DE60031282T2

DE60031282T2 - 2-azapurine verbindungen und ihre verwendung

Info

Publication number: DE60031282T2
Application number: DE60031282T
Authority: DE
Inventors: Frank Seela; Helmut Rosemeyer; Enno Schweinberger; Dieter Heindl; Frank Bergmann
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1999-08-30
Filing date: 2000-08-28
Publication date: 2007-05-03
Anticipated expiration: 2020-08-29
Also published as: ES2272322T3; DE60031282D1; EP1214331A2; CA2384407A1; EP1214331B1; CA2384407C; US7169553B1; US20090306360A1; WO2001016149A2; WO2001016149A3; US7612187B2; JP4202646B2; US20070015725A1; US7847075B2; ATE342271T1; JP2003508405A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine nukleinsäurebindende Verbindung, umfassend 2-Azapurine, eine Verbindung, die sich zur Herstellung einer solchen Verbindung eignet, ein Bindungsprodukt dieser nukleinsäurebindenden Verbindung mit einer Nukleinsäure, ein Verfahren zur Bestimmung einer Nukleinsäure mit der Verbindung und mehrere Verwendungen der 2-Azapurin-Verbindungen.
Einige 2-Azapurin-Verbindungen sind im Stand der Technik bekannt. In Chemistry of Nucleosides and Nucleotides (Bd. 2, S. 288–297 und S. 319) gibt es einige Beispiele für 2-Azapurin-Nukleoside. Es werden jedoch keine 7-Deaza-2-azapurin-Nukleoside offenbart.
In Biochimica et Biophysica Acta, 520 (1978), S. 441–451, ist die enzymatische Synthese von 2-Azaadenosin-5'-diphosphat und 2-Azainosin-5'-diphosphat und ihre Polymerisation in Homopolymere mittels E. coli-Polynukleotidphosphorylase offenbart. Dieses Verfahren ist komplex, und es kann keine Mischsequenzen produzieren. Zudem wurde die Fähigkeit der Homopolymere zur Bildung doppel- und dreisträngiger Komplexe mit anderen Homopolymeren beschrieben. Solche Verbindungen, die nur 2-Azaadenosin als Basis enthalten, haben sich als UV-empfindlich und labil erwiesen.
In J. Org. Chem. 1995, 60, 6262–6269 sind die Synthese und biophysikalischen und biologischen Eigenschaften von Oligonukleotiden offenbart, die 2-Aza-2'-desoxyinosin enthalten. Es wird ein 2-Azainosin-Nukleosid offenbart, das durch eine bestimmte photochemisch spaltbare Schutzgruppe an einem der Ring-Stickstoffatome modifiziert ist. Wie aus der Tabelle I auf Seite 6266 hervorgeht, unterscheidet I^Az nicht gut zwischen den natürlichen Nukleobasen. Weiterhin ist es ersichtlich, dass die Stabilität des Basenpaars I^Az/G um 13° kleiner ist als die des normalen Basenpaars C/G und um 9° kleiner als die des Basenpaars A/T. Der Austausch von C durch I^Az eignet sich daher nicht, um die Stabilität eines A/T-Basenpaars nachzuahmen.
In Liebigs Ann. Chem. 1990, 647–651 sind 2-Azaadenin und ein Nukleosid von Methylthioimidazotriazin sowie die entsprechende Methoxyverbindung offenbart. Keine Phosphate oder Phosphoramidite sind offenbart. Zudem wird nicht offenbart, wie man Oligonukleotide herstellt, die 2-Azaadenosin an bestimmten Stellen enthalten. Ihr Hybridisierungsverhalten ist nicht offenbart. Zudem ist 2-Aza-2'-desoxyadenosintriphosphat nicht offenbart.
In J. Org. Chem., Bd. 60, Nr. 20, 1995, S. 6262–6269 sind die Synthese und die biophysikalischen und biologischen Eigenschaften von Oligonukleotiden offenbart, die 2-Aza-2-desoxyinosin enthalten.
In Nucleosides and Nucleotides, Bd. 14, Nr. 3–5, S. 821–824, ist die Herstellung von Oligonukleotiden offenbart, die 2-Aza-2'-hypoxanthin enthalten.
In Tetrahedron Bd. 47, Nr. 42, 1991, S. 8917–8930, ist die Herstellung von Oligonukleotiden offenbart, die 2-Aza-2'-desoxyinosin enthalten.
Biochemical Pharmacology, Bd. 25, Nr. 5, 1976, S. 517–521 offenbart Nukleoside von 2-Azapurinen und untersucht die Cytotoxizitäten und Aktivitäten als Substrate für Enzyme, die Purin-Nukleoside metabolisieren, offenbart aber keine Oligonukleotide, die 2-Azaadenosin enthalten, oder Verbindungen, die sich zu deren Synthese eignen, oder Verfahren, bei denen diese Oligonukleotide verwendet werden können.
In J. of Med. Chem. Bd. 18, Nr. 6, 1975, S. 564–567 sind Nukleoside von 2-Azapurinen offenbart.
Bioorganic & Medicinal Chem., Bd. 4, Nr. 10, 1996, S. 1725–1731, offenbart die Synthese und biologische Bewertung von Imidazopyridazinen und Triazolopyridazinen, die in Bioorganic & Medicinal Chem. Bd. 4, Nr. 10, 1996, S. 1725–173, und in J. of Org. Chem., Bd. 25, Nr. 4, 1960, S. 579–582 offenbart wurden.
In Liebigs Ann. Chem., Nr. 7, 1990, S. 647–651, sind 2-Aza-2'-desoxyadenosine offenbart, es sind jedoch weder Oligonukleotide offenbart, die sie enthalten oder Verbindungen, die sich zu deren Synthese eignen, noch irgendwelche Verfahren, bei denen diese Verbindungen verwendet werden können.
Die vorliegende Erfindung eignet sich besonders bei Nukleinsäure-Bestimmungen, beispielsweise bei Analytiken, insbesondere auf dem Gebiet der Gesundheitsfürsorge. Nukleinsäuren haben sich als geeignete Analyten zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Genen oder Mikroorganismen in humanen Körperflüssigkeiten, Nahrung oder in der Umwelt erwiesen. Die Nukleinsäureanalyse nach der Einführung der Nukleinsäure-Amplifikation, wie die Polymeraskettenreaktion (PCR, siehe US-A-4,683,202) findet weit verbreitete Verwendung. Dadurch sind von jeder Probe hinreichende Mengen Nukleinsäuren verfügbar. Die Nukleinsäuren können aus dieser vorbehandelten Probe mit einer Anzahl verschiedener Techniken bestimmt werden, und zwar je nach dem entsprechenden Zweck. Die meisten Tests erfordern die Verwendung einer Sonde, die entweder immobilisiert oder immobilisierbar ist oder die durch Bindung von einer oder mehreren Reportergruppen markiert ist. Eine Reportergruppe hat die Eigenschaften, daß sie selbst bestimmt werden kann, oder dass sie mit Reagentien umgesetzt werden kann, die die Sonde über die Reportergruppe bestimmbar machen. Somit können beispielsweise durch Reportergruppen markierte Sonden bestimmt werden, wie beispielsweise Hybride, die die Sonde und eine zu bestimmende Nukleinsäure enthalten können. Bei immobilisierten Sonden wird das Hybrid zwischen der Sonde und der zu bestimmenden Nukleinsäure an der Festphase bestimmt, an der die Sonde gebunden ist. Bei einer besonderen Form von Tests wird nicht nur eine Nukleinsäure mit einer spezifischen Sequenz, sondern eine große Zahl von Nukleinsäuren mit verschiedenen Sequenzen bestimmt. Für diesen Zweck werden die Sonden in winzigen Spots in einer Anordnung auf der flachen Oberfläche, wie einem Glas-Chip, immobilisiert (EP-A-0 476 014 und TIBTECH (1997), Bd. 15, 465–469).
Das grundlegende Prinzip der Verwendung von Oligonukleotid-Anordnungen wurde zuerst in den späten 1980er Jahren vorgeschlagen, als das Konzept der Bestimmung einer DNA-Sequenz durch Hybridisierung an einen umfangreichen Satz an Oligonukleotiden (SBH, Sequenzierung durch Hybridisierung) entwickelt wurde.
Es gibt viele Vorschläge, die anstelle der natürlichen Nukleobasen modifizierte oder nicht-natürliche heterozyklische Gruppen enthalten. Beispiele für solche nicht-natürlichen Gruppen sind 7-Deaza-dGTP, die beim Einbringen in eine Nukleinsäure, die dGTP ersetzt, die Bandenkompression bei Sequenzierungsgelen reduziert (EP-B-0-286 028).
Nukleinsäurebestimmungen leiden allgemein an dem Problem, dass die möglichen Basenpaarungen zwischen den natürlichen Basen A und T und C und G unterschiedliche Stabilität aufweisen. Dies kann der unterschiedlichen Fähigkeit der Basen zur Bildung von Wasserstoffbrücken zugeordnet werden. Somit hat das dA-dT-Basenpaar zwei Wasserstoffbrücken, wohingegen das dG-dC-Basenpaar drei Wasserstoffbrücken aufweist. Dies führt je nach dem GC-Gehalt zu verschiedenen Schmelztemperaturen (Tm) der Hybride. Je höher der GC-Gehalt, desto höher die Tm. Bei Routine-Nukleinsäure-Analysen möchte man jedoch die Tm für Nukleinsäuren der gleichen Länge oder sogar unabhängig von der Länge der Nukleinsäure oder der Bindungsregion angleichen, sodaß man ähnliche Hybridisierungsbedingungen für alle Tests schafft. Dies ist besonders notwendig für Tests, die Anordnungen verwenden, da die Hybridisierungsbedingungen an solchen Anordnungen für jede Sonde identisch sein müssen.
Eine Lösung war der Einsatz niedriger Hybridisierungstemperaturen. Unter solchen Bedingungen binden viele Nukleinsäuren mit einem niedrigen Grad an Sequenzkomplementarität an die Sonde. Dieses wird als unspezifische Bindung bezeichnet, die keine Unterscheidung zwischen ähnlichen Sequenzen ermöglicht.
Ein weiterer Vorschlag betraf die Verwendung von Chemikalien in dem Hybridisierungsgemisch, beispielsweise die Zugabe von Tetramethylammoniumchlorid (TMAC). Dieses Reagens reduziert die Differenz zwischen der Stabilität von dG-dC und dA-dT-Basenpaaren, jedoch ist die Wirkung für kurze Oligonukleotide unzureichend. Zudem kann die Zugabe von Salzen, wie TMAC, nicht begrüßenswert sein, da dies die Optimierung des Tests verkompliziert.
Ein weiterer Vorschlag betraf die Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen jeder verschiedenen (immobilisierten) Sonde in einem Test. Dies wurde auf einer Chip-Oberfläche als technisch komplex, wenn nicht gar als unmöglich befunden.
Als weitere Möglichkeit wurde die Substitution von Ribonukleotiden in einem Oligonukleotid, bestehend aus Desoxyribonukleotiden und umgekehrt, bei der Anpassung der DNA-Stabilität verwendet, Hoheisel (1996), Nucleic Acids Res. 24, 430–432.
Sämtliche nun bekannten Vorschläge haben einige Nachteile. Es gibt aber immer noch einen Bedarf an Sonden, deren Tm nicht sehr von ihrem GC-Gehalt abhängt.
1 zeigt, wie z²A_d zur Basenpaarung mit einem dG in einem anderen Strang einer Nukleinsäure fähig ist.
In 2 sind verschiedene erfindungsgemäße Verbindungen gezeigt, wie 2-Aza-2'-desoxyadenosin (2), das entsprechende Triphosphat (11), ein Phosphoramidit zur Einbringung von 2-Aza-2'-desoxyadenosin in Oligonukleotide, während herkömmlicher chemischer automatisierter Synthese (10b) und ein H-Phosphonat (12).
3 zeigt erfindungsgemäß geeignete Verbindungen. Die Purinnnumerierung für Verbindung 2 und die systematische Numerierung für Verbindung 3 sind angegeben.
4 zeigt einen Syntheseweg für 2-Aza-2'-desoxyadenosin.
5 zeigt erfindungsgemäße Verbindungen.
6 zeigt einen Vergleich der Bindung von z²A_d mit dG und dG mit isoG_d in antiparalleler Bindung.
7 zeigt, dass z²A_d ebenfalls in einem Parallelmodus an isoG_d binden kann, im protonierten Zustand an dC im Parallelmodus binden kann und im protonierten Zustand an isoC_d im Antiparallelmodus binden kann.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist eine nukleinsäurebindende Verbindung, umfassend ein Grundgerüst, an das zur Basenpaarung mit natürlichen Nukleobasen fähige heterozyklische Gruppen gebunden sind, wobei es sich bei wenigstens einer der heterozyklischen Gruppen um eine der natürlich vorkommenden Nukleobasen handelt, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei wenigstens einer weiteren der heterozyklischen Gruppen um eine Gruppe der allgemeinen Formel I
handelt, wobei
W für N steht,
Z ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N und C, mit der Maßgabe, dass,

– falls Z für N steht, X unabhängig von Y ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N und CR³, und Y unabhängig von X ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N und CR⁴, und es sich bei der Bindung zwischen X und Y um eine Doppelbindung und bei der Bindung zwischen Y und Z um eine Einfachbindung handelt und,
– falls Z für C steht, X für NR³³ steht und Y ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N und CR⁴, und es sich bei der Bindung zwischen Z und Y um eine Doppelbindung und bei der Bindung zwischen X und Y um eine Einfachbindung handelt,

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₁

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¹¹

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₂

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⁶

Im folgenden wird die vorteilhafte Eigenschaft der erfindungsgemäßen Verbindungen erläutert, indem sie anhand des Beispiels von 2-Aza-2'-desoxyadenosin (2, z²A_d) erläutert werden, das spezifisch stabile Basenpaare mit 2'-Desoxyguanosin (dG) bildet, aber viel weniger stabile Basenpaare mit 2'-Desoxythymidin (dT), 2'-Desoxycytidin (dC) und 2'-Desoxyadenosin (dA) bildet. Das neue Basenpaar (z²A_d-dG) hat eine analoge Stabilität wie das normale dA-dT-Basenpaar.
Zur Angleichung von Tm können in einer nukleinsäurebindenden Verbindung ein oder mehrere zu einem G komplementäre C in einem Strang in einer zu bestimmenden Nukleinsäure durch ein z²A_d ersetzt werden. Das Oligonukleotid bindet dann spezifisch an die Zielsequenz, die dG gegenüber von z²A_d enthält, aber mit der Stabilität von einem dA-dT- und nicht einem dG-dC-Basenpaar. Dieses allgemeine Prinzip ist natürlich nicht auf z²A_d eingeschränkt, da Basen, die die gleichen Eigenschaften in dem 6-gliedrigen Ring aufweisen, auf der Basis der vorhergehenden Erklärung aufgrund ihres Gehalts an der 2-Azapurin-Struktur erwartungsgemäß die gleichen Eigenschaften haben. Je weiter der Teil der heterozyklischen Gruppe von dem Teil entfernt ist, der an der Basenpaarung beteiligt ist, desto toleranter ist das Oligomer gegenüber Modifikationen in der chemischen Struktur, beispielsweise die Bindung von Gruppen an diesen Teil der heterozyklischen Ringe. Im folgenden ist bei Bezugnahme auf die modifizierte Base (der Erfindung), eine heterozyklische Gruppe gemäß der allgemeinen Formel I gemeint.
Die gestrichelte Linie in Formel I zeigt an, dass es je nach den Definitionen von X, Y und Z zur Lokalisation einer Doppelbindung mehrere Möglichkeiten gibt. Es ist dem Fachmann geläufig, dass die Auswahl einer spezifischen Definition von Z eine Doppelbindung entweder zwischen Z und Y oder zwischen X und Y erfordert. Es ist zudem offensichtlich, dass eine Doppelbindung nicht gleichzeitig zwischen X und Y und Y und Z vorhanden ist.
Halogen steht für eine Fluor-, Chlor-, Brom oder Iod-Gruppe. Die am stärksten bevorzugten Halogengruppen sind -Cl und -Br.
Alkylgruppen werden vorzugsweise ausgewählt aus Alkylgruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, die entweder in linearer, verzweigter oder zyklischer Form angeordnet sind. Die tatsächliche Länge der Alkylgruppe hängt von der sterischen Situation an der spezifischen Position ab, an der sich die Alkylgruppe befindet. Kommt es zu irgendwelchen sterischen Hinderungen, ist die Alkylgruppe gewöhnlich kleiner, wobei die Methyl- und Ethylgruppe am stärksten bevorzugt sind. Sämtliche Alkyl-, Alkenyl- und Alkinylgruppen können entweder unsubstituiert oder substituiert sein. Die Substitution durch Heteroatome, wie es oben erörtert ist, steigert die Löslichkeit in wäßrigen Lösungen.
Alkenylgruppen werden vorzugsweise aus Alkenylgruppen ausgewählt, die 2 bis 10 Kohlenstoffatome enthalten. Für die Auswahlen gelten ähnliche Überlegungen wie für Alkylgruppen. Sie können auch linear, verzweigt und zyklisch sein. Die am stärksten bevorzugte Alkenylgruppe ist die Ethylengruppe.
Alkinylgruppen haben vorzugsweise 2 bis 10 Kohlenstoffatome. Wiederum können diese Kohlenstoffatome auf lineare, verzweigte und zyklische Weise angeordnet werden. Zudem kann mehr als eine Dreifachbindung in der Alkinylgruppe vorhanden sein. Die am stärksten bevorzugte Alkinylgruppe ist die 3-Propargylgruppe.
Alkoxygruppen enthalten vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatome und sind an den Rest der Einheit über das Sauerstoffatom gebunden. Für die in den Alkoxygruppen enthaltene Alkylgruppe gelten die gleichen Überlegungen wie für Alkylgruppen. Die am stärksten bevorzugte Alkoxygruppe ist die Methoxygruppe.
Aryloxygruppen enthalten vorzugsweise 6 bis 20 Kohlenstoffatome. Solche Kohlenstoffatome können in einem oder mehreren aromatischen Ringen und zudem in Seitenketten (beispielsweise Alkylketten) enthalten sein, die an die aromatische Einheit gebunden sind. Eine bevorzugte Aryloxygruppe sind die Phenoxy- und Benzoxygruppe.
Bevorzugte O-Schutzgruppen in R¹⁴ sind die Aroylgruppen, Acylgruppen und die Silylgruppen. Von diesen ist die Benzoylgruppe am stärksten bevorzugt.
Bevorzugte Silylgruppen sind die Trialkylsilylgruppen, wie Triethylsilyl.
Jedes Atom in den Definitionen mit den hier vorgestellten Formeln ist nicht auf ein spezielles Isotop eingeschränkt. Somit kann ein Phosphoratom (P) entweder das normale ³¹P oder das radioaktive ³²P oder ein Gemisch davon bedeuten. Das Gleiche gilt für Wasserstoff (H/D/T), Kohlenstoff (C), Iod (Cl, Br, I) und Stickstoff (N).
Die bevorzugte Gruppe -NR⁵R⁶ in der Definition von R³ und R⁴ ist die NH₂-Gruppe. In diesem Fall ist es offensichtlich, dass während der chemischen Synthese von Verbindungen, die eine solche Gruppe der Formel I aufweisen, eines der Wasserstoffatome dieser Aminogruppe durch eine geeignete Aminoschutzgruppe geschützt sein kann. Solche Schutzgruppen sind dem Fachmann gewöhnlich geläufig.
Das gleiche gilt für die Definitionen von R¹.
Während der chemischen Synthese sollten jegliche Gruppen -OH, -SH, und -NH₂ (einschließlich solcher Gruppen in Reportergruppen) durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden. Während der chemischen Synthese wird die Verbindung der Einfachheit halber zudem an eine feste Phase gebunden. In diesen Fällen werden folglich die Definitionen der oben angegebenen Substituenten ausgewählt.
Eine Schutzgruppe ist eine chemische Gruppe, die an eine funktionelle Einheit (beispielsweise an das Sauerstoffatom in einer Hydroxylgruppe, wodurch das Wasserstoffatom ersetzt wird) gebunden, sodaß die funktionelle Gruppe davor bewahrt wird, dass sie auf ungewünschte Weise reagiert. Eine Schutzgruppe ist zudem durch die Tatsache definiert, dass sie entfernt werden kann, ohne dass die biologische Aktivität des entstandenen Moleküls, in diesem Fall die Bindung der nukleinsäurebindenden Verbindung an eine Nukleinsäure, gestört wird. Geeignete Schutzgruppen sind dem Fachmann bekannt. Besonders bevorzugte Schutzgruppen beispielsweise für Hydroxylgruppen am 5'-Ende eines Nukleotids oder Oligonukleotids werden ausgewählt aus der Tritylgruppe, beispielsweise Dimethoxytrityl.
Bevorzugte Schutzgruppen an exozyklischen Aminogruppen in der Formel I sind die Acylgruppen, am stärksten bevorzugt die Benzoylgruppe (Bz), Phenoxyacetyl oder Acetyl oder Formyl und die N,N-Dialkylformamidin-Gruppe, vorzugsweise die Dimethyl-, Diisobutyl- und die Di-n-butylformamidin-Gruppe.
Die erfindungsgemäße nukleinsäurebindende Verbindung hat vorzugsweise eine Länge von weniger als 100 Untereinheiten, stärker bevorzugt 10 bis 30 Untereinheiten. Damit die Substituenten als nukleinsäurebindende Verbindung aktiv sind, sollten sie derart ausgewählt werden, dass Wasserstoffbrückenbindungen zu heterozyklischen Gruppen an der zu bindenden Nukleinsäure ermöglicht werden, vorzugsweise durch Watson-Crick-Basenpaarung und/oder auf die in der 1 offenbarte Weise. Verbindungen, in denen die Substituenten solche bevorzugten Wasserstoffbrückenbindungen nicht ermöglichen, können sich als Zwischenprodukte zur Herstellung von nukleinsäurebindenden Verbindungen eignen. Bevorzugte erfindungsgemäße nukleinsäurebindende Verbindungen werden chemisch synthetisiert.
Soll eine nukleinsäurebindende Verbindung als Sonde zur Bestimmung einer Nukleinsäure verwendet werden, oder ist eine andere Identifikation der Verbindung oder der Nukleinsäure vorgesehen, werden sämtliche Substituenten so ausgesucht, dass sie eine Reportergruppe enthalten. Es können zwar so viele Reportergruppen wie nötig zur hinreichenden Markierung der Nukleinsäureverbindung verwendet werden, jedoch wird vorzugsweise nur eine eingeschränkte Zahl von Reportergruppen an eine einzelne Untereinheit gebunden, sodaß die Erkennung von Nukleinsäuren, Affinitäten zu Nukleinsäuren und die Löslichkeit nicht betroffen sind, sodaß sich die Sonde nicht für Hybridisierungstests eignet. Bei einem sehr bevorzugten Fall sind nur 1 bis 4, am stärksten bevorzugt 1 oder 2 oder am stärksten bevorzugt 1 Reportergruppe in jeder nukleinsäurebindenden Verbindung zugegen. Es gibt Formate für die Nukleinsäurebestimmung, die mehr als eine an die Sonde gebundene Reportergruppe erfordern. Ein Beispiel für solche Formate ist in WO92/02638 offenbart. In diesem Fall ist eine der Reportergruppen ein Fluoreszenzemitter, wohingegen die andere ein Fluoreszenzquencher ist.
Reportergruppen sind gewöhnlich Gruppen, die die nukleinsäurebindende Verbindung sowie jegliche daran gebundenen Nukleinsäuren vom Rest der Flüssigkeit, d.h. von der Probe, unterscheidbar machen (nukleinsäurebindende Verbindungen mit einer gebundenen Reportergruppe können ebenfalls als markierte nukleinsäurebindende Verbindungen, markierte Sonden, oder einfach nur Sonden bezeichnet werden). Diese Unterscheidung kann entweder durch Auswahl der Reportergruppe aus der Gruppe der direkt oder indirekt nachweisbaren Gruppen oder aus den Gruppen der immobilisierten oder immobilisierbaren Gruppen durchgeführt werden. Direkt nachweisbare Gruppen sind beispielsweise fluoreszierende Verbindungen, wie Fluoreszein und seine Derivate, wie Hexachlorfluoreszein und Hexafluorfluoreszein, Rhodamine, Psoralene, Squaraine, Porphyrine, fluoreszierende Teilchen, biolumineszierende Verbindungen, wie Akridiniumester und Luminol, oder die Cyanin-Farbstoffe, wie Cy-5. Beispiele für solche Verbindungen sind in EP 0 680 969 offenbart. Zudem sind Spinmarkierungen, wie TEMPO, elektrochemisch nachweisbare Gruppen, Ferrocen, Viologen, Schwermetallchelate und elektrochemilumineszierende Markierungen, wie Rutheniumbispyridyl-Komplexe und Naphthochinone, Quencher-Farbstoffe, wie Dabcyl und Nuklease-Aktiv-Komplexe, beispielsweise Fe und Cu, geeignete nachweisbare Gruppen. Indirekt nachweisbare Gruppen können durch eine andere Einheit erkannt werden, die direkt oder indirekt markiert ist. Beispiele für solche indirekt nachweisbaren Gruppen sind beispielsweise Haptene, wie Digoxigenin oder Biotin. Digoxigenin kann beispielsweise durch Antikörper gegen Digoxigenin erkannt werden. Diese Antikörper können entweder direkt markiert werden oder können durch markierte Antikörper erkannt werden, die gegen die (Antidigoxigenin)-Antikörper gerichtet sind. Formate auf der Basis der Erkennung von Digoxigenin sind in EP-B-0 324 474 offenbart. Biotin kann durch Avidin und ähnliche Verbindungen, wie Streptavidin und andere biotinbindende Verbindungen erkannt werden. Wiederum lassen sich solche Verbindungen direkt oder indirekt markieren.
Die Reportergruppe kann zudem eine Nukleotidsequenz sein, die die anderen Nukleotidsequenzen in der Probe nicht stört. Die Sequenz kann daher durch ein Nukleotid spezifisch erkannt werden, das eine komplementäre Sequenz enthält. Diese Nukleotidsequenz kann direkt oder indirekt markiert werden, oder sie kann immobilisierbar oder immobilisiert sein.
Eine Reportergruppe kann zudem eine feste Phase sein. Die Bindung der nukleinsäurebindenden Verbindung an eine feste Phase kann entweder direkt oder indirekt sein, wie es oben für die nachweisbare Gruppe hervorgehoben wurde.
Die direkte Markierung kann durch kovalente Kopplung einer nukleinsäurebindenden Verbindung an eine reaktive Gruppe auf der festen Phase durchgeführt werden, d.h. vorzugsweise über einen Linker. Die indirekte Bindung kann ähnlich erfolgen, wie es vorstehend für die nachweisbaren Gruppen erörtert wurde. Eine indirekte Bindung ist vorzugsweise nicht-kovalent durch biospezifische Wechselwirkungen, beispielsweise diejenigen, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Hapten-Antikörper, Vitamin-Rezeptor, und zu einer Nukleinsäure komplementärer Nukleinsäure. Diese Wechselwirkungen und ihre Verwendung bei Nukleinsäure-Tests sind dem Fachmann geläufig.
Feste Phasen, die sich zur Immobilisierung der erfindungsgemäßen Sonde eignen, sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen, Glas und TiO₂. Die Formate solcher Festphasen können gemäß den Anforderungen der Gerätschaft und dem Testformat ausgewählt werden. Eine feste Phase kann beispielsweise die Form einer Perle oder eines Gefäßes haben.
Der Begriff Reportergruppe und die spezifischen Ausführungsformen umfassen vorzugsweise einen Linker, der zum Binden der zu verwendenden Einheit (die tatsächliche feste Phase oder die Fluorophoreinheit), an die Bindungsstelle als Reportergruppe verwendet wird. Der Linker bietet Flexibilität, sodaß die nukleinsäurebindende Verbindung an die zu bestimmende Nukleinsäuresequenz ohne größere Behinderung durch die feste Phase binden kann. Linker, insbesondere diejenigen, die nicht hydrophob sind, beispielsweise auf der Basis aufeinander folgender Ethylenoxyeinheiten, beispielsweise wie offenbart in DE 3943522 , sind dem Fachmann geläufig.
Aus der vorhergehenden Erklärung wird es deutlich, dass die Erfindung selbst dann noch arbeitet, wenn das Grundgerüst der Sonde kein Oligonukleotid im strengen Sinne ist. Es wurden in den letzten Jahren nukleinsäurebindende Verbindungen beschrieben, die ähnliche Eigenschaften wie Oligonukleotide haben, sich aber hinsichtlich ihres Grundgerüsts unterscheiden. Das Grundgerüst wird im allgemeinen als Teil der nukleinsäurebindenden Verbindung angesehen, die die Basen meist auf lineare Weise trägt, die an identische oder nicht-identische Untereinheiten gebunden sind. Das bekannteste Grundgerüst ist das natürlich vorkommende Zucker-Phosphat-Grundgerüst der Nukleinsäuren (die entweder Ribonukleosid-Untereinheiten (RNA), Desoxyribonukleosid-Untereinheiten (DNA) oder Peptid-Nukleinsäure-Untereinheiten (PNA) enthalten. Daher umfaßt das Grundgerüst in einer bevorzugten Ausführungsform Zucker- und Phosphat-Einheiten. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Zuckerkonfiguration ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den α-D-, β-D-, α-L und β-L-Konfigurationen, am stärksten bevorzugt enthält die Verbindung mindestens eine 2'-Desoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl-Gruppierung oder eine β-D-Ribofuranosyl-Gruppierung.
D ist vorzugsweise das Glycosid C-1 einer Zuckergruppierung der erfindungsgemäßen Verbindung. Bei bevorzugten Verbindungen der Formel VI ist R¹ NH₂, W bedeutet N, Z bedeutet N, Y bedeutet C, X bedeutet N und R¹⁴ ist H.
Weitere bevorzugte nukleinsäurebindende Verbindungen enthalten mindestens eine Gruppe der Formel I, wobei R¹ die Gruppe -NR⁵R⁶ ist, die entweder 2-Azaadenosin oder Derivate davon sind. Als Derivate von 2-Azaadenin werden hier Verbindungen angesehen, die eine Wasserstoffbrückenbindung über die gleichen Atome wie 2-Azaadenin an dG und dG in einer Nukleinsäure bereitstellen, die an die erfindungsgemäße nukleinsäurebindende Verbindung gebunden ist. Die am stärksten bevorzugte Gruppe der Formel I ist 2-Azaadenin, das über das N⁹-Atom an das Grundgerüst gebunden ist. Diese Gruppen unterscheiden eindeutig zwischen den natürlichen Nukleobasen und stellen zudem eine sehr ähnliche Stabilität wie das A-T-Basenpaar bereit.
Die nukleinsäurebindende Verbindung ist derart konstruiert, dass sie eine Nukleobasensequenz enthält, die im wesentlichen komplementär ist zu der zu bestimmenden Nukleinsäure oder zu der Nukleinsäure, die durch Basenpaarung gebunden werden soll. Da solche Nukleinsäuren gewöhnlich mindestens einmal eine der natürlich vorkommenden Nukleobasen Ade, Cyt, Gua und Thy oder Ura enthalten, enthält die erfindungsgemäße nukleinsäurebindende Verbindung auch eine dieser vier Basen. Erfindungsgemäß wird mindestens eine der heterozyklischen Gruppen in einer Position der nukleinsäurebindenden Verbindung, die sich gegenüber G in der zu bestimmenden Nukleinsäure befindet, durch die heterozyklische Base der Formel I ersetzt. Existiert mehr als ein G in der Sequenz, an die die nukleinsäurebindende Verbindung an der Nukleinsäure hybridisiert werden soll, werden vorzugsweise so viele C's in der nukleinsäurebindenden Verbindung als heterozyklische Gruppen der Formel I ausgewählt, wie es zur Bereitstellung der beabsichtigten Tm notwendig ist.
Die erfindungsgemäßen nukleinsäurebindenden Verbindungen zeigen die gleiche Basenpaarungsselektivität auch gegenüber anderen hetereozyklischen Gruppen in der Position, die sich gegenüber der Position der nukleinsäurebindenden Verbindung befindet, an der sich die Gruppe der Formel I befindet, insbesondere gegenüber Derivaten von G, beispielsweise c⁷G_d, z⁶c⁷G_d und z⁸G_d. In diesen Nennungen bedeutet c⁷, dass sich an der Position 7 ein Kohlenstoffatom befindet, und z⁸ bedeutet entsprechend, dass sich an der Position 8 ein Stickstoffatom befindet. Zudem sind Derivate von G, die erfindungsgemäß erkannt werden können, Nukleobasen G, die durch die Bindung der nachweisbaren Gruppen markiert werden, und Iso-G_d.
Die Nukleinsäure kann auch eine heterozyklische Gruppe der Formel I selbst enthalten. Die entsprechende Base an der nukleinsäurebindenden Verbindung ist vorzugsweise derart ausgewählt, dass sie mit dieser Gruppe ein Basenpaar bildet, beispielsweise ist sie dG. Die Nukleinsäure kann natürliche und/oder nicht-natürliche Basen enthalten, beispielsweise 7-Deaza-dGTP. Somit wird der Begriff Nukleinsäure in der vorliegenden Erfindung sehr breit ausgelegt. Nukleinsäuren mit gemischten Basensequenzen sind bevorzugt.
Die erfindungsgemäße nukleinsäurebindende Verbindung bindet vorzugsweise im Antiparallelmodus an Nukleinsäuren. Durch sorgfältiges Auswählen der Nukleobasen einer Nukleinsäure und/oder nukleinsäurebindenden Verbindung kann die Bindung auch in den Parallelmodus gezwungen werden. Die parallele Hybridisierung der Nukleinsäuren, die Iso-C und Iso-G enthalten, sind beispielsweise in EP 0 624 161 offenbart.
Bei bevorzugten nukleinsäurebindenden Verbindungen umfaßt das Grundgerüst eine oder mehrere Gruppierungen der allgemeinen Formel II
wobei
A ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus O, S und N-(C₁-C₁₀)-Alkyl,
L ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Oxy, Sulfandiyl und -NR²²-,
T ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Oxo, Thioxo und Selenoxo,
U ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -OH, -O-Reportergruppe, -SH, -S-Reportergruppe, -SeH, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₆-C₂₂)-Aryl, -(C₆-C₁₄)-Aryl-(C₁-C₁₀)-alkyl, -NR²³R²⁴ und -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O-(C₁-C₁₀)-alkyl-R²⁵, oder wobei -NR²³R²⁴ zusammen mit N einen 5–6- gliedrigen heterozyklischen Ring darstellen kann,
V ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Oxy, Sulfandiyl oder -NR²²-,
R¹⁴ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -OH, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₂-C₁₀)-Alkenyloxy, -Halogen, -Azido, -O-Allyl, -O-Alkinyl und -NH₂,
R²² unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe -H und -(C₁-C₁₀)-Alkyl,
R²³ und R²⁴ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₁-C₂₀)-Aryl, -(C₆-C₁₄)-Aryl-(C₁-C₁₀)-alkyl, -(C₁-C₆)-Alkyl-[NH(CH₂)_c]_d-NR²⁶R²⁷ und einer Reportergruppe,
R²⁵ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -OH, -Halogen, -Amino, -(C₁-C₁₈)-Alkylamino, -COOH, -CONH₂ und -COO(C₁-C₄)-Alkyl, und einer Reportergruppe,
R²⁶ und R²⁷ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₆)-Alkyl und -(C₁-C₄)-Alkoxy-(C₁-C₆)-alkyl, und einer Reportergruppe,
c eine ganze Zahl von 2 bis 6 darstellt,
d eine ganze Zahl von 0 bis 6 darstellt und
B für eine Gruppierung der Formel I steht,
wobei Alkyl, Alkenyl und Alkinyl jeweils gegebenenfalls substituiert sein können,
und beliebige Salze davon.
Die bevorzugten Definitionen der Gruppen der Definitionen der Formel I gelten wenn nicht anders angezeigt für die Formel II und die folgenden Formeln.
Eine bevorzugte Aufgabe der Erfindung ist daher eine nukleinsäurebindende Verbindung, wie oben angegeben, wobei das Grundgerüst eine oder mehrere Gruppierungen der allgemeinen Formel III umfaßt:
wobei
A ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus O, S und N-(C₁-C₆)-Alkyl,
M ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Oxy, Sulfandiyl, -NR²²-, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, oder -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O-, und -S-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O- und -NR²²-(C₁-C₆)-Alkyl-O-,
R²² ausgewählt ist aus der Gruppe -H, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, einer Schutzgruppe und einer Reportergruppe,
R¹⁴ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -OH, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₂-C₁₀)-Alkenyloxy, -(C₂-C₁₀)-Alkinyloxy, -Halogen, -Azido, SH, -(C₁-C₁₀)-Alkylmercapto und -NH₂,
R¹⁵ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₆)-Alkyl, -(C₂-C₁₀)-Alkenyl, -(C₂-C₁₀)-Alkinyl, -(C₂-C₁₀)-Alkylcarbonyl, -(C₃-C₁₉)-Alkenylcarbonyl, -(C₃-C₁₉)-Alkinylcarbonyl, -(C₆-C₁₄)-Aryl-(C₁-C₁₀)-alkyl, einer Festphase sowie einer Gruppe der Formel IV
wobei
T ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Oxo, Thioxo und Selenoxo, und
U ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -OH, -O-Reportergruppe, -SH, -SeH, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₆-C₂₂)-Aryl, -(C₆-C₁₄)-Aryl-(C₁-C₁₀)-alkyl, -NR²³R²⁴ und -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O-(C₁-C₁₀)-alkyl-R²⁵, oder wobei -NR²³R²⁴ zusammen mit N einen 5–6-gliedrigen heterozyklischen Ring darstellen kann,
R²³ und R²⁴ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₁-C₂₀)-Aryl, -(C₆-C₁₄)-Aryl-(C₁-C₁₀) -alkyl, -(C₁-C₆)-Alkyl-[NH(CH₂)_c]_d-NR²⁶R²⁷,
R²⁵ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -OH, -Halogen, -Amino, -(C₁-C₁₈)-Alkylamino, -COOH, -CONH₂ und -COO(C₁-C₄)-Alkyl,
R²⁶ und R²⁷ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₆)-Alkyl und -(C₁-C₄)-Alkoxy-(C₁-C₆)-alkyl,
R²⁹ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -OR³⁰ und -SR³⁰,
R³⁰ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₂-C₁₀)-Alkenyl, -(C₆-C₂₂)-Aryl, einer Schutzgruppe, einer Festphase und einer Reportergruppe,
B die Verknüpfung mit einer Gruppierung der Formel I darstellt,
und beliebige Salze davon.
Für die Definitionen und Präferenzen gelten die Einzelheiten wie sie für die Substituenten unter den Formeln I und II hervorgehoben sind, wenn für Formel III speziell nicht anderes angegeben.
In den Verbindungen der Formel II ist R¹⁴ vorzugsweise Wasserstoff. Die bevorzugte Definition von L ist Oxy. Die bevorzugte Definition von U ist -OH und -O-Reportergruppe. Die bevorzugte Definition von V ist Oxy. Die bevorzugte Definition von c ist eine ganze Zahl von 2 bis 4 und von d eine ganze Zahl von 0 bis 2.
Verbindungen der Formel II enthalten besonders geeignet die erfindungsgemäße heterozyklische Gruppierung als integrierten Teil (vorzugsweise nicht an einem der Enden) der nukleinsäurebindenden Verbindung.
Die Gruppe NR²³R²⁴ ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Dialkylaminogruppen. Sie nimmt bei dieser Gruppe und auch bei der Bildung eines 5- oder 6-gliedrigen heterozyklischen Rings vorzugsweise die Definition von Pyrrolidinyl oder Piperidinyl an.
Eine bevorzugte Arylgruppe ist die Phenyl- oder Naphthylgruppierung, die gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder mehreren der Reste Amino-, -Aminoalkyl, -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-, -S-(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, Sulfonyl, Sulfenyl, Sulfinyl, Nitro und Nitroso. Die am stärksten bevorzugte Arylgruppe ist die Phenylgruppe. Die bevorzugte Arylalkylgruppe ist die Benzylgruppe. Die bevorzugte Alkylaminogruppe ist die Ethylaminogruppe. Die bevorzugte -COO(C₁-C₄)-Alkylgruppe enthält ein oder zwei Kohlenstoffatome in der Alkyleinheit (Methyl- oder Ethylester).
Nukleinsäurebindende Verbindungen, bei denen die Gruppe der Formel I gebunden ist, um beispielsweise das Nukleotid am 3'-Ende der Verbindung zu unterwerfen, eignen sich entweder als Ausgangsverbindung für längere Verbindungen oder/und als endmarkierte Sonden. Diese Gruppe von Verbindungen ist besonders bevorzugt, weil die terminale Position der Sonden in Bezug auf die Bindung chemischer Gruppierungen im allgemeinen am tolerantesten ist.
Eine bevorzugte Aufgabe der Erfindung ist eine nukleinsäurebindende Verbindung, wie sie oben genannt ist, und die ein Grundgerüst der Formel V
umfaßt, wobei
A ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus O, S und N-(C₁-C₆)-Alkyl,
M' ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Oxy, Sulfandiyl, -NR²²-, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, oder -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O-, und -S-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O- und -NR²²-(C₁-C₆)-Alkyl-O-,
R²² ausgewählt ist aus der Gruppe -H, einer Schutzgruppe, einer Reportergruppe und -(C₁-C₁₀)-Alkyl,
R¹⁴ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -OH, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₂-C₁₀)-Alkenyloxy, -(C₂-C₁₀)-Alkinyloxy, -Halogen, -Azido, -SH, S-(C₁-C₆)-Alkylmercapto und NH₂,
R¹⁶ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₈)-Alkyl, -(C₂-C₁₈)-Alkenyl, -(C₂-C₁₈)-Alkinyl, -(C₂-C₁₈)-Alkylcarbonyl, -(C₃-C₁₉)-Alkenylcarbonyl, -(C₃-C₁₉)-Alkinylcarbonyl, -(C₆-C₁₄)-Aryl-(C₁-C₈)-alkyl, einer Schutzgruppe oder einer Verbindung der Formel IV
wobei
T ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Oxo, Thioxo und Selenoxo,
U ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -OH, -SH, -SeH, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₆-C₂₂)-Aryl, -(C₆-C₁₄)-Aryl-(C₁-C₁₀)-alkyl, -NR²³R²⁴ und -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O-(C₁-C₁₀)-alkyl-R²⁵, wobei NR²³R²⁴ zusammen mit N einen 5–6-gliedrigen heterozyklischen Ring darstellen kann,
R²³ und R²⁴ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₁-C₂₀)-Aryl, -(C₆-C₁₄)-Aryl-(C₁-C₁₀)-alkyl, -(C₁-C₆)-Alkyl-[NH(CH₂)_c]_d-NR²⁶R²⁷,
R²⁵ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -OH, -Halogen, -Amino, -(C₁-C₁₈)-Alkylamino, -COOH, -CONH₂ und -COO(C₁-C₄)-Alkyl,
R²⁶ und R²⁷ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₆)-Alkyl und -(C₁-C₄)-Alkoxy-(C₁-C₆)-alkyl,
R²⁹ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -OR³⁰ und -SR³⁰,
R³⁰ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₂-C₁₀)-Alkenyl, -(C₆-C₂₂)-Aryl, einer Schutzgruppe, einer Festphase und einer Reportergruppe, und
B die Verknüpfung mit einer Gruppierung der Formel I darstellt,
wobei Alkyl, Alkenyl und Alkinyl jeweils gegebenenfalls substituiert sein können,
und jegliche Salze davon.
Solche Verbindungen können als 5'-terminal markierte Sonden verwendet werden. In Bezug auf die Definitionen der Substituenten gelten wenn nicht anders angegeben die oben angegebenen Definitionen.
Eine sehr bevorzugte Verbindung hat die Formel V, wobei M für O steht, R¹⁶ für H steht und R¹⁴ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und Hydroxyl.
Das Grundgerüst der nukleinsäurebindenden Verbindung muß die basenpaarenden Heterozyklen tragen, sodaß die Verbindung an die Nukleinsäure binden kann, die eine komplementäre Sequenz hat. Der Grad der Komplementarität in den natürlich vorkommenden Basen reicht in einer Basenstrecke in einem Bereich, der die Bindung bewerkstelligt, verglichen mit der Strecke der gleichen Länge in dem Bereich der zu bindenden Nukleinsäure von 70% bis zu 100%. Deletionen und Insertionen der Untereinheiten in jeder Sequenz werden daher in dieser Berechnung als Lücken bis zur nächsten passenden Base gezählt, und reduzieren somit die Komplementarität um so viele Basen, wie die Lücke enthält.
Ein bevorzugtes Grundgerüst enthält Zucker-Phosphat-Gruppierungen. Von diesen sind Desoxy-Zucker enthaltende Grundgerüste weiter bevorzugt.
Jede Einheit in dem Gerüst, die eine Gruppierung trägt, die mit einer Nukleinsäure einer komplementären Sequenz Basenpaare bilden kann, einschließlich der erfindungsgemäßen Gruppierungen, wird als Untereinheit bezeichnet. Es gibt Verbindungen, deren Grundgerüste aus unterschiedlichen Arten von Untereinheiten gemischt sind. Vor kurzem wurde eine neue Art von nicht-natürlichen nukleinsäurebindenden Verbindungen beschrieben. Sie werden als Peptid-Nukleinsäuren (PNA) bezeichnet, da sie mindestens eine Peptidbindung zwischen den Untereinheiten enthalten (WO92/20702). Die erfindungsgemäße nukleinsäurebindende Verbindung kann eine beliebige Länge aufweisen. Aufgrund der Einfachheit der chemischen Synthese sind Verbindungen mit einer Länge von weniger als 100, stärker bevorzugt 10 bis 30 Untereinheiten, beispielsweise Nukleoside, bevorzugt.
Die erfindungsgemäße nukleinsäurebindende Verbindung kann analog zu bekannten Verfahren hergestellt werden.
Bei einer ersten Möglichkeit, die sich besonders für kurze Verbindungen eignet, werden die Verbindungen durch chemische Synthese hergestellt (Mehrschritt-Oligomerisierung), wobei chemisch aktivierte Derivate der Untereinheiten (Monomere) verwendet werden, von denen mindestens eine die erfindungsgemäße modifizierte Base enthält. Reaktive Gruppen in den Monomeren, die nicht an dem tatsächlichen Reaktionsschritt der Oligomerisierungsreaktion beteiligt sind, werden mit einer geeigneten Schutzgruppe geschützt. Solche Schutzgruppen sind im Stand der Technik bekannt, und es gibt keine größere Änderung der Schutz- und Synthesestrategie, wenn die erfindungsgemäßen Gruppen verwendet werden.
Eine aktivierte Untereinheit enthält einen Substituenten, der sich besonders für eine chemische Reaktion mit einem festgelegten Substituenten in einer anderen Untereinheit eignet, auf der Oberfläche einer Festphase oder in einem Oligomer, das aus Untereinheiten aufgebaut ist. Solche besonders geeigneten Untereinheiten werden vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Phosphoramiditen, Phosphonaten (wie Methylphosphonaten), Phosphotriestern, Phosphothioaten, Phosphodithioaten, Boranophosphonaten (siehe Chem. Commun. 1999, 1517–1518), Phosphatmethylestern, Phenylphosphonaten und Phosphatethylestern.
Die festgelegten Substituenten werden vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe -NH₂, -SH und -OH.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist daher ein Verfahren für die chemische Synthese einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei aktivierte Untereinheiten verwendet werden, und wobei die Untereinheit mindestens eine Gruppe der Formel I enthält. Es gibt verschiedene bekannt Ansätze für die chemische Synthese, wie das Phosphotriester-Verfahren von Narang et al., Meth. Enzymol. 68, 90–99 (1979); das Phosphodiesterverfahren von Brown et al., Meth. Enzymol. 68, 109–151 (1979); das Diethylphosphoramidit-Verfahren von Beaucage et al., Tetrahedron Lett. 22, 1859–1862 (1981); und das Festträgerverfahren, beschrieben in der US-Patentanmeldung Nr. 4,458,066 und in Methods in Molecular Biology, Hrsg. S. Agrawal, Bd. 20, Humana Press, Totowa, NJ, 1993. Das am stärksten bevorzugte Verfahren der chemischen Synthese verwendet den Phosphoramidit-Ansatz. Ein besonders bevorzugtes Verfahren verwendet eine aktivierte Untereinheit von einer oder mehreren Verbindungen der allgemeinen Formel VII. Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass es sehr geeignet ist, und dass die nötigen Reagentien, beispielsweise ein Phosphoramidit, das eine Gruppe der Formel I trägt, leicht aufgenommen werden können.
Bei einer weiteren Aufgabe der Erfindung handelt es sich daher um Verbindungen der allgemeinen Formel VII
wobei
A ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus O, S und N-(C₁-C₆)-Alkyl,
M und M' unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Oxy, Sulfandiyl, -NR²²-, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, oder -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O-, und -S-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O- und -NR²²-(C₁-C₆)-Alkyl-O-,
R²² ausgewählt ist aus der Gruppe -H und -(C₁-C₁₀)-Alkyl,
R¹⁴ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -OR³¹, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₂-C₁₀)-Alkenyloxy, -(C₂-C₁₀)-Alkinyloxy, -Halogen, -Azido, NHR³¹, SR³¹ und NH₂,
R³¹ für eine Schutzgruppe oder eine Reportergruppe steht,
R³² und R¹⁷ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₂-C₁₀)-Alkenyl und -(C₆-C₂₂)-Aryl,
R¹⁸ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus gegebenenfalls substituiertem -(C₁-C₆)-Alkyl, unsubstituiertem -(C₁-C₆)-Alkoxy oder ein- oder mehrfach mit einer Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -Halogen, p-Nitroaryloxy und -Cyano, substituiertem -(C₁-C₆)-Alkoxy, und
B für eine Gruppe der Formel I steht.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die Gruppe der Formel I in der Formel VII zumindest eine Reportergruppe. Am stärksten bevorzugt enthält die Gruppe der Formel I genau eine Reportergruppe.
Am stärksten bevorzugt in solchen Verbindungen ist in -NR⁵R⁶ zumindest einer der Reste R⁵ und R⁶ eine Schutzgruppe.
Bei einer weiteren Aufgabe der Erfindung handelt es sich um Verbindungen der allgemeinen Formel IX
wobei
A ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus O, S und N-(C₁-C₆)-Alkyl,
M und M' unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Oxy, Sulfandiyl, -NR²², -(C₁-C₁₀)- Alkyl, oder -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O-, und -S-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O- und -NR²²-(C₁-C₆)-Alkyl-O-,
R²² ausgewählt ist aus der Gruppe -H und -(C₁-C₁₀)-Alkyl,
R¹⁴ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -OR³¹, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₂-C₁₀)-Alkenyloxy, -(C₂-C₁₀)-Alkinyloxy, -Halogen, -Azido, NHR³¹, SR³¹ und -NH₂,
R³¹ für eine Schutzgruppe oder eine Reportergruppe steht,
R³² und R¹⁷ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₂-C₁₀)-Alkenyl und -(C₆-C₂₂)-Aryl,
R¹⁸ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus gegebenenfalls substituiertem -(C₁-C₆)-Alkyl, unsubstituiertem -(C₁-C₆)-Alkoxy oder ein- oder mehrfach mit einer Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -Halogen, p-Nitroaryloxy und -Cyano, substituiertem -(C₁-C₆)-Alkoxy, und
B für eine Gruppe der Formel I
steht, wobei
W für N steht,
Z ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N und C, mit der Maßgabe, dass,

¹

⁵

⁶

³

⁴

¹³

¹⁹

₁

₁₀

₂

₁₀

₂

₁₀

₂

⁵

⁶

¹¹

₁

₆

₂₂

¹²

⁵

⁶

¹²

¹³

¹⁹

³³

₁

₁₀

₂

₁₀

₂

₁₀

₆

₂₂

₁

₆

₁

₆

⁵

⁶

¹¹

⁵

⁶

⁵

⁶

₂

_r

_s

⁵

⁶

⁵

⁶

⁵

⁶

Diese Verbindungen können genauso wie diejenigen der Formel VII in der chemischen Synthese verwendet werden.
Bei einer weiteren Aufgabe der Erfindung handelt es sich um Verbindungen der allgemeinen Formel X
wobei
M und M' unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Oxy, Sulfandiyl, -NR²², -(C₁-C₁₀)-Alkyl, oder -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O-, und -S-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O- und -NR²²-(C₁-C₆)-Alkyl-O-,
R²² ausgewählt ist aus der Gruppe -H und -(C₁-C₁₀)-Alkyl,
R¹⁴ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -OR³¹, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₂-C₁₀)-Alkenyloxy, -(C₂-C₁₀)-Alkinyloxy, -Halogen, -Azido, NHR³¹, SR³¹ und -NH₂,
R³¹ für eine Schutzgruppe oder eine Reportergruppe steht,
B für eine Gruppe der Formel I
steht, wobei
W für N steht,
Z ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N und C, mit der Maßgabe, dass,

– falls Z für N steht, X unabhängig von W und Y ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N und CR³, und Y unabhängig von W und X ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N und CR⁴, und es sich bei der Bindung zwischen X und Y um eine Doppelbindung und bei der Bindung zwischen Y und Z um eine Einfachbindung handelt und,
– falls Z für C steht, X für NR³³ steht und Y ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N und CR⁴, und es sich bei der Bindung zwischen Z und Y um eine Doppelbindung und bei der Bindung zwischen X und Y um eine Einfachbindung handelt,

¹

⁵

⁶

³

⁴

¹³

¹⁹

₁

₁₀

₂

₁₀

₂

₁₀

₂

⁵

⁶

¹¹

₁

₆

₂₂

¹²

⁵

⁶

¹²

¹³

¹⁹

³³

₁

₁₀

₂

₁₀

₂

₁₀

₆

₂₂

₁

₆

₁

₆

⁵

⁶

¹¹

⁵

⁶

⁵

⁶

₂

_r

_s

⁵

⁶

Diese Verbindungen eignen sich auch zur chemischen Synthese.
Bei einer weiteren Möglichkeit, die sich mehr für lange Oligomere und solche auf der Basis natürlicher Grundgerüste eignet, werden die Oligomere enzymatisch produziert. In diesem Fall wird ein Start-Oligomer mit einer Polymerase und einem Triphosphat umgesetzt, sodaß ein Monophosphat oder ein modifiziertes Monophosphat an ein Ende des Oligomers gebunden wird, sodaß das Oligomer verlängert wird. Auch für dieses Verfahren kennt der Fachmann mehrere mögliche Formate, wie den Nick-Translations-Ansatz oder die einfache Primer-Extension (J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989).
Der Einbau von z²A_d in eine DNA-Sequenz kann über herkömmliche Verfahren, beispielsweise durch polymerasekatalysierten Einbau von z²A_d-5'-Triphosphat (11) durchgeführt werden.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist daher ein Verfahren zur enzymatischen Synthese einer erfindungsgemäßen nukleinsäurebindenden Verbindung, umfassend das Umsetzen einer Triphosphat-Untereinheit mit einem Primer unter Verwendung einer Nukleinsäure als Matrize zur Verlängerung des Primers, wobei die Triphosphat-Untereinheit eine heterozyklische Gruppe der Formel 1 umfaßt. Die Triphosphat-Untereinheit hat vorzugsweise die Formel VI.
Bei einer weiteren Aufgabe der Erfindung handelt es sich daher um Verbindungen der allgemeinen Formel VI
wobei
A ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus O, S und N-(C₁-C₁₀)-Alkyl,
R¹⁴ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -OH, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, O-Schutzgruppe, S-Schutzgruppe, NH-Schutzgruppe, -(C₂-C₁₀)-Alkenyloxy, -Halogen, -Azido, -SH, -(C₁-C₆)-Alkylmercapto und -NH₂,
R¹⁵ und R¹⁶ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₈)-Alkyl, -(C₂-C₁₈)-Alkenyl, -(C₂-C₁₈)-Alkinyl, -(C₂-C₁₈)-Alkylcarbonyl, -(C₃-C₁₉)-Alkenylcarbonyl, -(C₃-C₁₉)-Alkinylcarbonyl, -(C₆-C₁₄)-Aryl-(C₁-C₈)- alkyl, einer Schutzgruppe oder einer Verbindung der Formel IV
wobei
T ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Oxo, Thioxo und Selenoxo,
U ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -OH, -SH, -SeH, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₆-C₂₂)-Aryl, -(C₆-C₁₄)-Aryl-(C₁-C₁₀)-alkyl, -NR²³R²⁴ und -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O-(C₁-C₁₀)-alkyl-R²⁵, oder wobei NR²³R²⁴ zusammen mit N einen 5–6-gliedrigen heterozyklischen Ring darstellen kann,
R²³ und R²⁴ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₁-C₂₀)-Aryl, -(C₆-C₁₄)-Aryl-(C₁-C₁₀)-alkyl, -(C₁-C₆)-Alkyl-[NH(CH₂)_c]_d-NR²⁶R²⁷,
R²⁵ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -OH, -Halogen, -Amino, -(C₁-C₁₈)-Alkylamino, -COOH, -CONH₂ und -COO(C₁-C₄)-Alkyl,
R²⁶ und R²⁷ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₆)-Alkyl und -(C₁-C₄)-Alkoxy-(C₁-C₆)-alkyl,
R²⁹ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -OR³⁰ und -SR³⁰,
R³⁰ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₂-C₁₀)-Alkenyl, -(C₆-C₂₂)-Aryl, einer Schutzgruppe, einem Diphosphat und einer Reportergruppe, und
M und M' unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Oxy, Sulfandiyl, -NR²²-, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, oder -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O-, und -S-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O- und -NR²²-(C₁-C₆)-Alkyl-O-,
R²² ausgewählt ist aus der Gruppe -H und -(C₁-C₁₀)-Alkyl, und
B für eine Gruppierung der Formel I steht,
wobei sämtliche Alkyl-, Alkenyl- und Alkinyl-Reste substituiert oder unsubstituiert sein können, und wobei zumindest einer der Reste R¹⁵ und R¹⁶ keine Gruppe der Formel IV ist, mit der Maßgabe, dass
MR¹⁶, MR¹⁵ und R¹⁴ jeweils nicht -OH sind, wenn R¹ -NH₂ ist, und wenn entweder

– W und X und Y und Z gleich N ist, oder
– W und X und Z gleich N ist und Y gleich CR⁴ ist, oder
– W und Y und Z gleich N ist und X gleich CR³ ist.

Am stärksten bevorzugt in diesen Verbindungen ist -MR¹⁶ eine Triphosphatgruppe, und -MR¹⁵ ist OH. Bei der am stärksten bevorzugten Verbindung ist der Rest R¹⁴ gleich -OH.
Solche Verbindungen sind insbesondere diejenigen Verbindungen, in denen die heterozyklische Gruppierung der Erfindung nicht an der endständigen Position der nukleinsäurebindenden Verbindung enthalten ist.
Bei bevorzugten Verbindungen ist M gleich Oxy oder Sulfandiyl, R¹⁶ ist eine Verbindung der Formel IV, wobei U gleich -OH ist, T gleich Oxo oder Thioxo ist, R²⁹ gleich -OR³⁰ ist, und R³⁰ eine Diphosphatgruppe ist und deren Salze.
Die am stärksten bevorzugten Verbindungen haben die Formel VIII
wobei
PPP für eine Triphosphat-Gruppe steht,
R¹⁴ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -OH, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₂-C₁₀)-Alkenyloxy, -(C₂-C₁₀)-Alkinyloxyhalogen, -Azido und NH₂, und
B für eine Gruppe der Formel I steht, mit der Maßgabe, dass R¹⁴ nicht OH ist, wenn B für 2-Azaadenin steht.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die Gruppe der Formel I in Verbindungen der Formel VII ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Gruppen der Formel I, wobei entweder

– W für N, Z für N, Y für N und X für CR³ steht oder
– W für N, Z für C, Y für N und X für CR³ steht oder
– W für N, Z für N, Y für N und X für N steht.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur enzymatischen Synthese einer erfindungsgemäßen nukleinsäurebindenden Verbindung, umfassend das Umsetzen einer Triphosphat-Untereinheit mit einem Primer, wobei eine Nukleinsäure-Matrize zur Verlängerung des Primers verwendet wird, und wobei die Triphosphat-Untereinheit eine heterozyklische Gruppe der Formel I umfaßt.
Dieses Verfahren umfaßt stärker bevorzugt eine Triphosphat-Untereinheit einer Verbindung der Formel VIII wie oben definiert.
Die Verbindungen der allgemeinen Formeln VI, VII und VIII können aus Verbindungen hergestellt werden, die leicht verfügbar sind. In einer ersten Ausführungsform werden die Verbindungen der Formel VI, die durch das Atom an der Stellung 2 gekennzeichnet sind (Purin-Numerierung), hergestellt durch Auswählen der entsprechenden Verbindung, die ein Kohlenstoffatom an dieser Stelle aufweist (wobei vorzugsweise MR¹⁵ für OH steht und M'R¹⁶ für OH steht und R¹ für NH₂ steht), Umsetzen mit 2-Chloracetaldehyd, Spalten des Pyrimidinrings unter alkalischen Bedingungen und erneutes Schließen des Rings mit Natriumnitrit und danach Hydrolyisieren des Imidazolrings, der durch das Aldehyd eingebracht wurde. Diese Reaktion ergibt einen Austausch des Kohlenstoffatoms an der Position 2 gegen ein Stickstoffatom.
Diese Verbindung kann dann durch Reagentien umgesetzt werden, die Schutzgruppen oder/und aktivierende Gruppen, wie Phosphoramidite oder Phosphate, an die Hydroxylgruppen binden, die bei der Oligomerisierung verwendet werden sollen. Verfahren zur Bindung der Schutzgruppen, wie die Dimethoxytritylgruppe, sind dem Fachmann gewöhnlich geläufig. Die Bindung der Mono-, Di- und Triphosphatgruppen ist dem Fachmann auch geläufig.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel VII, wobei R¹ eine geschützte Aminogruppe ist, M'R³¹ eine O-Schutzgruppe und MPR¹⁸NR³²R¹⁷ eine O-Phosphoramiditgruppe ist, einer Verbindung der Formel VI, wobei M'R¹⁶ und MR¹⁵ jeweils OH sind und R¹ NH₂ ist, Bedingungen unterworfen, mit denen die Aminogruppe geschützt wird, vorzugsweise durch die Schutzgruppe Dialkylaminomethyliden, dann mit Reagentien umgesetzt, um die 5'-Hydroxylgruppe zu schützen und dann mit einem aktivierten Phosphan umgesetzt, sodaß das Phosphoramidit erzeugt wird. Die resultierende Verbindung der Formel VII kann bei der chemischen Synthese zur direkten Einführung des 2-Azapurins verwendet werden. Die Schutzgruppe bei R¹ wird während der chemischen Synthese entfernt.
Für eine alternative Synthese von 2-Aza-2'-desoxyadenosin, siehe N. Yamaji, M. Kato, Chemistry Lett. 1975, 311–314.
Durch die vorstehenden Verfahren kann man prinzipiell nur ein Monomer, das die erfindungsgemäße Gruppierung enthält, aber bei Bedarf auch mehr als eins einbringen. Die höchste Reduktion von Tm erfolgt, wenn alle C im Bindungsbereich ersetzt werden. Dies ermöglicht ein Feinabstimmen der Tm. Natürlich können auch verbleibende Cs in sämtlichen Bereichen vorhanden sein, die mit der zu bestimmenden Nukleinsäure keine Basenpaare bilden sollen.
Die Verbindungen der Formeln I bis VIII, in denen die Substituenten R¹, R², R³ und R⁴ jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Halogen, insbesondere Cl, Cyano oder SR¹⁹, eignen sich als Zwischenprodukte für die Synthese von Verbindungen, bei denen solche Substituenten ausgewählt sind aus der Gruppe -NR⁵R⁶ und -OR¹³, vorzugsweise -NR⁵R⁶. Die Zwischenprodukte können durch Substitutionsreaktion in die Endprodukte umgewandelt werden.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung einer Nukleinsäure, umfassend die Schritte

– Bereitstellen einer Probe, von der vermutet wird, dass sie die Nukleinsäure enthält,
– Bereitstellen einer nukleinsäurebindenden Verbindung nach Anspruch 1, die zu der Nukleinsäure im wesentlichen teilweise oder vollständig komplementär ist,
– Inkontaktbringen der Probe mit der nukleinsäurebindenden Verbindung unter Bedingungen für die Bindung der nukleinsäurebindenden Verbindung an die Nukleinsäure,
– Bestimmen des aus der Nukleinsäure und der nukleinsäurebindenden Verbindung gebildeten Bindungsprodukts als Maß für das Vorhandensein der Nukleinsäure.

Verfahren zur Bestimmung der Nukleinsäuren durch Hybridisierung sind im Stand der Technik allgemein bekannt, beispielsweise aus Sambrook et al., (oben zitiert). Sie können leicht an die Verwendung der erfindungsgemäßen Sonden angepaßt werden. Die nukleinsäurebindende Verbindung wird vorzugsweise an die Nukleinsäure in Lösung gebunden, da die Reaktion schneller als auf einer festen Phase erfolgt. Der Fachmann weiß, wie man die Tm des Hybrids aus der zu bestimmenden Nukleinsäure und der Sonde vor der Erstellung eines Tests und seinem allgemeinen Beginn bestimmt. Einmal bestimmt sollte es dem Fachmann klar sein, dass er in jedem Test ähnliche Bedingungen wählen sollte, wobei die gleiche Analyt-Nukleinsäure verwendet wird.
Eine solche Bestimmung beginnt mit der Bereitstellung einer Probe, von der vermutet wird, dass sie die zu bestimmende Nukleinsäure enthält. Die Probe kann Schritten unterworfen worden sein, die die Nukleinsäuren in eine geeignete Form bringen, beispielsweise durch Lysieren beliebiger Zellen, in denen die Nukleinsäuren enthalten sein können, und die man ansonsten nicht bestimmen kann. Zudem können beliebige Schritte zur Bereitstellung der Probe Schritte zur Reinigung der zu bestimmenden Nukleinsäuren von Komponenten einer Ursprungsprobe, die die Bestimmung beeinträchtigen könnten, umfassen. Solche Komponenten können Enzyme sein, die bei Freisetzen einer Nukleinsäure aus Zellen, die Nukleinsäure spalten oder zersetzen würden, beispielsweise RNasen. Weiterhin werden die Nukleinsäure-Komponenten der Ursprungsprobe, die die Amplifikation der Nukleinsäuren beeinträchtigen könnten, vorzugsweise entfernt.
Es gibt verschiedene Möglichkeiten für die Bestimmung von Nukleinsäuren mit der erfindungsgemäßen nukleinsäurebindenden Verbindung. In einer ersten Gruppe wird die nukleinsäurebindende Verbindung als nachweisbare Sonde verwendet. In diesem Fall enthält die nukleinsäurebindende Verbindung eine nachweisbare Reportergruppe. Jegliche Hybride, die aus der nukleinsäurebindenden Verbindung und einer Nukleinsäure gebildet werden, können dann über die nachweisbare Reportergruppe bestimmt werden. Diese Gruppe von Tests kann weiter in zwei Gruppen unterteilt werden, nämlich in die Gruppe der homogenen Tests und die Gruppe der heterogenen Tests. Bei heterogenen Tests wird das Hybrid (Bindungsprodukt) bestimmt, wenn es an eine feste Phase gebunden ist. Diese Ausführungsform hat den Vorteil, dass jeglicher Sondenüberschuß und andere Komponenten leicht aus dem Hybrid entfernt werden können, sodaß die Bestimmung leichter erfolgt. Das gebildete Hybrid kann somit kovalent, nicht-kovalent, spezifisch oder unspezifisch in einer festen Phase eingefangen werden. Es gibt verschiedene Ausführungsformen, die dem Fachmann bekannt sind.
Bei den so genannten homogenen Tests wird das entstandene Hybrid nicht an eine feste Phase gebunden, wird aber entweder direkt oder indirekt in Lösung bestimmt. Ein bevorzugtes Beispiel für solche Tests ist in EP 0 543 942 offenbart. Die erfindungsgemäße nukleinsäurebindende Verbindung eignet sich besonders als Sonde in diesem Test. Da der hier offenbarte Test eine Feinabstimmung der Schmelztemperaturen der in diesen Tests verwendeten Primer und Sonden erfordert, ist die vorliegende Erfindung, die die Modulation einer Schmelztemperatur des Hybrids, das durch die zu bestimmende Nukleinsäure gebildet wird, oder von deren Amplifikaten, und der Sonde verwendet, besonders geeignet. Dies ist besonders von Nutzen, da die Selektivität bewahrt bleiben kann, weil die Tm durch Auswahl des a(n-x)-mer-Oligonukleotids anstelle eines n-mer-Oligonukleotids reduziert wird.
Daher ist eine weitere Aufgabe der Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit, Abwesenheit oder der Menge einer Nukleinsäure in einer Probe, umfassend die Schritte:

– Bereitstellen von Primern, wobei ein erster Primer im wesentlichen komplementär zu einer ersten Bindungssequenz der Nukleinsäure und der zweite Primer im wesentlichen komplementär zu einer Bindungssequenz eines Komplements dieser Nukleinsäure ist, und einer zu der Nukleinsäure oder dem Komplement davon komplementären Sonde zwischen den Bindungssequenzen der Primer, wobei die Sonde an unterschiedlichen Untereinheiten mit wenigstens zwei unterschiedlichen Reportergruppen markiert ist,
– Aussetzen der Probe mit den Primern und der Sonde unter Bedingungen, die die Verlängerung der Primer begünstigen und die Reportergruppen durch Spalten der Sonde voneinander trennen, und
– Bestimmen des Ausmaßes der Spaltung der Sonde über wenigstens eine der Reportergruppen,

_m

Bei einer weiteren Ausführungsform kann die erfindungsgemäße nukleinsäurebindende Verbindung als immobilisierbare oder immobilisierte Sonde zum Binden beliebiger Nukleinsäuren an eine Festphase verwendet werden. Modi zur Immobilisierung der Verbindung sind oben offenbart. In einem Test ist es entweder möglich, die Verbindung zu immobilisieren, bevor sie mit der Probe in Kontakt gebracht wird oder während des Inkontaktbringens der Probe mit einer Festphase oder sogar nach dem Inkontaktbringen der Probe mit der Festphase. In jedem dieser Fälle wird die zu bestimmende Nukleinsäure an die Festphase gebunden, und vorzugsweise können jegliche Substituenten der Probe, die nicht bestimmt werden sollen, aus der Festphase weggewaschen werden, wohingegen die Verbindungen und die Nukleinsäure gebunden bleiben. Danach kann das an die Festphase gebundene Hybrid durch bekannte Verfahren bestimmt werden, beispielsweise durch Verwendung einer nachweisbar markierten Sonde, wie oben erläutert, oder durch direkte Bestimmung des Hybrids, beispielsweise durch Inkontaktbringen des Hybrids mit interkalierenden Farbstoffen und Messen der Änderung an der festen Phase.
Bei einer anderen Ausführungsform wird die immobilisierte Sonde zum Isolieren oder Reinigen einer Nukleinsäure verwendet.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform verwendet eine nukleinsäurebindende Verbindung, die sowohl an eine Festphase gebunden als auch durch eine nachweisbare Reportergruppe markiert wird. Die Markierung in diesem Fall ist vorzugsweise eine Gruppe, deren nachweisbare Eigenschaften sich ändern, wenn die zu bestimmende Nukleinsäure an die Sonde bindet. Wiederum sind solche Verbindungen im Stand der Technik bekannt.
Der Fachmann kann die Sequenz einer nukleinsäurebindenden Verbindung entwerfen, wenn er die Sequenz der Nukleinsäure kennt, an die die nukleinsäurebindende Verbindung gebunden werden soll. In fast allen Fällen hat die Nukleinsäure eine Sequenz, die alle vier natürlichen Nukleobasen enthält. In diesem Fall möchte man sämtliche Basen auswählen, die sich bei Bindung an einen bestimmten Bereich der Nukleinsäure an Positionen befinden, die an C, A und T der Nukleinsäure Basenpaare binden können, d.h. G, T bzw. A. Diese Basen können jedoch durch äquivalente Basen, die mit den genannten Basen in der Nukleinsäure Basenpaare bilden können, ersetzt werden. Die Base, die an der Position an G in der Nukleinsäure ein Basenpaar bilden kann, wird nun ein oder mehrmals in der nukleinsäurebindenden Verbindung durch eine Gruppe von 1 ersetzt. Wie in dieser Erfindung offenbart, kann die Gruppe von 1 ebenfalls an andere Gruppierungen binden, damit beispielsweise die Orientierung der Bindung vom antiparallel-(Regulär-)-Modus in die Parallel (nicht-natürliche) Orientierung gezwungen wird.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Verwendung von 2-Azapurin der Formel I in einer nukleinsäurebindenden Verbindung als Ersatz für Cytosin, insbesondere zur Bindung der Nukleinsäuren, deren Basen nicht nur aus G bestehen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von 2-Azapurin der Formel I bei Hybridisierungsreaktionen von Sonden mit der Nukleinsäure als Base an der Position der Sonde, die am G in der Nukleinsäure eine Basenpaarung eingeht.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein Bindungsprodukt von mindestens einer erfindungsgemäßen nukleinsäurebindenden Verbindung und einer Nukleinsäure, wobei die nukleinsäurebindende Verbindung und die Nukleinsäure durch Basenpaarung in paralleler oder antiparalleler Orientierung aneinander gebunden sind. Das Bindungsprodukt kann ein Molekül der Nukleinsäure und ein Molekül der nukleinsäurebindenden Verbindung enthalten, die einen Duplex bilden, oder das Bindungsprodukt kann drei Stränge enthalten und ist somit ein Triplex. Der Triplex kann entweder zwei Moleküle der nukleinsäurebindenden Verbindung und einen Strang der Nukleinsäure enthalten oder er kann eine nukleinsäurebindende Verbindung und zwei Moleküle der Nukleinsäure enthalten. Die Art des gebildeten Triplexes hängt von der Konzentration und der Komplementarität der nukleinsäurebindenden Verbindung und der Nukleinsäure ab.
Die vorliegende Erfindung schafft die Möglichkeit zur Auswahl ähnlicher T_ms für eine Reihe von Sonden mit unterschiedlicher Sequenz. Somit handelt es sich bei einer bestimmten Aufgabe der Erfindung um Verfahren, wobei Nukleinsäuren unterschiedlicher Sequenzen gleichzeitig isoliert oder bestimmt werden sollen.
Bei einer ersten Ausführungsform ist dieses Verfahren ein sogenanntes Multiplex-Verfahren zur Isolation oder Bestimmung von Nukleinsäuren. Bei dieser Ausführungsform werden Sonden, die jeweils eine Sequenz enthalten, die komplementär ist zu einer Sequenz von einer der Nukleinsäuren (beispielsweise Nukleinsäuren aus unterschiedlichen Viren, wie HCV, HIV und HBV) mit einer T_m, die erfindungsgemäß angepaßt ist (eine oder mehrere Sonden, die eine Gruppe der Formel I enthalten) mit der Probe zusammengebracht, von der vermutet wird, dass sie die Nukleinsäuren enthält. Je nach dem Format können die verschiedenen Nukleinsäuren über die Hybride bestimmt werden, die mit den Sonden gebildet werden, und zwar entweder als Summe oder unabhängig.
Eine zweite Ausführungsform beruht auf Anordnungen von Sonden. Insbesondere ist eine Aufgabe der Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Nukleinsäuren, die jeweils eine bestimmte Sequenz in einer Probe umfassen, umfassend die Schritte:

– Inkontaktbringen der Probe mit einer Festphase mit auf ihrer Oberfläche immobilisierten nukleinsäurebindenden Verbindungen, die jeweils eine zu einer der bestimmten Sequenzen der Nukleinsäuren komplementäre Sequenz enthalten,
– Bestimmen der Ausbildung von Hybriden, die eine Nukleinsäure mit einer bestimmten Sequenz und die die komplementäre Sequenz enthaltende nukleinsäurebindende Verbindung enthalten, auf der Festphase dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der wenigstens einen der nukleinsäurebindenden Verbindungen um eine Verbindung handelt, die ein Grundgerüst aufweist, an dem heterozyklische Gruppen gebunden sind, die mit natürlichen Nukleobasen Basenpaare ausbilden können, wobei mindestens eine der heterozyklischen Gruppen eine der natürlich vorkommenden Nukleobasen ist, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine andere der heterozyklischen Gruppen eine Gruppe der allgemeinen Formel I ist.

Verfahren dieser Art sind entweder geeignet, wenn gleichzeitig eine Probe auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von Nukleinsäuren untersucht wird, beispielsweise eine Reihe verschiedener Bakterienarten. Auf diese Weise kann man nicht nur auf eine Art nach einander chargenweise untersuchen, sondern man kann gleichzeitig Sequenzinformationen über verschiedene Nukleinsäuren erhalten. Solche Arten von Verfahren sind im allgemeinen im Stand der Technik bekannt. Die vorliegende Erfindung hat jedoch festgestellt, dass die erfindungsgemäßen nukleinsäurebindenden Verbindungen besonders geeignet in derartigen Testarten sind, da die Schmelztemperatur derart eingestellt werden kann, dass sie für nukleinsäurebindende Verbindungen unterschiedlicher Sequenz oder/und Länge sehr ähnlich ist. Zur Erzielung ähnlicher Schmelztemperaturen jeder der nukleinsäurebindenden Verbindungen müssen offensichtlich nicht alle diese verschiedenen Verbindungen erfindungsgemäß modifiziert werden, aber der Fachmann kann diese Verbindungen, die sich nicht wie die anderen verhalten, einfach modifizieren, beispielsweise, indem sie eine viel höhere Schmelztemperatur als die Schmelztemperaturen der anderen Verbindungen auf der gleichen Festphase haben. Mit jedem C, das erfindungsgemäß ausgetauscht wird, kann die T_m um 3 bis 6°C fallen, vorzugsweise um 4 bis 5°C. Diesbezüglich hat der Fachmann, verglichen mit der derzeit bekannten Chip-Technologie, eine viel größere Flexibilität bei der Auswahl der bestimmten Sequenzen, die zur Bindung der verschiedenen Nukleinsäuren verwendet werden. Der hohe G-C-Gehalt solcher Bereiche in zu bestimmenden Nukleinsäuren verhinderte beispielsweise bisher, dass diese Bereiche sich als Zielregionen für solche Tests auf der Basis von Sonden eignen, die zu diesen Bereichen komplementär sind. Erfindungsgemäß können sogar diese Bereiche, die sehr spezifisch für die zu bestimmende Nukleinsäure sein können, in solchen Tests verwendet werden.
Tests, die Array-Technologie verwenden, sind dem Fachmann gewöhnlich bekannt, beispielsweise aus EP-A-0 476 014. Diese Festphasen sind vorzugsweise flache Träger. Auf ihrer Oberfläche befinden sich durch reine Oberfläche getrennte Anordnungen, an denen jeweils eine Sonde mit unterschiedlicher Sequenz gebunden ist, die an eine bestimmte spezifische Sequenz in einer Nukleinsäure gerichtet ist. Je nach den Erfordernissen des tatsächlichen Tests ist die Sequenz der Sonde im wesentlichen komplementär zu einer (oder mehreren) der jeweiligen Sequenzen, die in der zu bestimmenden Nukleinsäure enthalten sind. Während des Tests findet jede Nukleinsäure die Sonde auf der Oberfläche, an die sie binden kann. Die Bestimmung der Bildung von Hybriden in jeder Anordnung auf der Festphase ermöglicht die Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Nukleinsäuren, die die jeweilige Sequenz enthalten, auf der Basis der Änderung einer Eigenschaft in dieser spezifischen Anordnung. Diese Änderungen werden vorzugsweise mit Hilfe eines Computerprogramms bewertet, welches weiß, in welcher Anordnung sich eine bestimmte Sequenz befindet. Ein Chip kann 2 bis Tausende oder sogar Millionen Anordnungen enthalten, an die jeweils eine nukleinsäurebindende Verbindung mit einer spezifischen Sequenz gebunden ist, die einzigartig sein kann. Man kann jedoch sogar die Anwesenheit einer Gruppe von verschiedenen Nukleinsäuren bestimmen, die jeweils eine Sequenz gemeinsam haben, und zwar einfach durch Verwendung einer nukleinsäurebindenden Verbindung, die entweder relativ unspezifisch ist und somit verschiedene Sequenzen bindet, oder durch Auswahl der Sequenz der nukleinsäurebindenden Verbindungen, sodaß sie auf eine Sequenz gerichtet ist, die sich auf verschiedenen Nukleinsäuren befindet.
In einem zweiten, etwas anderen Ansatz, können solche Anordnungen zur Bestimmung der Sequenz einer Nukleinsäure verwendet werden, indem man den sogenannten "Sequenzieren durch Hybridisieren"-Ansatz einsetzt. In diesem Modus enthält die Probe vorzugsweise überwiegend Nukleinsäuren der gleichen Sequenz. Dies kann erzielt werden durch Isolieren der Sequenz aus einem Gemisch, in dem sie enthalten waren, oder durch Anreichern in einer In-vitro- oder In-vivo-Amplifikation. Die Sequenz der an die Festphase gebundenen nukleinsäurebindenden Verbindungen wird derart ausgewählt, dass sie alle zusammen eine Sequenz enthalten, die die zu bestimmende Sequenz in der Nukleinsäure abdeckt. Innerhalb dieser Sequenz überlappen die Sequenzen jeder nukleinsäurebindenden Verbindung jeweils um ein oder mehrere Basen. Bei dem Bestimmungsschritt dieses Verfahrens wird erfaßt, an welche dieser Partialsequenzen die Nukleinsäure binden wird, was (idealerweise) nur dann auftritt, wenn eine zur Partialsequenz komplementäre Sequenz auf einer zu bestimmenden Nukleinsäure enthalten ist. Die Bestimmung des Testergebnisses erfolgt vorzugsweise durch einen Computer. Der Computer bestimmt somit aus den Partialsequenzen, die anscheinend in der zu bestimmenden Sequenz enthalten sind, in welcher Reihe sie in der gesamten Nukleinsäure angeordnet gewesen sein müssen. Insbesondere bei dieser Art von Tests ist die vorliegende Erfindung sehr hilfreich, da bei diesem Ansatz eine große Anzahl von nukleinsäurebindenden Verbindungen an der Oberfläche fixiert werden muß, der nicht immer die Probleme berücksichtigen kann, die bei einem hohen G-C-Gehalt vorkommen. Bei der vorliegenden Erfindung kann man daher sogar Nukleinsäuren sequenzieren, deren Sequenzen gleichzeitig niedrigen und hohen G-C-Gehalt aufweisen.
Dem Fachmann ist es bekannt, dass jegliche Verbindung, wie hier offenbart, zu einem gewissen Grad als Tautomere und Salze zugegen sein kann. Diese Tautomere und Salze, vorzugsweise die Alkalisalze, am stärksten bevorzugt die Natriumsalze, liegen innerhalb der Definition der Formeln und sind Aufgabe der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele genauer beschrieben.
Beispiele
Allgemein
Monomere: Flash-Chormatographie (FC): bei 0,5 bar mit Silicagel 60 (Merck, Darmstadt, Deutschland). Lösungsmittelsysteme für FC und DC: CH₂Cl₂-MeOH 85:15 (A), EtOAc-MeOH 3:1 (B), CH₂Cl₂-MeOH 80:20 (C), CH₂Cl₂-HOAc-MeOH 17:1:3 (D), CH₂Cl₂-MeOH 9:1 (E), CH₂Cl₂-Aceton 85:15 (F). Die Proben wurden mit einem UltroRac II-Fraktionensammler (LKB Instruments, Schweden) gesammelt. Schmelzpunkte: Büchi SMP-20-Gerät (Büchi, Schweiz). UV-Spektren: U-3200 Spektralphotometer (Hitachi, Japan). NMR-Spektren: AC-250 und AMX-500 Spektrometer (Bruker, Deutschland); die δ-Werte sind auf internes Me₄Si oder externes H₃PO₄ bezogen. Die Fluoreszenzspektren wurden in H₂O an einem F-4500 Fluoreszenz-Spektralphotometer (Hitachi, Japan) aufgezeichnet. Die Mikroanalysen erfolgten durch Mikroanalytisches Laboratorium Beller (Göttingen, Deutschland).
Oligonukleotide: Die Oligonukleotide wurden mit einem ABI 392-DNA-Synthesegerät (Applied Biosystems, Deutschland) gemäß dem Standard-Protokoll mit dem "Trityl-Off"-Modus synthetisiert, jedoch wurden die unmodifizierten Oligodesoxynukleotide mit dem "Trityl-On"-Modus synthetisiert. Die Kopplungsausbeuten der modifizierten Phosphoramidite waren gewöhnlich durchschnittlich 95% (Trityl-Leitfähigkeitsüberwachung). Die detritylierten modifizierten Oligomere wurden durch Ionenaustausch-Chromatographie auf einer Dionex Nucleopac PA-100 HPLC-Säule (4 × 250 mm, P/N 043010, Dionex GmbH, Idstein, Deutschland) mit dem folgenden Gradienten gereinigt: 5 min 5% 0,01 M NaOH/1,5 M wäßr. LiCl (X) in 0,01 M NaOH (Y); 25 min 5–30% Y in X; 10 min 30–5% Y in X; 5 min 5% Y in X. Ionenaustausch-HPLC-Gerät: L-4250 UV/VIS-Detektor, L-6250-Intelligent-Pumpe und D-2500 Integrator (Merck-Hitachi, Deutschland). Die tritylierten unmodifizierten Oligonukleotide wurden durch RP-18 HPLC mit dem folgenden Gerät und Verfahren gereinigt: 250 × 4 mm RP-18-Säule (Merck, Deutschland); Merck-Hitachi HPLC-Gerät, bestehend aus einem 655 A-12 Flüssigkeitschromatographen mit einem UV-Monitor mit 655 A variabler Wellenlänge und einem D-2000 Chromato-Integrator (Merck-Hitachi, Darmstadt, Deutschland); Gradienten von 0,1 M (Et₃NH)OAc (pH-Wert 7,0)/MeCN 95:5 (U) und MeCN (V); Gradient I: 0–50 min 0–50% V in U, Fließgeschwindigkeit 1 ml/min; Gradient II: 0–20 min 0–20% V in U; 20–40 min 20–40% V in U, Fließgeschwindigkeit 1 ml/min. Die Detritylierung erfolgte durch Behandeln der gereinigten Oligomere mit einer 2,5% Dichloressigsäurelösung in CH₂Cl₂ (1 ml) für 5 min. Nach der Neutralisierung mit Et₃N, Eindampfen bis zur Trockne, gefolgt von Co-Verdampfen mit MeOH wurden die Oligomere erneut durch RP-18 HPLC mit der vorstehend genannten Vorrichtung gereinigt. Gradient: 0–30 min 0–20% V in U, 30–35 min 20% V in U, 35–40 min 20–0% V in U, 40–45 min 0% V in U. Das anschließende Entsalzen für sämtliche Oligonukleotide erfolgte auf einer RP-19 HPLC-Säule (4 × 100 mm) mit dem Gerät, wie oben beschrieben. Das Lösungsmittel zur Adsorption: H₂O, Lösungsmittel zur Desorption: MeOH-H₂O 3:2. Allgemeine Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min. MALDI-TOF Massenspektren der Oligonukleotide wurden auf einem Eigenbaugerät mittels UV-Laserbestrahlung bei 337 nm für 3 nsec. gemessen.
Die enzymatische Hydrolyse der Oligomere erfolgte wie in Helv. Chim. Acta 1998, 81, 1139–1155 beschrieben, jedoch unter Verwendung einer Fließgeschwindigkeit von 0,6 ml/min. Die Quantifizierung der Bestandteile erfolgte auf der Basis der Peak-Flächen, welche durch die Extinktionskoeffizienten des Nukleosids geteilt wurden (ε₂₆₀-Werte: dA 15400, dC 7300, dG 11400, dT 8800, z²A_d 8200). Schlangengift-Phosphodiesterase EC 3.1.15.1, Crotallus durissus) und alkalische Phosphatase (EC 3.1.3.1, E. coli), die zur enzymatischen Hydrolyse von Oligonukleotiden verwendet wurden, stammten von Roche Diagnostics GmbH.
Bestimmung der Schmelzkurven und Thermodynamiken: Profile von Extinktion gegen Temperatur wurden gemessen auf Cary 1- oder 1E-Spektralphotometern (Varian, Australien) mit einem thermoelektrischen Regler von Cary. Die T_m-Werte wurden in der Referenzzelle mit einem Pt-100-Widerstand gemessen, und die thermodynamischen Daten (ΔH°, ΔS°, ΔG°₂₉₈) wurden mit dem Programm MeltWin 3.0 berechnet. Die Zirkulardichroismus-Spektren wurden auf einem Jasco 600 (Jasco, Japan) Spektralpolarimeter, einem thermostatisch gesteuerten Bad (Lauda RCS-6) in einer 1 cm-Küvette aufgezeichnet.
Beispiel 1
3-(2-Desoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-3H-imidazo[2,1-i]purin (N¹-N⁶-Etheno-2'-desoxyadenosin (5)). 2'-Desoxyadenosinmonohydrat (1) (5,0 g, 20 mmol) wurde in 1 M wäßr. Natriumacetat-Puffer (pH-Wert 4,5–5,0, 110 ml) durch Aufwärmen auf 40 bis 50°C gelöst. Zu der Lösung wurde Chloracetaldehyd (50% wäßr. Lösung, 7,7 mol/l, 25 ml) dazugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde für 70 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Die gelbe Lösung wurde bis zur Trockne verdampft, und der Rückstand wurde in MeOH gelöst und filtriert, sodaß das anorganische Salz entfernt wurde. Nach dem Waschen mit MeOH wurden die vereinigten Filtrate und Waschlösungen im Vakuum bei 40 bis 50°C eingeengt. Der Rückstand wurde auf FC (Silicagel 60H, Säule 20 × 6 cm) aufgetragen. Die Elution mit CH₂Cl₂-MeOH (85:15) ergab eine Hauptfraktion, aus der beim Verdampfen des Lösungsmittels und anschließender Kristallisation aus MeOH-EtOAc Verbindung 5 (3,86 g, 70%) als farblose Kristalle isoliert wurde. Schmp. 138–141°C. DC (Silicagel, EtOAc-MeOH, 3:1). R_f 0,4 UV (MeOH): λ_max 275 (7300), 265 (7600), 258 (6600), 229 nm (35700). ¹H-NMR ([D₆]DMSO) δ 2,39 (m, 1H, H_α-C(2')); 2,70 (m, 1H, H_β-C(2')); 3,57 (m, 1H, H_α-C(5')); 3,67 (m, 1H, H_b-C(5')); 3,88 (m, 1H, H-C(4'); 4,43 (m, 1H, H-C(3')); 4,99 (t, 1H, ³J (H, H) = 5,2 Hz, 5'-OH); 5,38 (d, 1H, ³J (H, H) = 3,8 Hz, 3'-OH); 6,47 (pt, 1H, ³J (H, H) = 6,2 Hz, H-C(1')); 7,55 (s, 1H, H-C(11); 8,07 (s, 1H, H-C(10); 8,53 (s, 1H, H-C(2)); 9,29 (s, 1H, H-C(8)).
Beispiel 2
1-(2-Desoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-5-amino-4-(imidazol-2''-yl)-imidazol (6). Verbindung 5 (3,85 g, 14 mmol) wurde mit 1 N wäßr. NaOH (60 ml) bei Raumtemperatur über Nacht behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Zugabe von 2 N wäßr. HCl auf pH-Wert 7 eingestellt und zu einem Sirup eingeengt. Dieser wurde in absolutem MeOH gelöst, und das gefällte NaCl wurde abfiltriert und mit MeOH gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden vereinigt und verdampft. Der Rückstand wurde einer FC (Silicagel 60H, Säule: 20 × 6 cm) unterworfen. Die Elution mit CH₂Cl₂-MeOH (C) ergab eine Hauptzone, aus der Verbindung 6 (2,70 g, 73%) als farbloser Schaum erhalten wurde, der ohne weitere Reinigung für die nächsten Reaktionen verwendet wurde. Eine Analyseprobe wurde aus MeOH-EtOAc kristallisiert, sodaß farblose kugelförmige Kristalle erhalten wurden; Schmp. 91–93°C (Zers.). DC (Silicagel, CH₂Cl₂-HOAC-MeOH, 17:1:3): R_f 0,22. UV (MeOH): λ_max 271 nm (12800). ¹H-NMR ([D₆]DMSO) δ 2,21 (m, 1H, H_α, -C(2')); 2,47 (m, 1H, H_β C(2')); 3,57 (m, 2H, H₂-C(5')); 3,84 (m, 1H, H-C(4')); 4,36 (m, 1H, H-C(3')); 6,00 (pt, 1H, ³J (H, H) = 6,5 Hz, H-C(1')); 6,60 (br. s, NH₂); 7,13 (s, 2H, H-C(4) + H-C(5)); 7,55 (s, 1H, H-C(2)); 8,16 (s, NH).
Beispiel 3
3-(2-Desoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-1H-diimidazo[1,2-c:4',5'-e][1,2,3]-triazin (N¹-N⁶-Etheno-2-aza-2'-desoxyadenosin, 7). Eine Lösung von Verbindung 6 (4,50 g, 17 mmol) in 80% wäßr. HOAc wurde mit Natriumnitrit (1,17 g, 17 mmol) in einem Eiswasserbad für 1 Std. behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde zu einem Sirup eingedampft. Dieser wurde in H₂O gelöst, und mehrmals eingedampft, um HOAc zu entfernen. Der Rückstand wurde auf FC (Silicagel 60H, Säule, 20 × 6 cm) aufgetragen. Die Elution mit CH₂Cl₂-MeOH (85:15) ergab Verbindung 7 (2,50 g, 53%) beim Eindampfen. Schmp. 151–152°C (Zers.). DC (Silicagel, CH₂Cl₂-MeOH, 4:1): R_f 0,5 UV (MeOH: λ_max 282 (3100), 268 (3200), 238 nm (37900). ¹H-NMR ([D₆]DMSO) δ 2,54 (m, 1H, H_α-C(2')); 2,85 (m, 1H, H_β-C(2')); 3,97 (m, 2H, H₂-C(5')); 4,00 (m, 1H, H-C(4')); 4,50 (m, 1H, H-C(3')); 4,96 (t, 1H, ³J (H, H) = 5,4 Hz, 5'-OH); 5,41 (d, 1H, ³J (H, H) = 4,3 Hz, 3'-OH); 6,69 (pt, 1H, ³J (H, H) = 6,3 Hz, H-C(1')); 7,85 (d, 1H, ³J (H, H) = 1,1 Hz, H-C(11)); 8,75 (d, 1H, ³J (H, H) = 1,1 Hz, H-C(10)); 8,95 (s, 1H, H-C(8)). Anal. berechn. für C₁₁H₁₂N₆O₃ (276,25): C 47,83, H 4,38, N 30,42; gefunden: C 47,71, H 4,32, N 30,32.
Beispiel 4
4-Amino-7-(2-desoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-7H-imidazo[4,5-d][1,2,3]-triazin(2-aza-2'-desoxyadenosin, 2). Verbindung 7 (0,56 g, 2 mmol) wurde in 1 M wäßr. Natriumacetat-Puffer (pH-Wert 4,0–4,5, 120 ml) durch Aufwärmen auf 40 bis 50°C gelöst. Zu dieser Lösung wurde N-Bromsuccinimid (2,8 g, 16 mmol) gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde eingedampft, und auf eine Dowex 1 × 8-Ionenaustauschsäule (3 × 12 cm, OH^–-Form) aufgetragen. Die Elution mit H₂O (250 ml) ergab Verbindung 2 (0,19 g, 38%) als farblose Nadeln, die sich über 185°C zersetzen. Das Reaktionsprodukt war zu einer authentischen Probe in jeder Hinsicht identisch^[21].
Vergleichsbeispiel 5
7-(2-Desoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-7H-imidazo[4,5-d][1,2,3]-triazin-4-on(2-aza-2'-desoxyinosin, 3). Verbindung 2 (19 mg, 0,076 mmol) wurde in H₂O gelöst, und Adenosindesaminase (2 μg, aus Kalbsdarm, gelöst in Glycerin) wurde dazugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 18 Std. bei Raumtemperatur gerührt, bis 2 vollständig verschwunden war (UV-Überwachung) und dann in einem SpeedVac-Konzentrator bis zur Trockne eingedampft. UV (H₂O): λ_max 247 (5500), 290 nm (6200). ¹H-NMR (D₂O): 2,49 (m, 1H, H_α-C(2')); 2,75 (m, 1H, H_β-C(2')); 3,41, 3,50 (2m, 2H, H₂-C(5')); 4,03 (m, 1H, H-C(4')); 4,51 (m, 1H, H-C(3')); 6,43 (pt, 1H, ³J (H, H) = 3,2 Hz, H-C(1')); 8,31 (s, 1H, H-C(8)).
Beispiel 6
4-(Benzoylamino)-7-(2-desoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-7H-imidazo[4,5-d][1,2,3]-triazin (8). Verbindung 2 (125 mg, 0,5 mmol) wurde zweimal mit wasserfreiem Pyridin co-verdampft. Der Rückstand wurde in wasserfreiem Pyridin suspendiert und mit Trimethylsilylchlorid (0,5 ml, 4 mmol) behandelt. Nach wenigen Minuten Rühren entstand eine klare Lösung. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 2 Std. gerührt. Anschließend wurde Benzoylchlorid (0,25 ml, 2 mmol) dazugegeben, und das Rühren wurde für weitere 2 Std. fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde in einem Eiswasserbad abgekühlt, und H₂O (1 ml) wurde zugegeben. Nach 10 min wurde das Reaktionsgemisch mit wäßr. konz. NH₃ (0,8 ml) behandelt, und für weitere 30 min belassen. Das Gemisch wurde dann bis zur Trockne verdampft, mit H₂O behandelt, und mit EtOAc (3 × 20 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden getrocknet (Na₂SO₄) und auf eine Silicagelsäule (3 × 15 cm) aufgetragen. Die Elution erfolgte mit CH₂Cl₂ (150 ml), gefolgt von CH₂Cl₂-MeOH (9:1). Die nukleosidhaltigen Fraktionen wurden bis zur Trockne verdampft, und Verbindung 8 wurde aus MeOH-H₂O kristallisiert, sodaß farblose Nadeln (135 mg, 76%) erhalten wurden. Schmp. 208–210°C (Zers. > 170°C). DC (Silicagel, CH₂Cl₂-MeOH 9:1): R_f 0,31. UV: (10% MeOH in Wasser): λ_max 233 (15600), 276 nm (16400). ¹H-NMR ([D₆]DMSO): δ 2,97 (2m, 2H, H₂-C(2')); 3,69 (m, 2H, H₂-C(5')); 4,00 (m, 1H, H-C(4')); 4,57 (m, 1H, H-C(3')); 5,07 (t, 1H, ³J (H, H) = 4,8 Hz, 5'-OH), 5,49 (d, 1H, ³J (H, H) = 4,0 Hz, 3'-OH); 6,72 (t, 1H, ³J (H, H) = 6,5 Hz, H-C(1')); 7,61–7,78 (m, 4H, aromatisches H), 8,16 (d, 2H, aromatisches H); 9,09 (s, 1H, H-C(8)); 11,84 (s, 1H, N-H). Anal. berechn. für C₁₆H₁₆N₆O₄ (356,3): C 52,93, H, 4,41, N 23,38; gefunden: C 52,68, H 4,39, N, 23,07.
Beispiel 7
7-(2-Deoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-4-{[(dimethylamino)methyliden]-amino}-7H-imidazo[4,5-d][1,2,3]-triazin (9a). Zu einer gerührten Suspension von Verbindung 2 (63 mg, 0,25 mmol) in MeOH (5 ml) wurde N,N-Dimethylformamiddimethylacetal (120 mg, 0,5 mmol) zugegeben. Das Rühren erfolgte weitere 2 Std. bei Raumtemperatur. Das Reaktionsgemisch wurde bis zur Trockne verdampft, und der Rückstand wurde auf Silicagel adsorbiert. Die Flash-Chromatographie auf einer Silicagelsäule (3 × 10 cm) mit CH₂Cl₂ (100 ml), gefolgt von CH₂Cl₂-MeOH (9:1) ergab farblose Nadeln (MeOH-H₂O, 65 mg, 85%), Schmp. 173–175°C. DC (Silicagel, CH₂Cl₂-MeOH, 9:1): R_f 0,28. UV: (10% MeOH in H₂O): λ_max 234 (13250), 319 nm (29500). ¹H-NMR ([D₆]DMSO): δ 2,84 (2m, 2H, H-C(2')); 3,17, 3,25 (2s, 2H, N-CH₃); 3,60 (m, 2H, H₂-C(5')); 3,92 (m, 1H, H-C(4')); 4,47 (m, 1H, H-C(3')); 5,05 (t, 1H, ³J (H, H) = 4,9 Hz, 5'-OH); 5,39 (d, 1H, ³J (H, H) = 4,0 Hz, 3'-OH); 6,55 (t, 1H, ³J (H, H) = 6,6 Hz, H-C(1')); 8,79 (s, 1H, N=CH); 9,08 (s, 1H, H-C(8)).
Anal. berechn. für C₁₂H₁₇N₇O₃ (307,3): C 46,90, H 5,58, N 31,90; gefunden: C 46,55, H 5,68, N 31,66.
Beispiel 8
7-(2-Desoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-4-{[(di-isobutylamino)methyliden]-amino}-7H-imidazo[4,5-d][1,2,3]-triazin (9b). Wie für 9a beschrieben, jedoch mit N,N-Diisobutylformamiddimethylacetal. Farblose Kristalle (72%). Schmp. 138–140°C. DC (Silicagel, CH₂Cl₂-MeOH, 9:1): R_f 0,40. UV (10% MeOH in Wasser): λ_max 236 (10100), 325 nm (25850). ¹H-NMR ([D₆]DMSO): δ 0,88, 0,94 (2d, 12H, CH₃); 1,95, 2,20 (2m, 2H, CH); 2,80 (2m, 2H, H₂-C(2')); 3,30–3,74 (m, 6H, H₂-C(5') und 2CH₂); 4,00 (m, 1H, H-C(4')); 4,45 (m, 1H, H-C(3')); 5,03 (t, 1H, ³J (H, H) = 4,9 Hz, 5'-OH); 5,37 (d, 1H, ³J (H, H) = 4,0 Hz, 3'-OH); 6,54 (t, 1H, ³J (H, H) = 6,4 Hz, H-C(1')); 8,78 (s, 1H, N=CH); 9,10 (s, 1H, H-C(8)). Anal. berechn. für C₁₈H₂₉N₇O₃·½H₂O (400,5): C 53,99, H 7,55, N 24,48; gefunden: C 53,65, H 7,62, N 24,11.
Beispiel 9
7-(2-Desoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-4-{[(di-n-butylamino)methyliden]-amino}7H-imidazo[4,5-d][1,2,3]-triazin (9c). Wie für 9a beschrieben, aber mit N,N-di-n-Butylformamiddimethylacetal. Farblose Nadeln (75%). Schmp. 107–109°C. DC (Silicagel, CH₂Cl₂-MeOH, 9:1): R_f 0,42. UV: (10% MeOH in Wasser): λ_max 235 (10200), 325 nm (25700). ¹H NMR ([D₆]DMSO): δ 0,93 (t, 6H, CH₃), 1,33, 1,64, 3,70 (3m, 12H, -CH₂-); 2,45, 2,80 (2m, 2H, H₂-C(2')); 3,60 (m, 2H, H₂-C(5')); 3,92 (m, 1H, H-C(4')); 4,48 (m, 1H, H-C(3')); 5,04 (t, 1H, ³J (H, H) = 5,8 Hz, 5'-OH); 5,39 (d, 1H, ³J (H, H) = 4,0 Hz, 3'-OH); 6,55 (pt, 1H, ³J (H, H) = 6,3 Hz, H-C(1')); 8,78 (s, 1H, N=CH); 9,08 (s, 1H, H-C(8)). Anal. berechn. für C₁₈H₂₉N₇O₃ (391,5): C 55,23, H 7,47, N 25,05; gefunden: C 55,36, H 7,66, N 24,97.
Beispiel 10
7-[2-Desoxy-5-O-(4,4'-dimethoxytriphenylmethyl)-β-D-erythro-pentofuranosyl]-4-{[(di-n-butylamino)methyliden]amino}-7H-imidazo[4,5-d][1,2,3]-triazin (10a). Verbindung 9c (390 mg, 1 mmol) wurde zweimal mit Pyridin co-verdampft, und der ölige Rückstand wurde in wasserfreiem Pyridin (6 ml) gelöst. Anschließend wurde 4,4'-Dimethoxytriphenylmethylchlorid (450 mg, 1,3 mmol) dazugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde für 2 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Daraufhin wurde MeOH (0,2 ml) dazugegeben, und das Rühren wurde für 15 min fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde in 15 ml einer wäßr. 5% NaHCO₃-Lösung gegossen, und diese wurde zweimal mit CH₂Cl₂ (30 ml jeweils) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über Na₂SO₄ getrocknet, verdampft, und der Rückstand wurde auf Silicagel adsorbiert. Dies wurde auf eine Silicagel 60H-Säule (4 × 14 cm) aufgetragen und mit einem CH₂Cl₂-Aceton-Gradienten (0→25% Aceton, Gesamtvolumen, 600 ml) chromatographisch aufgetrennt. Die nukleosidhaltigen Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft, sodaß Verbindung 10a als fester Schaum (560 mg, 81%) erhalten wurde. DC: (Silicagel, CH₂Cl₂-Aceton, 85:15): R_f 0,15, ¹H-NMR ([D₆]DMSO): 0,93 (t, 6H, CH₃); 1,34, 1,63, 3,75 (3m, 12H, -CH₂-); 2,95 (2m, 2H, H-C(2')); 3,51 (m, 2H, H₂-C(5')); 3,63, 3,69 (2s, 6H, OCH₃); 4,01 (m, 1H, H-C(4')); 4,59 (m, 1H, H-C(3')); 5,45 (d, 1H, ³J (H, H) = 4,1 Hz, 3'-OH); 6,57 (pt, 1H, ³J (H, H) = 6,2 Hz, H-C(1')); 6,60–7,30 (m, 13H, Phenyl-H); 8,71 (s, 1H, N=CH), 9,07, (s, 1H, H-C(8)). Anal. berechn. für C₃₉H₄₇N₇O₅ (693,8): C 67,51; H 6,83; N 14,13; gefunden: C 67,15, H 6,82, N 14,13.
Beispiel 11
7-[2-Desoxy-5-O-(4,4'-dimethoxytriphenylmethyl)-β-D-erythro-pentofuranosyl]-4-{[(di-n-butylamino)-methyliden]amino}-7H-imidazo[4,5-d][1,2,3]-triazin-3'-[(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidit] (10b). Zu einer Lösung von Verbindung 10a (300 mg, 0,43 mmol) in wasserfreiem CH₂Cl₂ (20 ml) wurden N,N-Diisopropylethylamin (145 μl, 0,88 mmol) und Chlor-(2-cyanoethoxy)-N,N-diisopropylaminophosphin (143 μl, 0,62 mmol) unter einer Ar-Atmosphäre gegeben. Nach Rühren für 20 min bei Raumtemperatur wurde eine 5%ige wäßr. NaHCO₃-Lösung (15 ml) gegeben, und das Gemisch wurde mit CH₂Cl₂ (2 × 30 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und eingedampft. FC (Silicagel, Säule 5 × 10 cm CH₂Cl₂/Aceton, 85:15) ergab ein Gemisch aus Diastereoisomeren der Titelverbindung (300 mg, 78%). DC (Silicagel, CH₂Cl₂/Aceton, 85:15): R_f 0,71, 0,80. ³¹P-NMR (CDCl₃): 149,962, 150,223.
Beispiel 12
5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-6-N-((di-n-butylamino)-methylen)-2-aza-2'-desoxyadenosin-3'-[(2-cyanoethyl)-N,N-(diisopropyl)]phosphoramidit (12). Zu einer Lösung von 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-6-N-((di-n-butylamino)methylen)-2-aza-2'-desoxyadenosin (300 mg, 0,43 mmol) in wasserfreiem CH₂Cl₂ (20 ml) wurden (i-Pr)₂EtN (145 μl, 0,88 mmol) und Chlor-(2-cyanoethoxy)(diisopropylamino)phosphin (143 μl, 0,62 mmol) gegeben. Nach Rühren für 20 min bei RT wurde eine 5%ige wäßr. NaHCO₃-Lösung (15 ml) dazugegeben, und das Gemisch wurde mit CH₂Cl₂ (2 × 30 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und eingedampft. FC (Silicagel, Säule 5 × 10 cm, CH₂Cl₂/Aceton, 85:15) ergab ein Gemisch von Diastereoisomeren NR-411 (300 mg, 77%). DC (Silicagel, CH₂Cl₂/Aceton, 85:15): R_f 0,71, 0,80. ³¹P-NMR (CDCl₃) 149,962, 150,223.
Beispiel 13
Synthese der nukleinsäurebindenden Verbindungen mit den Monomeren von Beispiel 12.
Die Synthese erfolgte wie im allgemeinen Abschnitt beschrieben.
Beispiel 14
Bestimmung von Nukleinsäuren mittels der Sonden gemäß Beispiel 13. Tabelle 1. T_m-Werte und thermodynamische Parameter von Doppelstrang-Bildung von Oligonukleotiden, die 2-Aza-2'-desoxyadenosin enthalten.
10 mM Na-Cacodylat, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, pH-Wert 7; 5 μM Einzelstrang-Konzentration; 6: z²A_d.
Die beiden Oligonukleotide 5'-d (TAGGTCAATACT) und 5'-d (AGTATTGACCTA) wurden konstruiert, sodaß ein stabiles Hybrid mit einem T_m-Wert von 47°C erzeugt wurde. Dieser Doppelstrang wird als Standard verwendet, um den Einfluss von modifizierten Basen auf die Duplex- Struktur und Stabilität zu untersuchen. Tabelle 1 zufolge reduziert der Austausch von einem zentralen dA-dT gegen ein z²A_d-dT-Basenpaar die T_m des Duplexes um 5°; der Austausch von zwei Basenpaaren ergibt eine Abnahme der T_m um 10°. Die Reduktion der Duplex-Stabilität ist offensichtlich unabhängig von der Position des Basenpaaraustausches: Der Doppelstrang mit zwei aufeinander folgenden z²A_d-dT-Paaren, weist die gleiche T_m wie der Duplex auf, bei dem die modifizierten Basenpaare durch drei normale getrennt sind. Die Duplex-Stabilität wird weiter linear gesenkt, wenn die Anzahl der z²A_d-dT-Basenpaare erhöht wird; das Oligonukleotid mit vier modifizierten Paaren weist eine T_m von nur 28°C auf. Dieses Ergebnis steht in auffälligem Kontrast zu den Befunden über Oligonukleotide, in denen dA-Reste durch 8-Aza-2'-desoxyadenosin ausgetauscht sind; hier übt die Einführung von sogar vier z⁸A_d-Resten anstelle von dA keinen Einfluss auf die Duplex-Stabilität aus.
Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, dass die TM eines Oligonukleotids, bei dem ein G-C-Basenpaar an Position 7 (letzte Zeile in Tabelle 1) eine TM von 54°C hat. Der Austausch von zwei C's in diesen Basenpaaren durch 2-Azaadenin ergibt eine TM von 46°C (7 Duplex). Die gleiche TM ist vorhanden, wenn diese künstlichen Basenpaare durch das natürliche Basenpaar A-T (erster Duplex) ersetzt werden. Darüber hinaus hat der Doppelstrang ein gemischtes 2-Azaadenin/G und A-T-Basenpaar (dritter Duplex). Aus Tabelle 1 geht hervor, dass der Austausch von einem G-C-Basenpaar durch ein künstliches Basenpaar der vorliegenden Erfindung die TM um 3 bis 5°C, vorzugsweise 4°C senkt.
Die vorstehend beschriebenen Ergebnisse wurden für Duplices mit antiparalleler Kettenorientierung gefunden. Das gleiche Ergebnis wurde jedoch ebenfalls für Oligonukleotid-Duplices mit paralleler Strangpolarität gefunden. Die Kettenorientierung natürlich vorkommender DNA ist antiparallel (aps). Diese Orientierung kann in parallel umgewandelt werden, wenn der Duplex isoG_d-dC und/oder isoMe⁵C_d-dG-Basenpaare enthält (Helv. Chim. Acta. 1997, 80, 73–85). Da die Paarung von dA mit dT ungewiss ist, kann jede natürliche DNA im Parallelmodus hybridisiert werden, wenn der zweite Strang die Basen Isoguanin, Isocytosin, Adenin und Thymin enthält. Ein Duplex ist beispielsweise in Tabelle 1 angegeben. Werden in diesem Duplex zwei dA-dT-Basenpaare durch z²A_d-dT ersetzt, wird eine Reduktion des T_m-Wertes um 10° bestimmt, was mit den Ergebnissen für entsprechende antiparallele Oligonukleotid-Duplices übereinstimmt. Die in Tabelle 1 aufgeführten T_m-Daten zeigen ein weiteres interessantes Merkmal der Basenpaarungseigenschaften von z²A_d (2). Angeregt durch den Befund, dass der Austausch eines destabilisierenden zentralen z²A_d-dT-Basenpaars durch z²A_d-dG den T_m-Wert des Oligomers zurück auf den Wert des unmodifizierten Duplexes (T_m 46°C) steigert, untersuchten wir die Duplex-Stabilitäten von Oligomeren, die Fehlpaarungen enthalten.
Zu diesem Zweck wurden Oligodesoxynukleotide synthetisiert, in denen zwei zentrale z²A_d-Reste gegenüber von entweder zwei dT-, dA-, dC- oder dG-Resten untergebracht werden. In sämtlichen Fällen, außer für z²A_d-dG-enthaltende Duplices wird der T_m-Wert signifikant gesenkt – am eindeutigsten für das Oligomer mit zwei z²A_d-dC-Paaren. Dieses Oligonukleotid weist jedoch fast den gleichen Wert auf, wie der unmodifizierte Duplex. Dies veranlasste uns, ein z²A_d-dG-Basenpaar vorzuschlagen, wie es in der 1 und 6 gezeigt ist (Motiv 1). Somit kann die vorliegende Erfindung ebenfalls in Tests verwendet werden, in denen Nukleinsäuren mittels Fehlpaarungen unterschieden werden sollten.
Die Befunde über die bestimmte Basenpaarung von 2-Aza-2'-desoxyadenosin legen nahe, dass dieses Nukleosid ähnliche Paarungseigenschaften wie 2'-Desoxyguanosin (isoG_d) aufweist, und zwar umso mehr als beide ein ähnliches Wasserstoffbrückenbindungs-Donor-Akzeptormuster zeigen, wenn man eine Keto/H-N(3)- tautomere Form von 2'-Desoxyguanosin annimmt (6, Motiv II). Tatsächlich bildet letzteres ein Purin-Purin-Basenpaar mit 2'-Desoxyguanosin in Oligodesoxynukleotiden mit einer antiparallelen Strangpolarität, aber erheblich schwächere Basenpaare mit dC und dT, und besonders mit dA.
Aufgrund dieser Ergebnisse nehmen wir an, dass parallel ausgerichtete Oligonukleotide 2-Aza-2'-desoxyadenosin unter neutralen Bedingungen ein Basenpaar mit isoG_d (7, Motiv III) bilden, sowie mit protoniertem dC (7, Motiv V) in antiparallel angeordneten Duplices. Andererseits sollte mit protoniertem 2'-Desoxyisocytidin ein antiparalleles Basenpaar nach dem in 7 dargestellten Strukturmotiv VI gebildet werden.

Claims

Nukleinsäurebindende Verbindung, umfassend ein Grundgerüst, an das zur Basenpaarung mit natürlichen Nukleobasen fähige heterozyklische Gruppen gebunden sind, wobei es sich bei wenigstens einer der heterozyklischen Gruppen um eine der natürlich vorkommenden Nukleobasen handelt, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei wenigstens einer weiteren der heterozyklischen Gruppen um eine Gruppe der allgemeinen Formel I
handelt, wobei W für N steht, Z ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N und C, mit der Maßgabe, daß, – falls Z für N steht, X unabhängig von Y ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N und CR³, und Y unabhängig von X ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N und CR⁴, und es sich bei der Bindung zwischen X und Y um eine Doppelbindung und bei der Bindung zwischen Y und Z um eine Einfachbindung handelt und, – falls Z für C steht, X für NR³³ steht und Y ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N und CR⁴, und es sich bei der Bindung zwischen Z und Y um eine Doppelbindung und bei der Bindung zwischen X und Y um eine Einfachbindung handelt, wobei R¹ für NR⁵R⁶ steht, R³ und R⁴ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus -H, -Halogen, -OR¹³, -SR¹⁹, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₂-C₁₀)-Alkenyl, -(C₂-C₁₀)-Alkinyl, -NO₂, -NR⁵R⁶, -Cyano und -C(=O)R¹¹, R¹¹ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -OH, -(C₁-C₆)-Alkoxy, -(C₆-C₂₂)-Aryloxy und -NHR¹², R⁵, R⁶, R¹², R¹³, R¹⁹ und R³³ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₂-C₁₀)-Alkenyl, -(C₂-C₁₀)-Alkinyl, -(C₆-C₂₂)-Aryl, einer Schutzgruppe und einer Reportergruppe, r und s unabhängig voneinander eine ganze Zahl von 1 bis 18 darstellen, D die Position der Bindung der Gruppe an den Rest der nukleinsäurebindenden Verbindung darstellt und wobei das Alkyl, Alkenyl und Alkinyl gegebenenfalls mit einer oder mehreren Gruppierungen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -Halogen, -SH, -S-(C₁-C₆)-Alkyl, -(C₁-C₆)-Alkoxy, -OH, -NR⁵R⁶, -COR¹¹, -NH-CONR⁵R⁶, -NH-CSNR⁵R⁶ und -[O-(CH₂)_r]_s-NR⁵R⁶, substituiert ist.
Nukleinsäurebindende Verbindung nach Anspruch 1, wobei das Grundgerüst Zucker- und Phosphat-gruppierungen umfaßt.
Nukleinsäurebindende Verbindung nach Anspruch 2, wobei die Zuckerkonfiguration ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus der ☐-D-, ☐-D-, ☐-L- und ☐-L-Konfiguration.
Nukleinsäurebindende Verbindung nach Anspruch 3, wobei es sich bei der Zuckergruppierung um eine 2'-Desoxy-☐-D-erythropentofuranosyl-Gruppierung handelt.
Nukleinsäurebindende Verbindung nach einem der Ansprüche 1–4, wobei das Grundgerüst eine oder mehrere Gruppierungen der allgemeinen Formel II
umfaßt, wobei A ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus O, S und N-(C₁-C₁₀)-Alkyl, L ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Oxy, Sulfandiyl und -NR²²-, T ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Oxo, Thioxo und Selenoxo, U ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -OH, -O-Reportergruppe, -SH, -S-Reportergruppe, -SeH, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₆-C₂₂)-Aryl, -(C₆-C₁₄)-Aryl-(C₁-C₁₀)-alkyl, -NR²³R²⁴ und -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O-(C₁-C₁₀)-alkyl-R²⁵, oder wobei -NR²³R²⁴ zusammen mit N einen 5–6-gliedrigen heterozyklischen Ring darstellen kann, V ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Oxy, Sulfandiyl oder -NR²²-, R¹⁴ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -OH, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₂-C₁₀)-Alkenyloxy, -Halogen, -Azido, -O-Allyl, -O-Alkinyl und -NH₂, R²² unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe -H und -(C₁-C₁₀)-Alkyl, R²³ und R²⁴ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₁-C₂₀)-Aryl, -(C₆-C₁₄)-Aryl-(C₁-C₁₀)-alkyl, -(C₁-C₆)-Alkyl-[NH(CH₂)_c]_d-NR²⁶R²⁷ und einer Reportergruppe, R²⁵ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -OH, -Halogen, -Amino, -(C₁-C₁₈)-Alkylamino, -COOH, -CONH₂ und -COO(C₁-C₄)-Alkyl, und einer Reportergruppe, R²⁶ und R²⁷ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₆)-Alkyl und -(C₁-C₄)-Alkoxy-(C₁-C₆)-alkyl, und einer Reportergruppe, c eine ganze Zahl von 2 bis 6 darstellt, d eine ganze Zahl von 0 bis 6 darstellt und B für eine Gruppierung der Formel I steht, wobei Alkyl, Alkenyl und Alkinyl jeweils gegebenenfalls substituiert sein können.
Nukleinsäurebindende Verbindung nach Anspruch 1, wobei R¹ für -NH₂ steht.
Nukleinsäurebindende Verbindung nach Anspruch 1, enthaltend wenigstens eine Reportergruppe.
Nukleinsäurebindende Verbindung nach Anspruch 1, wobei das Grundgerüst eine Gruppierung der allgemeinen Formel III
umfaßt, wobei A ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus O, S und N-(C₁-C₆)-Alkyl, M ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Oxy, Sulfandiyl, -NR²²-, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, oder -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O-, und -S-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O- und -NR²²-(C₁-C₆)-Alkyl-O-, R²² ausgewählt ist aus der Gruppe -H, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, einer Schutzgruppe und einer Reportergruppe, R¹⁴ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -OH, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₂-C₁₀)-Alkenyloxy, -(C₂-C₁₀)-Alkinyloxy, -Halogen, -Azido, SH, -(C₁-C₁₀)-Alkylmercapto und -NH₂, R¹⁵ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₆)-Alkyl, -(C₂-C₁₀)-Alkenyl, -(C₂-C₁₀)-Alkinyl, -(C₂-C₁₀)-Alkylcarbonyl, -(C₃-C₁₉)-Alkenylcarbonyl, -(C₃-C₁₉)-Alkinylcarbonyl, -(C₆-C₁₄)-Aryl-(C₁-C₁₀)-alkyl, einer Festphase sowie einer Gruppe der Formel IV
wobei T ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Oxo, Thioxo und Selenoxo, und U ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -OH, -O-Reportergruppe, -SH, -SeH, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₆-C₂₂)-Aryl, -(C₆-C₁₄)-Aryl-(C₁-C₁₀)-alkyl, -NR²³R²⁴ und -O-(C₁-C₁₀)- Alkyl-O-(C₁-C₁₀)-alkyl-R²⁵, oder wobei -NR²³R²⁴ zusammen mit N einen 5–6-gliedrigen heterozyklischen Ring darstellen kann, R²³ und R²⁴ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₁-C₂₀)-Aryl, -(C₆-C₁₄)-Aryl-(C₁-C₁₀)-alkyl, -(C₁-C₆)-Alkyl-[NH(CH₂)_c]_d-NR²⁶R²⁷, R²⁵ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -OH, -Halogen, -Amino, -(C₁-C₁₈)-Alkylamino, -COOH, -CONH₂ und -COO(C₁-C₄)-Alkyl, R²⁶ und R²⁷ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₆)-Alkyl und -(C₁-C₄)-Alkoxy-(C₁-C₆)-alkyl, R²⁹ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -OR³⁰ und -SR³⁰, R³⁰ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₂-C₁₀)-Alkenyl, -(C₆-C₂₂)-Aryl, einer Schutzgruppe, einer Festphase und einer Reportergruppe, B die Verknüpfung mit einer Gruppierung der Formel I darstellt, wobei Alkyl, Alkenyl und Alkinyl jeweils gegebenenfalls substituiert sein können.
Nukleinsäurebindende Verbindung nach einem der Ansprüche 1, 5 und 6, wobei das Grundgerüst eine Gruppierung der Formel V
umfaßt, wobei A ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus O, S und N-(C₁-C₆)-Alkyl, M' ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Oxy, Sulfandiyl, -NR²²-, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, oder -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O-, und -S-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O- und -NR²²-(C₁-C₆)-Alkyl-O-, R²² ausgewählt ist aus der Gruppe -H, einer Schutzgruppe, einer Reportergruppe und -(C₁-C₁₀)-Alkyl, R¹⁴ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -OH, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₂-C₁₀)-Alkenyloxy, -(C₂-C₁₀)-Alkinyloxy, -Halogen, -Azido, -SH, S-(C₁-C₆)-Alkylmercapto und NH₂, R¹⁶ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₈)-Alkyl, -(C₂-C₁₈)-Alkenyl, -(C₂-C₁₈)-Alkinyl, -(C₂-C₁₈)-Alkylcarbonyl, -(C₃-C₁₉)-Alkenylcarbonyl, -(C₃-C₁₉)-Alkinylcarbonyl, -(C₆-C₁₄)-Aryl-(C₁-C₈)-alkyl, einer Schutzgruppe oder einer Verbindung der Formel IV
wobei T ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Oxo, Thioxo und Selenoxo, und U ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -OH, -SH, -SeH, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₆-C₂₂)-Aryl, -(C₆-C₁₄)-Aryl-(C₁-C₁₀)-alkyl, -NR²³R²⁴ und -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O-(C₁-C₁₀)-alkyl-R²⁵, wobei NR²³R²⁴ zusammen mit N einen 5–6-gliedrigen heterozyklischen Ring darstellen kann, R²³ und R²⁴ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₁-C₂₀)-Aryl, -(C₆-C₁₄)-Aryl-(C₁-C₁₀)-alkyl, -(C₁-C₆)-Alkyl-[NH(CH₂)_c]_d-NR²⁶R²⁷, R²⁵ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -OH, -Halogen, -Amino, -(C₁-C₁₈)-Alkylamino, -COOH, -CONH₂ und -COO(C₁-C₄)-Alkyl, R²⁶ und R²⁷ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₆)-Alkyl und -(C₁-C₄)-Alkoxy-(C₁-C₆)-alkyl, R²⁹ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -OR³⁰ und -SR³⁰, R³⁰ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₂-C₁₀)-Alkenyl, -(C₆-C₂₂)-Aryl, einer Schutzgruppe, einer Festphase und einer Reportergruppe, und B die Verknüpfung mit einer Gruppierung der Formel I darstellt, wobei Alkyl, Alkenyl und Alkinyl jeweils gegebenenfalls substituiert sein können.
Verbindung nach Anspruch 9, wobei M' für O steht, R¹⁶ für H steht und R¹⁴ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H und -OH.
Verbindung der Formel VII
wobei A ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus O, S und N-(C₁-C₆)-Alkyl, M und M' unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Oxy, Sulfandiyl, -NR²²-, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, oder -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O-, und -S-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O- und -NR²²-(C₁-C₆)-Alkyl-O-, R²² ausgewählt ist aus der Gruppe -H und -(C₁-C₁₀)-Alkyl, R¹⁴ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -OR³¹, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₂-C₁₀)-Alkenyloxy, -(C₂-C₁₀)-Alkinyloxy, -Halogen, -Azido, NHR³¹, SR³¹ und NH₂, R³¹ für eine Schutzgruppe oder eine Reportergruppe steht, R³² und R¹⁷ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₂-C₁₀)-Alkenyl und -(C₆-C₂₂)-Aryl, R¹⁸ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus gegebenenfalls substituiertem -(C₁-C₆)-Alkyl, unsubstituiertem -(C₁-C₆)-Alkoxy oder ein- oder mehrfach mit einer Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -Halogen, p-Nitroaryloxy und -Cyano, substituiertem -(C₁-C₆)-Alkoxy, und B für eine Gruppe der Formel I
steht, wobei W für C steht, Z ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N und C, mit der Maßgabe, daß, – falls Z für N steht, X unabhängig von Y ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N und CR³, und Y unabhängig von X ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N und CR⁴, und es sich bei der Bindung zwischen X und Y um eine Doppelbindung und bei der Bindung zwischen Y und Z um eine Einfachbindung handelt und, – falls Z für C steht, X für NR³³ steht und Y ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N und CR⁴, und es sich bei der Bindung zwischen Z und Y um eine Doppelbindung und bei der Bindung zwischen X und Y um eine Einfachbindung handelt, wobei R¹ für NR⁵R⁶ steht, R³ und R⁴ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus -H, -Halogen, -OR¹³, -SR¹⁹, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₂-C₁₀)-Alkenyl, -(C₂-C₁₀)-Alkinyl, -NO₂, -NR⁵R⁶, -Cyano und -C(=O)R¹¹, R¹¹ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -OH, -(C₁-C₆)-Alkoxy, -(C₆-C₂₂)-Aryloxy und -NHR¹², R⁵, R⁶, R¹², R¹³, R¹⁹ und R³³ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₂-C₁₀)-Alkenyl, -(C₂-C₁₀)-Alkinyl, -(C₆-C₂₂)-Aryl, einer Schutzgruppe und einer Reportergruppe, r und s unabhängig voneinander eine ganze Zahl von 1 bis 18 darstellen, D die Position der Bindung der Gruppe an den Rest der nukleinsäurebindenden Verbindung darstellt und wobei Alkyl, Alkenyl und Alkinyl gegebenenfalls mit einer oder mehreren Gruppierungen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -Halogen, -S-(C₁-C₆)-Alkyl, -(C₁-C₆)-Alkoxy, -NR⁵R⁶, -CO-R¹¹, -NH-CO-NR⁵R⁶, -NH-CSNR⁵R⁶ und -[O-(CH₂)_r]_s-NR⁵R⁶, substituiert ist, mit der Maßgabe, daß es sich bei wenigstens einem der Reste R⁵ und R⁶ von -NR⁵R⁶ um eine Schutzgruppe handelt.
Verbindung nach Anspruch 11, wobei die Gruppe der Formel I wenigstens eine Reportergruppe enthält.
Verbindung nach Anspruch 11, wobei die Gruppe der Formel I ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Gruppen der Formel I, wobei entweder – W für N, Z für N, Y für N und X für CR³ steht oder – W für N, Z für C, Y für N und X für CR³ steht oder – W für N, Z für N, Y für N und X für N steht.
Bindungsprodukt wenigstens einer nukleinsäurebindenden Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und einer Nukleinsäure, wobei die nukleinsäurebindende Verbindung und die Nukleinsäure über Basenpaarung in paralleler oder antiparalleler Orientierung aneinander gebunden sind.
Verfahren zur Bestimmung einer Nukleinsäure, bei dem man die folgenden Schritte durchführt: – Bereitstellen einer Probe, von der vermutet wird, daß sie die Nukleinsäure enthält, – Bereitstellen einer nukleinsäurebindenden Verbindung nach Anspruch 1, die im wesentlichen zu der Nukleinsäure teilweise oder vollständig komplementär ist, – Inkontaktbringen der Probe mit der nukleinsäurebindenden Verbindung unter Bedingungen für die Bindung der nukleinsäurebindenden Verbindung an die Nukleinsäure, – Bestimmen des aus der Nukleinsäure und der nukleinsäurebindenden Verbindung gebildeten Bindungsprodukts als Maß für das Vorhandensein der Nukleinsäure.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei eventuell in der nukleinsäurebindenden Verbindung nach Anspruch 1 vorliegende Gruppen der Formel I so in der Verbindung lokalisiert sind, daß sie eine Basenpaarung mit einer G-Gruppierung in der Nukleinsäure eingehen.
Verwendung von 2-Azapurin der Formel I gemäß Anspruch 1 in einer nukleinsäurebindenden Verbindung als Ersatz für Cytosin.
Verwendung von 2-Azapurin der Formel I gemäß Anspruch 1 in Hybridisierungsreaktionen von Sonden mit Nukleinsäuren als Base an einer Stelle der Sonde, die mit G in der Nukleinsäure eine Basenpaarung eingeht.
Verfahren zur chemischen Synthese einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 10 unter Verwendung aktivierter Untereinheiten, wobei die Untereinheit wenigstens eine Gruppe der Formel I enthält.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei es sich bei wenigstens einer Untereinheit um eine Verbindung nach einem der Ansprüche 11 bis 13 handelt.
Verfahren zur enzymatischen Synthese einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem man eine Triphosphat-Untereinheit mit einem Primer unter Verwendung einer Nukleinsäure als Matrize zur Verlängerung des Primers umsetzt, wobei die Triphosphat-Untereinheit eine heterozyklische Gruppe der Formel I enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei die Triphosphat-Untereinheit die Formel VIII
aufweist, wobei PPP für eine Triphosphat-Gruppe steht, R¹⁴ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -OH, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₂-C₁₀)-Alkenyloxy, -(C₂-C₁₀)-Alkinyloxyhalogen, -Azido und NH₂, und B für eine Gruppe der Formel I steht, wobei W für N steht und wobei R¹ für NR⁵R⁶ steht, wodurch R⁵ und R⁶ für Gruppierungen mit der in Anspruch 1 angegebenen Bedeutung stehen.
Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von jeweils eine bestimmte Sequenz umfassenden Nukleinsäuren in einer Probe, bei dem man die folgenden Schritte durchführt: – Inkontaktbringen der Probe mit einer Festphase mit auf seiner Oberfläche immobilisierten nukleinsäurebindenden Verbindungen, die jeweils eine zu einer der bestimmten Sequenzen der Nukleinsäuren komplementäre Sequenz enthalten, – Bestimmen der Ausbildung von Hybriden, die eine Nukleinsäure mit einer bestimmten Sequenz und die die komplementäre Sequenz enthaltende nukleinsäurebindende Verbindung enthalten, auf der Festphase, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei wenigstens einer der nukleinsäurebindenden Verbindungen um eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 handelt.
Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins, der Abwesenheit oder der Menge einer Nukleinsäure in einer Probe, bei dem man die folgenden Schritte durchführt: – Bereitstellen von Primern, wobei ein erster Primer im wesentlichen komplementär zu einer ersten Bindungssequenz der Nukleinsäure und der zweite Primer im wesentlichen komplementär zu einer Bindungssequenz eines Komplements dieser Nukleinsäure ist, und einer zu der Nukleinsäure oder dem Komplement davon komplementären Sonde zwischen den Bindungssequenzen der Primer, wobei die Sonde an unterschiedlichen Untereinheiten mit wenigstens zwei unterschiedlichen Reportergruppen markiert ist, – Aussetzen der Probe mit den Primern und der Sonde unter Bedingungen, die die Verlängerung der Primer begünstigen und die Reportergruppen durch Spalten der Sonde voneinander trennen, und – Bestimmen des Ausmaßes der Spaltung der Sonde über wenigstens eine der Reportergruppen, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei wenigstens einem der Primer oder/und der Sonde um eine nukleinsäurebindende Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1–10 handelt.
Verbindung der allgemeinen Formel VIII
wobei PPP für eine Triphosphat-Gruppe steht, R¹⁴ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -OH, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₂-C₁₀)-Alkenyloxy, -(C₂-C₁₀)-Alkinyloxyhalogen, -Azido und NH₂, und B für eine Gruppe der Formel I steht, wobei W für N steht und wobei R¹ für NR⁵R⁶ steht, wodurch R⁵ und R⁶ für Gruppierungen mit der in Anspruch 1 angegebenen Bedeutung stehen.
Verbindung nach Anspruch 25, wobei -M-R¹⁶ für eine Triphosphat-Gruppe und -M-R¹⁵ für -OH steht.
Verbindung nach Anspruch 26, wobei R¹⁴ für -OH steht.
Verbindung nach Anspruch 25, wobei R¹⁴ für -H und R¹ nicht für -OH steht.
Verbindung der allgemeinen Formel IX
wobei A ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus O, S und N-(C₁-C₆)-Alkyl, M und M' unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Oxy, Sulfandiyl, -NR²², -(C₁-C₁₀)-Alkyl, oder -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O-, und -S-(C₁-C₁₀)-Alkyl-O- und -NR²²-(C₁-C₆)-Alkyl-O-, R²² ausgewählt ist aus der Gruppe -H und -(C₁-C₁₀)-Alkyl, R¹⁴ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -H, -OR³¹, -(C₁-C₁₀)-Alkoxy, -(C₂-C₁₀)-Alkenyloxy, -(C₂-C₁₀)-Alkinyloxy, -Halogen, -Azido, NHR³¹, SR³¹ und -NH₂, R³¹ für eine Schutzgruppe oder eine Reportergruppe steht, R³² und R¹⁷ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₂-C₁₀)-Alkenyl und -(C₆-C₂₂)-Aryl, R¹⁸ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus gegebenenfalls substituiertem -(C₁-C₆)-Alkyl, unsubstituiertem -(C₁-C₆)-Alkoxy oder ein- oder mehrfach mit einer Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -Halogen, p-Nitroaryloxy und -Cyano, substituiertem -(C₁-C₆)-Alkoxy, und B für eine Gruppe der Formel I
steht, wobei W für N steht, Z ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N und C, mit der Maßgabe, daß, – falls Z für N steht, X unabhängig von Y ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N und CR³, und Y unabhängig von X ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N und CR⁴, und es sich bei der Bindung zwischen X und Y um eine Doppelbindung und bei der Bindung zwischen Y und Z um eine Einfachbindung handelt und, – falls Z für C steht, X für NR³³ steht und Y ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus N und CR⁴, und es sich bei der Bindung zwischen Z und Y um eine Doppelbindung und bei der Bindung zwischen X und Y um eine Einfachbindung handelt, wobei R¹ für NR⁵R⁶ steht, R³ und R⁴ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus -H, -Halogen, -OR¹³, -SR¹⁹, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₂-C₁₀)-Alkenyl, -(C₂-C₁₀)-Alkinyl, -NO₂, -NR⁵R⁶, -Cyano und -C(=O)R¹¹, R¹¹ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -OH, -(C₁-C₆)-Alkoxy, -(C₆-C₂₂)-Aryloxy und -NHR¹², R⁵, R⁶, R¹², R¹³, R¹⁹ und R³³ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus -H, -(C₁-C₁₀)-Alkyl, -(C₂-C₁₀)-Alkenyl, -(C₂-C₁₀)-Alkinyl, -(C₆-C₂₂)-Aryl, einer Schutzgruppe und einer Reportergruppe, r und s unabhängig voneinander eine ganze Zahl von 1 bis 18 darstellen, D die Position der Bindung der Gruppe an den Rest der nukleinsäurebindenden Verbindung darstellt und wobei Alkyl, Alkenyl und Alkinyl gegebenenfalls mit einer oder mehreren Gruppierungen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -Halogen, -S-(C₁-C₆)-Alkyl, -(C₁-C₆)-Alkoxy, -NR⁵R⁶, -CO-R¹¹, -NH-CO-NR⁵R⁶, -NH-CSNR⁵R⁶ und -[O-(CH₂)_r]_s-NR⁵R⁶, substituiert ist, mit der Maßgabe, daß es sich bei wenigstens einem der Reste R⁵ und R⁶ von -NR⁵R⁶ um eine Schutzgruppe handelt.