。

在一些实施方式中，同源臂具有相同的长度。在另一些实施方式中，同源臂具有不同的长度。同源臂可以是至少约10个碱基对(bp)，如至少约10bp、15bp、20bp、25bp、30bp、35bp、45bp、55bp、65bp、75bp、85bp、95bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、550bp、600bp、650bp、700bp、750bp、800bp、850bp、900bp、950bp、1000bp、1.1千碱基(kb)、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2.0kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb、3.0kb、3.1kb、3.2kb、3.3kb、3.4kb、3.5kb、3.6kb、3.7kb、3.8kb、3.9kb、4.0kb、或更长。同源臂可以是约10bp-4kb，如约10bp-20bp、约10bp-50bp、约10bp-100bp、约10bp-200bp、约10bp-500bp、约10bp-1kb、约10bp-2kb、约10bp-4kb、约100bp-200bp、约100bp-500bp、约100bp-1kb、约100bp-2kb、约100bp-4kb、约500bp-1kb、约500bp-2kb、约500bp-4kb、约1kb-2kb、约1kb-2kb、约1kb-4kb、或约2kb-4kb。

供体修复模板可以克隆到表达载体中。可以使用本领域普通技术人员已知的常规的基于病毒和非病毒的表达载体。

代替重组供体修复模板，单链寡脱氧核苷酸(ssODN)供体模板可用于同源重组介导的修复。ssODN可用于在靶DNA中引入短修饰。例如，ssODN适合于精确校正基因突变，如SNP。ssODN含有两个侧翼、在Cas9剪切的靶点的每一侧的同源序列，并且可以导向相对于靶DNA在正义或反义方向。每个侧翼序列可以是至少约10个碱基对(bp)，如至少约10bp、15bp、20bp、25bp、30bp、35bp、40bp、45bp、50bp、55bp、60bp、65bp、70bp、75bp、80bp、85bp、90bp、95bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、550bp、600bp、650bp、700bp、750bp、800bp、850bp、900bp、950bp、1kb、2kb、4kb、或更长。在一些实施方式中，每个同源臂为约10bp-4kb，如约10bp-20bp,about、约10bp-50bp、约10bp-100bp、约10bp-200bp、约10bp-500bp、约10bp-1kb、约10bp-2kb、约10bp-4kb、约100bp-200bp、约100bp-500bp、约100bp-1kb、约100bp-2kb、约100bp-4kb、约500bp-1kb、约500bp-2kb、约500bp-4kb、约1kb-2kb、约1kb-2kb、约1kb-4kb、或约2kb-4kb。ssODN可以是长度至少约25个核苷酸(nt)，例如至少约25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt、80nt、85nt、90nt、95nt、100nt、150nt、200nt、250nt、300nt、或更长。在一些实施方式中，ssODN长度为约25-50；约50-100；约100-150；约150-200；约200-250；约250-300；或约25nt-300nt。

D.靶细胞

本发明可用于调控任何目标靶细胞的基因组编辑。靶细胞可以是来自任何生物体的细胞，例如细菌细胞，古细菌细胞，单细胞真核生物的细胞，植物细胞(如稻谷细胞、小麦细胞、番茄细胞、拟南芥细胞、玉米细胞等)，藻类细胞(如葡萄藻、衣藻、海洋富油微拟球藻、蛋白核小球藻、展枝马尾藻(Sargassum patens C.Agardh)等)，真菌细胞(如酵母细胞等)，动物细胞，来自无脊椎动物(如果蝇、刺胞动物，棘皮动物，线虫等)的细胞，来自脊椎动物(如鱼、两栖动物、爬行动物、鸟、哺乳动物等)的细胞，来自哺乳动物的细胞，来自人的细胞，来自健康人的细胞，来自人类患者的细胞，来自癌症患者的细胞等。在一些情况下，通过本发明的方法处理的靶细胞可以移植到受试者(例如患者)。例如，靶细胞可以来自待治疗的受试者(例如，患者)。

任何类型的细胞可能是有感兴趣的，例如干细胞(如胚胎干细胞，诱导多能干细胞，成体干细胞(如间充质干细胞)，神经干细胞，造血干细胞，器官干细胞)，祖细胞，体细胞(如成纤维细胞，肝细胞(hepatocyte)，心脏细胞，肝细胞(liver cell)，胰腺细胞，肌细胞，皮肤细胞，血细胞，神经细胞，免疫细胞和身体(如人体)的任何其它细胞)。细胞可以是来自受试者(如动物受试者或人受试者)的原代细胞或原代细胞培养物，并允许在体外生长有限数量的传代。在一些实施方式中，细胞是疾病细胞或来自患有疾病的受试者。例如，细胞可以是癌症或肿瘤细胞。细胞也可以是例如来自癌细胞系的永生化细胞(如细胞系)。

可以通过任何标准方法从受试者收集原代细胞。例如，可以通过组织活检或细针抽吸收集来自组织(如皮肤，肌肉，骨髓，脾脏，肝脏，肾脏，胰腺，肺，肠，胃等)的细胞，。可以从全血，血浆或血清中分离血细胞和/或免疫细胞。在一些情况下，合适的原代细胞包括外周血单核细胞(PBMC)，外周血淋巴细胞(PBL)和其它血细胞亚群，例如但不限于T细胞，自然杀伤细胞，单核细胞，天然杀伤剂T细胞，单核细胞前体细胞，造血干细胞或非多能干细胞。在一些情况下，细胞可以是任何免疫细胞，包括任何T细胞如肿瘤浸润细胞(TILs)，例如CD3+T细胞，CD4+T细胞，CD8+T细胞或任何其它类型的T细胞。T细胞也可以包括记忆T细胞，记忆干T细胞或效应T细胞。T细胞也可能倾向于特定的群体和表型。例如，T细胞可以倾向于表型包含CD45RO(-),CCR7(+),CD45RA(+),CD62L(+),CD27(+),CD28(+)和/或IL-7Rα(+)。可以选择合适的细胞，其包含选自下列的多个标志物之一：CD45RO(-)、CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L(+)、CD27(+)、CD28(+)、和/或IL-7Rα(+)。根据如美国专利号7,682,828,8,058,065,8,530,238,8,871,504,8,900,871和8,791,248(为了所有目的将其全部内容通过引用并入本文)中所述的标准方案，诱导的多能干细胞可以由分化细胞产生，。

在一些实施方式中，靶细胞在体外。在另一些实施方式中，靶细胞是离体的。在又一些实施方式中，靶细胞是体内的。

E.将核酸酶介导的基因组编辑的组件转入细胞

将多肽和核酸转入靶细胞(宿主细胞)的方法是本领域已知的，并且可以使用任何已知的方法来将核酸酶或核酸(如编码核酸酶的核苷酸序列，DNA-靶向的RNA(如单导向RNA)，用于同源介导修复(HDR)的供体修复模板等)转入细胞，例如干细胞，祖细胞或分化细胞。合适方法的非限制性实例包括电穿孔，病毒或噬菌体感染，转染，缀合，原生质体融合，脂质转染，磷酸钙沉淀法，聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染，DEAE-葡聚糖介导的转染，脂质体介导的转染，粒子枪技术，磷酸钙沉淀，直接显微注射，纳米颗粒介导的核酸递送等。

在一些实施方式中，可以使用递送系统将核酸酶介导的基因组编辑的组分转入靶细胞。在某些情况下，递送系统包括纳米颗粒，微粒(如聚合物微聚合物)，脂质体，胶束，病毒颗粒(virosome)，病毒颗粒(viral particle)，核酸复合物，转染剂，电穿孔剂(如使用NEON转染系统)，核转染试剂，脂质转染试剂，和/或包含核酸酶组分(作为多肽或由表达构建物编码的)和一种或多种核酸组分(如DNA靶向的RNA和/或供体修复模板)的缓冲系统。例如，组分可以与脂转染试剂混合，使得它们被包封或包装成阳离子亚微米水包油乳液。或者，组分可以在没有递送系统的情况下递送，例如作为水溶液。

制备脂质体和在脂质体中封装多肽和核酸的方法描述于，例如,方法和协议,卷1:药物纳米载体：方法和协议(ed.Weissig).Humana Press,2009和Heyes等(2005)控制释放杂志107:276-87。制备微粒和封装多肽和核酸的方法描述于，例如，功能性聚合物胶体和微粒，卷4(微球、微胶囊、脂质体)。(eds.Arshady&Guyot).Citus Books,2002和递送蛋白和疫苗的微粒系统(eds.Cohen&Bernstein).CRC Press,1996.

F.评估基因组编辑效率的方法

为了功能性检测是否存在正确的基因组编辑修饰，可以通过本领域已知的标准方法分析靶DNA。例如，可以使用突变检测试剂盒(集成DNA技术公司，科拉尔维尔，IA)或Guide-it^TMIndel鉴定试剂盒(Clontech，山景城，CA)，通过测序鉴定indel突变。可以通过基于PCR的方法并结合测序或RFLP分析来检测同源介导修复(HDR)。基于PCR的试剂盒的非限制性实例包括Guide-it突变检测试剂盒(Clontech)和基因组切割检测试剂盒(美国生命技术公司，卡尔斯巴德，CA)。也可以使用深度测序，特别是对于大量样品或潜在靶/脱靶位点。

在某些实施方式中，基因编辑的效率(例如，特异性)对应靶内基因切割事件的数量或百分比相对全部基因切割事件(包括靶内和脱靶事件)的数量或百分比的值。

在一些实施方式中，本文所述的小分子化合物(单独或与一种或多种DNA复制酶抑制剂组合)能够调控(例如增强或抑制(减弱))靶DNA序列的基因编辑。基因组编辑可以包括同源介导修复(HDR)(例如插入、缺失或点突变)或非同源末端结合(NHEJ)。

在某些实施方式中，与其不存在相比(例如，未与小分子化合物接触的对照细胞)，在本文所述的小分子化合物(单独或与DNA复制酶抑制剂组合)存在下，细胞中靶DNA序列的核酸酶介导的基因编辑的效率增强至少约0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、或更多。在一些实施方式中，本文所述的小分子化合物，例如β肾上腺素受体激动剂(例如L755507)和布雷菲德菌素A，可以将对于大片段插入的CRISPR介导的HDR效率提高至少约3倍，对于点突变提高至少约9倍。在其它实施方式中，本文所述的小分子化合物例如核苷类似物(例如叠氮胸苷(AZT))可以将CRISPR介导的NHEJ效率提高至少约2倍。

在某些其他实施方式中，与其不存在相比(例如，未与小分子化合物接触的对照细胞)，在本文所述的小分子化合物(单独或与DNA复制酶抑制剂组合)存在下，细胞中靶DNA序列的核酸酶介导的基因编辑效率减弱至少约0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、或更多。在某些实施方式中，本文所述的小分子化合物例如核苷类似物(例如叠氮胸苷(AZT)、三氟尿苷(TFT)等)可以将CRISPR介导的NHEJ效率提高至少约3倍。在其它实施方式中，本文所述的小分子化合物例如β肾上腺素受体激动剂(例如L755507)可以将CRISPR介导的NHEJ效率减弱至少约2倍。

G.用于调控节基因编辑的小分子化合物的应用

本文所述的小分子化合物以及利用本发明的系统和方法鉴定的化合物可用于调控基因编辑的效率。例如，该调控可以是增强基因组编辑的效率。在某些情况下，该调控可以是细胞毒性的降低。该化合物可以应用于基于核酸酶的基因疾病的靶向治疗剂。用于精确校正原发性患者细胞基因组中的基因突变的当前方法是非常低效的(少于1％的细胞可以被精确编辑)。本文提供的小分子可以增强基因编辑的活性，并增加基于基因编辑的疗法的功效。由于小分子在生理剂量和短时间内发挥功能，因此可用于患基因疾病对象的基因的体内基因编辑。可以通过任何合适的施用途径和以足以增强基于核酸酶的疗法效果(例如，改善基因编辑效率)的剂量或量，向对象施用小分子化合物。

可以用该方法治疗的疾病包括但不限于镰状细胞性贫血、地中海贫血、血友病、瘤变、癌症、年龄相关性黄斑变性、精神分裂症、三核苷酸重复病症、脆性X综合征、朊病毒相关病症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、药物成瘾、自闭症、阿尔茨海默病、帕金森病、囊性纤维化、血液和凝血疾病或病症、炎症、免疫相关疾病或病症、代谢疾病、肝脏疾病和病症、肾脏疾病和病症、肌肉/骨骼疾病和病症(例如肌营养不良、杜氏肌营养不良)、神经和神经元疾病和病症、心血管疾病和病症、肺部疾病和病症、以及眼部疾病和病症等。

小分子化合物可用于产生转基因生物，如转基因动物、植物和细胞。转基因生物的产生需要胚胎细胞或受精卵的精确的缺失、插入或突变。由于效率低下，筛选包含所需修饰的胚胎是非常困难的，并且是非常低效和昂贵的(时间和金钱)过程。通过使用增强基因编辑(例如，甚至达两倍)的化合物，将需要筛选的胚胎以鉴定具有所需修饰的胚胎更少，从而降低产生转基因生物的成本。小分子可用于降低细胞毒性。

H.调控CRISPR/Cas9介导的基因组编辑的小分子化合物的鉴定

基因组修饰的CRISPR/Cas系统包括Cas9核酸酶或其变体、包含引导序列(将Cas9靶向靶基因组DNA)的靶向DNA的RNA(例如，单向导RNA或sgRNA)、和与Cas9相互作用的scaffold序列(例如tracrRNA)和任选的供体修复模板。在一些情况下，Cas9的变体，如Cas9突变体包含一个或多个以下突变：D10A、H840A、D839A和H863A，或可以代替Cas9核酸酶的Cas9切口酶。供体修复模板可以包括编码报告多肽(例如荧光蛋白或抗生素抗性标记)的核苷酸序列，以及与靶DNA同源且位于基因修饰位点两侧的同源臂。或者，供体修复模板可以是ssODN。

1.靶DNA

在CRISPR/Cas系统中，靶DNA序列可以与靶向DNA的RNA片段互补，并且可以紧跟着前间区序列邻近基序(PAM)序列。靶DNA位点可以直接位于PAM序列的5’端，其特定于使用的Cas9的细菌种类。例如，衍生自酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的Cas9的PAM序列是NGG；衍生自脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)的Cas9的PAM序列为NNNNGATT；衍生自嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)的Cas9的PAM序列是NNAGAA；和衍生自齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)的Cas9的PAM序列是NAAAAC。在一些实施方式中，PAM序列是5’-NGG，其中N是任意核苷酸；5’-NRG，其中N是任意核苷酸且R是嘌呤；或5’-NNGRR，其中N是任意核苷酸且R是嘌呤。对于酿脓链球菌系统，选定的靶DNA序列紧靠在(例如，位于5’)5’NGG PAM之前，其中N是任意核苷酸，使得靶向DNA的RNA的引导序列与相反链配对，从而在PAM序列上游约3碱基对处介导切割。

在一些实施方式中，当使用合适的比对算法进行最佳比对时，靶向DNA的RNA的引导序列与相应靶DNA序列之间的互补程度为约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或以上。可以利用比对序列的任何合适算法来确定最佳比对，其非限制性实例包括Smith-Waterman算法、Needleman-Wunsch算法、基于Burrows-Wheeler变换的算法(例如，Burrows Wheeler比对法)、ClustalW，Clustal X，BLAT，Novoalign(Novocraft科技，雪兰莪州，马来西亚)和ELAND(依诺米那，圣地亚哥，CA)。

可以在预先确定的基因组序列(基因)中选择靶DNA位点，利用基于网络的软件，例如ZiFiT Targeter软件(Sander等，2007，核酸研究，35：599-605；Sander等，2010，核酸研究，38：462-468)、E-CRISP(Heigwer等，2014，自然方法，11：122-123)、RGEN工具(Bae等，2014，生物信息学，30(10)：1473-1475)，CasFinder(Aach等，2014，bioRxiv)、DNA2.0gNRA设计工具(DNA2.0，门洛帕克，CA)和CRISPR设计工具(布罗德研究所，剑桥，MA)。这样的工具分析基因组序列(例如，目标基因或位点)并鉴定用于基因编辑的合适靶点。为了评估各靶向DNA的RNA的脱靶基因修饰，基于碱基对错配同一性、位置和分布的定量特异性分析，进行脱靶位点的计算性预测。

2.靶向DNA的RNA

本文提供的引导核酸可以是靶向DNA的RNA。该靶向DNA的RNA(例如，单向导RNA或sgRNA)可以包含与靶DNA中特定序列互补的核苷酸序列(例如，引导序列)和与Cas9多肽或其变体相互作用的蛋白质结合序列(例如，scaffold序列或tracrRNA)。靶向DNA的RNA的引导序列可以包含约10-2000个核酸，例如约10-100个核酸、约10-500个核酸、约10-1000个核酸、约10-1500个核酸、约10-2000个核酸、约50-100个核酸、约50-500个核酸、约50-1000个核酸、约50-1500个核酸、约50-2000个核酸、约100-500个核酸、约100-1000个核酸、约100-1500个核酸、约100-2000个核酸、约500-1000个核酸、约500-1500个核酸、约500-2000个核酸、约1000-1500个核酸、约1000-2000个核酸、或约1500-2000个核酸，其可利用RNA-DNA互补碱基配对将Cas9引导至靶DNA位点。在一些实施方式中，靶向DNA的RNA的引导序列在5’端包含约100个核酸，其可利用RNA-DNA互补碱基配对将Cas9引导至靶DNA位点。在一些实施方式中，引导序列在5’端包含约20个核酸，其可利用RNA-DNA互补碱基配对将Cas9引导至靶DNA位点。在其他实施方式中，引导序列包含至少20个，例如19、18、17、16、15个或更少核酸，其可与靶DNA位点互补。引导序列可以包含17个核酸，其可引导Cas9至靶DNA位点。在一些情况下，引导序列在靶向区域5’端的互补区中含有约1-10个核酸错配。在其他情况下，引导序列在靶向区域3’端的最后约5-12个核酸处的互补区中不存在错配。

靶向DNA的RNA的蛋白质结合序列包含彼此杂交以形成双链RNA双螺旋(dsRNAduplex)的两个互补延伸的核苷酸。所述的蛋白结合序列可以是约30-200个核苷酸，例如，约40-200个核苷酸、约50-200个核苷酸、约60-200个核苷酸、约70-200个核苷酸、约80-200个核苷酸、约90-200个核苷酸、约100-200个核苷酸、约110-200个核苷酸、约120-200个核苷酸、约130-200个核苷酸、约140-200个核苷酸、约150-200个核苷酸、约160-200个核苷酸、约170-200个核苷酸、约180-200个核苷酸、或约190-200个核苷酸。在某些方面，所述的蛋白结合序列可以是约30-190个核苷酸，例如，约30-180个核苷酸、约30-170个核苷酸、约30-160个核苷酸、约30-150个核苷酸、约30-140个核苷酸、约30-130个核苷酸、约30-120个核苷酸、约30-110个核苷酸、约30-100个核苷酸、约30-90个核苷酸、约30-80个核苷酸、约30-70个核苷酸、约30-60个核苷酸、约30-50个核苷酸、或约30-40个核苷酸。

靶向DNA的RNA的蛋白结合序列(例如tracrRNA)的示例性实施方式是5’-GTT GGAACC ATT CAA AAC AGC ATA GCA AGT TAA AAT AAG GCT AGT CCG TTA TCA ACT TGA AAAAGT GGC ACC GAG TCG GTG CTT TTT；SEQ ID NO:33.tracrRNA的另一示例性实施方式是5’-AAG AAA TTT AAA AAG GGA CTA AAA TAA AGA GTT TGC GGG ACT CTG CGG GGT TACAAT CCC CTA AAA CCG CTT TT；SEQ ID NO:34.tracrRNA的另一示例性实施方式是5’-ATCTAA AAT TAT AAA TGT ACC AAA TAA TTA ATG CTC TGT AAT CAT TTA AAA GTA TTT TGAACG GAC CTC TGT TTG ACA CGT CTG AAT AAC TAA AAA；SEQ ID NO:35.tracrRNA的另另一示例性实施方式是5’-TGT AAG GGA CGC CTT ACA CAG TTA CTT AAA TCT TGC AGA AGCTAC AAA GAT AAG GCT TCA TGC CGA AAT CAA CAC CCT GTC ATT TTA TGG CAG GGT GTTTTC GTT ATT T；SEQ ID NO:36.tracrRNA的另另一示例性实施方式是5’-TTG TGG TTT GAAACC ATT CGA AAC AAC ACA GCG AGT TAA AAT AAG GCT TAG TCC GTA CTC AAC TTG AAAAGG TGG CAC CGA TTC GGT GTT TTT TTT-3’；SEQ ID NO:37.

可以使用上述任何基于web的软件来选择靶向DNA的RNA。选择靶向DNA的RNA的考虑因素包括使用的Cas9多肽的PAM序列和最小化脱靶修饰的策略。工具，诸如CRISPR设计工具，可以提供制备靶向DNA的RNA的序列，用于评估靶修饰效率，和/或评估脱靶位点的切割。

编码靶向DNA的RNA的核苷酸序列可以克隆到表达盒或表达载体中。在一些实施方式中，核苷酸序列通过PCR产生并包含在表达盒中。对于实例，编码靶向DNA的RNA的核苷酸序列可以进行PCR扩增并附加至启动子序列，例如U6RNA聚合酶III启动子序列。在其它实施方式中，将编码靶向DNA的RNA的核苷酸序列克隆到表达载体中，该载体含有启动子，例如U6RNA聚合酶III启动子、转录控制元件、增强子、U6终止序列、一个或多个核定位信号等。在一些实施方式中，该表达载体是多顺反子或双顺反子，并且还可以包括编码荧光蛋白、表位标签和/或抗生素抗性标记的核苷酸序列。在双顺反子表达载体的某些情况下，编码例如荧光蛋白的第一核苷酸序列与编码例如抗生素抗性标记的第二核苷酸序列，通过编码自切割肽例如病毒性2A肽的序列，进行连接。2A肽包括口蹄疫病毒2A(F2A)；马鼻炎A病毒2A(E2A)；猪捷申病毒-1 2A(P2A)和四体病毒(Thoseaasigna virus)2A(T2A)，其具有高切割效率，使得两种蛋白可以同时表达，但从相同RNA转录物分别表达。

用于表达靶向DNA的RNA的合适的表达载体可从Addgene，Sigma-Aldrich和美国生命技术公司(Life Technologies)商业购得。表达载体可以是包含荧光蛋白mCherry的pLQ1651(Addgene目录号51024)。表达载体还可以含有编码Cas9或其变体的序列。这些表达载体的非限制性实例包括pX330、pSpCas9、pSpCas9n、pSpCas9-2A-Puro、pSpCas9-2A-GFP、pSpCas9n-2A-Puro、CRISPR核酸酶OFP载体等。

3.小分子文库

在将本发明的多核苷酸引入靶细胞后，所得细胞可以暴露于小分子化合物文库，以确定基因编辑的增强剂或抑制剂。在一些实施方式中，筛选小分子以鉴定增强特定细胞类型中特定靶位点处的DSB和/或HDR效率的小分子。

小分子可以以不损害细胞例如不诱导细胞死亡、坏死或凋亡的任何浓度处理细胞。可以用以下浓度处理细胞，约0.01μM-10μM,例如，约0.01μM-0.05μM、约0.01μM-0.1μM、约0.01μM-0.2μM、约0.01μM-0.4μM、约0.01μM-0.6μM、约0.01μM-0.8μM、约0.01μM-1μM、约0.01μM-2μM、约0.01μM-3μM、约0.01μM-4μM、约0.01μM-5μM、约0.01μM-6μM、约0.01μM-7μM、约0.01μM-8μM、约0.01μM-9μM、约0.1μM-1μM、约0.1μM-2μM、约0.1μM-3μM、约0.1μM-4μM、约0.1μM-5μM、约0.1μM-6μM、约0.1μM-7μM、约0.1μM-8μM、约0.1μM-9μM、约0.1μM-10μM、约0.5μM-1μM、约0.5μM-2μM、约0.5μM-4μM、约0.5μM-6μM、约0.5μM-8μM、约0.5μM-10μM、约1μM-2μM、约1μM-4μM、约1μM-6μM、约1μM-8μM、约1μM-10μM、约2μM-4μM、约2μM-6μM、约2μM-8μM、约2μM-10μM、约4μM-6μM、约4μM-8μM、约4μM-10μM、约6μM-8μM、约6μM-10μM、或约8μM-10μM。使用的小分子的浓度至少为约0.01μM，例如，至少约0.02μM、至少约0.04μM、至少约0.06μM、至少约0.08μM、至少约0.1μM、至少约0.2μM、至少约0.4μM、至少约0.6μM、至少约0.8μM、至少约1μM、至少约2μM、至少约4μM、至少约6μM、至少约8μM、或至少约10μM。of the small molecule.在一些实施方式中，细胞和测试的小分子化合物混合约0-72小时，例如约0-72小时、约0-12小时、约0-24小时、约0-36小时、约0-48小时、约0-60小时、约12-24小时、约12-36小时、约12-48小时、约12-60小时、约12-72小时、约24-36小时、约24-48小时、约24-60小时、约24-72小时、约36-48小时、约36-60小时、约36-72小时、约48-60小时、约48-72小时、或约60-72小时，在向细胞引入核酸酶后。

为了鉴定调控多功能干细胞中基因编辑的小分子，可以用小分子文库处理iPS细胞或包含本文所述系统的胚胎干细胞(包含具有病毒2A序列和核定位序列的GFP报告盒的供体修复模板)。与未经处理相比，如果更多用测试小分子处理的细胞是GFP阳性，该测试小分子可能是HDR介导的基因组编辑的增强剂。与未经处理相比，如果更少用测试小分子处理的细胞是GFP阳性，该测试小分子可能是HDR介导的基因组编辑的抑制剂。

本文提供的系统和方法还可以用于鉴定调控其他细胞类型和靶位点中的基因编辑的化合物。测试小分子化合物处理后，如果敲入效率，即HDR效率提高约0.5倍，0.6倍，0.7倍，0.8倍，0.9倍，1倍，1.1倍，1.2倍，1.3倍，1.4倍，1.5倍，2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍或更多，则确定该小分子化合物可以提高或增强敲入效率。小分子化合物处理后，如果敲入效率下降约0.5倍，0.6倍，0.7倍，0.8倍，0.9倍，1倍，1.1倍，1.2倍，1.3倍，1.4倍，1.5倍，2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍或更多，则该小分子化合物可能是HDR介导修复的抑制剂。

I.试剂盒

在某些方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含：(a)如本文所述的DNA核酸酶或编码DNA核酸酶的核苷酸序列；和(b)如本文所述的调控细胞中靶DNA基因组编辑的小分子化合物。所述试剂盒可以进一步包含如本文所述的多种下列组分之一：靶向DNA的RNA(如sgRNA)或编码靶向DNA的RNA的核苷酸序列；重组供体修复模板；DNA复制酶抑制剂；或其组合。编码DNA核酸酶的核苷酸序列，编码靶向DNA的RNA的核苷酸序列和/或重组供体修复模板可位于一个或多个表达载体中。该试剂盒还可以包括使用本文所述的表达载体进行修饰的细胞。在一些实施方式中，该试剂盒的表达载体已经被引入细胞。该试剂盒还可以包括说明书。

在具体实施方式中，本发明的试剂盒可以包括：(a)靶向DNA的RNA(例如sgRNA)或编码靶向DNA的RNA的核苷酸序列；(b)Cas9多肽或其变体或编码Cas9多肽或其变体的核苷酸序列；(c)调控细胞中靶DNA的基因组编辑的小分子化合物；和任选地(d)重组供体修复模板和/或(e)DNA复制酶抑制剂。在一些实施方式中，重组供体修复模板包含了包括靶DNA的两个非重叠同源部分的两条核苷酸序列，其中，核苷酸序列位于对应于靶DNA的核苷酸序列的5’和3’末端，以进行基因编辑。在一些实施方式中，小分子化合物包含β-肾上腺素受体激动剂(例如L755507)或其类似物、布雷菲德菌素A或其类似物、核苷类似物(例如叠氮胸苷(AZT)、三氟尿苷(TFT)等)，其衍生物，或其组合。该试剂盒还可以包括说明书。

在某些其他方面，本文提供了一种试剂盒，其包括含有编码Cas9多肽或其变体的多核苷酸序列的第一重组表达载体，含有编码引导RNA的多核苷酸序列的第二重组表达载体，所述引导RNA可操作地连接到启动子，和重组供体修复模板。单链向导RNA包含与预先选定的靶DNA互补的第一多核苷酸序列和与Cas9多肽或其变体相互作用的第二多核苷酸序列。重组供体修复模板包括报告盒和两个多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含来自靶插入位点的每一侧的靶DNA的两个非重叠同源序列。报告盒可以侧接两个多核苷酸序列。报告盒包括编码报告多肽(例如，荧光蛋白，酶或抗生素抗性标记)的多核苷酸序列和编码自我剪切肽的多核苷酸序列。在一些实施方式中，编码报告多肽的序列可操作地连接至至少一个，例如1、2、3、4、5或更多的核定位信号。重组供体修复模板可以位于表达载体中。该试剂盒还可以包括使用本文所述的表达载体进行修饰的细胞。在一些实施方式中，该试剂盒的表达载体已经被引入细胞。该试剂盒还可以包括说明书。

实施例

提供但不限于以下实施例来说明要求保护的发明。

实施例1.增强CRISPR介导的基因组编辑的小分子的鉴定

本实施例描述了可用于各种靶细胞的基于重组CRISPR/Cas9报告系统的高通量化学筛选平台。本实施例还说明了用于鉴定增强或降低系统中调控基因编辑的同源介导修复效率的小分子的方法。最后，本实施例描述了增强经Cas9切割的非同源末端接合的基因敲除的小分子。

概要

细菌CRISPR/Cas9系统已经成为通过非同源末端接合(NHEJ)进行序列特异性基因敲除的有效工具，但基因组序列的精准编辑仍然低效。此处，我们开发了一种基于报告的筛选方法，用于通过同源介导修复(HDR)调控精准基因组编辑的化合物的高通量筛选。使用该筛选方法，我们已经表征了增强CRISPR介导的HDR效率的小分子，对于大片段插入是3倍，对于点突变是9倍。有趣的是，我们还观察到，抑制HDR的小分子可以增强NHEJ介导的插入缺失突变。筛选的小分子以最小的毒性，在多种细胞类型中稳定地发挥功能。小分子的使用提供了一种增强精准基因组工程的应用的简单有效的策略，并有助于哺乳动物细胞中DNA修复机制的研究。

说明

细菌适应性免疫系统CRISPR(成簇的规律间隔短回文重复序列)-Cas(CRISPR相关蛋白)已被用于哺乳动物基因组的序列特异性编辑(Barrangou等，2007，科学，315,1709-1712；Cong等，2013，科学，339,819-823；Mali等，2013，科学，339,823-826；Smith等，2014，细胞干细胞，15,12-13；Wang等，2013，细胞，153,910-918；Yang等，2013，细胞，154,1370-1379)。CRISPR系统衍生自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)，使用Cas9核酸酶蛋白，其与含有20个核苷酸(nt)序列的单链向导RNA(sgRNA)复合，用于引入位点特异性双链断裂(Hsu等，2013，生物技术，31,827-832；Jinek等，2012，科学，337,816-821)。Cas9-sgRNA复合物对DNA的靶向，通过sgRNA和DNA之间的碱基配对以及相邻的NGG PAM(前间区序列邻近基序)序列(Marraffini和Sontheimer，2010，自然，463,568-571)的存在而具体化。双链断裂发生在PAM位点上游3bp处，其允许通过或者非同源末端接合(NHEJ)或者同源介导修复(HDR)的DNA修复途径进行靶向序列修饰，NHEJ引入了导致等位基因功能丧失的移码插入和缺失(indel)突变(Geurts等，2009，科学，325,433；Lieber和Wilson，2010，细胞，142,496-496.e491；Sung等，2013，自然生物技术，31,23-24；Tesson等，2011，自然生物技术，31,23-24；Wang等，2014，科学，343,80-84)，HDR可用于在靶位点上精确插入点突变或所需序列的片段(Mazón等，2010，细胞，142,648.e641-648.e642；Wang等，2014，科学，343,80-84；Yin等，2014，自然生物技术，32,551-553)。

迄今为止，利用NHEJ的CRISPR介导的基因敲除已经有效进行。例如，已报道的在小鼠胚胎干(ES)细胞和受精卵中敲除蛋白质编码基因的效率为20％至60％(Wang等，2013，细胞，153,910-918；Yang等，2013，细胞，154,1370-1379)。然而，由同源模板引导的序列片段或点突变的引入仍然相对低效(Mali等，2013，科学，339,823-826；Wang等，2013，细胞，153,910-918；Yang等，2013，细胞，154,1370-1379)。通常需要通过细胞分选或选择，扩增和测序进行漫长而繁琐的筛选程序，以确定正确编辑的细胞。改进CRISPR介导的精准基因编辑仍然是一个重大挑战。

已经表明，小分子化合物可以调控DNA修复途径(Hollick等，2003，生物有机化学与医药化学，13,3083-3086；Rahman等，2013，人类基因治疗，24,67-77；Srivastava等，2012，细胞，151,1474-1487)。然而，仍然不清楚小分子是否可用于通过HDR增强CRISPR诱导的DNA修复。因此，我们试图鉴定可以增强HDR以促进更有效的精确基因插入或点突变校正的新小分子。

结果

为了表征CRISPR介导的HDR效率，首先在E14小鼠ES细胞中建立了荧光报告系统。在筛选中使用ES细胞，因为与体细胞相比，ES细胞具有合适的HDR频率，提供了合理的基因插入基础水平(Kass等，2013，美国科学学院学报，110,5564-5569)。用三种质粒通过电穿孔共转染ES细胞：一种表达核酸酶Cas9，一种表达靶向Nanog基因终止密码子的sgRNA，第三种质粒含有启动子缺少(promoterless)的超级折叠GFP(sfGFP)以及框内N末端2A肽(p2A)和两个核定位序列(NLS)(图1A)。模板上的sfGFP盒的两侧是Nanog的两个同源臂，一个1.8千碱基(kb)的左臂和一个2.4kb的右臂。在电穿孔后3天利用流式细胞分析评估绿色荧光，以检测CRISPR诱导的p2A-NLS-sfGFP序列向内源性Nanog位点的框内插入。研究结果表明，只有所有三种质粒的共同电穿孔产生GFP阳性ES细胞(～17％的细胞显示强荧光)，而缺少三种质粒中任一的对照几乎没有GFP阳性细胞(图1B)。为了确认模板是否正确插入到Nanog位点，对GFP阳性细胞进行了分选，PCR扩增，并通过测序验证了目标位点。结果显示，正确的HDR介导的sfGFP整合入GFP阳性细胞中(图1C)。此外，使用不含同源臂的模板，没有观察到荧光信号(图3A)，表明荧光增加与HDR介导的基因编辑之间相关。

为了广泛研究可以作为CRISPR介导的HDR的增强剂或抑制剂的小分子，开发了基于报告系统的高通量化学筛选试验(图1D和3B)。在该试验中，将Cas9，sgNanog和模板共转染小鼠ES细胞，并以2,000细胞/孔接种到涂覆基质胶的384孔板中，孔中含有补充了来自已知药物集合的单个化合物的LIF-2i培养基。3天培养和化学处理后，固定细胞，用DAPI染色，并通过自动化高含量IN细胞成像系统成像，以分析各孔中DAPI阳性和GFP/DAPI双阳性核的数量。

从具有已知生物活性约4000种小分子的集合中，利用流式细胞术，鉴定并随后确认了两个小分子L755507和布雷菲德菌素A可以提高敲入效率(图1D和1E)。L755507是β3肾上腺素能受体激动剂(Parmee等，1998，生物有机化学与医药化学，8,1107-1112)，与DMSO处理的对照细胞相比，其GFP插入的效率提高了3倍，通过PCR扩增和靶位点测序和测序验证进一步验证(图1E和1F)。布雷菲德菌素A是从内质网到高尔基体的胞内蛋白转运抑制剂(Ktistakis等，1992，自然356,344-346)，也将插入效率提高了2倍(图1E和1F)。

有趣的是，我们还确定了两种胸苷类似物，叠氮胸苷(AZT)和三氟尿苷(TFT)，能够降低HDR效率(图1D和1E)。AZT，先前用作抗HIV药物，其抑制逆转录酶活性(Mitsuya等，1985，美国科学学院学报82,7096-7100)，TFT，通过阻断病毒DNA复制，被鉴定为抗疱疹病毒药物(Little等，1968，实验生物学与医学学会会刊127,1028-1032)。利用流式细胞术测定显示HDR效率降低了3倍(图1E)，或通过测序测定降低了超过10倍(图1F)。

我们进一步检验了选定小分子的剂量效应、治疗持续时间和细胞毒性。我们发现HDR增强剂L755507和布雷菲德菌素A分别在5μM和0.1μM取得最佳增强效果(图1G)。HDR抑制剂AZT和TFT在5μM下表现出最佳的敲入抑制作用。另外，我们还检验了电穿孔后0-24小时、24-48小时、48-72小时或0-72小时的化合物治疗窗口。所有化合物在第一个24小时内显示最佳活性，表明基因组敲入事件大多发生在系统的第一个24小时内(图3C)。值得注意的是，通过进行细胞计数和MTS细胞增殖分析实验，化合物在其优化的浓度下没有表现出或表现出非常轻微的毒性(图3D和3E)。

为了测试这些化合物在不同基因位点调控HDR的通用性，我们使用另一模板将框架中的t2A-Venus盒插入到Alpha平滑肌肌动蛋白(ACTA2)位点(图32A)，其是在多种癌细胞系和正常细胞中表达的基因(Ueyama等人，1990，Jinrui idengaku zasshi，35,145-150)。模板质粒含有780bp的左同源臂和695bp的右同源臂，位于t2A-Venus盒的侧翼。我们首先用表达Cas9和sgACTA2的单一构建物和模板质粒共转染HeLa细胞。Venus阳性的HeLa细胞的测序结果证实，表达Venus代表Venus正确插入到ACTA2位点(图2B)。然后我们测试了几种其他类型的人类细胞。流式细胞术的结果显示，敲入效率从0.8％-3.5％变化，取决于细胞类型。用L755507处理的不同类型的细胞显示出持续增强的HDR效率，在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中提高超过2倍。事实上，L755507持续提高HDR效率，在不同细胞中，包括癌细胞系(K562和HeLa)、悬浮细胞(K562)、原代新生细胞(HUVEC和成纤维细胞CRL-2097)和人类ES细胞衍生细胞(神经干细胞)(Li等，2011，美国科学学院学报，108,8299-8304)，表明L755507增强CRISPR介导的HDR的机制在转化细胞和原代细胞中是常见的

通过单链寡脱氧核苷酸(ssODN)模板，精确编辑单核苷酸多态性(SNP)，是基因组编辑的另一个重要应用，广泛应用于疾病建模和基因治疗。接着，我们试图验证选定的小分子是否也利用短ssODN，增强通过HDR的SNP编辑。已经建立利用CRISPR-Cas9和ssODN，向人类多能干(IPS)细胞引入突变的方法(Ding等，2013，干细胞，12，238-251；杨，2013，核酸研究，41，9049-9061)。按照类似的方法，我们合成了200nt的ssODN模板，以便将A4V突变引入人SOD1位点(图2D)，这是导致美国人群中肌萎缩侧索硬化症(ALS)的常见突变之一(Rosen等,1994,人基因Ther.,24,67-77).我们以某一方式设计sgRNA(sgSOD1)，该方式引入A4V突变同时破坏其PAM序列，从而防止A4V等位基因的sgSOD1进一步靶向。我们编码Cas9和sgSOD1(包含或不包含ssODN模板)的两个载体共转染入人类iPS细胞(Ding等，2013，干细胞，12，238-251；丁等，2013，干细胞，12，393-394；朱等，2010，干细胞，7，651-655)。随后，将细胞用DMSO或L755507处理，之后提取基因组DNA，随机挑选大肠杆菌转化子进行PCR克隆和测序。测序结果表明，相比于DMSO对照，L755507使A4V等位基因的突变频率增强了近9倍(图2E and 2F)。我们的研究结果还显示，加入L755507后，indel等位基因的突变频率下降。这些结果表明，我们的小分子大大增强了利用短ssODN模板的SNP编辑。

然后，我们试图测试小分子是否抑制HDR同时影响NHEJ。我们认为，如果一个小分子直接抑制Cas9的DNA切割活性，也应该抑制CRISPR介导的无模板基因删除。为测试这一点，我们繁育了Nanog位点处携带单等位基因sFGFP插入的克隆小鼠ES细胞系(图4A和4B)。我们在编码Cas9的相同质粒上，设计了三种靶向sfGFP编码序列的sgRNA(sgGFP-1，2,3)(图2G)。用任意sgRNA进行电穿孔，都在3天后使部分(a population of)细胞显示出GFP表达的完全丧失，而用无靶向位点的sgRNA(sgGAL4)转染的ES细胞，没有显示出GFP信号损失(图2G)。电穿孔后立即向细胞添加L755507，显示出GFP敲除的抑制作用。出乎意料的是，敲入抑制剂AZT大大提高了三种sgRNA的GFP敲除效率。例如，AZT使得sgGFP-1的敲除效率提高了超过1.8倍(图2B)。这也与对indel检测的深度测序结果一致(图5).同时，这些结果表明NHEJ和HDR修复途径之间可能存在取舍。

三种多能性标志基因Oct4，Sox2，Nanog的染色表明，化合物不影响细胞的多能性(图4C and 4D)。此外，电穿孔(图4E)和化合物添加(图4f)也不会影响Nanog的表达。增强的敲除效率表明，AZT参与NHEJ途径而非与Cas9-sgRNA复合物相互作用。这些结果还表明，筛选系统选定的化合物可以调控CRISPR介导的基因敲除。AZT不会导致复制中的更多的错误，转而导致EGFP失活，为排除这一可能性，我们在无CRISPR系统的AZT处理下，将Nanog-sfGFPES细胞系传代10代，没有观察到GFP信号损失(图4G)。

综上所述，我们开发了一种用于CRISPR基因组编辑的高通量化学筛选平台，提供了小分子可以用来调控CRISPR介导的精确基因编辑效率的概念验证演示。我们报告几个可以增强或抑制HDR介导的基因编辑的小分子。选定的化合物可能是与涉及DNA修复途径(通过NHEJ或HDR)的因素相互作用，从而提供了一套潜在的用于这些途径的机理研究的有用工具。选定的化学品也具有最小的毒性并在不同类型的细胞中有效，可用于增强大模板介导的基因插入和ssODN介导的SNP编辑。我们还报告了增强无模板基因敲除的小分子。减弱HDR可以增强NHEJ的观察结果可能表明，CRISPR DNA切割后的两种DNA修复途径之间存在取舍。不同类的小分子的鉴定提供了一种促进和加速CRISPR介导的精确基因组编辑的方法，其在生物医学研究和临床应用中是有用的。

材料和方法

生成sgRNA和DNA模板

为克隆sgRNA mCherry载体，通过BstXI和XhoI双酶切，将优化的sgRNA表达载体(pSLQ1651，Addgene目录号51024)线性化，并进行凝胶纯化。使用不同的正向引物(见下文)和常见的反向引物(sgRNA.R)，从pSLQ1651中PCR扩增新的sgRNA序列，用BstXI和XhoI酶切，凝胶纯化，并连接到线性化的pSLQ1651载体上。

sgNanog.F(SEQ ID NO:1):GGAGA ACCAC CTTGT TGGCG TAAGT CTCAT ATTTCACCGT TTAAG AGCTA TGCTG GAAAC AGCA

sgSOD1.F(SEQ ID NO:2):GTATC CCTTG GAGAA CCACC TTGTT GGTCG CCCTT CAGCACGCAC AGTTT AAGAG CTATG CTGGA AACAG CA

sgRNA.R(SEQ ID NO:3):CTAGT ACTCG AGAAA AAAAG CACCG ACTCG GTGCC AC

为克隆单个Cas9-sgRNA表达载体，将表达Cas9和sgRNA的pX330(Addgene目录号42230)表达载体用BbsI酶切线性化，并进行凝胶纯化。每个靶向位点的一对寡核苷酸被磷酸化，退火并连接到线性化的pX330上。

sgsfGFP-1.F(SEQ ID NO:4):CACCG CATCA CCTTC ACCCT CTCCA

sgsfGFP-1.R(SEQ ID NO:5):AAACT GGAGA GGGTG AAGGT GATGC

sgsfGFP-2.F(SEQ ID NO:6):CACCG CGTGC TGAAG TCAAG TTTGA

sgsfGFP-2.R(SEQ ID NO:7):AAACT CAAAC TTGAC TTCAG CACGC

sgsfGFP-3.F(SEQ ID NO:8):CACCGTCGACAGGTAATGGTTGTC

sgsfGFP-3.R(SEQ ID NO:9):AAACG ACAAC CATTA CCTGT CGAC

sgACTA2.F(SEQ ID NO:10):CACCG CGGTG GACAA TGGAA GGCC

sgACTA2.R(SEQ ID NO:11):AAACG GCCTT CCATT GTCCA CCGC

Nanog的p2A-NLS-sfGFP模板是使用吉布森组装反应混合物(Gibson AssemblyMaster Mix)(纽英伦生物技术(New England Biolabs))，由4个DNA片段：一个5’同源臂，一个p2A-NLSX2-sfGFP盒，一个3’同源臂和一个改造的pUC19骨架载体组合的。从小鼠ES细胞提取的基因组DNA中对5’和3’同源臂进行PCR扩增。通过PCR扩增将p2A和NLS的两个拷贝的序列加入到sfGFP编码序列的上游。骨架载体用PmeI和ZraI酶切线性化。在吉布森(Gibson)组装反应之前，将所有DNA片段进行凝胶纯化。

细胞培养，电穿孔和流式细胞术分析

将E14小鼠ES细胞在N2B27培养基(50％基础培养基(Neurobasal)、50％Dulbecco改良的Eagle培养基/Ham’s营养混合物F12、0.5％NEAA、0.5％丙酮酸钠、0.5％谷氨酰胺、0.5％N2、1％B27、0.1mMβ-巯基乙醇和0.05g/L牛血清白蛋白组分V；全部来自英杰公司Invitrogen)培养，在凝胶包被的平板中添加有LIF和2i。

对于电穿孔，使用核转染(Nucleofector)试剂盒和程序A-030对小鼠胚胎干细胞(Amaxa)的3×10⁶个细胞进行电穿孔。对于插入实验，使用2.5μg pX330(Cas9)，2.5μgsgNanog和15μg模板(Nanog-p2A-NLS-sfGFP)。对于sfGFP缺失实验，使用含有所需sgRNA的20μg pX330。使用Endofree Maxiprep试剂盒(Qiagen)对所有质粒进行大量提取。用台盼蓝计数电穿孔后的细胞，接种到基质胶(Matrigel)包被的含有LIF的ESGRO-2i培养基(Millipore)的平板上，培养3天。在第3天，使用BD FACSCalibur平台分析细胞。

在添加有3μM CHIR99021和1μM A-83-01的N2B27培养基中培养将人ES细胞来源的神经干细胞。将人成纤维细胞(CRL-2097)和HeLa细胞在添加有10％FBS(Gibco)的Dulbecco改良的Eagle培养基中培养。K562细胞在添加有10％FBS的RPMI培养基中培养。利用内皮细胞生长培养基试剂盒(Lonza)培养HUVECs。为在ACTA2位点插入Venus，使用Neon转染系统(生命技术公司(Life Technologies))，用5μg pX330-sgACTA2和15μg模板对1×10⁷个细胞进行电穿孔。使用的方法是：人ES细胞来源的神经干细胞用1,300V，10ms和3个脉冲；成纤维细胞用1,500V，30ms，1脉冲；HeLa用1,005V，35ms，2脉冲；K562用1,450V，10ms，3脉冲；和HUVEC的1,350V，30ms和1脉冲。在第3天，使用BD FACSCalibur平台分析细胞。

人类iPS细胞中SOD1 SNP编辑

将人诱导多能干细胞(iPS)(hiPSC-O#1)，在Geltrex包被的6孔板中的mTeSR1(干细胞技术公司(STEMCELL Technologies))中培养。电穿孔前3小时，将细胞移至添加有1μMROCK抑制剂(thioovivin)的新鲜mTeSR1培养基中。利用建立的方法递送Cas9载体、sgSOD1mCherry载体和200-nt ssODN模板(SEQ ID NO:12；5’-GTGCT GGTTT GCGTC GTAGT CTCCTGCAGC GTCTG GGGTT TCCGT TGCAG TCCTC GGAAC CAGGA CCTCG GCGTG GCCTA GCGAG TTATGGCGAC GAAGG TCGTG TGCGT GCTGA AGGGC GACGG CCCAG TGCAG GGCAT CATCA ATTTC GAGCAGAAGG CAAGG GCTGG GACGG AGGCT TGTTT GCGAG GCCGC TCCCA-3’)(Ding等,2013,CellStem Cell 12,238-251；Ding等,2013,Cell Stem Cell,12,393-394).简言之，使用BioRad基因脉冲，用15μg Cas9载体、15μg sgSOD1mCherry载体、有或没有(无模板对照)30μgssODN模板的混合物对1×10⁷个细胞进行电穿孔。然后在电穿孔后将细胞在添加有1μMROCK抑制剂、有或没有L755507的mTeSR1培养基下中恢复48小时。通过荧光活化细胞分选(FACS)将mCherry阳性细胞收集到6孔板中，培养5天，使用PureLink基因组DNA小量提取试剂盒(生命技术公司)提取基因组DNA。基因组DNA用Herculase II融合DNA聚合酶(Herculase II Fusion DNA聚合酶)(Agilent)进行PCR扩增，使用两个同源臂侧翼的引物(正向引物序列：SEQ ID NO:13；AAAGT GCCAC CTGAC AGGTC TGGCC TATAA AGTAG TCGCG；反向引物序列:SEQ ID NO:14；AGCTG GAGAC CGTTT GACCC GCTCC TAGCA AAGGT).使用NucleoSpin凝胶和PCR清洁试剂盒(Macherey-Nagel)纯化PCR产物。两个引物含有额外的15-bp区域，其可以使用In-Fusion HD Cloning Plus试剂盒(Clontech)进行有效亚克隆到改造的pUC19载体。将克隆产物转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，并在含有羧苄青霉素(Sigma)的LB琼脂平板上生长。过夜培养后，我们分别随机选择96、288和192个菌落，对应无模板，DMSO和L755507样本。将所有大肠杆菌菌落小量提取，并进行测序验证检测突变序列(QuintaraBio)。A4V等位基因突变频率以(A4V转化子数#)/(细菌转化子总数#)计算。插入缺失标记(indel)等位基因突变频率以(插入缺失标记转化子数#)/(细菌转化子总数#)计算。含有A4V突变和另一个插入缺失标记的等位基因被简单地计为一个插入缺失标记等位基因。

插入Nanog和ACTA2中的长模板测序

对于在Nanog或ACTA2位点插入的长模板，用PureLink基因组DNA小量提取试剂盒(生命技术公司)分离并纯化1×10⁶个细胞的基因组DNA。对于测序，使用Herculase IIFusion DNA聚合酶(Agilent)和同源臂外的一对引物对基因组DNA进行PCR扩增。纯化PCR产物并使用In-Fusion克隆亚克隆至骨架载体(pUC19)进行测序。使用以下PCR引物：

Nanog.F(SEQ ID NO:15):AAAGT GCCAC CTGAC ATTCT TCTAC CAGTC CCAAA CAAAAGCTCTC

Nanog.R(SEQ ID NO:16):AGCTG GAGAC CGTTT AGCAA ATGTC AATCC CAAAG TTGGGAG

ACTA2.F(SEQ ID NO:17):AAAGT GCCAC CTGAC CTGGT TAGCC AGTTT TCAC TGTTCTCTGT

ACTA2.R(SEQ ID NO:18):AGCTG GAGAC CGTTT GCATT TTGGA AAGTC AAGAG GAGAGAATTGC

对于p2A-NLSx2-sfGFP插入，使用在sfGFP中结合的引物(SEQ ID NO：19；GCATGACTTT TTCAA GAGTG CCA)来验证插入是否正确。

Nanog-sfGFP敲除的深度测序

为深度测序，将Nanog-sfGFP位点进行PCR扩增和纯化。通过PCR将接头和条形码加入扩增子。按照制造商的使用说明，使用MiSeq Reagent试剂盒v3(150个循环)在MiSeq(Illumina)上对DNA片段进行测序。

Nanog-sfGFP-2.F(SEQ ID NO:20):ACACG TTCAG AGTTC TACAG TCCGA CGATCGACGG GACCT ACAAG ACGCG

Nanog-sfGFP-2.R(SEQ ID NO:21):ACACG TTCAG AGTTC TACAG TCCGA CGATCGACGG GACCT ACAAG ACGCG

5’接头引物(SEQ ID NO：22):AATGA TACGG CGACC ACCGA GATCT ACACG TTCAGAGTTC TACAG TCCGA

3’条形码引物：CAAGC AGAAG ACGGC ATACG AGATA AACAG TGTGA CTGGAGTTCCTTGGC ACCCG AGAAT TCCA(SEQ ID NO:23)；CAAGC AGAAG ACGGC ATACG AGATA AACCCCGTGA CTGGA GTTCC TTGGC ACCCG AGAAT TCCA(SEQ ID NO:24)；CAAGC AGAAG ACGGCATACG AGATA AACGG CGTGA CTGGA GTTCC TTGGC ACCCG AGAAT TCCA(SEQ ID NO:25).

小分子化合物文库和筛选

筛选Sigma LOPAC文库(1280个化合物)，Tocriscreen文库(1120个化合物)和部分Spectrum Collection文库(1760个化合物)。为了筛选，在含有20μL ESGRO-2i培养基的基质胶包被的384孔板中加入50nL/孔的化合物。电穿孔后，将70μL ESGRO-2i培养基中的2,000个细胞接种到384孔板中。培养3天后，将细胞固定，用DAPI染色，并使用IN细胞分析仪(GE)成像。DAPI阳性细胞核和DAPI/GFP双阳性细胞核数通过IN细胞分析仪计数。计算双阳性细胞核和DAPI阳性核的比例，并从高到低绘制，如图1D所示。如果结果是由严重的细胞死亡造成的，极端界外值被单独检查和排除。

产生Nanog位点处携带单等位基因sfGFP插入的克隆小鼠ES细胞系

将用模板质粒(p2A-NLS-sfGFP)电穿孔的E14小鼠ES细胞培养3天，并用Accutase(生命技术)分离成单细胞。将单GFP阳性细胞分选并接种到含有FACS Aria II(BD)的基质胶包被的96孔板的每个孔中。分选后7天，将克隆的GFP阳性菌落扩增为正常的ES细胞。将兔多克隆抗体(abcam)用于Nanog的免疫荧光染色。

毒性试验

电穿孔后在第一个24小时用小分子处理细胞。在电穿孔后第3天计数细胞数目。按照制造商的使用说明，通过MTS分析(Promega)测定细胞活力。

实施例2.使用小分子组合物增强基因组编辑

本实施例说明，通过组合使用实施例1确定的小分子与涉及DNA复制的酶(如DNA连接酶、DNA回旋酶、DNA解旋酶)的小分子抑制剂，可以进一步提高用实施例1中鉴定的小分子观察到的精确基因组编辑的效率。例如，DNA连接酶抑制剂可以是Scr7(5,6-双((E)-亚苄基氨基)-2-硫代-2,3-二氢嘧啶-4(1H)-酮)或其类似物。

结果

图6显示了使用DNA连接酶IV抑制剂如Scr7类似物(“SCR7a”)，或β3-肾上腺素受体激动剂如L755507，或SCR7a和L755507的组合的GFP插入效率。如通过增加GFP插入比单独使用任一化合物的百分比所证实的，SCR7a和L755507的组合增强了同源介导修复(HDR)的效率。“无HR”对照为仅ES细胞，“无化合物”对照为仅DMSO。

材料和方法

细胞培养，电穿孔和流式细胞术分析

将E14小鼠ES细胞在N2B27培养基(50％Neurobasal、50％Dulbecco改良的Eagle培养基/Ham’s营养混合物F12、0.5％NEAA、0.5％丙酮酸钠、0.5％谷氨酰胺、0.5％N2、1％B27、0.1mMβ-巯基乙醇和0.05g/L牛血清白蛋白组分V；全部来自英杰公司Invitrogen)培养，在凝胶包被的平板中添加有LIF和2i。

对于电穿孔，使用核转染(Nucleofector)试剂盒和程序A-023对小鼠胚胎干细胞(Amaxa)的3×10⁶个细胞进行电穿孔。对于插入实验，使用2.5μg pX330(Cas9)，2.5μgsgNanog和15μg模板(Nanog-p2A-NLS-sfGFP)。对于sfGFP缺失实验，使用含有所需sgRNA的20μg pX330。使用Endofree Maxiprep试剂盒(Qiagen)对所有质粒进行大量提取。电穿孔后的细胞用台盼蓝计数，接种到基质胶(Matrigel)包被的含有LIFE的ESGRO-2i培养基(Millipore)的平板上，培养3天。在第3天，使用BD FACSCalibur平台分析细胞。

虽然为了清楚理解的目的，已经通过说明和示例的方式对前述发明进行了详细描述，但是本领域技术人员将会理解，在所附权利要求的范围内可以进行某些改变和修改。此外，本文提供的每个参考文献通过引用整体并入本文，就像每个参考文献通过引用单独并入一样。

非正式的序列表

SEQ ID NO:1

sgNanog.F

GGAGA ACCAC CTTGT TGGCG TAAGT CTCAT ATTTC ACCGT TTAAG AGCTA TGCTGGAAAC AGCA

SEQ ID NO:2

sgSOD1.F

GTATC CCTTG GAGAA CCACC TTGTT GGTCG CCCTT CAGCA CGCAC AGTTT AAGAGCTATG CTGGA AACAG CA

SEQ ID NO:3

sgRNA.R

CTAGT ACTCG AGAAA AAAAG CACCG ACTCG GTGCC AC

SEQ ID NO:4

sgsfGFP-1.F

CACCG CATCA CCTTC ACCCT CTCCA

SEQ ID NO:5

sgsfGFP-1.R

AAACT GGAGA GGGTG AAGGT GATGC

SEQ ID NO:6

sgsfGFP-2.F

CACCG CGTGC TGAAG TCAAG TTTGA

SEQ ID NO:7

sgsfGFP-2.R

AAACT CAAAC TTGAC TTCAG CACGC

SEQ ID NO:8

sgsfGFP-3.F

CACCGTCGACAGGTAATGGTTGTC

SEQ ID NO:9

sgsfGFP-3.R

AAACG ACAAC CATTA CCTGT CGAC

SEQ ID NO:10

sgACTA2.F

CACCG CGGTG GACAA TGGAA GGCC

SEQ ID NO:11

sgACTA2.R

AAACG GCCTT CCATT GTCCA CCGC

SEQ ID NO:12

ssODN模板

5’-GTGCT GGTTT GCGTC GTAGT CTCCT GCAGC GTCTG GGGTT TCCGT TGCAG TCCTCGGAAC CAGGA CCTCG GCGTG GCCTA GCGAG TTATG GCGAC GAAGG TCGTG TGCGT GCTGA AGGGCGACGG CCCAG TGCAG GGCAT CATCA ATTTC GAGCA GAAGG CAAGG GCTGG GACGG AGGCT TGTTTGCGAG GCCGC TCCCA-3’

SEQ ID NO:13

SOD1正向引物

AAAGT GCCAC CTGAC AGGTC TGGCC TATAA AGTAG TCGCG

SEQ ID NO:14

SOD1反向引物

AGCTG GAGAC CGTTT GACCC GCTCC TAGCA AAGGT

SEQ ID NO:15

Nanog.F

AAAGT GCCAC CTGAC ATTCT TCTAC CAGTC CCAAA CAAAA GCTCTC

SEQ ID NO:16

Nanog.R

AGCTG GAGAC CGTTT AGCAA ATGTC AATCC CAAAG TTGGG AG

SEQ ID NO:17

ACTA2.F

AAAGT GCCAC CTGAC CTGGT TAGCC AGTTT TCAC TGTTC TCTGT

SEQ ID NO:18

ACTA2.R

AGCTG GAGAC CGTTT GCATT TTGGA AAGTC AAGAG GAGAG AATTGC

SEQ ID NO:19

插入p2A-NLSx2-sfGFP的引物

GCATG ACTTT TTCAA GAGTG CCA

SEQ ID NO:20

Nanog-sfGFP-2.F

ACACG TTCAG AGTTC TACAG TCCGA CGATC GACGG GACCT ACAAG ACGCG

SEQ ID NO:21

Nanog-sfGFP-2.R

ACACG TTCAG AGTTC TACAG TCCGA CGATC GACGG GACCT ACAAG ACGCG

SEQ ID NO:22

5’端引物

AATGA TACGG CGACC ACCGA GATCT ACACG TTCAG AGTTC TACAG TCCGA

SEQ ID NO:23

3’端引物

CAAGC AGAAG ACGGC ATACG AGATA AACAG TGTGA CTGGAGTTCC TTGGC ACCCGAGAAT TCCA

SEQ ID NO:24

3’端引物

CAAGC AGAAG ACGGC ATACG AGATA AACCC CGTGA CTGGA GTTCC TTGGC ACCCGAGAAT TCCA

SEQ ID NO:25

3’端引物

CAAGC AGAAG ACGGC ATACG AGATA AACGG CGTGA CTGGA GTTCC TTGGC ACCCGAGAAT TCCA

SEQ ID NO:26

5’-CTCCACCAGGTGAAATATGAGACTTACGCAACAT

SEQ ID NO:27

5’-ATGTTGAGTAAGTCTCATATTTCACCTGGTGGAG

SEQ ID NO:28

5’-GAAGCCGGGCCTTCCATTGTCCACCGCAAATGCT

SEQ ID NO:29

5’-AGCATTTGCGGTGGACAATGGAAGGCCCGGCTTC

SEQ ID NO:30

5’-GAAGGCCGTGGCGTGCTGCTGAAGGGCGACGGCC

SEQ IDNO:31

5’-GGCCGTCGCCCTTCAGCACGCACACGGCCTTC

SEQ ID NO:32

5’-GAAGGTCGTGTGTGCGTGCTGAAGGGCGACGGCC

SEQ ID NO:33

tracrRNA

5’-GTT GGA ACC ATT CAA AAC AGC ATA GCA AGT TAA AAT AAG GCT AGT CCGTTA TCA ACT TGA AAA AGT GGC ACC GAG TCG GTG CTT TTT-3’

SEQ ID NO:34

tracrRNA

5’-AAG AAA TTT AAA AAG GGA CTA AAA TAA AGA GTT TGC GGG ACT CTG CGGGGT TAC AAT CCC CTA AAA CCG CTT TT-3’

SEQ ID NO:35

tracrRNA

5’-ATC TAA AAT TAT AAA TGT ACC AAA TAA TTA ATG CTC TGT AAT CAT TTAAAA GTA TTT TGA ACG GAC CTC TGT TTG ACA CGT CTG AAT AAC TAA AAA-3’

SEQ ID NO:36

tracrRNA

5’-TGT AAG GGA CGC CTT ACA CAG TTA CTT AAA TCT TGC AGA AGC TAC AAAGAT AAG GCT TCA TGC CGA AAT CAA CAC CCT GTC ATT TTA TGG CAG GGT GTT TTC GTTATT T-3’

SEQ ID NO:37

tracrRNA

5’-TTG TGG TTT GAA ACC ATT CGA AAC AAC ACA GCG AGT TAA AAT AAG GCTTAG TCC GTA CTC AAC TTG AAA AGG TGG CAC CGA TTC GGT GTT TTT TTT-3’

Claims

1.一种调控细胞中靶DNA的基因组编辑的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)向所述细胞中导入DNA核酸酶或编码DNA核酸酶的核苷酸序列，其中，所述DNA核酸酶能够在靶DNA中产生双链断裂，从而诱导靶DNA的基因组编辑；和

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的调控增强基因组编辑的效率。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的调控增强细胞活性。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述的DNA核酸酶选自下组：CRISPR相关蛋白(Cas)多肽、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、其变体、其片段、及其组合。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的Cas多肽为Cas9多肽、其变体、或其片段。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(a)还包括向所述细胞中引入靶向DNA的RNA或编码靶向DNA的RNA的核酸序列。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的靶向DNA的RNA包含至少两种不同的靶向DNA的RNA，其中各靶向DNA的RNA被引导至不同的靶DNA。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，调控基因编辑的所述小分子化合物选自下组：β肾上腺素受体激动剂或其类似物、布雷菲德菌素A或其类似物、核苷类似物、其衍生物、及其组合。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，与未与所述小分子化合物接触的对照细胞相比，所述的小分子化合物增强或抑制靶DNA的基因组编辑。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的基因组编辑包括靶DNA的同源介导修复(HDR)。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤(a)还包括向所述细胞中引入重组供体修复模板。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的重组供体修复模板包含了包括靶DNA的两个非重叠同源部分的两条核苷酸序列，其中，所述的核苷酸序列位于对应于靶DNA的核苷酸序列的5’和3’末端，以进行基因编辑。

13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的重组供体修复模板包含一条合成的单链寡脱氧核苷酸(ssODN)模板，和包括靶DNA的两个非重叠同源部分的两条核苷酸序列，其中，所述的核苷酸序列位于编码突变的核苷酸序列的5’和3’末端。

14.如权利要求10-13中任一项所述的方法，其特征在于，增强HDR的所述小分子化合物为β肾上腺素受体激动剂、布雷菲德菌素A、其衍生物、其类似物、或其组合。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述的β肾上腺素受体激动剂为L755507。

16.如权利要求10-13中任一项所述的方法，其特征在于，抑制HDR的所述小分子化合物为核苷类似物、其衍生物、或其组合。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述的核苷类似物为叠氮胸苷(AZT)、三氟尿苷(TFT)、或其组合。

18.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的基因组编辑包括靶DNA的非同源性末端接合(NHEJ)。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，增强NHEJ的所述小分子化合物为核苷类似物或其衍生物。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述的核苷类似物为叠氮胸苷(AZT)。

21.如权利要求18所述的方法，其特征在于，抑制NHEJ的所述小分子化合物为β肾上腺素受体激动剂、或其衍生物或类似物。

22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述的β肾上腺素受体激动剂为L755507。

23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(b)还包括将所述细胞与DNA复制酶抑制剂接触。

24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述的DNA复制酶抑制剂选自下组：DNA连接酶抑制剂、DNA旋转酶抑制剂、DNA解旋酶抑制剂、及其组合。

25.如权利要求23或24所述的方法，其特征在于，与接触所述小分子化合物或者所述DNA复制酶抑制剂的对照细胞相比，所述小分子化合物和所述DNA复制酶抑制剂的组合增强或抑制靶DNA的基因组编辑。

26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述的基因组编辑包括靶DNA的同源介导修复(HDR)。

27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，增强HDR的所述小分子化合物和DNA复制酶抑制剂的组合为β肾上腺素受体激动剂或其衍生物或其类似物与DNA复制酶抑制剂或其衍生物或其类似物的组合。

28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述的β肾上腺素受体激动剂为L755507。

29.如权利要求27或28所述的方法，其特征在于，所述的DNA连接酶抑制剂为Scr7(5,6-二((E)-苯亚甲基氨基)-2-硫代-23-二氢嘧啶-4(1H)-酮)或其类似物。

30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其特征在于，所述小分子化合物的浓度为约0.1μM-10μM。

31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其特征在于，所述的细胞与所述的小分子化合物接触约24小时。

32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其特征在于，所述的细胞选自下组：干细胞、人细胞、哺乳动物细胞、非哺乳动物细胞、脊椎动物细胞、无脊椎动物细胞、植物细胞、真核细胞、细菌细胞、免疫细胞、T细胞、和古细胞。

33.如权利要求1-32中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：(c)分离、筛选、培养、和/或扩增所述细胞。

34.一种试剂盒，其特征在于，包含：(a)DNA核酸酶或编码DNA核酸酶的核苷酸序列；和(b)调控细胞中靶DNA组基因编辑的小分子化合物。

35.如权利要求34所述的试剂盒，其特征在于，还包含靶向DNA的RNA或编码靶向DNA的RNA的核酸序列。

36.如权利要求34或35所述的试剂盒，其特征在于，还包含重组供体修复模板。

37.如权利要求34-36中任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包含DNA复制酶抑制剂。

38.一种预防或治疗一对象的基因疾病的方法，其特征在于，所述方法包括：

(b)向所述对象施用足够量的小分子化合物以增强DNA核酸酶的作用。

39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述的基因疾病选自下组：X-连锁严重联合免疫缺陷病、镰状细胞性贫血、地中海贫血、血友病、瘤变、癌症、年龄相关性黄斑变性、精神分裂症、三核苷酸重复病症、脆性X综合征、朊病毒相关病症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、药物成瘾、自闭症、阿尔茨海默病、帕金森病、囊性纤维化、血液和凝血疾病或病症、炎症、免疫相关疾病或病症、代谢疾病和病症、肝脏疾病和病症、肾脏疾病和病症、肌肉/骨骼疾病和病症、神经和神经元疾病和病症、心血管疾病和病症、肺部疾病和病症、以及眼部疾病和病症。

40.如权利要求38或39所述的方法，其特征在于，所述的DNA核酸酶选自下组：CRISPR相关蛋白(Cas)多肽、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、其变体、其片段、及其任意组合。

41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述的Cas多肽为Cas9多肽、其变体、或其片段。

42.如权利要求38-41中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(a)还包括向所述对象施用重组供体修复模板。

43.如权利要求38-42中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(a)还包括向所述对象施用靶向DNA的RNA或编码靶向DNA的RNA的核酸序列。

44.如权利要求38-43中任一项所述的方法，其特征在于，所述的小分子化合物选自下组：β肾上腺素受体激动剂、布雷菲德菌素A、其衍生物、其类似物、及其组合。

45.如权利要求38-44中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(b)还包括向所述对象施用DNA复制酶抑制剂。

46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述的DNA复制酶抑制剂选自下组：DNA连接酶抑制剂、DNA旋转酶抑制剂、DNA解旋酶抑制剂、及其组合。

47.如权利要求45或46所述的方法，其特征在于，与施用所述小分子化合物或者所述DNA复制酶抑制剂相比，施用所述小分子化合物和所述DNA复制酶抑制剂的组合增强DNA核酸酶纠正靶基因突变的作用。

48.如权利要求38-47中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(a)包括利用选自下组的递送系统施用于对象：纳米颗粒、脂质体、胶束、病毒体、核酸复合物、及其组合。

49.如权利要求38-48中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(b)包括利用选自下组的递送路径施用于对象：口服、静脉内、腹膜内、肌内、皮内、皮下、小动脉内、心室内、颅内、病灶内、鞘内、局部、经粘膜、鼻内、及其组合。