DE69532565T2

DE69532565T2 - Verfahren zur Herstellung von Isoguanosin und 2'-Derivaten davon

Info

Publication number: DE69532565T2
Application number: DE69532565T
Authority: DE
Inventors: Mark Collins; Thomas Horn; Patrick Sheridan; Brian Warner; Michael Urdea
Original assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date: 1994-08-30
Filing date: 1995-08-30
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2015-08-31
Also published as: ATE259374T1; JPH10506270A; ATE227778T1; JP2008043341A; SK25497A3; US5780610A; CZ58997A3; US6232462B1; ES2215797T3; EP0778898A1; US5681702A; AU3463195A; BG101246A; WO1996006950A1; JP2006217925A; PL318933A1; CN100335649C; BR9508674A; MX9701419A; JP4461278B2

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Nukleinsäurechemie und Hybridisierungsassays. Die Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur Erzeugung eines stärker zielabhängigen Signals in Nukleinsäure-Hybridisierungsassays durch Minimierung des Untergrundrauschens, das in erster Linie aus einer nicht-spezifischen Hybridisierung stammt. Die Erfindung hat auch Anwendungen bei Antisense- und Aptamer-Therapeutika und in der Arzneimittelentdeckung.
Hintergrund
Nukleinsäure-Hybridisierungsassays werden im Allgemeinen in der genetischen Forschung, der biomedizinischen Forschung und der klinischen Diagnostik eingesetzt. In einem Nukleinsäure-Hybridisierungsbasisassay wird eine einzelsträngige Analytennukleinsäure an eine markierte einzelsträngige Nukleinsäuresonde hybridisiert und resultierende markierte doppelsträngige DNA wird detektiert. Variationen dieses Basisschemas wurden entwickelt um die Genauigkeit zu erhöhen, die Trennung der zu detektierenden Doppelstränge von Fremdmaterialien zu erleichtern und/oder das Signal, das detektiert wird, zu verstärken.
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf ein Verfahren zur Reduzierung des Untergrundrauschens, das in einem beliebigen Nukleinsäure-Hybridisierungsassay auftritt. Im Allgemeinen resultiert das Untergrundrauschen, das bei derzeit offenbarten Techniken auftritt, aus einer unerwünschten Wechselwirkung verschiedener Polynukleotidkomponenten, die in einem gegebenen Assay verwendet werden, d. h. aus einer Wechselwirkung, die zu einem Signal führt, das nicht dem Vorliegen oder der Menge eines Analyten entspricht. Die Erfindung ist in Verbindungen mit einer Reihe von Assayformaten einsetzbar, bei denen mehrere Hybridisierungsschritte durchgeführt werden um ein detektierbares Signal zu produzieren, das mit dem Vorliegen oder der Menge eines Polynukleotidanalyten korreliert.
Ein derartiger Assay wird detailliert im U.S. Patent Nr. 4,868,105 von Urdea et al. beschrieben. Dieser Assay beinhaltet die Verwendung eines zweiteiligen Einfangsystems, das so konzipiert ist, dass es den Polynukleotidanalyten an einen festen Träger bindet, und eines zweiteiligen Markierungssystems, das so konzipiert ist, dass es eine nachweisbare Markierung an den zu detektierenden oder quantitativ zu bestimmenden Polynukleotidanalyten bindet. Das zweiteilige Einfangsystem involviert die Verwendung von Einfangsonden, die an einen festen Träger gebunden sind, und von Einfangextendermolekülen, die sowohl an ein Segment der Einfangsonden als auch an ein Segment des Polynukleotidanalyten hybridisieren. Das zweiteilige Markierungssystem involviert die Verwendung von Markierungsextendermolekülen, die an ein Segment des Polynukleotidanalyten hybridisieren, und markierte Sonden, die an die Markierungsextendermoleküle hybridisieren und eine nachweisbare Markierung enthalten oder an eine nachweisbare Markierung binden. Ein Vorteil eines solchen Systems besteht darin, dass eine Vielzahl von Hybridisierungsschritten erfolgen muss, damit die Markierung in einer Weise detektiert wird, die mit dem Vorliegen des Analyten korreliert, insofern, als zwei unterschiedliche Hybridisierungsreaktionen zum Analyten-"Einfangen" erfolgen müssen und gleichermaßen zwei unterschiedliche Hybridisierungsreaktionen zur Analytenmarkierung erfolgen müssen. Allerdings bleiben eine Reihe von Wegen übrig, auf denen ein detektierbares Signal in einer Weise erzeugt werden kann, die nicht dem Vorliegen oder der Menge des Analyten entspricht; diese werden unten detailliert erläutert.
Ein weiteres Beispiel für einen Assay, mit dem die vorliegende Erfindung anwendbar ist, ist ein Signalverstärkungsverfahren, das in dem U.S.-Patent Nr. 5,124,246 von Urdea beschrieben ist. In diesem Verfahren wird das Signal durch die Verwendung von Amplifikationsmultimeren, Polynukleotiden, die so aufgebaut sind, dass sie ein erstes Segment enthalten, das in spezifischer Weise an die Markierungsextender hybridisiert und eine Vielzahl von identischen zweiten Segmenten enthalten, die spezifischerweise an eine markierte Sonde hybridisieren, amplifiziert. Der Verstärkungsgrad ist theoretisch proportional zur Anzahl der Wiederholungen des zweiten Segments. Die Multimere können entweder linear oder verzweigt sein. Verzweigte Multimere können in Form einer Gabel oder eines Kamms sein, wobei Multimere des Kamm-Typs bevorzugt sind.
Ein Ansatz zur Lösung des Problems von störenden Untergrundsignalen in Nukleinsäure-Hybridisierungsassays wird in der PCT-Publikation Nr. WO 95/16055 bereitgestellt, in der mindestens zwei Einfangextender und/oder zwei oder mehrere Markierungsextender an den Analyten binden müssen um ein nachweisbares Signal auszulösen. Um ein Untergrundrauschen weiter zu verringern, wird der Assay unter Bedingungen durchgeführt, die die Bildung von Mehrkomponentenkomplexen begünstigen.
Ein weiterer Ansatz, der zur Erhöhung der Zielabhängigkeit des Signals in einem Hybridisierungsassay vorgeschlagen wurde, ist in der europäischen Patentpublikation Nr. 70,685, Erfinder Heller et al., beschrieben. Diese Literaturstelle beschreibt einen homogenen Hybridisierungsassay, in dem eine nicht-strahlende Übertragung von Energie zwischen proximalen Sonden auftritt; es müssen zwei getrennte Events erfolgen, damit ein von einem Ziel erzeugtes Signal produziert wird, was die Genauigkeit der Detektion verstärkt.
Die vorliegende Erfindung ist auch konzipiert um die Detektionsgenauigkeit und Quantifizierung von Polynukleotidanalyten in Hybridisierungsassays zu erhöhen. Die Erfindung erhöht sowohl die Empfindlichkeit als auch die Spezifität solcher Assays, indem die Häufigkeit der Signalerzeugung, die in Abwesenheit eines Ziels auftritt, reduziert wird; außerdem involviert sie keine Erhöhung der Zeit oder der Kosten im Vergleich zu derzeit verwendeten Assaykonfigurationen.
Die Ziele der vorliegenden Erfindung, nämlich Untergrundrauschen zu verringern und die Genauigkeit der Detektion und quantitativen Bestimmung von Analyten in Nukleinsäure-Hybridisierungsassays zu erhöhen, wurden teilweise durch die Verwendung von Nukleosid varianten erreicht, die durch "nicht-natürliche" Wasserstoffbrückenbindungsmuster Basenpaare bilden. Der Ausdruck "ein nicht-natürliches" Basenpaar, wie er hier verwendet wird, ist eines, das zwischen anderen nukleotidischen Einheiten als Adenosin (A), Thymidin (T), Cytidin (C), Guanosin (G) oder Uridin (U) gebildet wird. Ein derartiges nicht-natürliches Nukleosid-Basenpaar wird zwischen Isocytosin (isoC) und Isoguanin (isoG) gebildet. IsoC und isoG können ein Basenpaar mit einer Standardgeometrie bilden (d. h. ein "Watson-Crick base pair"), allerdings ist eine andere Wasserstoffbrückenbindung involviert als die, die bei der Bindung von Cyosin (C) an Guanin (G) involviert ist, was nachfolgend gezeigt wird:
Leach et al. (1992), J. Am. Chem. Soc. 114: 3675–3683, wendeten Berechnungen über die molekulare Mechanik, molekulare Dynamik und freie Energiepertubation an um die Struktur und Stabilität des isoC*isoG-Basenpaars zu untersuchen. Tor et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115: 4461–4467 beschreiben ein Verfahren, durch das ein modifiziertes isoC in einer DNA-Matrize den Einbau eines isoG-Analogons in das transkribierte RNA-Produkt steuern wird. Switzer et al. (1993), Biochemistry 32: 10489–10496, untersuchten die Bedingungen, unter denen das durch isoC und isoG gebildete Basenpaar durch DNA- und RNA-Polymerase in DNA und RNA eingebaut werden könnte.
Die Einführung eines neuen Basenpaares in DNA-Oligomere bietet das Potential, dass eine genauere Kontrolle über eine Hybridisierung ermöglicht wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Kits zum Detektieren von Nukleinsäureanalyten in einer Probe bereit. Im Allgemeinen stellen die Verfahren Verbesserungen bei Nukleinsäure-Hybridisierungsassays, z. B. in situ-Hybridisierungsassays, Southern-, Northern-Dotblots und Polymerasekettenreaktionsassays bereit. Die Verfahren stellen insbesondere Verbesserungen bei Sandwich-Hybridisierungsassays in Lösungsphase bereit, die eine Bindung des Analyten an einen festen Träger, Markieren des Analyten und Detektieren des Vorliegens der Markierung auf dem Träger umfassen. Bevorzugte Verfahren beinhalten die Verwendung von Amplifikationsmultimeren, die die Bindung von deutlich mehr Markierung im Analyt-Sonden-Komplex ermöglichen, was die Assaysensitivität und -spezifität erhöht.
In einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Assay bereitgestellt, in dem eine oder mehrere nukleotidische Einheiten, die fähig sind, Basenpaare zu bilden, und die andere als Adenosin (A), Thymidin (T), Cytidin (C), Guanosin (G) oder Uridin (U) sind, in hybridisierende Oligonukleotidsegmente, die keine Ziele darstellen, d. h. "universelle" Segmente von Nukleinsäure-Hybridisierungsassaykomponenten eingebaut werden. Die Verwendung von solchen Nukleotid-einheiten (bzw. nukleotidischen Einheiten) führt zu der Entwicklung von einzigartigen Basenpaarungsschemata, die zu einer verstärkten Bindungsspezifität zwischen universellen Segmenten führen.
In einem verwandten Aspekt der Erfindung wird ein Assay bereitgestellt, in dem mindestens eine erste andere Nukleotideinheit als A, T, C, G oder U, die zur Bildung eines Basenpaars fähig ist, mit einer zweiten anderen Nukleotideinheit als A, T, C, G oder U in Nukleinsäure-sequenzen von Assaykomponenten eingebaut ist, die zu Nukleinsäuresequenzen komplementär sind, welche in anderen Assaykomponenten als dem Zielanalyten vorliegen. Beispiele für Basenpaare, die zwischen zwei solchen Nukleotideinheiten gebildet werden, werden in den folgenden Strukturen (I) bis (IV) angegeben:

worin R eine Hauptkette darstellt, die es erlauben wird, dass die Basen mit einer komplementären nukleotidischen Einheit, wenn diese in ein Polynukleotid eingebaut wird, ein Basenpaar bilden; und R' z. B. Wasserstoff, Methyl, α- oder β-Propinyl, Brom, Fluor, Iod oder dergleichen ist. Durch Einbau von solchen nukleotidischen Einheiten in sogenannte "universelle" Sequenzen, d. h. Sequenzen, die bei der Hybridisierung an den Zielanalyten nicht involviert sind, wird das Potential für eine nicht-spezifische Hybridisierung stark reduziert. In einer bevorzugten Ausführungsform bestehen die erste und die zweite nukleotidische Einheit austauschbar aus Isocytidin und Isoguanosin, wie dies in Formel (I) dargestellt ist.
In einem verwandten Aspekt der Erfindung wird ein Assay bereitgestellt, in dem die Schmelztemperatur T_m1 des Komplexes, der zwischen dem Analyten und den trägergebundenen Einfangsonden, vermittelt durch ein oder mehrere getrennte Einfangextendermoleküle und/oder den Markierungsextender und Amplifier oder Preamplifier, deutlich niedriger ist als die Schmelztemperatur T_m2 des Komplexes, der zwischen den markierten Sonden und dem Amplifier gebildet wird. Nach diesem Aspekt wird der Assay unter Bedingungen durchgeführt, die zu Beginn die Bildung aller Hybridkomplexe begünstigen. Die Bedingungen werden dann im Verlauf des Assays geändert um so die T_m1-Hybridkomplexe zu destabilisieren.
Die Erfindung umfasst zusätzlich ein Verfahren zur Durchführung eines Hybridisierungsassays, in dem die vorstehend genannten Techniken kombiniert werden, d. h. bei dem andere nukleotidische Einheiten als A, T, G, C oder U in universelle Segmente von Assaykomponenten eingebaut werden, und in dem die Schmelztemperatur von T_m1-Hybridkomplexen deutlich niedriger ist als die Schmelztemperatur von T_m2-Hybridkomplexen.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein neues Verfahren zur Synthese von Isoguanosin oder 2'-Desoxy-isoguanosin bereit.
Schließlich umfasst die Erfindung Kits, die die Reagentien enthalten, die zur Durchführung der hierin beschriebenen und beanspruchten Assays notwendig sind.
Kurze Beschreibung der Figuren
1. 1 ist eine schematische Darstellung eines Lösungsphasen-Sandwich-Hybridisierungsassays des Standes der Technik, wobei fett gezeichnete Linien die universellen Sequenzen kennzeichnen.
2. 2 stellt ein Verfahren zur Bindung von Sonden an doppelsträngige DNA dar, wobei fett gezeichnete Linien die universellen Sequenzen kennzeichnen.
3. 3 zeigt die Verwendung von nicht-natürliches Nukleotid enthaltenden Sonden und Kompetimeren um eine nicht-spezifische Hybridisierung zu blockieren.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Definitionen und Nomenklatur
Bevor die vorliegende Erfindung im Detail offenbart und beschrieben wird, wird betont, dass die vorliegende Erfindung nicht auf spezifische Assayformate, Materialien oder Reagentien beschränkt ist, da solche natürlich variieren können. Es ist auch einzusehen, dass die hierin verwendete Terminologie lediglich zur Beschreibung besonderer Ausführungsformen und nicht zur Beschränkung bestimmt ist.
In dieser Beschreibung und den Ansprüchen, die folgen, wird auf eine Reihe von Ausdrücken Bezug genommen, die mit den folgenden Bedeutungen definiert sein sollen:
Die Ausdrücke "Polynukleotid" und "Oligonukleotid", wie sie hier verwendet werden, sollen generisch für Polydesoxyribonukleotide (enthaltend 2-Desoxy-D-ribose), für Polyribonukleotide (enthaltend D-Ribose), für einen beliebigen anderen Polynukleotidtyp, der ein N- oder C-Glycosid einer Purin- oder Pyrimidinbase ist, und für andere Polymere, die nichtnukleo-tidische Grundgerüste enthalten, z. B. Polyamid (z. B. Peptidnukleinsäuren (PNAs)) und Polymorpholino (im Handel erhältlich von Anti-Virals, Inc., Corvallis, Oregon, als Neugene^TM-Polymere) und für andere sequenzspezifische Nukleinsäurepolymere, die dafür sorgen, dass die Polymere Nukleobasen in einer Konfiguration enthalten, die eine Basenpaarung und ein Basenstapeln, wie es z. B. in DNA und RNA gefunden wird, ermöglichen, sein. Es ist keine Unterscheidung in der Länge zwischen dem Ausdruck "Polynukleotid" und "Oligonukleotid" und diese Ausdrücke werden austauschbar verwendet. Diese Ausdrücke beziehen sich nur auf die Primärstruktur des Moleküls. Somit umfassen diese Ausdrücke doppelsträngige und einzelsträngige DNA, wie auch doppelsträngige und einzelsträngige RNA, DNA:RNA-Hybride und Hybride zwischen PNAs und DNA oder RNA und umfassen auch bekannte Modifizierungstypen, z. B. Markierungen, die auf dem Gebiet bekannt sind, Methylierung, "Caps", Substitution einer oder mehrerer der natürlich auftretenden Nukleotide mit einem Analogon, Internukleotidmodifikationen, z. B. solche mit ungeladenen Bindungen (z. B. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoamidate, Carbamate usw.), mit negativ geladenen Bindungen (z. B. Phosphorothioate, Phosphorodithioate usw.) und mit positiv geladenen Bindungen (z. B. Aminoalkylphosphoramidate, Aminoalkylphosphotriester), solche, die anhängende Gruppierungen enthalten, beispielsweise Proteine (einschließlich Nukleasen, Toxine, Antikörper, Signalpeptide, Poly-L-lysin usw.), solche mit Interkalatoren (z. B. Acridin, Psoralin, usw.), solche, die Chelatbildner enthalten (z. B. Metalle, radioaktive Metalle, Bor, oxidative Metalle usw.), solche, die Alkylatoren enthalten, solche mit modifizierten Bindungen (z. B. α-anomere Nukleinsäuren, usw.) wie auch unmodifizierte Formen des Polynukleotids oder Oligonukleotids.
Es wird klar werden, dass die Ausdrücke "Nukleosid" und "Nukleotid", wie sie hierin verwendet werden, solcher Gruppierungen umfassen, die nicht nur die bekannten Purin- und Pyrimidinbasen enthalten, sondern auch andere heterocyclische Basen, die modifiziert wurden, enthalten. Solche Modifikationen umfassen methylierte Purine oder Pyrimidine, acylierte Purine oder Pyrimidine oder andere Heterocyclen. Modifizierte Nukleoside oder Nukleotide werden auch Modifikationen an der Zuckergruppierung umfassen, z. B. wenn eine oder mehrere der Hydroxylgruppen durch Halogen, aliphatische Gruppen ersetzt sind, oder als Ether, Amine oder dergleichen funktionalisiert sind. Der Ausdruck "nukleotidische Einheit" soll Nukleoside und Nukleotide umfassen.
Darüber hinaus umfassen Modifikationen an nukleotidischen Einheiten Umlagerung, Anhängen, Ersetzen von funktionellen Gruppen oder in anderer Weise funktionelle Gruppen an der Purin- oder Pyrimidinbase verändern, welche Wasserstoffbrücken zu einem entsprechenden komplementären Pyrimidin oder Purin bildet. Die resultierende modifizierte nukleotidische Einheit kann mit anderen derartigen modifizierten nukleotidischen Einheiten, nicht aber mit A, T, C, G oder U ein Basenpaar bilden. Standard-A-T-, und -G-C-Basenpaare bilden sich unter Bedingungen, die die Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem N³-H und C⁴-Oxy von Thymidin und dem N¹ und C⁶-NH₂ von Adenosin und zwischen dem C²-Oxy, N³ und C⁴-NH₂ von Cytidin und C²-NH₂, N¹-H und C⁶-Oxy von Guanosin ermöglichen. So kann z. B. Guanosin (2-Amino-6-oxy-9-β-D-ribofuranosylpurin) unter Bildung von Isoguanosin (2-Oxy-6-amino-9-β-D-ribofuranosylpurin) modifiziert werden. Eine solche Modifikation resultiert in einer Nukleosidbase, die nicht länger wirksam ein Standardbasenpaar mit Cytosin bildet. Allerdings führt eine Modifikation von Cytosin (1-β-D-Ribofuranosyl-2-oxy-4-amino-pyrimidin) unter Bildung von Isocytosin (1-β-D-Ribofuranosyl-2-amino-4-oxy-pyrimidin) zu einem modifizierten Nukleotid, das zwar nicht mit Guanosin ein Basenpaar bildet, aber mit Isoguanosin ein Basenpaar bildet. Isocytosin ist von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) verfügbar; Isocytidin kann durch das von Switzer et al. (1993), oben, und darin angegebene Literaturstellen hergestellt werden; 2'-Desoxy-5-methyl-isocytidin kann durch das Verfahren von Tor et al. (1993), oben, und darin angegebene Literaturstellen hergestellt werden; und Isoguaninnukleotide können unter Verwendung des Verfahrens, das von Switzer et al., oben, und Mantsch et al. (1993) Biochem. 14: 5593–5601 beschrieben wurde, oder das unten detailliert beschriebene Verfahren hergestellt werden. Die in Struktur (II) gezeigten nicht-natürlichen Basenpaare, die als κ und π bezeichnet werden, können durch das Verfahren synthetisiert werden, das in Piccirilli et al. (1990) Nature 343: 33–37 für die Synthese von 2,6-Diaminopyrimidin und seinem Komplement (1-Methylpyrazolo[4,3]pyrimidin-5,7-(4H,6H)-dion beschrieben ist. Weitere derartige modifizierte nukleotidische Einheiten, die eindeutige Basenpaare bilden, wurden in Leach et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114: 3675–3683 und Switzer et al., oben, beschrieben oder werden dem Fachmann auf diesem Gebiet geläufig sein.
Der Ausdruck "Polynukleotidanalyt" bezieht sich auf ein einzelsträngiges oder doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das eine Zielnukleotidsequenz enthält. Die Analytennukleinsäuren können aus einer Vielzahl von Quellen, z. B. biologischen Flüssigkeiten oder Feststoffen, Lebensmittel, Umweltmaterial usw. stammen und können für die Hybridisierungsanalyse durch eine Vielzahl von Mitteln, z. B. Proteinase K/SDS, chaotrope Salze oder dergleichen, präpariert werden. Der Ausdruck "Polynukleotidanalyt" wird hier austauschbar mit den Ausdrücken "Analyt", "Analytennukleinsäure" und "Ziel" verwendet.
Der Ausdruck "Zielregion" oder "Zielnukleotidsequenz", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Sonden-bindende Region, die innerhalb des Zielmoleküls enthalten ist. Der Ausdruck "Zielsequenz" bezieht sich auf eine Sequenz, mit der eine Sonde unter gewünschten Bedingungen ein stabiles Hybrid bilden wird.
Der Ausdruck "Sonde", wie er hier verwendet wird, bezeichnet eine Struktur, die aus einem Polynukleotid, wie es oben definiert wurde, besteht, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, die komplementär zu einer Nukleinsäuresequenz ist, die im Zielanalyten vorliegt. Die Polynukleotidregionen der Sonden können aus DNA und/oder RNA und/oder synthetischen Nukleotidanaloga bestehen.
Es wird zu erkennen sein, dass die Bindungssequenzen zur Bereitstellung stabiler Hybride nicht perfekte Komplementarität haben müssen. In vielen Fällen werden sich stabile Hybride bilden, wenn weniger als etwa 10% der Basen Fehlpaarungen sind, wobei Schleifen aus vier oder mehr Nukleotiden ignoriert werden. Dementsprechend bezieht sich der Ausdruck "komplementär", wie er hier verwendet wird, auf ein Oligonukleotid, das unter Assaybedingungen mit seinem "Komplement" eine stabile Doppelhelix bildet, und zwar im Allgemeinen, wenn die Homologie etwa 90% oder größer ist.
Die Ausdrücke "Nukleinsäuremultimer" oder "Amplifikationsmultimer" werden hier verwendet um ein lineares oder verzweigtes Polymer desselben sich wiederholenden einzelsträngigen Oligonukleotidsegments oder verschiedener einzelsträngiger Polynukleotidsegmente zu bezeichnen, von denen jedes eine Region enthält, in der eine markierte Sonde binden kann, d. h. eine Nukleinsäuresequenz enthält, die zu einer Nukleinsäuresequenz komplementär ist, die in einer markierten Probe enthalten ist; die Oligonukleotidsegmente können aus RNA, DNA, modifizierten Nukleotiden oder Kombinationen davon bestehen. Mindestens eines der Segmente hat eine Sequenz, eine Länge und eine Zusammensetzung, die es ermöglichen, dass es an eine markierte Sonde bindet; zusätzlich hat mindestens eines der Segmente eine Sequenz, eine Länge und eine Zusammensetzung, die es ermöglicht, dass es spezifischerweise an einen Markierungsextender oder einen Preamplifier bindet. Typischerweise werden solche Segmente etwa 15 bis 50, vorzugsweise 15 bis 30, Nukleotide enthalten und werden einen GC-Gehalt im Bereich von etwa 20% bis etwa 80% haben. Die Gesamtzahl der Oligonukleotidsegmente im Multimer wird üblicherweise im Bereich von etwa 3 bis 1000, noch typischer im Bereich von etwa 10 bis 100 und am typischsten bei etwa 50 liegen. Die Oligonukleotidsegmente des Multimer können durch Phosphodiesterbindungen oder durch dazwischen angeordnete Verbindungsmittel, wie z. B. Nukleinsäure-, Aminosäure-, Kohlenhydrat- oder Polyolbrücken oder durch andere Vernetzungsmittel, die zur Vernetzung von Nukleinsäure oder modifizierten Nukleinsäuresträngen fähig sind, direkt kovalent aneinander gebunden sein. Alternativ kann das Multimer aus Oligonukleotidsegmenten bestehen, die nicht kovalent gebunden sind, sondern in anderer Weise gebunden sind, z. B. durch Hybridisierung. Ein derartiges Multimer wird z. B. im U.S. Patent Nr. 5,175,270 von Nilsen et al. beschrieben. Die Bindungsstelle(n) kann (können) an den Enden des Segments (entweder in normaler 3'-5'-Orientierung oder statistisch orientiert) und/oder an einem oder mehreren internen Nukleotiden im Strang liegen. In linearen Multimeren sind die einzelnen Segmente Ende-an-Ende unter Bildung eines linearen Polymers gebunden. In einem Typ eines verzweigten Multimers gehen drei oder mehrere Oligonukleotidsegmente von einem Ursprungspunkt aus, wodurch eine verzweigte Struktur gebildet wird. Der Ursprungspunkt kann ein anderes Nukleotidsegment oder ein multifunktionelles Molekül sein, an welches mindestens drei Segmente kovalent gebunden sein können. In einem anderen Typ gibt es ein Oligonukleotidsegment-Grundgerüst mit einem oder mehreren anhängenden Oligonukleotidsegmenten. Dieser zuletzt genannte Typ der Multimeren hat eine "gabelartige", "kammartige" Struktur oder eine Struktur, die eine Kombination aus "gabelartig" und "kammartig" ist, wobei "kammartige" Multimere, die hierin bevorzugten Multimere, Polynukleotide sind, die ein lineares Grundgerüst mit einer Vielzahl von Seitenketten, die sich vom Grundgerüst aus erstrecken, haben. Die anhängenden Segmente werden normalerweise von einem modifizierten Nukleotid oder einer anderen organischen Gruppierung abhängen, die geeignete funktionelle Gruppen hat, an welche Oligonukleotide konjugiert oder in anderer Weise gebunden sein können. Das Multimer kann vollständig linear, vollständig verzweigt sein oder eine Kombination aus linearen und verzweigten Teilen darstellen. Typischerweise wird es mindestens zwei Verzweigungspunkte im Multimer, bevorzugter mindestens drei, noch bevorzugter im Bereich von 5 bis 30, geben, obgleich es in einigen Ausführungsformen mehr sein können. Das Multimer kann ein Segment oder mehrere Segmente doppelsträngiger Sequenzen umfassen. Weitere Informationen bezüglich Multimersynthese und spezifischer Multimerstrukturen können in dem U.S. Patent Nr. 5,124,246 von Urdea et al. gefunden werden.
Die PCT-Publikation Nr. WO92/02526 beschreibt verzweigte Multimere des Kammtyps, die in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren besonders bevorzugt sind und die aus einem linearen Grundgerüst und anhängenden Seitenketten bestehen; das Grundgerüst umfasst ein Segment, das eine spezifische Hybridisierungsstelle für Analyten-Nukleinsäure oder Nukleinsäure, die an den Analyten gebunden ist, bereitstellt, wohingegen die anhängenden Seitenketten Wiederholungen eines Segments umfassen, das spezifische Hybridisierungsstellen für eine markierte Sonde bereitstellt.
Wie oben angegeben wurde, kann auch ein "preamplifier"-Molekül verwendet werden, das als Brückengruppierung zwischen den Markierungsextendermolekülen und den Amplifikationsmultimeren dient. Auf diese Weise wird mehr Amplifier und somit mehr Markierung in einem gegebenen Ziel-Sonden-Komplex gebunden. Preamplifier-Moleküle können entweder linear oder verzweigt sein und enthalten typischerweise im Bereich von etwa 30 bis etwa 3000 Nukleotide. In der hierin bevorzugten Ausführungsform bindet das Preamplifier-Molekül an mindestens zwei unterschiedliche Markierungsextendermoleküle, so dass die Gesamtgenauigkeit des Assays erhöht wird (d. h. wiederum ist eine Vielzahl von Hybridisierungsevents zur Bildung des Sonden-Ziel-Komplexes erforderlich).
Der Ausdruck "biologische Probe", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Gewebeprobe oder eine Flüssigkeitsprobe, die aus einem Individuum isoliert wurde, einschließlich, aber nicht beschränkt auf z. B. Plasma, Serum, spinale Flüssigkeit, Samen, Lymphflüssigkeit, die externen Abschnitte der Haut, des Atemtrakts, intestinalen Trakts und Geschlechtsapparats, Tränen, Speichel, Milch, Blutzellen, Tumore, Organe und auch Proben von in vitro-Zellkulturbestandteilen (einschließlich, aber nicht beschränkt auf konditioniertes Medium, das aus dem Wachstum von Zellen in Zellkulturmedium, vermutlich viral infizierten Zellen, rekombinanten Zellen und Zellkomponenten stammt). Bevorzugte Verwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Detektion und/oder quantitative Bestimmung von Nukleinsäuren wie den Folgenden: (a) virale Nukleinsäuren, z. B. aus Hepatitits B-Virus ("HBV"), Hepatitis C-Virus ("HCV"), Hepatitis D-Virus ("HDV"), humanes Immundefizienzvirus ("HIV"), und die Viren der Herpesfamilie einschließlich Herpes zoster (Hühnerpocken), Herpes simplex-Virus I und II, Cytomegalovirus, Epstein-Barr-Virus und das kürzlich isolierte Herpes VI-Virus; (b) bakterielle Nukleinsäuren, z. B. Chlamydia, Mycobacterium tuberculosis usw.; und (c) zahlreiche humane Sequenzen von Interesse.
Der Ausdruck "nicht-spezifische Hybridisierung", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf Vorkommen, in denen ein Segment eines ersten Polynukleotids, das an ein Segment eines ausgewählten zweiten Polynukleotids hybridisieren soll, auch an ein drittes Polynukleotid hybridisiert, wodurch ein fehlerhaftes Resultat ausgelöst wird, d. h. es entsteht eine Situation, in der eine Markierung in Abwesenheit eines Zielanalyten detektiert werden kann. Die Verwendung des Ausdrucks "hybridisiert" bedeutet nicht, dass eine Nicht-Watson-Crick-Basenpaarung ausgeschlossen wird.
Der Ausdruck "nicht-spezifische Bindung", wie er hier verwendet wird, wird eingesetzt um solche Events zu bezeichnen, bei denen ein Polynukleotid an einen festen Träger oder eine andere Assaykomponente durch eine Wechselwirkung – die entweder direkt oder indirekt sein kann – die keine Wasserstoffbrückenbindungen an Träger-gebundene Polynukleotide beinhaltet, bindet.
Unter Bezugnahme auf die in 1 dargestellte bevorzugte Ausführungsform werden die folgenden Ausdrücke auf den hierin dargestellten Hybridisierungsassay verwendet. Es wird betont, dass in 1 die universellen Sequenzen zur Klarheit durch fettgedruckte Linien gekennzeichnet sind.
"Markierungsextendermoleküle (LEs)", hierin auch als "Markierungsextender" bezeichnet, enthalten Komplementaritätsregionen, gegenüber dem Analytenpolynukleotid und für das Amplifikationsmultimer ("AMP"). Wenn ein Preamplifier verwendet wird (in den Figuren nicht gezeigt), werden die Markierungsextendermoleküle eher an diese Zwischenspezies als direkt an das Amplifikationsmultimer binden. Wenn weder ein Preamplifier noch ein Amplifier verwendet wird, werden die Markierungsextendermoleküle direkt an eine Sequenz in der markierten Sonde (labeled probe = "LP") binden. Somit sind die Markierungsextendermoleküle einzelsträngige Polynukleotidketten, die eine erste Nukleinsäuresequenz L-1 komplementär zu einer Sequenz des Analytenpolynukleotids und eine zweite universelle Region mit einer Multimer-Erkennungssequenz L-2 komplementär zu einem Segment L-1 der Markierungssonde, Amplifikationsmultimer oder Preamplifier haben.
"Markierte Sonden (LPs)" sind so konzipiert, dass sie entweder an den Markierungsextender oder, wenn ein Amplifikationsmultimer im Assay verwendet wird, an die sich wiederholenden Oligonukleotidsegmente des Multimers binden. LPs enthalten entweder eine Markierung oder sind so strukturiert, dass sie an eine Markierung binden. Somit enthalten LPs eine Nukleinsäuresequenz L-3, die zu einer Nukleinsäuresequenz M-2 komplementär ist, welche innerhalb der sich wiederholenden Oligonukleotideinheiten des Multimers vorliegt, und werden an eine Markierung gebunden oder sind so strukturiert, dass sie an eine Markierung binden, welche direkt oder indirekt ein nachweisbares Signal liefert.
"Einfangextendermoleküle (captured extenders molecules = CEs)", hier auch als "Einfangextender" bezeichnet, binden an das Analytenpolynukleotid und an Einfangsonden, die wiederum an einen festen Träger binden. Somit sind Einfangextendermoleküle einzelsträngige Polynukleotidketten, die eine erste Polynukleotidsequenzregion, die eine Nukleinsäuresequenz C-1 enthält, welche zu einer Sequenz des Analyten komplementär ist, und eine zweite, nichtkomplementäre Region mit einer Einfangsonden-Erkennungssequenz C-2 haben. Die Sequenzen C-1 und L-1 sind nicht-identische, nicht-komplementäre Sequenzen, die jeweils zu physikalisch unterschiedlichen Sequenzen des Analyten komplementär sind.
"Einfangsonden (CPs)" binden an die Einfangextender und an einen festen Träger. Wie in 1 dargestellt ist, haben Einfangsonden eine Nukleinsäuresequenz C-3, die zu C-2 komplementär ist, und sind kovalent an einen festen Träger gebunden (oder fähig, kovalent an einen festen Träger zu binden).
Im Allgemeinen werden Hybridisierungsassays in Lösungsphase unter Verwendung des in 1 dargestellten Systems durchgeführt und laufen wie folgt ab. Einzelsträngige Analytennukleinsäure wird unter Hybridisierungsbedingungen mit den Einfangextenderen und Markierungsextendern inkubiert. Das resultierende Produkt ist ein Nukleinsäurekomplex des Analytenpolynukleotids, das an die Einfangextender und die Markierungsextender gebunden ist. Dieser Komplex kann anschließend unter Hybridisierungsbedingungen zu einer festen Phase, die Einfangsonden an ihrer Oberfläche gebunden hat, gegeben werden; in einer bevorzugten Ausführungsform wird die anfängliche Inkubation in Gegenwart der Träger-gebundenen Einfangsonden durchgeführt. Das resultierende Produkt umfasst den Komplex, der über die Einfangextendermoleküle und Einfangsonden an die feste Phase gebunden ist. Die feste Phase mit gebun denem Komplex wird dann von ungebundenen Materialien abgetrennt. Ein Amplifikationsmultimer, vorzugsweise ein Multimer vom Kammtyp, wie es oben beschrieben wurde, wird dann gegebenenfalls zu dem Festphasen-Analyt-Sonde-Komplex unter Hybridisierungsbedingungen gegeben um es möglich zu machen, dass das Multimer an die LEs hybridisiert; wenn Preamplifier-Sonden verwendet werden, wird der feste Phase-Analyt-Sonde-Komplex mit den Preamplifiersonden entweder zusammen mit dem Amplifikationsmultimer oder vorzugsweise vor Inkubation mit dem Amplifikationsmultimer inkubiert. Der resultierende Festphasenkomplex wird dann durch Waschen von ungebundenem Preamplifier und/oder Multimer abgetrennt. Die markierten Sonden werden dann unter Bedingungen zugesetzt, die eine Hybridisierung an LEs oder, wenn ein Amplifikationsmultimer verwendet wurde, an sich wiederholende Oligonukleotidsegmente des Multimers ermöglichen. Der resultierende feste Phase-markierte Nukleinsäure-Komplex wird dann gewaschen um ungebundenes markiertes Oligonukleotid zu entfernen, und danach gelesen. Es sollte betont werden, dass die in 1 dargestellten Komponenten nicht notwendigerweise maßstabsgetreu gezeichnet sind und dass Amplifikationsmultimere, wenn sie verwendet werden, eine weit größere Anzahl von sich wiederholenden Oligonukleotidsegmenten enthalten, als sie dargestellt sind (wie oben erläutert), wobei jedes so konzipiert ist, dass es an eine markierte Sonde bindet.
Das primäre Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Eliminierung von Quellen für Untergrundrauschen, indem die Wechselwirkung von Einfangsonden und Einfangextendermolekülen mit den markierten Sonden, Markierungsextendermolekülen und Amplifiern minimiert wird, die Wahrscheinlichkeit reduziert wird, dass nicht-korrekte Gruppierungen an die Träger-gebundenen Einfangsonden binden.
Eine Hybridisierung zwischen komplementären Oligonukleotidsequenzen wird, basierend auf der Fähigkeit der Purin- und Pyrimidinnukleotide, die darin enthalten sind, stabile Basenpaare zu bilden, postuliert. Die fünf natürlich vorkommenden Nukleotide, Adenosin (A), Guanosin (G), Thymidin (T), Cytidin (C) und Uridin (U) bilden die Purin-Pyrimidin-Basenpaare G-C und A-T(U). Die Bindungsenergie des G-C-Basenpaars ist größer als die des A-T-Basenpaars, und zwar infolge des Vorliegens von drei Wasserstoffbrückenbindungsgruppierungen in dem Erstgenannten, im Vergleich zu zwei in dem Letztgenannten, wie es nachfolgend gezeigt wird:
und
Demnach sind in einem herkömmlichen Nukleinsäure-Sandwichassay in Lösungsphase die Oligonukleotidmoleküle so konzipiert, dass sie Nukleinsäuresequenzen enthalten, die zu Nukleinsäuresequenzen in anderen Assaykomponenten oder im Zielanalyt komplementär sind und daher mit diesen hybridisieren, was detailliert oben erläutert wurde. Das erfindungsgemäße Verfahren reduziert eine nicht-spezifische Hybridisierung durch Einarbeitung von nicht- natürlichen nukleotidischen Einheiten in universelle Oligonukleotidsegmente von Assaykomponenten, die fähig sind, eindeutige Basenpaare zu bilden. Darüber hinaus reduziert das erfindungsgemäße Verfahren den Beitrag einer nicht-spezifischen Bindung von Assaykomponenten, indem es detektierbar markierte Assaykomponenten, die mit dem Vorliegen und/oder der Menge eines Zielanalyten assoziiert sind, von denen, die nicht-spezifisch gebunden sind und zu einem Assay-Untergrundrauschen beitragen, abtrennt.
In einer ersten Ausführungsform der Erfindung wird ein Hybridisierungsassay bereitgestellt, indem andere nukleotidische Einheiten als A, T, C, G und U, die zur Bildung eindeutiger Basenpaare fähig sind, in hybridisierende Oligonukleotidsegmente von Assaykomponenten eingearbeitet werden, welche nicht Zielanalyt-spezifisch sind und somit weniger wahrscheinlich stabile Hybride mit zielspezifischen Sondensequenzen oder mit äußeren Nicht-Ziel-Nukleinsäure-sequenzen bilden. Wie in 1 dargestellt ist, können so z. B. nukleotidische Einheiten in komplementäre Nukleinsäuresequenzen C-2/C-3, L-2/M-1 und L-3/M-2 eingearbeitet sein. Die hybridisierenden Oligonukleotidsegmente der Assaykomponenten, die zu Nukleinsäuresegmenten des Zielanalyten komplementär sind, werden aus natürlich vorkommenden Nukleotiden (d. h. A, T, C, G oder U) aufgebaut. Oligonukleotidsegmente, die nukleotidische Einheiten enthalten, können aufgebaut werden, indem etwa 15% bis etwa 100% der natürlich auftretenden Nukleotide durch das Gegenstück der nukleotidischen Einheit ersetzt werden. Vorzugsweise wird jede dritte oder vierte Base in einem Oligonukleotid durch eine nukleotidische Einheit ersetzt, welche zur Bildung eines eindeutigen Basenpaars fähig ist. Dem Fachmann wird klar sein, dass, wenn der prozentuale Ersatz nukleotidischer Einheiten erhöht wird, gleichzeitig eine nicht-spezifische Hybridisierung verringert wird. Ein vollständiger Ersatz wird mindestens zwei neue Basenpaare erfordern um eine ausreichende Sequenzdiversität aufrecht zu erhalten um so eine nicht-spezifische Hybridisierung unter den universellen Sequenzen auszuschließen.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird auf das Phänomen einer Zielunabhängigen Signalerzeugung abgezielt, indem ein Hybridisierungsassay bereitgestellt wird, der so konfiguriert ist, dass die Schmelztemperatur T_m1 des C-2/C-3-Hybrids oder des L-2/M-1-Hybrids deutlich niedriger als die Schmelztemperatur T_m2 des L-3/M-2-Hybrids ist. Dieses Verfahren erfordert die Entwicklung und Konstruktion von Hybridkomplexen derart, dass die Schmelztemperatur T_m1 mindestens etwa 5°C niedriger, vorzugsweise mindestens etwa 10°C niedriger, bevorzugter mindestens 20°C niedriger als die Schmelztemperatur T_m2 ist.
Diese Stabilitätsdifferenz wird ausgenutzt, indem der Assay unter Stringenzbedingungen durchgeführt wird, die zu Beginn die Bildung von T_m1- und T_m2-Hybridkomplexen begünstigen. Die Stringenz wird in einem nachfolgenden Schritt des Assays verändert, der dadurch die physikalische Trennung des Zielanalyten von den Einfangsonden oder die physikalische Trennung der Amplifier-gebundenen markierten Sonden von dem Ziel erreicht. Die Stringenz kann gesteuert werden, indem ein Parameter verändert wird, der thermodynamisch variabel ist. Solche Variablen sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen Formamidkonzentration, Salzkonzentration, chaotrope Salzkonzentration, pH (Wasserstoffionenkonzentration), Gehalt an organischem Lösungsmittel und Temperatur. Bevorzugte Stringenzkontrollen sind pH und Salzkonzentration; ein Assayschritt wird bei einem pH oder einer Salzkonzentration durchgeführt, der/die den Hybridkomplex, der zwischen Einfangsonde/Einfangextender gebildet wird, oder das Hybrid, das zwischen Markierungsextender/Amplifier (oder Preamplifier) gebildet wird, destabilisiert. Ein bevorzugter Schritt, bei welchem Stringenz angewendet wird, ist der Zusatz von Substrat. So wird in einer bevorzugten Ausführungsform der Hybridisierungsassay unter Bedingungen durchgeführt, die die Stabilität von Hybridkomplexen, die zwischen allen Assaykomponenten gebildet werden, begünstigt, und danach wird mit Zusatz von Markierungssubstrat die Stringenz so verändert, dass Hybridkomplexe, z. B. Einfangsonde/Einfangextender oder Markierungsextender/Amplifier (Preamplifier) und dergleichen, destabilisiert werden, mit der Maßgabe, dass die markierte Sonde nicht aus dem Markierungsextender oder Amplifier freigesetzt wird.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung stellt ein Mittel dar, durch das die obige Ausführungsform der Erfindung verwirklicht werden kann, und zwar durch Konfigurieren des Hybridisierungsassays derart, dass die komplementäre Nukleotidsequenzen, die T_m1-Hybridkomplexe bilden, kürzer sind als die, die T_m2-Hybridkomplexe bilden. Der Fachmann wird erkennen, dass die Möglichkeit für eine Sequenzdiversität mit kürzeren komplementären Nukleotidsequenzen abnimmt. Diese Diversität kann allerdings aufrecht erhalten werden, indem in die komplementären Sequenzen ein nicht-natürliches Basenpaar, z. B. ein isoC-isoG-Basenpaar, eingebaut wird.
Dem Fachmann wird klar sein, dass, je höher die Temperaturdifferenz zwischen T_m1 und T_m2 ist, umso größer die "Effizienz" dieser Technik bei der Entfernung des Untergrundrauschens sein wird. So wird ein Fachmann auf diesem Gebiet erkennen, dass Temperaturdifferenzen von weniger als 10°C, selbst weniger als 5°C, auch eine Verringerung des Untergrundrauschens erlauben würden, wenn auch zu einem geringeren Ausmaß.
Das Verfahren der offenbarten Erfindung, durch die nicht-natürliche nukleotidische Einheiten in hybridisierende Oligonukleotidsequenzen eingebaut werden, um die Spezifität der Hybridisierung mit einem Zielanalyten zu erhöhen, findet in einer Vielzahl von Anwendungen Einsatzmöglichkeiten.
Im grundlegenden oder amplifizierten Nukleinsäure-Sandwichassay in Lösungsphase werden eine Vielzahl von Einfangsonden an einer festen Oberfläche fixiert. Am häufigsten wird der für eine nicht-spezifische Bindung verfügbare Oberflächenbereich durch Inkubieren der Oberfläche mit DNA aus z. B. Lachssperma oder Kälberthymus kontrolliert. Allerdings erhöht das Vorliegen dieser DNA das Potential für eine nicht-spezifische Hybridisierung von Assaykomponenten an den festen Träger und daher für ein verstärktes Untergrundrauschen. Ein Ersatz dieser natürlichen DNAs mit synthetischen DNAs, die nicht-natürliche Basen enthalten, wird die nicht-spezifische Hybridisierung und die nicht-spezifsche Bindung minimieren.
Diese Polynukleotide werden vorzugsweise durch 3'-Tailing kurzer Oligonukleotide mit Nukleotidgemischen durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, hergestellt. Alternativ können Oligonukleotide kurzer, nahezu statistischer Sequenzen, die nicht-natürliche Nukleotide enthalten, unter Bildung von Polynukleotiden aneinander gefügt werden. Verzweigte DNAs können zu diesem Zweck zweckdienlicherweise eingesetzt werden. Beispielsweise kann die Blocksequenz -TNVN-F-TNVN-J-TNVN-, worin F für isoC steht und J für isoG steht, hergestellt werden und chemisch unter Bildung eines Polymers aneinander gefügt werden. Der Vorteil einer Verwendung dieses Ansatzes gegenüber der Verwendung des enzymatischen 3'-Tailing-Ansatzes ist die Eliminierung von Homopolymer/Homooligomer-Sequenzen.
Eine weitere Anwendung, bei der die Konstruktion hybridisierender Oligonukleotide, die nicht-natürliche nukleotidische Einheiten enthalten, zum Einsatz kommt, ist die Entwicklung von Antisense-Verbindungen. Antisense-Verbindungen, wie sie z. B. in Ching et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10006–10010, Broder et al. (1990) Ann. Int. Med. 113: 604–618, Loreau et al. (1990) FEBS Letters 274: 53–56 und PCT-Publikation Nr. WO91/11535, WO91/09865, WO91/04753, WO90/13641, WO91/13080 und WO91/06629 erklärt werden; sind Oligonukleotide, die an die mRNA binden, die für die Bildung eines besonderen Proteins verantwortlich ist, oder die Produktion dieser mRNA behindern oder verhindern. Herkömmliche Antisensemoleküle sind im Allgemeinen fähig, mit einer Vielzahl von Oligonukleotidspezies zu reagieren. Infolge ihrer Länge (im Allgemeinen Oligonukleotidsequenzen mit bis zu 30 nukleotidischen Einheiten) zeigen solche Antisensemolekül-Probleme, die mit einer nichtspezifischen Hybridisierung mit Nicht-Zielspezies verbunden sind. Eine Lösung besteht darin, kurze Hybridisierungsregionen zwischen Mehrfachsonden und dem Ziel zu verwenden, den Gesamtkomplex zu verstärken, wobei kurze "Dimerisierungsdomänen" zwischen den Sonden verwendet werden, wie es von Distefano et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114: 1006–1007 beschrieben wurde. Die Dimerisierungsdomänen können so konzipiert sein, dass sie Schwänze mit komplementären Sequenzen haben, die nicht-natürliche nukleotidische Einheiten enthalten und dadurch eine hoch effiziente und spezifische Bindung an den Zielanalyten bereitstellen, ohne dass eine nicht-spezifische Hybridisierung an Nicht-Zielanalyten erhöht wird. Das Konzept ist in 2 mit einem doppelsträngigen DNA-Ziel dargestellt.
Wie in 2 erläutert wird, kann eine Strangverdrängung verwendet werden um eine doppelsträngige DNA auseinander zu brechen. AT-reiche Promotorsequenzen unter superhelikaler Spannung, die gegenüber S1-Nuklease empfindlich sind, und somit bereits teilweise einzelsträngig sind, sind eine besonders bevorzugte Stelle für diesen Typ der Antigenanwendung. Kurze Oligonukleotide würden verwendet, um die Spezifität zu maximieren; ihre Bindungsenergie an das Ziel würde verstärkt werden, indem sie unter Bildung eines Netzwerks aus Oligonukleotiden miteinander verknüpft werden.
In diesem Konstrukt enthalten die kurzen universellen Sequenzen, die keine stabilen Basenpaare in Abwesenheit eines Ziels bilden, isoC und isoG um eine nicht-spezifische Hybridisierung der Sonden mit den humanen Sequenzen zu begrenzen. Bei Bindung der Sonden 1, 2 und 3 an das Ziel werden die universellen Sequenzen in ausreichend enger Nähe sein, dass ihre wirksame Konzentration deutlich erhöht sein wird. Die universellen Sequenzen werden dann Paare bilden, was zu einer weiteren Erhöhung der Festigkeit der Bindung führt. RNA-Ziele können in Verbindung mit diesem Ansatz ebenfalls verwendet werden.
Das SELEX-Verfahren, das im U.S. Patent Nr. 5,270,163 von Gold et al., Tuerk et al. (1990) Science 249: 505–510, Szostak et al. (1990) Nature 346: 818–822 und Joyce (1989) Gene 82: 83–87 beschrieben wird, kann eingesetzt werden um RNA- oder DNA-Sequenzen auszuwählen, die infolge ihrer Gestalt ein gewünschtes Zielmolekül erkennen und daran binden. Der Ausdruck "Aptamer" (oder Nukleinsäureantikörper) wird hier verwendet um ein solches einzelsträngiges oder doppelsträngiges DNA- oder einzelsträngiges RNA-Molekül zu bezeichnen. Siehe z. B. PCT-Publikationen Nrn. WO92/14843, WO91/19813 und WO92/05285. "Zielmoleküle" umfassen im Gegensatz zu "Zielanalyten" Polymere, wie Proteine, Polysaccharide, Oligonukleotide oder andere Makromoleküle, und kleine Moleküle, wie z. B. Arzneimittel, Metaboliten, Toxine oder dergleichen, an welche ein Aptamer binden soll.
Im SELEX-Verfahren wird ein Oligonukleotid konstruiert, in dem ein n-mer, vorzugsweise eine randomisierte Sequenz von Nukleotiden, die dadurch einen "Randomerpool" von Nukleotiden bilden, von zwei Polymerase-Ketten-Reaktions(PCR)-Primern flankiert ist. Das Konstrukt wird unter Bedingungen, die die Bindung der Oligonukleotide an das Zielmolekül begünstigen, dann mit einem Zielmolekül in Kontakt gebracht. Solche Oligonukleotide, die das Zielmolekül binden, werden: (a) von solchen Oligonukleotiden, die das Zielmolekül nicht bin den, unter Verwendung herkömmlicher Verfahren, wie z. B. Filtration, Zentrifugation, Chromatographie oder dergleichen, abgetrennt; (b) vom Zielmolekül dissoziiert und (c) unter Verwendung herkömmlicher PCR-Technologie unter Bildung eines Liganden-angereicherten Pools von Oligonukleotiden amplifiziert. Es werden weitere Runden der Bindung, Abtrennung, Dissoziierung und Amplifikation durchgeführt, bis ein Aptamer mit der gewünschten Bindungsaffinität, Spezifität oder beidem erreicht ist. Die identifizierte endgültige Aptamersequenz kann dann chemisch oder durch in vitro-Transkription hergestellt werden. Bei Herstellung von solchen Aptameren, werden ausgewählte Basenpaare durch nicht-natürliche Basenpaare ersetzt, um die Wahrscheinlichkeit der Aptameren, an humane Nukleinsäuren zu hybridisieren, zu reduzieren.
Die vorliegende Erfindung kann auf mindestens zwei allgemeinen Wegen in SELEX eingesetzt werden. Erstens, isodG und isodC können unter den Sequenzen in dem statistischen DNA-Sequenz-Pool enthalten sein. Die Anzahl möglicher statistischer Strukturen, die Proteine oder andere wichtige Biomoleküle erkennen, wird durch Synthese von DNA-Strängen aus sechs oder mehr Nukleotiden anstelle der herkömmlichen vier Nukleotide A, T, G und C erhöht. Dies wiederum erhöht die Chancen zur Identifizierung einer Sequenz, die mit größerer Affinität und/oder Spezifität an das Zielmolekül bindet.
Im SELEX können die konservierten Oligonukleotidsequenzen, die ausgewählt wurden, eine unerwünschte Hybridisierung an celluläre Sequenzen aufweisen. Diese nicht-spezifische Hybridisierung kann unter Verwendung von nicht-natürlichen Basen im Selektionsverfahren reduziert werden. Nukleotide, die von humanen RNA- und DNA-Polyrnerasen nicht erkannt werden, die aber durch bestimmte Phagen- oder Bakterienpolymerasen erkannt werden, sind in dieser Anwendung besonders nützlich.
Eine zweite Verwendung für die vorliegende Erfindung im SELEX-Verfahren ist die Herstellung eines endgültigen Aptamerkonstrukts mit minimierter nicht-spezifischer Hybridisierung. Beispielsweise werden Aptamere, die eine vorher bestimmte Bindungsaffinität, -Spezifität oder andere Zielmolekül-Erkennungscharakteristika aufweisen, aus einem Pool an RNA- oder DNA-Sequenzen unter Verwendung des SELEX-Verfahrens ausgewählt. Diese Zielmolekül-Erkennungscharakteristika werden durch die Sekundärstruktur des Aptamers bestimmt, die zum Teil durch die Bildung von intramolekularen Oligonukleotid-Hybridkomplexen aufrecht gehalten wird. Bei Klärung der Sekundärstruktur des Aptamers wird es für den Fachmann klar sein, dass die Spezifität von Basenpaaren in bestimmten intramolekularen Hybridkomplexen zur Aufrechterhaltung der Sekundärstruktur und daher der Zielmolekül-Erkennungs- und -Bindungs-charakteristika des Aptamers in hohem Maße bevorzugt ist. D. h. die Basenpaare sind vorzugsweise G-C oder A-T. In diesen intramolekularen Hybridkomplexen wird es andere Basenpaare geben, z. B. im Basenpaarungsteil der Sternschleife, die durch ein beliebiges Paar komplementärer Nukleotide, die hier als N-N'-Basenpaare bezeichnet werden, ersetzt sein können, ohne dass die Sekundärstruktur des Aptamers verändert wird.
Ein einfacher Ersatz von ausgewählten N-N'-Basenpaaren und G-C- und C-G-Basenpaaren im endgültigen Aptamerkonstruktur durch isoG-isoC oder isoC-isoG wird eine nicht-spezifische Hybridisierung an Nicht-Ziel-Oligonukleotidsequenzen reduzieren. Da das isoC-isoG-Basenpaar mit dem C-G-Basenpaar isoenergetisch ist, werden die Grundgestalt des Moleküls und die Festigkeit der Haarnadeln sehr ähnlich sein. Ein Basenpaar, das mit A-U isoenergetisch ist, wäre zum Ersatz von Basenpaaren wünschenswert, bei denen die Gewinnungssequenzen eine starke Präferenz für A-U oder U-A gegenüber C-G zeigen. Diese Substituenten haben den Effekt, dass die Aptamere für das Zielmolekül spezifischer gemacht werden, indem ihr Potential für eine unerwünschte Hybridisierung an celluläre RNA- und DNA-Sequenzen limitiert wird.
In dem Basisverfahren werden ausgewählte Basenpaare durch isoC-isoG- oder isoGisoC-Basenpaare ersetzt. Im endgültigen Konstrukt können isoC-isoG-Basenpaare Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide umfassen. Ein chimäres Aptamer(bestehend sowohl aus Ribonukleotiden als auch Desoxyribonukleotiden)-Molekül kann chemisch hergestellt werden. Alternativ können Ribo-isoGTP und Ribo-isoCTP (mit geeignetem 2'-Schutz) verwendet werden um das Aptamer durch in vitro-Transkription von DNA-Matrizen, die isoC und isoG enthalten, herzustellen.
Andere Anwendungen, in denen die vorliegende Erfindung Einsatz finden kann, umfassen in situ-Hybridisierungen bei der Reduzierung einer nicht-spezifischen Bindung in Hybridisierungsassays und in Polymerasen-Ketten-Reaktions(PCR)-Assays.
Einer in situ-Hybridisierung fehlt ausreichende Empfindlichkeit um ein einzelnes Molekül eines Zielanalyten zu detektieren. In situ-PCR (siehe z. B. Bagasra et al. (1993) J. Immunological Methods 158: 131–145) wurde entwickelt um diesem Empfindlichkeitsbedarf nachzukommen; allerdings ist eine quantitative Bestimmung nicht so genau wie mit dem PCR-Verfahren. Eine Alternative wäre eine Verwendung von mehreren Markierungsextendersonden um den Ziel-analyten zu binden. Die Markierungsextender würden entweder Preamplifier oder Amplifier binden. Bei Verwendung würden Preamplifier Markierungsextender und Amplifier überbrücken. Die Amplifier würden markierte Sonden binden, die vorzugsweise durch Lumineszens (Fluoreszens, wenn die Empfindlichkeit hoch genug ist) detektiert würden. Wie vorstehend würden die universellen Sequenzen L-2/M-1 und M-2/L-3 aus kurzen Oligonukleotiden bestehen, die optimal zwischen 15 und 30% isoC und isoG enthalten um eine unerwünschte Hybridisierung an humane Sequenzen zu reduzieren. Es könnte ein viertes Basenpaar verwendet werden um eine Repräsentation der natürlichen Basen in diesen Sequenzen zu reduzieren.
Wie früher angegeben wurde, kann eine nicht-spezifische Bindung, wie auch eine nichtspezifische Hybridisierung durch Verwendung nicht-natürlicher Basenpaare reduziert werden. Statistische Polymere oder nahezu statistische Blockcopolymere, die aus sechs bis acht unterschiedlichen Nukleotiden bestehen, könnten verwendet werden um eine nicht-spezifische Bindung des Amplifiers und markierter Sonden an die cellulären Bestandteile, die hohe Affinität für Polynukleotide haben, zu verringern. Somit wird eine nicht-spezifische Bindung ohne die Gefahr einer Erhöhung der nicht-spezifischen Hybridisierung verringert werden, indem natürliche Sequenzen aus Kalb oder Lachs eingeführt werden, wie es üblicherweise gemacht wird.
Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird erkennen, dass die gleiche Strategie auf Blotting-Assays, z. B. Dot blots, Southern blots und Northern blots, angewendet werden könnte um eine nicht-spezifische Hybridisierung und nicht-spezifische Bindung der Sonden an die festen Träger zu verringern.
Die vorliegende Erfindung findet auch verschiedene Anwendungen in der PCR und in anderen exponentiellen Amplifikationstechniken. Bei der ineinander geschachtelten PCR beispielsweise wird der Zielanalyt zu Beginn amplifiziert und dann mehrere tausendfach verdünnt und dann ist es üblich, einen 5'-Überhang an einem Primer zum Einfangen und einen 5'-Überhang an dem anderen Primer zur Markierung zu verwenden. Es wird ein Spacer, der durch die Polymerase nicht gelesen werden kann, insertiert, so dass die Überhänge einzelsträngig bleiben (siehe z. B. Newton et al. (1993) Nucl. Acids Res. 21: 1155–1162). Die generischen Sequenzen in diesen 5'-Überhängen können so hergestellt werden, dass sie modifizierte Basenpaare enthalten um die Häufigkeit eines Primings bei Nicht-Zielen zu reduzieren. In der Tat kann das Vorliegen von isodC oder isodG in der ersten Base des 5'-Überhangs anstelle der derzeit verwendeten Spacer verwendet werden; die Polymerase kann isodC oder isodG nicht lesen, da sie kein isodGTP oder isodCTP haben wird, um es anstelle dieses einzusetzen. Da die Polymerase T mit geringer Häufigkeit in das Polymer setzen kann, wenn sie isodG im Primer nachweist, ist es vorteilhaft, isoC als die erste Base im 5'-Überhang zu verwenden.
Experimentelles
Die Praxis der vorliegenden Erfindung wird, wenn nichts anderes angegeben ist, herkömmliche Techniken der organischen Synthesechemie, Biochemie, Molekularbiologie und dergleichen verwenden, die innerhalb des Fachwissens eines Fachmanns liegen. Solche Techniken sind in der Literatur vollständig erläutert. Siehe z. B. Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, Hrsg. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins, Herausg. 1984); und die Reihe Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.).
In den folgenden Beispielen wurden Anstrengungen unternommen um die Genauigkeit bezüglich der verwendeten Zahlen (z. B. Mengen, Temperatur usw.) sicherzustellen, allerdings sollten gewisse experimentelle Fehler und Abweichungen berücksichtigt werden. Die Temperatur ist immer in Grad Celsius angegeben und, wenn nichts anderes angegeben ist, ist der Druck atmosphärischer Druck oder liegt in der Nähe von atmosphärischem Druck.
Synthese von Isoguanosin oder 2'-Desoxy-isoguanosin
Für die Synthese von Isoguanosin oder 2'-Desoxy-isoguanosin wurden nur wenige Verfahren beschrieben. Beispielsweise wurde 2'-Desoxy-isoguanosin synthetisiert: 1) aus 2'-Desoxyadenosin über 2'-Desoxyadenosin-(N¹-oxid) durch direkte Photolyse unter basischen Bedingungen (Switzer et al. (1993), oben); 2) aus 2-Chlor-2'-desoxyadenosin durch direkte Photolyse unter basischen Bedingungen (Seela et al. (1992) Helv. Chim. Acta 75: 2298–2306); und 3) auf chemischem Weg aus 6-Amino-1-(2'-desoxy-beta-D-erythropentofuranosyl)-1H-imidazol-4-carbonitril [AICA-2'-desoxynukleosid], das mit Benzoylisocyanat umgesetzt wurde, worauf eine Behandlung mit Ammoniak zur Durchführung einer Anlagerung des Pyrimidinrings folgte (Kazimierczuk et al. (1991) Helv. Chim. Acta 74: 1742–1748).
Da allerdings die photolytische Umwandlung von 2'-Desoxyadenosin-(N¹-oxid) in 2'-Desoxy-isoguanosin selbst nicht zur Erhöhung des Maßstabs verleitet, wurde ein zweckdienlicher chemischer Weg zu 2'-Desoxy-isoguanosin aus leicht verfügbarem 2'-Desoxyribonukleosid als Ausgangsmaterial entwickelt.
Es wurden verschiedene Verfahren für die Umwandlung von 2'-Desoxyguanosin in 2,6-Diaminopurinnukleosid und N⁶-Alkyl-2,6-diaminopurinnukleosid über spezielle "konvertierbare" 2'-Desoxyguanosinderivate, z. B. O⁶-Phenyl-2'-desoxyguanosin, beschrieben (MacMillan et al. (1991) Tetrahedron 47: 2603–2616; Gao et al. (1992) J. Org. Chem. 57: 6954–6959; und Xu et al. (1992) Tetrahedron 48: 1729–1740). Ferner beschrieben Fathi et al. (1990) Tetrahedron Letters 31: 319–322 eine zweckdienliche Synthese von O⁶-Phenyl-2'-desoxyguanosin unter Verwendung eines Verfahrens, das eine Behandlung von 2'-Desoxyguanosin mit Trifluoressigsäureanhydrid/Pyridin, gefolgt von einer in situ-Verdrängung mit Phenol, involviert. Alternativ wurde die Einführung von O⁶-Phenylgruppierungen in 2'-Desoxyguanosin von Reese et al. (1984) J. Chem. Soc., Perkin Trans. I, 1263–1271 beschrieben, wobei das Zwischenprodukt O⁶-(4-Toluolsulfonyl)-2'-desoxyguanosin mit Trimethylamin, gefolgt von Phenol, behandelt wurde um eine Verdrängung von O⁶-(4-Toluolsulfonyl) unter Erhalt von O⁶-Phenyl-2'-desoxyguanosin zu erreichen. Eine Isoguanosin-artige Verbindung wurde aus 2-(Methylmercapto)-6-aminopyrazol-pyrimidinribonukleosid durch S-Oxidation, Herstellung von 2-(Methylsulfonyl)-6-aminopyrazolopyrimidinribonukleosid, gefolgt von einer Verdrängung mit NAH erzeugt, wobei das Isoguanosin als Analogon erhalten wurde (Cottam et al. (1983) Nucleic Acids Research 11: 871–882).
Eine Transformation der 2-Aminogruppe in Guanosin und 2'-Desoxyguanosin unter Verwendung von Alkylnitriten wurde beschrieben. Diese umfassen eine Umwandlung in 2-Halogen- (Nair et al. (1982) Synthesis 670–672) und 2-(Methylmercapto)-6-chlorpurinribonukleosid (Trivedi (1991) in Nucleic Acid Chemistry, Townsend et al. (Herausg.) Wiley Inter-Science, Teil 4, 269–273) in Radikalreaktionen. Eine Oxidation von O⁶-(p-Nitrophenylethyl)-3',5'-O-di-t-butyldimethylsilan-2'-desoxyguanosin mit reinem Pentylnitrit unter Erhalt von O⁶-(p-Nitrophenylethyl)-3',5'-O-di-TBDMS-2'-desoxyxanthosin wurde beschrieben (Steinbrecher et al. (1993) Angew. Chem. Int. Ausg. Engl. 32: 404–406).
Ein Verfahren für die Synthese von 2'-Desoxyisoguanosin wurde bei Seela et al. (1994) Helv. Chim. Acta 77: 622–30 beschrieben. In einer ersten Stufe wurde 2'-Desoxyguanosin in 2-Amino-2'-desoxyadenosin umgewandelt. In einer zweiten Stufe wurde 2-Amino-2'-desoxy adensoin durch Diazotierung der 2-Aminogruppe mit Natriumnitrit deaminiert, wodurch 2'-Desoxyisoguanosin erhalten wurde.
Das hierin offenbarte und beanspruchte Verfahren zur Synthese einer Verbindung mit der Strukturformel
worin R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl, Sulfhydryl, Halogen, Amino, Alkyl, Allyl und -OR², wobei R² Alkyl, Allyl, Silyl oder Phosphat ist, umfassend:

a) Umsetzen einer Verbindung mit der Strukturformel
mit einem Reagens, das geeignet ist, sowohl die 3'- als auch die 5'-Hydroxylgruppen zu schützen;
b) Umsetzen des Produktes aus Schritt (a) mit einem Reagens, das geeignet ist, die O⁶-Oxygruppierung in eine funktionelle Gruppe umzuwandeln, welche für nukleophiles Ersetzen empfänglich ist, wobei eine funktionalisierte O⁶-Gruppierung hergestellt wird;
c) Oxidieren der 2-Aminogruppe des Produktes aus Schritt (b);
d) Umsetzen des Produktes aus Schritt (c) mit einem nukleophilen Reagens um die funktionalisierte O⁶-Gruppierung zu ersetzen; und
e) Umsetzen des Produktes aus Schritt (d) mit einem Reagens, das geeignet ist, die geschützten 3'- und 5'-Hydroxylgruppen zu entschützen.

Die Umwandlung von Guanosin oder 2'-Desoxyguanosin in Isoguanosin oder 2'-Desoxyisoguanosin kann durch Schützen der Hydroxylgruppen an der Zuckergruppierung unter Verwendung eines geeigneten Reagenses, z. B. TBDMS, Benzoylchlorid, Essigsäureanhydrid oder dergleichen, durchgeführt werden. Wie vorher angegeben wurde, können eine oder mehrere der Hydroxylgruppen an der Zuckergruppierung durch Halogen, aliphatische Gruppen ersetzt werden oder Ether, Amine oder dergleichen funktionalisiert werden. Das Produkt wird isoliert und das O⁶ wird so modifiziert, dass es durch geeignete nukleophile Agentien ersetzt werden kann. Beispiele für solche ersetzbaren bzw. verdrängbaren Gruppen umfassen z. B. CH₃-S-C₆H₄-O⁶-, C₆H₅-SO₂-O⁶-, C₆H₅-O⁶-, 4-Nitro-C₆H₄-O⁶-, 2,4,6-Trinitro-C₆H₂-O⁶- oder dergleichen. Die 2-Aminogruppe wird dann unter Verwendung eines Alkylnitrits oder eines anderen geeigneten Agenses, wie es auf dem Gebiet bekannt ist, in die Oxyfunktion übergeführt (siehe Nair et al. (1982), supra; Trevidi (1991) supra; oder Steinbrecher et al. (1993), supra). Das Produkt wird mit einem geeigneten Nukleophil, z. B. NH₄OH, oder anderem Aminoalkyl, Aminoaryl, Aminoheteroalkyl, Aminoheteroaryl, das ein terminales -NH₂, -SH, -COOH enthält, oder dergleichen umgesetzt um dadurch die modifizierte O⁶-Abgangsgruppe zu ersetzen. Eine Entschützung der geschützten Hydroxylgruppen kann z. B. durch Behandlung mit Base oder Fluorid erfolgen.
In der folgenden Diskussion wird O⁶-(4-Methylthiophenyl) als Beispiel für eine verdrängbare Gruppe dienen. Allerdings ist seine Verwendung nur zum Zweck einer Beschreibung besonderer Ausführungsformen und nicht zur Beschränkung anzusehen.
N⁶-alkylierte Isoguanosinderivate können in einfacher Weise synthetisiert werden, indem ein Alkylamin als Nukleophil verwendet wird. Beispielsweise kann Hexandiamin eingesetzt werden um das O⁶-(4-Methylthiophenyl) unter Bildung von N⁶-(6-Aminohexyl)-isoguanosin zu verdrängen. Ein Schutz der Aminohexylgruppe (z. B. als das Trifluoracetamidoderivat) und anschließende Umwandlung in ein Phosphoramidit-Reagens liefert ein funktionalisierbares Isoguanosin-Analogon, das in eine gewünschte Position in ein Oligonukleotid zur weiteren Derivatisierung nach der Synthese eingebaut werden kann. Auf diese Weise wäre es möglich, die Isoguanosingruppierung von ausgewählten Isoguanosin/Isocytidin-Basenpaaren spezifisch zu markieren. Es wäre auch möglich, eine Reihe von N⁶-Derivaten von Isoguanosin, die eine beliebige gewünschte Funktionalität tragen, in einfacher Weise zu synthetisieren, indem die O⁶-(4-Methylthiophenyl)-Gruppe mit einem in geeigneter Weise terminierten Nukleophil, z. B. -COOH-, -SH, -NH₂ oder dergleichen, ersetzt wird.
Darüber hinaus kann O²-(4-Methylthiophenyl)-2'-desoxyxanthosin in seiner vollständig geschützten Phosphoramiditform (O²-(4-Methylthiophenyl)-5'-O-DMT-3'O-(BCE-diisopropylphosphoramidit)-2'-desoxyxanthosin) als konvertierbares Derivat nach Einbau in ein Oligonukleotid verwendet werden. Eine Verdrängung des O²-(4-Methylthiophenyl) aus dem O²-(4-Methylthiophenyl)-2'-desoxyxanthosin mit Alkylamin oder anderem funktionalisiertem Alkylamin produziert N⁶-(Aminoalkyl)-2'-desoxy-isoguanosin-enthaltende Oligonukleotide. Das derivatisierte Isoguanosin kann als Stelle zur Einführung einer Markierung oder eines anderen Reportermoleküls spezifisch am funktionalisierten Isoguanosinrest dienen.
Überblick über den Syntheseansatz: Wie in Schema 1 gezeigt ist, wurde die Synthese von 2'-Desoxyisoguanosin wie folgt in fünf Schritten aus 2'-Desoxyguanosin erreicht:

1) Umwandlung von 2'-Desoxyguanosin in 3',5'-O-(t-Butyldimethylsilyl)₂-2'-desoxyguanosin (Ogilvie et al. (1973) Can. J. Chem. 51: 3799–3807) mit Reinigung durch Umkristallisieren;
2) Umwandlung in O⁶-(4-Toluolsulfonyl)-3',5'-O-TBDMS₂-2'-desoxyguanosin;
3) Verdrängung der 4-Toluolsulfonylgruppe am O⁶ mit einem geeigneten Phenol, z. B. 4-(Methylthio)phenol oder Pentachlorphenyl unter Anwendung des Reese-Verfahrens unter Erhalt von O⁶-(4-Methylthio)phenyl)-3',5'-O-TBDMS₂-2'-desoxyguanosin (Reese et al. (1984), supra);
4) Oxidation der 2-Aminogruppe mit tert.-Butylnitrit unter neutralen Bedingungen zur Oxyfunktion unter Erhalt von O⁶-(4-Methylthio)phenyl-3',5'-O-TBDMS₂-2'-desoxyxanthosin (Steinbrecher et al. (1993), supra); und
5) Verdrängung der O²-(4-(Methylthiophenyl)-Gruppe mit Ammoniumhydroxid bei erhöhter Temperatur unter Erhalt von 3',5'-O-TBDMS₂-2'-desoxy-isoguanosin.

Die Synthese von Isoguanosin aus Guanosin kann unter Verwendung eines ähnlichen Reaktionsschemas erfolgen.
SCHEMA 1
SCHEMA 1 (Fortsetzung)
Das erhaltene Material war in jeder Hinsicht (TLC, HPLC, UV und NMR) mit einer authentischen Probe, die auf einem publizierten, photolytischen Weg (Switzer et al. (1993), supra) hergestellt worden war, identisch.
Herstellung von Isocytidin- oder 2'-Desoxy-isocytidin-Derivaten
Es können Derivate von Isocytidin oder 2'-Desoxy-isocytidin hergestellt werden, in denen die glykosidische Bindung gegenüber einem Einwirken von verdünnter Säure während der Oligonukleotidsynthese stabilisiert ist. Für 2'-Desoxyadenosin wurden z. B. N²-Amidinderivate beschrieben; McBride et al. (1986) J. Am. Chem. Soc. 108: 2040–2048; Froehler et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11: 8031–8036 und Pudlo et al. (1994) Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 1025–1028. N²-(N,N-Di(X)formamidino)-2'-desoxy-isocytidin wurde nach dem folgenden Verfahren synthetisiert: Wie hier als Beispiel aufgeführt, ist X n-Butyl. X kann allerdings auch C₂-C₁₀-Alkyl, Aryl, Heteroalkyl, Heteroalkyl oder dergleichen sein.
N-Di-n-butylformamiddimethylacetal wurde durch Transaminierung von N,N-Methylformamiddimethylacetal mit Di-n-butylamin, wie es in McBride et al. (1986), supra, Froehler et al. (1983), supra, und Pudlo et al. (1994), supra, beschrieben ist, synthetisiert. 10 mmol 2'-Desoxy-5-methyl-isocytidin wurden in 100 ml Methanol suspendiert und es wurden 10 mmol N,N-Di-n-butylformamiddimethylacetal zugesetzt. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren wurde eine klare Lösung erhalten. Eine Analyse mittels Dünnschichtchromatographie an Silical 60H, entwickelt unter Verwendung von 10% Methanol in Methylenchlorid, zeigte, dass das Ausgangsmaterial vollständig verbraucht war. Es wurde Wasser (10 ml) zugegeben um einen Überschuss an Reagens zu zerstören; die Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt, wodurch 3,8 g rohes N²-(N,N-Dibutylformamidino)-2'-desoxy-isocytidin erhalten wurden. Dieses Derivat kann direkt in 5'-O-DMT-N²-(N,N-dibutylformamidino)-2'-desoxy-isocytidin zum Einbau in Oligonukleotide umgewandelt werden.
Es können andere Isocytidinderivate hergestellt werden, die funktionalisierbare Substituenten liefern, durch welche nachweisbare Markierungen in eine spezifische Position eines Oligonukleotids eingebaut werden können. Beispielsweise wurden 5-alkylierte 2'-Desoxyuridinderivate beschrieben, z. B. 5-[N-(6-Trifluoracetylaminohexyl)-3-(E)acrylamido]-2'-desoxyuridin, und zwar von Ruth (1991) Oligodeoxynucleotides with Reporter Groups Attached to the Base, in Eckstein (Herausg.) Oligonucleotides and Analogues, IRL press, S. 255–282. Es wurde festgestellt, dass solche 5-Positionsderivate ein Basenpaar-Hybridisierungsmuster nicht stören. Die von Ruth beschriebene Chemie kann angewendet werden um 5-[N-(6-Trifluoracetylaminohexyl)-3-(E)acrylamido]-2'-desoxy-isocytidin zu synthetisieren, wodurch ein funktionalisiertes Isocytidin bereitgestellt wird, das an ausgewählten Isoguanosin*Isocytidin-Basenpaaren nachweisbar markiert werden kann.
Diese und andere 5-Positionsderivate von Isocytidin und 2'-Desoxyisocytidin stellen eine zusätzliche Stabilisierung für eine Basenpaarbildung bereit. Solche Derivate umfassen 5'-β- Propinyl (siehe Froehler et al. (1993) Tetrahedron Lett. 34: 1003–1006), 5-β-Propenyl- oder andere 5-Alkyl-isocytidin- oder 2'-Desoxyisocytidinderivate.
Kits zur Durchführung von Nukleinsäure-Hybridisierungsassays gemäß der vorliegenden Erfindung werden eine abgepackte Kombination aus mindestens einer hybridisierenden Oligonukleotidsonde, einem Segment, das zur Bildung eines Hybridkomplexes mit dem Analyten fähig ist, und ein Mittel zum Detektieren des Hybridkomplexes umfassen, wobei mindestens eine hybridisierende Oligonukleotidsonde eine erste nukleotidische Einheit umfasst, welche unter Bedingungen, unter denen A-T- und G-C-Basenpaare gebildet werden, mit Adenosin (A), Thymidin (T), Cytidin (C), Guanosin (G) oder Uridin (U) nicht effektiv ein Basenpaar bilden wird. Diese Reagentien werden typischerweise in getrennten Behältern im Kit vorliegen. Der Kit kann außerdem ein Denaturierungsreagens zur Denaturierung des Analyten, Hybridisierungspuffer, Waschlösungen, Enzymsubstrate, negative und positive Kontrollen und geschriebene Instruktionen zur Durchführung des Assays enthalten.
Die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung einer Kombination aus gerichteter Festphasen-Oligonukleotidsynthese, enzymatischen Ligationsverfahren und chemischer Synthese in Lösungsphase, wie es detailliert im U.S. Patent Nr. 5,849,481 beschrieben wird, zusammengefügt werden.
Alle chemischen Oligonukleotidsynthesen können mit einem automatischen DNA-Synthesizer (Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Modell 380 B) durchgeführt werden. Die Phosphoramiditchemie des β-Cyanoethyl-Typs wurde eingesetzt; einschließlich einer 5'-Phosphorylierung, die PHOSTEL^TM-Reagens (DMT-O-CH₂CH₂-(SO₂)-CH₂CH₂-O-P(N(iPr)₂) (-O-CH₂CH₂CN) verwendet, worin DMT Dimethoxytrityl ist und iPr Isopropyl ist). Es wurden die Standardprotokolle des Herstellers verwendet, wenn nichts anderes angegeben ist.
Beispiel 1
Assay auf Untergrundrauschen, verursacht durch nicht-spezifische Hybridisierung von zielspezifischen Extendersequenzen mit generischen Assaykomponenten
Um zu bestimmen, wie ein Assay-Untergrundrauschen durch Kreuzhybridisierung von zielspezifischen Extendersequenzen mit generischen Assaykomponenten verursacht werden kann, wurde ein amplifizierter DNA-Hybridisierungsassay durchgeführt um M13-Phagen quantitativ zu bestimmen, wobei die Pools von Einfangextendern und Markierungsextendern verwendet wurden, die in den Tabellen 1, 2 und 3 angegeben sind.
Für Zwecke der Erläuterung trennt ein Zwischenraum die 3'-Nicht-Ziel-Bindungsregion von der Bindungsregion jeder Sonde.
Der Assay wurde im Wesentlichen so ablaufen gelassen, wie es in der PCT Publikation Nr. WO95/16055 beschrieben ist. Kurz beschrieben, nach einer Hybridisierung über Nacht bei 63°C in Mikrotitervertiefungen, die Einfangsonden enthielten, welche zu der Nicht-Ziel-Bindungsregion der Einfangextender komplementär waren, wurden die Platten für 10 min auf Raumtemperatur abgekühlt, zweimal mit einem Puffer, der 0,1 × SSC (15 mM NaCl; 1,5 mM Natriumcitrat; pH 7,0), 0,1% Natriumdodecylsulfat enthielt, gewaschen. Ein 15 × 3 (15 "Arme", jeder mit 3 Sonden-Bindungsstellen für alkalische Phosphatase) verzweigter DNA-Amplifier (100 fm), der zu der 3'-Nicht-Ziel-Bindungsregion des Markierungsextenders komplementär war, wurde in die Vertiefungen gegeben und die Inkubation wurde für 30 min bei 53°C fortgesetzt, wonach die Platten gekühlt und wie oben gewaschen wurden. Nach dem Zusatz einer alkalischen Phosphatasesonde (200 fm) zu den Vertiefungen und einer weiteren Inkubation für 15 min bei 53°C wurden die Platten erneut gekühlt und wie oben gewaschen. Es erfolgten drei zusätzliche Waschgänge mit einem 0,1 × SSC-Puffer. Die Signale wurden nach 20 min in Dioxetanphosphat-Substratlösung Lumiphos 530 (Lumigen) in einem Chiron-Luminometer detektiert. Die Resultate sind in Tabelle 4 angegeben.
Der Zusatz der Pool B-Einfangextender erhöht das Nettosignal nicht, erhöht aber das Rauschen um das etwa 100-fache. Eine Computeranalyse der involvierten Sequenzen zeigte, dass der Einfangextender Nr. 8 von Pool B umfangreiche Homologie mit der T20--LLA2-Sequenz des verzweigten DNA-Amplifiers hat (einschließlich eines 9mer-Oligo(dA)--Oligo(dT)), während der Einfangextender Nr. 9 von Pool B umfangreiche Homologie mit der BLA3c-Sequenz des verzweigten DNA-Amplifiers hat.
Die vorliegende Erfindung wendet sich dem Problem eines Hybridisierungs-abhängigen Assay-Untergrundrauschens zu. Nukleotidsequenzen werden aufgebaut, die durch Nukleotide unterbrochen sind, welche mit "natürlichen" Nukleobasen keine stabilen Basenpaare bilden, wodurch die Hybridisierung von solchen Sequenzen mit natürlichen Sequenzen inhibiert wird. Idealerweise wäre jede dritte oder vierte Base in der universellen Sequenz eine modifizierte Base, die sich nicht mit A, C, G oder T (U) paart. Durch Verwendung von Basenpaaren, die mit dem C*G-Basenpaar isoenergetisch sind, kann man auch die Länge der universellen Sequenzen reduzieren. Statistische Argumente zeigen, dass dieses auch die Häufigkeit unerwünschter Kreuzhybridisierungen unter universellen Sequenzen und zwischen universellen Sequenzen und Nicht-Ziel-Sequenzen in der Probe und zwischen universellen Sequenzen und den zielspezifischen Sequenzen in den Extendersonden reduzieren sollte. Auf der Basis einer mehrzähnigen Bindung unter Bildung stabiler Hybride können die Längen der universellen Sequenzen weiter reduziert werden (siehe WO95/16055). Alle universellen Sequenzen würden mit mindestens 6 und vorzugsweise 8 Nukleotiden entwickelt: Einfangsonde, Einfangextenderschwänze, Markierungsextenderschwänze, Amplifier, markierte Sonden und Preamplifier (wenn anwendbar).
Beispiel 2
Spezifität und Stärke von isoC-isoG-Basenpaaren
Um die Spezifität und Stärke des isoC-isoG-Basenpaars zu bestimmen, wurde eine thermische Schmelzanalyse an den folgenden Oligonukleotiden durchgeführt:
Das Kernhybrid dieser Oligonukleotide besteht aus dreizehn Nukleotiden.
Nukleotide, die bei der Basenpaarung nicht involviert sind, werden in Klammern angegeben. L = ein primäres Amin, F = isoC, J = isoG. Eine thermische Schmelzanalyse erfolgte an einem Cary 3E-Spektralphotometer in 3 × SSC (0,45 M NaCl, 0,045 M Natriumcitrat), pH 7,9. Jedes der zwei Oligonukleotide, die miteinander inkubiert wurden, lag mit etwa 1,5 μM vor. Die T_m wurde als Maximum in einem Diagramm dA₂₆₀/dT vs Temperatur errechnet. Die in Tabelle 4 angegebenen Resultate zeigen, dass das isoC*isoG-Basenpaar mit dem natürlichen C*G-Basenpaar isoenergetisch ist.
Dementsprechend können universelle Sequenzen, die C, G, isoC, isoG, A und T etwa äquimolar enthalten, kürzer sein als Sequenzen, die nur A, T, C und G in etwa gleichen Verhältnissen enthalten. Dies begrenzt das Potential für eine Kreuzreaktivität mit natürlichen Nicht-Zielsequenzen in der Probe und mit LE- und CE-Zielbindungssequenzen, die mehr oder weniger darauf beschränkt sind, aus A, T(U), C und G zu bestehen.
Die Daten zeigen auch die Spezifität des isoC*isoG-Basenpaars. Die isoG*G- und isoG*C-Paare verhalten sich wie Fehlpaarungen. Klassischerweise wird die Destabilisierung in Grad C durch die prozentuale Fehlpaarung genähert. Somit würde eine Änderung von 7,5°C für T_m vorhersagen, dass in 13 Nukleotiden eine Fehlpaarung auftritt (7,5% Fehlpaarungen). Die beobachtete Änderung von 8°C bei einem Vergleich der C*G- oder isoC*isoG-Paarungen mit den Fehlpaarungen entspricht der Änderung, die bei einer durchschnittlichen Fehlpaarung mit dem A-, T-, C- und G-Code auftreten würde.
IsoG existiert in mindestens zwei tautomeren Formen, dem Keto und dem Enol. Die Keto-Form ist in wässrigen Lösungsmitteln begünstigt und die Enol-Form ist in organischen Lösungsmitteln begünstigt (Sepiol et al. (1976) Zeitschrift für Naturforschung 31C: 361–370). Das isoG-Enoltautomer kann im Prinzip zwei Wasserstoffbrückenbindungen an dT ausbilden, was es dem A*T-Basenpaar analog macht. Wenn das Enoltautomer im Hybridisierungspuffer in signifikanten Konzentrationen vorliegt, wird die Spezifität des isoC*isoG-Basenpaars limitiert sein. Die beobachtete T_m bei der iso*T-Fehlpaarung war 53°C, was im Wesentlichen dieselbe wie die anderer Fehlpaarungen ist.
Diese Daten stützen die Schlussfolgerung, dass das Enoltautomer in 3 × SSC mit pH 7,9 in sehr geringer Konzentration vorliegt oder, wenn es vorliegt, noch ein Hybrid mit 7–8°C niedrigerer T_m als das isoC-isoG-Hybrid bildet. Die Kontrolle mit einer G*T-Fehlpaarung hatte eine T_m von etwa 49°C. Dies ist etwas niedriger als es für die durchschnittliche G*T-Fehlpaarung erwartet wird, ist aber nahe an der für die isoG-T-Fehlpaarung.
Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird erkennen, dass noch eine andere Basenpaarungskombination (d. h. 8 Basen, 4 Paare), die entweder mit C*G isoenergetisch ist oder nicht, die Spezifität der Basenpaarung unter universellen Sequenzen verbessern würde. In diesem Fall könnte man A, T, C und G aus den universellen Sequenzen nahezu eliminieren. Allerdings trägt eine kleine Repräsentation dieser Basen zu der Diversität der Bibliothek möglicher universeller Sequenzen bei, was einem die Möglichkeit gibt, universelle Sequenzen zu entwickeln; die möglichst nicht miteinander wechselwirken.
Bei einem 4-Basencode z. B. kann man nur zwei Paare von universellen 15meren entwickeln, welche kein einzelnes 3mer-Kreuzhybrid haben. D. h. mit Zusatz eines dritten Paars von 15mer-Sequenzen muss es mindestens einige 3 Nukleotid-Kreuzhybride geben. Mit einem 6-Basencode kann man 8 Paare von 15mer-Sequenzen sogar ohne ein 3mer-Kreuzhybrid des Wat son-Crick-Typs entwickeln. Mit einem 8-Basencode kann man 19 derartige Paare von 15meren entwickeln.
Beispiel 3
Der Effekt des pH auf die isoC*isoG-Basenpaarung
Um das Verhalten des isoC*isoG-Basenpaars als Funktion des pH zu untersuchen, wurde an den in Beispiel 2 bereitgestellten Oligonukleotiden eine T_m-Analyse durchgeführt. Die Wirkung des pH auf die T_m der Oligonukleotide, die das komplementäre isoC*isoG-Basenpaar (Sequenz 2 bzw. 4) und C*G-Basenpaar (Sequenz 1 bis 3) enthalten, wurde bei 0,5 M Salz und etwa 1,5 μm Oligonukleotid bestimmt (n = 2 oder 3); die Resultate sind in Tabelle 5 angegeben.
Im Allgemeinen sind Oligonukleotidhybride bei pH 5 und pH 10 stabil. Unter pH 5 werden C und A protoniert, während über pH 10, G und T beginnen, ihre Iminoprotonen zu verlieren. Demnach zeigen Nukleinsäurehybride unter pH 5 und über pH 10 eine reduzierte Stabilität. Die Daten von Tabelle 2 zeigen, dass das isoC*isoG-Basenpaar normale Säurestabilität hat. Allerdings zeigt sowohl das isoG*isoC-Hybrid als auch das G*C-Hybrid eine unübliche Änderung von –9°C bei T_m über eine pH-Erhöhung von 1,6 Einheiten. Der Grund ist wahrscheinlich ihre sehr kurze Länge.
Theoretisch könnte man Hybride mit noch größerer pH-Empfindlichkeit unter Verwendung des SELEX-Protokolls, das in U.S. Patent Nr. 5,270,163 von Gold et al., in Tuerk et al. (1990) Science 249: 505–510, Szostak et al. (1990) Nature 346: 818–822 und Joyce (1989) Gene 82: 83–87, beschrieben ist, auswählen, wobei eine Population von DNA- oder RNA-Randomeren nach Bindung bei neutralem pH und nach Dissoziation aus der Zielsequenz bei mildem alkalischem oder mildem saurem pH selektiert würde. Nach Amplifikation würde das Selektionsverfahren mehrmals wiederholt. Nach der letzten Wiederholung würden die Oligomere, die die gewünschte pH-Empfindlichkeit zeigen, kloniert und sequenziert. Solche Sequenzen würden synthetisiert und die mit der besten Leistungsfähigkeit in einem direkten Kompetitionsassay ausgewählt.
Eine Labilität in milder Base kann in dem gängigen amplifizierten DNA-Assayformat ausgenutzt werden um das Assay-Untergrundrauschen zu reduzieren. Im Endschritt hat der verwendete Substratpuffer typischerweise einen pH von 9,5 bis 10,5. Mit einer Einfangsonde mit der geeigneten Basenlabilität wird sich das Ziel an der Oberfläche abscheiden und könnte in einer anderen Vertiefung detektiert werden. Der Untergrund wird zurückgelassen werden. Eine Minimierung der Einfangextenderbindung an den Träger durch die Verfahren, die in WO95/16055 offenbart sind, wird das Untergrundrauschen reduzieren, das durch die Freisetzung von Molekülen verursacht wird, welche durch Einfangextender nicht spezifisch an Einfangsonden gebunden sind.
Wenn man alkalische Phosphatasesonden, die an nicht-spezifisch gebundene Amplifier hybridisiert sind, nicht freisetzen möchte, würden vorzugsweise die Einfangsonde-Einfangextender-Hybride mit beträchtlich stärkerer Basenlabilität (d. h. höhere T_m bei einem gegebenen pH) als der Amplifier und die markierte Sonde und der Amplifier und Markierungsextenderhybride ausgewählt. Alternativ könnte das L-2/M-2-Hybrid von 1 das basenlabile Hybrid sein. In jedem Fall muss das M-2/L-3-Hybrid das stabilste sein, andernfalls würde die markierte Sonde, die an den nicht-spezifisch gebundenen Amplifier hybridisiert ist, freigesetzt werden.
Wie oben angegeben wurde, könnte man das freigesetzte Ziel auch zweckdienlicherweise zum Ablesen in frische Vertiefungen transferieren. Allerdings wäre es günstig, die freigesetzte Lösung in der Vertiefung abzulesen, in der sie erzeugt wurde. Dies würde zusätzliche Pipettierschritte vermeiden und eine Ungenauigkeit eliminieren, die mit zusätzlichen Flüssigkeits-Übertragungsschritten verbunden ist. Es gibt verschiedene Verfahren, durch welche Übertragungen aus Vertiefungen vermieden werden können, wie es unten beschrieben wird.
Um die Spezifität des Assays weiter zu verstärken, könnte die spezifische Freisetzung des Ziels mit einer Maskierung des Untergrunds an der Oberfläche verbunden werden. In diesem Fall wäre der Transfer auf einen anderen Träger unnötig. Beispielsweise könnte die Oberfläche des festen Trägers mit Inhibitoren der markierten Sonde und/oder verschiedenen Lumineszenzinhibitoren, Absorbern oder Quenchern beschichtet werden. Eine Oberflächenbeschichtung, die gängigerweise verwendet wird, ist Poly(phe-lys). Phenylalanin ist ein bekannter Inhibitor der alkalischen Phosphatase, eine besonders bevorzugte Enzymmarkierung. In die polymere Peptidbeschichtung kann man andere Inhibitoren der alkalischen Phosphatase, z. B. Tryptophan und Cystein, einarbeiten. Beispiele für lumineszente Inhibitoren umfassen Verbindungen mit niedrigen Quantenausbeuten, d. h. eine Verbindung, die vorzugsweise eher Wärme als Licht abgibt, nachdem sie durch Kollision mit einem dephosphorylierten Dioxetan angeregt wurde.
Es gibt mindestens zwei andere zweckdienliche Wege um eine Detektion der freigesetzten Lösung selektiver zu machen um dadurch einen Transfer des freigesetzten Ziels auf eine andere Vertiefung zu vermeiden. Die Ziel-assoziierten Signale können in Lösung gelesen wer den, indem die feste Phase für Visualisierungsreagentien unzugänglich gemacht wird oder indem Signalerzeugungsreaktionen, die an dem festen Träger auftreten, maskiert werden. Eine Isolierung der festen Phase aus anschließenden Visualisierungsschritten kann durch Zusetzen eines unmischbaren Öls, das schwerer als Wasser ist, in den Reaktionsbehälter erfolgen. Dieses Öl wird den Boden des Behälters bedecken, während es die interessierende Lösung obenauf schwimmen lässt. Für eine einfache kolorimetrische Detektion durch visuelle Messung oder Reflektionsmessung kann dem Öl eine opake Substanz zugesetzt werden um als neutraler Untergrund zur Visualisierung zu dienen.
Zur Chemilumineszenz-Detektion kann das Öl mit einer optisch opaken Substanz gefüllt werden. Wenn ein weißer Feststoff, z. B. Titandioxid, verwendet wird, wird Licht, das aus der schwimmenden wässrigen Schicht emittiert wird, nach oben aus dem Behälter zur Detektion reflektiert. Ein dunkler Feststoff oder ein Farbstoffmolekül, gelöst in Öl, kann auch verwendet werden um die stationäre Phase zu maskieren. Selbst wenn die Öllösung die feste Phase nicht vollständig von Visualisierungsreagentien isoliert, werden die suspendierten Feststoffe oder gelösten Farbbstoffe die Transmission dieses Lichts von der Oberfläche blockieren.
Es ist auch möglich, dass eine stationäre Phase mit einem Farbstoff gefärbt wird, der eine Emission von Licht aus Reaktionen, die in der Nähe seiner Oberfläche stattfinden, blockiert. Dies wird besonders mit gefärbten Perlen als feste Phase, die in einer opaken Vertiefung enthalten sind, zweckdienlich sein.
Beispiel 4
Die Wirkung von Salz auf das isoC*isoG-Basenpaar bei neutralem und alkalischem pH
Um das Verhalten des isoG*isoG-Basenpaars als Funktion der Salzkonzentration zu untersuchen, wurde eine T_m-Analyse der in Beispiel 2 bereitgestellten Oligonukleotide durchgeführt. Der Effekt der Salzkonzentration auf die T_m der Oligonukleotide, die das komplementäre isoC*isoG-Basenpaar (Sequenz 2 bzw. 4) und C*G-Basenpaar (Sequenz 1 bzw. 3) enthalten, wurde bei pH 7,9 oder 9,5 (n = 3) und etwa 1,5 μM Oligonukleotid bestimmt; die Resultate sind in Tabelle 6 dargestellt.
Klassischerweise zeigen Polynukleotide für jede log-Änderung in der Salzkonzentration bei der T_m eine Änderung von etwa 16 bis 17°C. Oligonukleotide zeigen oft eine etwas reduzierte Salzabhängigkeit. Eine Änderung der T_m von 10 bis 11°C pro log-Änderung beim Salz bei pH 7,9, errechnet für das isoC*isoG-Hybrid, liegt nahe an dem Wert, der für ein 13-mer erwartet wird. Allerdings war die Änderung bei pH 9,5 von nur etw 3°C für das isoC*isoG-Hybrid und 5 Grad für das C*G-Hybrid pro log-Änderung beim Salz überraschend niedrig.
Dies kann auch bei einer spezifischen Zielfreisetzung ausgenützt werden. Im Allgemeinen wird für eine spezifische Zielfreisetzung geringe Salzkonzentration verwendet. Unglücklicherweise wird oft auch eine signifikante Fraktion des Untergrundes freigesetzt.
Infolge der Salzunabhängigkeit der Schmelze des isoC*isoG-Basenpaars bei mild alkalischem pH wird kein zusätzlicher Vorteil aus einer Senkung der Salzkonzentration wie auch aus einer Erhöhung des pH erreicht. Demnach kann man eine hohe Salzkonzentration (die auch für alkalische Phosphatase bevorzugt ist) für die Freisetzung und Minimierung der Freisetzung des Untergrunds verwenden.
Wie in Beispiel 3 erläutert wird, kann das SELEX-Verfahren eingesetzt werden um DNA- oder RNA-Sequenzen zu finden, die bei ihrem Schmelzen eine verstärkte Salzunabhängigkeit bei einem beliebigen ausgewählten pH zeigen.
Beispiel 5
Der Effekt einer Basenpaar-Fehlpaarung bei Hybridisierung
Die vorherigen Beispiele zeigen, dass ein Oligomer mit isoG-Base in spezifischer Weise mit seinem Komplement, das isoG enthält, paart. Das isoG-enthaltende Oligomer wird um etwa 7 bis 8°C destabilisiert, wenn es an ein anderes Oligomer hybridisiert, das eine einzelne isoG*T- oder isoG*C-Fehlpaarung enthält. Typischerweise gibt es eine etwa zehnfache Verringerung bei der Bindung für jede Änderung der T_m um 10°C.
Der Effekt einer Fehlpaarung von zwei Basen bei der Bindung eines 13-mer-Hybrids wurde unter Verwendung der in Tabelle 8 angegebenen Sonden abgeschätzt.

F: = isoC
J: = isoG
ALK. PHOS.: = alkalische Phosphatase
X: = eine Spacersequenz, die ein Amin zur Anheftung an den festen Träger enthält.

Markierte Sonde 32, das alkalische Phosphatase-Oligonukleotidkonjugat, wurde, wie es beschrieben worden war, hergestellt (Urdea et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16: 4937–4955). Markierte Sonde 32 wurde mit Kontrollsonde 30 hybridisiert um die alkalische Phosphatase-Sonde 30*32 zu schaffen. Die markierte Sonde 32 wurde mit der modifizierten Sonde 31 hybridisiert um die isoC,isoG-alkalische Phosphatase-Sonde 31*32 zu bilden.
Die Sonde 35, die Einfangsonde, wurde an Mikrotiterplatten gebunden, wie es beschrieben worden war (PCT-Publikation Nr. WO93/13224, deren Offenbarung hier durch Referenz aufgenommen wird), um einen festen Träger zur Hybridisierung zu schaffen. Sonde 34, ein Einfangextender, wurde an Sonde 35 hybridisiert. Dieser Einfangextender ist zu der alkalischen Phosphatase-Sonde 30*32 komplementär und partiell komplementär zu der alkalische Phosphatase-Sonde 31*32. Sonde 33 ist ein "Competimer", das an den Einfangextender bindet und die Bindung einer alkalischen Phosphatase-Sonde blockiert.
Die folgenden Inkubationen wurden für 30 Minuten bei 53°C in etwa 1,0 M NaCl durchgeführt:

(1) 250 fmol Sonde 34 in Vertiefungen, die 1 pmol immobilisierte Sonde 35 enthielten;
(2) 250 fmol Sonde 34 + 5 pmol Sonde 33 in Vertiefungen, die 1 pmol immobilisierte Sonde 35 enthielten;
(3) 5 pmol Sonde 33 in Vertiefungen, die 1 pmol immobilisierte Sonde 35 enthielten; und
(4) nur Puffer.

Nach 2 Waschgängen mit 0,1 × SSC, 0,1% SDS, wie in Beispiel 1 definiert, kann jede der obigen ersten Inkubationen einer zweiten 15-minütigen Inkubation unter denselben Bedingungen ausgesetzt werden, und zwar jeweils wie folgt:

(1) 25 fmol Sonde 30 + 500 attomol Sonde 32;
(2) 25 fmol Sonde 31 + 500 attomol Sonde 32;
(3) 500 attomol Sonde 32; und
(4) nur Puffer.

Die Platten wurden zweimal wie oben und dreimal mit demselben Puffer, der mit 10 mM MgCl₂, 1 mM ZnCl₂, 0,1% Brij-35 ergänzt war, gewaschen. Nach einer 25-minütigen Inkubation mit Lumiphos Plus (Lumigen) wurden die Platten an einem Chiron-Luminometer gelesen.
Die Hybride, die gebildet werden können, sind in 3 gezeigt, worin Z, hierin beispielhaft durch isoC und isoG dargestellt, ein nicht-natürliches Nukleotid darstellt. Sonde 33, das Competimer, kann mit dem Einfangextender 21 Basenpaare bilden und kann theoretisch beide alkalische Phosphatase-Sonden vor einer Bindung blockieren. Modifizierte Sonde*markierte Sonde (31*32) kann an den Einfangextender hybridisieren, wobei 11 Basenpaare und zwei Fehlpaarungen (z. B. G*isoC,isoG*T) gebildet werden. Die Kontrollsonde*markierte Sonde (30*32) kann mit dem Einfangextender 13 Basenpaare bilden.
Wie in Tabelle 8 gezeigt ist, bildet der Einfangextender (34) mit Kontrollsonde*markierte Sonde (30*32) (Probe 1 = 399 relative Lichteinheiten (RLE)) ein starkes Hybrid. Eine Vorinkubation des Einfangextenders mit einem 20-fachen molaren Überschuss an Competimer, Probe 2, reduzierte dieses Untergrundrauschen um das etwa 10-fache (30 RLE). Modifizierte Sonde*markierte Sonde (31*32) zeigt eine 40-fach geringere Hybridisierung (Probe 3 = 9 RLE) an dem Einfangextender als Kontrollsonde*markierte Sonde (30*32). Die zwei Fehlpaarungen waren für eine 40-fache Veränderung bei der Hybridisierung verantwortlich. Dies ist wie für 2 Fehlpaarungen erwartet, wobei jede die T_m um 7 bis 8°C (7 × 8 = 56-fach) destabilisiert. Die Verwendung des Competimers und der fehlgepaarten alkalischen Phosphatase-Sonde (Probe 4 = 0,4 RLE) reduzierte das Untergrundrauschen um den Faktor etwa 1000. Probe 5 ist eine Kontrolle und hat im Wesentlichen kein Untergrundrauschen (0,1 RLE). Dies ist wie erwartet, da die markierte Sonde 32 keine nachweisbare Homologie mit dem Einfangextender hat.
In Hybridisierungsassays ist die Verwendung von Competimeren für alle Einfangextender in der Praxis nicht durchführbar, da es typischerweise 5 bis 10 Einfangextender pro Assay gibt. Außerdem zeigt dieses Beispiel, dass eine Vorinkubation mit dem Competimer nicht so wirksam war wie eine einfache Verwendung einer 15% Basensubstitution (mit isoC,isoG), z. B. 2 Basen aus 13, in den universellen Sequenzen. Es würde erwartet, dass eine 30% Basensubstitution (3 aus 10) eine nicht-spezifische Hybridisierung eines ansonsten perfekt basengepaarten Komplements um etwa den Faktor 1000 reduzieren würde (30% Fehlpaarung entspricht einer Änderung von etwa 30°C bei der T_m; es gibt eine etwa zehnfache Verringerung bei der Bindung für jede 10°C-Änderung bei der T_m).
Beispiel 6
Chemische Synthese von 2'-Desoxyisoguanosin
Die Synthese von 2'-Desoxyisoguanosin aus 2'-Desoxyguanosin wurde nach dem folgenden Verfahren erreicht.
Schritt 1. 2'-Desoxyguanosinmonohydrat (50 mmol) und Imidazol (200 mmol) wurden durch Coverdampfung mit 500 ml Dimethylformamid (DMF) getrocknet und der Rest wurde in 500 ml DMF gelöst. Zu dieser Lösung wurde t-Butyldimethylsilylchlorid (150 mmol) gegeben und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 18 Stunden rühren gelassen. Methanol (30 ml) wurde zugegeben und nach 25 Minuten wurden die Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Die Lösungsmittel wurden durch Verdampfung entfernt. Der Rückstand wurde in 1 l CH₂Cl₂ gelöst, mit 1 l 5% NaHCO₃ und 1 l 80%igem gesättigtem NaCl gewaschen, die organische Phase wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und zur Trockene eingeengt, was zu einem Rohprodukt (30 g) führte, was direkt in 2 l heißem Ethanol gelöst wurde. Langsames Abkühlen auf 20°C, gefolgt von einer Lagerung bei 4°C für 20 Stunden, produzierte reines 3',5'-TBDMS₂-2'-Desoxyguanosin (65% Ausbeute).
Schritt 2. 3',5'-TBDMS₂-2'-Desoxyguanosin (12 mmol) wurde in 125 ml CH₂Cl₂, das Triethylamin (150 mmol) und N,N-Dimethylaminopyridin (100 mg) enthielt, suspendiert. 4-Toluolsulfonylchlorid (40 mmol) wurde mit 0°C zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Als sich das gesamte Feststoffmaterial gelöst hatte, wurde eine leicht gelbe Lösung erhalten. Die Reaktion wurde mit 50 ml 5% NaHCO₃ unter Rühren für 1 Stunde abgeschreckt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 300 ml CH₂Cl₂ verdünnt, mit 300 ml 5% NaHCO₃ und 300 ml 80%igem gesättigtem NaCl gewaschen, die organische Phase über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und zur Trockene eingeengt, was zu einem rohen Produkt (8,9 g) führte. Silicagel-Flashchromatographie unter Verwendung eines 1%-bis-4%-Methanol/CH₂Cl₂-Gradienten lieferte 7,95 Gramm reines O⁶-(4-Toluolsulfonyl)-3',5'-O-TBDMS₂-2'-desoxyguanosin (11 mmol).
Schritt 3. 12 g O⁶-(4-Toluolsulfonyl)-3',5'-O-TBDMS₂-2'-desoxyguanosin (17 mmol) wurden in 300 ml CH₃CN suspendiert. Dann wurde Methylpyrrolidin (17 ml) zugesetzt und die Suspension wurde für 1 Stunde gerührt, wodurch eine klare Lösung produziert wurde. DSC- Analyse zeigte, dass das gesamte Ausgangsmaterial in Basislinienmaterial umgewandelt worden war. 11 Gramm 4-(Methylthio)phenol (85 mmol) wurden zugesetzt und die Lösung wurde 60 Stunden gerührt. Nach Einengung auf ein kleines Volumen wurden 600 ml Ethylacetat zugesetzt. Diese Lösung wurde mit 3 × 400 ml 0,3 M NaOH und 400 ml 80%igem gesättigtem NaCl extrahiert, die organische Phase wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und zur Trockene eingeengt, wodurch 11,55 g Rohprodukt erhalten wurden. Silicagel-Flashchromatographie unter Verwendung eines 4%-bis-5%-Methanol/CH₂Cl₂-Gradienten lieferte O⁶-(4-Methylthio)phenyl-3',5'-Ol-TBDMS₂-2'-desoxyguanosin (11 mmol).
Schritt 4. 4 Gramm O⁶-(4-Methylthio)phenyl-3',5'-O-TBDMS₂-2'-desoxyguanosin (6,5 mmol) wurden in 65 ml CH₂Cl₂ bei 0°C gelöst und 6,5 ml tert.-Butylnitrit wurden tropfenweise zugesetzt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und aus dem Gemisch entwich Gas (N₂). Nach 40 Minuten, als eine TLC-Analyse einen vollständigen Verbrauch des Ausgangsmaterials und das Auftreten eines neuen, weniger weit wandernden Flecks zeigte, wurde überschüssiges t-Butylnitrit durch Coverdampfung mit 2 × 100 ml Toluol im Vakuum entfernt. Der Rückstand des Rohproduktes wurde durch Silicagel-Flashchromatographie unter Verwendung eines 4%-bis-5%-Methanol/CH₂Cl₂-Gradienten gereinigt, wodurch 2,75 g O⁶-(4-Methylthio)phenyl-3',5'-O-TBDMS₂-2'-desoxyguanosin (4,45 mmol) erhalten wurden.
Schritt 5. Die gesamten gereinigten 2,75 Gramm O⁶-(4-Methylthio)phenyl-3',5'-O-TBDMS₂-2'-desoxyxanthosin (4,45 mmol) wurden in 50 ml Methanol aufgelöst. Konzentriertes wässriges Ammoniumhydroxid (50 ml) wurde zugesetzt und das Gemisch wurde in einer dicht verschlossenen Bombe bei 100°C für 4 Stunden erwärmt. Nach dem Abkühlen wurden die Lösungsmittel durch Coverdampfung mit Ethanol im Vakuum unter Erhalt von 1,8 g Rohprodukt (3,6 mmol) entfernt. Eine Reinigung durch Umkristallisieren aus heißem Ethanol führte zu einer Probe aus reinem 3',5'-O-TBDMS₂-2'-desoxy-isoguanosin. Dieses Material war in jeder Hinsicht (UV, DSC, TLC, NMR und MS) mit einer Probe identisch, die durch den publizierten photolytischen Weg (Switzer et al. (1993), supra) hergestellt worden war.
Beispiel 7
Kontrolle einer nicht-spezifischen Hybridisierung von Amplifier und alkalischer Phosphatase-Sonde an Einfangextender
A. Konstruktion von isoC, isoG-bDNA-amp und isoC, isoG-Ap-Sonde
Ein kammartiges Amplifikations-Multimer (amp) mit 15 Stellen wurde, wie in der PCT-Publikation Nr. WO92/02526 beschrieben, aufgebaut. Arme wurden an den Kamm ligiert, wobei ein 12-Nukleotidlinker und T4-DNA-Ligase, wie beschrieben, verwendet wurden. Die alkalische Phosphatase (ap)-Sonde wurde aus einem Oligonukleotid, das eine Aminofunktionalität enthält, wie es im U.S. Patent Nr. 5,124,246 beschrieben ist, konstruiert. Die verwendeten Sequenzen waren:

F: = iso C,
J: = iso G,
L: = langkettiges Amin

B. Herstellung von Einfangextender(Capture Extender = CE)-Sequenzen
Einfangextender für TNF-alpha-, Interleukin-2 (IL-2)-, IL-4-, IL-6- und gamma-Interferon (IFNγ)-Ziele wurden durch Standardphosphoramiditverfahren hergestellt. Die getesteten Einfangextendersequenzen waren:
TNF-alpha-CE-Pool
IL-6-CE-Pool
IFNγ-CE-Pool
IL-2-CE-Pool
IL-4-CE-Pool
Anmerkung: Z = Triethylenglykol-Spacer
C. Verfahren zur Messung einer nicht-spezifischen Hybridisierung (NSH zwischen CE und amp und CE und ap
Insgesamt 100 femtomol der einzelnen Einfangextendersonden oder ein Pool, bestehend aus insgesamt 100 femtomol jedes Einfangextenders, wurden für 1 Stunde bei 53 Grad in den Mikrovertiefungen inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit Waschlösung A (0,1 × SSC, 0,1% SDS) wurden die Vertiefung für 30 Minuten in Amplifier-Verdünnungsmittel +/– nichtisoC,isoG-amp, beschrieben in WO95/16055, oder dem isoC,isoG-amp, beschrieben in Beispiel 7A, supra, inkubiert. Nach zwei weiteren Waschgängen mit Waschlösung A wurden die Vertiefungen für 15 Minuten in amp-Verdünnungsmittel (5 × SS, zu 50% mit Proteinase K verdautes Pferdeserum), enthaltend entweder die nicht-isoC,isoG-amp-Sonde, beschrieben in WO95/16055, oder die isoC,isoG-ap-Sonde, beschrieben in Beispiel 7A, supra, enthielt, inkubiert.
Es wurden die folgenden Definitionen verwendet: AP NSB = Untergrund der ap-Sonde, wenn kein CE vorliegt. Amp NSB = Untergrund der amp- und ap-Sonde, wenn kein CE vorliegt, minus das ap NSB. AP NSH = RLE aus CE-Probe ohne amp, minus das ap NSB. AMP NSH = RLE aus der CE-Probe – AP NSH – AMP NSB – AP NSB.
D. Resultate
Fünf einzelne CE-Sonden wurden auf nicht-spezifischen Hybridisierungs-Untergrund untersucht, wobei 100 fm pro Vertiefung verwendet wurden. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle gezeigt.
Werte in Klammern sind weniger als null RLE. AMP = nicht-iso,isoG-amp, iC AMP = isoC,isoG-amp, AP = nicht-isoC,isoG-ap, iC AP = isoC,isoG-ap
Der nicht-spezifische Untergrund in Abwesenheit von CE-Sonden (AP-NSB und AMP-NSB) ist für alle amp- und ap-Sonden vernachlässigbar (≤ 1 RLE). Drei der Extender zeigen eine starke (> 10 RLE) Kreuzreaktivität mit der vorliegenden amp-Sonde, die mit isoC,isoGamp nicht zu erkennen ist. Eine Sonde zeigt eine 6 RLE-Kreuzreaktivität mit der gängigen AP-Sonde, die mit der isoC,isoG-AP-Sonde nicht erkannt wird. In allen Fällen ist der NSH-Wert mit der isoC,isoG-Sonde vernachlässigbar. RLE-Werte von kleiner als 1,0 werden im Vergleich zu dem NSB-Wert als unbedeutend angesehen.
Fünf Pools an CE-Sonden werden mit denselben Molekülen auf Untergrund durch nichtspezifische Hybridisierung untersucht. Die Resultate sind nachfolgend angegeben.
Bezüglich der Abkürzungen siehe die vorangehende Tabelle
Wiederum sind die NSB-Werte für alle amps- und ap-Sonden im Vergleich zu NSH vernachlässigbar. Vier von fünf Pools zeigen einen signifikanten amp-NSH-Wert, der im Bereich von 2,3 bis 34,9 RLE liegt, während keiner der CE-Pools einen signifikanten NSH-Wert (< 1) mit dem isoC,isoG-amp hat. Zwei der Pools haben einen deutlichen NSH-Wert mit der ap-Sonde, während keiner der Pools eine signifikante Wechselwirkung mit der isoC,isoG-ap-Sonde hat. In diesem Experiment wurden insgesamt 30 CE-Sequenzen auf Kreuzreaktivität durchgemustert.
Ein Fachmann mit Kenntnissen über die Einarbeitung neuer Basenpaare in Hybridisierungsassay-Formate wird erkennen, dass zu erwarten ist, dass ein Ersatz der amp-Leadersequenz durch enie isoC-isoG-Leadersequenz zu niedrigeren NSH-Werten für den hier verwendeten isoC,isoG führt.
E. Vollständige IL-2- und IL-6-Dosisantwortkurven mit isoC,isoG-amp und -ap
Vollständige Dosisantwortkurven wurden erstellt, indem Reihenverdünnungen von humanen Zellen auf IL-2- und IL-6-mRNA untersucht wurden. Die Nachweisgrenze wurde als die Zellenzahl errechnet, bei der delta = null. Delta ist definiert als: pos RLE – 2 std-Abw. – (neg RLE + 2 st-Abw.).
Die Resultate sind in der folgenden Tabelle angegeben.
Bei Verwendung von isoC/G-amp und -ap anstelle der gängigen Moleküle, die natürliche Sequenzen haben, wurde die Empfindlichkeit beim IL-2-Assay um das 12,6-fache und beim IL-6-Assay auf das 3-fache verbessert. Je größer das Rauschen mit den natürlichen Sequenzen ist, desto größer ist die Assayverbesserung.
Somit wurden neue Verfahren zur Erzeugung eines stärker zielabhängigen Signals in Sandwich-Hybridisierungsassays in Lösungsphase offenbart. Außerdem wurde ein neues Verfahren zur Synthese von 2'-Desoxy-isoguanosin offenbart.

Claims

Verfahren zum Synthetisieren einer Verbindung mit der Strukturformel
wobei R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff-, Hydroxyl-, Sulfhydryl-, Halogen-, Amino-, Alkyl-, Allyl-Gruppe und -OR², wobei R² Alkyl, Allyl, Silyl oder Phosphat ist, umfassend: a) Umsetzen einer Verbindung mit der Strukturformel
mit einem Reagenz, das geeignet ist, sowohl die 3'-, als auch die 5'-Hydroxylgruppen zu schützen; b) Umsetzen des Produktes aus Schritt (a) mit einem Reagenz, das geeignet ist, die O⁶-Oxy-Gruppierung in eine funktionelle Gruppe umzuwandeln, welche für nukleophiles Er setzen empfänglich ist, wobei eine funktionalisierte O⁶-Gruppierung hergestellt wird; c) Oxidieren der 2-Aminogruppe des Produktes aus Schritt (b); d) Umsetzen des Produktes aus Schritt (c) mit einem nukleophilen Reagenz, um die funktionalisierte O⁶-Gruppierung zu ersetzen; und e) Umsetzen des Produktes aus Schritt (d) mit einem Reagenz, das geeignet ist, die geschützten 3'- und 5'-Hydroxyl-Gruppen zu entschützen.
Verfahren zum Synthetisieren von 2'-Desoxy-Isoguanosin umfassend: a) Umwandeln von 2'-Desoxyguanosin zu 3',5'-O-(t-Butyldimethylsilyl)₂-2'-desoxiguanosin, indem 2'-Desoxyguanosin mit t-Butyldimiethylsilyl(TBDMS)-chlorid umgesetzt wird; b) Umwandeln von 3',5'-O-TBDMS₂-2'-Desoxyguanosin in O⁶-(4-Toluolsulfonyl)-3',5'-O-TBDMS₂-2'-Desoxyguanosin, indem 3',5'-O-TBDMS₂-2'-Desoxyguanosin mit 4-Toluolsulfonylchlorid umgesetzt wird. c) Ersetzen der O⁶-(4-Toluolsulfonyl)-Gruppe durch Versetzen des O⁶-(4-Toluolsulfonyl)-3',5'-O-TBDMS₂-2'-Desoxyguanosins mit einem Phenol, unter Bildung von O⁶-(4-(Methylthio)phenyl)-3',5'-O-TBDMS₂-2'-Desoxyguanosin; d) Oxidieren der 2-Aminogruppe von O⁶-(4-(Methylthio)phenyl)-3',5'-O-TBDMS₂-2'-Desoxiguanosin zur Oxy-Funktion, indem O⁶-(4-(Methylthio)phenyl)-3',5'-O-TBDMS₂-2'- Desoxyguanosin unter neutralen Bedingungen mit t-Butylnitrid versetzt wird, unter Bildung von O⁶-(4-(Methylthio)phenyl)-3',5'-O-TBDMS₂-2'-Desoxyxantosin; und e) Verdrängen der O²-(4-(Methylthio)phenyl)-Gruppe von O₆-(4-(Methylthio)phenyl)-3',5'-O-TBDMS₂-2'-Desoxyxantosin bei erhöhter Temperatur mit Ammoniumhydroxid unter Bildung von 3',5'-O-TBDMS₂-2'-Desoxyisoguanosin.