DE175689T1 - Verfahren zum bestimmen von nukleinsaeuresequenzen. - Google Patents

Verfahren zum bestimmen von nukleinsaeuresequenzen.

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DE175689T1 DE198484901695T DE84901695T DE175689T1 DE 175689 T1 DE175689 T1 DE 175689T1 DE 198484901695 T DE198484901695 T DE 198484901695T DE 84901695 T DE84901695 T DE 84901695T DE 175689 T1 DE175689 T1 DE 175689T1
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Pajt_e_nt
1. Such-Vektor-Molekül, das zum Nachweisen einer eine bestimmte Basensequenz X-1X0X-,..-X .. .Y„ Y,Y, ... Y
\ c 5 m ι c 5 m
enthaltenden Target-Nukleinsäure verwendet wird, wobei der Such-Vektor aus einem linearen, teilweise einzelsträngigen DNA-Molekül besteht, das zwei Stränge umfaßt, einen langen
Strang, enthaltend die Sequenz X X1 ,...Χ',Χ',Χ1,
m m—ί jet
Z^Z'gZ'j.-.Z1 ...Y'nY'n„1 .. ·γΙ3γΙ2ΥΊ' und einen kurzen Strang enthaltend die Sequenz Z1ZpZ3...1 , wobei
für jedes k, X1, die zu X. komplementäre Base und Y1. die zu Y. komplementäre Base ist, wobei die Enden des Such-Vektors zu Abschnitten der Target-DNA im wesentlichen komplementär sind,
m und η ausreichend groß sind, so daß, wenn der Such-Vektor zu der Target-DNA unter Hybridisierungsbedingungen gegeben wird, eine stabile Hybridisierung zwischen den Enden des Such-Vektors und dem im wesentlichen komplementären Abschnitt der Target-DNA auftritt, wodurch ein Zirkularhybrid gebildet wird, wobei der Such-Vektor ζirku I arisiert wird, wenn, und nur wenn die bestimmte Target-Sequenz vorliegt und mit dem Such-Vektor hybridisiert hat, und
die Bereiche Z..Z-Z....Z und Ζ'.Ζ'.Ζ',.,.Ζ1 der Such-
Vektor-Stränge ein Replikon enthalten und einen nachweisbaren Phänotyp übertragen bzw. hervorrufen, so daß durch das Hybrid transformierte Bakterien nachweisbar und von nicht transformierten Bakterien aufgrund des Auftretens dieses Phänotyps unterscheidbar sind.
2. Such-Vektor-MoleküL nach Anspruch 1, wobei die
Segmente X'J'm-1 '' "X V V ' 1 Und Y ' nY ' n-1 "' "Y V V ' 1
des Such-Vektors zu Target-Bereichen X4X0X7...X -X
ι c 5 tn-i m
und Υι^2Υ3"" *Yn-1Yn komplementär sind, wobei diese Target-Bereiche nicht zueinander benachbart und durch ein Segment W ..WpW,...W getrennt sind, so daß in dem Z i rkuL a r-Ta rget / Sueh-Vektor-Hybrid die Enden des Such-Vektors durch das Target-Segment W^W2W3...W voneiander getrennt sind.
3. Verfahren zum Bestimmen des VorLiegens einer eine
bestimmte Basensequenz X1X0X7 X Y4 Y0Y, ..... Y
λ c 5 m \ c 5 m
enthaltenden Target-NukIeinsäure in einer DNA-Mischung, wobei das Verfahren die Verwendung des langen Strangs und des kurzen Strangs nach Anspruch 1 oder nur des langen Strangs nach Anspruch 1 erfordert und folgende Stufen umfaßt:
A) Einführen des Such-Vektors in die Nukleinsäuren enthaltende Probe, wobei die Nukleinsäuren einzelst rängig sind oder vor oder nach der Zugabe des Such-Vektors einzelsträng ig gemacht worden sind, wobei die Mischung aus der Probe und dem Such-Vektor die Prüfmischung darstellt:
B) Einstellen der Bedingungen der Prüfmischung auf Hybridisierungsbedingungen, wobei diese Bedingungen für die Bildung von Zirkularhybriden zwischen dem Such-Vektor und dem Target, wenn das Target in der Probe vorliegt, günstig sind, solche Bedingungen jedoch
für die BiLdung von Hybriden zwischen Nicht-Target-Nukleinsäuren und dem Such-Vektor ungünstig sind, wobei die Prüfmischung nach der Hybridisierung die Hybridisierungsmischung darstellt;
C) Einführen der Hybridisierungsmischung in bakterielle Zellen, wobei die bakteriellen Zellen zur Transformation durch Zirkular-DNA-Moleküle, jedoch nicht durch lineare DNA-Moleküle prädisponiert sind, wobei die Einführung unter Bedingungen durchgeführt wird, welche eine Transformation durch das Target/Sueh-Vektor-Hybrid, jedoch nicht durch einen linearen Such-Vektor erlauben, die bakteriellen Zellen den durch den Such-Vektor übertragenen bzw. hervorgerufenen, nachweisbaren Phänotyp nicht aufweisen und die Mischung aus den bakteriellen Zellen und der Hybridisierungsmischung die Transformationsmischung darstellt;
D) Einstellen der Bedingungen der Transformationsmischung, um den Nachweis des phänotypisehen Markers zu ermöglichen, wobei der phänotypise he Marker nur durch transformierte Zellen zum Vorschein gebracht wird, wobei eine solche Mischung die Nachweismischung darstellt; und
E) Untersuchen der Nachweismischung auf das Vorliegen des phänotypisehen Markers.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Such-Vektor vom Typ nach Anspruch 2 ist, das Verfahren den Nachweis des Targets und ebenso das Klonieren des Bereichs W1WpW,...W des Targets zur Folge hat, wobei dieser Bereich einen komplementären Bereich auf dem Such-Vektor nicht aufweist.
5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Bakterien
Escherichia coLi sind und der Bereich Z ' « Z '->Ζ ', .. . Z ' des
ι i j ρ
Such-Vektors ein in E. coli funtionierendes Replikon und einen in E. coli nachweisbaren phänotypischen Marker enthält.
6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Bakterien Escherichia coli sind und der Bereich Z 1J '-,Z ', ... Z · des
I C D ρ
Such-Vektors.'ein in E. coli funktionierendes Replikon und einen in E. coli nachweisbaren phänotypischen Marker enthält.
7. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Bereich Z'-Z'pZ',...!1 des Such-Vektors das Replikon des Plasmids pBR322 und das AmpiciLIin-resistente Gen des Plasmids pBR322 enthält.
8. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Bereich
Z ',. Z ' pZ ' , . .. Z ' des Such-Vektors das Replicon des Plasmids pBR322 und das Ampici11in-resistente Gen des Plasmids pBR322 enthält.
9. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Nachweismischung auf Festagar-Plättchen aufgebracht wird, die derart formuliert sind, daß sie das Wachstum bakterieller Zellen, die durch das Target/Sueh-Vektor-Hybrid transformiert worden sind, jedoch nicht das Wachstum bakterieller Zellen, die durch dieses Hybrid nicht transformiert worden sind, erlauben, die Agar-Plättchen unter geeigneten Bedingungen inkubiert werden und die Anzahl bakterieller Kolonien auf den Plättchen bestimmt wird, wobei diese Anzahl ein Maß für die Menge der in der Probe vorhandenen Target-DNA darstellt.
10. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Nachweismischung auf Festagar-Plättchen aufgebracht wird, die derart formuliert sind, daß sie das Wachstum bakterieller Zellen,
die durch das Target/Such-Vektor-Hybrid transformiert worden sind, jedoch nicht das Wachstum bakterieller Zellen, die durch dieses Hybrid nicht transformiert worden sind, erlauben, die Agar-Plättchen unter geeigneten Bedingungen inkubiert werden und die Anzahl der bakteriellen Kolonien auf den Plättchen bestimmt wird, wobei diese Zahl ein Maß für die Menge der in der Probe vorhandenen Target-DNA darstellt.
11. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Nachweismischung auf Festagai—Plättchen aufgebracht wird, die derart formuliert sind, daß sie das Wachstum bakterieller Zellen, die durch das Target/Such-Vektor-Hybrid transformiert worden sind, jedoch nicht das Wachstum bakterieller Zellen, die durch dieses Hybrid nicht transformiert worden sind, erlauben, die Agar-Plättchen unter geeigneten Bedingungen inkubiert werden und die Anzahl der bakteriellen Kolonien auf den Plättchen bestimmt wird, wobei diese Zahl ein Maß für die Menge der in der Probe vorhandenen Target-DNA darstellt.
12. Verfahren nach A2nspruch 3, wobei die Nachweismischung auf Festagar-Plättchen aufgebracht wird, die das Antibiotikum Ampicillin in einer ausreichenden Menge vorliegend enthalten, um das Wachstum bakterieller Zellen, die durch das Target/Such-Vektor-Hybrid transformiert worden sind, zu erlauben, jedoch das Wachstum bakterieller Zellen, die durch dieses Hybrid nicht transformiert worden sind, zu verhindern, wobei das Hybrid ein Gen enthält, das bakteriellen Zellen, die das Hybrid beherbergen, Resistenz gegenüber Ampicillin verleiht; die Agar-Plättchen bei einer geeigneten Temperatur inkubiert werden und die Anzahl der gegenüber Ampicillin resistent en Kolonien bestimmt wird, wobei diese Zahl ein Maß für die Menge der in der Probe vorhandenen Target-DNA darstellt.
13. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Nachweismischung auf Festagar-PLättchen aufgebracht wird/ die das Antibiotikum Ampicillin in. einer ausreichenden Menge vorliegend enthalten, um das Wachstum bakterieller Zellen, die durch das Target/Sueh-Vektor-Hybrid transformiert worden sind, zu erlauben, jedoch das Wachstum bakterieller Zellen, die durch dieses Hybrid nicht transformiert worden sind, zu verhindern, wobei das Hybrid ein Gen enthält, das bakteriellen Zellen, die das Hybrid beherbergen, Resistenz gegenüber Ampicillin verleiht; die Agar-Plättchen bei einer geeigneten Temperatur inkubiert werden und die Anzahl der gegenüber Ampicillin resistenten Kolonien bestimmt wird, wobei diese Zahl ein Maß für die Menge der in der Probe vorhandenen Target-DNA darstellt.
14. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Nachweismischung auf Festagar-Plättchen aufgebracht wird, die das Antibiotikum Ampicillin in einer ausreichenden Menge vorliegend enthalten, um das Wachstum bakterieller Zellen, die durch das Target/Such-Vektor-Hybrid transformiert worden sind,zu erlauben, jedoch das Wachstum bakterieller Zellen, die durch dieses Hybrid nicht transformiert worden sind, zu verhindern, wobei das Hybrid ein Gen enthält, das bakteriellen Zellen, die das Hybrid beherbergen, Resistenz gegenüber Ampicillin verleiht; die Agar-Plättchen bei einer geeigneten Temperatur inkubiert werden und die Anzahl der gegenüber Ampicillin resistenten Kolonien bestimmt wird, wobei diese Zahl ein Maß für die Menge der in der Probe vorhandenen Target-DNA darstellt.
15. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Nachweismischung auf Festagar-Plättchen aufgebracht wird, die das Antibiotikum Ampicillin in einer ausreichenden Menge vorliegend enthalten, um das Wachstum bakterieller Zellen, die durch das Target/Such-Vektor-Hybrid transformiert worden sind, zu erlauben, jedoch das Wachstum bakterieller
Zellen, die durch dieses Hybrid nicht transformiert worden sind, zu verhindern, wobei das Hybrid ein Gen enthält, das bakteriellen Zellen, die das Hybrid beherbergen, Resistenz gegenüber Ampicillin verleiht; die Agar-Plättchen bei einer geeigneten Temperatur inkubiert werden und die Anzahl der gegenüber Ampicillin resistenten Kolonien bestimmt wird, wobei diese Zahl ein Haß für die Menge der in der Probe vorhandenen Target-DNA darstellt.
16. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Target aus DNA besteht.bzw. diese beinhaltet.
17. Verfahren nach den Ansprüchen 4,5,7 oder 12, wobei das Target aus DNA besteht bzw. diese beinhaltet.
18. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Target Viren-DNA
ist und wobei die Bereiche X' X1 ,,...Χ',Χ',Χ1, und
m m-i 5 ά ι
Y1 Y1 ....Υ',Υ',Υ1« des Such-Vektors zu einem Bereich der η η-ι 3 c λ
Viren-DNA komplementär sind.
19. Verfahren nach den Ansprüchen 4,5, 7 oder 16, wobei das Target Viren-DNA ist und wobei die Bereiche
Xl γ I Y1Y1Y' iinrlY'Y1 Y1Y1Y1 H P C
α _Λ···Α -ih ρΛ * una τ ι _ * ... τ ι' ρ' ι u"i>
Such-Vektors zu einem Bereich der Viren-DNA komplementär sind.
20. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Target Hepatitis B-DNA ist und der Such-Vektor Bereiche
X1 X1 ,...X' X' X' und Y1 Y1 ....Y' Y' Y' enthält, die m m-i 5 c \ η η—1 5 c \
zu einem Bereich der Hepatitis B-Viren-DNA oder zur gesamten Hepatitits B-Viren-DNA komplementär sind.
21. Verfahren nach den Ansprüchen 4, 5,7,12,16 oder 18, wobei das Target Hepatitis B-DNA ist und der Such-Vektor
Bereiche X1 X1 ,...X1,X' Χ« und Y1 Y1 ....Y' Y' Y" m m — t 5 c 1 η η-ι 3 2 1
enthält, die zu einem Bereich der Hepatitis B-Viren-DNA oder zur gesamten Hepatitits B-Viren-DNA komplementär sind.
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