DE69833606T2

DE69833606T2 - Fluoreszens-Energie-Transfer durch kompetitive Hybridisierung

Info

Publication number: DE69833606T2
Application number: DE69833606T
Authority: DE
Inventors: Chih-Sheng Vannuys Chiang; Jose F. Vannuys Cuan
Original assignee: Quest Diagnostics Investments LLC
Current assignee: Quest Diagnostics Investments LLC
Priority date: 1997-02-28
Filing date: 1998-03-02
Publication date: 2006-12-14
Anticipated expiration: 2018-03-03
Also published as: ES2396379T3; JPH10262700A; EP0861906B1; ES2259809T3; JP3016759B2; EP0861906A1; DE69833606D1

Description

UMFANG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft ungleich lange komplementäre Sonden, die einen Fluorophor auf der einen Sonde und einen Quencher auf der anderen Sonde aufweisen. Der Fluorophor und der Quencher liegen auf eine Weise nebeneinander, dass die Nähe des Quenchers zu dem Fluorophor die Fluoreszenz des Fluorophors quencht. Diese Sonden sind zur Detektion von Nukleotiden mit Sequenzkomplementarität verwendbar. Die Fähigkeit zur Detektion liegt in der kompetitiven Hybridisierung, die aus der Verwendung ungleichlanger Sonden Resultiert, sowie der anschließenden Verminderung im Quenchen, das durch diese kompetitive Hybridisierung hervorgerufen wird.
GEBIET DER ERFINDUNG
Verfahren zur Nukleinsäureamplifikation wurden zu der Gruppe von Techniken hinzugefügt, durch die sehr kleine Mengen eines Nukleotids zu einer Konzentration vervielfältigt werden können, bei der sie durch einige Mitteln detektiert werden können. Mehrere Amplifikationsverfahren wurden verfügbar. Die am meisten verbreitete Technik ist die der Polymerasekettenreaktion oder PCR, wie sie nunmehr üblicherweise bezeichnet wird. Während die Amplifikationsverfahren die zur Detektion zur Verfügung stehende Anzahl von Targetnukleotidsequenzen oder deren Wiedergewinnung und Verwendung erhöhen, wird eine sensitive Methode benötigt, um das Amplifikationsprodukt zu detektieren. Ferner profitieren Amplifikationsverfahren von der Überwachung des Amplifikationsprozesses in Echtzeit. Eine Überwachung in Echtzeit kann nicht-reaktive Amplifikationsläufe oder Ineffizienzen im Prozess detektieren. Eine Quantifizierung der Olionukleotidmenge (oligonucleotide burden) könnte ebenfalls mit einer Überwachung in Echtzeit möglich sein, falls solch eine Überwachung ohne Beeinträchtigung der Amplifikationsreaktion durchgeführt werden kann.
Das Verfahren dieser Erfindung basiert auf dem Fluoreszenzenergietransfer zwischen einer mit einem Fluorophor markierten Sonde und einer mit einem Quencher markierten Sonde, mit Sequenzkomplementarität zueinander. Die verwendeten Sonden weisen ungleiche Längen auf, was die Hybridisierung (annealing) einer Sonde an die Targetnukleinsäuresequenz gegenüber einer Hybridisierung an ihre komplementäre Sonde begünstigt. In der Abwesenheit von Nukleinsäuren mit Sequenzen, die zu den Sondensequenzen (Targetsequenz) komplementär oder identisch sind, würden die beiden Sonden aneinander hybridisieren. Wenn die beiden Sonden aneinander hybridisiert sind, erzeugt die Nähe des Quenchers zu dem Fluorophor ein Quenchen der Fluoreszenz des Fluorophors. In der Gegenwart einer Nukleinsäure mit Sequenzen, die zu der Sondensequenz komplementär oder identisch sind, wird ein Teil der mit dem Fluorophor markierten Sonde mit der komplementären Sequenz an die Nukleinsäure binden und vom Quencher getrennt werden und eine erhöhte (ungequenchte) Fluoreszenz ergeben. Dieser Unterschied in der Fluoreszenz kann zur spezifischen Detektion der Gegenwart von Nukleinsäuren mit den Targetsequenzen verwendet werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einem ersten Aspekt betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur Überwachung der Nukleinsäureamplifikation, das umfasst: Durchführen einer Nukleinsäureamplifikation eines Targetpolynukleotids mit Hilfe eines beliebigen Verfahrens, wobei die Amplifikation in der Gegenwart einer ersten Olionukleotidsonde und einer zweiten, kürzeren Olionukleotidsonde, die in ihrer Länge um mindestens zwei Basenpaare variieren, durchgeführt wird, was die Überwachung der Nukleinsäureamplifikation ermöglicht; die erste Sonde, die einen Fluorophor aufweist; die zweite Sonde, die zur ersten Sonde komplementär ist, und die ein Quencher-Molekül aufweist, das zum Quenchen der Fluoreszenz eines Fluorophors in der Lage ist, wobei der Fluorophor und der Quentscher an ihre entsprechenden Sonden an Positionen angeheftet sind, was in dem Quencher-Molekül ein Quenchen der Fluoreszenz des Fluorophors zur Folge hat, wenn die Sonden aneinander hybridisiert sind; wobei die längere Sonde vorzugsweise an das Targetpolynukleotid bindet, und wobei, wenn sie das Targetpolynukleotid vorzugsweise gebunden hat, die Fluoreszenzintensität des Fluorophors größer ist als die Fluoreszenzintensität des Fluorophors, wenn sie an die zweite hybridisiert hat; und Überwachen der Fluoreszenz des Fluorophors, wobei die Erzeugung von Fluoreszenz mit dem Auftreten einer Nukleinsäureamplifikation korrespondiert.
Sie betrifft ferner ein Verfahren zur Detektion der Gegenwart eines Targetpolynukleotids unter Verwendung ungleich langer Sonden.
Die hybridisierten Sonden mit dem Fluorophor und dem Quencher sind ebenfalls Teil dieser Erfindung.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 stellt das Fluoreszenzsignal dar, das aus einer PCR Amplifikation einer HCV Target-RNA unter Verwendung ungleich langer Sonden erhalten wurde, wobei die längere Sonde einen Fluorophor auf dem 5'-terminalen Kohlenstoffatom aufwies, und die kürzere Sonde einen Quencher auf dem 3'-terminalen Kohlenstoffatom aufwies und durch Deletion von drei Basenpaaren vom 5'-Terminus der längeren Sonde erzeugt wurde.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung wird in Verbindung mit der Amplifikation eines Targetpolynukleotids durch ein beliebiges Verfahren verwendet. Diese Amplifikationsverfahren umfassen PCR, Ligasekettenreaktion (LCR), Gap LCR, transkriptionsvermittelte Amplifikation (TAM), nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (NASBA) und Strangverdrängungsamplifikation (SDA, strand displacement amplification).
Die PCR ist von größtem Interesse. Die PCR wird in vielen Referenzen beschrieben, zum Beispiel in Innis et al., Hrsg., PCR Protocols (Academic Press, New York, 1989); Sambrook et al., Molecular Cloning, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989). Die Bindungsstelle der Olionukleotidsonde liegt zwischen den zur Amplifikation des Targetpolynukleotids verwendeten PCR Primern. Die PCR kann mit Hilfe einer beliebigen Polymerase durchgeführt werden. Da sich die Intensität des Fluoreszenzsignals intensiviert, je mehr Kopien (replicates) des Targetpolynukleotids hergestellt werden, wird eine beliebige Polymerase, welche die Anzahl von Targetpolynukleotiden erhöht, in diesem Verfahren funktionieren. Vorzugsweise wird die PCR unter Verwendung einer thermostabilen Polymerase durchgeführt. Das bevorzugte Enzym ist eine Taq DNA-Polymerase, z.B. Amplitaq^TM (Perkin-Elmer, Norwalk, Connecticut), oder eine äquivalente thermostabile DNA-Polymerase. Die Hybridisierungstemperatur der PCR liegt etwa 5 bis 10 Grad Celsius unterhalb der Schmelztemperatur der verwendeten Olionukleotidsonden. Die Polymerase Pwo kann ebenfalls mit Erfolg in dieser Erfindung verwendet werden.
Der Begriff "Oligonukleotid", wie hier verwendet, umfasst lineare Oligomere natürlicher oder modifizierter Monomere oder Verknüpfungen einschließlich Deoxyribonukleosiden, Ribonukleosiden und dergleichen, die zu einer spezifischen Bindung eines Targetpolynukleotids mittels eines regulären Musters von Monomer-zu-Monomer-Interaktionen im Stande sind, wie z.B. dem Watson-Crick-Typ der Basepaarung. Üblicherweise sind Monomere durch Phospordiesterbrücken oder Analoga davon verknüpft, um Oligonukleotide zu bilden, die in der Größe von einigen monomeren Einheiten, z.B. 3-4, bis zu mehreren Zehn monomeren Einheiten reichen. Wann immer ein Oligonukleotid durch eine Buchstabensequenz repräsentiert wird, wie z.B. "ATGCCTG", ist es selbstverständlich, dass die Nukleotides von links nach rechts in der 5' → 3'-Richtung angegeben sind, und dass "A" Deoxyadenosin, "C" Deoxycytidin, "G" Deoxyguanosin und "T" Deoxythymidin bezeichnet, außer, es ist etwas anderes angegeben. Analoga von Phosphodiesterverknüpfungen umfassen Phosphorthioat, Phosphordithioat, Phosphoranilidat, Phosphoramidat und dergleichen. Im Allgemeinen weisen die Oligonukleotidsonden der Erfindung an ihrem 5'-Ende eine ausreichende Anzahl von Phosphodiesterverknüpfungen auf, sodass die verwendete 5' → 3'-Exonukleaseaktivität die gebundene Sonde effizient degradieren kann, um die Reporter- und Quencher-Moleküle zu trennen.
"Perfekt übereinstimmend (matched)" in Bezug auf einen Duplex bedeutet, dass die den Komplex bildenden Poly- oder Oligonukleotidstränge eine doppelsträngige Struktur miteinander bilden, sodass jedes Nukleotid in jedem Strang eine Watson-Crick-Basenpaarung mit einem Nukleotid in dem anderen Strang ausbildet. Der Begriff umfasst ferner die Paarung von Nukleosidanaloga, wie z.B. Deoxyinosin oder Nukleoside mit 2-Aminopurinbasen und dergleichen, die verwendet werden können. Umgekehrt bedeutet ein "Mismatch" in einem Duplex zwischen einem Targetpolynukleotid und einer Oligonukleotidsonde oder einem Primer, dass ein Paar von Nukleotiden im Duplex keine Watson-Crick-Bindung ausbildet.
Die Oligonukleotidsonden der Erfindung können mit Hilfe einer Reihe von Ansätzen synthetisiert werden, siehe z.B. Ozaki et al., Nucleic Rcids Research, 20: 5205-5214 (1992); Agrawal et al., Nucleic Acids Research, 18: 5419-5423 (1990) oder dergleichen. Die Oligonukleotidsonden der Erfindung können auf bequeme Weise mit Hilfe eines automatischen DNA-Synthesegeräts synthetisiert werden, z.B. einem DNA/RNA-Synthesizer von Applied Biosystems, Incorporated Foster City, Kalifornien, Modell 392 oder 394, unter Verwendung einer Standardchemie, wie z.B. der Phosphoramiditchemie, welche z.B. in den folgenden Referenzen offenbart ist: Beaucage and Iyer, Tetrahedron, 48: 2223-2311 (1992); Molko et al., U.S. Pat. Nr. 4,980,460; Koster et al., U.S. Pat. Nr. 4,725,677; Caruthers et al., U.S. Pat. Nr. 4,415,732; 4,458,066; und 4,973,679; und dergleichen. Eine alternative Chemie, die z.B. nicht-natürliche Gruppen in der Gerüststruktur zur Folge hat, wie z.B. Phosphorthioat, Phosphoramidat und dergleichen, können ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt, dass die Hybridisierungseffizienzen der resultierenden Oligonukleotide und/oder die Spaltungseffizienzen der verwendeten Exonuklease nicht negativ beeinträchtigt werden. Vorzugsweise weist die Oligonukleotidsonde eine Länge im Bereich von 15-60 Nukleotiden auf. Noch bevorzugter weist die Oligonukleotidsonde eine Länge im Bereich von 18-30 Nukleotiden auf. Die genaue Sequenz und die Länge einer Oligonukleotidsonde der Erfindung hängen zum Teil von der Natur des Targetpolynukleotids ab, an das sie bindet. Die Bindestelle und die Länge können variiert werden, um die geeigneten Hybridisierung- und Schmelzeigenschafen für eine bestimmte Ausführungsform zu erreichen. Vorzugsweise ist das 3'-terminale Nukleotid der Oligonukleotidsonde blockiert oder ist zur Extension durch eine Nukleinsäurepolymerase nicht im Stande. Solch eine Blockierung wird üblicherweise durch das Anheften eines Reporter- oder Quencher-Moleküls an das 3'-terminale Kohlenstoffatom der Oligonukleotidsonde über eine Linkereinheit durchgeführt. Vorzugsweise sind Reporter-Moleküle fluoreszierende organische Farbstoffe, die für das Anheften an das 3'-terminale Kohlenstoffatom oder das 5'-terminale Kohlenstoffatoms einer Sonde über eine Linkereinheit derivatisiert wurden. Vorzugsweise sind Quencher-Moleküle ebenfalls organische Farbstoffe, die fluoreszierend sein können oder nicht, abhängig von der Ausführungsform der Erfindung. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist z.B. das Quencher-Molekül fluoreszierend. Ob das Quencher-Molekül fluoreszierend ist oder die transferierte Energie vom Reporter einfach über nicht-strahlenden Zerfall freisetzt, im Allgemeinen sollte die Absorptionsbande des Quenchers im Wesentlichen mit der fluoreszierenden Emissionsbande des Reportermoleküls überlappen. Nicht fluoreszierende Quencher-Moleküle, die Energie von angeregten Reportermolekülen absorbiern, die aber die Energie nicht über Strahlung freisetzen, werden hier als chromogene Moleküle bezeichnet. In der Literatur ist im hohen Maße praktische Anleitung zur Auswahl geeigneter Reporter/Quencher-Paare für spezielle Sonden verfügbar, wie z B. exemplarisch in den nachfolgenden Referenzen dargestellt: Clegg "Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids, " Methods of Enzymology, 221: 353-389 (1992), Wu et al.; "Resonance energy transfer: methods and applications", Anal. Biochem. 218: 1-13 (1994).; Pesce et al., Hrsg., Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); und dergleichen. Die Literatur umfasst ferner Referenzen mit erschöpfenden Listen fluoreszierender und chromogener Moleküle sowie deren relevanter optischer Eigenschaften zur Auswahl von Reporter/Quencher-Paaren, z.B. Berlman, Handbook of Fluorescence Sprectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Colour and Consitution of Organic Molecules (Academic Press, New York 1976); Bishop, Hrsg., Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); und dergleichen. Ferner gibt es in der Literatur umfassende Anleitungen zur Derivatisierung von Reporter- und Quencher-Molekülen für die kovalente Anheftung über herkömmliche reaktive Gruppen, die an ein Oligonukleotid angefügt werden können, wie exemplarisch in den folgenden Referenzen dargestellt: Haugland (oben zitiert); Ullman et al., U.S. Pat. Nr. 3,996,345; Khanna et al., U.S. Pat. Nr. 4,351,760.
Exemplarische Reporter/Quencher-Paare können aus den Xanthen-Farbstoffen einschließlich der Fluoresceine und der Rhodamin-Farbstoffe ausgewählt werden. Viele geeignete Formen dieser Verbindungen sind mit Substituenten an ihren Phenyleinheiten, die als Bindungsstellen oder als Bindungsfunktionalität zur Anheftung eines Oligonukleotids verwendet werden könne, verbreite kommerziell verfügbar. Eine weitere Gruppe fluoreszierender Verbindungen sind die Naphthylamine, die eine Aminogruppe in der Alpha- oder der Beta-Position aufweisen. Eingeschlossen in solche Naphthylaminoverbindungen sind 1-Dimetylaminonaphthyl-5-sulfonat, 1-Anilin-8-naphthalensulfonat und 2-p-Touidinyl-6-naphthalensulfonat. Weitere Farbstoffe umfassen 3-Phenyl-7-isocyanatocoumarin, Acridine, wie z.B. 9- Isothiocyanatoacridin und Acridinorange, N-(p-(2-Benzoxazolyl)phenyl)maleimid, Benzoxadiazole, Stilbene, Pyrene und dergleichen. Vorzugsweise werden die Reporter- und Quencher-Moleküle aus Fluorescein- und Rhodamin-Farbstoffen ausgewählt. Diese Farbstoffe und geeignete Verknüpfungsverfahren zur Anheftung an Oligonukleotide werden in vielen Referenzen beschrieben, z.B. in Khanna et al. (oben zitiert); Marshall, Histochemical J., 7: 299-303 (1975); Mechnen et al., U.S. Pat. Nr. 5,188,934; Mechnen et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 87 310 256.0; und Bergot et al., Internationale Anmeldung PCT/US90/05565. Die letzteren vier Dokumente werden hier durch Bezugnahme eingeschlossen.
Es gibt zahlreiche Verknüpfungseinheiten und Verfahren zur Anheftung von Reporter- oder Quencher-Molekülen an die 5'- oder 3'-Termini von Oligonukleotiden, wie beispielhaft in den folgenden Referenzen dargestellt: Eckstein, Hrsg., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991); Zuckerman et al., Nucleic Acids Research 15: 5305-5321 (1987) (3'-Thiolgruppe an das Oligonukleotid); Sharma et al., Nucleic Rcids Research 19: 3019 (1991) (3'-Sulfhydryl); Giusti et al., PCR Methods and Applications, 2:223-227 (1993) und Fung et al., U.S. Pat. Nr. 4,757,141 (5'- Phosphoaminogruppe via Aminolink^TM.II verfügbar von Applied Biosystems, Foster City, Kalif.); Stabinsky U.S. Pat. No. 4,739,044 (3'-Aminoalkylphosphorylgruppe); Agrawal et al., Tetrahedron Letters 31: 1543-1546 (1990) (Anheftung via Phosphoramidatverknüpfungen); Sproat et al., Nucleic Acids Research, 15: 4837 (1987) (5'-Mercaptogruppe); Nelson et al., Nucleic Acids Research 17: 7187-7194 (1989) (3'-Aminogruppe); und dergleichen. Vorzugsweise werden kommerziell verfügbare Verknüpfungseinheiten verwendet, die während der Synthese an das Oligonukleotid angeheftet werden können, z.B. verfügbar von Clontech Laboratories (Palo Alto, Kalifornien).
Rhodamin- und Fluorescein-Farbstoffe werden ebenfalls am Ende der Festphasensynthese mit Hilfe von Farbstoffen, die mit einer Phosphoramiditeinheit derivatisiert wurden, auf einfache Weise an das 5'-Hydroxyl eines Oligonukleotids angeheftet, siehe z.B. Woo et al., U.S. Pat. Nr. 5,231,191, und Hobbs, Jr. U.S. Pat. Nr. 4,997,928.
Die Auswahl der in dieser Erfindung verwendeten Primer und Sonden liegt in der Hand des Ausführenden. Diese Erfindung beinhaltet keine besonderen Erfordernisse oder Einschränkungen hinsichtlich der Auswahl der Primer oder der Sonden. Solche Auswahlverfahren sind im Stand der Technik bekannt.
Die Sonden können eine beliebige Länge aufweisen, solange dies die Durchführung der Erfindung ermöglicht. Als Minimum (baseline) muss die längere Sonde mindestens drei Basenpaare aufweisen. Aus praktischer Überlegung wird die längere Sonde jedoch aus mehr als drei Basenpaaren bestehen. Es gibt jedoch kein oberes Limit, wie durch die Verwendung von FETCH gezeigt wurde. Die Länge der längeren Sonde wird durch die Anwendung von FETCH nicht vorgeschrieben, da dieses mit einer beliebigen Sondenlänge ober- und unterhalb des Grunderfordernisses einer Länge von mindestens drei Basenpaaren funktioniert. Aus praktischen Gründen wird die längere Sonde eine Länge aufweisen, die sicherstellt, dass sie auf einzigartige Weise mit dem Targetpolynukleotid und der kürzeren Sonde hybridisiert. Die kürzere Sonde weist mindestens zwei Basenpaare weniger auf als die längere Sonde. Dies ist der Minimalstandard (basic standard) zur Herstellung der kürzeren Sonde. Es wurde festgestellt, dass ein gutes Zusammenpassen im Hinblick auf die Längendifferenz zwischen den Sonden durch Berechnen der Dissoziationstemperatur der hybridisierten Sonden erreicht werden kann. Als allgemeine Regel muss die Dissoziationstemperatur der Primer höher als etwa 55°C und niedriger als 90°C sein. Ein geeignetes Mittel zur Durchführung dieser Berechnung ist die Verwendung einer Software mit der Bezeichnung Gene Runner (Hastings Software, Inc.), z.B. die Version 3.04.
Das kürzere Gen kann eine 5'-trunkierte Form des längern Gens sein, oder es kann eine 3'-trunkierte Form sein. Eine dritte Option ist die Herstellung der kürzeren Sonde durch Trunkieren sowohl des 5'- als auch des 3'-Endes des längeren Gens. Jede dieser drei Formen der kürzeren Sonde funktioniert. Während zwei oder mehr trunkierte Formen verwendet werden könnten, ist es am einfachsten, nur eine Form zu verwenden, vorzugsweise die 5'-trunkierte Form.
Der Fluorophor und der Quencher können auf einer beliebigen Kombination von Basenpaaren lokalisiert sein, solange die Fluoreszenz des Fluorophors durch den Quencher effektiv gequencht wird, wenn die beiden Sonden hybridisiert sind. Der einfachste Ansatz ist es, den Fluorophor auf das 5'-terminale Nukleotid der längern Sonde und den Quencher auf das 3'-terminale Nukleotid der kürzeren Sonde zu setzen. Dieser Ansatz kann den Effekt des Quencher-Moleküls auf die Fluoreszenz des Fluorophors optimieren. Vorzugsweise werden Fluorophor und Quencher-Moleküle über 5'- und 3'-Linkereinheiten an das 5'-terminale Kohlenstoffatom und das 3'-terminale Kohlenstoffatom der Sonde angeheftet. Es wurde jedoch zumindest mit einer Reihe hier zweckdienlicher Fluorophore gezeigt, dass der Fluorophor und der Quencher auch voneinander entfernt und doch operativ positioniert sein können. Siehe dazu z.B. das U.S. Patent Nr. 5,538,848, das offenbart, dass ein Fluorophor und ein Quencher mehrere Nukleotide voneinander getrennt sein können. Dieses Patent offenbart eine Arbeit, in der ein Fluorophor und ein Quencher mindestens 15 Nukleotide oder mehr voneinander entfernt sind, und zeigt vermeintlich dennoch eine Verwendbarkeit. In ähnlicher Weise können hier der Fluorophor und der Quencher zahlreiche Nukleotide voneinander getrennt sein, solange diese Trennung die Fähigkeit des Quenchers, das Signal des Fluorophors zu beeinflussen, wenn die beiden Sonden hybridisiert sind, nicht wesentlich reduziert. Natürlich könnte der Fluorophor und/oder Quencher an ein Nukleotid im Inneren der Sonden gebunden werden. Aus Gründen der Einfachheit der Synthese und zur Optimierung der Hybridisierung von Sonde/Target und Sonde/Sonde wird es jedoch bevorzugt, den Fluorophor und den Quencher an die 5'- und 3'-terminalen Enden der Sonden zu setzen, wie oben angemerkt. Der Assay ist auch funktionell, wenn sowohl der Fluorophor als auch der Quencher auf den 5'- oder 3'-terminalen Nukleotiden ihrer entsprechenden Oligonukleotide liegen. Eine alternative Anordnung wäre es, den Fluorophor auf die kürzere Sonde und den Quencher auf die längere Sonde zu setzen. In dieser Anordnung würde die länger Sonde wiederum vorzugsweise an das Target binden, und dadurch ausreichend von der Sonde mit dem Fluorophor getrennt sein, um dessen Fluoreszenz nicht effektiv zu quenchen. Das bevorzugte Konstrukt ist es jedoch, den Fluorophor auf der längeren Sonde zu haben.
Der Assay kann durch Variieren des Verhältnisses zwischen der Sonde mit dem Quencher und der Fluorophor-Sonde optimiert werden. Ein 1:1 Verhältnis ergab gute Ergebnisse. Es wurde jedoch festgestellt, dass ein 2:1 Verhältnis der Quencher-Sonde zur Fluorophor-Sonde bessere Ergebnisse erbrachte. Während dieser Aspekt der Erfindung nicht optimiert wurde, wurde festgestellt, dass ein Fachmann in der Lage ist, einen gegebenen Assay durch Routineuntersuchung verschiedener Verhältnisse zu optimieren.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Illustration der Erfindung und sind nicht als Einschränkung des beanspruchten Schutzumfangs der Erfindung zu verstehen.
BEISPIELE
Allgemeine Beschreibung
Die Verwendung des Fluoreszenzenergietransfers durch kompetitive Hybridisierung (FETCH) wurde als ein Assay zur Detektion des Hepatitis C Virus (HCV) in humanen Proben mit Hilfe von PCR entwickelt. Die "Vorwärts"-Sonde (forward probe), die längere Sonde, wies einen 6-FAM Farbstoff (Carboxyfluorescein) an der 5'-Position und eine Phosphatgruppe an der 3'-Position auf (um die Extension während der PCR zu verhindern). Die "Rückwärts"-Sonde (reverse probe), die kürzere Sonde, wies einen TAMRA Farbstoff (N,N,N',N'-Tetramethyl-6-carboxyrhodamin) an der 3'-Position auf (kein 3'-OH, sodass keine Extension während der PCR möglich ist). FAM, ein üblicherweise verwendeter fluoreszierender Farbstoff, wurde als Fluorophor verwendet. TAMRA, ein fluoreszierender Farbstoff mit einer Absorptionsbande, welche die Emissionsbande von FAM überlagert, wurde als Quencher in dieser Anwendung verwendet.
BEISPIEL 1
Selektion der Primer und Sonden
Die HCV Polynukleotidsequenzen wurden anhand der Literatur identifiziert. Um einen Assay zu haben, der alle bekannten HCV Stämme abdeckt, wurden zwei Primer und zwei Sonden ausgewählt, die Polynukleotidsequenzen aufwiesen, welche den RNA-Sequenzen aller bekannten Stämme gemeinsam sind. Die Primer wurden so ausgewählt, dass sie an alle bekannten HCV Stämme hybridisieren würden, und dass sie entsprechende Eigenschaften besitzen, wie zum Beispiel eine ähnliche Dissoziationstemperatur, keine extensive 3'-Komplementarität zueinander usw. Die ausgewählten Primer flankieren ein 254 Basenpaarsegment in der 5' nicht-kodierenden Region von HCV von Nukleotid Nummer 3290 bis 3543, wie in der Literatur beschrieben. Die verwendeten HCV Sequenzdaten, die Primer und die ausgewählten Sonden werden in den nachfolgenden Tabellen I(beigefügt), II und IV dargestellt. Tabelle II
Tabelle III
Die unkonventionelle Darstellung der Sequenz von C2 (von 3' → 5') dient der Veranschaulichung ihrer Komplementarität zu C1. Tabelle IV
Die Molekulargewichte wurden mit Hilfe der Gene Runner Version 3.04 (Hasting Software, Inc.) berechnet.
BEISPIEL 2
Synthese der Sonden
Zwei Sonden wurden in Auftragssynthese bei TriLink Biotechnologies, Inc. (11585 Sorrento Valley Rd., Suite 105, San Diego, CA 92121) synthetisiert. Sie wurden wie folgt hergestellt:
Schritt 1: Synthese des Oligonukleotids
Das Oligonukleotid wurde auf einem Träger hergestellt, der nach dem Entschützen eine 3'-Phosphatgruppe ergab (Glen Research Katalog Nr. 20-2913).
Schritt 2: Hinzufügen von 6-FAM
Das an den Träger gebundene Oligonukleotid wurde im Anschluss manuell mit 15 Äquivalenten 6-FAM Amidit (Glen Research Katalog Nr. 10-5901) umgesetzt, um eine hohe Effizienz sicherzustellen.
Schritt 3: Entschützen des Oligonukleotids
Das mit FAM markierte Oligonukleotid wurde 36 Stunden bei Raumtemperatur mit frischem konzentrierten Ammoniumhydroxid entschützt. Nach dem Entschützen wurde das Reagenz dekantiert, die Partikel (beads) gewaschen, und die vereinigten Lösungen getrocknet.
Schritt 4: Reinigung
Das mit FAM markierte Oligonukleotid wurde mit Hilfe einer Reversphasen HPLC gereinigt. Das FAM lag nur auf dem vollständigen Material vor und war eine hilfreiche lipophile Handhabe, die eine gute Abtrennung ermöglichte. Nach der Reinigung wurde die Verbindung in der Präparation für die Präzipitation getrocknet. Die Verbindung wurde unter Verwendung von Ethanol aus 0.3 M NaOAc präzipitiert. Das Produkt wurde durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation gewonnen und zweimal mit Ethanol gewaschen.
Schritt 5: Finale Analyse
Das getrocknete Produkt wurde in Wasser resuspendiert, quantifiziert und mittels HPLC auf seine Reinheit untersucht. Die Verbindung wurde im Anschluss erneut in der Präparation für die Auslieferung getrocknet.
BEISPIEL 3
Detektion von HCV-RNA mittels Reverser Transkriptase-PCR unter Verwendung von FETCH
Dieser Assay wurde als eine Einschritt-Reaktion aus reverser Transkription und Polymerasekettenreaktion durchgeführt. Die HCV-RNA wurde aus humanen Serum oder Plasma isoliert und gereinigt. Die Serum- oder Plasmaprobe wurde unter hochgradig denaturierenden Bedingungen lysiert, um RNasen zu inaktivieren und die Isolation intakter RNA sicherzustellen. Die RNA wurde mit Ethanol präzipitiert und auf eine QIAmp Zentrifugationssäule (Qiagen, Chatsworth, CA) transferiert, die RNA bindet. Die Säule wurde im Anschluss gewaschen und die RNA mit Wasser isoliert. Das gereinigte RNA- Template (10 μl) wurde mit dem HCV Mastemix (40 μl, siehe Tabelle V) gemischt und im Anschluss revers in DNA transkribiert, mittels PCR amplifiziert und im gleichen Röhrchen in einem Perkin Elmer 7700 Sequenzanalysegerät detektiert, wie in Tabelle VI dargestellt. Während der PCR hybridisierten ein Teil der mit FAM markierten Sonde und ein Teil der mit TAMRA markierten Sonde mit dem PCR-Produkt, wodurch das Quenchen der FAM-Floureszenz reduziert und die Detektion einer höheren Floureszenz ermöglicht wurde. Die Fluoreszenz von FAM steigt mit der Anzahl an Zyklen im Thermocycler, was mit einem Anstieg der Menge an PCR Produkt einhergeht, wie in 1 dargestellt. Tabelle V
TaqMan ist eine eingetragene Marke von Roch Molecular Systems, Inc. Tabelle VI

Claims

Verfahren zur Überwachung der Nukleinsäureamplifikation, das umfasst: – Durchführen einer Nukleinsäureamplifikation eines Targetpolynukleotids mit Hilfe eines beliebigen Verfahrens, wobei die Amplifikation in der Gegenwart einer ersten Oligonukleotidsonde und einer zweiten, kürzeren Oligonukleotidsonde, die in ihrer Länge um mindestens 2 Basenpaare variieren, durchgeführt wird, was die Überwachung der Nukleinsäureamplifikation ermöglicht; – die erste Sonde, die einen Fluorophor aufweist; – die zweite Sonde, die zur ersten Sonde komplementär ist, und die ein Quencher-Molekül aufweist, das zum Quenchen der Fluoreszenz des Fluorophors in der Lage ist, wobei der Fluorphor und der Quencher an ihre entsprechenden Sonden an Positionen angeheftet sind, was in dem Quencher-Molekül ein Quenchen der Fluoreszenz des Fluorophors zur Folge hat, wenn die Sonden aneinander hybridisiert sind; – wobei die längere Sonde vorzugsweise an das Targetpolynukleotid bindet, und wobei, wenn sie das Targetpolynukleotid vorzugsweise gebunden hat, die Fluoreszenzintensität des Fluorophors größer ist als die Fluoreszenzintensität des Fluorophors, wenn sie an die zweite Sonde hybridisiert ist; und – Überwachen der Fluoreszenz des Fluorophors, wobei die Erzeugung von Fluoreszenz mit dem Auftreten einer Nukleinsäureamplifikation korrespondiert.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Nukleinsäurepolymerase eine thermostabile Nukleinsäurepolymerase ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Fluorophor auf der ersten Sonde und das Quencher-Molekül auf der zweiten Sonde am selben hybridisierten Basenpaar liegen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Fluorophor und Quencher-Moleküle innerhalb von 1 bis 3 hybridisierten Basenpaaren voneinander entfernt liegen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Fluorophor und Quencher-Moleküle innerhalb von 3 oder mehr hybridisierten Basenpaaren voneinander entfernt liegen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Fluorophor am 5'-terminalen Nukleotid der ersten Sonde liegt, und der Quencher am 3'-terminalen Nukleotid der zweiten Sonde liegt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Fluorophor am 3'-terminalen Nukleotid der ersten Sonde liegt, und der Quencher am 5'-terminalen Nukleotid der zweiten Sonde liegt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die zweite Sonde komplementär zur ersten Sonde ist, verkürzt durch Deletion von 3 oder mehr 5'-terminalen Nukleotiden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die zweite Sonde komplementär zur ersten Sonde ist, verkürzt durch Deletion von 3 oder mehr 3'-terminalen Nukleotiden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die zweite Sonde komplementär zur ersten Sonde ist, verkürzt durch Deletion von 3 oder mehr 5'-terminalen Nukleotiden und Deletion von 1 oder mehr 3'-terminalen Nukleotiden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die erste und die zweite Sonde einen Unterschied in der Dissoziationstemperatur von 2 Grad oder mehr aufweisen.
Verfahren zur Detektion der Gegenwart spezifischer Nukleinsäuresequenzen in einer vorbereiteten Nukleinsäureprobe, das umfasst: – Einbringen einer Probe aus Nukleinsäuren in eine geeignete Lösung und Inkubieren mit einer ersten Oligonukleotidsonde und einer zweiten, kürzeren Oligonukleotidsonde, die in ihrer Länge um mindestens 2 Basenpaare variieren; – die erste Sonde, die einen Fluorophor aufweist; – die zweite Sonde, die zur ersten Sonde komplementär ist, und die ein Quencher-Molekül aufweist, das zum Quenchen der Fluoreszenz des Fluorophors in der Lage ist, wobei der Fluorophor und der Quencher an ihre entsprechenden Sonden an Positionen angeheftet sind, was in dem Quencher-Molekül ein Quenchen der Fluoreszenz des Fluorophors zur Folge hat, wenn die Sonden aneinander hybridisiert sind; – wobei die längere Sonde vorzugsweise an das Targetpolynukleotid bindet, und wobei, wenn sie das Targetpolynukleotid vorzugsweise gebunden hat, die Fluoreszenzintensität des Fluorophors größer ist als die Fluoreszenzintensität des Fluorophors, wenn sie an die zweite Sonde hybridisiert ist; und – Überwachen der Fluoreszenz des Fluorophors, wobei die Erzeugung von Fluoreszenz mit der Gegenwart spezifischer Nukleinsäuresequenzen korrespondiert.