CN115838719B - 特异性促进腺嘌呤碱基编辑器活性的化合物、化学调控方法及其应用 - Google Patents

特异性促进腺嘌呤碱基编辑器活性的化合物、化学调控方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了特异性促进腺嘌呤碱基编辑器活性的化合物、化学调控方法及其应用。具体地，本发明提供了一种以SB505124为代表的ALK5/SMAD2/3通路抑制剂的用途，它被用于制备一组合物或制剂，所述组合物或制剂用于促进腺嘌呤碱基编辑器(ABE)的基因编辑。本发明化合物可选择性地显著提高ABE的基因编辑效率并扩大ABE基因编辑的窗口，从而为高效、精准的基因编辑提供了一种简单而又高效的策略。

Description

特异性促进腺嘌呤碱基编辑器活性的化合物、化学调控方法 及其应用
技术领域
本发明涉及生物学和医学领域，具体地涉及特异性促进腺嘌呤碱基编辑器活性的化合物、化学调控方法及其应用更具体地涉及ALK5/SMAD2/3抑制剂特异性促进腺嘌呤碱基编辑器活性的化学调控方法、化合物及其应用。
背景技术
G·C到A·T点突变是人类致病性SNP中比例最大的一类。为了治疗这种突变，腺嘌呤碱基编辑器(Adenine base editor，ABE)通过将定向进化的来源于细菌的腺苷脱氨酶融合到活性缺陷的CRISPR-Cas9系统中，实现基因组上有针对性的A→G转换，因此具有很大的治疗潜力。
然而，以可控的方式实现对不同基因组位点的高效和精确编辑仍然具有挑战性。首先，ABE编辑效率有待提高，因为其对疾病相关突变的修复效率仍低下。如果突变存在于难编辑的基因组区域内或被难编辑的基因组区域所包围，例如表观遗传抑制染色质位点，则表观遗传抑制染色质位点会强烈抑制碱基编辑器的活性。
虽然一些ABE变体通过蛋白质工程获得了更高的催化活性，但同时在基因组和转录组上也存在更多的脱靶编辑，导致不利于临床应用。因此，需要为ABE开发更有效的工具，以大幅提高其对目标的编辑水平，并减少脱靶影响。
综上，目前尚缺乏令人满意的特异性促进腺嘌呤碱基编辑器活性的调控方法。
因此，本领域迫切需要开发新的特异性促进腺嘌呤碱基编辑器活性的调控方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性促进腺嘌呤碱基编辑器活性的调控方法、化合物及其应用。
在本发明的第一方面，提供了一种ALK5/SMAD2/3通路抑制剂的用途，用于制备一组合物或制剂，所述组合物或制剂用于促进腺嘌呤碱基编辑器(ABE)的基因编辑。
在另一优选例中，所述的组合物包括药物组合物。
在另一优选例中，所述的制剂包括实验用试剂。
如本文所用，术语“ALK5/SMAD2/3通路抑制剂”包括直接或间接地抑制ALK5和/或SMAD2/3活性、抑制ALK5和/或SMAD2/3的表达、促进ALK5和/或SMAD2/3降解的化合物(包括小分子化合物、抗体、核酸)。
在另一优选例中，“SMAD2/3”包括蛋白家族“SMAD”中的2型和/或3型，它们是TGF-beta超家族受体ALK5下游的主要信号转导因子。
在另一优选例中，所述的“ALK5/SMAD2/3通路抑制剂”包括基因编辑试剂。
在另一优选例中，所述的促进腺嘌呤碱基编辑器(ABE)的基因编辑选自下组：
(P1)提高ABE的基因编辑效率；
(P2)降低ABE的脱靶率；
(P3)扩大ABE的碱基编辑窗口；
(P4)促进ABE对难编辑基因组位点的碱基编辑；
(P5)上述P1～P4的任意组合。
在另一优选例中，所述的难编辑的基因组位点选自下组：异染色质中的待编辑的位点、常染色质中的待编辑的位点、高DNA甲基化区域中的待编辑的位点、或其组合。
在另一优选例中，所述“降低ABE的脱靶率”指降低Toff/(Ton+Toff)比值，其中，Ton为靶定位点的编辑率(即在gRNA引导下在预定靶点位置发生的编辑率)，Toff为非靶定位点的编辑率(即碱基编辑器在非靶向位置的脱靶编辑效率)。
在另一优选例中，所述“促进腺嘌呤碱基编辑器(ABE)的基因编辑”包括：在提高ABE在靶编辑效率的同时，不导致或基本不导致脱靶编辑率升高。
在另一优选例中，所述的“促进腺嘌呤碱基编辑器(ABE)的基因编辑”包括：提高基因编辑效率和扩大基因编辑窗口。
在另一优选例中，所述的扩大基因编辑窗口指：对经典编辑窗口之外的A进行基因编辑(如：位点8、9、10、12、13)。
在另一优选例中，所述的“经典编辑窗口”为PAM(Cas9蛋白识别靶向DNA序列的保守序列，Protospacer Adjacent Motif,PAM)上游的20个碱基中，从远端第20位向PAM端计数的第4-7位碱基(适用于ABE7.10)，或第4-8位碱基(适用于ABE8.20和ABE8e)。
在另一优选例中，所述的ALK5/SMAD2/3通路抑制剂选自下组：ALK5抑制剂、SMAD2/3蛋白磷酸化抑制剂、或其组合。
在另一优选例中，所述的ALK5/SMAD2/3通路抑制剂包括：小分子化合物、siRNA、或其组合。
在另一优选例中，所述的ALK5/SMAD2/3通路抑制剂选自下组：SB505124、SB431542、RepSox、ITD1、SD208、LY3200822、抑制ALK5的siRNA、或其组合。
在另一优选例中，所述的抑制ALK5的siRNA的序列选自下组：CGAGAUAGGCCGUUUGUAU(SEQ ID No:1)、GAGAAGAACGUUCGUGGUU(SEQ ID No:2)、UGCGAGAACUAUUGUGUUA(SEQ ID No:3)、或GACCACAGACAAAGUUAUA(SEQ ID No:4)。
在另一优选例中，所述ALK5/SMAD2/3通路抑制剂为式A结构的化合物、或其药学上可接受的盐：
式中，
环C是取代或未取代的5元含N杂原子的芳杂环；
环B为取代或未取代的苯基、取代或未取代的6元杂芳基，其中，所述的取代指被一个或多个选自下组的取代基取代：卤素、羟基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-C8环烷基、C2-C6杂环、苯基、苄基、吡啶基；
环A为取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基，其中，所述的取代指被一个或多个选自下组的取代基取代：卤素、羟基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-C8环烷基、C2-C6杂环、苯基、苄基、吡啶基；或者环A的两个取代基构成-O-CH2-O-、-O-(CH2)2-O-并且与相连接的环A的环碳原子构成5元或6元杂环；
R1选自下组：
(i)无、或H；
(ii)取代或未取代的以下基团：C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C3-C8环烷基、C3-C6的杂环、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氨基、
(iii)取代或未取代的苯基、取代或未取代的6元杂芳基、取代或未取代的6-8元环烷基、取代或未取代的6-8元杂环烷基；其中，所述的取代指被一个或多个选自下组的取代基取代：卤素、羟基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-C8环烷基、C2-C6杂环、苯基、苄基、吡啶基、酰胺基、C2-C6酯基、C1-C6醛基、-CO-NRaRb；其中Ra和Rb各自独立地为H、C1-C3烷基；或者两个相邻的取代基构成“-O-CH2－O－”并与连接的碳原子构成含两个O原子的五元杂环。
在另一优选例中，所述的芳基为C6-C10芳基，如苯基、萘基。
在另一优选例中，所述的杂芳基为C4－C10杂芳基，所述杂芳基含有1-3个选自N、O和S的杂原子。
在另一优选例中，所述的杂芳基为稠环结构。
在另一优选例中，所述的环A选自下组：萘环。
在另一优选例中，所述的环B为取代或未取代的含氮原子的杂芳基，其中，所述的取代指被一个或多个(如1-3个)选自下组的取代基取代：卤素、羟基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-C8环烷基、C2-C6杂环、苯基、苄基、吡啶基。
在另一优选例中，所述的环B为取代或未取代的含有1-2个氮原子的杂芳环，如
在另一优选例中，环B为取代或未取代的吡啶基、或取代或未取代的嘧啶基。
在另一优选例中，所述的环C为含有2个N原子的杂芳基。
在另一优选例中，所述的环C选自下组：
在另一优选例中，所述的杂环烷基含有1-3个选自N、O和S的杂原子。
在另一优选例中，所述的杂环烷基的饱和的或部分不饱和的。
在另一优选例中，R1为无、C1-C8烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的吡啶基。
在另一优选例中，所述的式A化合物选自下组：SB505124、SB431542、RepSox、或其组合：
在另一优选例中，所述的式A化合物为SB505124，化学式为2-[4-(1,3-苯并二氧戊环-5-基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-6-甲基-吡啶。
在另一优选例中，所述的ABE基因编辑器选自下组：ABE1.1、ABE1.2、ABE2.1、ABE2.9、ABE2.10、ABE3.1、ABE4.3、ABE5.1、ABE5.3、ABE6.3、ABE6.4、ABE7.4、ABE7.8、ABE7.9、ABE7.10、ABEmax、VRQR-ABEmax、VREQ-ABEmax、xABEmax、NG-ABEmax、Sa-ABE、SaKKH-ABE、dCas9-ABE、ABE8.8、ABE8.13、ABE8.17、ABE8.20、ABE8a、ABE8b、ABE8c、ABE8d、ABE8e、ABE8e-NG、CP-Cas9-ABE、A&C-BEmax(Dual base editor)、SACE(CRISPR–Cas9-basedsynchronous programmable adenine and cytosine editor)。
在另一优选例中，ABE基因编辑器包括不同的突变体。
在另一优选例中，所述的“提高基因编辑特异性”指A1/A2≥1.5，优选地，A1/A2≥2，更优选地，A1/A2≥3，式中，A1为加入化合物时ABE在特异性位点发生在靶编辑的数量与脱靶编辑的数量之比，A2为不加入化合物时在特异性位点发生在靶编辑的数量与脱靶编辑的数量之比。
在另一优选例中，所述的“提高基因编辑特异性”指提高针对A碱基的特异性编辑，而非对C，G，或T碱基的编辑。
在另一优选例中，所述的“提高基因编辑特异性”指提高ABE的基因编辑，但不提高CBE或Cas9或基于Cas9的其他编辑器介导的基因编辑。
在另一优选例中，所述的组合物包括药物组合物。
在另一优选例中，所述的基因编辑包括基于腺嘌呤碱基编辑器(Adenine baseeditor，ABE)的基因编辑。
在另一优选例中，所述的基因编辑包括体内基因编辑、体外基因编辑、或其组合。
在另一优选例中，所述的基因编辑针对的样品选自下组：细胞、组织、器官、或其组合。
在另一优选例中，所述的样品来自动物、植物、微生物、细菌、病毒。
在另一优选例中，所述的样品来自人和非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述的细胞包括原代细胞和传代的细胞。
在另一优选例中，所述的细胞包括体细胞、生殖细胞、配子、干细胞。
在另一优选例中，所述的干细胞包括：全能干细胞、多能干细胞、和单能干细胞。
在另一优选例中，所述的干细胞为诱导性多能干细胞(iPSC)。
在另一优选例中，所述的细胞包括：胚胎干细胞、脂肪干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、少突胶质祖细胞、造血干细胞、免疫细胞(如T细胞、B细胞、NK细胞)。
在另一优选例中，所述的细胞包括：健康正常人体细胞、癌变人体细胞。
在另一优选例中，所述的细胞包括：悬浮细胞、贴壁细胞。
在另一优选例中，所述的制剂包括药物组合物。
本发明的第二方面，提供了一种ABE基因编辑的方法，所述方法包括：
在ABE基因编辑促进剂的存在下，对细胞进行基因编辑，从而促进所述细胞内的基因编辑，
其中，所述基因编辑促进剂是ALK5/SMAD2/3通路抑制剂。
在另一优选例中，所述的方法包括体内和/或体外方法。
在另一优选例中，所述的ALK5/SMAD2/3通路抑制剂选自下组：ALK5抑制剂、SMAD2/3蛋白磷酸化抑制剂、或其组合。
在另一优选例中，所述的ALK5/SMAD2/3通路抑制剂包括：小分子化合物、siRNA、或其组合。
在另一优选例中，所述ALK5/SMAD2/3通路抑制剂选自下组：SB505124、SB431542、RepSox、ITD1、抑制ALK5的siRNA、或其组合。
在另一优选例中，所述的ALK5/SMAD2/3通路抑制剂为式A化合物。
在另一优选例中，所述的化合物包括其药学上可接受的盐、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物。
在另一优选例中，在进行基因编辑之前、之中和/或之后，将所述基因编辑促进剂与所述进行基因编辑的细胞进行接触。
在另一优选例中，所述的体外的基因编辑在一体外反应体系中进行。
在另一优选例中，所述的体外反应体系中，所述ABE促进剂的浓度为0.01-100μM,较佳地0.1-20μM。
在另一优选例中，所述ABE促进剂的浓度如下：SB505124(1-20μM)、SB431542(5-50μM)、RepSox(5-50μM)、ITD1(1-20μM)。
在另一优选例中，所述方法为非诊断性和非治疗性的。
本发明的第三方面，提供了一种体外的ABE基因编辑的方法，所述方法包括：
在ABE基因编辑促进剂的存在下，在体外对待编辑的细胞进行基因编辑，从而促进所述细胞内的基因编辑，其中，所述基因编辑促进剂是ALK5/SMAD2/3通路抑制剂。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗的。
本发明的第四方面，提供了一种试剂产品(或试剂组合)，包括：
(i)第一试剂，所述的第一试剂为ABE基因编辑促进剂，所述基因编辑促进剂是ALK5/SMAD2/3通路抑制剂；和
(ii)第二试剂，所述的第二试剂是进行ABE基因编辑的试剂。
在另一优选例中，所述的第二试剂包括选自下组的一种或多种试剂：
(c1)ABE碱基编辑器、ABE碱基编辑器的编码序列、或表达ABE碱基编辑器的载体、或组合；
(c2)gRNA、crRNA、或用于产生所述gRNA或crRNA的载体；
在另一优选例中，所述的基因编辑针对致病基因、肿瘤相关基因(如致癌基因)、免疫相关基因(如与自身免疫相关的基因，或与免疫治疗相关基因)、视觉相关基因、听觉相关、肿瘤相关、脑发育相关、生殖相关、肝脏疾病相关、肾脏疾病、胰腺疾病相关、骨骼疾病相关、神经疾病相关、胶质疾病相关、肌肉疾病相关、血液疾病相关、器官发育相关、损伤修复、代谢相关、病毒感染相关、遗传疾病、衰老相关。
在另一优选例中，所述基因选自下组：TAU、APP、PCSK9、HBG、EMX1、VEGFA、Plp1、MSSK1、FANCF、MAGEA1、DYSF、ACADVL、DMD等，或其组合。
本发明的第五方面，提供了一种试剂盒，包括：
(i)第一容器，以及位于所述第一容器的第一试剂，所述的第一试剂为ABE基因编辑促进剂，所述基因编辑促进剂是ALK5/SMAD2/3通路抑制剂；和
(ii)第二容器，以及位于所述第二容器内的第二试剂，所述的第二试剂是进行ABE基因编辑的试剂。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有说明书。
在另一优选例中，所述的说明书记载了本发明的促进基因编辑的方法。
在另一优选例中，所述的基因编辑是针对体细胞、干细胞的基因编辑。
在另一优选例中，所述的基因编辑针对致病基因、肿瘤相关基因(如致癌基因)、免疫相关基因(如与自身免疫相关的基因)、视觉相关基因、听觉相关、代谢相关、病毒感染相关、遗传疾病相关。
本发明的第六方面，提供了一种提高基因编辑特异性的方法，包括步骤：给需要的对象施用ABE基因编辑促进剂和进行基因编辑的ABE碱基编辑器，其中，所述基因编辑促进剂是ALK5/SMAD2/3通路抑制剂。
在另一优选例中，所述的对象包括人和非人哺乳动物。
在另一优选例中，在施用所述ABE促进剂之前、之中和/或之后，给所述对象施用进行基因编辑的ABE碱基编辑器。
本发明的第七方面，提供了一个提高基因编辑效率的反应体系，包括：
(i)一个待编辑的DNA靶序列；
(ii)ABE基因编辑器；
(iii)ABE基因编辑促进剂，所述基因编辑促进剂是ALK5/SMAD2/3通路抑制剂；和
(iv)gRNA、crRNA、或用于产生所述gRNA或crRNA的载体。
本发明的第八方面，提供了一种筛选ABE基因编辑器的潜在激动剂的方法，包括步骤：
(a)提供待测试的化合物，所述的待测试的化合物选自下组：ALK5抑制剂、SMAD2/3蛋白磷酸化抑制剂、或其组合；
(b)在测试组中，在所述待测试化合物存在下，进行ABE编辑，并测定ABE编辑的基因编辑效率E1，并且在对照组中，在无所述待测试化合物存在下，进行ABE编辑，并测定ABE编辑的基因编辑效率E0，其中对照组和测试组的除了所述测试化合物之外，其他条件相同；
其中，如果所述基因编辑效率E1显著高于基因编辑效率E0，则提示所述化合物为ABE基因编辑器的潜在激动剂。
在另一优选例中，所述方法还包括：
(c)测试所述ABE基因编辑器的潜在激动剂与ABE基因编辑器的基因编辑效率之间，是否存在剂量依赖关系。
在另一优选例中，所述的待测试的化合物包括：小分子化合物、siRNA、或其组合。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一赘述。
附图说明
图1显示了高通量小分子化合物筛选鉴定ABE激动剂。a、b：ESM报告系统和化合物筛选工作流程的示意图。报告基因包含eGFP和mCherry开放阅读框，由PAM上游带有框内终止密码子的连接子短肽序列分隔。ABE的编辑将终止密码子转化为色氨酸，并导致eGFP和mCherry(ESM细胞)的共表达(a)。将经ABE 7.10系统转染的ESM细胞(ESM-7.10)接种到含有单个化合物的384孔板中，48小时后通过高内涵成像系统定量eGFP和mCherry的荧光强度(b)。c：散点图显示了每种化合物的mCherry/eGFP比率，与DMSO对照组标准化处理(％)。假阳性或高细胞毒性(>30％)的化合物已从图表中删除。红色突出显示的点是靶向ALK5/SMAD2/3通路的化合物。d、e：eGFP和mCherry在经DMSO或SB505124处理48小时后在ESM-7.10细胞中表达情况的代表性图像。比例尺：100微米(d)。量化eGFP和mCherry的强度，并计算比率的倍数变化(eGFP/mCherry值标准化至DMSO对照)(e，n＝9)。f、g：Sanger测序结果显示，在处理48小时后(f，n＝3x3)或在其他指定时间点(SB505124，g，n＝2x3)使用指定浓度的SB505124处理后的A转化为G的效率。h：散点图显示了由指定小分子(与DMSO对照标准化)诱导的A>G转化效率(n＝9)。数据表示平均值和标准差。P值由双尾T检验确定。
图2显示了化合物SB505124促进内源基因组位点的ABE编辑。a-c：热图显示了ABE7.10(a)、ABE8.20(b)和ABE8e(c)在图示位点每个位置的编辑效率。数据来自三个技术重复(n＝3)。计算每个位置的绝对变化(d、g、j)和编辑效率的倍数变化(e、h、k)，并显示ABE7.10(d、e、f)、ABE 8.20(g、h、i)和ABE 8e(j、k、l)的所有测试位点(f、i、l)的倍数变化。编辑效率大于5％的SB505124组数据用于(f，i，l)的统计分析。对于每个ABE版本，将编辑效率与7个位点处DMSO组的最大观测效率标准化。m-o：显示了ABE 7.10(m)、ABE 8.20(n)和ABE8e(o)在每个位置的平均编辑效率。数据表示平均值和标准差，来自三个独立的技术重复。P值由双尾T检验确定。
图3显示了SB505124促进难治性甲基化基因组区域的ABE编辑。a-d：天然甲基化基因组区域的编辑效率。条形图显示了5个内源性高甲基化位点(a)9个位置的编辑效率。每个位点的靶向腺嘌呤(红色)、甲基化胞嘧啶(蓝色)、甲基化率(数值)和PAM序列如图(b)所示。计算所有测试位置的倍数变化(c)和绝对变化(d)。e-h：异染色质和常染色质区域的编辑效率。柱状图图显示了3个异染色质基因座(e)上的10个位置和2个常染色质基因座(f)上的4个位置的编辑效率。计算所有测试位点编辑效率的绝对变化(g)和倍数变化(h)。数据表示平均值和标准差，来自三个技术重复。P值由双尾T检验确定。
图4为分析SB505124引起的脱靶编辑。a-d：gRNA依赖的DNA脱靶编辑由二代测序分析。计算VEGFA3的在靶编辑(a)、腺嘌呤被替代为不同碱基的比例(b)和三个验证OT位点(c)上的脱靶编辑效率。分析了所有测试OT位点的平均脱靶编辑率(d)。数据表示平均值和标准差，来自三个技术重复。P值由双尾T检验确定。e：检测gRNA非依赖性DNA脱靶编辑的R-loop分析示意图。f：条形图显示了五个R-loop区域的编辑效率。数据表示平均值和标准差，来自三个技术重复。P值由双尾T检验确定。数据表示平均值和标准差，来自三个技术重复。
图5显示了SB505124对SpCas9和CBE编辑的影响。a-d：SB505124对SpCas9编辑的影响。热图显示了经SB505124或DMSO(n＝3)(a)处理后SpCas9在五个基因组位点的切割效率。对所有检测位点的平均突变率进行量化，并与DMSO(b)进行比较。通过二代测序结果计算与DMSO比较每个独立测试位点(c)的插入缺失突变率和所有试验点(d)的统计分析。数据表示平均值和标准差，来自三个技术重复。P值由双尾T检验确定。e：Sanger测序结果显示BE3在6个基因组位点的10个位置的编辑效率。f：Sanger测序结果显示，在EMX1和RNF2基因座上，四个图示CBE变体的编辑效率。g：(e)中所有6个测试位点的BE3编辑频率倍数变化的统计分析。h：对EMX1和RNF2处四种指定CBE变体编辑效率倍数变化进行统计分析。i：条形图显示了BE3在6个指定基因组位点诱导的插入缺失突变率的二代测序结果。j：二代测序分析了6个指定位点上BE3靶向胞嘧啶置换为不同碱基的比例。数据表示平均值和标准差，来自三个技术重复。P值由双尾T检验确定。
图6显示了SB505124促进了ABE对体内疾病相关基因的编辑。a-c：ABE 8e在Plp1p.A242V上的编辑效率(a)，及ABE 8e-NG在TAU p.A152T上的编辑效率(b)。经DMSO或SB505124处理后ABE 7.10在Pcsk9(c)上的编辑效率。数据表示平均值和标准差，来自三个技术重复。P值由双尾T检验确定。d：小鼠体内实验的示意图。ABE 7.10和经验证的靶向Pcsk9剪接位点的gRNA通过尾静脉水压注射至体内，SB505124溶液或溶剂从第1天到第4天每天腹腔给药。在第5天，通过流式细胞术分离eGFP表达阳性的肝细胞。e：显示了在指定条件下，一只小鼠的6个组织Pcsk9位点上的编辑效率。f：通过qPCR定量分析Pcsk9基因的表达，并与空白对照组进行比较(每组包含1只小鼠的3个原代肝组织)。
图7显示了ESM细胞系的构建和鉴定。a、b：ESM细胞系构建的工作流程。报告系统由慢病毒导入HEK293T细胞，阳性克隆被扩增并通过FACS分选进行验证。c-e：通过成像分析eGFP和mCherry在经ABE7.10转染的ESM-7.10细胞中的表达情况，ABE7.10转染的细胞包含gRNA靶向终止密码子(上图)、或对照gRNA(中图)或空载体(下图)。比例尺：100微米(c)、FACS(d)和Sanger测序(e)。数据表示平均值和标准差，n＝12来自三个生物学重复。P值由双尾T检验确定。
图8显示了SB505124的细胞毒性分析。a、b：指定时间点ESM细胞中SB505124和ITD-1的细胞毒性分析。比例尺：100微米(a)。细胞数量通过eGFP(b)的面积进行量化。数据表示平均值和标准差，来自三个技术重复。P值由双尾T检验确定。
图9为二代测序分析编辑产物纯度。a、b：SB505124或DMSO处理的HEK293T细胞中VEGFA3位点的编辑产物分布(a)和indel分析(b)。数据来自三次技术重复。P值由双尾T检验确定。c-e：ABE 7.10经指定小分子处理后在ESM细胞中的编辑效率。表中显示了小分子及其靶点(c)。计算了图示小分子诱导后的编辑效率(d)和倍数变化(e)。数据表示平均值和标准差，n＝6来自两个生物学重复。P值由双尾T检验确定。
图10显示了ABE激动剂的验证。示意图显示了经典的TGF-β信号通路，以及本发明中确定的针对ALK5或SMAD2/3的ABE小分子激动剂。b：本发明中确定的以TGF-β通路为靶点的ABE激动剂及其靶点。c：通过qPCR定量分析转染靶向ALK5(si-ALK5)或非靶向对照(si-NT)siRNA的HEK293T细胞中ALK5的表达。数据表示平均值和标准差，来自三个技术重复。P值由双尾T检验确定。d:Sanger测序分析转染靶向ALK5(si-ALK5)或非靶向对照(si-NT)siRNA的HEK293T细胞中ABE的编辑效率。e：ABE 7.10在经指定小分子处理的ESM细胞中的编辑效率。数据表示平均值和标准差，n＝9来自三个生物学重复。P值由双尾T检验确定。
图11显示了SB505124促进内源性基因组位点的ABE编辑。a-c：ABE 7.10(a)、ABE8.20(b)和ABE 8e(c)在所有测试位置编辑效率的绝对变化。数据来自三次技术重复。d-f：在SB505124或DMSO(d)处理的HEK293T细胞中，分析了ABE 8e在5条染色体上5个基因组位点15个位置的编辑效率。(e)中测试的所有位点的标准化编辑频率的统计分析以及每个位置编辑效率的绝对变化如(f)所示。数据表示平均值和标准差，来自三个技术重复。P值由双尾T检验确定。
图12显示了SB505124增强了不同细胞类型中的ABE编辑。a-d：经SB505124或DMSO处理过的U2OS细胞中的ABE 8e编辑效率显示在指定位点(a)及U251细胞(c)中的编辑情况。分析U2OS细胞(b)和U251细胞(d)中所有测试位点的编辑效率倍数变化。数据表示平均值和标准差，来自三个技术重复。P值由双尾T检验确定。
图13显示了被测试基因的表观遗传学修饰特征。图示基因位点的组蛋白修饰特征检索至ChIP-Seq峰图。顶部的蓝色箭头表示所选gRNA的位置。染色体坐标(hg38)标记如下。
图14显示了SB505124处理细胞后的gRNA错配脱靶效应分析。gRNA依赖的DNA脱靶编辑由二代测序分析。显示了HBG(a)和EMX1(b)位点在指定位置进行在靶编辑和在OT位点进行脱靶编辑的转换频率。数据表示平均值和标准差，来自三个技术重复。P值由双尾T检验确定。
图15显示了SB505124处理细胞后的SpCas9编辑分析。针对转染SpCas9并经SB505124或DMSO处理细胞的基因组DNA，计算指定位点的产物纯度。
图16显示了SB505124促进体内ABE编辑。a-c：C57BL/6小鼠(a)、肝组织(b)的照片，以及肝脏中eGFP表达的代表性图像。比例尺：100微米(c)。d：在指定条件下，对从C57BL/6小鼠肝组织分离的eGFP阳性细胞(圈内)进行FACS分析。
图17显示了本发明部分ABE促进剂的化学结构。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现了一类可以高效显著提高ABE复合体的碱基编辑特异性、效率和/或扩大编辑窗口的化合物。具体地，本发明人通过高通量小分子化合物筛选，识别并验证了一系列靶向TGF-RI/ALK5/SMAD2/3通路的小分子抑制剂(简称为“本发明化合物”，例如化合物SB505124)，这些化合物可作为有效的ABE激动剂，提高ABE的特异性和效率等性能。在此基础上，发明人完成了本发明。
实验表明，以SB505124为代表的本发明化合物不仅可促进多个内源性基因组位点的ABE靶向编辑，包括那些难于编辑的基因组位点，还极大地扩大了编辑窗口。与此同时，SB505124等本发明化合物几乎不提高基因组的脱靶编辑，保持高保真度，且特异性地提高ABE的碱基编辑活性。
术语
如本文所用，术语“提高基因编辑特异性”指降低基因编辑的脱靶率，或提高基因编辑的N1/N0之比，式中，N1为在特异性位点发生预定基因编辑的数量(即on)；而N0为在非特异性位点发生预定基因编辑的数量(即发生脱靶的数量，off)。
如本文所用，术语“A>G”或“A→G”均指碱基A突变为G。
术语“C1-C8烷基”、“C1-C6烷基”和“C1-C3烷基”指分别具有1-8、1-6或1-3个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、或类似基团。
术语“C2-C8烯基”指具有2-8个碳原子的直链或支链的烯基，例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、或类似基团。
术语“C2-C8炔基”指具有2-8个碳原子的直链或支链的炔基，例如乙炔基、丙炔基、丁炔基、或类似基团。
术语“C3-C6环烷基”指具有3-6个碳原子的环烷基，例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基或类似基团。
术语“3-6元杂环基”指具有3-6个环原子且一个或多个环原子为杂原子(选自下组：N、O、S)的环基。
术语“C6-C10芳基”指具有6-10个碳原子的芳基，例如苯基或萘基。
术语“杂芳基”指具有4-9个环碳原子且一个或多个环原子为杂原子的芳基，例如含1、2、或3个氮原子的杂芳基，如吡啶基、嘧啶基、等。
术语“C1-C6烷氧基”指具有1-6个碳原子的直链或支链烷基氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、或类似基团。
术语“C2-C6杂环”指具有4-10个环原子且一个或多个环原子为杂原子且含有2-6个碳原子的环基。
术语“卤素”指F、Cl、Br和I。
ABE促进剂
如本文所用，“本发明化合物”、“式A化合物”、“本发明的ABE促进剂”、“本发明的ABE激动剂”可互换使用，指ALK5/SMAD2/3通路抑制剂、或其药学上可接受的盐、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物。应理解，该术语还包括上述组分的混合物。
优选的本发明化合物为式A所示结构的化合物、或其药学上可接受的盐、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物。
在本发明中，还包括式A化合物的药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。
本发明化合物可采用现有技术中本领域技术人员熟知的方法进行制备，对各个步骤的反应参数没有特别限制。
如本文所用，在式A化合物中，如果存在手性碳原子，则手性碳原子可以为R构型，也可以为S构型，或二者的混合物。
ABE碱基编辑
本发明化合物可显著提高ABE碱基编辑器的性能，其中包括(但并不限于)：提高碱基编辑效率、提高碱基编辑特异性、扩大碱基编辑的窗口、降低编辑的脱靶率、或其组合。
如本文所用，“碱基编辑器”(也称为“核碱基编辑器”)是指进行碱基编辑的融合蛋白。该融合蛋白会与gRNA形成复合体，该复合体在碱基编辑时不切割双链DNA，而是通过脱氨酶介导的脱氨反应，在细胞内DNA修复/复制机制的参与下，完成对单碱基的替换。
在本发明中，代表性的ABE碱基编辑器包括(但并不限于)：基于CRISPR的碱基编辑器。
典型地，本发明的ABE单碱基编辑器是基于Cas9和腺苷脱氨酶的融合蛋白，其包含与脱氨酶融合的Cas9切口酶结构域或dCas9(dead Cas9，只保留Cas9识别和结合底物的能力，但不具备切口酶活性)。在另一些情况下，碱基编辑融合蛋白是腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，例如将细菌和人细胞DNA中的A·T转换为G·C碱基对的ABE。
在本发明中，ABE腺嘌呤碱基编辑器通过向导RNA(gRNA)靶向特定的基因位点，并且其可将在前间隔序列相邻基序(PAM)位点附近的小编辑窗口中的腺嘌呤碱基(A)转换为肌苷(Inosine)，也称为次黄苷、次黄嘌呤核苷等，随后在细胞DNA修复或复制机制的参与下，原始的A·T碱基对将替换为G·C碱基对，最终实现A→G的突变。
用途
本发明化合物和ABE碱基编辑器的组合，可显著提高基因编辑的活性和/或特异性，因而在治疗应用等不同领域具有革命性的潜力。
本发明的式A化合物可用于提高ABE介导的基因编辑的活性和/或特异性，进而可用于预防或治疗与致病基因相关的疾病。
本发明还提供了一种利用本发明化合物促进ABE介导的基因编辑方法，该方法可以是治疗性的或非治疗性的。通常，该方法包括步骤：在施用ABE碱基编辑器之前、之中、之后或同时，给需要的对象施用本发明化合物。
优选地，所述对象包括人和非人哺乳动物(啮齿动物、兔、猴、家畜、狗、猫等)。
组合物和施用方法
本发明提供了一种用于促进ABE碱基编辑器介导的基因编辑活性和/或特异性的组合物。所述的组合物包括(但并不限于)：药物组合物、科研用试剂组合物等。
在本发明中，所述的组合物可直接用于提高基因编辑的编辑效率和特异性等性能，例如，提高ABE的碱基编辑效率、在难编辑的基因组位点进行有效的碱基编辑、扩增原有的ABE碱基编辑窗口。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明化合物以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、粉剂、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。
以药物组合物为例，本发明的组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。本发明的药物组合也可以被制成粉剂用于雾化吸入。
对于本发明的药物组合物，可通过常规的方式施用于所需的对象(如人和非人哺乳动物)。代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、注射、局部施用等。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明提供了一类可以特异性显著提高ABE基因编辑器活性的化合物,这些化合物为靶向经典TGF-βRI/ALK5/SMAD2/3的小分子抑制剂，其中选择性的ALK5抑制剂SB505124最为有效。
(b)本发明化合物可显著提高ABE的碱基编辑效率。
(c)本发明化合物可显著提高碱基编辑保真度。以SB505124为例，SB505124几乎不提高基因组的脱靶编辑，保持高保真度。
(d)本发明化合物可有效扩大碱基编辑的窗口。
(e)本发明化合物可有效促进ABE对难编辑的基因组位点的碱基编辑，例如封闭的染色体、染色质、高DNA甲基化及其周边等区域。
(f)本发明的SB505124特异性地诱导了ABE的编辑，而不是CBE或Cas9，不易对其他基因编辑方法产生干扰。此外，本发明化合物不会导致A到非G的转换，也不导致插入缺失突变率增加。
(g)本发明化合物具有高安全性。细胞实验显示，SB505124没有明显的细胞毒性，因此有较大的潜在的临床应用与治疗价值。
(h)本发明化合物可以通过与细胞直接孵育进入细胞，促进ABE的碱基编辑活性。例如，SB505124在体内也可以进行有效的碱基编辑，在体内促进疾病相关基因ABE编辑方面，有较大的应用前景。
(i)本发明基于式A化合物和ABE的组合，为精准基因编辑提供了一种简单而又高效的策略。
(j)本发明可以对不同类型的细胞进行精准的基因编辑。
(k)本发明可以在哺乳动物体内促进ABE对疾病相关位点的精准编辑。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
序列
实施例中涉及的gRNA编码序列和对应于的靶点如下：
*当编码序列转录后，将gRNA编码序列中的T转录为U，所获得的序列就是gRNA的靶向序列。
实施例1.高通量化学筛选识别有效的ABE激动剂
1.1筛选系统的建立
为筛选ABE的小分子激动剂，构建了一个用于筛选的基因工程细胞。方法如下：
首先构建了一个编码eGFP和mCherry的报告基因，其通过含人为引入终止密码子的短肽连接(图1a，图7a)。终止密码子的腺嘌呤碱基被设计在PAM远端第五位碱基上。该报告基因系统由慢病毒导入HEK293T细胞，通过流式细胞仪(FACS)筛选出报告基因整合良好且表达稳定的单克隆进行进一步研究(图7b，c)，以下简称ESM细胞。
将表达ABE7.10和靶向终止密码子的gRNA的游离质粒转染入ESM细胞，获得的细胞被命名为ESM-7.10细胞。
在这些ESM-7.10细胞中，ABE 7.10的异位表达和以终止密码子为目标的gRNA成功地将过早的终止密码子转化为色氨酸密码子(即将终止密码子TAG转化为TGG)，并导致27.1％的细胞同时表达eGFP和mCherry(图7d)。
通过Sanger测序检测，平均A>G编辑效率约为41％，验证了这些细胞可作为基于成像的高通量筛选的合适工具(图7e)。
1.2ABE激动剂
利用首先筛选了一个包含7647个生物活性化合物的商品化化合物库和一个包含111个化合物的自制化合物库。
用表达ABE7.10和靶向终止密码子的gRNA的游离质粒转染ESM细胞，获得ESM-7.10细胞。12小时后，将ESM-7.10细胞接种到384孔板中，每孔5000个细胞，同时每孔分别加入10μM浓度的小分子化合物。48小时后，通过高内涵成像量化eGFP和mCherry的荧光强度，将eGFP/mCherry荧光强度比与DMSO对照组标准化(图1b)。当ABE成功进行碱基编辑时，人为引入的过早的终止密码子被转化为色氨酸密码子(TAG→TGG)，从而表达eGFP和mCherry。这导致荧光从单一的eGFP变为同时表达eGFP和mCherry，mCherry的荧光强度与ABE编辑效率呈正比例关系。
1.3结果
经筛选，83个小分子表现出高荧光比率(与DMSO对照组相比，eGFP/mCherry>1.5倍)和细胞存活率(>70％)，作为ABE激动剂的候选物。再通过第二轮筛选验证这化合物对ABE的促进作用(图1c)。
在这些候选激动剂中筛选出了一系列靶向TGF-β通路的小分子抑制剂，其中SB505124是一种选择性的ALK5抑制剂，促进ABE编辑活性最好(图1c-e)。
SB505124剂量依赖性地提高了ABE的编辑效率(最高从27.2％提高到66.2％，2.4倍诱导)，且没有明显的细胞毒性(图1f和图8)，直到处理后72小时，编辑效率达到了平台期(图1g)。
二代测序(NGS)结果证实，SB505124显著增强了ABE编辑(图9a)，同时未发现插入缺失突变率增加，也未观察到不期望的A到非G的转换(图9)。
综上，通过高通量化学筛选，鉴定并验证了SB505124可作为ABE的强有力的激动剂。
实施例2.SB505124通过抑制经典ALK5/SMAD2/3通路促进ABE编辑：
2.1ALK5的小分子抑制剂可增强ABE编辑
SB505124通过阻断ALK5介导的下游效应因子SMAD2/3的磷酸化，作为TGF-β通路的选择性抑制剂(图10a)。此外，还发现，在实施例1获得ABE激动剂中靶向ALK5的小分子抑制剂，包括LY3200882、SD 208、SB431542和RepSox，均增强了ABE编辑(图1h)。
此外，当通过特异性siRNA敲低ALK5时，可以观察到1.2倍的编辑增强(图10c，d)。
2.2ALK5通过下游效应子SMAD2/3的磷酸化影响ABE编辑
正常情况下，ALK5通过下游效应子SMAD2/3的磷酸化来实现其功能。为了更严格地探究SB505124是否通过这一通路工作，本发明人用ITD-1单独处理细胞。ITD-1是一个可以有效阻断SMAD2/3蛋白磷酸化的抑制剂。
结果表明，ITD-1将A>G转换提高了1.8倍(图1h)。
另外，用SB505124和ITD-1同时处理细胞不能进一步地提高编辑效率(图10e)。这说明，SB505124通过抑制经典的ALK5/SMAD2/3通路促进ABE编辑。
实施例3.SB505124促进ABE有效编辑内源性基因组位点
3.1SB505124促进ABE编辑内源性基因组位点的效率
为了深入研究SB505124是否促进了ABE在内源性基因组位点的编辑，本发明人用Lipo3000转染了HEK293T细胞，其中的gRNA针对基因组的多个位点(图2a)。这些位点包括在ABE的典型编辑窗口4-7位的A碱基，以及那些靠近编辑窗口的A碱基，这些位点通常被编辑的可能性较低。在本实施例中，比较了存在或不存在SB505124的情况下，不同ABE编辑器的编辑效率。
结果表明，SB505124诱导7个位点中的2个位点增强20～40％，3个位点增强10～20％，2个位点增强3～10％(图2a，2d和图11a)。在经典的编辑窗口中，位置4到7的平均编辑效率分别提高了16.2％(3.0倍)、12.1％(1.8倍)、28％(2.4倍)和15.6％(2.7倍)(图2d，图11a)。特别针对18和19位点编辑效率显著提高了3.4倍，达到40～65％(图2m)。
统计表明，SB505124将ABE 7.10的编辑提升了2.5倍(图2f)。
除了ABE 7.10，本发明人还进一步研究了SB505124是否适用于另外两个主要使用的ABE系统，ABE 8.20和8e(图2b c)。值得注意的是，SB505124诱导了几乎所有测试位点的编辑，ABE8.20和ABE8e的编辑效率分别被提升为2.2倍和1.8倍(图2i，l，图11b，c)。在3个突变体中，SB505124诱导ABE 8e最少。
为了更严格地描述SB505124在ABE 8e上的功能，我们在不同的染色体上选择了五个额外的位点，包括位于着丝粒近端位置的位点。Sanger测序结果证实，SB505124可诱导5个位点全部15个位置ABE 8e的编辑，平均1.56倍(图11d-f)。
在U2OS和U251细胞中，我们进一步验证了SB505124对ABE的促进作用，我们观察到在两种细胞中分别是1.5倍和1.6倍的诱导效率(图12)。这些结果共同表明，SB505124对ABE在不同基因组位点的激活具有普遍作用。
3.2SB505124扩大了ABE的编辑窗口
为了检测SB505124是否调节ABE的编辑窗口，本发明人选择了位点18和19(Site18、19)，分别覆盖了远PAM端位置A1到A13的奇数和偶数位置。
令人惊讶的是，除了典型编辑窗口内的靶腺嘌呤外，本发明人还观察到SB505124在邻近位置显著提高编辑效率，特别是对于ABE 8.20和ABE 8e。简单地说，SB505124提高了位置A2和A3的编辑效率，ABE 8.20提高了12％和11.7％，ABE8e提高了10％和19.3％，在A9和A12，ABE 8.20提高了25％和12.7％，ABE 8e提高了18.7％和21.7％(图2n和2o)。总的来说，SB505124极大地促进了ABE编辑，并扩展了编辑窗口。
实施例4.SB505124促进难于编辑基因组位点的编辑：
表观遗传的抑制性染色质区域，以高DNA甲基化或抑制性组蛋白标记为标志，通常高度折叠浓缩且难以接近，据报道，这样的区域会强烈抑制碱基编辑器活性。
为了检验SB505124是否促进了这些难编辑区域的编辑，本发明人首先检测了MSSK1，一个高度甲基化的位点。第5位腺嘌呤毗邻甲基胞嘧啶(约75％)。当ABE靶向此位点时，A>G转化约为20.7％，而SB505124诱导后为29.7％，诱导倍数为1.4倍(图3a和3b)。
本发明人进一步选择了另外5个基因组位点，这些位点都被报道为高度甲基化。在5个位点的9个位置上，SB505124均显著提高了编辑效率(图3a和图3b)。平均而言，SB505124将ABE编辑活性提高1.5倍，从11％到16％(图3c和3d)。
此外，本发明人还研究了SB505124是否有助于编辑H3K9m3修饰标记的转录抑制异染色质区域。本发明人从3条染色体中选择了3个异染色质区域包含10个ABE靶向编辑位置。同时，本发明人在2个基因组位点中选择了H3K4m3修饰的4个位置作为常染色质区域的对照(图13)。
结果表明，SB505124在异染色质区显著提高了2～13％的编辑能力，在常染色质区显著提高了4～11％(图3e和3f)，平均分别提高1.52倍和1.37倍(图3g和3h)。
上述实验结果表明，SB505124促进ABE在难编辑基因组区域的有效编辑。
实施例5.SB505124对ABE脱靶效应的影响
ABE的发展带来了更高的转换效率，同时也产生了更多的脱靶编辑。这种脱靶效应是由ABE在基因组DNA或mRNA中的非靶向性脱氨作用引起的，被认为是临床应用的主要关注点。在本实施例中，进一步测试SB505124是否会导致脱靶编辑的增加。
5.1SB505124不促进依赖于gRNA的DNA脱靶编辑
进一步测试SB505124是否会促进基因组上的gRNA依赖的脱靶编辑。方法如下：
用gRNA转染HEK293T细胞，以VEGFA3为靶点，这是一个先前已经报道用于评估ABE脱靶效应的基因组位点。本发明人分析了在靶位点上的A>G转换，以及三个最活跃的脱靶位点。本发明人检测到靶向编辑率为26％，SB505124诱导到31％(图4a)。在靶位点检测到非常低的A到非G的转换率，这与DMSO组相当(图4b)。值得注意的是，NGS测序结果显示，无论是否用SB505124处理，三个脱靶位点的编辑率没有显著差异(图4c和4d)。
为了更严格地表征，本发明人进一步转染了靶向HBG和EMX1的gRNA。同样地，本发明人没有观察到无论是否使用SB505124，脱靶位点上编辑率的显著差异(图14)。
这些结果表明，SB505124不会促进依赖于gRNA的脱靶编辑。
5.2SB505124不促进非gRNA依赖的DNA脱靶编辑
还研究了SB505124是否诱导了基因组上非gRNA依赖的脱靶编辑。为此，本发明人使用基于nSpCas9的ABE系统(nSp-ABE7.10和靶向Site18位点的gRNA)转染HEK293T细胞，同时共转nSaCas9系统(nSaCas9和靶向R-loop位点1～5的gRNA)。nSaCas9系统的表达会导致基因位点上R-loop的产生，这是一小段单链DNA，可以作为游离nSp-ABE7.10的底物(图4e)。
二代测序结果表明，在SB505124存在的情况下，五个R-loop上没有诱导非目的性A>G转换率提高(图4f)。
综上所述，这些结果表明SB505124对ABE在基因组上脱靶编辑的影响不大。
实施例6.SB505124特异性促进ABE编辑
鉴于SB505124能够诱导ABE活性，在本实施例中，进一步研究SB505124是否会调节Cas9或CBE的活性。
6.1SB505124不调节Cas9的活性
为此，本发明人将Cas9和相应的gRNA转染到HEK293T细胞中，针对5个基因组位点，分析SB505124是否促进Cas9的基因组切割活性。
结果表明，对于所有被检测的位点，本发明人没有发现单个位点的编辑率发生显著变化，在这些位点上，SB505124的平均基因组切割效率与DMSO对照没有统计学差异(图5a，5b)。此外，SB505124没有引起不必要的编辑，因为所有被测位点的插入缺失突变率显示出明显的变化(图15)。NGS结果证实了这些结果(图5c，5d)。
这些数据共同表明，SB505124不调节Cas9的活性。
6.2SB505124不调节CBE的活性
CBE的开发策略与ABE相似，只是与nCas9融合的模块是APOBEC家族的胞苷脱氨酶，而不是腺苷脱氨酶。为了测试SB505124是否在CBE上起作用，首先用BE3-hA3A(BE3)评估了8个基因组位点的C>T转换，BE3是一种常用的高效CBE。
BE3在8个位点中的5个位点诱导了高效的C>T转换(转化率范围为10％-30％)，在3个位点诱导了低效的编辑(效率>5％)(图5e，f)。然而，本发明人没有观察到在SB505124存在时单个位点编辑率的显著变化，总体转化率也没有被SB505124显著诱导(图5g)。
为了更严格地描述这种现象，本发明人测试了其他CBE变体的编辑效率，包括BE3-hA3A-Y130F、BE3-hA3A-Y132D和BE3-mA1。在所有9个被测位点中，SB505124既没有增加编辑效率，也没有增加不必要的插入缺失突变和C到非T的转化(图5f，图5h-j)。
综合上述结果，可以看出，SB505124特异性促进ABE编辑活性，但对Cas9和CBE无影响。
实施例7.SB505124促进ABE对致病突变的纠正
点突变是已知致病遗传变异中最大的一类，其中大约一半是可以被ABE纠正的G·C到A·T突变。
7.1SB505124促进ABE纠正蛋白脂质蛋白基因1(PLP1)的点突变
佩梅病(Pelizaeus Merzbacher disease，PMD)是一种伴X染色体的隐性中枢神经系统髓鞘形成障碍疾病，由蛋白脂质蛋白基因1(PLP1)的突变引起。虽然PLP1基因重复是最常见的突变，但点突变，如错义突变c.725C>T(p.Ala242Val，写作A242V)，会导致更罕见、更严重的PMD。
为了纠正这种突变，本发明人用ABE 8e和靶向突变腺嘌呤的gRNA转染了携带PLP1A242V突变的HEK293T细胞，ABE 8e的表达纠正A242V的效率为11％(图6a)。在SB505124加入后，转化效率为32％，增加了2.9倍(图6a)。
7.2SB505124促进ABE微管相关蛋白Tau的点突变
微管相关蛋白TAU(Microtubule-Associated Protein TAU，MAPT)基因突变已在具有神经退行性疾病高风险的个体中发现。其中，突变c.454G>A(p.A152T)在被诊断为额颞叶谱系障碍的患者中发现。
对于携带A152T突变的HEK293T细胞，本发明人发现SB505124可将转化效率从3.3％提高到8.4％，显著提高2.6倍(图6b)。
上述结果共同表明，SB505124可促进对人类细胞中致病点突变的纠正。
实施例8.利用SB505124和ABE进行体内碱基编辑：
为了测试SB505124是否促进了体内碱基编辑，本发明人将重点放在与疾病相关的基因PCSK9上，该基因主要在肝脏中表达，并作为LDL受体的负调节因子。据报道，通过阻断PCSK9典型剪接位点使其功能失活，能够降低血液中LDL水平，因此是一个有前景的治疗靶点。
首先在小鼠N2a细胞中验证了Pcsk9的编辑，使用SB505124诱导A6的转化效率从40.7％提高44％(图6c)。
为了在成年小鼠中检查校正情况，本发明人将携带ABE7.10和验证过的gRNA的游离质粒经尾静脉水压注射至小鼠体内(图6d)。质粒在肝脏中持续表达，用eGFP监测ABE的表达(图16c，d)。从第2天开始每天腹腔注射SB505124或溶剂。直到第5天，处死小鼠，从肝细胞中分离基因组DNA进行分析。
结果，本发明人发现ABE编辑Pcsk9的A6位置效率为26.8％(图6e)。在SB505124处理下，A6上的编辑效率增强至30.4％(图6e)。在转录水平上，本发明人发现PCSK9被ABE敲低到68％，SB505124进一步降低到15％(图6f)。
这些结果强有力地表明，SB505124可在体内促进ABE对疾病相关基因的基因编辑。
讨论
碱基编辑器的主要应用是治疗疾病相关的点突变。因此，在不同的基因组区域实现高效和精确的编辑是非常需要的。在此，本发明人筛选了大约8000个具有足够覆盖度和多样性的化学文库的小分子，并最终确定了有效的ABE激活剂。令人惊讶的是，大部分激活剂都针对细胞表面受体。出乎意料的是，有一系列的小分子激活剂都属于TGF-β抑制剂的范畴。
本发明人通过遗传学和化学方法进一步验证了这种调控，证实了TGF-β通路对ABE活性的调控作用。其中，SB505124是能够显著促进ABE在多个内源性位点在靶编辑的最有效的激活因子。值得注意的是，SB505124促进了ABE在表观遗传抑制区域的编辑，而这些区域通常都会强烈抑制碱基编辑器的活动，因此本发明的新发现极大地扩展了ABE的研究范围。
此外，SB505124在体内和体外均增强了疾病相关基因的编辑。随着递送技术的发展，这些激活剂有望以可控的方式促进不同器官不同位点和不同细胞类型的体内编辑，从而具有很大的治疗潜力。
目前，碱基编辑的活性和特异性的调控机制仍然很不清楚。最近，通过基于CRISPRi的遗传学筛选，Liu和同事们报道了参与DNA错配修复的因子是先导编辑器(Primeeditor,PE)在细胞中介导编辑的重要决定因素，一种蛋白质工程MMR(Mismatch Repair,MMR)抑制蛋白的瞬时表达提高了PE的效率。然而，哺乳动物细胞的内在调节机制是如何作用于来源于细菌腺苷脱氨酶的ABE，尚无相关报道。
在本发明中，本发明人发现TGF-β通路参与了ABE编辑的调控。用靶向ALK5或下游效应因子SMAD2/3的小分子抑制剂阻断这一通路可大大增强ABE的编辑活性。同时，ALK5的基因抑制也表现出与小分子抑制剂相同的促进作用，证实了经典的TGF-β通路参与ABE活性的调节。
ABE的精确编辑是其临床应用的首要标准。然而，较高的ABE活性通常伴随着在基因组和转录组上更多的脱靶编辑，这是一个主要的担忧因素。在本发明中以SB505124为代表的本发明化合物在基因组上显著促进在靶编辑，而不是脱靶编辑，表现出高保真度。
此外，在SB505124存在的情况下，本发明人观察到了转录组的脱靶编辑诱导，这表明基因组DNA和mRNA的编辑可能受到不同机制的调控。ABE活性在不同底物(包括DNA和RNA)以及不同特征(如表观遗传状态)上的调控还需要进一步研究。
先前的研究报道HDAC抑制剂可以诱导碱基编辑器的编辑。这些小分子非选择性地在全基因组范围内诱导转录，并促进CBE和ABE在基因组上的在靶和脱靶活性。ABE的选择性激活剂仍有待研究。在本发明中，验证的SB505124是迄今为止发现的最有效的激活剂。更重要的是，SB505124是ABE的特异性激活剂，而不促进CBE或Cas9，它为控制特定的碱基编辑器提供了一个可选择的工具。当不同种类的碱基编辑器(如ABE和CBE)同时使用时，这将尤为有用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海交通大学医学院
<120> 特异性促进腺嘌呤碱基编辑器活性的化合物、化学调控方法及其应用
<130> P2021-3451
<160> 29
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 抑制ALK5的siRNA
<400> 1
cgagauaggc cguuuguau 19
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<211> 19
<212> RNA
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<220>
<223> 抑制ALK5的siRNA
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<212> RNA
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<220>
<223> 抑制ALK5的siRNA
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<212> RNA
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<220>
<223> 抑制ALK5的siRNA
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<223> 靶向Site8的gRNA编码序列
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<223> 靶向Site9的gRNA编码序列
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gaagaccaag gatagactgc 20
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ggacaggcag catagactgt 20
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cacacacact tagaatctgt 20
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gcctggaagt tcgctaatcc 20
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gctggcagca agggcggcgc 20
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<223> 靶向chr8: HGSNAT的gRNA编码序列
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<223> 靶向chr2: DYSF的gRNA编码序列
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<223> 靶向chr17: ACADVL的gRNA编码序列
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<223> 靶向chrX: DMD的gRNA编码序列
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<212> DNA
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<223> 靶向chr8: 119122625的gRNA编码序列
<400> 29
gcttgcagtt tagggcatcg 20

Claims (26)

1.一种ALK5/SMAD2/3通路抑制剂在制备用于促进腺嘌呤碱基编辑器(ABE)的基因编辑的组合物中的用途；
其中所述的ALK5/SMAD2/3通路抑制剂选自下组：SB505124、SB431542、RepSox、ITD1、SD208、LY3200822、抑制ALK5的siRNA、或其组合；
其中，所述的抑制ALK5的siRNA为CGAGAUAGGCCGUUUGUAU(SEQ ID No: 1)、GAGAAGAACGUUCGUGGUU(SEQ ID No: 2)、UGCGAGAACUAUUGUGUUA(SEQ ID No: 3)和GACCACAGACAAAGUUAUA(SEQ ID No: 4)的组合。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物包括药物组合物。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物包括实验用试剂。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的促进腺嘌呤碱基编辑器(ABE)的基因编辑选自下组：
(P1) 提高ABE的基因编辑效率；
(P2) 降低ABE的脱靶率；
(P3) 扩大ABE的碱基编辑窗口；
(P4) 促进ABE对难编辑基因组位点的碱基编辑；
(P5) 上述P1～P4的任意组合。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的难编辑的基因组位点选自下组：异染色质中的待编辑的位点、常染色质中的待编辑的位点、高DNA甲基化区域中的待编辑的位点、或其组合。
6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述降低ABE的脱靶率指降低Toff/(Ton+Toff)比值，其中，Ton为靶定位点的编辑率，即在gRNA引导下在预定靶点位置发生的编辑率；Toff为非靶定位点的编辑率，即碱基编辑器在非靶向位置的脱靶编辑效率。
7.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述促进腺嘌呤碱基编辑器(ABE)的基因编辑包括：在提高ABE在靶编辑效率的同时，不导致脱靶编辑率升高。
8.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的扩大ABE的碱基编辑窗口指：对经典编辑窗口之外的A进行基因编辑，其中包括对位点8、9、10、12、或13进行基因编辑。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的经典编辑窗口为Cas9蛋白识别靶向DNA序列的保守序列PAM上游的20个碱基中，适用于ABE7.10的从远端第20位向PAM端计数的第4-7位碱基，或适用于ABE8.20和ABE8e第4-8位碱基。
10.如权利要求1所述的用途，其特征在于，ALK5/SMAD2/3通路抑制剂选自下组：SB505124、SB431542、RepSox、ITD1、SD208、LY3200822、或其组合。
11.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的ALK5/SMAD2/3通路抑制剂为抑制ALK5的siRNA，所述siRNA的序列为：CGAGAUAGGCCGUUUGUAU(SEQ ID No: 1)、GAGAAGAACGUUCGUGGUU(SEQ ID No: 2)、UGCGAGAACUAUUGUGUUA(SEQ ID No: 3)、和GACCACAGACAAAGUUAUA(SEQ ID No: 4)的组合。
12.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的ALK5/SMAD2/3通路抑制剂选自下组：SB505124、SB431542、RepSox：
。
13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述的ALK5/SMAD2/3通路抑制剂为SB505124，化学式为2-[4-(1,3-苯并二氧戊环-5-基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-6-甲基-吡啶。
14.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的腺嘌呤碱基编辑器(ABE)选自下组：ABE1.1、ABE1.2、ABE2.1、ABE2.9、ABE2.10、ABE3.1、ABE4.3、ABE5.1、ABE5.3、ABE6.3、ABE6.4、ABE7.4、ABE7.8、ABE7.9、ABE7.10、ABEmax、VRQR-ABEmax、VREQ-ABEmax、xABEmax、NG-ABEmax、Sa-ABE、SaKKH-ABE、dCas9-ABE、ABE8.8、ABE8.13、ABE8.17、ABE8.20、ABE8a、ABE8b、ABE8c、ABE8d、ABE8e、ABE8e-NG、CP-Cas9-ABE、A&C-BEmax、SPACE。
15.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的促进腺嘌呤碱基编辑器(ABE)的基因编辑包括提高基因编辑特异性。
16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述的提高基因编辑特异性指提高ABE的基因编辑，但不提高CBE或Cas9或基于Cas9的其他编辑器介导的基因编辑。
17.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的基因编辑包括体内基因编辑、体外基因编辑、或其组合。
18.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的基因编辑针对的样品选自下组：细胞、组织、器官、或其组合。
19.如权利要求18所述的用途，其特征在于，所述的样品来自动物、植物、微生物。
20.如权利要求18所述的用途，其特征在于，所述的样品来自细菌、病毒。
21.如权利要求18所述的用途，其特征在于，所述的细胞包括原代细胞和传代的细胞。
22.一种腺嘌呤碱基编辑器(ABE)基因编辑的方法，其特征在于，所述方法包括：
在ABE基因编辑促进剂的存在下，对细胞进行基因编辑，从而促进所述细胞内的基因编辑，
其中，所述基因编辑促进剂是ALK5/SMAD2/3通路抑制剂，
其中，所述细胞包括体细胞、干细胞，其中，所述干细胞选自下组：诱导性多能干细胞、脂肪干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、少突胶质祖细胞、造血干细胞；
其中，所述的ALK5/SMAD2/3通路抑制剂选自下组：SB505124、SB431542、RepSox、ITD1、SD208、LY3200822、抑制ALK5的siRNA、或其组合；
其中，所述的抑制ALK5的siRNA为CGAGAUAGGCCGUUUGUAU(SEQ ID No: 1)、GAGAAGAACGUUCGUGGUU(SEQ ID No: 2)、UGCGAGAACUAUUGUGUUA(SEQ ID No: 3)和GACCACAGACAAAGUUAUA(SEQ ID No: 4)的组合；
其中，所述方法是非诊断性和非治疗性的。
23.一种体外的腺嘌呤碱基编辑器(ABE)基因编辑的方法，其特征在于，所述方法包括：
在ABE基因编辑促进剂的存在下，在体外对待编辑的细胞进行基因编辑，从而促进所述细胞内的基因编辑，其中，所述基因编辑促进剂是ALK5/SMAD2/3通路抑制剂，
其中，所述细胞包括体细胞、干细胞，其中，所述干细胞选自下组：诱导性多能干细胞、脂肪干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、少突胶质祖细胞、造血干细胞；
其中所述的ALK5/SMAD2/3通路抑制剂选自下组：SB505124、SB431542、RepSox、ITD1、SD208、LY3200822、抑制ALK5的siRNA、或其组合；
其中，所述的抑制ALK5的siRNA为CGAGAUAGGCCGUUUGUAU(SEQ ID No: 1)、GAGAAGAACGUUCGUGGUU(SEQ ID No: 2)、UGCGAGAACUAUUGUGUUA(SEQ ID No: 3)和GACCACAGACAAAGUUAUA(SEQ ID No: 4)的组合；
其中，所述方法是非诊断性和非治疗性的。
24.一种试剂产品，其特征在于，包括：
(i)第一试剂，所述的第一试剂为ABE基因编辑促进剂，所述基因编辑促进剂是ALK5/SMAD2/3通路抑制剂；和
(ii)第二试剂，所述的第二试剂是进行ABE基因编辑的试剂且所述试剂为腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，
其中,所述的ALK5/SMAD2/3通路抑制剂选自下组：SB505124、SB431542、RepSox、ITD1、SD208、LY3200822、或其组合。
25.一种试剂盒，其特征在于，包括：
(i) 第一容器，以及位于所述第一容器的第一试剂，所述的第一试剂为ABE基因编辑促进剂，所述基因编辑促进剂是ALK5/SMAD2/3通路抑制剂；和
(ii) 第二容器，以及位于所述第二容器内的第二试剂，所述的第二试剂是进行ABE基因编辑的试剂且所述试剂为腺嘌呤碱基编辑器(ABE)；
其中，所述的ALK5/SMAD2/3通路抑制剂选自下组：SB505124、SB431542、RepSox、ITD1、SD208、LY3200822、或其组合。
26.一个提高基因编辑效率的反应组合物，其特征在于，包括：
(i) 一个待编辑的DNA靶序列；
(ii) 腺嘌呤碱基编辑器(ABE)；
(iii) ABE基因编辑促进剂，所述基因编辑促进剂是ALK5/SMAD2/3通路抑制剂；和
(iv) gRNA、crRNA、或用于产生所述gRNA或crRNA的载体，
其中，所述的ALK5/SMAD2/3通路抑制剂选自下组：SB505124、SB431542、RepSox、ITD1、SD208、LY3200822、或其组合。
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