WO2020173150A1

WO2020173150A1 - 单碱基编辑导致非靶向单核苷酸变异及避免该变异的高特异性无脱靶单碱基基因编辑工具

Info

Publication number: WO2020173150A1
Application number: PCT/CN2019/119842
Authority: WO
Inventors: 杨辉; 左二伟
Original assignee: 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心
Priority date: 2019-02-28
Filing date: 2019-11-21
Publication date: 2020-09-03
Also published as: EP3940078A1; CN110804628A; JP2022522019A; CN110804628B; US20220136041A1; EP3940078A4

Abstract

提供了一种降低单碱基编辑器的脱靶效应的方法和一种分析基因编辑工具或基因编辑操作的靶向效应的方法(GOTI)。

Description

单碱基编辑导致非靶向单核苷酸变异及避免该变异的

髙特异性无脱靶单碱基基因编辑工具技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，更具体地，本发明涉及单碱基编辑导致非靶向单核苷酸变异的现象，本发明还涉及用于避免该变异的高特异性无脱靶单碱基基因编辑工具。背景技术

基因组编辑技术自问世以来受到人们的高度重视。 CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称， Cas是 CRISPR相关蛋白的简称。 CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的，是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。在 CRISPR/Cas9系统中，酶 Cas9在 DNA靶位点上进行切割。 Cas9与 sgRNA一起被称作 Cas9-sgRNA系统。 CRISPR/Cas9技术已被应用于疾病模型建立、药物靶点筛选、并正在成为新一代基因治疗手段。

但是， CRISPR/Cas9和 base editors介导的基因编辑方法已经开发出来，并为治疗致病性突变引起的遗传疾病带来了很大的希望。基于 CRISPR/Cas9基因编辑或者碱基编辑的临床应用需要综合性分析脱靶效应，减少有害突变的风险。尽管本领域中开发了多种方法来检测全基因组的基因编辑细胞的离靶活性，包括高通量全基因组易位测序 (HTGTS )，全基因组，双链断裂的无偏差识别 (GUIDE- seq)和通过循环测序在体外报告切割效率 (CIRCLE-seq)。然而，这些方法都不能有效地检测单核苷酸变异 (SNV)。至今本领域还没有一种有效的方法来检测 SNV。

并且， CRISPR/Cas9在应用时，缺陷在于同源介导修复的低编辑效率。本领域人员利用 16个碱基长的 XTEN接头 (XTEN linker)将胞苷脱氨酶 APOBEC 1与 dCas9连接在一起，从而构建出第一代碱基编辑器 (BE1)。为了增加体内编辑效率，第二代碱基编辑器 (BE2)系统除了将胞苷脱氨酶与 dCas9连接在一起之外，还将碱基切除修复抑制剂 UGI与 dCas9融合在一起，从而将编辑效率提高三倍，最高达到 20%左右。

为了将碱基编辑效率提高，本领域人员将 dCas9换为 Cas9n来模拟错配修复，从而构建出第三代碱基编辑器 (BE3)。 BE3在非互补 DNA链上产生切口，细胞使用含尿嘧啶 (U)的 DNA链作为模板来进行修复，从而复制这种碱基编辑。在人细胞系的多种革巴基因中，这种 BE3 系统使得碱基编辑效率发生显著性地提高，它的平均 indel(insertion-deletion)发生率仅为 1.1 %。对这些测试的革 E基因而言，这些数字是对 Cas9介导的 HDR的巨大改进；平均的 HDR介导的编辑频率仅为 0.5%，并且相比于之前的单碱基编辑，更多的 indel被观察到。在多次细胞分裂中， CRISPR碱基编辑持续存在，说明这种方法产生稳定的碱基编辑。但是，这种 BE3 系统也会遭受脱靶编辑的影响。

基因组编辑具有治疗由致病突变诱导的遗传疾病的巨大潜力，对基因编辑的脱靶效应进行综合分析对其实用性是非常必需的。同时，本领域还需要进一步地找到解决脱靶问题的手段。发明内容

本发明的目的在于研究单碱基编辑导致非靶向单核苷酸变异的现象，以及提供一种高特异性无脱靶单碱基基因编辑工具。

在本发明的第一方面，提供一种降低单碱基编辑器的脱靶效应的方法，包括：在单碱基编辑器系统中，对其中的胞嗦聢脱氨酶（cytidine deaminase enzyme（s））进行改造，弱化其与 DNA的结合能力。

在一个优选例中，所述的改造是针对胞嘧啶脱氨酶的 DNA结合区域的改造；较佳地，所述的 DNA结合区域为其与 DNA（如 ssDNA）结合的结构域。

在另一优选例中，所述的改造包括但不限于：基因突变，靶向性封闭或阻滞（如以结合蛋白或抗体进行封闭或阻滞，或以竞争性结合分子进行封闭或阻滞），干扰。

在另一优选例中，所述的单碱基编辑器系统为 BE3基因编辑器系统。

在另一优选例中，所述的 DNA为单链 DNA（ssDNA）或双链 DNA（dsDNA）。在另一优选例中，所述的胞嘧啶脱氨酶包括但不限于选自下组的酶： AID （如：人 AID）， APOBEC3G（如：人 APOBEC3G）， APOBEC 1， APOBECA3A， CDA1（如： lamprey CDA1）₀

在另一优选例中，所述弱化为显著性的弱化，例如该弱化使得胞嘧啶脱氨酶与 DNA（较佳地为 ssDNA）的结合能力降低 10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或以上，或降低 100%。

在另一优选例中，所述的胞嘧啶脱氨酶为 APOBEC 1 ; 较佳地，所述的改造为对该酶的第 126位的氨基酸进行改造；更佳地，所述的改造为将其第 126位的 R突变为

E o

在另一优选例中，所述的改造还包括：对 APOBEC 1酶的第 132位的氨基酸进行改造；较佳地，所述的改造为将其第 132位突变为 E。

在另一优选例中，所述的改造还包括：对 APOBEC 1酶的第 90位的氨基酸进行改造；较佳地，所述的改造为将其第 90位突变为 Y。

在另一优选例中，所述的改造还包括：对 APOBEC 1酶的第 90位的氨基酸进行改造；较佳地，所述的改造为将其第 90位突变为 F。

在另一优选例中，所述的改造还包括：对 APOBEC 1 酶第 90位氨基酸和第 126 位氨基酸改造 W90Y合并 R126E。

在另一优选例中，所述的改造还包括：对 APOBEC 1 酶第 90位氨基酸和第 126 位氨基酸改造 W90F合并 R126E。

在另一优选例中，所述的胞嘧啶脱氨酶为 AP0BECA3A，所述的改造为对该酶的第 130位的氨基酸进行改造；较佳地，所述的改造为将其第 130位的 Y突变为 F。

在本发明的另一方面，提供一种胞嘧啶脱氨酶的突变体，其 DNA结合区域发生改造，该改造使得其与 DNA的结合被弱化，所述的 DNA如单链 DNA。

在一个优选例中，所述的胞嘧啶脱氨酶包括但不限于选自下组的酶： AID， APOBEC3G， APOBEC 1， APOBECA3A， CDA1。

在另一优选例中，所述的酶为 APOBEC 1 ; 较佳地，所述改造发生在该结构域的第 126位上或其邻近的位置上；更佳地，所述的改造为将其第 126位的 R突变为 E。

在另一优选例中，所述的酶为 APOBEC 1 ; 较佳地，所述改造发生在该结构域的第 132位上或其邻近的位置上；更佳地，所述的改造为将其第 132位的 R突变为 E。

在另一优选例中，所述的改造还发生在 APOBEC 1酶的第 90位氨基酸上；较佳地，所述的改造为将其第 90位突变为 Y。

在另一优选例中，所述的酶为 APOBECA3A，所述改造发生在该酶的第 130位的氨基酸上或其邻近的位置上；较佳地，所述的改造为将其第 130位的 Y突变为 F。

在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述的突变体。在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种单碱基编辑器，其包含所述的胞嘧啶脱氨酶的突变体；较佳地所述的编辑器为 BE3单碱基编辑器。

在本发明的另一方面，提供一种生产所述的胞嘧啶脱氨酶的突变体的方法，包括步骤：（1）培养所述的宿主细胞，获得培养物；和（2）从培养物中分离所述的胞嘧啶脱氨酶突变体。

在本发明的另一方面，提供所述的胞嘧啶脱氨酶突变体的用途，用于参与基于单碱基编辑器系统的基因编辑，以降低基因编辑器的脱靶效应。

在一个优选例中，所述的胞嘧啶脱氨酶突变体的用途可以是非治疗性的用途。在本发明的另一方面，提供一种筛选对于降低单碱基编辑器的脱靶效应有用的物质的方法，包括：（1）用候选物质处理胞嘧啶脱氨酶或其 DNA结合结构域以及 DNA（如 ssDNA）相互作用（结合）的体系；和（2）检测所述体系中胞嘧啶脱氨酶 DNA结合结构域与 DNA 相互作用情况；其中，若所述候选物质抑制、阻滞或下调胞嘧啶脱氨酶或其 DNA结合结构域与 DNA的相互作用，则表明该候选物质是对于降低基因编辑器的脱革巴效应有用的物质。

在一个优选例中，所述的候选物质包括（但不限于）：小分子化合物，针对胞嘧啶脱氨酶或其 DNA结合结构域或其编码核酸设计的结合分子（如抗体或配体）、阻滞分子（如基于氨基酸修饰的阻滞剂）、干扰分子、基因编辑试剂、核酸抑制物；和 /或在另一优选例中，所述的体系包括（但不限于）：细胞体系（如表达胞嘧啶脱氨酶或其 DNA结合结构域以及含有 DNA（如 ssDNA）的细胞）（或细胞培养物体系）、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

在本发明的另一方面，提供一种分析单碱基基因编辑工具的靶向效应的方法（GOTI），述方法包括：（1）获取 n -细胞阶段的胚胎，在其中 1〜 n- 1个细胞中进行基因编辑操作；保留至少一或几个细胞则不进行基因编辑操作；其中所述 n为 2〜 10的正整数；（2）在胚胎发育的下游阶段，观测发生基因编辑的情况。

在一个优选例中，步骤（1）中，所述的 n为 2〜 8， 2〜 6或 2〜 4的正整数；较佳地，所述 n为 2。

在另一优选例中，所述的方法为体外培育方法或体内培育方法。

另一优选例中，在发育的卵裂期，可以将同一个胚胎中基因编辑的卵裂球和没有编辑的卵裂球拆开，然后移植到受体（如小鼠）体内，可以分别发育成成体。

在另一优选例中，步骤（2）中，所述胚胎发育的下游阶段为胚胎发育到原肠胚阶段至出生前阶段，或在体内状态下为胚胎植入子宫至出生前的阶段。

在另一优选例中，所述的胚胎为小鼠的胚胎，所述胚胎发育的下游阶段为胚胎发育的第 8〜 20天（E8-E20阶段），较佳地为胚胎发育的第 9.5~ 18.5 ^（E9.5-E 18.5阶段），更佳地为胚胎发育的第 12〜 16（E 1 1-E16阶段，如 E 14.5）。

在另一优选例中，所述的基因编辑操作包括（但不限于）： CRISPR 介导的基因编辑， Base Editor（碱基编辑器）介导的基因编辑， Cre/loxP 介导的基因编辑，腺嘌呤碱基编辑器介导的基因编辑。

在另一优选例中，所述的 CRISPR介导的基因编辑包括（但不限于）： CRISPR/Cas9 介导的基因编辑， CRISPR/Cas9n介导的基因编辑， CRISPR/Cas l3（如 CRISPR/Cas l3a， CRISPR/Cas l3d）介导的基因编辑， CRISPR/CasRx介导的基因编辑。

在另一优选例中，所述的 Base Editor包括： BE 1， BE2， BE3， BE4， BE4-Max。在另一优选例中，所述的腺嘌呤碱基编辑器包括： ABE7.10， ABE 6.3， ABE 7.8 , ABE 7.9， Prime Editing _o

在一个优选例中，步骤（1）中，包括：将用于切割核酸（如 DNA）靶位点的酶的（如 Cas mRNA， Cre mRNA），以及相应导向序列（如 sgRNA）引入到所述的其中一个细胞中，进行基因编辑。

在另一优选例中，所述的用于切割核酸（如 DNA）靶位点的酶选自但不限于下组的酶： Cas9， Cas9n， Cas l3a， CasRx， BE 1， BE2， BE3， BE4， BE4-Max， ABE7.10， ABE 6.3， ABE 7.8， ABE 7.9， Prime Editing _o

在另一优选例中，步骤（i）中，采用可检测标记物来标记所述的基因编辑操作，在其中 1〜 n- l个细胞中进行基因编辑操作并设置可检测标记物。在另一优选例中，所述的可检测标记物包括但不限于：染色标记物、荧光信号分子、报告基因；更佳地，所述的可检测标记物为（但不限于） tdTomato， EGFP， mCherry， GFP， dsred _o

在另一优选例中，步骤（2）中，所述观测发生基因编辑的情况包括：

分选发生基因编辑的细胞（如 tdTomato 阳性细胞）以及未发生基因编辑的细胞（如 tdTomato阴性细胞）；

另一优选例中，在发育的卵裂期，可以将同一个胚胎中基因编辑的卵裂球和没有编辑的卵裂球拆开，然后移植到受体（如小鼠）体内，可以分别发育成成体，不使用流式细胞术分选。

进行测序分析（如 WGS分析）；

利用单核苷酸变异（SNV）分析工具和 /或 indel分析工具进行分析；

比较发生编辑的细胞和未发生编辑的细胞来鉴定靶向效应或脱靶效应，包括检测

SNV和 indel _o

在另一优选例中，所述的 SNV分析工具包括但不限于： Mutect2 , Lofreq和 Strelka 或其组合；或，所述的 indel分析工具包括但不限于： Mutect2， Scalpel， Strelka或其组合。

在另一优选例中，采用流式细胞术进行发生基因编辑的细胞（如 tdTomato阳性细胞）以及未发生基因编辑的细胞（如 tdTomato阴性细胞）的分选。

在另一优选例中，所述的分析单碱基基因编辑工具的靶向效应的方法（G0TI）可以为非治疗性的方法。

在另一优选例中，所述的分析单碱基基因编辑工具的靶向效应的方法可以为离体的方法。

在另一优选例中，所述的胚胎来自于哺乳动物，包括但不限于非人哺乳动物，如鼠、兔、羊、牛、猴等。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明

图 1、在一个 2-cell阶段胚胎的一个卵裂球中注射 CRISPR-Cas9，BE3或 ABE7.10 介导的基因编辑。（A）实验设计：将 Cre， Cas9/BE3和 sgRNA混合物注射入 2细胞胚胎中的一个卵裂球，胚胎来自 Ai9雄鼠与野生型雌鼠交配而来。 Cre的作用是有望产生一个嵌合胚胎，其中一半的细胞标记为 tdTomato（红色）。流式细胞仪将 E14.5嵌合体胚胎中分离 tdTomato+和 tdTomato-细胞并用于全基因组测序。通过比较 tdTomato+细胞和 tdTomato-细胞，使用三种不同的调用算法来识别脱靶的 SNV和 indel（SNV使用 Mutect2、 Lofreq和 Strelka， indel使用 Mutect2、 Scalpel和 Strelka）。 SNV和 indel标记为彩点和叉。（B）指定胚胎中的 FACS分析。（C）基于 WGS的 tdTomato +和 tdTomato-细胞的革巴向效率。在 tdTomato +细胞中 Cas9， BE3和 ABE7.10的靶向效率为 66%+/-12%插入或者缺失（SEM， n = 5）， 83%+/- 10%（SEM, n = 4）和 47%+分别为〜 18%（SEM， n = 2）单碱基编辑。（D）Cas9-Tyr-A、 Cas9-Tyr-B、 BE3-Tyr-C、 BE3-Tyr-D处理 E14.5胚胎的流式细胞仪分析；未注射胚胎的流式细胞分析如图 S ib 所示。（E）基于全基因组测序 tdTomato+ 细胞（左）和 tdTomato-细胞（右）的革巴向效率；同样处理的细胞用同样的颜色表示。（F）Cas9-Tyr-A、 Cas9-Tyr-B、 BE3-Tyr-C、 BE3-Tyr-D处理的 E14.5胚胎， TA克隆测序 On-target分析；每一列上的数字代表分析克隆的总数。

图 2、在 BE3 处理的小鼠胚胎中产生的大量脱靶 SNV _o （A）检测到的脱靶 SNV 的总数的比较。 Cre-， Cas9-， BE3 -和 ABE7.10 处理的胚胎的 SNV 数量为 14 +/- 12（SEM， n=2）， 12 +/- 4（SEM， n = 1 1）, 283 + /分别为 -32（SEM， n = 6）和 10 +/- 5 SNV（SEM， n = 4）。（B）突变类型的分布。每个细胞中的数字表示所有突变中某种突变的比例。（C）C> T和 G的比例 > Cre， Cas9和 BE3的 A突变，以及 ABE7.10的 T> C 和 A> G突变。分析了两个 Cre， 1 1个 Cas9,6个 BE3和 4个 ABE7.10样品。 A）和（B）中的 P值通过 two-sided Wilcoxon。

图 3、 BE3诱导的脱靶 SNV的特征。（A）与随机排列相比，脱靶基因 SNV在基因组的转录区域中富集。（B）含有脱靶 SNV的基因表达显著高于 4细胞胚胎中的随机模拟基因。（C）从每个胚胎中鉴定的 SNV是非重叠的。（D）由 GOTI检测到的 SNV与 Cas-OFFinder和 CRISPOR预测的脱靶之间的重叠。（A）和（B）中的 P值通过 two-sided

Wilcoxon _o

图 4、BE3脱靶评估所构建的 BE2系统。（a）质粒图谱。（b）来自 WGS数据的 R126E 突变 BE3的靶向效率。（c）检测到的脱靶 SNV的总数的比较。

图 5、 Apobecl 点突变可以消除 BE3 的 DNA和 RNA脱靶。（a） BE3 体系中的 APOBEC1；（b） BE3用量（BE3显微注射浓度）与靶向效率的关联性； ⑹测序确认靶向效率；（d）比较不同的突变体脱靶情况。显示 BE3^R126E， BE3^r126e+W9QYDNA脱靶明显降低；（e）突变体与脱靶效应的关联性分析。

图 6、不同混合处理的 E14.5胚胎流式细胞仪分析。（a）Cas9-Tyr-A基因靶向胚胎的代表图。上部：四细胞胚胎，下部：一个分散的 8细胞胚胎。红色箭头表示 tdTomato+ 卵裂球。比例尺： 100pm。（b）从左到右，从上到下一次排列：未注射， Cre-#1, Cre-#2, Cre+Cas9-#1， Cre+Cas9-#2， Cre+Cas9+LacZ-#l， Cre+Cas9+LacZ-#2, Cre+Cas9+Pde6b-#1 和 Cre+Cas9+Pde6b-#2。（c）靶向 Tyr基因的 8细胞胚胎的基因型。从 4个 Cas9-Tyr-A和 4个 Cas9-Tyr-B基因革巴向的囊胚中分离到单个 tdTomato+和 tdTomato-细胞。数字：囊胚分析总数。 WT：野生型等位基因。 Mutant： Tyr等位基因突变。

图 7、利用 DNA体外切割法测定 sgRNAs的切割效率。琼脂糖凝胶电泳从左到右分别表示 Cas9-Tyr-A， Cas9-Tyr-B， Cas9-LacZ和 Cas9-Pde6b。对每个基因的 sgRNA靶位点两侧的基因组区域或结构进行 PCR扩增， PCR产物与 Cas9核糖核蛋白及 sgRNA 孵育 3h。

图 8、 CRISPR/Cas9和 BE3处理的嵌合胚胎的发育和基因型。 ⑻注射不同 mix后 tdTomato+囊胚的百分比。数字：囊胚或胚胎总数。 ⑻注射不同 mix后 E14.5胚胎存活率。数字：胚胎计算总数或转移总数。（_C）tdTomato+囊胚百分比及 E14.5胚胎中 Tyr突变百分比。数字：囊胚或胚胎分析总数。

图 9、 tdTomato+和 tdTomato-细胞全基因组测序得到的 On-target序列。 WT和突变序列的全基因测序结果显示为 WT和 MUT，斜杠前的数字表示 WT或突变序列，总数在斜杠后显示。突变序列以下划线突出显示，末三位 TGG、 CGG、 GGG为 PAM。

图 10、使用指定的软件工具，在每个胚胎中， WGS数据中检测到 SNV的韦恩图。 ⑻在 Cre或 CRISPR/Cas9处理的样本中检测到的 SNV。（b）在 BE3处理的胚胎中鉴定的 SNV。从接下来的分析中去除等位基因频率小于 10%的重复 SNV。

图 11、代表性的 Sanger测序峰图显示全基因组测序在 Cre或 CRISPR/Cas9处理胚胎中检测突变的情况。（a）对所示样品进行 PCR扩增，并进行 Sanger测序。绿色箭头：野生型；红色箭头：插入核苷酸。红点线，缺失核苷酸。（b）通过 Sanger测序对所示样品的 SNV进行了验证。绿色箭头：野生型核苷酸；红色箭头：突变核苷酸。引物见表 S 16。图 12、 Cre和 CRISPR/Cas9处理的胚胎中，从 WGS数据中检测到的 SNV数量。同一组胚胎用同样的颜色表示。右边柱图模拟-自发突变数量的分布。

图 13、从 Cre和 CRISPR/Cas9处理的胚胎中鉴定出的脱靶 SNV和 indel。（a）注射 Cre或 CRISPR/Cas9的每一个胚胎中所鉴定出的 snv是相互排斥的。（b）从 CRISPR/ cas9 处理的胚胎中检测到的 SNV与 Cas-OFFinder和 CRISPOR预测的靶外位点的重合。（c）前 10位预测的 Cas9-Tyr-A和 Cas9-Tyr-B Off-target序列比对，以及从 WGS数据中检测到的 Cas9-Tyr-A和 Cas9-Tyr-B突变。

图 14、通过比较来自相同胚胎的 tdTomato-和 tdTomato+细胞，总结从 WGS数据反向调用的变异。 ⑻从 Cre-和 CRISPR/Cas9处理的样本中调用相反的变量。（b）从 BE3处理的样本中调用相反结果。

图 15、在此研究中鉴定的每一个胚胎的突变类型。每个小格的数量表示某种突变类型的比例，颜色越深表示突变类型的比例越高。

图 16、从四组 Cistrome数据集比较有无识别的 off-target峰区。每个柱形图顶部的数字表示应用数据集的 GEO accession P值由 Wilcoxon rank sum test计算得出。具体实施方式

基因组编辑有望纠正致病突变。但是由于不同个体间的单核苷酸多态性，基因编辑的脱靶效应很难确定。为了研究此类脱靶效应，本发明人开发了一种通过二或多细胞（优选二细胞）胚胎注射进行全基因组脱靶分析的方法，命名为 GOTI。本发明的方法适用于 CRISPR介导的基因编辑， Base Editor介导的基因编辑， Cre/loxP介导的基因编辑，腺嘌呤碱基编辑器介导的基因编辑后的追踪分析，检测靶向效应 /效率。本发明提供了一种分析单碱基基因编辑工具的靶向效应的方法（GOTI），所述方法包括：（1）获取 n-细胞阶段的胚胎，在其中 1〜 n- 1个个细胞中进行基因编辑操作；其中所述 n为 2〜 10的正整数；（2）在胚胎发育的下游阶段，观测发生基因编辑的情况。在一些优选方式中，所述的 n为 2〜 8， 2〜 6或 2〜 4的正整数。在本发明的优选实施例中，所述 n较佳地为 2。

本发明的方法适用于在体外状态下的胚胎培养，例如试管中或其它胚胎培养容器中进行胚胎的培育。本发明的方法也适用于在体内状态下的胚胎培育，例如在体外进行如本发明的方法的处理后，将发育的细胞移植到体内，例如移植到动物的输卵管中，由胚胎自行游动到子宫中；或移植到动物的子宫中。

本发明的方法适用于在体外状态下的胚胎培养，例如试管中或其它胚胎培养容器中进行胚胎的培育。

本发明的方法适用于在体外状态下的胚胎培养，胚胎培养容器中进行胚胎的培育，建立胚胎干细胞系。

本发明的方法适用于在体外状态下的胚胎培养，胚胎培养容器中进行胚胎的培育，编辑后的卵裂球和没有编辑的卵裂球分别建立胚胎干细胞系。

本发明的方法适用于同一胚胎将编辑后卵裂球和没有编辑的链裂球拆开，形成两个胚胎分别移植到受体不同小鼠体内或者体外建立胚胎干细胞系。

本发明的方法适用于同一胚胎将编辑后卵裂球和没有编辑的卵裂球拆开，形成两个胚胎同时移植到受体同一小鼠体内或者体外建立胚胎干细胞系。

本发明的方法也适用于在体内状态下的胚胎培育，例如在体外进行如本发明的方法的处理后，将发育的细胞移植到体内，例如移植到动物的输卵管中，由胚胎自行游动到子宫中；或移植到动物的子宫中。

在本发明的优选方式中，所述胚胎发育的下游阶段为胚胎发育到原肠胚阶段至出生前阶段，或在体内状态下为胚胎植入子宫至出生前的阶段。本发明人发现，在胚胎发育的“适当时间”进行细胞的分选以及基因编辑效应的测定是较为理想的。一般地，所述的 “适当时间” 为胚胎生长至适于被酶分解为单细胞的阶段。例如，所述的 n- 细胞阶段的胚胎是小鼠的胚胎，那么所述胚胎发育的下游阶段为胚胎发育的第 8〜 20 天（E8-E20阶段），较佳地为胚胎发育的第 9.5〜 18.5天（E9.5-E18.5阶段），更佳地为胚胎发育的第 12〜 16（E1 1-E 16阶段，如 E 14.5）。

本发明的方法适用于多种单碱基基因编辑的方法中。在多种切割 DNA靶位点的酶参与的基因编辑中，均可采取本发明的方法。所述的切割 DNA靶位点的酶可以是本领域技术人员熟悉的多种参与此过程的酶，例如可以是但不限于下组的酶： Cas9 , Cas9n， Cas l3a， CasRx， BE 1， BE2， BE3， BE4， ABE7.10 , ABE 6.3 , ABE 7.8 , ABE 7.9， Prime Editing ₀ 在所述的 GOTI方法中，可以采用可检测标记物来标记所述的基因编辑操作，所述的可检测标记物包括但不限于：染色标记物、荧光信号分子、报告基因。本发明的实施例中，采用了 tdTomato，这是一种优选的方案，但是其它的标记物也可被应用于本发明中。作为本发明的优选方式，所述观测发生基因编辑的情况包括：分选发生基因编辑的细胞（如 tdTomato阳性细胞）以及未发生基因编辑的细胞（如 tdTomato阴性细胞）；进行测序分析（如 WGS分析）；利用 SNV分析工具和 /或 indel分析工具进行分析；比较发生编辑的细胞和未发生编辑的细胞来鉴定脱靶 SNV和 indel。应理解，测序工具以及分析工具并不限于上述以及本发明实施例中所列举的，其它的一些测序工具以及分析工具也可被应用于本发明中。可以应用本领域中已知的多种方法进行细胞分选，例如但不限于磁珠法、流式细胞术等。

本发明中，所述 “动物” 是指哺乳纲的动物，包含人、非人灵长类动物（猴、猩猩）、家畜与农畜（例如，猪、绵羊、牛），鼠（小鼠），以及啮齿动物（例如，小鼠、大鼠、兔）等。所述的动物是不包含人的动物；在有限的或特殊的情况下，所述的动物也可以是人，但这仅被应用于并非涉及 “人胚胎的商业应用” 的范畴内。

在本发明的具体实施例中，编辑与未编辑的卵裂球的子代细胞在 E14.5的全基因组序列的比较显示，在 CRISPR-Cas9 或腺嘌呤单碱基编辑的胚胎中，单核苷酸突变（SNV）脱靶是罕见的，频率接近于自发突变率。相比之下，胞嘧啶单碱基编辑诱导产生了超过 20倍的脱靶单核苷酸突变。

在临床应用前，哺乳细胞中要求没有全基因组脱靶，但是由于个体中核苷酸多态性，因此很难确定脱靶效应的程度。本发明开发的 GOTI （双细胞胚胎注射全基因组脱靶分析）的方法改变了这一现状，在不干扰 SNPs 的情况下检测脱靶突变，能准确有效地实现基因组靶向效应的分析。本发明人进一步研究了导致单碱基编辑发生脱靶效应（如单核苷酸脱靶变异）的原因。在观测到单碱基编辑工具 BE3会导致大量的单核苷酸脱靶变异（SNV）后，本发明人进行了大量的研究工作，最终确定这些脱靶变异是由 APOBEC 1 的过表达及其与 DNA（如 ssDNA）的结合引起的。在具体的实施例中，本发明揭示一种解决方案，通过在 APOBEC 1 上进行突变，如进行 R126E， R132E, W90F, W90Y W90F/R126E, W90Y/R126E突变，来解决 BE3诱导的脱靶效应。

根据上述，本发明中确定了一个对于降低单碱基编辑器的脱靶效应有用的方法，包括：在单碱基编辑器系统中，对其中的胞嘧啶脱氨酶进行改造，弱化其与 DNA（如 ssDNA）的结合。较佳地，所述的改造是针对胞嘧啶脱氨酶的 DNA结合区域的改造；更佳地，所述的 DNA结合区域为其与 DNA结合的结构域。所述的单碱基编辑器例如是 BE3基因编辑器。

只要能发挥弱化的作用，针对胞嘧啶脱氨酶的多种改造方法都是可用的。作为一些可选的方式，所述的改造可以是基因突变，靶向性封闭或阻滞（如以结合蛋白或抗体进行封闭或阻滞，或以竞争性结合分子进行封闭或阻滞），干扰等。

可应用于单碱基编辑器系统的多种胞嘧啶脱氨酶或与其同功能的酶都可被本发明的方法改造，以降低其所在的单碱基编辑器系统的脱靶效应。例如，所述的胞嘧啶脱氨酶包括但不限于选自下组的酶： AID （如：人 AID）， APOBEC3G （如：人 APOBEC3G）， APOBEC 1， CDA1（如： lamprey CDA1）。

本发明中，所述的 “弱化” 是指胞嘧啶脱氨酶与 DNA 的相互作用（结合）能力被下调或消除。例如该弱化使得胞嘧啶脱氨酶与 DNA的结合能力降低 10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或以上，或降低 100%。

作为本发明的优选方式，提供了一种具体的胞嘧啶脱氨酶 APOBEC 1（野生型序列见 SEQ ID NO: 1，其一种突变体见 SEQ ID NO: 4），对其 DNA结合区域的进行改造后，其所参与的单碱基编辑器系统的编辑结果发生了极为显著的变化，脱靶效应显著性降低。较佳地，这种改造为对该酶的第 126位的氨基酸进行改造；更佳地，所述的改造为将其第 126位的 R突变为 E。

在更为优选的方式中，针对 APOBEC 1 的改造还发生在 APOBEC 1酶的第 90位氨基酸上；较佳地，所述的改造为将其第 90位突变为 Y。

作为本发明的另一优选方式，提供了一种具体的胞嘧啶脱氨酶 APOBECA3A（SEQ ID NO: 37），针对 APOBECA3A的改造发生在该酶的第 130位的氨基酸上或其邻近的位置上；较佳地，所述的改造为将其（SEQ ID NO: 37）第 130位的 Y 突变为 F。根据本发明人的新发现，进一步还提供一种筛选对于降低 BE3 基因编辑器的脱革巴效应有用的物质的方法，包括：（1）用候选物质处理胞嘧啶脱氨酶或其 DNA结合结构域以及 DNA相互作用（结合）的体系；和（2）检测所述体系中胞嘧啶脱氨酶 DNA结合结构域与 DNA相互作用情况；其中，若所述候选物质抑制、阻滞或下调胞嘧啶脱氨酶或其 DNA结合结构域与 DNA的相互作用，则表明该候选物质是对于降低 BE3基因编辑器的脱靶效应有用的物质。

在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到胞嘧啶脱氨酶或其 DNA结合结构域以及 DNA相互作用（结合）的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的胞嘧啶脱氨酶或其 DNA结合结构域以及 DNA相互作用（结合）的体系。作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和 /或动物试验，以进一步选择和确定对于调节两者的相互作用 (结合)真正有用的物质。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社， 2002 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。材料和方法

1、包含 GOTI方法的实验设计

分别将 Cre， Cas9/BE3/ABE7.10的 mRNA和 sgRNA的混合物注射到 2细胞阶段胚胎的一个卵裂球中，该胚胎来自于野生型雌性小鼠 X Ai9雄性小鼠。 Cre的作用产生嵌合胚胎，其中注射的细胞被 tdTomato(红色)标记， tdTomato阳性表示发生了编辑， tdTomato阴性表示未编辑。通过 FACS在 E14.5从嵌合胚胎中分离 tdTomato阳性细胞和 tdTomato阴性细胞，并分别用于 WGS分析。通过使用三种算法 (用于 SNV分析的 Mutect2， Lofreq和 Strelka，以及用于 indel分析的 Mutect2， Scalpel和 Strelka)比较 tdTomato+细胞和 tdTomato-细胞来鉴定脱靶 SNV和 indel。 SNV和插入缺失在图 1A中表示为有色点和交叉。 Cre 蛋白序列如 SEQ ID NO: 2所示， Cas9蛋白序列 SEQ ID NO: 3所示。

2、动物及护理

雌性 C57BL/6 小鼠 (4 周龄 )和杂合子 Ai9(B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9 (CAG-td-Tomato)Hze/J； JAX strain 007909)雄性小鼠用于胚胎收集。 ICR雌性小鼠作为受体。动物的使用和护理符合中国科学院上海生命科学研究院生物医学研究伦理委员会的指导原则。

3、 Cas9 mRNA， BE3 mRNA， ABE7.10 mRNA, Cre mRNA和 sgRNA

使用引物 Cas9F和 R从 px260质粒扩增出 Cas9蛋白编码区域。纯化 T7-Cas9 PCR 产物，并且使用 mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA转录 mRNA。从 px330质粒扩增出 T7-sgRNA PCR, 并使用 MEGA Shortcript T7试剂盒 (Life Technologies)将其体外转录成 RNA。通过 PCR扩增将 T7启动子添加至 Cre模板，纯化 T7-Cre PCR产物，并使用 mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA试剂盒 (Life Technologies)将其体外转录成 mRNA。使用 MEGA clear kit (Life Technologies) 纯化 Cas9 mRNA， Cre mRNA和 sgRNA，并在无 RNase的水中洗脱。

sgRNA序列 (序列编号从上到下依次为： SEQ ID NO: 5- 1 1) Lociis; Sequence (5’-3’)

4、 2 -细胞注射，胚胎培养和胚胎移植

将超排 C57BL/6 雌性 (4 周龄 ) 与杂合的 Ai9 B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-td-Tomato)Hze/J； JAX strain 007909)雄性交配， hCG 注射后 23小时，从输卵管受精卵。对于 2-cell 编辑， Cas9 mRNA(50 ng/jj 1)， BE3 mRNA(50 ng/jj 1)或 ABE7.10 mRNA(50 ng /jj 1)， sgRNA(50 ng/jj 1)和 Cre mRNA(2 ng/ |J 1)的混合物，使用具有恒定流量的 FemtoJet显微注射器 (Eppendorf)，在 hCG注射后 48小时，在含有 5jJ g/ ml细胞松弛素 B(CB)的 HEPES-CZB培养基的液滴中将 RNA 混合物注射到 2-cell 胚胎的一个卵裂球的细胞质中。注射后的胚胎在含有氨基酸的 KSOM培养基中于 37 ^°C， 5%C02的空气中培养 2小时，然后移植到假孕 ICR雌性的输卵管中。

5、单细胞 PCR分析

解剖显微镜下使用自制玻璃毛细管，用 acid Tyrode solution溶液消化 8-cell阶段小鼠胚胎去除透明带，然后将胚转移到 0.25%胰蛋白酶中并轻轻移液以分离单个卵裂球。最后，将卵裂球 KSOM中洗涤中 7至 10次，并转移到 PCR管中。然后将含有 0.1 %吐温 20， 0.1 % Triton X- 100和 4jJ g/ ml蛋白酶 K的 1.5jJ 1裂解缓冲液移液到管中。将每个管离心以促进混合。将裂解液在 56 ^°C的温度下孵育 30 分钟，然后在 95 ^°C下孵育 5分钟。裂解程序的产物用作巢式 PCR分析中的模板。所有操作中避免污染样品。

Nest PCR引物 (序列编号从上到下依次为： SEQ ID NO: 27-30)

Outer F: GTTATCCTCACACTACTTCTG

O咖: R: GTAATCCX4 CAAGAGTCTCA

Tvr - iniiei F: TCCTCACACTACTTCTGAFG

Inner S.: GTCTC AAGATGGAAGATCAC 6、 T载体克隆和基因型检测

纯化 PCR产物并连接到 pMD 18-T载体上并转化到感受态大肠杆菌菌株 DH5a 中。在 37 ^°C过夜培养后，通过 Sanger方法对随机选择的克隆进行测序。通过从细胞中提取的基因组 DNA的 PCR确定突变体 E14.5胚胎的基因型。 ExTaq在 95 ^°C下活化 3分钟； PCR进行 34个循环： 95 ^°C下 30秒， 62 ^°C下 30秒， 72 ^°C下 1分钟；最终在 72 ^°C下延伸 5分钟。对于胚胎，用 KSOM洗涤 6次后，将单个胚胎直接转移到含有

1.5M 1胚胎裂解缓冲液 (0.1 %吐温 20,0.1 %Triton X- 100和 4jJ g/ ml蛋白酶 K)的 PCR 管中并孵育 30分钟。在 56 ^°C时， 95 ^°C下灭活 10分钟。使用巢引物组进行 PCR扩增。

ExTaq在 95 ^°C下活化 3分钟； PCR进行 34个循环： 95 ^°C下 30秒， 62 ^°C下 30秒， 72 ^°(：下 1分钟；最终在 72 ^°C下延伸 5分钟。使用 0.5jJ g第一轮 PCR产物和内侧引物进行二次 PCR。 PCR在相同的反应混合物中进行。使用 pMD- 19t克隆试剂盒 (Takara) 按照制造商的说明凝胶纯化和克隆 PCR 产物。从每次转化中挑选菌落，然后进行 Sanger测序以检测突变。

引物序列 (序列编号从上到下依次为： SEQ ID NO: 31-36)

Name Sequence (5 "-3 )

Tyr F GTTATCCTCACACTACTTCTG

Tyr R GTAATCCTACCAAGAGTCTCA

Tyr-OF GTCTGTGACACTCATTAACC

Tyr-OR CAIAGGAGGTGCTAACAATAC

Tyr-IF GTATTGCCTTCTGTGGAGTT

Tyr-IR TGAACCAATCAGTCCTTGTT

7、流式分选 (FACS)

为了分离细胞，将剪碎的组织在 5mL胰蛋白酶 -EDTA(0.05%)的溶液中在 37 ^°C下酶解 30分钟。通过加入 5ml含 10%胎牛血清 (FBS)的 DMEM培养基终止消化。然后使用 lml 枪头反复吹打 30-40 次使胎儿组织均质化。将细胞悬浮液离心 6 分钟 (800rpm) , 将沉淀重悬于含 10%FBS 的 DMEM培养基中。最后，将细胞悬浮液通过 40-|J m细胞过滤器过滤，并通过 FACS分离 tdtomato + / tdtomato-细胞。使用第二轮流式细胞术和荧光显微镜分析评估，样品纯度＞ 95%判定合格。

8、全基因组测序和数据分析

根据制造商的说明，使用 DNeasy血液和组织试剂盒 (目录号 69504， Qiagen)从细胞中提取基因组 DNA。通过 Illumina HiSeq X Ten以 50倍的平均覆盖率进行 WGS。 BWA(v0.7.12)用于将合格的测序读数映射到参考基因组 (mmlO)。然后应用 Picard 工具 (V2.3.0)对映射的 BAM文件的重复项进行排序和标记。为了高可信度地鉴定全基因组从头变异，本发明人分别使用三种算法 Mutect2(v3.5)， Lofreq(v2.1.2)和 Strelka(v2.7.1)进行单核苷酸变异 (25-27)分析。同时，分别运行 Mutect2(v3.5) , Scalpel(v0.5.3)和 Strelka(v2.7.1)用于检测全基因组序列。三种 SNV或 indel算法的重叠被认为是真正的变体。在 tdTomato+样品的定位 BAM 文件中鉴定变体，其中 tdTomato-样品在与对照相同的胚胎中，仅可鉴定 tdTomato+样品中突变的变体。例如，如果 WT等位基因在某个坐标中是 G，则 tdTomato+细胞携带 A，并且 tdTomato-细胞携带 G，然后突变体 A将被称为从头突变。然而，如果 tdTomato-细胞携带 A，则无法鉴定突变体。为了进一步验证脱革 G SNV仅在 tdTomato+样品中鉴定，本发明人还称 tdTomato-样品中的变体与同一胚胎中的 tdTomato+样品作为对照，其中只有变体在 tdTomato-细胞中突变但是在 WT中可以识别 tdTomato+细胞。

WGS分析显示 Cas9-Tyr-A和 Cas9-Tyr-B组的 tdTomato-细胞中的低水平靶向编辑范围为 0-6.3%，这可能是由假阴性 FACS分选引起的 (已知发生在低水平)。因此，本发明人只考虑等位基因频率超过 10%的变体在后续分析中是可靠的。本发明人还标记了与 UCSC重复区域和微卫星序列重叠的变体，或存在于 dbSNP(v l38)和 MGP(v3) 数据库中。所有测序数据都保存在 NCBI (SRA)。

为了验证目标效率，本发明人将 BAM文件与 e-value设置为 0.⑻ 01的 on-target 进行了对比。利用已有的两种算法对 on-target的潜在 off-target进行预测 (Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/)和 CRISPOR (http://crispor.tefor.net/) )。

使用 RefSeq数据库用 annovar (version 2016-02-01)注释 SNV和 indel。原癌基因和抑癌基因从 UniprotKB/Swiss-Prot数据库中检索 ( 2018-09 )。本发明人从 CistromeDB 数据库下载了 5个 ATAC-seq文件，生物来源为胚胎并通过所有质量控制。检索到的五个数据集包括 CistromeDB IDs “79877” (GSM2551659)， “79976” (GSM2551677)， “80493” (GSM2535470)， “81049” (GSM2551664) 和 “81052” (GSM2551667)。基于染色体位置将脱靶位点定位到每个文件中的峰值区域，然后通过双侧 Wilcoxon秩和检验将具有或不具有脱靶的峰区域相互比较。

9、模拟胚胎发育过程中的自发突变为了估计从 2细胞阶段到 E14.5阶段的自发突变的数量，考虑到 40的平均测序覆盖率和 10%的等位基因频率阈值，在计算机模拟中发现单核苷酸突变。对于每一轮模拟，鉴于 1.8 x KT¹⁽⁾的突变率和小鼠核基因组的大小 (2,785,490,220bp)，本发明人考虑了从 2细胞阶段到 16细胞阶段的复制过程，对于细胞 16阶段后发生的突变，考虑等位基因频率，不会检测到。在每次复制期间，每个细胞可以突变或不突变，并且一旦发生突变，分裂的细胞将继承突变。然后随机选择累积突变及其野生型等位基因进行测序，深度为 40, 将所选突变总计为每轮的自发突变数，并重复相同的过程 10,000 次。

10、 Digenome-seq分析

如前所述 (32)进行了多重 Digenome-seq，包括 Cas9-LacZ, Cas9-Pde6b, Cas9-Tyr-A 和 Cas9-Tyr-B。具体地，根据生产商说明书用 TIANamp Genomic DNA Kit(Tiangen) 从小鼠尾部纯化基因组 DNA。 PCR扩增每个基因的 sgRNA靶位点包括侧翼的基因组区域，并根据制造商的说明用 Universal DNA Purification Kit (Tiangen) 纯化 PCR扩增产物。将 Cas9蛋白 (l jJ g)和 sgRNA(l M g)在室温下预孵育 10分钟以形成 RNP复合物。将 DNA(4jJ g)与 RNP复合物在反应缓冲液中于 37 ^°C温育 3小时。随后加入 RNase A( 100iJ g/ ml)以除去 sgRNA后，再次用 Universal DNA纯化试剂盒 (Tiangen)纯化消化的 DNA。

使用 Illumina HiSeq X Ten测序仪对文库进行 WGS，并且在 30x至 40x的测序深度下进行 WGS。使用 Digenome-seq2 (https://github.com/chizksh/digenome-toolkit2) 计算鉴定 DNA切割位点。通过编辑距离用 R包“Biostrings”分类鉴定的体外切割位点并列出。

1 1、统计分析

本研究采用 R version 3.5.1 (http://www_R-proiect.org/)进行所有统计分析。所有检验均为双侧检验， P < 0.05为差异有统计学意义。实施例 1、三种基因编辑工具的评估

利用 G0TI的方法，用于评估三种常用的基因编辑工具， CRISPR-Cas9 , 胞嘧啶碱基编辑器 3(BE3， rAP0BECl-nCas9-UGI)和腺嘌呤碱基编辑器 7.10(ABE7.10 , TadA-TadA*-nCas9)诱导的脱靶效应 (参考文献 6-8)。

本发明人将 CRISPR-Cas9， BE3或 ABE7.10与 Cre mRNA再加上相应的 sgRNA 一起注射到来自 Ai9(CAG-LoxP-Stop-LoxP-tdTomato)小鼠的二细胞胚胎的一个卵裂球中 (参考文献 9- 10)(图 1A)，使用 CRISPR/Cas9或 BE3基因编辑，并结合 Cre mRNA 进行编辑。根据 tdTomato在基因编辑细胞中的表达情况，用荧光激活细胞分选法 (FACS) 将子细胞群中编辑与未编辑的细胞进行分选。 tdTomato+和 tdTomato-分别进行全基因组测序。利用流式细胞分选 (FACS)分离 E 14.5天的胚胎，根据细胞中 tdTomato进行分选，此时整个胚胎可以容易地被消化以获得足够的单细胞 (图 IB)。 Cas9-Tyr-A、 Cas9-Tyr-B、 BE3-Tyr-C、 BE3-Tyr-D处理 E14.5胚胎的流式细胞仪分析如图 ID ; 未注射胚胎的流式细胞分析如图 6b所示。 Cas9-Tyr-A、 Cas9-Tyr-B、 BE3-Tyr-C、 BE3-Tyr-D 处理的 E14.5胚胎， TA克隆测序 On-target分析如图 1E。本发明中基于全基因组测序 tdTomato+ 细胞 (左)和 tdTomato-细胞 (右)的靶向效率如图 IF。

本发明人进一步论证分别用 Cre和 Cas9/BE3系统处理的编辑细胞可以有效地与未编辑的细胞分离。在 Cre介导的重组过程中，约有 50%的胚胎细胞表达 tdTomato。荧光显微镜下观察 4细胞期或 8细胞期或流式细胞仪分析 E14.5天细胞验证了这一点，如图 6a-b _o 此外，本发明人还发现用 CRISPR/Cas9编辑毛色基因酪氨酸酶，方法是 2细胞胚胎中的一个卵裂球注射任意一个 sgRNAs(Cas9-Tyr-A, Cas9-Tyr-B) , 实现了高效的革巴向编辑。对 Tyr基因测序显示，从 4个分散的 8细胞胚胎中收集到 13个 (Cas9-Tyr-A)和 15 个 ( Cas9-Tyr-B)tdTomato+细胞， 85%和 80%细胞存在 Tyr等位基因突变。相反，收集到的 16个 (Cas9-Tyr-A)和 15个 (Cas9-Tyr-B)tdTomato-细胞没有 Tyr等位基因突变，如图

6c o

对分离的 tdTomato+和 tdTomato-细胞分别进行全基因组测序 (WGS)，并通过三种算法对 tdTomato+样本鉴定 SNV和 indel，同时将来自于同一个胚胎的 tdTomato-样品作为参照。

本发明人还验证了本方法在靶向 Tyr基因时的编辑效率。对胚胎注射的方法进行全基因组测序的探索，设计了四个 sgRNAs用于 CRISPR/Cas9编辑， Cas9-Tyr-A, Cas9-Tyr-B 革巴向 Tyr；一个对照 sgRNAs靶向在 C57小鼠基因组中没有切割位点的 LacZ；一个 sgRNA 革巴向 Pde6b，它与 C57小鼠基因组存在一个错配，且之前报道中可以产生大量的 SNV。通过 DNA切割实验，本发明人在体外验证了这些 sgRNAs的切割效率。结果如图 7，表明发生了有效的切割。

本发明人还通过 BE3介导，测试了两个靶向 Tyr基因的 sgRNAs。作为对照组，也包括三组胚胎注射 Cre only， Cre和 Cas9， Cre和 BE3。将 CRISPR/Cas9或 BE3， Cre mRNAs 和 sgRNAs的混合物注射入一个卵裂球中，发现胚胎发育没有受到损伤，如正常的囊胚率 (图 8a)和存活率 (图 8b)所示。 Sanger 测序显示，全部检测到的来自 Cas9-Tyr-A, Cas9-Tyr-B， BE3-Tyr-C和 BE3-Tyr-D的囊胚和 E14.5胎儿存在 Tyr突变 (图 8c)。为了验证靶向 Tyr基因的编辑效率，本发明人对 Cas9-Tyr-A或 Cas9-Tyr-B处理的 E14.5的胎儿进行 FACS分选，收集约 400k tdTomato+和 400k tdTomato-细胞，并进行 TA克隆测序。实验结果表明，用 Cas9-Tyr-A和 Cas9-Tyr-B编辑的 tdTomato+细胞存在 50%和 100%的等位基因突变。第二个重复实验中，用 Cas9-Tyr-A和 Cas9-Tyr-B编辑的 tdTomato+细胞存在 58%和 50%的等位基因突变 (31个和 14个克隆)。相反，从 E14.5天胚胎中收集的 tdTomato-细胞没有 Tyr等位基因突变。相似的， BE3存在很高的编辑效率，在 BE3-Tyr-C有 71%的等位基因突变以及在 BE3-Tyr-D有 100%的等位基因突变，而相应的 tdTomato-细胞仅有大约 3%Tyr突变。这些结果证明， CRISPR/Cas9和 BE3编辑在 tdTomato+产生高效的目标编辑效率，但是在 tdTomato-细胞中基本上没有目标编辑效率。

为了进一步探索编辑效率和潜在的全基因组脱靶效应，本发明人对来自 18个 E14.5 胚胎 9种处理的 36个样本进行平均深度为 47（47x）的全基因组测序： Cre only， Cre和 Cas9， Cre和 Cas9-LacZ， Cre和 Cas9-Pde6b， Cre和 Cas9-Tyr-A， Cre和 Cas9-Tyr-B， Cre和 BE3， Cre和 BE3-Tyr-C， Cre和 BE3-Tyr-D，其中只有 Cas9-Tyr-A， Cas9-Tyr-B， BE3-Tyr-C和 BE3-Tyr-D在 C57基因组中存再编辑位点。对 Cas9-Tyr-A, Cas9-Tyr-B进行 On-target分析显示，在 tdTomato+细胞中分别有 56%和 72%的 Tyr等位基因突变，表明在 Tyr基因上有高效的 On-target效率；同样地， BE3-Tyr-C和 BE3-Tyr-D在 tdTomato+ 细胞中均表现出高效编辑（分别为平均 75%和 92%的 Tyr等位基因突变），如图 9。本发明人也分析了其它 tdTomato+胚胎 On-target效率，所有对照胚胎全都没有 On-target效率。然而，全基因组测序分析显示 Cas9-Tyr-A和 Cas9-Tyr-B 处理的 tdTomato-细胞有 0-6.3%的低水平靶向编辑，这可能是假阴性流式细胞仪分选造成的（已知发生在较低水平）。因此，在接下来的分析中，只考虑等位基因频率超过 10%的变异是可靠的。

为了评估脱靶效应，通过每个胚胎中同时使用三种不同的变异调用算法比较 tdTomato+ 细胞和 tdTomato-细胞，本发明人分析了全基因组的从头到尾变异，三种算法定义的变量均为真正的变量。在全部 9组中发现只有 0-4个 indel（图 10），这个结果进一步由 Sanger 测序验证（图 1 1）。同时，在 Cre only的胚胎中，观察到平均 14个 SNV，用 CRISPR/Cas9 处理的胚胎（Cas9, Cas9-LacZ， Cas9-Pde6b， Cas9-Tyr-A和 Cas9-Tyr-B），各组平均 SNV 分别为 12.5、 5、 0、 16、 19，与“Cre-only”组比较，差异无统计学意义。此外，观察到 Cas9-Pde6b 编辑胚胎中 SNV 没有增加，这与之前的许多研究一致（图 12）。所有在 CRISPR/Cas9 编辑胚胎中检测到的脱靶 SNV 均经 Sanger 测序证实。在 Cre-或者 CRISPR/Cas9处理的样品中检测出 SNV可能是因为在基因复制过程中自发突变引起的，但是变异数量在自发突变范围内。此外，本发明人的研究中没有出现同一变异（图 13a），与 Cas-OFFinder， CRISPOR和 Digenome-seq推测的脱靶位点没有重叠（图 13b）。本发明人也观察到，所识别的 SNV邻近序列与靶向位点没有序列相似性（图 13c）。

另外，通过相反调用变量，比较每个胚胎的 tdTomato-和 tdTomato+样本，发现 SNV的数量相似，表明 CRISPR/Cas9编辑没有产生脱靶，本发明人观察到的 SNV来自自发突变（图 14）。

本发明人进一步共设计了 12 个组：一个 Cre 组（仅 Cre）, 六个包括或者不包括 sgRNA 的 Cas9 组（Cas9， Cas9-LacZ， Cas9-Pde6b， Cas9-Tyr-A， Cas9-Tyr-B 和 Cas9-Tyr-C）, 具有或不具有 sgRNA的三个 BE3组（BE3， BE3-Tyr-C , BE3-Tyr-D）（参考文献 1 1）和具有或不具有 sgRNA的两个 ABE组（ABE7.10， ABE7.10-Tyr-E）。本发明人通过 Sanger测序验证了在 8细胞和 E14.5阶段胚胎的靶向效率。为了进一步探索目的位点的编辑效率和潜在的全基因组脱靶效应，本发明人对来自 23 个 E14.5胚胎的 46个样品进行了平均深度为 47x的 WGS（表 1）。

表 1、 HiSeq X Ten sequencing的汇总

M p#d

Sainpk： Grmp Acxes^sa b*s^ Cm^age

P)

Cas9， BE3和 ABE7.10在 tdTomato+细胞中的活性分别通过靶向位点的高 indel 和高 SNV比例得到了证实（图 1C ; 表 2-3）。表 2、每个胚胎中 SNV和 indel的 WGS鉴定

Ois-tar^t

v

icotatioiii

对于脱靶效应，本发明人发现来自所有 12个组的胚胎中仅有 0-4个 indel（表 2和 4），并且它们都没有与预测的脱靶位点有重叠（表 5）。

Cbr P— Dig 賺 e DNA seqm&iiee

score

TJT-A_1 (OK- dir? 8T43S0S3 205.535443 GCGAAGOCACCGCCCTCTTTTGG

target site)

Jyr-A_2 chi-S 70679420 S7.5901275 TGGTTCATGCACCCCCCCTTAGG

Tyr-A_3 dir2 1 1906262 I2 9S29391 catgtaiagc3g:t₂tgccagaag

I_} r-A_4 dir6 940120 IS 5733594479 CTATGGOAGGAGGTAACTAAGCG

Tyr-B i dii5 L22E-0S 39.9S904S54 AAGAGGGCGGTGCTAAGATGGGG

T>T-B_2 dirX L 12E^38 21.2247577 AGGTACATAGCCTTC'ATATCAGG

Tyr-B_3 chi l l L14E-0S S 274157156 CCCATGGGGAACACTCCTGGGGG

Tyr-B_4 chil l J 1S462I SJ 9S3S3346 ACAAGCAAGTGTTGGrTCCATAGG

T>T-B_5 dii-1 1 L 14E-^3S 6 6S 1354096 C：CC：ATGGGGAACACTCCTGGGGG

Tyr-B_6 ckX S7M09S0 5 514465963 CA^4AGCTAOCAATTTCCAATAGG

Tyr-B_7 (OH- dir? S743S053 4 S26363636 C

fatget site) ：C；GATAGGTGCATTGG-CTTCTGG

Tyr-B_§ did 234§I074 4 209S76693 ATATAAGTTAACATCCCAAAAGG

Tyr-B_9 dirl l 95292492 3 644424 3 TATTOGGTGTCATCTCTTTCTCC

Tyr-B lO chrl L2SE-^0S 3.544329556 CCCAAGACATGCACACCGATAGG

Tvs - B_il dii6 6SI H03 i 2.614919S35 c^tigaCATAAAACATACC^'TAAAg

L_ftcZ l chr2 32395622 43.46541216 TTC.GGCTTCGGOGCGGGGTCAAG

Oar Posifioit DNA sequence

Tyr-A_l dirS 70<5?9420 100.166815 TG<3TTCATGCA€C：CCC；：CCTTAGG

TTT-A_2 (OH- dn

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对于所有 Cas9编辑的胚胎，不同 Cas9组之间没有显著的 SNV差异（平均 12个 SNV /胚胎），并且与 “Cre” 组相比也没有明显的差异（平均 14个 SNV /胚胎）（表 2）。在 Cre或 Cas9处理的样品中检测到的 SNV可能是由于发育期间基因组复制期间的自发突变引起的，因为本发明人检测到的 SNV的数目在模拟的自发突变的范围内，并且相邻序列和靶向位点也没有序列相似性（参考文献 12）。

令人惊讶的是，本发明人在 BE3编辑的胚胎中发现了平均 283个 SNV /胚胎，比在 Cre或 Cas9处理的胚胎中观察到的水平高至少 20倍（图 2A和表 2）。相比之下， ABE7.10平均只产生 10个 SNV /胚胎，频率接近自发突变率（图 2A和表 2）。本发明人进一步比较了 “BE3 only” 组中鉴定到的脱靶位点与 BE3-Tyr-C或 BE3-Tyr-D中的脱靶位点，发现 sgRNA的存在不会诱导产生更高的 SNV（P = 0.21， Kruskal-Wallis检验）。此外，这些突变是在 tdTomato+细胞而不是 tdTomato-细胞中特异性鉴定到的（参见方法，表 6）。

E3样本中检测到的脱靶在每一组中都没有重复，并且在整个基因组中随机分布。然后本发明人将这些脱靶突变与 Cas-OFFinder和 CRISPROR softwares预测的所有潜在脱靶位点进行比较。不出意外的是，这两种预测工具预测了大量的脱靶位点，但是没有出现在本发明人检测到的 SNV中。除此之外，所鉴定的 SNV邻近序列与 BE3 sgRNA靶向位点之间没有序列相似性，而预测的脱靶点最多的位点与目标位点 BE3序列相似。值得注意的是，尽管 BE3编辑产生的 SNV是独特的，但是突变类型与 APOBEC 1的突变类型是一致的。

值得注意的是，在 BE3编辑的细胞中鉴定到的 SNV超过 90%都是从 G突变为 A 或从 C突变为 T，在 Cre-， Cas9 -或 ABE7.10处理的细胞中未观察到突变偏好性（图 2B和 C，图 15）。这种突变偏好性与 APOBEC 1本身（参考文献 13）的偏好性相同，表明这些突变不是自发的，而是由 BE3编辑诱导的。以前的研究表明， APOBEC家族的几个成员（包括 APOBEC 1）的作用需要单链 DNA的存在（参考文献 14- 16）。本发明人的分析也显示 BE3诱导的 SNV在转录区域存在显著富集（图 3A），尤其是在具有高表达的基因中（图 3B。有趣的是，没有任何脱靶位点在不同的 BE3编辑的胚胎中共享或与预测的脱靶位点重合（图 3C和 D）。

据报道， DNA 的可结合性与基因编辑效率有关。因此本发明人通过评估 Cistrome 数据库中来自小鼠胚胎细胞的 ATAC-seq数据集合，判断脱靶位点是否富集在开放染色质区域。事实上，在具有混合 C57BL6/DBA2背景的 E8.5胚胎和 Cistrome数据库中的四个高质量数据集中，脱靶位点显著富集于具有较高结合性的区域中（图 16）。

此外，在脱靶和目标位点之间未观察到序列相似性，而通过计算机预测的脱靶位点显示与 BE3的靶向位点存在很高的序列相似性。因此， BE3脱靶 SNV是 sgRNA非依赖性的并且可能由 APOBEC 1的过表达引起。

在 BE3诱导产生的 1698个 SNV中， 26个位于外显子上，其中 14个导致非同义变化。本发明人通过 PCR成功扩增了 20个，并通过 Sanger测序证实了它们的存在（表 7）。

26个 SNVs中， 14个导致编码蛋白质的非同义变化， 2个在 Trim23和 Aim2基因中导致提前终止。 Trim23编码一个 E3泛素连接酶，其功能障碍可导致肌营养不良。先前的研究报道了 Aim2基因在先天免疫中起着重要作用，是抵御病毒感染的基础。本发明人也发现 1个 SNV在原癌基因上， 13个 SNVs在抑癌基因上，引起了对 BE3编辑致癌风险的严重关注（图 16）。本发明人还发现 1个 SNV位于原癌基因， 13个 SNV位于抑癌基因上，引起了对 BE3 编辑的致癌风险的担忧。本发明人猜测是否通过表达较低量的 BE3 可以降低这种风险，然而，使用较少量的 BE3会逐渐降低目标位点编辑的效率（表 8）。 99999999 D D D D D D D D D D D D D D D_{DQ D3DD DQQaDD3 DQCCDDDD} 表 8

ID M«j3fk>u WT i>> 5gRN_‘4

T>T-C

Tyf-C 13

n 50 u 50

D2-IG

50

42.S6 D2-B

7692 T>T-C

m：29 m 042 o 2525 _c54， 2、.. _{i ! i ! ! ! i} ^y _4i30s02 ₂₀

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50 77 m

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T>T-C _*0

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u

F2^

n n Tyr-C

T>T-C

14.25 F14

T_yS-C：

F2S 本发明的方法的一大优势是可在一只动物内对比编辑与未编辑的细胞，排除了遗传背 ^{|g M M33333338} o s ^{^ 0 B B B B c c c4} ^{A A A « B BB B B c c c}景^{|:rB!,,oi)4823i?35?i57:,15,} 的区别。先前的研究中比较编辑与未编辑的动物时，由于遗传背景的不同混淆了。事实上，本发明人也将该方法用于一个已发表的数据集中，并发现在 CRISPR/Cas9编辑的和未编辑的小鼠中平均有~ 1000个 SNVs和 - 100 indels _o 基于这一发现，本发明人认为同胞之间的差异是由于遗传变异而不是 CRISPR/Cas9编辑的结果。此外，对任意两个不同胚胎之间的序列进行比较时，发现更多的 SNV(3706±5232)和 indel (583 ± 762) (n = 18 pairs) , 因为所使用的胚胎并非来自同一亲本。这些结果表明，即使它们有相同的亲本，由于小鼠之间存在大量的遗传变异，也很难在脱靶分析中找到一个完全空白对照对编辑过的小鼠与未编辑过的小鼠进行比较。

总而言之，本发明证明 GOTI在研究基因编辑引起的脱靶效应方面的优势，即利用同一个胚胎的子细胞进行全基因组测序。本发明人也发现由 CRISPR/cas9介导的基因编辑引起的不希望发生的 off-target突变在小鼠胚胎中很少见，这支持以前的研究结果，基于 CRISPR/Cas9的体内编辑不会导致显著的 SNVs和 indels。然而，不能排除其他研究报道的大部分缺失或者大部分染色体易位。相比之下，本发明发现许多由 BE3编辑引起的新 SNV，这提高了在治疗应用中的基础编辑方法的安全性。本发明人发现 BE3诱导产生了许多新的 SNV，这在以前的研究中没有报道。可能的解释是，本发明中 GOTI可以检测来自单个基因编辑的卵裂球的细胞群，而之前的研究使用了大量的细胞池，其中编辑是不一样的，由于种群平均导致随机脱靶的信号丢失。与 BE3不同， ABE7.10诱导的 SNV没有增加，可能是由于 TadA缺乏 DNA 结合能力（参考文献 17）。 BE3的脱靶效应可能可以通过降低 APOBEC 1 的 DNA结合能力或使用不同形式的胞嘧啶脱氨酶得到解决。总之， GOTI免于受不同个体之间的 SNP干扰而用于检查各种基因编辑工具的脱靶效应。实施例 2、 APOBEC1酶对于脱靶效应的影响作用

如上，单碱基编辑工具 BE3会导致大量的单核苷酸脱靶变异（SNV）。本发明人预期这些脱靶变异是由 APOBEC 1的过表达及其与单链 DNA（ssDNA）的结合引起的。然而，单碱基基因编辑工具（BEs）已被广泛用于单个碱基的突变研究，并且有成为纠正病原突变的潜力。本实施例中，本发明人测试解决 BE3 的脱靶问题的可能性，从而使疾病相关的靶 Cs能够被特异性地矫正。野生型 APOBEC 1蛋白序列如 SEQ ID NO: 1所示。

为了进行 BE3脱靶评估所构建的 BE2系统如图 4a，其中包括 Apobec l 以及 Sp nCas9酶、 UGI酶，通过 16AA（序列为 SGSETPGTSESATPES（SEQ ID NO: 38））和 4AA（序列为 SGGS（SEQ ID NO: 39））两段肽进行连接。

本发明人首先减少注入胚胎的 BE3 mRNA的量，并应用 GOTI来检测脱靶变体。随着 BE3的注射减少，相应地降低了靶向位点基因编辑的效率（图 4b）。但是脱靶 SNV 的数量没有显著降低（图 4c）。

作为替代方法，本发明人尝试对 Apobec l 蛋白上的 ssDNA结合域进行突变，观测是否可降低 APOBEC 1的脱靶活性。本发明人根据先前的研究将相应的 BE3相应氨基酸位点进行突变，并使用 GOTI方法评估它们对靶向效率和脱靶效应的影响（图 4a）。

本发明人评估了基因编辑 Tyr-C 和 Tyr-D 靶位点不同突变的效率。首先使用 sgRNA-C和 D评估突变体 BE3， BE3-W90A（发生于 Apobec l 蛋白氨基酸序列第 90 位上）， BE3-W90F， BE3-R132E（发生于 Apobec l 蛋白氨基酸序列第 132 位上）， BE3-R126E（发生于 Apobec l 蛋白氨基酸序列第 126 位上）和 BE3-E63A（发生于 Apobec l 蛋白氨基酸序列第 63位上）编辑活性。结果显示，与 BE3相比 BE3-R126E 突变在两个靶位点上编辑效率相差不大。突变体 BE3-R126E的活性也通过来自 WGS 的高靶向效率证实（图 4b）。但是，值得注意的是，与 BE3相比， R126E突变胚胎中的脱靶 SNV的数量显著减少，并且与 “仅 Cre” 相比没有发现显著差异（图 4c）。此外，在 R126E处理的两个胚胎中相差不大。检测到的 SNV数量接近自发突变率，并且没有 SNV与预测潜在的脱靶位点重叠，表明通过突变 Apobec l 126精氨酸成为谷氨酸可显著降低 BE3诱导的脱靶 SNV。基于上述，本发明人首次揭示一种解决方案，通过在 APOBEC 1上进行突变，如进行 R126E突变，来解决 BE3诱导的脱靶效应。

本发明中建立的模块性表明 GOTI适用于 APOBEC 1的其他突变版本或胞苷脱氨酶的新工程化版本的进一步解决方案。实施例 3、突变优化研究

首先，本发明人将不同量的 BE3 mRNA(50 ng/jj 1和 10 ng/jj 1)与 sgRNA-Tyr-C 或 sgRNA-Tyr-D—起注入胚胎，并通过单细胞 Sanger测序评估祀向效率。

本发明人发现，使用较少量的 BE3可显著降低靶向效率 (72.6 ± 5.3%， 50 ng/jj 1； 12.6 ± 2_9%， lO ng /jJ l)。

然后本发明人应用 GOTI 方法进行全基因组脱靶评估，通过双细胞胚胎注射 (GOTI)进行全基因组脱靶分析，以检测 BE3-Tyr-D处理的胚胎上的脱靶变体，并且发现两种不同水平 (分别注射 50ng/nl和 10ng/nl)的 BE3 mRNA的脱靶 SNV的数量没有变化。

本发明人接下来检查了 APOBEC 1的 DNA结合域处的点突变是否会降低 BE3的脱靶率。基于先前研究提出的 DNA结合域，本发明人将各种点突变引入 BE3体系中的 APOBEC 1 的推定 DNA结合域，并评估它们对靶向效率和脱靶率的影响 (图 5a)。对于点突变 E63A， R126E和 R132E， BE3的碱基编辑效率在 Tyr基因上的两个位点的靶向碱基编辑中评估，其中在 2 细胞小鼠胚胎中具有相应的 sgRNA Tyr-C 和 Tyr-D (图 5b)。本发明人发现，与野生型 BE3相比， BE3-E63A或 BE3-R132E在 Tyr 上的编辑效率都显著降低，而 BE3-R126E 在两个靶位点都保持了高编辑效率。本发明人进一步证实， BE3-R126E的 DNA靶向活性与 HEK293T细胞中另外三个位点上的 BE3相似。有趣的是， BE3-R126E的编辑窗口缩小了。

本发明人接下来进行 GOTI 以评估 BE3-R126E 在具有或不具有 sgRNA(BE3-R126E ， BE3-R126E-Tyr-C 和 BE3-R126E-Tyr-D) 的三组， BE3-W90Y+R126E(YE 1)-Tyr-C和 BE3-W90F+R126E(FE 1)-Tyr-C中的靶向效率和脱靶频率。通过全基因组测序确认了靶向效率 (图 5c) _o 值得注意的是，用 BE3-R126E和 BE3-W90Y+R126E(YE 1)处理的胚胎中脱靶 SNV 的数量从野生型 BE3 处理的胚胎中的 283 ± 2(n=6)显著降低至 24 ± 8 , 接近于自发突变 (图 5d)。此外，本发明人没有观察到突变偏差和没有与预测的脱靶位点重叠的 SNV，表明 BE3R126E诱导的脱靶 SNV 不存在。

本发明人进一步在 293T细胞上检测 BE3-W90Y+R126E(YE1) , BE3-R126E在转录组水平脱靶情况。结果发现 BE3-R126E 可以显著降低 RNA 的脱靶。 BE3-W90Y+R126E(YE 1)可以完全消除 RNA的脱靶 (图 5e)。

图 5d-e 中， BE3(hA3A) 是使用人的 APOBECA3A(human APOBECA3A)取代了 BE3 上的 apobec l，构建的新的 BE3 编辑工具。 BE3(hA3AY130F)是在 human APOBECA3A突变 Y 130转变为 F，可以观测到这一突变显著减少脱靶 SNV的数量。

总之，通过应用 GOTI方法评估脱靶 SNV的量，能够证明通过突变基础编辑器的脱氨酶的假定 ssDNA结合域可以消除胞嘧啶碱基编辑器的 DNA和 RNA水平脱靶效应。

该结果表明，基础编辑器可以被设计成用于基因编辑和治疗应用的有效且安全的工具。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

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Claims

权利要求

1. 一种降低单碱基编辑器的脱靶效应的方法，包括：在单碱基编辑器系统中，对其中的胞嘧啶脱氨酶进行改造，弱化其与 DNA的结合能力。

2. 如权利要求 1 所述的方法，其特征在于，所述的改造是针对胞嘧啶脱氨酶的 DNA结合区域的改造；较佳地，所述的 DNA结合区域为其与 DNA结合的结构域。

3. 如权利要求 2所述的方法，其特征在于，所述的改造包括但不限于：基因突变，靶向性封闭或阻滞，干扰。

4. 如权利要求 1所述的方法，其特征在于，所述的单碱基编辑器系统为 BE3基因编辑器系统；或

所述的 DNA为单链 DNA或双链 DNA。

5. 如权利要求 1 所述的方法，其特征在于，所述的胞嘧啶脱氨酶包括但不限于选自下组的酶： AID， APOBEC3G， APOBEC 1， APOBECA3A， CDA1。

6. 如权利要求 5所述的方法，其特征在于，所述的胞嘧啶脱氨酶为 APOBEC 1 ; 较佳地，所述的改造为对该酶的第 126位的氨基酸进行改造；更佳地，所述的改造为将其第 126位的 R突变为 E。

7. 如权利要求 6所述的方法，其特征在于， APOB EC 1的改造还包括：对 APOB EC 1 酶的第 90位的氨基酸进行改造；更佳地，所述的改造为将其第 90位突变为 Y。

8. 如权利要求 5所述的方法，其特征在于，所述的胞嘧啶脱氨酶为 A P O B E C A 3 A，所述的改造为对该酶的第 130 位的氨基酸进行改造；较佳地，所述的改造为将其第 130位的 Y突变为 F。

9. 一种胞嘧啶脱氨酶的突变体，其 DNA 结合区域发生改造，该改造使得其与 DNA的结合被弱化，所述的 DNA如单链 DNA；较佳地，所述的胞嘧啶脱氨酶包括但不限于选自下组的酶： AID， APOBEC3G， APOBEC 1， APOBECA3A， CDA1。

10. 如权利要求 9所述的突变体，其特征在于，所述的酶为 APOBEC 1 ; 较佳地，所述改造发生在该结构域的第 126位氨基酸上或其邻近的位置上；更佳地，所述的改造为将其第 126位的 R突变为 E。

1 1. 如权利要求 9所述的突变体，其特征在于，所述的改造还发生在 APOBEC 1 酶的第 90位氨基酸上，更佳地，所述的改造为将其第 90位突变为 Y。

12. 如权利要求 9所述的突变体，其特征在于，所述的酶为 APOBECA3A，所述改造发生在该酶的第 130位的氨基酸上或其邻近的位置上；较佳地，所述的改造为将其第 130位的 Y突变为 F。

13. 分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求 9- 12 任一所述的突变体。

14. 一种单碱基编辑器，其包含权利要求 9- 12 任一所述的胞嘧啶脱氨酶的突变体；较佳地所述的编辑器为 BE3单碱基编辑器。

15. 权利要求 9- 13任一所述的胞嘧啶脱氨酶突变体的用途，用于参与基于单碱基编辑器系统的基因编辑，以降低基因编辑器的脱靶效应。

16. 一种筛选对于降低单碱基编辑器的脱靶效应有用的物质的方法，包括：

(1) 用候选物质处理胞嘧啶脱氨酶或其 DNA结合结构域以及 DNA相互作用的体系；和

(2) 检测所述体系中胞嘧啶脱氨酶 DNA结合结构域与 DNA相互作用情况；其中，若所述候选物质抑制、阻滞或下调胞嘧啶脱氨酶或其 DNA结合结构域与 DNA的相互作用，则表明该候选物质是对于降低基因编辑器的脱靶效应有用的物质。

17. 一种分析单碱基基因编辑工具或基因编辑操作的靶向效应的方法，其特征在于，所述方法包括：

( 1) 获取 n-细胞阶段的胚胎，在其中 1〜 n- 1 个细胞中进行基因编辑操作；其中所述 n为 2〜： 10的正整数；

(2) 在胚胎发育的下游阶段，观测发生基因编辑的情况。

18. 如权利要求 17所述的方法，其特征在于，步骤 ( 1 )中，所述的 n为 2〜 8 , 2〜 6或 2〜 4的正整数；较佳地，所述 n为 2。

19. 如权利要求 17 所述的方法，其特征在于，所述的方法为体外培育方法或体内培育方法。

20. 如权利要求 17所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述胚胎发育的下游阶段为胚胎发育到原肠胚阶段至出生前阶段，或在体内状态下为胚胎植入子宫至出生前的阶段。

21. 如权利要求 17 所述的方法，其特征在于，所述的胚胎为小鼠的胚胎，所述胚胎发育的下游阶段为胚胎发育的第 8〜 20天（E8-E20阶段），较佳地为胚胎发育的第 9.5- 18.5 天（E9.5-E18.5 阶段），更佳地为胚胎发育的第 12〜 16（E11-E16 阶段，如 E14.5）_o

22. 如权利要求 17 所述的方法，其特征在于，在胚胎发育的卵裂期，将胚胎中基因编辑的卵裂球和没有编辑的卵裂球进行拆分，移植到受体中，发育成成体。

23. 如权利要求 22所述的方法，其特征在于，基因编辑的卵裂球和没有编辑的卵裂球形成分别的胚胎，移植到不同的受体或同一受体中，或体外建立胚胎干细胞系。

24. 如权利要求 17所述的方法，其特征在于，所述的基因编辑操作包括（但不限于）： CRISPR介导的基因编辑， Base Editor（碱基编辑器）介导的基因编辑， Cre/loxP介导的基因编辑， Prime editor。

25. 如权利要求 24所述的方法，其特征在于，所述的 CRISPR介导的基因编辑包括（但不限于）： CRISPR/Cas9 介导的基因编辑， CRISPR/Cas9n 介导的基因编辑， CRISPR/Casl3（如 CRISPR/Casl3a， CRISPR/Casl3d）介导的基因编辑， CRISPR/CasRx 介导的基因编辑。

26. 如权利要求 24所述的方法，其特征在于，所述的 Base Editor包括： BE1， BE2， BE3， BE4， BE4-Max。

27. 如权利要求 24所述的方法，其特征在于，所述的腺嘌呤碱基编辑器包括：

ABE7.10, ABE 6.3 , ABE 7.8 , ABE 1.9, Prime Editing。

28. 如权利要求 17所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，包括：将用于切割核酸（如 DNA）靶位点的酶（如 Cas mRNA， Cre mRNA），以及相应导向序列（如 sgRNA）引入到所述的其中一个细胞中，进行基因编辑。

29. 如权利要求 28所述的方法，其特征在于，所述的用于切割核酸 (如 DNA)靶位点的酶选自但不限于下组的酶： Cas9， Cas9n， Cas l 3a， CasRx， BE 1， BE2， BE3 , BE4， ABE7.10, ABE 6.3 , ABE 7.8 , ABE 7.9。

30. 如权利要求 17所述的方法，其特征在于，步骤 ( 1)中，采用可检测标记物来标记所述的基因编辑操作，在其中 1〜 n- 1 个细胞中进行基因编辑操作并设置可检测标记物。

31. 如权利要求 30所述的方法，其特征在于，所述的可检测标记物包括但不限于：染色标记物、焚光信号分子、报告基因；更佳地，所述的可检测标记物为 tdTomato , EGFP， mCherry , GFP， dsred。

32. 如权利要求 17所述的方法，其特征在于，步骤 (2)中，所述观测发生基因编辑的情况包括：

分选发生基因编辑的细胞以及未发生基因编辑的细胞；

进行测序分析；

利用单核苷酸变异分析工具和 /或 indel分析工具进行分析；

SNV和 indel _o

33. 如权利要求 32所述的方法，其特征在于，所述的单核苷酸变异分析工具包括但不限于： Mutect2， Lofreq和 Strelka或其组合；或，所述的 indel分析工具包括但不限于： Mutect2， Scalpel， Strelka或其组合。

34. 如权利要求 17 所述的方法，其特征在于，所述的胚胎来自于哺乳动物，包括非人哺乳动物。