JPS61501747A - 核酸配列の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸配列の検出方法 〔発明の背景〕 本発明は特定の塩基配列’ｔ−７にするＤＮＡの特別な検出に関する。特に、本 発明は「プローブベクター」と称するＤＮＡ分子の構成Ｉこ関し、このＤＮＡ分 子は「標的」配列と称する検出しようとするＤＮＡ配列の相補的なものであり、 かつ標的配列と交雑されるとまたこのときに限り高い効率で細菌を形質転換させ るものである。

デオキシリボ核酸すなわちＤＮＡはヌクレオチドと称する単位の長い線状重合体 である。各ヌクレオチドは４檻の含窒素塩基アデニ”ｔｓＪ　ｓ　グアニン（ψ 、シトクン（ｑおよびチミン（７′ｌのいずれか一つを含有している。生物のＤ ＮＡ中の塩基の配列は生物の遺伝特性を特定する６種に属する個々の生物の大部 分はそれらの各々のＤＮＡ配列の大部分を共有している。従って、種の個々の生 物の全部もしくは大部分が含庸しているが種の外にある生物に存在していないＤ ＮＡ配列を同定することが可能である。このようなりＮＡ配列は種を特徴づける ものであり、ある意味では種の「診断」となる。

特別の種の検出および同定の能力により感染性疾患の診断に適用し得る。種々の 病源体例えばウィルス、細菌、菌および原生動物は本発明による臨床検体中の特 別のＤＮＡ配列を検出することによって検出し、同定することができる。

病原性もしくは治療剤ｌこ対する抵抗性（例えば抗生物質耐性）＃こ影響する感 染性生物の更に他の遺伝特性もまた本発明によって検出、同定することができる 。

種のうちで、個々の生物は相互に他のものと遺伝的に相違がある。場合によって は、このような相違がある。

場合によっては、このような相違は遺伝的疾患例えば人での＃Ｌｍ赤血球貧血と して発現する。これらの相違は種々の生物のＤＮＡの塩基配列の相違として検出 することができる。その他の疾患例えば糖尿症２よび心臓疾患は遺伝的に特異体 質を決定したものであり、この体質は個体のＤＮＡ配列の特徴のある変更によっ て同定することができる。本発明はこれらの変更全検出、同定することができ、 それによりこれらの変更が指示する遺伝的特異体質を検出、同定することができ る。

ゲノムＤＮＡの再配列は、以前には相互に離れていた配列が密接に類似したもの となる結果を生じることができる。このような遺伝子転置は免疫系の生成過程で 生じ、そしていくつかの癌の病源学に包含されている。本発明のプローブベクタ ーは、２種の標的配列を検出するためｌここれらの配列間の密接な連結を必要と する。それで、適当なプローブベクターは遺伝子転置から生じる再配列を検出す るのに使用することができる。

同定しようとする特徴のあるＤＮＡ配列は異った配列を有するＤＮＡが非常ｉこ 沢山存在する場合に与られる（みられる可能性がある）ので、その検出方法は極 めて特異的である必要がある。更に、特徴のある配列のＤＮＡは分析にほとんど 利用し得ないので、高感度の方法もまた望ましい。

ＤＮＡは塩基相補性と称する基本特性を有している。

天然に、ＤＮＡは通常対の逆平行鎖の形態で存在し、各鎖の塩基は反対の鎖方向 に該鎖から突出している。一つの鎖の塩基アデニン（４）は常に他の鎖の塩基チ ミン（力に添っていて、そして塩基グア二）（ｑは塩基シトクン（ＣＩ！こ添っ ている。塩基はこの特殊な方法でそれらの能力により水素結合と同格に保持され ている。各々の個々の結合は比較的弱いが、多くの隣接水素結合された塩基の総 合効果は、塩基積重ね効果と一緒になって、２種の相補鎖の安定な結合である。

これらの結合は例えば高ｐＨまたは高温のような処理によりこわれることができ 、これらの条件によって２ｙａの鎖の解離もしくは「変性」を生じる。

次にＤＮＡを塩基の水素結合を熱力学的に好ましいものとする条件下におくと、 ＤＮＡ鎖がアニーリングもしくは交雑され、そして当初の二重鎖のＤＮＡｔ−再 生する。

適切な条件下で実施すると、この交雑は非常に特異的であり得る。すなわち、高 度の塩基相補性を有する鎖のみが安定な二重鎖の構造を形成し得る。反応条件に 対する交雑の特異性の関係はよく知られている。すなわち、交雑を２片のＤＮＡ がその塩基配列において相補的であるか否かを検定するのに使用し得る。

細菌の多くの属はプラスミドと称するＤＮＡ分子を宿している。プラスミドは細 菌遺伝子の主な組とは別異の円形分子である。プラスミドは形質転換と称する方 法において適切な条件下で細菌により取り上げられる。プラスミドはそれ自体の 複製を確保するのに必要な配列を含有している。そして、通例、細菌に容易に検 知し得る表現型例えば抗生物質耐性を与える他の配列をも含有している。

プラスミドは試験管内で種々の生化学的技法により変性されてきた。これらのう ちで最も著名なのは組換えＤＮＡ操作であり、これにより外部ＤＮＡのセクショ ンをプラスミドに挿入する。これは種々の酵素、特に制限エンドヌクレアーゼ（ 特定の塩基配列で定められた部位でＤＮＡを開裂する）およびリガーゼ（ＤＮＡ 末端を再結合するのに使用し得る）の助けによって達成される。

：Ｉ−ｘン（Ｃｏｈｇｎ　）等の米国特許第４，２３７，２２４号を参照。

本発明にとって基本的に重要なのは、細菌細胞、例えばエツクエリヒア・コリ（ Ｅｓｃｈａｒｉｃ屓ａ　ｃｏｌｔ）を効率よく形質転換させるためにはプラスミ ドＤＮＡは円形構造を有してい＆ければならない事実である。２−１５キロ塩基 対を含有する完全な二重鎖プラスミドによるＥ。

コリの形質転換はｌＸｌ０’形質転換細胞／Ｐ１１導入ＤＮＡの程度の効率で進 行し〔Ｄ、ハナへン（Ｈａｎａｈａｎ　）ｓ　！。

モＡ／、ビオ／ｌ／　（Ｊ、Ｍｏｌ　、Ｂｉｏｌ　、）、１６６．５５７−５８ ０．１９８３年〕または約４キロ塩基対のプラスミドｔこついて１形質転換細胞 ／１０ｊｌ）ＨＡ分子の程度で進行する。これに対して、線状プラスミドＤＮＡ 　（すなわち、両方の鎖が同じ個所で−たん切断されている以前は円形のＤＮＡ 分子）はＥ、コリを極めて貧弱に、多分円形の同一のＤＮＡよりも１０００倍も 少い程度で形質転換させる。プラスミドは、切断部位が、部間の相互作用が２種 の切断部を一緒に保持するのに十分に強い塩基対で十分に分離されていると、両 方の鎖が切断されていても円形を保持し得る。このような切断されてはいるがな お円形のプラスミドは未切断分子とほぼ同じ〈効率よく形質転換させる（止揚の り、ダナハンの論文を参照）。

円形単一鎖ＤＮＡ分子は天然にある種のウィルスのゲノムとして存在する。これ らのＤＮＡはＥ、コリ細胞内に入り、確立するが、効率が低下する（約に０　な らびに他の均等な二重鎖円形）。線状単一鎖形態のプラスミドは定量するのが難 しいほど低い効率でＥ、コリを形質転換させる。

本文Ｉこ記載の発明はＤＮＡ交雑の特異性と細菌形質転換の感受性とを組合せて 特異的でかつ感度のよいＤＮＡ配列を検出する方法を提供するものである。本方 法の更に他の利点は、適切なりＮＡ試薬により検出される配列の一部分をクロー ニングし得ることである。これによって、例えば配列および制限酵素開裂の方法 によりＤＮＡを更に研究することが可能となる。

〔発明の要約〕

本発明によれば、標的ＤＮＡ配列は該１２ＨＡを特別なプローブＤＮＡにより交 雑することにより検出される。

本文で「プローブベクター」と称するこの特別なプローブは、標的との交雑がプ ローブベクターを線状構造から円形構造に変換するような方法で生じた場合そし てこの場合に限り、細菌細胞を効率よく形質転換させる、すなわち細胞ｌこ入り 、そしてその遺伝子物質の一部となり得るように構成されている。プローブベク ターの更に必要な特徴は、該ベクターが形質転換細胞Ｃζ遺伝し得る検出可能な 表現型を付与し、その結果形質転換細胞の存在が容易に確認し得ることである。

適当なプローブベクターにより、標的の一部分が検出分析の過５程でクローニン グされる。これらのクローニングされた領域を検量することにより、重要な情報 が得られる。

〔図面の簡単な説明〕

第１図は不発明によるプローブベクターを用いるＤＮＡ標的の検出を図示する図 面である。セグメン）Ａ−ａ’。

Ｂ　−Ｂ’　は相補鎖を示し、そして生物学的機能を何も包含していない。

第２図はプラスミドｐＨＥＶ１３、ｐＨＢＶ４１０２およびｐＫＨ４００４の起 源の図式的表示である。セグメントＡ−Ａ’、ｎ−ｘ２ｃｍｃ′、Ｄ　−Ｄ’　 は相補鎖を示し、生物学的機能を何も包含していない。

第３図および第４図はそれぞれｐＨＢＶ４１０２およびｐＫＨ４００４からのプ ローブベクター鎖の発生を示す図式的図である。

第５因はプラスミドｐＨＥＶ１３からの標的！肝炎Ｂウィルス（ＨＥＷ）の発生 を図式的形態で示す。

第６図は、部分的に二重＃Ａｔ−有するプローブベクターを伴うクローン肝炎Ｂ ウィルス標的ＤＮＡの検出を示す。

セグメントＡ−Ａ′％ｎ−ｎｚ　ｃ−ｃ’、　ｎ−ｎ’　は相互に相補的であり 、生物学的機ｉｔ＠ｔ−何も包含していない。

第７図は本発明の態様による単一鎖プローブベクターによるクローン肝炎Ｂウィ ルス標的ＤＮＡの検出を示す図である。

第８図は、ＨＥＷ挿入が異った配列でクローン化されそしてｘｂａ１部位が除去 されたプラスミドｐＨＢＶ４７１１の起源の図式的図面である。

第９図は、ｐＨＢＶ４７１１２よびｐＢＲ３２２からの鎖の発生および短縮プロ ーブベクターを形成するためのそれらの交雑を示す図式的図面である。

第１０図は標的配列の部分を欠除している短縮プａ　−プベクターを用いるＨＢ Ｙ標的ＤＮＡの検出およびクローニングを図示的に示している。

〔発明の詳細な説明〕

まず第１図を参照するに、不発明のプローブベクターは円形、自律複製ＤＮＡ分 子の線状、部分もしくは完全単一鎖の誘導体、便宜上プラスミドとして示されて いる。

プローブベクターの末端の塩基配列ＡＩ％　Ｂ′　は標的ＤＮＡの部分に対して 相補的であり、そして、ブローブベクタ−が交雑条件下で標的と混合されたとき 、プローブベクターの末端が単一標的分子鎖と又雑し、そして標的鎖が細菌を形 質転換させ得る円形構造でプローブベクターを保持するように配列されている。

いくつかの他の領域でプローブベクターはまたレプリコンを担有し、このレプリ コンはウィルスまたはプラスミド起源であってよく、そして形質転換される細菌 を選択または同定し得る表現型の遺伝子情報を担有している。

ｇｉ図の検出方法において、プローブベクターを標的配列を含有し得るかまたは 含有し得ないＤＮＡの試料に加える。変性および交雑後、混合物を適切な形質転 換条件下でかつ表現型遺伝標識の選定のための条件下で適切な宿主細菌、便宜上 エツシエリヒア・コリと組合せる。

標的が試料中＋Ｃないときは、プローブは環状とならず、そして形質転換された 細胞はほとんどもしくは全く生じない。しかし、もしも標的が存在していると、 多くの細胞が形質転換される。例えば、遺伝標識が細胞全部が曝される特別の抗 生物質ｌこ対する抵抗性をコードすることができる。形質転換された細胞のみが 生存し、そしてコロニーを形成する。標的ＤＮＡを超える十分に過剰のプローブ ベクターが存在するとぎは、コロニーの数は試料中の標的の量の直接の画数であ る。試料中の標的ＤＮＡの量を測定するのに、形質転換体の数を測定するいずれ の手段金も使用することができる。潜在的に有用な表現型には、抗生物質耐性、 螢光、栄養欠乏の相補、ウィルスの誘発または拡散、呈色もしくは螢光分析で検 知し得る遺伝子生産物の生成あるいは上記の組合せが包含される。

このアプローチの長所は生物学的系の増大効果にある。

以下の実施例において、おそらくは−千万個の細菌を含む目に見えるコロニーが 単一の場合、すなわち単一細胞への単一の標的／プローブベクター雑種分子の導 入から生じる。更ｌこ、プローブベクターは標的の検出が標的の−ｉ’ｔクロー ン化するものとなるように構成することができる。形質転換された細胞から単離 されたプラスミドは標的からのみ誘発されたセグメントを含有している。

これらのセグメントは対象とする特徴例えばある樵の遺伝性疾病の突然変異特性 ｌこついて分析することができる。

標的に対して相補的なプローブベクター配列は、プローブベクターを環化させる ようＩこ十分に安定な二重鎖雑種が単一鎖標的と単一鎖領域（プローブベクター の）との間に形成される限り、大きくても小さくてもよい。事実、雑種から拡が っているかまたは二分子の交雑領域内の標的の未交雑領域（プローブベクター− こ存在する相補領域を伴わない）が存在し得る。このようなりＮＡの未交雑領域 は交雑プローブベクターの形質転換の効率に影響を及ぼすことがある（一般ｉこ 減少させる）、シかし、これらの差異は円形および線状プローブペクト間すなわ ち標的の存在下と不存在下のプローブベクター間の形質転換効率の差異に比して 小さい。

〔好ｌしい態様の説明〕

交雑後の細菌の形質転換における不発明の部分的に二重鎖のプローブベクターの 性能を次の実験例で示す、実験例ζこおいて、標的配列はクローンウィルスＤＮ Ａであった。

実施例 肝炎Ｂウィルス（ＨＢＶ）ゲノムをプラスミドｐＫＨ４７のＥｃｏＲ１部位中に クローニングした〔林、遺伝子（Ｇａｎｇ）、　１１，１０９−１１５頁、１９ ８０年参照〕。

第２図に示すｐＨＢＶ１３と称するプラスミドが得られた。

ｐＨＢＶ１３のサイズを、凹　！で消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびデオキ クヌクレオシドトリホスフエートで末端を修復しそして末端を一緒に結合するこ とによって減少してｐＨＢＶ４１０２’ｉ得た。プラスミドｐＨＢＶ４１０２を 酵素Ｈｐα■で肝炎Ｂ領域内で切断し、そしてそのｒＡＪｔｉｌ（アデノシンヌ クレオクドの長い配列を含む）をオリゴ−ｄＴセルロースでのグロマトグラフイ 一により精製した。プラスミドｐＫＨ４００４をそのＥｃｏＥ１部位で切断し、 モしてｒｒＪ＠（テミジ／ヌクレオシドの長い配列を含む）をオリゴ−ｄＡセル ロースで単離した。第３図および第４図ならびに上記林の文献を参照。

これらの２種の鎖を交雑条件下で混合すると、部分的Ｉこ二重鎖の分子が形成さ れる。分析のための標的■は、ｐＨＥＶ１３ｔＥｅｏＲＩで消化しそして小さい フラグメントを第５図に示すように精製することにより、製造された。

ｐＫＨ４００４の「Ｔ」鎖（８，４４ｉ＞ｓｐよびｐＨＥＹ４１０２のｒＡＪ鎖 （１０，２ｎｌ）　ｋそれぞれ水に溶解し、そして総容量６μノで標的Ｉの２５ ．４　ｎｆＩＣｐＨＢＶ１３の３．２キロ塩基ＥｃｏＲＩ　ＨＥＷフラグメント ）の存在下または不存在下に混合した。　０．２　ＮａＯＨの６μＪ　ｔ−７１ １１１えて反応を変性し、次に等容量の０．４　Ｎ　ＥＣノおよび０．３Ｎ）リ スＨＣＩ　ｐＨ＆１からなる溶液６μＩｆ加えて中和した。管を６５℃で６０分 間培養し、冷却しそして各反応物の半量を予め形質転換に対して受容能力をもつ ようｌこしたＥ・　コリ細胞ｉこ加えた。形質転換プロトコール完了後、細胞の アリコートを栄養分およびアンピシリンを含む寒天培地上に展開した。プレート を３７℃で一夜培養した。標的を欠いている反応では１３のコロニーが得られ、 −１標的を含む反応では２３３２のコロニー（アリコートから算出）が得られた 。

予めＨｐα■　で消化した上記標的２３．８ｎｆｉｔ−用いて同一の実験を行っ た。この処理により、プローブベクターに交雑する能力が変らない標的が残、る が、第６図に示すように環状構造にプローブベクターを変換する能力が破壊され ていた。反応により僅か６２のコロニーが得られ、またはコロニーの約３％が同 一の但し未切断標的により生産された。この結果から効率の良いプローブベクタ ー形質転換のための標的／プローブベクター雑種の環化の要件が実証された。

標的フラグメント（３，２キロ塩基対長さ）がプローブベクターの相補領域より も１．８キロ塩基対長いときｌこ、この結果が得られたことに注目すべきである 。すなわち、標的／プローブベクター雑種は環状の′！まで第６図に図示したと おり標的ＤＮＡの長い単一鎖テイル金含有していた。

次の実験では、完全に単一の鎖プローブベクターの標的検知能力を実証した。プ ラスミドｐＨＥＶ４１０２をＨｐａ！で切断して線状化し、そして、「Ｔ」鎖（ チミジンヌクレオクドの長い配列を含有している）をオリゴ−ｄＡセルロースで 精製した。ｒ７’Ｊ鎖をＰａｔ　ｌで消化して任意の混在している二本鎖ＤＨ− Ａｆ消化することにより（単一鎖ＤＮＡは消化されない）低い基底とした。

ＨＢＶ標的標的列配列記の如（ｐＨＢＶ１３から調製した。

このクローニングＨＥＷ標的を検知するのに、６６ｍｕ　ＮａＣ１，５０ｍＭ　 ）すｘＨｃｌ　ｐＨ８％　５　ａＭ　ＭｙＣ１ｔ中のプローブベクター「Ｔ」鎖 ３μｌｃ４゜５ｎｌ）ｌｃｌｌＡ的！の１２．７ｘ、ｌｉｔ＠含む０．１６　Ｎ 　ＮａＯＨ５１１１ｆこ児えた。

第７図を参照。同じプロトコールにより適当な対照反応を行った。変性の次に、 反応を等容量の０．４ＮＨＣ１訃よび０．３Ｍ）リスＥＣ１ｐｆｆ＆１からなる 溶液４μ！で中和し、そして６５℃で８０分間培養した。管を氷冷した後、Ｅ。

コリ細胞を予め形質転換を受容し得るようにしておき、反応に加え、そして形質 転換プロトコールにより実施した。Ｊａｌ胞のアリコートを栄養分およびアンピ シリンを含む寒天平板に展開し、そして３７℃で一夜培養した。プローブベクタ ーおよび標的双方を含む反応ｌこより１４，８８８の形質転換（アリコートから 算出）が得られ、−１負の対照反応（標的単独または「Ｔ」鎖単独を含む）では コロニーは得られなかった。

肝炎標的ＤＮＡの検知に対　る非標的ＤＮＡの効果上記の如くして調製したプラ スミドｐＫＨ４００４ｒＴＪ鎖（２゜１杼）およびｐｇｓｖ＋１０２ｒＡＪ鎖（ ２，５ｎｇ　）をＡｖａ　ｌで消化しておいた標的Ｉ　ＤＮＡ　ＣｐＨＢＶ１３ のＥＬ）Ｅ　ｌフラグメント）　６．２　ｎｉｌと混合した。この組合せにより 形成された標的／プローブベクター雑種は事実上単一鎖特性を有してなく、それ 故に二重鎖プラスミド分子−こ類似していた。これらのＤＮＡを異った量のニシ ン精液ＤＮＩＬ　（肝炎ウィルスに関連した配列を含んでいてはならない）と総 量３μ！で混和し、９．２ＮＮＧＯＫ３μｊで変性し、等容量の０．４ＮＨＣ１ および０．３　Ｍ　）リスＭＣＩ　ｐＨ８，１からなる溶液３μｌで中和し、そ して６５℃で４５分間培養した。冷却した反応物を用いて尺コリを形質転換し、 そして次憂こ示す数の形質転換体を得た。

添加二クン精液ＤＮＡ　Ｂｙ　コロニー（形質転換体）Ｏ標的なし　５ ０　標的添加　９４６ １００　ｚ　Ｉ　９５７ １０００　、Ｉ　１１３３ ５０００　ｚ　ｐ　２４２０ すなわち、１０００倍過剰の異種ＤＮＡの添加は分析からのシグナル（コロニー ）に対して顕著な効果を有していなかった。ニシン精液ＤＮＡが形質転換体の収 率を著しく増加もしくは低減させないことは、プローブベクターを環化するかま たはＨＢＶ標的ＤＮＡが環化するのを防止するようにプローブベクターについて の対を基にしていないことを示している。

用量−反応関係：増加標的の検知 ｐＫＨ４００４の「ＴＪ鎖（２，Ｏｎ１ｌ）およびｐＨＢ”／４１０２のｒａＪ 鎖（２，４ｎｇ）をＨＢＶ標的Ｄ　Ｎ　Ａ（Ａｖａ■で切断し、その結果生成し た雑種はテイルを有していない）の増加する量と混合した。これらの成分を上述 したのと同様な変性、中和、交雑および形質転換工程に付し、そして次の結果を 得た。

シグナルは分析での標的の量に直接対応する。

短縮プローブベクター分子による検出：検出　伴うクローニング 以下に記載の操作ｆこよってプローブベクターを製造し、そして得られた部分的 に二重鎖の分子はＨＥＷ領域からの１４１９塩基対を欠いていた。ＨＥＷ標的Ｄ ＮＡ１こ交雑させると、プローブベクターは環状得造に保持され、但しプローブ ベクターの二つの末端は、先の実施例の如く正確ξζ並ｒＩＬされている代りに 、１４１９塩基離れていた。このタイプの標的／プローブベクター雑種は高い効 率でＥ５すを形質転換することができ、そして形質転換されたムコリ細胞から抽 出されたプラスミドは標的ＤＮＩＬからのみ誘導された１４１９塩基対を含有し ていた。

第８図Ｉこ誘導を示したプラスミドｐＨＢＴ／４７１１をＥｃｏＥＶで消化した 。デオキシヌクレオシドチオトリホスフェート（Ｓ−ｄＮＴＰ、α−ホスフェー トで酸素原子の一個が硫黄原子で置換されている通常のデオキシヌクレオシドト リホスフェートの類似体）を次の反応混合物中０．２５１１９ＤＮＡ／ｍで線状 分子を３７℃で５分間次に氷上で２０分間培養することによりＤＮＡ鎖の３１− 末端に組み入れた。３３　ｎｔＭ　）リス酢酸塩ｐＨ７，９，６６ｍＭ酢酸カリ ウム、１０扉Ｍ酢！！１ｔｙｓ　ｏ、ｓ　ｒｙｔ＆ジチオスレイトール、０．１ η／ｄ牛血清アルブミン、２．５Ｍ各々５−ｄＡ、５−６０％５−ｄＣおよびＳ −ｄ　Ｔ　［：　Ｐ−Ｚ、ビオケミカルズ（Ｂｉｏｃｈｇｒｎｉｃａｌｍ　）か ら購入〕訃よび２５０単位／ＭＩＴ４ＤＮＡポリメラーゼ。予備実験では、この ように処理したＤＮＡはその３′一端に組入れられたチオヌクレオチドによりエ キソヌクレアーゼ■のａ／−−）　Ｓ／エキソヌクレアーゼ活性をこ対して抵抗 性を示すようになったことがわかった（　Ｓ、Ｄ、プトネイ（Ｐｗｔｓｔｙ）等 、ブロク。

ナショナル、アカド、サイ、　ＵＳＡ　ＣＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｅｉ、ＵＳＡ）７８　：　７３５０〜７３５４頁、１９８１年参照〕。

保護反応物をフェノール抽出し、エタノール沈殿し、そしてＢｓｔＥｌで切断し 、これによって２個の未保護３′末端が露出された。Ｅ１１ｔＥｌｉ消化後、Ｄ ＮＡをフェノール抽出し、そしてセファデックス（ａａｐｈαｄｅｗ　）　Ｇ　 −５０カラムにかけた。ＤＮＡを含むフラクションをプールし、エタノール沈殿 し、そしてＤＮＡを５０　ｒｎＭ　）すＸＨＣｌ　ｐＨ７，５，１０ＷＬｕ　Ｍ ｙＣｌ、、５ｍＭ２−メルカプトエタノール中０．２５ａｇ／ｌｌｊで溶解した 。この混合物にｌθ単位エキンヌクレアーゼＴｌ／ｐｌＤｙｈを加えた。３７℃ で３０分後に、反応混合切をｊｊ４４ａ用低融点アガロースゲルにかけ、そして ４２６３塩基ｐｘｎｖ＜７１１　ｒｘｘＪ鎖を第９図に示すように精製した。

短縮プローブベクターの反対鎖を調製するために、プラスミドｐＥＲ３２２をＥ ｃｏＲで切断し、上記の如くチオヌクレオチドの組入れによってエキソヌクレア ーゼ■から保護し、次にＰｔｔｘ　ＩＩで切断した。エキソヌクレアーゼ■消化 の次ｆこ、２４８２塩基ｐＥＲ３２２ｒＥＰＪ鎖を調製的アガロースゲル電解に より精製した。第９図を参照。

ｐＨＢＶ４７１１　「１ｆ；ＥＪ鎖１．４Ｋｇ（１フ工ムトモル）２よびｐｓｎ ３ｚｚｒｘ：Ｐ」鎖０．８　ｘｇ（１フ工ムトモル）を用いて標的１（Ｍａｔｌ 切断ＨＥＷ環）　０．５　ｓＪＦを検出すると、１４２９のコロニー（検定コロ ニー）が得られた。標的の不存在下では、１２の基底コロニーがみられた。標的 曹単独（いずれの鎖も伴わない）ではコロニーは得られなかった。検定コロニー １６および基底コロニー８からのプラスミドを調製した。検定コロニープラスミ ド全１６は、標的／プローブベクター雑種が生体内で正確に修復されたときに予 測される如（、ｐＨＢＶ４７１１とはサイズが区別し得なかった。全８つの基底 プラスミドはｐＨＢＶ４７１１よりも可成り小さかった。これらのデータに一致 する説明としては、標的／プローブベクター雑種中のプローブベクターの５’Ｂ ｓｔ　Ｅ　ｌ端と３′盈鵠Ｒｙ端との間の１４１９塩基ギヤツプが、鋳型として 交雑標的鎖を用いて尺コリ細胞により生体内で修復されていた。１０の無作為に 選定した検定プラスミドを分析すると、予測されたμ２８１および王η！部位が 全ＩＯのプラスミドのギャップ領域に確認された。鎖を調製したプラスミド（ｐ ＨＢｙ＋７ｔｔ）から４η１ｍ位が存在していないので、その存在は検定プラス ミドのこの領域が標的ＤＮＡから誘導されることを示す強力な証拠である。

事実、この標的の領域は検出過程でクローニングされた。被数配列を検出しかつ クローニングするこのような能力は、人の遺伝子的欠陥の診断に有用である可能 性がある。例えば、鎌型赤皿球突起変異部位を欠除しているプローブでβ−グロ ビン遺伝子の検知ｌこ次いで、プラスミドＤＮＡは検定コロニーから単離するこ とができた。

鎧型赤血球突起変異の存在（この場合、制限酵素部位の存在または不存在）を次 ｉこ評価することができた。

本発明を好ましい態様について特に強調して詳述してきたが、不発明の精神およ び範囲内で当業者にとって変化および変形をなし得ることは明白である。

第２図 莞３図 ｐＨＢＶ４１０２　Ａ″　ａ ＋ ｐ）ｌＢＶ４１０２　”ＴＭ韻 ｐＫＨ４００４”Ａ”１！ ＋ 嶌５図 絹ヒ的１　、３．２０　ｋｂ 莞６図 ｐＨＢＶ４１０２１八１韻 ＋ 児７図 第９図 ｐＨＢＶ４７１１　”ＥＢ”　傾ｐＢＲ３２２”　ＥＰ”　１１第１０図 短縮ブローア公りター 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．特別な塩基配Ｘ１Ｘ２Ｘ３……Ｘｍ……Ｙ１Ｙ２Ｙ３……Ｙｍを含有する標 的核酸を検出するのに使用されるプローブベクター分子において、前記プローブ ベクターが２種の鎮からなる線状部分的に単一鎖のＤＮＡ分子からなり、長い鎖 は配列Ｘ′ｍＸ′ｍ−１……Ｘ′３Ｘ′２Ｘ′１……Ｚ′１Ｚ′２Ｚ′３……Ｙ ′ｎＹ′ｎ−１Ｙ３Ｙ２Ｙ１を含有し、そして短い鎖は配列Ｚ１Ｚ２Ｚ３……Ｚ ｐを含有し、ここで任意のｋについて、Ｘ′ｋはＸｋに対して相補的である塩基 であり、そしてＹ′ｋはＹｋに対して相補的である塩基であり、前記プローブベ クターの末端は前諾標的ＤＮＡの区分に対して実質的に相補的であり、ｍおよび ｎは十分に大きくてその結果前記プローブベクターを交雑条件下に前記標的ちＤ ＮＡに加えたときに安定な交雑が前記プローブベクターの末端の間で生じ、そし てこれにより前記標的ＤＮＡの実質的に相補区分が環状雑種を形成し、而してプ ローブベクターは、特別な標的配列が存在しかつ前記プローブベクターに交雑さ れているときとかつこのときに限り、環化され、そして前記プローブベクター鎖 の領域Ｚ１Ｚ２Ｚ３……ＺｐおよびＺ′１Ｚ′１Ｚ′２……Ｚ′ｐはレプリコン を含有し、そして検出可能な表現型を付与し、その結果前記雑種により形質転換 された細菌が検出可能であり、かつ前記表現型の開示により未形質転換細菌から 区別し得るようになる上記プローブベクター分子。 ２．プローブベクターのセグメントＸ′ｍＸ′ｍ……Ｘ′３Ｘ′２Ｘ′１，およ びＹ′ｎＹ′ｎ−１……Ｙ′３Ｙ′２Ｙ′１が標的領域Ｘ１Ｘ２Ｘ３……Ｘｍ− １ＸｍおよびＹ１Ｙ２Ｙ３……Ｙｎ−１Ｙｎに対して実質的に相補的であり、前 記標的領域が非隣接でありかつセグメントＷ１Ｗ２Ｗ３……Ｗｐで分離され、そ の結果環状標的／プローブベクター雑種においてプローブベクターの末端が標的 セグメントＷ１Ｗ２Ｗ３−Ｗｐにより分離きれている請求の範囲第１項記載のプ ローブベクター分子。 ３ＤＮＡの混合物に６いて、特別の塩基配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３……Ｘｍ……Ｙ１Ｙ２ Ｙ３……Ｙｍを含有する標的核酸の存在を測定し、而して請求の範囲第１項記載 の長鎖および短鎖あるいは請求の範囲第１項記載の長鎖のみの使用を必要とする 方法において、 Ａ）前記プローブベクターを核酸を含む試料に導入し、前記核酸は単一鎖である かまたはプローブベクターの添加前もしくは後に単一鎖とされ、前記試料および プローブベクターの混合物は供試混合物を包含し；Ｂ）供試混合物の条件を交雑 条件に調整し、かかる条件は前記標的が試料中に存在しているときは前記プロー ブベクターと前記標的との間に環状雑種を形成するのに好ましいものであり、但 しかかる条件は非標的核酸とプローブベクターとの間に雑種を形成するには好ま しいものではなく、交雑後の供試混合物は交雑混合物を包含し；Ｃ）前記交雑混 合物を細菌細胞に導入し、前記細菌細胞は環状ＤＮＡ分子（線状ＤＮＡ分子では ない）により形質転換を受けやすくされており、前記導入は前記標的／プローブ ベクター雑種（線状プローブベクターではない）により形質転換が可能であるよ うな条件下で行われ、前記細菌細胞は前記プローブベクターで付与される検出可 能な表現型を欠除し、前記細菌細胞と交雑混合物との混合物は形質転換混合物を 包含し； Ｄ）形質転換混合物の条件を表現型遺伝標識の検出を可能とするように調整し、 前記表現型遺伝標識は形質転換された細胞によつてのみ開示され、かかる混合物 は検出混合物を包含し；そして Ｅ）検出混合物を表現型遺伝標識の存在について評価する 各工程からなることを特徴とする上記の方法。 ４．プローブベクターが請求の範囲第２項記載のタイプであり、前記方法が標的 の検出を生じ、また標的の領域Ｗ１Ｗ２Ｗ３……Ｗｐのクローニングを生じ、前 記領域がプローブベクターでの相補的領域を欠除している請求の範囲第３項記載 の方法。 ５．細菌がエツシエリヒア・コリ（Ｅ８ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であり 、プローブベクターの領域Ｚ′１Ｚ′２Ｚ′３……Ｚ′ｐがＥ．コリ中で働くレ プリコンおよびＥ．コリで検出可能な表現型遺伝標識を含有している請求の範囲 第３項記載の方法。 ６．細菌がエツシエリヒア・コリであり、プローブベクターの領域Ｚ′１Ｚ′２ Ｚ′３……Ｚ′ｐがＥ．コリ中で働くレプリコンおよびＥ．コリで検出可能な表 現型遺伝標識を含有している請求の範囲第４項記載の方法。 ７．プローブベクターの領域Ｚ′１Ｚ′２Ｚ′３……Ｚ′ｐがプラスミドｐＢＲ ３２２のレプリコンおよびプラスミドｐＢＲ３２２のアンピシリン抵抗遺伝子を 含有している請求の範囲第３項記載の方法。 ８．プローブベクターの領域Ｚ′１Ｚ′２Ｚ′３……Ｚ′ｐがプラスミドｐＢＲ ３２２のレプリコンおよびプラスミドｐＢＲ３２２のアンピシリン抵抗遺伝子を 含有している請求の範囲第４項記載の方法。 ９．検出化合物を、標的／プローブベクター雑種により形質転換されている細菌 細胞の生育を可能とするように処方されているが、前記雑種により形質転換され ていない細菌細胞の生育を可能とはしない固形寒天平板培地にのせ、前記平板培 地を適当な条件下で培養し、そして平板培地上の細菌コロニーの数を測定し、こ の数が試料中に存在する標的ＤＮＡの量の尺度となる請求の範囲第３項記載の方 法。 １０．検出化合物を、標的／プローブベクター雑種により形質転換されている細 菌細胞の生育を可能とするように処方されているが、前記雑種により形質転換さ れていない細菌細胞の生育を可能とはしない固形寒天平板培地にのせ、前記平板 培地を適当な条件下で培養し、そして平板培地上の細菌コロニーの数を測足し、 この数が試料中に存在する標ＤＮＡの量の尺度となる請求の範囲第４項記載の方 法。 １１．検出化合物を、標的／プローブベクター雑種により形質転換されている細 菌細胞の生育を可能とするように処方されているが、前記雑種により形質転換さ れていない細菌細胞の生育を可能とはしない固形寒天平板培地にのせ、前記平板 培地を適当な条件下で培養し、そして平板培地上の細菌コロニーの数を測定し、 この数が試料中に存在する標的ＤＮＡの量の尺度となる請求の範囲第７項記載の 方法。 １２．検出混合物を、標的／プローブベクター雑種により形質転換されている細 菌細胞の生育を可能とするのに十分な最で、但し前記雑種により形質転換されて いない細菌細胞の生育を阻止する量で存在する抗生物質アンピシリンを含む寒天 平板培地にのせ、前記雑種は雑種を包含する細菌細胞にアンピシリン耐性を付与 する遺伝子を含有し；前記寒天平板培地を適当な温度で培養しそしてアンピシリ ン耐性コロニーの数を測定し、前記数が試料中に存在する標的ＤＮＡの量の尺度 となる請求の範囲第項記載の方法。 １３．検出混合物を、標的／プローブベクター雑種により形質転換されている細 菌細胞の生育を可能とするのに十分な量で、但し前記雑種により形質転換されて いない細菌細胞の生育を阻止する量で存在する抗生物質アンピシリンを含む寒天 平板培地にのせ、前記雑種は雑種を包含する細菌細胞にアンピシリン耐性を付与 する遺伝子を含有し；前記寒天平板培地を適当な温度で培養しそしてアンピシリ ン耐性コロニーの数を測定し、前記数が試料中に存在する標的ＤＮＡの量の尺度 となる請求の範囲第４項記載の方法。 １４．検出混合物を、標的／プローブベクター雑種により形質転換されている細 菌細胞の生育を可能とするのに十分な量で、但し前記雑種により形質転換されて いない細菌細胞の生育を阻止する量で存在する抗生物質アンピシリンを含む寒天 平板培地にのせ、前記雑種は雑種を包含する細菌細胞にアンピシリン耐性を付与 する遺伝子を含有し；前記寒天平板培地を適当な温度で培養しそしてアンピシリ ン耐性コロニーの数を測定し、前記数が試料中に存在する標的ＤＮＡの量の尺度 となる請求の範囲第７項記載の方法。 １５．検出混合物を、標的／プローブベクター雑種により形質転換されている細 菌細胞の生育を可能とするのに十分な量で、但し前記雑種により形質転換されて いない細菌細胞の生育を阻止する量で存在する抗生物質アンピシリンを含む寒天 平板培地にのせ、前記雑種は雑種を包含する細菌細胞にアンピシリン耐性を付与 する遺伝子を含有し；前記寒天平板培地を適当な温度で培養しそしてアンピシリ ン耐性コロニーの数を測定し、前記数が試料中に存在する標的ＤＮＡの量の尺度 となる請求の範囲第９項記載の方法。 １６．標的がＤＮＡからなる請求の範囲第３項記載の方法。 １７．標的がＤＮＡからなる請求の範囲第４、５、７または１２項記載の方法。 １８．標的がウイルスＤＮＡであり、プローブベクターの領域Ｘ′ｍＸ′ｍ−１ ……Ｘ′３Ｘ′２Ｘ′１およびＹ′ｎＹ′ｎ−１……Ｙ′３Ｙ′２Ｙ′１がウイ ルスＤＮＡの領域に対して相補的である請求の範囲第３項記載の方法。 １９．標的がウイルスＤＮＡであり、プローブベクターの領域Ｘ′ｍＸ′ｍ−１ ……Ｘ′３Ｘ′２Ｘ′１およびＹ′ｎＹ′ｎ−１……Ｙ′３Ｙ′２Ｙ′１がウイ ルスＤＮＡの領域に対して相補的である請求の範囲第４、５、７または１６項記 載の方法。 ２０標的が肝炎ＢＤＮＡであり、プローブベクターが肝炎ＢウイルスＤＮＡの領 域または全肝炎ＢウイルスＤＮＡに対して相補的である領域Ｘ′ｍＸ′ｍ−１… …Ｘ′３Ｘ′２Ｘ′１およびＹ′ｎＹ′ｎ−１……Ｙ′３Ｙ′２Ｙ′１を含有し ている請求の範囲第３項記載の方法。 ２１．標的が肝炎ＢＤＮＡであり、プローブベクターが肝炎ＢウイルスＤＮＡの 領域または全肝炎ＢウイルスＤＮＡに対して相補的である領域Ｘ′ｍＸ′ｍ−１ ……Ｘ′３Ｘ′２Ｘ′１およびＹ′ｎＹ′ｎ−１……Ｙ′３Ｙ′２Ｙ′１を含有 している請求の範囲第４、５、７、１２、１６または１８項記載の方法。