DE69829760T2

DE69829760T2 - Bi- und tri-zyklische - nukleosid, nukleotid und oligonukleotid-analoga

Info

Publication number: DE69829760T2
Application number: DE69829760T
Authority: DE
Inventors: Jesper Wengel; Poul Nielsen
Original assignee: Exiqon AS
Current assignee: Exiqon AS
Priority date: 1997-09-12
Filing date: 1998-09-14
Publication date: 2006-03-02
Anticipated expiration: 2018-09-15
Also published as: IL185570A0; EP1557424A1; EP1015469A2; JP5677716B2; IL185569A; CA2303299C; EP2341057A3; ATE293123T1; IL135000A0; ES2242291T3; EP1015469B1; IL185568A0; KR20010030586A; NZ503765A; JP2002521310A; JP4236812B2; EP1015469B2; IL185568A; KR100414936B1; HK1033946A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet von bi- und trizyklischen Nucleosidanaloga und die Synthese solcher Nucleosidanaloga, die zur Bildung von synthetischen Oligonucleotiden nützlich sind, welche in der Lage sind, Nucleobasen-spezifische Duplices und Triplices mit einzelsträngigen und doppelsträngigen Nucleinsäuren zu bilden. Diese Komplexe weisen höhere Thermostabilität auf als die entsprechenden Komplexe, die mit normalen Nucleinsäuren gebildet werden. Die Erfindung betrifft auch das Gebiet von bi- und trizyklischen Nucleosidanaloga und die Synthese solcher Nucleoside, die als therapeutische Wirkstoffe verwendet werden können und die durch Matrizen-gebundene Nucleinsäurepolymerasen in Oligonucleotide eingebunden werden können.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Synthetische Oligonucleotide sind Verbindungen, die in den verschiedensten Bereichen wie z.B. Molekularbiologie und DNA-basierten Diagnose- und Therapieverfahren weithin verwendet werden.
Therapeutische Einsatzbereiche
In therapeutischen Einsatzbereichen wurden bisher z.B. Oligonucleotide erfolgreich verwendet, um in vivo die Translation spezifischer mRNAs zu blockieren und hierdurch die Synthese von Proteinen, die unerwünscht oder schädlich für die Zelle/den Organismus sind, zu unterbinden. Dieses Konzept von Oligonucleotid-vermitteltem Blockieren von Translation ist als der "Antisense"-Ansatz bekannt. Aus mechanistischer Sicht wird angenommen, dass das hybridisierende Oligonucleotid seine Wirkung entweder durch Schaffen einer physikalischen Blockierung des Translationsprozesses oder durch Rekrutieren von zellulären Enzymen, die den mRNA-Teil des Duplex spezifisch verdauen (RNAseH), hervorruft.
In jüngerer Vergangenheit haben Oligoribonucleotide und Oligodesoxyribonucleotide und Analoga davon, die RNAse-katalytische Aktivität mit der Fähigkeit, Sequenz-spezifisch mit einem komplementären RNA-Target wechselzuwirken (Ribozyme), kombinieren, großes Interesse als Antisense-Sonden auf sich gezogen. So weit wurde von Ribozymen berichtet, dass sie sowohl gegen virale Targets als auch gegen Onkogene in Zellkulturen wirksam sind.
Um die Synthese eines bestimmten Proteins durch den Antisense-Ansatz völlig zu unterbinden, ist es erforderlich, alle mRNAs, die für dieses bestimmte Protein kodieren, zu blockieren/zerstören, und in zahlreichen Fällen ist die Anzahl dieser mRNA sehr hoch. Typischerweise werden die mRNAs, die für ein bestimmtes Protein kodieren, von einem einzelnen oder einigen wenigen Genen transkribiert. Durch Targeting des Gens also ("Antigen"-Ansatz), und nicht seiner mRNA-Produkte, sollte es möglich sein, entweder die Produktion seines zugehörigen Proteins effizienter zu blockieren oder eine signifikante Reduktion in der Menge von Oligonculeotiden zu erreichen, die erforderlich ist, um die erwünschte Wirkung hervorzurufen. Um Transkription zu blockieren, muss das Oligonucleotid in der Lage sein, Sequenz-spezifisch an doppelsträngige DNA zu hybridisieren. 1953 zeigten Watson und Crick, dass Desoxyribonucleinsäure (DNA) aus zwei Strängen zusammengesetzt ist (Nature 171, 737 (1953)), die in einer Helixkonfiguration durch Wasserstoffbindungen zusammengehalten werden, die zwischen gegenüberliegenden, komplementären Nucleobasen in den zwei Strängen gebildet werden. Die vier üblicherweise in DNA vorkommenden Nucleobasen sind Guanin (G), Adenin (A), Thymin (T) und Cytosin (C), von denen G mit C und A mit T Nucleobasen-Paare bildet. In RNA ist die Nucleobase Thymin durch die Nucleobase Uracil (U) ersetzt, die ähnlich wie T mit A Nucleobasenpaare bildet. Die chemischen Gruppen in den Nucleobasen, die an der Standard-Duplexformation teilnehmen, bilden die Watson-Crick-Seite. 1959 zeigte Hoogsteen, dass die Purin-Nucleobasen (G und A) zusätzlich zu der Watson-Crick-Seite auch eine Hoogsteen-Seite aufweisen, die von außen an einem Duplex erkannt und verwendet werden kann, um Pyrimidin-Oligonucleotide über Wasserstoffbindungen zu binden, wodurch eine Tripelhelixstruktur gebildet wird. Obwohl dies den "Antigen"-Ansatz konzeptuell durchführbar macht, ist die praktische Nützlichkeit von Tripelhelix bildenden Oligomeren zur Zeit durch mehrere Faktoren eingeschränkt, einschließlich des Erfordernisses von Homopurinsequenz-Motiven im Target-Gen und eines Bedarfs an unphysiologisch hoher Ionenstärke und niedrigem pH, um den Komplex zu stabilisieren.
Die Verwendung von Oligonucleotiden, die als Aptamere bekannt sind, wird auch aktiv untersucht. Diese vielversprechende neue Klasse an therapeutischen Oligonucleotiden wird in vitro selektiert, um spezifisch an ein bestimmtes Target mit hoher Affinität zu binden, beispielsweise Ligandenrezeptoren. Ihre Bindungseigenschaften sind wahrscheinlich eine Wiederspiegelung der Fähigkeit von Oligonucleotiden, dreidimensionale Strukturen zu bilden, die durch intramolekulare Nucleobasenpaarung zusammengehalten werden.
Demähnlich zeigten sich Nucleoside und Nucleosidanaloga bei der chemotherapeutischen Behandlung von zahlreichen Virusinfektionen und Krebsarten wirksam.
Auch wurde für mehrere Arten doppelsträngiger RNA gezeigt, dass sie das Wachstum mehrerer Krebsarten wirksam hemmten.
Diagnoseverfahren
In der Molekularbiologie werden Oligonucleotide für zahlreiche verschiedene Zwecke, wie beispielsweise (i) als Hybridisierungssonden beim Einfangen, Identifizieren und Quantifizieren von Target-Nucleinsäuren, (ii) als Affinitätssonden bei der Reinigung von Target-Nucleinsäuren, (iii) als Primer in Sequenzierungsreaktionen und Target-Amplifikationsprozessen wie der Polymerasekettenreaktion (PCR), (iv) zum Klonieren und Mutieren von Nucleinsäuren und (v) als Bausteine in der Anordnung makromolekularer Strukturen, routinemäßig verwendet.
Bei der Diagnose werden zahlreiche der zuvor genannten Oligonucleotid-basierten Verfahren eingesetzt, insbesondere jene, die zu einfacher Automatisierung geeignet sind und reproduzierbare Resultate mit hoher Empfindlichkeit ermöglichen. Ziel in diesem Bereich ist, Oligonucleotid-basierte Verfahren als ein Mittel zu verwenden, um beispielsweise (i) Menschen, Tiere und Nahrungsmittel auf die Gegenwart pathogener Mikroorganismen zu testen, (ii) auf genetische Veranlagungen zu einer Krankheit zu testen, (iii) vererbte und erworbene genetische Erkrankungen zu identifizieren, (iv) biologische Ablagerungen mit Verdächtigen in Strafprozessen in Verbindung zu bringen und (v) die Gegenwart von Mikroorganismen zu bestätigen, die in die Herstellung von Nahrungsmitteln und Getränken eingebunden sind.
Allgemeine Beobachtungen
Um in einem weiten Bereich der verschiedensten, oben genannten Anwendungsgebiete nützlich zu sein, müssen Oligonucleotide zahlreichen verschiedenen Erfordernissen gerecht werden. Bei Antisense-Therapieverfahren beispielsweise muss ein nützliches Oligonucleotid in der Lage sein, die Zellmembran zu durchdringen, muss gute Resistenz gegenüber extra- und intrazellulären Nucleasen aufweisen und vorzugsweise die Fähigkeit haben, endogene Enzyme wie RNAseH zu rekrutieren. Im Bereich von DNA-basierten Diagnoseverfahren und Molekularbiologie sind andere Eigenschaften wichtig, wie z.B. die Fähigkeit von Oligonucleotiden, als wirksame Substrate für einen breite Palette an verschiedenen Enzymen zu wirken, die sich entwickeln, um auf natürliche Nucleinsäuren zu wirken, wie z.B. Polymerasen, Kinasen, Ligasen und Phosphatasen. Die zentrale Eigenschaft von Oligonucleotiden jedoch, die allen Verwendungen zugrunde liegt, ist ihre Fähigkeit, Sequenzen, die zu komplementären einzelsträngigen Nucleinsäuren spezifisch sind, zu erkennen und unter Verwendung von entweder Watson-Crick-Wasserstoffbindung (A-T und G-C) oder anderen Wasserstoffbindungsschemata wie beispielsweise dem Hoogsteen-Modus zu hybridisieren. Die zwei wichtigen Bezeichnungen Affinität und Spezifität werden üblicherweise verwendet, um die Hybridisierungseigenschaften eines bestimmten Oligonucleotids zu charakterisieren. Affinität ist ein Maß für die Bindungsstärke des Oligonucleotids an seine komplementäre Targetsequenz (ausgedrückt als die Thermostabilität (T_m) des Duplex). Jedes Nucleobasenpaar im Duplex erhöht die Thermostabilität, wodurch die Affinität mit wachsender Größe (Anzahl an Nucleobasen) des Oligonucleotids steigt.
Spezifität ist ein Maß für die Fähigkeit des Oligonucleotids, zwischen einer vollständig komplementären und einer fehlgepaarten Targetsequenz zu unterscheiden. In anderen Worten ist Spezifität ein Maß für den Verlust von Affinität, der durch fehlgepaarte Nucleobasenpaare im Target in Verbindung steht. Bei konstanter Oigonucleotidgröße steigt die Spezifität mit steigender Anzahl an Fehlpaarungen zwischen dem Oligonucleotid und seinen Targets (d.h. der Prozentsatz an Fehlpaarungen steigt). Umgekehrt sinkt die Spezifität, wenn die Größe des Oligonucleotids bei einer konstanten Anzahl an Fehlpaarungen gesteigert wird (d.h. der Prozentsatz an Fehlpaarungen sinkt). Anders ausgedrückt tritt eine Steigerung der Affinität eines Oligonucleotids zulasten der Spezifität auf und umgekehrt.
Diese Eigenschaft von Oligonucleotiden schafft zahlreiche Probleme für die praktische Verwendung. In sehr langen Diagnoseverfahren beispielsweise muss das Oligonucleotid sowohl hohe Affinität aufweisen, um adäquate Empfindlichkeit des Tests sicherzustellen, als auch hohe Spezifität, um falsche positive Resultate zu vermeiden. Demähnlich muss ein Oligonucleotid, das als Antisense-Sonde verwendet wird, sowohl hohe Affinität für ihre Target-mRNA aufweisen, um ihre Translation wirksam zu hemmen, als auch hohe Spezifität, um das nicht beabsichtigte Blockieren der Expression von anderen Proteinen zu vermeiden. Bei enzymatischen Reaktionen, wie z.B. PCR-Amplifikation, muss die Affinität des Oligonucleotid-Primers hoch genug sein, dass der Primer/Target-Duplex im Temperaturbereich, in dem die Enzyme Aktivität aufweisen, stabil ist, und die Spezifität muss hoch genug sein, um sicherzustellen, dass nur die korrekte Targetsequenz amplifiziert wird.
Angesichts der Unzulänglichkeiten natürlicher Oligonucleotide würden neue Ansätze zur Steigerung von Affinität und Spezifität sehr nützlich in den Bereichen von DNA-basierten Therapieverfahren, Diagnoseverfahren und Molekularbiologieverfahren allgemein sein.
Konformations-eingeschränkte Nucleoside
Es ist bekannt, dass Oligonucleotide einen Konformationsübergang im Laufe der Hybridisierung an eine Targetsequenz erfahren, von der relativ zufälligen Spiralstruktur des einzelsträngigen Zustands zur geordneten Struktur des Duplexzustandes.
Zahlreiche Konformations-eingeschränkte Oligonucleotide, einschließlich bizyklischer und trizyklischer Nucleosidanaloga (1A und 1B, worin B = Nucleobase) wurden synthetisiert, in Oligonucleotid und Oligonucleotidanaloga eingebunden und auf ihre Hybridisierung und andere Eigenschaften getestet.
Bicyclo[3.3.0]nucleoside (bcDNA) mit einer zusätzlichen C-3',C-5'-Ethano-Brücke (A und B) wurden mit allen fünf Nucleobasen (G, A, T, C und U) synthetisiert, während (C) nur mit T- und A-Nucleobasen synthetisiert wurde (M. Tarköy, M. Bolli, B. Schweizer und C. Leumann, Helv. Chim. Acta, 1993, 76, 481; Tarköy und C. Leumann, Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 1993, 32, 1432; M. Egli, P. Lubini, M. Dobler und C. Leumann, J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 5855; M. Tarköy, M. Bolli und C. Leumann, Helv. Chim. Acta, 1994, 77, 716; M. Bolli und C. Leumann, Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 1995, 34, 694; M. Bolli, P. Lubini und C. Leumann, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 2077; J. C. Litten, C. Epple und C. Leumann, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1995, 5, 1231; J. C. Litten und C. Leumann, Helv. Chim. Acta, 1996, 79, 1129; M. Bolli, J. C. Litten, R. Schültz und C. Leumann, Chem. Biol., 1996, 3, 197; M. Bolli, N. U. Trafelet und C. Leumann, Nucleic Acids Res., 1996, 24, 4660).
DNA-Oligonucleotide, die ein paar dieser Analoga enthalten oder vollständig aus ihnen bestehen, sind in den meisten Fällen in der Lage, Watson-Crick-gebundene Duplices mit komplementären DNA- und RNA-Oligonucleotiden zu bilden. Die Thermostabilität der resultierenden Duplices jedoch ist entweder eindeutig niedriger (C), mäßig niedriger (A) oder vergleichbar (B) mit der Stabilität der natürlichen DNA- und RNA-Gegenstücke. Alle bcDNA-Oligomere zeigten eine ausgeprägte Steigerung der Empfindlichkeit gegenüber der Ionenstärke des Hybridisierungsmedium im Vergleich zu den natürlichen Gegenstücken. Die α-Bicyclo-DNA (B) ist stabiler gegenüber der 3'-Exonuclease-Schlangengift-Phosphordiesterase als die β-Bicyclo-DNA (A), die nur mäßig stabiler ist als nicht modifizierte Oligonucleotide.
Bicarbocyclo[3.1.0]nucleoside mit einer zusätzlichen C-1',C-6'- oder C-6',C-4'-Methano-Brücke an einem Cyclopentanring (D bzw. E) wurden mit allen fünf Nucleobasen (T, A, G, C und U) synthetisiert. Es wurden jedoch nur die T-Analoga in Oligomere eingebunden. Die Einbindung eines oder zehn Monomere D in ein gemischtes Polypyrimidin-DNA-Oligonucleotid resultierte in einem wesentlichen Rückgang der Affinität gegenüber DNA- und RNA-Oligonucleotiden im Vergleich zum nicht modifizierten Bezugsoligonucleotid. Der Rückgang war bei ssDNA stärker ausgeprägt als bei ssRNA. Die Einbindung eines Monomers E in zwei verschiedene Polypyrimidin-DNA-Oligonucleotide führte zu mäßigen Steigerungen der T_m um 0,8°C und 2,1°C bei Duplices hin zu ssRNA, verglichen zu nicht modifizierten Bezugsduplices. Wurden zehn T-Analoga in ein 15-mer-Oligonucleotid eingebunden, das ausschließlich Thiophosphat-Internucleosid-Bindungen enthielt, so wurde die T_m gegenüber dem komplementären RNA-Oligonucleotid im Vergleich zu derselben, nicht modifizierten Thiophosphatsequenz um etwa 1,3°C pro Modifikation erhöht. Im Gegensatz zu der Kontrollsequenz vermittelte das Oligonucleotid, das das bizyklische Nucleosid E enthielt, RNAseH-Spaltung nicht. Die Hybridisierungseigenschaften von Oligonucleotiden, die die G-, A-, C- und U-Analoga von E enthielten, wurden nicht beschrieben. Auch eignet sich die Chemie dieses Analogons nicht zu weiteren intensiven Untersuchungen an vollständig modifizierten Oligonucleotiden (K.-H. Altmann, R. Kesselring, E. Francotte und G. Rihs, Tetrahedron Lett., 1994, 35, 2331; K.-H. Altmann, R. Imwinkelried, R. Kesselring und G. Rihs, Tetrahedron Lett., 1994, 35, 7625; V. E. Marquez, M. A. Siddiqui, A. Ezzitouni, P. Russ, J. Wang, R. W. Wagner und M. D. Matteucci, J. Med. Chem., 1996, 39, 3739; A. Ezzitouni und V. E. Marquez, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1997, 10731.
Ein Bicyclo[3.3.0]nucleosid, das einen zusätzlichen C-2',C-3'-Dioxalanring enthält, wurde als ein Dimer mit einem nicht modifizierten Nucleosid synthetisiert, worin der zusätzliche Ring Teil der Internucleosid-Bindung ist, die eine natürliche Phosphordiesterbindung (F) ersetzt. Dieses Analogon wurde nur entweder als Thymin-Thymin- oder Thymin-5-methylcytosin-Block synthetisiert. Eine 15-mer-Polypyrimidinsequenz, die sieben dieser Dimer-Blöcke enthielt und abwechselnd Phosphordiester- und Riboacetal-Bindungen hatte, wies im Vergleich zu einer Kontrollsequenz mit ausschließlich natürlichen Phosphordiester-Internucleosid-Bindungen eine wesentlich reduzierte T_m gegenüber komplementärer ssRNA auf (R. J. Jones, S. Swaminathan, J. F. Millagan, S. Wadwani, B. S. Froehler und M. Matteucci, J. Am. Chem. Soc. 115, 9816 (1993)).
Die zwei Dimere (G und H) mit zusätzlichen C-2',C-3'-Dioxanringen, die Bicyclo[4.3.0]-Systeme in Internucleosid-Bindungen vom Acetaltyp bilden, wurden als T-T-Dimere synthetisiert und einmal in der Mitte von 12-mer-Polypyrimidin-Oligonucleotiden eingebunden. Oligonucleotide, die entweder G oder H enthielten, bildeten beide signifikant weniger stabile Duplices mit komplementärer ssRNA und ssDNA als das nicht modifizierte Kontroll-Oligonucleotid (J. Wang und M. D. Matteucci, Bioorg. Med. Chem. Lett. 7, 229 (1997)).
Dimere, die ein Bicyclo[3.1.0]nucleosid mit einer C-2',C-3'-Methanobrücke als Teil von Internucleosid-Bindungen vom Amid- und Sulfonamidtyp (I und J) enthalten, wurden synthetisiert und in Oligonucleotide eingebunden. Oligonucleotide, die eines oder mehrere dieser Analoga enthalten, zeigten einen signifikanten Rückgang der T_m im Vergleich zu nicht modifizierten natürlichen Bezugs-Oligonucleotiden (C. G. Yannopoulus, W. Q. Zhou, P. Nower, D. Peoch, Y. S. Sanghvi und G. Just, Synlett, 378 (1997)).
Ein Trimer mit Formacetal-Internucleosid-Bindungen und einem von Bicyclo[3.3.0]glucose abstammenden Nucleosidanalogon in der Mitte (K) wurde synthetisiert und mit dem 3'-Ende eines Oligonucleotids verbunden. Die T_m gegenüber komplementärer ssRNA war im Vergleich zu einer Kontrollsequenz um 4°C erniedrigt, und im Vergleich zu einer Sequenz, die zwei 2',5'-Formacetalbindungen im 3'-Ende enthielt, um 1,5°C (C. G. Yannopoulus, W. Q. Zhou, P. Nower, D. Peoch, Y. S. Sanghvi und G. Just, Synlett, 378 (1997)).
Erst jüngst wurde von Oligomeren, die aus trizyklischen Nucleosidanaloga (L) zusammengesetzt waren, berichtet, dass sie im Vergleich zu natürlicher DNA gesteigerte Duplexstabilität aufwiesen (R. Steffens und C. Leumann (Poster SB-B4), Chimia 51, 436 (1997)).
Drei bizyklische ([4.3.0] und [3.3.0]) Nucleoside mit einem zusätzlichen C-2',C-3'-verbundenen, sechs- (M und N) oder fünfgliedrigen (O) Ring wurden als die T-Analoga synthetisiert. Die bizyklischen Nucleoside M und N wurden einmal und zweimal in 14-mer-Oligo-T-Sequenzen eingebunden. Die T_m gegenüber komplementärer ssRNA und ssDNA wurden im Vergleich zu nicht modifizierten Kontrollsequenzen um 6–10°C pro Modifikation erniedrigt. Vollständig modifizierte Oligonucleotide von Analogon O wiesen im Vergleich zum Kontroll-DNA-Oligonucleotid eine um etwa 1,0°C erhöhte T_m pro Modifikation gegenüber dem komplementären RNA-Oligonucleotid auf. Auch war die zur Gänze modifizierte Sequenz wesentlich stabiler gegenüber Schlangengift-Phosphordiesterasehydrolyse als die nicht modifizierte Kontrollsequenz. Teilweise modifizierte Oligonucleotide, in denen bis zu vier Analoga von O eingebunden waren, waren jedoch weniger thermostabil als die entsprechenden nicht modifizierten Oligonucleotide. Alle Oligonucleotide, die Analogon O enthielten (sowohl vollständig als auch teilweise modifiziert), zeigten im Vergleich zu den nicht modifizierten Oligonucleotiden einen wesentlichen Rückgang der Thermostabilität gegenüber komplementären DNA-Oligonucleotiden (P. Nielsen, H. M. Pfundheller, J. Wengel, Chem. Commun. 826 (1997); P. Nielsen, H. M. Pfundheller, J. Wengel, XII International Roundtable: Nucleosides, Nucleotides and Their Biological Applications; La Jolla, Kalifornien, 15.–19. September 1996, Poster PPI 43).
Ein Versuch, das bizyklische Uridinnucleosid-Analogon Q herzustellen, das einen zusätzlichen O-2',C-4'-fünfgliedrigen Ring aufweisen sollte, ausgehend von 4'-C-Hydroxymethylnucleosid P, missglückte (K. D. Nielsen, Specialerapport (Odense University, Dänemark) (1995)).
Bis heute war das Streben nach Konformations-eingeschränkten Nucleosiden, die zur Bildung von synthetischen Oligonucleotiden mit signifikant verbesserten Hybridisierungseigenschaften nützlich sind, nur wenig erfolgreich. Im Großteil der Fälle bilden Oligonucleotide, die diese Analoga enthalten, im Vergleich zu den nicht modifizierten Oligonucleotiden weniger stabile Duplices mit komplementären Nucleinsäuren. In anderen Fällen, in denen mäßige Verbesserung der Duplexstabilität zu beobachten ist, betrifft dies nur entweder ein DNA- oder ein RNA-Target, oder es betrifft vollständig, nicht jedoch teilweise, modifizierte Oligonucleotide, oder umgekehrt. Eine Beurteilung der meisten untersuchten Analoga ist aufgrund des Mangels an Daten zu Analoga mit G-, A- und C-Nucleobasen und des Mangels an Daten, welche die Spezifität und die Art der Hybridisierung angeben, noch weiter erschwert. In zahlreichen Fällen ist die Synthese der untersuchten Monomeranaloga sehr komplex, während in anderen Fällen die Synthese von vollständig modifizierten Oligonucleotiden mit den durchwegs eingesetzten Phosphoramidit-Chemiestandards unvereinbar ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Unter Anbetracht der Unzulänglichkeiten der bisher bekannten Nucleosidanaloga stellen die Erfinder der vorliegenden Erfindung nun neue Nucleosidanaloga (LNAs) und Oligonucleotide, die LNA-Nucleosidanaloga in sich eingebunden haben, bereit. Die neuen LNA-Nucleosidanaloga werden mit allen üblicherweise verwendeten Nucleobasen bereitgestellt, wodurch ein ganzes Set an Nucleosidanaloga zur Einbindung in Oligonucleotide zur Verfügung steht. Wie aus der folgenden Beschreibung hervorgeht, stellen die LNA-Nucleosidanaloga und das LNA-modifizierte Oligonucleotid umfassende Verbesserungen an Oligonucleotiden bereit, die in den Bereichen der Diagnose und der Therapie verwendet werden. Weiters liefern die LNA-Nucleosidanaloga und das LNA-modifizierte Oligonucleotid auch völlig neue Perspektiven in Nucleosid- und Oligonucleotid-basierten Diagnose- und Therapieverfahren.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung Oligomere, die zumindest ein Nucleosidanalogon (in weiterer Folge als "LNA" bezeichnet) der allgemeinen Formel I
umfassen, worin X ausgewählt ist aus -O-, -S-, -N(R^N*)-, -C(R⁶R^6*)-, -O-C(R⁷R^7*)-, -C(R⁶R^6*)-O-, -S-C(R⁷R^7*)-, -C(R⁶R^6*)-S-, -N(R^N*)-C(R⁷R^7*)-, -C(R⁶R^6*)-N(R^N*)- und -C(R⁶R^6*)-C(R⁷R^7*)-;
B ausgewählt ist aus Wasserstoff, Hydroxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-4-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-4-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_1-4-Acyloxy, Nucleobasen, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden;
P die Restposition einer Internucleosid-Bindung an ein folgendes Monomer oder eine 5'-terminale Gruppe bezeichnet, wobei eine solche Internucleosid-Bindung oder 5'-terminale Gruppe gegebenenfalls den Substituenten R⁵ umfasst;
einer der Substituenten R², R^2*, R³ und R^3* eine Gruppe P^*, die eine Internucleosid-Bindung zu einem vorangehenden Monomer bezeichnet, oder eine 3'-terminale Gruppe ist;
die Substituenten R^2* und R^4* zusammen ein Biradikal, ausgewählt aus -O-, -S-, -N(R*)-, (CR*R*)_r+s+1-, -(CR*R*)_r-S-(CR*R*)_s-, -(CR*R*)_r-N(R*)-(CR*R*)_s-, -O-(CR*R*)_r+s-O-, -S-(CR*R*)_r+s-O-, -O-(CR*R*)_r+s-S-, -N(R*)-(CR*R*)_r+s-O-, -O-(CR*R*)_r+s-N(R*)-, -S-(CR*R*)_r+s-S-, -N(R*)-(CR*R*)_r+s-N(R*)-, -N(R*)-(CR*R*)_r+s-S- und -S-(CR*R*)_r+s-N(R*)-, bezeichnen;
worin jeder R* unabhängig voneinander aus der aus Wasserstoff, Halogen, Azido, Cyano, Nitro, Hydroxy, Mercapto, Amino, Mono- oder Di(C_1-6-alkyl)amino, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden bestehenden Gruppe ausgewählt ist und/oder zwei benachbarte (nicht geminale) R* zusammen eine Doppelbindung bezeichnen können, und jedes der r und s im Bereich von 0 bis 3 liegt, unter der Voraussetzung, dass die Summe r + s = 1–4 ergibt;
jeder der Substituenten R^1*, R², R^2*, R³, R^4*, R⁵, R^5*, R⁶ und R^6*, R⁷ und R^7*, die vorhanden und in P und P* oder das/die Biradikal(e) nicht eingebunden sind, unabhängig voneinander aus der aus Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertem C_1-12-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-12-Alkenyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-12-Alkinyl, Hydroxy, C_1-12-Alkoxy, C_1-12-Alkenyloxy, Carboxy, C_1-12-Alkoxycarbonyl, C_1-12-Alkylcarbonyl, Formyl, Aryl, Aryloxycarbonyl, Aryloxy, Arylcarbonyl, Heteroaryl, Heteroaryloxycarbonyl, Heteroaryloxy, Heteroarylcarbonyl, Amino, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)amino, Carbamoyl, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)aminocarbonyl, Amino-C_1-6-alkylaminocarbonyl, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)amino-C_1-6-alkylaminocarbonyl, C_1-6-Alkylcarbonylamino, Carbamido, C_1-6-Alkanoyloxy, Sulfon, C_1-6-Alkylsulfonyloxy, Nitro, Azido, Sulfanyl, C_1-6-Alkylthio, Halogen, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wobei Aryl und Heteroaryl gegebenenfalls substituiert sein können und wobei zwei geminale Substituenten zusammen Oxo, Thioxo, Imino oder gegebenenfalls substituiertes Methylen bezeichnen oder zusammen ein Spiro-Biradikal bilden können, bestehend aus einer 1–5 Kohlenstoffatom(e) langen Alkylenkette, die gegebenenfalls unterbrochen und/oder durch ein(e) oder mehrere Heteroatom(e)/-gruppe(n), ausgewählt aus -O-, -S- und -(NR^N)-, terminiert ist, wobei R^N aus Wasserstoff und C_1-4-Alkyl ausgewählt ist und worin zwei benachbarte (nicht geminale) Substituenten eine zusätzliche Bindung, die zu einer Doppelbindung führt, bezeichnen können; und R^N* sofern er vorhanden und nicht in ein Biradikal eingebunden ist, aus Wasserstoff und C_1-4-Alkyl ausgewählt ist;
und basische Salze und Säureadditionssalze davon.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiters Nucleosidanaloga (nachstehend als LNAs bezeichnet) der allgemeinen Formel II
worin der Substituent B ausgewählt ist aus Nucleobasen, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden;
X ausgewählt ist aus -O-, -S-, -N(R^N*)- und -C(R⁶R^6*)-;
einer der Substituenten R², R^2*, R³ und R^3* eine Gruppe Q* ist;
wobei Q und Q^* jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Azido, Halogen, Cyano, Nitro, Hydroxy, Prot-O-, Act-O-, Mercapto, Prot-S-, Act-S-, C_1-6-Alkylthio, Amino, Prot-N(R^H)-, Act-N(R^H)-, Mono- oder Di(C_1-6-alkyl)amino, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenoxy, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkinyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkinyloxy, Monophosphat, Diphosphat, Triphosphat, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen, Liganden, Carboxy, Sulfon, Hydroxymethyl, Prot-O-CH₂-, Act-O-CH₂-, Aminomethyl, Prot-N(R^H)-CH₂-, Act-N(R^H)-CH₂-, Carboxymethyl, Sulfonmethyl, worin Prot eine Schutzgruppe für -OH, -SH bzw. -NH(R^H) ist, Act eine Aktivierungsgruppe für -OH, -SH bzw. -NH(R^H) ist und R^H aus Wasserstoff und C_1-6-Alkyl ausgewählt ist;
R^2* und R^4* zusammen ein Biradikal, ausgewählt aus -O-, -S-, -N(R*)-, (CR*R*)_r+s+1-, -(CR*R*)_r-S-(CR*R*)_s-, -(CR*R*)_r-N(R*)-(CR*R*)_s-, -O-(CR*R*)_r+s-O-, -S-(CR*R*)_r+s-O-, -O-(CR*R*)_r+s-S-, -N(R*)-(CR*R*)_r+s-O-, -O-(CR*R*)_r+sN(R*)-, -S-(CR*R*)_r+s-S-, -N(R*)-(CR*R*)_r+s-N(R*)-, -N(R*)-(CR*R*)_r+s-S- und -S-(CR*R*)_r+s-N(R*)-, bezeichnen;
worin jeder R* unabhängig voneinander aus der aus Wasserstoff, Halogen, Azido, Cyano, Nitro, Hydroxy, Mercapto, Amino, Mono- oder Di(C_1-6-alkyl)amino, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden bestehenden Gruppe ausgewählt ist und/oder zwei benachbarte (nicht geminale) R* zusammen eine Doppelbindung bezeichnen können, und
jedes der r und s im Bereich von 0 bis 3 liegt, unter der Voraussetzung, dass die Summe r + s = 1–4 ergibt;
jeder der Substituenten R^1*, R², R^2*, R³, R^4*, R⁵ und R^5*, die nicht in Q, Q* oder das Biradikal eingebunden sind, unabhängig voneinander aus der aus Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertem C_1-12-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-12-Alkenyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-12-Alkinyl, Hydroxy, C_1-12-Alkoxy, C_2-12-Alkenyloxy, Carboxy, C_1-12-Alkoxycarbonyl, C_1-12-Alkylcarbonyl, Formyl, Aryl, Aryloxycarbonyl, Aryloxy, Arylcarbonyl, Heteroaryl, Heteroaryloxycarbonyl, Heteroaryloxy, Heteroarylcarbonyl, Amino, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)amino, Carbamoyl, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)aminocarbonyl, Amino-C_1-6-alkylaminocarbonyl, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)amino-C_1-6-alkylaminocarbonyl, C_1-6-Alkylcarbonylamino, Carbamido, C_1-6-Alkanoyloxy, Sulfon, C_1-6-Alkylsulfonyloxy, Nitro, Azido, Sulfanyl, C_1-6-Alkylthio, Halogen, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wobei Aryl und Heteroaryl gegebenenfalls substituiert sein können und wobei zwei geminale Substituenten zusammen Oxo, Thioxo, Imino oder gegebenenfalls substituiertes Methylen bezeichnen oder zusammen ein Spiro-Biradikal bilden können, bestehend aus einer 1–5 Kohlenstoffatom(e) langen Alkylenkette, die gegebenenfalls unterbrochen und/oder durch ein(e) oder mehrere Hetero atom(e)/-gruppe(n), ausgewählt aus -O-, -S- und -(NR^N)-, terminiert ist, wobei R^N aus Wasserstoff und C_1-4-Alkyl ausgewählt ist und worin zwei benachbarte (nicht geminale) Substituenten eine zusätzliche Bindung, die zu einer Doppelbindung führt, bezeichnen können; und R^N*, sofern er vorhanden und nicht in ein Biradikal eingebunden ist, aus Wasserstoff und C_1-4-Alkyl ausgewählt ist;
und basische Salze und Säureadditionssalze davon;
mit der Maßgabe, dass jede chemische Gruppe (einschließlich jeder Nucleobase), die unter den bei Oligonucleotidsynthese vorherrschenden Bedingungen reaktiv ist, gegebenenfalls mit einer funktionellen Gruppe geschützt ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der Nucleosidanaloga (LNAs) zur Herstellung von Oligomeren sowie die Verwendung der Nucleosidanaloga (LNAs) in den Bereichen Diagnostik, Molekularbiologie und Therapie.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1A und 1B veranschaulichen bekannte Konformations-eingeschränkte Nucleotide.
2 veranschaulicht Nucleotid/Nucleosid-Analoga der Erfindung.
3 veranschaulicht die Leistung von LNA-modifizierten Oligonucleotiden im sequenzspezifischen Einfangen von PCR-Amplikonen.
Die 4A und 4B veranschaulichen, dass LNA-modifizierte Oligonucleotide in der Lage sind, ihr zugehöriges PCR-Amplikon durch Stranginvasion einzufangen.
5 veranschaulicht, dass LNA-modifizierte Oligonucleotide, immobilisiert an einer festen Oberfläche, beim sequenzspezifischen Einfangen eines PCR-Amplikons effizient funktionieren.
6 veranschaulicht, dass LNA-modifizierte Oligonucleotide als Substrate für T4-Polynucleotidkinase wirken können.
7 veranschaulicht, dass LNA-modifizierte Oligonucleotide als Primer für Nucleinsäurepolymerasen funktionieren können.
8 veranschaulicht, dass LNA-modifizierte Oligonucleotide als Primer in Target-Amplifikationsprozessen funktionieren können.
9 veranschaulicht, dass LNA-modifizierte ligonucleotide, die ein 5'-Anthrachinon tragen, kovalent auf einem festen Träger durch Bestrahlung immobilisiert werden können und dass das immobilisierte Oligomer beim Einfangen eines komplementären DNA-Oligos wirksam ist.
10 veranschaulicht, dass LNA-Thymidin-5'-Triphosphat (LNA-TTP) als ein Substrat für terminate Desoxynucleotidyltransferase (TdT) wirken kann.
11 veranschaulicht Hybridisierung und Detektion an einem Test mit unterschiedlichen, LNA-modifizierten, Cy3-markierten 8-meren.
Die 12 und 13 veranschaulichen Hybridisierung und Detektion von Endfehlpaarungen an einer Anordnung mit LNA-modifizierten Cy3-markierten 8-meren.
14 veranschaulicht eine Blockade durch LNA von [D-Ala2]deltorphin-induzierter Antinozizeption im Warmwasser-Schwanzzucktest bei Ratten bei Bewusstsein.
Die 15A, 15B und 15C veranschaulichen Hybridisierung und Detektion von Endfehlpaarungen an einer Anordnung mit AT und allen LNA-modifizierten Cy3-markierten 8-meren.
Die 16 und 17 veranschaulichen, dass LNA lebenden menschlichen MCF-7-Brustkrebszellen zugeführt werden kann.
Die 18 und 19 veranschaulichen die Verwendung von [α³³P]-ddNTPs und ThermoSequenase^TM-DNA-Polymerase zum Sequenzieren von DNA-Matrizen, die LNA-T-Monomere enthalten.
Die 20 und 21 veranschaulichen, dass Exonuclease-freie Klenow-Fragment-DNA-Polymerase I LNA-Adenosin-, -Cytosin-, -Guanosin- und -Uridin-5'-Triphosphate in einen DNA-Strang einbinden kann.
22 veranschaulicht die Fähigkeit von terminaler Desoxynucleotidyltransferase (TdT), LNA-modifizierte Oligonucleotide zu beschließen.
Die 23A und 23B veranschaulichen, dass vollständig vermischte LNA-Monomere verwendet werden können, um die Leistung von immobilisierten biotinylierten DNA-Oligos beim sequenzspezifischen Einfangen von PCR-Amplikonen signifikant zu steigern.
Die 24 bis 41 veranschaulichen mögliche Synthesewege, um die LNA-Monomere der Erfindung zu erhalten.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In Zusammenhang mit dieser Beschreibung bezieht sich die Bezeichnung "LNA" (Locked Nucleoside Analogues, blockierte Nucleosidanaloga) auf die bi- und trizyklischen Nucleosidanaloga der Erfindung, die entweder in das Oligomer der Erfindung eingebunden sind (allgemeine Formel I) oder in Form einer separaten chemischen Spezies (allgemeine Formel II) vorliegen. Die Bezeichnung "monomere LNA" bezieht sich spezifisch auf die letztgenannte Form.
Oligomere und Nucleosidanaloga
Wie zuvor erwähnt betrifft die vorliegende Erfindung u.a. neue Oligomere (Oligonucleotide), die ein oder mehrere bi-, tri- oder polyzyklische Nucleosidanaloga umfassen (in Folge als "LNA" bezeichnet). Es wurde erkannt, dass die Einbindung solcher LNAs anstelle von oder als Ergänzung zu z.B. bekannten Nucleosiden einem Oligonucleotid interessante und äußerst nützliche Eigenschaften verleihen. Bi- und trizyklische, insbesondere bizyklische, LNAs scheinen innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung besonders interessant zu sein.
Jedes der möglichen LNAs, die in ein Oligomer (Oligonucleotid) eingebunden werden, genügt der allgemeinen Formel I:
worin X ausgewählt ist aus -O- (das Furanose-Motiv), -S-, -N(R^N*)-, -C(R⁶R^6*)-, -O-C(R⁷R^7*)-, -C(R⁶R^6*)-O-, -S-C(R⁷R^7*)-, C(R⁶R^6*)-S-, -N(R^N*)-C(R⁷R^7*)-, -C(R⁶R^6*)-N(R^N*)- und -C(R⁶R^6*)-C(R⁷R^7*)-, worin R⁶, R^6*, R⁷, R^7* und R^N* wie nachstehend definiert sind. Somit können die in das Oligomer eingebundenen LNAs entweder einen 5- oder 6-gliedrigen Ring als einen wesentlichen Teil der bi-, tri- oder polyzyklischen Struktur umfassen. Es wird angenommen, dass 5-gliedrige Ringe (X = -O-, -S-, -N(R^N*)-, -C(R⁶R^6*)-) besonders interessant darin sind, dass sie in der Lage sind, im Wesentlichen dieselben Konformationen einzunehmen (auch wenn sie durch das Einführen von einem oder mehreren Biradikalen blockiert sind (siehe unten)) wie der native Furanose-Ring eines natürlich vorkommenden Nucleosids. Unter den möglichen 5-gliedrigen Ringe scheinen die Situationen, in denen X für -O-, -S- und -N(R^N*)- steht, besonders interessant zu sein, und die Situation, in der X -O- ist, scheint ganz besonders interessant zu sein.
Der Substituent B kann eine Gruppe bezeichnen, die, wenn das Oligomer mit DNA oder RNA einen Komplex bildet, in der Lage ist, mit DNA oder RNA, insbesondere Nucleobasen von DNA oder RNA, wechselzuwirken (z.B. durch Wasserstoffbindung oder kovalente Bindung oder elektronische Wechselwirkung). Alternativ dazu kann der Substituent B eine Gruppe bezeichnen, die als eine Markierung oder ein Reporter wirkt, oder der Substituent B kann eine Gruppe (z.B. Wasserstoff) bezeichnen, von der erwartet wird, dass sie nur geringe oder keine Wechselwirkungen mit DNA oder RNA hat. Somit ist der Substituent B vorzugsweise aus Wasserstoff, Hydroxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-4-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-4-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_1-4-Acyloxy, Nucleobasen, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden ausgewählt.
Im vorliegenden Zusammenhang deckt die Bezeichnung "Nucleobase" natürlich vorkommende Nucleobasen sowie nicht natürlich vorkommende Nucleobasen ab. Es sollte Fachleuten eindeutig bekannt sein, dass verschiedene Nucleobasen, die bisher als "nicht natürlich vorkommend" erachtet wurden, in weiterer Folge in der Natur gefunden wurden. Somit schließt die Bezeichnung "Nucleobase" nicht nur die bekannten Purin- und Pyrimidin-Heterozyklen ein, sondern auch heterozyklische Analoga und Tautomere davon. Veranschaulichende Beispiele von Nucleobasen sind Adenin, Guanin, Thymin, Cytosin, Uracil, Purin, Xanthin, Diaminopurin, 8-Oxo-N⁶-methyladenin, 7-Deazaxanthin, 7-Deazaguanin, N⁴,N⁴-Ethanocytosin, N⁶,N⁶-Ethano-2,6-diaminopurin, 5-Methylcytosin, 5-(C³-C⁶)-Alkinylcytosin, 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, Pseudoisocytosin, 2-Hydroxy-5-methyl-4-triazolopyridin, Isocytosin, Isoguanin, Inosin und die "nicht natürlich vorkommenden" Nucleobasen, die in Brenner et al., US-Patent Nr. 5.432.272, beschrieben sind. Die Bezeichnung "Nucleobase" soll jedes einzelne und alle diese Beispiele sowie Analoga und Tautomere davon abdecken. Besonders interessante Nucleobasen sind Adenin, Guanin, Thymin, Cytosin und Uracil, die als die natürlich vorkommenden Nucleobasen in Verbindung mit therapeutischer und diagnostischer Anwendung bei Menschen betrachtet werden.
In der vorliegenden Beschreibung bedeutet "DNA-Interkalator" eine Gruppe, die sich in eine DNA- oder RNA-Helix, -Duplex oder -Triplex interkalieren kann. Beispiele für funktionelle Teile von DNA-Interkalatoren sind Acridine, Anthracen, Chinone wie beispielsweise Anthrachinon, Indol, Chinolin, Isochinolin, Dihydrochinone, Anthracycline, Tetracycline, Methylenblau, Anthracyclinon, Psoralene, Cumarine, Ethidium-Halogenide, Dynemicin, Metallkomplexe wie beispielsweise 1,10-Phenanthrolinkupfer, Tris(4,7-diphenyl-1,10-phenanthrolin)rutheniumkobalt-endiine wie beispielsweise Calcheamicin, Porphyrine, Distamycin, Netropcin, Viologen und Daunomycin. Besonders interessante Beispiele sind Acridine, Chinone wie beispielsweise Anthrachinon, Methylenblau, Psoralene, Cumarine und Ethidium-Halogenide.
Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich die Bezeichnung "photochemisch aktive Gruppen" auf Verbindungen, die in der Lage sind, durch Bestrahlung mit Licht chemische Reaktionen zu erfahren. Veranschaulichende Beispiele für funktionelle Gruppen davon sind Chinone, insbesondere 6-Methyl-1,4-naphthochinon, Anthrachinon, Naphtochinon und 1,4-Dimethylanthrachinon, Diazirine, aromatische Azide, Benzophenone, Psoralene, Diazoverbindungen und Diazirinoverbindungen.
Im vorliegenden Zusammenhang ist "thermochemisch reaktive Gruppe" definiert als eine funktionelle Gruppe, die in der Lage ist, thermochemisch-induzierte kovalente Bindungsbildung mit anderen Gruppen zu erfahren. Veranschaulichende Beispiele für funktionelle Teile thermochemisch reaktiver Gruppen sind Carbonsäuren, Carbonsäureester wie beispielsweise aktivierte Ester, Carbonsäurehalogenide wie beispielsweise Säurefluoride, Säurechloride, Säurebromide und Säureiodide, Carbonsäureazide, Carbonsäurehydrazide, Sulfonsäuren, Sulfonsäureester, Sulfonsäurehalogenide, Semicarbazide, Thiosemicarbazide, Aldehyde, Ketone, primäre Alkohole, sekundäre Alkohole, tertiäre Alkohole, Phenole, Alkylhalogenide, Thiole, Disulfide, primäre Amine, sekundäre Amine, tertiäre Amine, Hydrazine, Epoxide, Maleinimide und Borsäurederivate.
Im vorliegenden Kontext bedeutet die Bezeichnung "Chelat bildende Gruppe" ein Molekül, das mehr als eine Bindungsstelle enthält und sich häufig an ein anderes Molekül, Atom oder Ion über mehr als eine Bindungsstelle gleichzeitig bindet. Beispiele für funktionelle Teile von Chelat bildenden Gruppen sind Iminodiessigsäure, Nitrilotriessigsäure, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Aminophosphonsäure usw.
Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet die Bezeichnung "Reportergruppe" eine Gruppe, die entweder durch sich selbst oder als ein Teil einer Detektionsreihe nachweisbar ist. Beispiele für funktionelle Teile von Reportergruppen sind Biotin, Digoxigenin, fluoreszierende Gruppen (Gruppen, die in der Lage sind, elektromagnetische Strahlung zu absorbieren, z.B. Licht- oder Röntgenstrahlen einer bestimmten Wellenlänge, und die in weiterer Folge die absorbierte Energie als Strahlung mit längerer Wellenlänge wiederum abgeben; veranschaulichende Beispiele hierfür sind Dansyl ((5-Dimethylamino)-1-naphthalinsulfonyl), DOXYL (N-Oxyl-4,4-dimethyloxazolidin), PROXYL (N-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin), TEMPO (N-Oxyl-2,2,6,6-tetramethylpiperidin), Dinitrophenyl, Acridine, Cumarine, Cy3 und Cy5 (Warenzeichen für Biological Detection Systems, Inc.), Erytrosin, Cumarinsäure, Umbelliferon, Texas-Rot, Rhodamin, Tetramethylrhodamin, Rox, 7-Nitrobenzo-2-oxa-1-diazol (NBD), Pyren, Fluorescein, Europium, Ruthenium, Samarium und andere Seltenerdmetalle), radioisotopische Markierungen, chemilumineszierende Markierungen (Markierungen, die durch Lichtemission während einer chemischen Reaktion nachweisbar sind), Spinmarkierungen (ein Radikal (z.B. substituierte organische Nitroxide) oder andere paramagnetische Sonden (z.B. Cu²⁺, Mg²⁺), gebunden an ein biologisches Molekül, das/die durch die Verwendung von Elektronenspinresonanz-Spektroskopie nachweisbar ist/sind), Enzyme (wie beispielsweise Peroxidasen, alkalische Phosphatasen, β-Galactosidasen und Glucose-Oxidasen), Antigene, Antikörper, Haptene (Gruppen, die in der Lage sind, sich mit einem Antikörper zu kombinieren, die jedoch keine Immunantwort durch sich selbst initiieren können, wie z.B. Peptide und steroide Hormone), Trägersysteme für Zellmembranpenetration wie beispielsweise: Fettsäurereste, steroide Gruppierungen (Cholesteryl), Vitamin A, Vitamin D, Vitamin E, Folsäurepeptide für spezifische Rezeptoren, Gruppen zur Vermittlung von Endocytose, Epidermiswachstumsfaktor (EGF), Bradykinin und von Blutplättchen gewonnener Wachstumsfaktor (PDGF). Besonders interessante Beispiele sind Biotin, Fluorescein, Texas-Rot, Rhodamin, Dinitrophenyl, Digoxigenin, Ruthenium, Europium, Cy5, Cy3 usw.
Im vorliegenden Zusammenhang bezeichnet "Ligand" etwas, das bindet. Liganden können funktionelle Gruppen umfassen, wie beispielsweise: aromatische Gruppen (wie z.B. Benzol, Pyridin, Naphthalin, Anthracen und Phenanthren), heteroaromatische Gruppen (wie z.B. Thiophen, Furan, Tetrahydrofuran, Pyridin, Dioxan und Pyrimidin), Carbonsäuren, Carbonsäureester, Carbonsäurehalogenide, Carbonsäureazide, Carbonsäurehydrazide, Sulfonsäure, Sulfonsäureester, Sulfonsäurehalogenide, Semicarbazide, Thiosemicarbazide, Aldehyde, Ketone, primäre Alkohole, sekundäre Alkohole, tertiäre Alkohole, Phenole, Alkylhalogenide, Thiole, Disulfide, primäre Amine, sekundäre Amine, tertiäre Amine, Hydrazine, Epoxide, Maleinimide, C₁-C₂₀-Alkylgruppen, gegebenenfalls mit einem oder mehreren Heteroatomen wie beispielsweise Sauerstoffatomen, Stickstoffatomen und/oder Schwefelatomen unterbrochen oder terminiert, gegebenenfalls aromatische oder mono/polyungesättigte Kohlenwasserstoffe enthaltend, Polyoxyethylen wie beispielsweise Polyethylenglykol, Oligo/Polyamide wie beispielsweise Poly-β-Alanin, Polyglycin, Polylysin, Peptide, Oligo/Polysaccharide, Oligo/Polyphosphate, Toxine, Antibiotika, Zellgiftarten und Steroide, und auch "Aftinitätsliganden", d.h. funktionelle Gruppen oder Biomoleküle, die eine spezifische Affinität für Stellen an bestimmten Proteinen, Antikörpern, Poly- und Oligosacchariden und anderen Biomolekülen aufweisen.
Fachleuten wird bekannt sein, dass die zuvor erwähnten spezifischen Beispiele zu den Bezeichnungen DNA-Interkalatoren, photochemisch aktive Gruppen, thermochemisch aktive Gruppen, Chelat bildende Gruppen, Reportergruppen und Liganden dem "aktiven/funktionellen" Teil der betreffenden Gruppen entsprechen. Fachleuten wird weiters bekannt sein, dass DNA-Interkalatoren, photochemisch aktive Gruppen, thermochemisch aktive Gruppen, Chelat bildende Gruppen, Reportergruppen und Liganden typischerweise in der Form M-K- vorliegen, worin M der "aktive/funktionelle" Teil der betreffenden Gruppe und K ein Abstandshalter ist, durch den der "aktive/funktionelle" Teil an den 5- oder 6-gliedrigen Ring gebunden ist. Somit gilt zu verstehen, dass die Gruppe B, in dem Fall, in dem B aus DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden ausgewählt ist, die Form M-K- aufweist, worin M der "aktive/funktionelle" Teil des DNA-Interkalators, der photochemisch aktiven Gruppe, der thermochemisch aktiven Gruppe, der Chelat bildenden Gruppe, der Reportergruppe bzw. des Liganden ist und K ein optionaler Abstandshalter ist, der 1–50 Atome, vorzugsweise 1–30 Atome, besonders bevorzugt 1–15 Atome, zwischen dem 5- oder 6-gliedrigen Ring und dem "aktiven/funktionellen" Teil umfasst.
Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich die Bezeichnung "Abstandshalter" auf eine thermochemisch und photochemisch inaktive distanzbildende Gruppe und wird verwendet, um zwei oder mehr verschiedene Gruppierungen der zuvor definierten Typen zu verbinden. Abstandshalter werden auf Grundlage zahlreicher verschiedener Eigenschaften ausgewählt, einschließlich ihrer Hydrophobie, Hydrophilie, molekularer Flexibilität und Länge (siehe z.B. Hermanson et al., "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, San Diego, Kalifornien, S. 137ff (1992)). Im Allgemeinen beträgt die Länge der Abstandshalter weniger als oder etwa 400 Å, in manchen Anwendungsformen vorzugsweise weniger als 100 Å. Der Abstandshalter umfasst somit eine Kette von Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls unterbrochen oder terminiert mit einem oder mehreren Heteroatomen, wie beispielsweise Sauerstoffatomen, Stickstoffatomen und/oder Schwefelatomen. Somit kann der Abstandshalter K ein oder mehrere Amid-, Ester-, Amino-, Ether- und/oder Thioether-Funktionalitäten und gegebenenfalls aromatische oder mono/polyungesättigte Kohlenwasserstoffe, Polyoxyethylen wie beispielsweise Polyethylenglykol, Oligo/Polyamide wie beispielsweise Poly-β-Alanin, Polyglycin, Polylysin und Peptide im Allgemeinen, Oligosaccharide und Oligo/Polyphosphate umfassen. Darüber hinaus kann der Abstandshalter aus kombinierten Einheiten davon bestehen. Die Länge des Abstandshalters kann unter Berücksichtigung der erwünschten oder erforderlichen Positionierung und räumlichen Ausrichtung des "aktiven/funktionellen" Teils der betreffenden Gruppe in Bezug auf den 5- oder 6-gliedrigen Ring variieren. In besonders interessanten Ausführungsformen umfasst der Abstandshalter eine chemisch spaltbare Gruppe. Beispiele für solche chemisch spaltbaren Gruppen umfassen Disulfidgruppen, die unter reduktiven Bedingungen spaltbar sind, Peptidfragmente, die durch Peptidasen spaltbar sind, usw.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezeichnet K eine Einfachbindung, sodass der "aktive/funktionelle" Teil der betreffenden Gruppe direkt an den 5- oder 6-gliedrigen Ring gebunden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Substituent B in den allgemeinen Formeln I und II vorzugsweise aus Nucleobasen ausgewählt, insbesondere aus Adenin, Guanin, Thymin, Cytosin und Uracil.
In den Oligomeren der vorliegenden Erfindung (Formel I) bezeichnet P die Restposition für eine Internucleosid-Bindung an ein folgendes Monomer oder eine 5'-terminale Gruppe. Die erste Möglichkeit tritt ein, wenn das betreffende LNA nicht das 5'-terminale "Monomer" ist, während die zweite Möglichkeit von Relevanz ist, wenn das betreffende LNA das 5'-terminale "Monomer" ist. Es gilt anzumerken (was auch auf Grundlage der nachstehend gegeben Definition von Internucleosid-Bindung und 5'-terminaler Gruppe klar hervorgeht), dass solch eine Internucleosid-Bindung oder 5'-terminale Gruppe den Substituenten R⁵ (oder gleich anwendbar: den Substituenten R^5*) einbinden kann, wodurch eine Doppelbindung zur Gruppe P entsteht. (5'-terminal bezieht sich auf die Position, die dem 5'-Kohlenstoffatom einer Ribosegruppierung in einem Nucleosid entspricht.)
Andererseits kann eine Internucleosid-Bindung an ein vorangehendes Monomer oder eine 3'-terminale Gruppe (P^*) von den Positionen, die durch einen der Substituenten R², R^2*, R³ und R^3* definiert sind, vorzugsweise von den Positionen, die durch einen der Substituenten R³ und R^3* definiert sind, ausgehen. Analog dazu kann die erste Möglichkeit zum Tragen kommen, wenn das betreffende LNA nicht das 3'-terminale "Monomer" ist, während die letztere Möglichkeit dann relevant ist, wenn das betreffende LNA das 3'-terminale "Monomer" ist. (3'-terminal bezieht sich auf die Position, die dem 3'-Kohlenstoffatom einer Ribosegruppierung in einem Nucleosid entspricht.)
Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich die Bezeichnung "Monomer" auf natürlich vorkommende Nucleoside, nicht natürlich vorkommende Nucleoside, PNAs usw. sowie auf LNAs. Somit bezieht sich die Bezeichnung "nachfolgendes Monomer" auf das benachbarte Monomer in der 5'-terminalen Richtung, und das "vorangehende Monomer" bezieht sich auf das benachbarte Monomer in der 3'-terminalen Richtung. Solche nachfolgenden und vorangehenden Monomere, gesehen aus der Position eines LNA-Monomers, können natürlich vorkommende Nucleoside oder nicht natürlich vorkommende Nucleoside oder sogar weitere LNA-Monomere sein.
Folglich bedeutet im vorliegenden Zusammenhang (wie von den obigen Definition abgeleitet werden kann) die Bezeichnung "Oligomer" ein Oligonucleotid, das durch die Einbindung eines oder mehrerer LNAs) modifiziert ist.
Das zentrale Element der vorliegenden Erfindung ist die Gegenwart eines oder mehrerer Ringe, die an den 5- oder 6-gliedrigen Ring fusioniert sind, veranschaulicht durch die allgemeine Formel I, definiert durch die Substituenten R^2* und R^4* nach Anspruch 1.
Die in die Oligomere eingebundenen LNAs umfassen nur ein Biradikal, das sich aus einem Paar (zweier) nicht-geminaler Substituenten zusammensetzt, das zwischen R^2* und R^4* gebildet ist.
Im vorliegenden Zusammenhang, d.h. in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen, ist die Ausrichtung der Biradikale so beschaffen, dass die linke Seite den Substituenten mit der geringsten Nummer und die rechte Seite den Substituenten mit der höchsten Nummer darstellt; somit gilt, sofern R³ und R⁵ zusammen ein Biradikal "-O-CH₂-" bezeichnen, dass das Sauerstoffatom R³ darstellt, somit das Sauerstoffatom z.B. an die Position von R³ gebunden ist, und die Methylengruppe R⁵ darstellt.
Besonders interessante Oligomere sind jene, worin eines der folgenden Kriterien für zumindest ein LNA in einem Oligomer gilt: R^2* und R^4* zusammen bezeichnen ein Biradikal, ausgewählt aus -O-, -S-, -N(R*)-, -(CR*R*)_r+s+1-, -(CR*R*)_r-S-(CR*R*)_s-, -(CR*R*)_r-N(R*)-(CR*R*)_s-, -O-(CR*R*)_r+s-O-, -S-(CR*R*)_r+s-O-, -O-(CR*R*)_r+s-S-, -N(R*)-(CR*R*)_r+s-O-, -O-(CR*R*)_r+s-N(R*)-, -S-(CR*R*)_r+s-S-, -N(R*)-(CR*R*)_r+s-N(R*)-, -N(R*)-(CR*R*)_r+s-S- und -S-(CR*R*)_r+s-N(R*)-, worin jedes der r und s im Bereich von 0 bis 3 liegt, unter der Voraussetzung, dass die Summe r + s = 1–4 ergibt, und worin R^H Wasserstoff oder C_1-4-Alkyl bezeichnet.
Es wird weiters bevorzugt, dass ein R^* aus der aus Wasserstoff, Hydroxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden bestehenden Gruppe ausgewählt ist und jeder verbleibende Substituent R^* Wasserstoff ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine Gruppe R^* im Biradikal von zumindest einem LNA aus DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden ausgewählt (worin die letzten Gruppen einen Abstandshalter wie für den Substituenten B definiert einschließen kann).
Hinsichtlich der Substituenten R^1*, R², R^2*, R³, R^4*, R⁵, R^5*, R⁶ und R^6*, R⁷ und R^7*, die vorhanden und nicht in P, P^* oder das/die Biradikal(e) eingebunden sind, gilt anzumerken, dass sie unabhängig voneinander aus Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertem C_1-12-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-12-Alkenyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-12-Alkinyl, Hydroxy, C_1-12-Alkoxy, C_2-12-Alkenyloxy, Carboxy, C_1-12-Alkoxycarbonyl, C_1-12-Alkylcarbonyl, Formyl, Aryl, Aryloxycarbonyl, Aryloxy, Arylcarbonyl, Heteroaryl, Heteroaryloxycarbonyl, Heteroaryloxy, Heteroarylcarbonyl, Amino, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)amino, Carbamoyl, Mono- und Di(C_1-6-alkylaminocarbonyl, Amino-C_1-6-alkylaminocarbonyl, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)amino-C_1-6-alkylaminocarbonyl, C_1-6-Alkylcarbonylamino, Carbamido, C_1-6-Alkanoyloxy, Sulfon, C_1-6-Alkylsulfonyloxy, Nitro, Azido, Sulfanyl, C_1-6-Alkylthio, Halogen, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden ausgewählt sind (worin die letzte Gruppen einen Abstandshalter wie für den Substituenten B definiert einschließen können), wobei Aryl und Heteroaryl gegebenenfalls substituiert sein können und wobei zwei geminale Substituenten zusammen Oxo, Thioxo, Imino oder gegebenenfalls substituiertes Methylen bezeichnen oder zusammen ein Spiro-Biradikal bilden können, bestehend aus einer 1–5 Kohlenstoffatom(e) langen Alkylenkette, die gegebenenfalls durch ein(e) oder mehrere Heteroatom(e)/-gruppe(n), ausgewählt aus -O-, -S- und -(NR^N)-, unterbrochen und/oder terminiert ist, wobei R^N aus Wasserstoff und C_1-4-Alkyl ausgewählt ist und worin zwei benachbarte (nicht geminale) Substituenten eine zusätzliche Bindung, die zu einer Doppelbindung führt, bezeichnen können; und R^N*, sofern er vorhanden und nicht in ein Biradikal eingebunden ist, aus Wasserstoff und C_1-4-Alkyl ausgewählt ist.
Vorzugsweise ist jeder der Substituenten R^1*, R², R^2*, R³, R^3*, R^4*, R⁵, R^5*, R⁶, R^6*, R⁷ und R^7* der LNA(s), die vorhanden und nicht in P, P^* oder das/die Biradikal(e) eingebunden sind, unabhängig von den anderen aus Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyl, Hydroxy, C_1-6-Alkoxy, C_2-6-Alkenyloxy, Carboxy, C_1-6-Alkoxycarbonyl, C_1-6-Alkylcarbonyl, Formyl, Amino, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)amino, Carbamoyl, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)aminocarbonyl, C_1-6-Alkylcarbonylamino, Carbamido, Azido, C_1-6-Alkanoyloxy, Sulfon, Sulfanyl, C_1-6-Alkylthio, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden und Halogen ausgewählt, worin zwei geminale Substituenten zusammen Oxo bezeichnen können und worin R^N*, sofern vorhanden und nicht in ein Biradikal eingebunden, aus Wasserstoff und C_1-4-Alkyl ausgewählt ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist X von -O-, -S- und -NR^N*-, insbesondere -O-, ausgewählt, und jeder der Substituenten R^1*, R², R^2*, R³, R^3*, R^4*, R⁵, R^5*, R⁶, R^6*, R⁷ und R^7* der LNA(s), der vorhanden und nicht in P, P^* oder das/die Biradikal(e) eingebunden ist, bezeichnet Wasserstoff.
In einer noch bevorzugteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezeichnen R^2* und R^4* eines LNA, eingebunden in ein Oligomer, zusammen ein Biradikal. Vorzugsweise ist X O, R² ausgewählt aus Wasserstoff, Hydroxy und gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, und R^1*, R³, R⁵ und R^5* bezeichnen Wasserstoff, und noch spezifischer ist das Biradikal aus -O-, -(CH₂)_0-1-S-(CH₂)_1-3-, -(CH₂)_0-1-N(R^H)-(CH₂)_1-3- und -(CH₂)_2-4-, insbesondere aus -O-CH₂-, -S-CH₂- und -NR^H-CH₂-, ausgewählt. Unter angemessener Berücksichtigung der bisher gewonnenen Resultate wird es bevorzugt, dass das Biradikal, das R^2* und R^4* darstellt, eine Zwei-Kohlenstoffatom-Brücke bildet, d.h. dass das Biradikal einen fünfgliedrigen Ring mit dem Furanosering (X = O) bildet.
In diesen Ausführungsformen wird weiters bevorzugt, dass zumindest ein LNA, das in ein Oligomer eingebunden ist, eine Nucleobase (Substituent B), ausgewählt aus Adenin und Guanin, einschließt. Insbesondere wird bevorzugt, dass ein Oligomer, das LNA in sich eingebunden hat, sowohl zumindest eine Nucleobase, ausgewählt aus Thymin, Uracil und Cytosin, als auch zumindest eine Nucleobase, ausgewählt aus Adenin und Guanin, einbindet. Bei LNA-Monomeren wird es besonders bevorzugt, dass die Nucleobase aus Adenin und Guanin ausgewählt ist.
Für diese interessanten Ausführungsformen wird auch bevorzugt, dass das/die LNA(s) der allgemeinen Formel Ia (siehe unten) entspricht/entsprechen.
Bei einer Variante dieser interessanten Ausführungsform sind alle Monomere eines Oligonucleotids LNA-Monomere.
Aufgrund der allgemeinen Formel I (LNA(s) in einem Oligomer) (und der allgemeinen Formel II (monomeres LNA) – siehe unten) und der Definitionen, die hiermit verbunden sind, ist eindeutig, dass je nach Beschaffenheit der Substituenten und möglichen Biradikale (siehe unten) ein oder mehrere asymmetrische Kohlenstoffatome in den Oligomeren (und monomeren LNAs) vorhanden sein können. Die gemäß dem Verfahren der Erfindung hergestellten Oligomere, sowie die Oligomere an sich, sollen alle Stereoisomere einbinden, die aus der Gegenwart eines jeden und aller Isomere der einzelnen Monomerfragmente sowie Gemischen davon, einschließlich racemischer Gemische, entstehen. Berücksichtigt man jedoch den 5- oder 6-gliedrigen Ring, so wird jedoch angenommen, dass bestimmte stereochemische Konfigurationen von besonderem Interesse sein können, z.B. die
worin die Wellenlinien für die Möglichkeit darstellt, dass beide Diastereomere aus dem Austausch der zwei betreffenden Substituenten entstehen.
Eine besonders interessante stereoisomere Darstellung ist der Fall, wenn das/die LNA(s) die folgende Formel Ia aufweist/aufweisen:
Auch interessant als separater Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Variante von Formel Ia, worin B in der "α-Konfiguration" vorliegt.
In diesen Fällen sowie im Allgemeinen bezeichnet R^3* vorzugsweise P^*.
Die Oligomere gemäß der Erfindung umfassen typischerweise 1–10.000 LNA(s) der allgemeinen Formel I (oder der detaillierteren Formel Ia) und 0–10.000 Nucleoside, ausgewählt aus natürlich vorkommenden Nucleosiden und Nucleosidanaloga. Die Summe der Anzahl an Nucleosiden und die Anzahl an LNA(s) beträgt zumindest 2, vorzugsweise zumindest 3, insbesondere zumindest 5, ganz besonders zumindest 7, wie beispielsweise im Bereich von 2–15.000, vorzugsweise im Bereich von 2–100, wie beispielsweise 3–100, insbesondere im Bereich von 2–50, wie beispielsweise 3–50 oder 5–50 oder 7–50.
Vorzugsweise umfasst zumindest ein LNA eine Nucleobase als den Substituenten B.
Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich die Bezeichnung "Nucleosid" auf ein Glycosid einer heterozyklischen Base. Die Bezeichnung "Nucleosid" wird allgemein verwendet, um nicht natürlich vorkommende Nucleoside, natürlich vorkommende Nucleoside sowie andere Nucleosidanaloga abzudecken. Veranschaulichende Beispiele von Nucleosiden sind Ribonucleoside, umfassend eine Ribosegruppierung, sowie Desoxyribonucleoside, umfassend eine Desoxyribosegruppierung. Hinsichtlich der Basen solcher Nucleoside gilt anzumerken, dass dies jede beliebige der natürlich vorkommenden Basen sein kann, z.B. Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin und Uracil, sowie jede beliebige modifizierte Variante davon oder jede mögliche unnatürliche Base.
Unter Anbetracht der Definitionen und der bekannten Nucleoside (natürlich vorkommende und nicht natürlich vorkommende) und Nucleosidanaloga (einschließlich bekannter bi- und trizyklischer Analoga) ist es eindeutig, dass ein Oligomer ein oder mehrere LNA(s) (die identisch oder unterschiedlich, beides hinsichtlich der Auswahl des Substituenten und hinsichtlich der Auswahl des Biradikals) und ein oder mehrere Nucleoside und/oder Nucleosidanaloga umfassen kann. Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet "Oligonucleotid" eine aufeinanderfolgende Kette von Nucleosiden, verbunden über Internucleosid-Bindungen, wobei jedoch anzumerken gilt, dass eine Nucleobase in einer oder mehreren Nucleotideinheiten (Monomeren) in einem Oligomer (Oligonucleotid) mit einem Substituenten B wie oben definiert modifiziert worden sein kann.
Die Oligomere können unverzweigt, verzweigt oder zyklisch sein. Im Fall eines verzweigten Oligomers können die Verzweigungspunkte in einem Nucleosid, in einer Internucleosid-Bindung oder, wie eine faszinierende Ausführungsform zeigt, in einem LNA angeordnet sein. Es wird angenommen, dass im letztgenannten Fall die Substituenten R², R^2*, R³ und R^3* zwei Gruppen P^* bezeichnen können, die jeweils eine Internucleosid-Bindung zu einem vorangehenden Monomer bezeichnen, im Detail bezeichnet einer von R² und R^2* P^* und einer von R³ und R^3* ein weiteres P^*.
Wie zuvor erwähnt ist/sind das/die LNA(s) eines Oligomers mit anderen Monomeren über eine Internucleosid-Bindung verbunden. Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet die Bezeichnung "Internucleosid-Bindung" eine Bindung, die aus 2 bis 4, vorzugsweise 3, Gruppen/Atomen besteht, ausgewählt aus -CH₂-, -O-, -S-, -NR^H-, >C=O, >C=NR^H, >C=S, -Si(R'')₂-, -SO-, -S(O)₂-, -P(O)₂-, -PO(BH₃)-, -P(O,S)-, -P(S)₂-, -PO(R'')-, -PO(OCH₃)- und -PO(NHR^H)-, worin R^H aus Wasserstoff und C_1-4-Alkyl und R'' aus C_1-6-Alkyl und Phenyl ausgewählt ist. Veranschaulichende Beispiele für solche Internucleosid-Bindungen sind -CH₂-CH₂-CH₂-, -CH₂CO-CH₂-, -CH₂-CHOH-CH₂-, -O-CH₂-O-, -O-CH₂-CH₂-, -O-CH₂-CH= (einschließlich R⁵, sofern als eine Bindung zu einem nachfolgenden Monomer verwendet), -CH₂-CH₂-O-, -NR^H-CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-NR^H-, -CH₂-NR^H-CH₂-, -O-CH₂-CH₂-NR^H-, -NR^H-CO-O-, -NR^H-CO-NR^H-, -NR^H-CS-NR^H-, -NR^H-C(=NR^H)-NR^H-, -NR^H-CO-CH₂-NR^H-, -O-CO-O-, -O-CO-CH₂-O-, -O-CH₂-CO-O-, -CH₂CO-NR^H-, -O-CO-NR^H-, -NR^H-CO-CH₂-, -O-CH₂-CO-NR^H-, -O-CH₂-CH₂-NR^H-, -CH=N-O-, -CH₂-NR^H-O-, -CH₂-O-N= (einschließlich R⁵, sofern als eine Bindung zu einem nachfolgenden Monomer verwendet), -CH₂-O-NR^H-, -CO-NR^H-CH₂-, -CH₂-NR^H-O-, -CH₂NR^H-CO-, -O-NR^H-CH₂-, -O-NR^H-, -O-CH₂-S-, -S-CH₂-O-, CH₂-CH₂-S-, -O-CH₂-CH₂-S-, -S-CH₂-CH= (einschließlich R⁵, sofern als eine Bindung zu einem nachfolgenden Monomer verwendet), -S-CH₂-CH₂-, -S-CH₂-CH₂-O-, -S-CH₂-CH₂-S-, -CH₂-S-CH₂-, -CH₂-SO-CH₂-, -CH₂-SO₂-CH₂-, -O-SO-O-, -O-S(O)₂-O-, -O-S(O)₂-CH₂-, -O-S(O)₂-NR^H-, -NR^H-S(O)₂-CH₂-, -O-S(O)₂-CH₂-, -O-P(O₂)-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)₂-O-, S-P(O)₂-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)₂-O-, -O- P(O)₂-S-, -O-P(O,S)-S-, -O-P(S)₂-S-, -S-P(O)₂-S-, -S-P(O,S)-S-, -S-P(S)₂-S-, -O-PO(R'')-O-, -O-PO(OCH₃)-O-, -O-PO(OCH₂CH₃)-O-, -O-PO(OCH₂CH₂S-R)-O-, -O-PO(BH₃)-O-, -O-PO(NHR^N)-O-, -O-P(O)₂-NR^H-, -NR^H-P(O)₂-O-, -O-P(O,NR^H)-O-, -CH₂-P(O)₂-O-, -O-P(O)₂-CH₂- und -O-Si(R'')₂-O-; unter denen -CH₂-CO-NR^H-, -CH₂NR^H-O-, -S-CH₂-O-, -O-P(O)₂-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)₂-O-, -NR^H-P(O)₂-O-, -O-P(O,NR^H)-O-, -O-PO(R'')-O-, -O-PO(CH₃)-O- und -O-PO(NHR^N)-O-, worin R^H aus Wasserstoff und C_1-4-Alkyl und R'' aus C_1-6-Alkyl und Phenyl ausgewählt ist, besonders bevorzugt sind. Weitere veranschaulichende Beispiele sind in Mesmaeker et al., Current Opinion in Structural Biology 5, 343–355 (1995), zu finden. Die linke Seite der Internucleosid-Bindung ist an den 5- oder 6-gliedrigen Ring als Substituent P^* gebunden, während die rechte Seite an die 5'-Position eines vorangehenden Monomers gebunden ist.
Aus der obigen Erläuterung geht hervor, dass die Gruppe P auch eine 5'-terminale Gruppe bezeichnen kann, sofern das betreffende LNA das 5'-terminale Monomer ist. Beispiele für solche 5'-terminalen Gruppen sind Wasserstoff, Hydroxy, gegebenenfalls substituiertes C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiertes C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertes C_1-6-Alkylcarbonyloxy, gegebenenfalls substituiertes Aryloxy, Monophosphat, Diphosphat, Triphosphat und -W-A', worin W aus -O-, -S- und -N(R^H)- ausgewählt ist, wobei R^H aus Wasserstoff und C_1-6-Alkyl ausgewählt ist, und worin A' aus DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden ausgewählt ist (wobei die letztgenannten Gruppen einen Abstandshalter wie für den Substituenten B definiert einbinden können).
In der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen bezeichnen "Monophosphat", "Diphosphat" und "Triphosphat" Gruppen der Formel: -O-P(O)₂-O^–, -O-P(O)₂-O-P(O)₂-O^– bzw. -O-P(O)₂-O-P(O)₂-O-P(O)₂-O^–.
In einer besonders interessanten Ausführungsform bezeichnet die Gruppe P eine 5'-terminale Gruppe, ausgewählt aus Monophosphat, Diphosphat und Triphosphat. Insbesondere die Triphosphat-Variante ist als Substrat interessant.
Analog dazu kann die Gruppe P^* eine 3'-terminale Gruppe bezeichnen, falls das betreffende LNA das 3'-terminale Monomer ist. Beispiele für solche 3'-terminalen Gruppen sind Wasserstoff, Hydroxy, gegebenenfalls substituiertes C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertes C_1-6-Alkylcarbonyloxy, gegebenenfalls substituiertes Aryloxy und -W-A', worin W aus -O-, -S- und -N(R^H)- ausgewählt ist, wobei R^H aus Wasserstoff und C_1-6-Alkyl ausgewählt ist, und worin A' aus DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden ausgewählt ist (wobei die letztgenannten Gruppen einen Abstandshalter wie für den Substituenten B definiert einbinden können).
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das Oligomer die folgende Formel V auf: G-[Nu-L]_n(0)-{[LNA-L]_m(q)-[Nu-L]_n(q)}_q-G* Vworin
q = 1–50 ist;
jedes von n(0), ..., n(q) unabhängig 0–10.000 ist;
jedes von m(1), ..., m(q) unabhängig 1–10.000 ist;
mit der Maßgabe, dass die Summe von n(0), ..., n(q) und m(1), ..., m(q) 2–15.000 ist;
G eine 5'-terminale Gruppe bezeichnet;
jedes Nu unabhängig ein Nucleosid, ausgewählt aus natürlich vorkommenden Nucleosiden und Nucleosidanaloga, bezeichnet;
jedes LNA unabhängig ein Nucleosidanalogon bezeichnet;
jedes L unabhängig eine Internucleosid-Bindung zwischen zwei Gruppen, ausgewählt aus Nu und LNA, bezeichnet, oder L zusammen mit G* eine 3'-terminale Gruppe bezeichnet; und jedes LNA-L ein Nucleosidanalog der allgemeinen Formel I wie zuvor definiert, oder vorzugsweise der allgemeinen Formel Ia wie zuvor definiert, bezeichnet.
Im Rahmen dieser Ausführungsform sowie auch im Allgemeinen stellt die vorliegende Erfindung die faszinierende Möglichkeit bereit, LNAs mit unterschiedlichen Nucleobasen, insbesondere sowohl Nucleobasen ausgewählt aus Thymin, Cytosin und Uracil als auch Nucleobasen ausgewählt aus Adenin und Guanin, einzubinden.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Oligomer weiters ein PNA-Monomer- oder -Oligomersegment der Formel:
worin B wie zuvor für die Formel I definiert ist, AASC Wasserstoff oder eine Aminosäureseitenkette bezeichnet, t = 1–5 und w = 1–50 ist.
Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich die Bezeichnung "Aminosäureseitenkette" auf eine Gruppe, die an das α-Atom einer α-Aminosäure gebunden ist, d.h. entsprechend der betreffenden α-Aminosäure ohne die Glycingruppierung, vorzugsweise eine entweder natürlich vorkommende oder eine leicht erhältliche α-Aminosäure. Veranschaulichende Beispiele sind Wasserstoff (Glycin selbst), Deuterium (deuteriertes Glycin), Methyl (Alanin), Cyanomethyl (β-Cyanoalanin), Ethyl, 1-Propyl (Norvalin), 2-Propyl (Valin), 2-Methyl-1-propyl (Leucin), 2-Hydroxy-2-methyl-1-propyl (β-Hydroxyleucin), 1-Butyl (Norleucin), 2-Butyl (Isoleucin), Methylthioethyl (Methionin), Benzyl (Phenylalanin), p-Aminobenzyl (p-Aminophenylalanin), p-Iodbenzyl (p-Iodphenylalanin), p-Fluorbenzyl (p-Fluorphenylalanin), p-Brombenzyl (p-Bromphenylalanin), p-Chlorbenzyl (p-Chlorphenylalalnin), p-Nitrobenzyl (p-Nitrophenylalanin), 3-Pyridylmethyl (β-(3-Pyridyl)alanin), 3,5-Diiod-4-hydroxybenzyl (3,5-Diiodtyrosin), 3,5-Dibrom-4-hydroxybenzyl (3,5-Dibromtyrosin), 3,5-Dichlor-4-hydroxybenzyl (3,5-Dichlortyrosin), 3,5-Difluor-4-hydroxybenzyl (3,5-Difluortyrosin), 4-Methoxybenzyl (O-Methyltyrosin), 2-Naphtylmethyl (β-(2-Naphtyl)alanin), 1-Naphtylmethyl (β-(1-Naphtyl)alanin), 3- Indolylmethyl (Tryptophan), Hydroxymethyl (Serin), 1-Hydroxyethyl (Threonin), Mercaptomethyl (Cystein), 2-Mercapto-2-propyl (Penicillamin), 4-Hydroxybenzyl (Tyrosin), Aminocarbonylmethyl (Asparagin), 2-Aminocarbonylethyl (Glutamin), Carboxymethyl (Asparaginsäure), 2-Carboxyethyl (Glutaminsäure), Aminomethyl (α,β-Diaminopropionsäure), 2-Aminoethyl (α,γ-Diaminobuttersäure), 3-Aminopropyl (Ornithin), 4-Amino-1-butyl (Lysin), 3-Guanidino-1-propyl (Arginin) und 4-Imidazolylmethyl (Histidin).
Ein PNA-Mono- oder -Oligomersegment kann in ein Oligomer wie in EP 0.672.677 A2 beschrieben eingebunden werden.
Die Oligomere der vorliegenden Erfindung sollen auch chimäre Oligomere abdecken. "Chimäre Oligomere" bezeichnen zwei oder mehr Oligomere mit Monomeren verschiedenen Ursprungs, die entweder direkt oder über einen Abstandshalter verbunden sind. Veranschaulichende Beispiele für solche Oligomere, die kombiniert werden können, sind Peptide, PNA-Oligomere, Oligomere, die LNAs enthalten, und Oligonucleotidoligomere.
Abgesehen von den zuvor definierten Oligomeren stellt die vorliegende Erfindung auch monomere LNAs bereit, die z.B. zur Herstellung von Oligomeren, als Substrate für z.B. Nucleinsäurepolymerasen, Polynucleotidkinasen, terminale Transferasen und als therapeutische Mittel (siehe unten) nützlich sind. Die monomeren LNAs entsprechen in der Gesamtstruktur (insbesondere hinsichtlich der möglichen Biradikale) den als Konstituenten in Oligomeren definierten LNAs, hinsichtlich der Gruppen P und P^* jedoch unterscheiden sich die monomeren LNAs geringfügig, wie nachstehend erklärt wird. Weiters können monomere LNAs Schutzgruppen für funktionelle Gruppen umfassen, insbesondere, wenn die monomeren LNAs durch chemische Synthese in Oligomere einzubinden sind.
Eine interessante Untergruppe der möglichen monomeren LNAs umfasst bizyklische Nucleosidanaloga (LNAs) der allgemeinen Formel II
worin der Substituent B aus Nucleobasen, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden ausgewählt ist; X aus -O-, -S-, -N(R^N*)- und -C(R⁶R^6*)-, vorzugsweise aus -O-, -S- und -N(R^N*)-, ausgewählt ist; einer der Substituenten R², R^2*, R³ und R^3* eine Gruppe Q* ist;
jedes von Q und Q^* unabhängig voneinander aus Wasserstoff, Azido, Halogen, Cyano, Nitro, Hydroxy, Prot-O-, Act-O-, Mercapto, Prot-S-, Act-S-, C_1-6-Alkylthio, Amino, Prot-N(R^H)-, Act-N(R^H)-, Mono- oder Di(C_1-6-alkyl)amino, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyloxy, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkinyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkinyloxy, Monophosphat, Diphosphat, Triphosphat, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen, Liganden, Carboxy, Sulfon, Hydroxymethyl, Prot-O-CH₂-, Act-O-CH₂-, Aminomethyl, Prot-N(R^H)-CH₂-, Act-N(R^H)-CH₂-, Carboxymethyl und Sulfonmethyl ausgewählt ist, worin Prot eine Schutzgruppe für -OH, -SH bzw. -NH(R^H) ist, Act eine Aktivierungsgruppe für -OH, -SH bzw. -NH(R^H) ist und R^H aus Wasserstoff und C_1-6-Alkyl ausgewählt ist;
R^2* und R^4* zusammen ein Biradikal, ausgewählt aus -O-, -S-, -N(R*)-, -(CR*R*)_r+s+1-, -(CR*R*)_r-S-(CR*R*)_s-, -(CR*R*)_r-N(R*)-(CR*R*)_s-, -O-(CR*R*)_r+s-O-, -S-(CR*R*)_r+s-O-, -O-(CR*R*)_r+s-S-, -N(R*)-(CR*R*)_r+s-O-, -O-(CR*R*)_r+s-N(R*)-, -S-(CR*R*)_r+s-S-, -N(R*)-(CR*R*)_r+s-N(R*)-, -N(R*)-(CR*R*)_r+s-S- und -S-(CR*R*)_r+s-N(R*)-, bezeichnen; worin R^* wie zuvor für die Oligomere definiert ist; und jeder der Substituenten R^1*, R², R^2*, R³, R^4*, R⁵ und R^5*, die nicht in Q, Q^* oder das Biradikal eingebunden sind, wie zuvor für die Oligomere definiert ist.
Die monomeren LNAs umfassen auch basische Salze und Säureadditionssalze davon. Weiters gilt anzumerken, dass jede beliebige chemische Gruppe (einschließlich jeder beliebigen Nucleobase), die unter den Bedingungen, die bei chemischer Oligonucleotidsynthese vorherrschen, reaktiv ist, gegebenenfalls wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt Funktionsgruppen-geschützt ist. Dies bedeutet, dass Gruppen wie beispielsweise Hydroxy-, Amino-, Carboxy-, Sulfon- und Mercaptogruppen sowie Nucleobasen eines monomeren LNA gegebenenfalls Funktionsgruppen-geschützt sind. Schutz (und Schutzaufhebung) erfolgt mittels Verfahren, die Fachleuten bekannt sind (siehe z.B. T. W. Greene und P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", 2. Auflage, John Wiley, N. Y. (1991), und M. J. Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press (1984)).
Veranschaulichende Beispiele für Hydroxy-Schutzgruppen sind gegebenenfalls substituiertes Trityl, wie beispielsweise 4,4'-Dimethoxytrityl (DMT), 4-Monomethoxytrityl (MMT) und Trityl, gegebenenfalls substituiertes 9-(9-Phenyl)xanthenyl (Pixyl), gegebenenfalls substituiertes Ethoxycarbonyloxy, p-Phenylazophenyloxycarbonyoxy, Tetrahydropyranyl (thp), 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc), Methoxytetrahydropyranyl (mthp), Silyloxy wie beispielsweise Trimethylsilyl (TMS), Triisopropylsilyl (TIPS), tert-Butyldimethylsilyl (TBDMS), Triethylsilyl und Phenyldimethylsilyl, Benzyloxycarbonyl oder substituierte Benzyloxycarbonylether wie beispielsweise 2-Brombenzyloxycarbonyl, tert-Butylether, Alkylether wie beispielsweise Methylether, Acetale (einschließlich zwei Hydroxygruppen), Acyloxy wie beispielsweise Acetyl oder Halogen-substituierte Acetyle, z.B. Chloracetyl oder Fluoracetyl, Isobutyryl, Pivaloyl, Benzoyl und substituierte Benzoyle, Methoxymethyl (MOM), Benzylether oder substituierte Benzylether wie beispielsweise 2,6-Dichlorbenzyl (2,6-Cl₂Bzl). Alternativ dazu kann die Hydroxygruppe durch Anbindung an einen festen Träger, gegebenenfalls über einen Linker, geschützt sein.
Veranschaulichende Beispiele für Aminoschutzgruppen sind Fmoc (Fluorenylmethoxycarbonyl), BOC (tert-Butyloxycarbonyl), Trifluoracetyl, Allyloxycarbonyl (alloc, AOC), Benzyloxycarbonyl (Z, Cbz), substituierte Benzyloxycarbonyle wie beispielsweise 2-Chlorbenzyloxycarbonyl (2-ClZ), Monomethoxytrityl (MMT), Dimethoxytrityl (DMT), Phthaloyl und 9-(9-Phenyl)xanthenyl (Pixyl).
Veranschaulichende Beispiele für Carboxyschutzgruppen sind Allylester, Methylester, Ethylester, 2-Cyanoethylester, Trimethylsilylethylester, Benzylester (Obzl), 2-Adamantylester (O-2-Ada), Cyclohexylester (OcHex), 1,3-Oxazoline, Oxazoler, 1,3-Oxazolidine, Amide oder Hydrazide.
Veranschaulichende Beispiele für Mercaptoschutzgruppen sind Trityl (Trt), Acetamidomethyl. (acm), Trimethylacetamidomethyl (Tacm), 2,4,6-Trimethoxybenzyl (Tmob), tert-Butylsulfenyl (StBu), 9-Fluorenylmethyl (Fm), 3-Nitro-2-Pyridinsulfenyl (Npys) und 4-Methylbenzyl (Meb).
Weiters kann es erforderlich oder wünschenswert sein, jede Nucleobase zu schützen, die in ein monomeres LNA eingebunden ist, insbesondere wenn das monomere LNA in ein Oligomer gemäß der Erfindung einzubinden ist. Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet die Bezeichnung "geschützte Nucleobasen", dass die betreffende Nucleobase eine Schutzgruppe trägt, die aus den Gruppen, die Fachleuten bekannt sind, ausgewählt ist (siehe z.B. Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Bd. 20 (Sudhir Agrawal, Hrsg.), Humana Press, Totowa, NJ (1993); S. L. Beaucage und R. P. Iyer, Tetrahedron 49, 6123 (1993); S. L. Beaucage und R. P. Iyer, Tetrahedron 48, 2223 (1992); und E. Uhlmann und A. Peyman, Chem. Rev. 90, 543). Veranschaulichende Beispiele hierfür sind Benzoyl, Isobutyryl, tert-Butyl, tert-Butyloxycarbonyl, 4-Chlorbenzyloxycarbonyl, 9-Fluorenylmethyl, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl, 4-Methoxybenzoyl, 4-Methoxytriphenylmethyl, gegebenenfalls substituiertes Triazolo, p-Toluolsulfonyl, gegebenenfalls substituiertes Sulfonyl, Isopropyl, gegebenenfalls substituierte Amidine, gegebenenfalls substituiertes Trityl, Phenoxyacetyl, gegebenenfalls substituiertes Acyl, Pixyl, Tetrahydropyranyl, gegebenenfalls substituierte Silylether und 4-Methoxybenzyloxycarbonyl. Kapitel 1 in "Protocols for oligonucleotide conjugates", Methods in Molecular Biology, Bd. 26 (Sudhir Agrawal, Hrsg.), Humana Press, Totowa; NJ (1993), und S. L. Beaucage und R. P. Iyer, Tetrahedron 48, 2223 (1992), offenbaren weitere geeignete Beispiele.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Gruppe B in einem monomeren LNA vorzugsweise aus Nucleobasen und geschützten Nucleobasen ausgewählt.
In einer Ausführungsform der monomeren LNAs gemäß der vorliegenden Erfindung bezeichnet eines von Q und Q^*, vorzugsweise Q^*, eine Gruppe, die aus Act-O-, Act-S-, Act-N(R^H)-, Act-O-CH₂-, Act-S-CH₂-, Act-N(R^H)-CH₂- ausgewählt ist, und das andere von Q und Q^*, vorzugsweise Q, bezeichnet eine Gruppe, die aus Wasserstoff, Azido, Halogen, Cyano, Nitro, Hydroxy, Prot-O-, Mercapto, Prot-S-, C_1-6-Alkylthio, Amino, Prot-N(R^H)-, Mono- oder Di(C_1-6-alkyl)amino, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyloxy-, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkinyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkinyloxy, Monophosphat, Diphosphat, Triphosphat, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen, Liganden, Carboxy, Sulfon, Hydroxymethyl, Prot-O-CH₂-, Aminomethyl, Prot-N(R^H)-CH₂-, Carboxymethyl, Sulfonmethyl ausgewählt ist, und R^H ist aus Wasserstoff und C_1-6-Alkyl ausgewählt.
Im zuvor beschriebenen Fall bezeichnet die Gruppe Prot eine Schutzgruppe für -OH, -SH bzw. -NH(R^H). Solche Schutzgruppen werden aus denselben wie zuvor für Hydroxyschutzgruppen, Mercaptoschutzgruppen bzw. Aminoschutzgruppen definiert ausgewählt, wobei jedoch der Bedarf an einer stabilen und reversiblen Schutzgruppe in Betracht gezogen wird. Es wird jedoch bevorzugt, dass jede Schutzgruppe für -OH aus gegebenenfalls substituiertem Trityl, wie beispielsweise Dimethoxytrityl (DMT), Monomethoxytrityl (MMT) und Trityl, und 9-(9-Phenyl)xanthenyl (Pixyl), gegebenenfalls substituiert, Tetrahydropyranyl (thp) ausgewählt ist (weitere geeignete Hydroxyschutzgruppen für Phosphoramidit-Oligonucleotidsynthese sind in Agrawal (Hrsg.), "Protocols for Oligonucleotide Conjugates"; Methods in Molecular Biology, Bd. 26, Humana Press, Totowa, NJ (1994), und Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Bd. 20 (Sudhir Agrawal, Hrsg.), Humana Press, Totowa, NJ (1993), beschrieben) oder als Acetal geschützt ist; dass jede Schutzgruppe für -SH aus Trityl, wie beispielsweise Dimethoxytrityl (DMT), Monomethoxytrityl (MMT) und Trityl, und 9-(9-Phenyl)xanthenyl (Pixyl), gegebenenfalls substituiert, Tetrahydropyranyl (thp) ausgewählt ist (weitere geeignete Mercaptoschutzgruppen für Phosphoramidit-Oligonucleotidsynthese sind auch in Agrawal (siehe oben) beschrieben); und dass jede Schutzgruppe für -NH(R^H) aus Trityl, wie beispielsweise Dimethoxytrityl (DMT), Monomethoxytrityl (MMT) und Trityl, und 9-(9-Phenyl)xanthenyl (Pixyl), gegebenenfalls substituiert, Tetrahydropyranyl (thp) ausgewählt ist (weitere geeignete Aminoschutzgruppen für Phosphoramidit-Oligonucleotidsynthese sind auch in Agrawal (siehe oben) beschrieben).
In der zuvor erläuterten Ausführungsform sowie für alle hierin definierten monomeren LNAs bezeichnet Act eine Aktivierungsgruppe für -OH, -SH bzw. -NH(R^H). Solche Aktivierungsgruppen sind z.B. aus gegebenenfalls substituiertem O-Phosphoramidit, gegebenenfalls substituiertem O-Phosphortriester, gegebenenfalls substituiertem O-Phosphordiester, gegebenenfalls substituiertem H-Phosphonat und gegebenenfalls substituiertem O-Phosphonat ausgewählt.
In diesem Kontext bezeichnet "Phosphoramidit" eine Gruppe der Formel -P(OR^x)-N(R^y)₂, worin R^x eine gegebenenfalls substituierte Alkylgruppe, z.B. Methyl, 2-Cyanoethyl, oder Benzyl bezeichnet und jeder R^y gegebenenfalls substituierte Alkylgruppen, z.B. Ethyl oder Isopropyl, bezeichnet oder die Gruppe -N(R^y)₂ eine Morpholingruppe (-N(CH₂CH₂)₂O) bildet. R^x bezeichnet vorzugsweise 2-Cyanoethyl, und die zwei R^y sind vorzugsweise identisch und bezeichnen Isopropyl. Somit ist ein besonders relevantes Phosphoramidit N,N-Diisopropyl-O-(2-cyanoethyl)phosphoramidit.
Es gilt zu verstehen, dass die Schutzgruppen, die hierin für ein einzelnes monomeres LNA oder für mehrere monomere LNAs verwendet werden, so ausgewählt werden können, dass, wenn dieses/diese LNAs) in ein Oligomer gemäß der Erfindung eingebunden wird/werden, es möglich ist, entweder gleichzeitige Schutzaufhebung oder eine aufeinanderfolgende Entschützung der funktionellen Gruppen durchzuführen. Die letztgenannte Situation eröffnet die Möglichkeit, regioselektiv eine oder mehrere "aktive/funktionelle" Gruppen wie beispielsweise DNA-Interkalatoren, photochemisch aktive Gruppen, thermochemisch aktive Gruppen, Chelat bildende Gruppen, Reportergruppen und Liganden einzuführen, worin solche Gruppen über einen Abstandshalter wie zuvor beschrieben angebunden werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist Q aus Wasserstoff, Azido, Halogen, Cyano, Nitro, Hydroxy, Prot-O-, Mercapto, Prot-S-, C_1-6-Alkylthio, Amino, Prot-N(R^H)-, Mono- oder Di(C_1-6-alkyl)amino, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyloxy-, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkinyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkinyloxy, Monophosphat, Diphosphat, Triphosphat, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen, Liganden, Carboxy, Sulfon, Hydroxymethyl, Prot-O-CH₂-, Aminomethyl, Prot-N(R^H)-CH₂-, Carboxymethyl und Sulfonmethyl ausgewählt, worin Prot eine Schutzgruppe für -OH, -SH bzw. -NH(R^H) ist und R^H aus Wasserstoff und C_1-6-Alkyl ausgewählt ist; und Q^* aus Wasserstoff, Azido, Halogen, Cyano, Nitro, Hydroxy, Act-O-, Mercapto, Act-S-, C_1-6-Alkylthio, Amino, Act-N(R^H)-, Mono- oder Di(C_1-6-alkyl)amino, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyloxy-, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkinyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkinyloxy, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen, Liganden, Carboxy und Sulfon ausgewählt ist, worin Act eine Aktivierungsgruppe für -OH, -SH bzw. -NH(R^H) ist und R^H aus Wasserstoff und C_1-6-Alkyl ausgewählt ist.
Die monomeren LNAs der allgemeinen Formel II können, da die LNAs in Oligomere eingebunden sind, verschiedene Stereoisomere darstellen. Somit wird angenommen, dass die zuvor beschriebenen stereochemischen Varianten für die LNAs, die in Oligomere eingebunden sind, im Fall von monomeren LNAs gleich anwendbar sind (wobei es jedoch anzumerken gilt, dass P dann durch Q ersetzt werden sollte).
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das monomere LNA die allgemeine Formel IIa auf:
worin die Substituenten wie zuvor definiert sind.
Weiters gelten hinsichtlich der Definitionen von Substituenten, Biradikalen, R^* usw. dieselben bevorzugten Ausführungsformen wie zuvor für das Oligomer gemäß der Erfindung definiert auch im Fall von monomeren LNAs.
In einer besonders interessanten Ausführungsform der monomeren LNAs der vorliegenden Erfindung bezeichnet B eine Nucleobase, vorzugsweise eine Nucleobase, die aus Thymin, Cytosin, Uracil, Adenin und Guanin (insbesondere Adenin und Guanin) ausgewählt ist, X ist -O-, R^2* und R^4* bezeichnen zusammen ein Biradikal, ausgewählt aus -(CH₂)_0-1-S-(CH₂)_1-3- und -(CH₂)_0-1-N(R^N)-(CH₂)_1-3-, insbesondere -O-CH₂-, -S-CH₂- und -R^N-CH₂-, worin R^N ausgewählt ist aus Wasserstoff und C_1-4-Alkyl, Q Prot-O- bezeichnet, R^3* Q^* ist, das Act-OH bezeichnet, und R^1*, R², R³, R⁵ und R^5* jeweils Wasserstoff bezeichnen. In dieser Ausführungsform kann R^N auch aus DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden ausgewählt sein.
In einer weiteren, besonders interessanten Ausführungsform der monomeren LNAs der vorliegenden Erfindung bezeichnet B eine Nucleobase, vorzugsweise eine Nucleobase, ausgewählt aus Thymin, Cytosin, Uracil, Adenin und Guanin (insbesondere Adenin und Guanin), X ist -O-, R^2* und R^4* bezeichnen zusammen ein Biradikal, ausgewählt aus -(CH₂)_0-1-S-(CH₂)_1-3- und -(CH₂)_0-1-N(R^N)-(CH₂)_1-3-, insbesondere -O-CH₂-, -S-CH₂- und -R^N-CH₂-, worin R^N ausgewählt ist aus Wasserstoff und C_1-4-Alkyl, Q ausgewählt ist aus Wasserstoff, Mercapto, C_1-6-Alkylthio, Amino, Mono- oder Di(C_2-6-alkyl)amino, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyloxy, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkinyloxy-, Monophosphat, Diphosphat und Triphosphat, R^3* Q^* ist, das ausgewählt ist aus Wasserstoff, Azido, Halogen, Cyano, Nitro, Hydroxy, Mercapto, C_1-6-Alkylthio, Amino, Mono- oder Di(C_1-6-alkyl)amino, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyloxy, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkinyl und gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkinyloxy, R³ ausgewählt ist aus Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkinyl, und R^1*, R² und R^5* jeweils Wasserstoff bezeichnen. Hierbei kann R^N auch aus DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden ausgewählt sein.
Ein Aspekt der Erfindung ist es, verschiedene Derivate von LNAs für Festphasen- und/oder Lösungsphasen-Einbindung in ein Oligomer bereitzustellen. Monomere, die sich zur Einbindung von (1S,3R,4R,7S)-7-Hydroxy-1-hydroxymethyl-3-(thymin-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan, (1S,3R,4R,7S)-7-Hydroxy-1-hydroxymethyl-3-(cytosin-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan, (1S,3R,4R,7S)-7-Hydroxy-1-hydroxymethyl-3-(uracil-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan, (1S,3R,4R,7S)-7-Hydroxy-1-hydroxymethyl-3-(guanin-1-yl)-2,5-dioxabicyclo-[2.2.1]heptan und (1S,3R,4R,7S)-7-Hydroxy-1-hydroxymethyl-3-(adenin-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan unter Verwendung des Phosphoramidit-Ansatzes, des Phosphortriester-Ansatzes bzw. des H-Phosphonat-Ansatzes eignen, sind beispielsweise (1R,3R,4R,7S)-7-(2-Cyanoethoxy(diisopropylamino)phosphinoxy)-1-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-3-(thymin-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan, (1R,3R,4R,7S)-7-Hydroxy-1-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-3-(thymin-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan-7-O-(2-chlorphenylphosphat) und (1R,3R,4R,7S)-7-Hydroxy-1-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-3-(thymin-1-y1)-2,5-dioxa bicyclo[2.2.1]heptan-7-O-(H-phosphonat) sowie die 3-(Cytosin-1-yl)-, 3-(Uracil-1-yl)-, 3-(Adenin-1-yl)- bzw. 3-(Guanin-1-yl)-Analoga davon. Weiters wird auch von den Analoga, in denen das Methylenoxybiradikal der Monomere durch ein Methylenthio, ein Methylenamino oder ein 1,2-Ethylenbiradikal ersetzt sind, erwartet, dass sie besonders interessante Varianten im Rahmen der vorliegenden Erfindung darstellen. Von den Methylenthio- und Methylenamino-Analoga wird angenommen, dass sie gleich wie das Methylenoxy-Analogon einsetzbar sind, und daher sollten die spezifischen Reagenzien entsprechend jenen, die für die Einbindung von (1S,3R,4R,7S)-7-Hydroxy-1-hydroxymethyl-3-(thymin-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan, (1S,3R,4R,7S)-7-Hydroxy-1-hydroxymethyl-3-(cytosin-1-yl)-2,5-dioxabicyclo- [2.2.1]heptan, (1S,3R,4R,7S)-7-Hydroxy-1-hydroxymethyl-3-(uracil-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan, (1S,3R,4R,7S)-7-Hydroxy-1-hydroxymethyl-3-(guanin-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan und (1S,3R,4R,7S)-7-Hydroxy-1-hydroxymethyl-3-(adenin-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan erwähnt wurden, auch als besonders interessante reaktive Monomere im Rahmen der vorliegenden Erfindung erachtet werden. Bezüglich des Methylenamin-Analogons gilt anzumerken, dass das sekundäre Amin einen Substituenten, ausgewählt aus gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl wie beispielsweise Methyl und Benzyl, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkylcarbonyl wie beispielsweise Trifluoracetyl, gegebenenfalls substituiertem Arylcarbonyl und gegebenenfalls substituiertem Heteroarylcarbonyl, tragen kann.
In einer besonders interessanten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Oligomer, umfassend zumindest ein LNA der allgemeinen Formel Ia:
worin X -O- ist; B aus Nucleobasen, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden ausgewählt ist; P die Restposition für eine Internucleosid-Bindung zu einem nachfolgenden Monomer oder eine 5'-terminale Gruppe bezeichnet, wobei solche Internucleosid-Bindung oder 5'-terminale Gruppe gegebenenfalls den Substituenten R⁵ einbindet; R^3* eine Gruppe P^* ist, die eine Internucleosid-Bindung zu einem vorangehenden Monomer oder eine 3'-terminale Gruppe bezeichnet; R^2* und R^4* zusammen ein Biradikal, ausgewählt aus -O-, -S-, -N(R*)-, -(CR*R*)_r+s+1-, -(CR*R*)_r-S-(CR*R*)_s-, -(CR*R*)_r-N(R*)-(CR*R*)_s-, -O-(CR*R*)_r+s-O-, -S-(CR*R*)_r+s-O-, -O-(CR*R*)_r+s-S-, -N(R*)-(CR*R*)_r+s-O-, -O-(CR*R*)_r+s-N(R*)-, -S-(CR*R*)_r+s-S-, -N(R*)-(CR*R*)_r+s-N(R*)-, -N(R*)-(CR*R*)_r+s-S- und -S-(CR*R*)_r+s-N(R*)-, bezeichnen; worin jeder R^* unabhängig aus Wasserstoff, Halogen, Azido, Cyano, Nitro, Hydroxy, Mercapto, Amino, Mono- oder Di(C_1-6-alkyl)amino, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden ausgewählt ist und/oder zwei benachbarte (nicht geminale) R* zusammen eine Doppelbindung bezeichnen können, und jedes der r und s im Bereich von 0 bis 3 liegt, mit der Maßgabe, dass die Summe r + s = 1–4 ergibt; jeder der Substituenten R^1*, R², R³, R⁵ und R^5* unabhängig voneinander aus Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyl, Hydroxy, C_1-6-Alkoxy, C_2-6-Alkenyloxy, Carboxy, C_1-6-Alkoxycarbonyl, C_1-6-Alkylcarbonyl, Formyl, Amino, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)amino, Carbamoyl, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)aminocarbonyl, C_1-6-Alkylcarbonylamino, Carbamido, Azido, C_1-6-Alkanoyloxy, Sulfon, Sulfanyl, C_1-6-Alkylthio, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden sowie Halogen ausgewählt ist, worin zwei geminale Substituenten zusammen Oxo bezeichnen können; und basische Salze und Säureadditionssalze davon. Insbesondere ist ein R^* aus Wasserstoff, Hydroxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden ausgewählt, und jeder verbleibende Substituent R^* ist Wasserstoff.
Insbesondere ist das Biradikal aus -O-, -(CH₂)_0-1-O-(CH₂)_1-3-, -(CH₂)_0-1-S-(CH₂)_1-3-, -(CH₂)_0-1-N(R^N)-(CH₂)_1-3 und -(CH₂)_2-4- ausgewählt.
In einem weiteren interessanten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein LNA der allgemeinen Formel IIa:
worin X -O- ist; B aus Nucleobasen, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden ausgewählt ist; R^3* eine Gruppe Q^* ist; jedes von Q und Q^* unabhängig voneinander aus Wasserstoff, Azido, Halogen, Cyano, Nitro, Hydroxy, Prot-O-, Act-O-, Mercapto, Prot-S-, Act-S-, C_1-6-Alkylthio, Amino, Prot-N(R^H)-, Act-N(R^H)-, Mono- oder Di(C_1-6-alkyl)amino, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyloxy, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkinyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkinyloxy, Monophosphat, Diphosphat, Triphosphat, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden, Carboxy, Sulfon, Hydroxymethyl, Prot-O-CH₂-, Act-O-CH₂-, Aminomethyl, Prot-N(R^H)-CH₂-, Act-N(R^H)-CH₂-, Carboxymethyl und Sulfonmethyl ausgewählt ist, worin Prot eine Schutzgruppe für -OH, -SH bzw. -NH(R^H) ist, Act eine Aktivierungsgruppe für -OH, -SH bzw. -NH(R^H) ist und R^H aus Wasserstoff und C_1-6-Alkyl ausgewählt ist; R^2* und R^4* zusammen ein Biradikal, ausgewählt aus -O-, -S-, -N(R*)-, -(CR*R*)_r+s+1-, -(CR*R*)_r-S-(CR*R*)_s-, -(CR*R*)_r-N(R*)-(CR*R*)_s-, -O-(CR*R*)_r+s-O-, -S-(CR*R*)_r+s-O-, -O-(CR*R*)_r+s-S-, -N(R*)-(CR*R*)_r+s-O-, -O-(CR*R*)_r+s-N(R*)-, -S-(CR*R*)_r+s-S-, -N(R*)-(CR*R*)_r+s-N(R*)-, -N(R*)-(CR*R*)_r+s-S- und -S-(CR*R*)_r+s-N(R*)-, bezeichnen; worin jeder R^* unabhängig aus Wasserstoff, Halogen, Azido, Cyano, Nitro, Hydroxy, Mercapto, Amino, Mono- oder Di(C_1-6-alkyl)amino, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden ausgewählt ist und/oder zwei benachbarte (nicht geminale) R* zusammen eine Doppelbindung bezeichnen können, und jedes der r und s im Bereich von 0 bis 3 liegt, mit der Maßgabe, dass die Summe r + s = 1–4 ergibt; jeder der Substituenten R^1*, R², R³, R⁵ und R^5* unabhängig voneinander aus Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyl, Hydroxy, C_1-6-Alkoxy, C_2-6-Alkenyloxy, Carboxy, C_1-6-Alkoxycarbonyl, C_1-6-Alkylcarbonyl, Formyl, Amino, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)amino, Carbamoyl, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)aminocarbonyl, C_1-6-Alkylcarbonylamino, Carbamido, Azido, C_1-6-Alkanoyloxy, Sulfon, Sulfanyl, C_1-6-Alkylthio, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden sowie Halogen ausgewählt ist, worin zwei geminale Substituenten zusammen Oxo bezeichnen können; und basische Salze und Säureadditionssalze davon; und mit der Maßgabe, dass jede chemische Gruppe (einschließlich jeder Nucleobase), die unter den bei Oligonucleotidsynthese vorherrschenden Bedingungen reaktiv ist, gegebenenfalls Funktionsgruppengeschützt ist. Vorzugsweise ist ein R^* aus Wasserstoff, Hydroxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden ausgewählt, und jeder verbleibende Substituent R^* ist Wasserstoff. Insbesondere ist das Biradikal aus -O-, -(CH₂)_0-1-S-(CH₂)_1-3-, -(CH₂)_0-1-N(R^N)-(CH₂)_1-3- und -(CH₂)_2-4- ausgewählt.
Im Allgemeinen stellt die vorliegende Erfindung Oligomere mit überraschend guten Hybridisierungseigenschaften in Bezug auf Affinität und Spezifität bereit. So stellt die vorliegende Erfindung ein Oligomer bereit, das zumindest ein Nucleosidanalogon umfasst, das dem Oligomer eine T_m mit einem komplementären DNA-Oligonucleotid verleiht, die zumindest um 2,5°C höher, vorzugsweise um zumindest 3,5°C höher, insbesondere um zumindest 4,0°C höher, ganz besonders um zumindest 5,0°C höher, als jene des entsprechenden, nicht modifizierten Bezugs-Oligonucleotids, das kein Nucleosidanalogon umfasst. Insbesondere ist die T_m des Oligomers um zumindest 2,5 × N°C höher, vorzugsweise um zumindest 3,5 × N°C höher, insbesondere um zumindest 4,0 × N°C höher, und ganz besonders um 5,0 × N°C höher, worin N die Anzahl an Nucleosidanaloga darstellt.
Im Fall von Hybridisierung mit einem komplementären RNA-Oligonucleotid verleiht das zumindest eine Nucleosidanalogon dem Oligomer eine T_m mit dem komplementären DNA-Oligonucleotid, die zumindest 4,0°C höher, vorzugsweise zumindest 5,0°C höher, insbesondere zumindest 6,0°C höher, und ganz besonders 7,0°C höher, als jene des entsprechenden, nicht modifizierten Bezugs-Oligonucleotids ist, das kein Nucleosidanalogon umfasst. Insbesondere ist die T_m des Oligomers um zumindest 4,0 × N °C höher, vorzugsweise um zumindest 5,0 × N°C höher, insbesondere um zumindest 6,0 × N°C höher, und ganz besonders um 7,0 × N°C höher, worin N die Anzahl an Nucleosidanaloga darstellt.
Die Bezeichnung "entsprechendes, nicht modifiziertes Bezugs-Oligonucleotid" bezieht sich auf ein Oligonucleotid, das einzig aus natürlich vorkommenden Nucleotiden besteht, die dieselben Nucleobasen in derselben absoluten Reihenfolge (und derselben Ausrichtung) aufweist.
Die T_m wird unter einer der folgenden Bedingungen (d.h. im Wesentlichen wie in Beispiel 129 veranschaulicht) gemessen:

a) 10 mM Na₂HPO₄, pH 7,0, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA;
b) 10 mM Na₂HPO₄, pH 7,0, 0,1 mM EDTA; oder
c) 3 M Tetramethylammoniumchlorid (TMAC), 10 mM Na₂HPO₄, pH 7,0, 0,1 mM EDTA;

Das Oligomer ist vorzugsweise wie zuvor definiert, worin das zumindest eine Nucleosidanalogon der Formel I entspricht, worin B eine Nucleobase ist. Besonders interessant sind Fälle, bei denen zumindest ein Nucleosidanalogon eine Nucleobase umfasst, die aus Adenin und Guanin ausgewählt ist.
Weiters sollte hinsichtlich der Spezifität und Affinität das Oligomer, wenn es mit einem teilweise komplementären DNA-Oligonucleotid oder einem teilweise komplementären RNA-Oligonucleotid, das eine oder mehrere Fehlpaarungen mit diesem Oligomer aufweist, hybridisiert wird, einen Rückgang der T_m als Resultat dieser Fehlpaarungen aufweisen, der größer oder gleich jenem Rückgang ist, der bei dem entsprechenden, nicht modifizierten Bezugs-Oligonucleotid beobachtet werden sollte, das keine Nucleosidanaloga aufweist. Auch sollte das Oligomer im Wesentlichen dieselbe Empfindlichkeit der T_m gegenüber der Ionenstärke des Hybridisierungspuffers aufweisen wie das entsprechende, nicht modifizierte Bezugs-Oligonucleotid.
Oligomere, die hierin definiert sind, sind typischerweise zu zumindest 30%, vorzugsweise zu zumindest 50%, insbesondere zu 70%, und in manchen interessanten Anwendungen zu 100%, modifiziert.
Das Oligomer der Erfindung weist wesentlich höhere 3'-exonucleolytische Stabilität auf als das entsprechende, nicht modifizierte Bezugs-Oligonucleotid. Diese wichtige Eigenschaft kann wie in Beispiel 136 beschrieben untersucht werden.
Definitionen
Im vorliegenden Zusammenhang bezeichnet "C_1-12-Alkyl" eine unverzweigte, zyklische oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Cyclopropyl, Butyl, tert-Butyl, Isobutyl, Cyclobutyl, Pentyl, Cyclopentyl, Hexyl, Cyclohexyl und Dodecyl. Analog dazu bezeichnet "C_1-6-Alkyl" eine unverzweigte, zyklische oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Pentyl, Cyclopentyl, Hexyl und Cyclohexyl, und die Bezeichnung "C_1-4-Alkyl" soll unverzweigte, zyklische oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen abdecken, z.B. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Cyclopropyl, Butyl, Isobutyl, tert-Butyl und Cyclobutyl.
Bevorzugte Beispiele für "C_1-6-Alkyl" sind Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, tert-Butyl, Isobutyl, Pentyl, Cyclopentyl, Hexyl, Cyclohexyl, insbesondere Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, tert-Butyl, Isobutyl und Cyclohexyl. Bevorzugte Beispiele für "C_1-4-Alkyl" sind Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, tert-Butyl und Isobutyl.
Demähnlich deckt die Bezeichnung "C_2-12-Alkenyl" unverzweigte, zyklische oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppen mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen ab, die eine ungesättigte Bindung aufweisen. Beispiele für Alkenylgruppen sind Vinyl, Allyl, Butenyl, Pentenyl, Hexenyl, Heptenyl, Octenyl und Dodecaenyl. Analog dazu soll die Bezeichnung "C_2-6-Alkenyl" unverzweigte, zyklische oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppen mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und einer ungesättigten Bindung abdecken. Bevorzugte Beispiele für Alkenyl sind Vinyl, Allyl, Butenyl, insbesondere Allyl.
Demähnlich bezieht sich die Bezeichnung "C_2-12-Alkinyl" auf eine unverzweigte oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen und einer Dreifachbindung. Beispiele hierfür sind Ethinyl, Propinyl, Butinyl, Octinyl und Dodecanyl.
Im vorliegenden Zusammenhang, d.h. in Verbindung mit den Bezeichnungen "Alkyl", "Alkenyl" und "Alkinyl", bedeutet die Bezeichnung "gegebenenfalls substituiert", dass die betreffende Gruppe ein- oder mehrmals, vorzugsweise 1- bis 3-mal, mit (einer) Gruppe(n) substituiert sein kann, die aus Hydroxy (das, wenn an ein ungesättigtes Kohlenstoffatom gebunden, in der tautomeren Ketoform vorliegen kann), C_1-6-Alkoxy (d.h. C_1-6-Alkyloxy), C_2-6-Alkenyloxy, Carboxy, Oxo (das eine Keto- oder Aldehydfunktionalität bildet), C_1-6-Alkoxycarbonyl, C_1-6-Alkylcarbonyl, Formyl, Aryl, Aryloxycarbonyl, Aryloxy, Arylcarbonyl, Heteroaryl, Heteroaryloxycarbonyl, Heteroaryloxy, Heteroarylcarbonyl, Amino, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)amino; Carbamoyl, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)aminocarbonyl, Amino-C_1-6-alkylaminocarbonyl, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)amino-C_1-6-alkylaminocarbonyl, C_1-6-Alkylcarbonylamino, Cyano, Guanidino, Carbamido, C_1-6-Alkanoyloxy, Sulfon, C_1-6-Alkylsulfonyloxy, Nitro, Sulfanyl, C_1-6-Alkylthio und Halogen ausgewählt ist, worin jedes Aryl und Heteroaryl wie spezifisch nachstehend für "gegebenenfalls substituiertes Aryl und Heteroaryl" beschrieben wird substituiert sein kann.
Vorzugsweise sind die Substituenten aus Hydroxy, C_1-6-Alkoxy, Carboxy, C_1-6-Alkoxycarbonyl, C_1-6-Alkylcarbonyl, Formyl, Aryl, Aryloxycarbonyl, Arylcarbonyl, Heteroaryl, Amino, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)amino, Carbamoyl, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)aminocarbonyl, Amino-C_1-6-alkylaminocarbonyl, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)amino-C_1-6-alkylaminocarbonyl, C_1-6-Alkylcarbonylamino, Cyano, Carbamido und Halogen ausgewählt, worin Aryl und Heteroaryl 1- bis 5-mal, vorzugsweise 1- bis 3-mal, mit C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Nitro, Cyano, Amino oder Halogen substituiert sein können. Insbesonders bevorzugte Beispiele sind Hydroxy, C_1-6-Alkoxy, Carboxy, Aryl, Heteroaryl, Amino, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)amino und Halogen, worin Aryl und Heteroaryl 1- bis 3-mal mit C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Nitro, Cyano, Amino oder Halogen substituiert sein können.
Im vorliegenden Zusammenhang bezeichnet "Aryl" ein(en) vollständig oder teilweise aromatischen/s carbozylischen/s Ring oder Ringsystem, wie beispielsweise Phenyl, Naphthyl, 1,2,3,4-Tetrahydronaphthyl, Anthracyl, Phenanthracyl, Pyrenyl, Benzopyrenyl, Flurenyl und Xanthenyl, worunter Phenyl ein bevorzugtes Beispiel ist.
Die Bezeichnung "Heteroaryl" bezieht sich auf ein(en) vollständig oder teilweise aromatischen/s Ring oder Ringsystem, worin eines oder mehrere der Kohlenstoffatome durch Heteroatome, z.B. Stickstoff- (=N- oder -NH), Schwefel- und/oder Sauerstoffatome, ersetzt wurden. Beispiele für solche Heteroarylgruppen sind Oxazolyl, Isoxazolyl, Thiazolyl, Isothiazolyl, Pyrrolyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Pyridinyl, Pyrazinyl, Pyridazinyl, Piperidinyl, Cumaryl, Furyl, Chinolyl, Benzothiazolyl, Benzotriazolyl, Benzodiazolyl, Benzooxozolyl, Phthalazinyl, Phthalanyl, Triazolyl, Tetrazolyl, Isochinolyl, Acridinyl, Carbazolyl, Dibenzazepinyl, Indolyl, Benzopyrazolyl und Phenoxazonyl.
Im vorliegenden Zusammenhang, d.h. in Verbindung mit den Bezeichnungen "Aryl" und "Heteroaryl", bedeutet die Bezeichnung "gegebenenfalls substituiert", dass die betreffende Gruppe ein- oder mehrmals, vorzugsweise 1- bis 5-mal, insbesondere 1- bis 3-mal, mit (einer) Gruppe(n) substituiert sein kann, die aus Hydroxy (das, wenn an ein ungesättigtes Kohlenstoffatom gebunden, in der tautomeren Ketoform vorliegen kann), C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkoxy, Oxo (das in der tautomeren Enolform vorliegen kann), Carboxy, C_1-6-Alkoxycarbonyl, C_1-6-Alkylcarbonyl, Formyl, Aryl, Aryloxy, Aryloxycarbonyl, Arylcarbonyl, Heteroaryl, Amino, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)amino; Carbamoyl, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)aminocarbonyl, Amino-C_1-6-alkylaminocarbonyl, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)amino-C_1-6-alkylaminocarbonyl, C_1-6-Alkylcarbonylamino, Cyano, Guanidino, Carbamido, C_1-6-Alkanoyloxy, Sulfon, C_1-6-Alkylsulfonyloxy, Nitro, Sulfanyl, Dihalogen-C_1-4-alkyl, Trihalogen-C_1-4-alkyl und Halogen ausgewählt ist, worin Aryl und Heteroaryl, die Substituenten darstellen, 1- bis 3-mal mit C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Nitro, Cyano, Amino oder Halogen substituiert sein können. Bevorzugte Beispiele sind Hydroxy, C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkoxy, Carboxy, C_1-6-Alkoxycarbonyl, C_1-6-Alkylcarbonyl, Aryl, Amino, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)amino und Halogen, worin Aryl 1- bis 3-mal mit C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Nitro, Cyano, Amino oder Halogen substituiert sein kann.
"Halogen" schließt Fluor, Chlor, Brom und Iod ein.
Es gilt zu verstehen, dass Oligomere (worin LNAs eingebunden sind) und LNAs als solche mögliche Salze davon einbinden, von denen pharmazeutisch annehmbare Salze besonders relevant sind. Salze schließen Säureadditionssalze und basische Salze ein. Beispiele für Säureadditionssalze sind Hydrochloridsalze, Natriumsalze, Calciumsalze, Kaliumsalze usw. Beispiele für basische Salze sind Salze, in denen das (verbleibende) Gegenion aus Alkalimetallen, wie beispielsweise Natrium und Kalium, Erdalkalimetallen, wie beispielsweise Calcium, und Ammoniumionen (⁺N(R^g)₃R^h, worin jeder von R^g und R^h unabhängig voneinander gegebenenfalls substituiertes C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiertes C_2-6-Alkenyl, gegebenenfalls substituiertes Aryl oder gegebenenfalls substituiertes Heteroaryl bezeichnet) ausgewählt ist. Pharmazeutisch annehmbare Salze sind z.B. jene, die in Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Auflage, Ed. Alfonso R. Gennaro (Hrsg.), Mack Publishing Company, Easton, PA, USA (1985), und in jüngeren Auflagen und in der Encyclopedia of Pharmaceutical Technology beschrieben werden. Somit soll die Bezeichnung "ein Säureadditionssalz oder ein basisches Salz davon" hierin solche Salze umfassen. Weiters können die Oligomere und LNAs sowie jedes beliebige Zwischenprodukt oder Ausgangsmaterial hierfür auch in Hydratform vorliegen.
Herstellung von Monomeren
In einer bevorzugten Ausführungsform wurden Nucleoside, die einen zusätzlichen 2'-O,4'-C-gebundenen Ring enthielten, mittels des folgenden Verfahrens synthetisiert:
Über die Synthese zahlreicher 4'-C-Hydroxymethylnucleoside wurde bereits berichtet (R. D. Youssefyeh, J. P. H. Verheyden und J. G. Moffatt, J. Org. Chem., 1979, 44, 1301; G. H. Jones, M. Taniguchi, D. Tegg und J. G. Moffatt, J. Org. Chem., 1979, 44, 1309; C. O-Yang, H. Y. Wu, E. B. Fraser-Smith und K. A. M. Walker, Tetrahedron Lett., 1992, 33, 37; H. Thrane, J. Fensholdt, M. Regner und J. Wengel, Tetrahedron, 1995, 51, 10389; K. D. Nielsen, F. Kirpekar, P. Roepstorff und J. Wengel, Bioorg. Med. Chem., 1995, 3, 1493).
Als ein Beispiel für die Synthese von 2'-O,4'-C-gebundenen bizyklischen Nucleosiden wählten die Erfinder eine Strategie, die von 4'-C-Hydroxymethylfuranose-Derivat 31 ausging. Benzylierung, Acetylierung und Acetolyse, gefolgt von einer weiteren Acetylierung ergab Furanose 33, ein zentrales Zwischenprodukt für Nucleosid-Bindung. Stereoselektive Reaktion mit silyliertem Thymin bildete Verbindung 34, die deacetyliert wurde, um das Nucleosiddiol 35 zu ergeben. Tosylierung gefolgt von baseninduziertem Ringschluss bildete das 2'-O,4'-C-gebundene bizyklische Nucleosidderivat 36. Debenzylierung ergab das ungeschützte bizyklische Nucleosidanalogon 37, das zum 5'-O-4,4'-Dimethoxytrityl-geschützten Analogon 38 und weiters zum Phosphoramidit-Derivat 39 für Oligonucleotid-Synthese umgesetzt wurde. Ein ähnliches Verfahren wurde für die Synthese der entsprechenden Uracil-, Adenin-, Cytosin- und Guanin-Nucleoside verwendet, wie im Abschnitt der Beispiele dargestellt ist. Dieses Bindungsverfahren ist nur eine von mehreren Möglichkeiten, die Fachleuten bekannt sind. Auch ein Verfahren, das von einem vorgeformten Nucleosid ausgeht, ist möglich. So wurde beispielsweise die Umsetzung von Uridinderivat 62 zu Derivat 44 durch Tosylierung, Deisopropylidinierung und baseninduziertem Ringschluss erfolgreich durchgeführt. In einem anderen Beispiel wurde die Umsetzung von Nucleosid 67 zu Nucleosid 61B wie in 34 dargestellt durchgeführt. Die Umsetzung des bizyklischen Thyminnucleosids 37 zu dem entsprechenden 5-Methylcytosinnucleosid 65 wurde durch eine bekannte Reaktionssequenz unter Verwendung von Triazol und POCl₃, gefolgt von Benzoylierung und Behandlung mit Ammoniak, durchgeführt. Ein ähnliches Verfahren sollte für die Synthese von 57C aus 44 anwendbar sein. Ein weiteres Beispiel für mögliche Vorgehensweisen ist das Binden von präzyklisierten Furanose-Derivaten, die bereits einen zusätzlichen Ring mit Nucleobase-Derivaten enthalten. Solch eine Vorgehensweise würde zusätzlich die Herstellung der entsprechenden α-Nucleosidanaloga ermöglichen. Beim Binden mit einem geschützten Methylfuranosid von 4-C,2-O-Methylen-D-Ribofuranose erhielten die Erfinder hauptsächlich ein Produkt mit geöffnetem Ring. Das Binden von 1-O-Acetylfuranose 207 oder Thiophenylfuranose 212 ergab jedoch erfolgreich LNA-Nucleoside mit den α-Anomeren als ein Produkt. Die Einbindung solcher α-LNA-Nucleoside ist unter Verwendung der herkömmlichen Oligomerisationsverfahren (wie für die LNA-Oligomere, die Z enthalten) möglich, wobei α-LNA-Oligomere erhalten werden. Darüber hinaus ist ein synthetisches Verfahren, bei dem Nucleosidbindung unter Verwendung einer 4'-C-Hydroxymethylfuranose, die bereits für Ringschluss aktiviert ist (z.B. durch Beinhalten einer Mesyl- oder Tosylgruppe an der 4'-C-Hydroxymethylgruppe), erfolgt, möglich, wie durch das Beispiel der Umsetzung von Furanose 78 zu Nucleosid 79, gefolgt von Entschützung und Ringschluss, um 36 zu ergeben, gezeigt wird. Chemische oder enzymatische Transglykosylierung oder Anomerisation von geeigneten Furanose-Derivaten oder Nucleosiden sind wiederum andere mögliche Syntheseverfahren. Diese und andere ähnliche Vorgehensweisen ermöglichen die Synthese von bizyklischen Nucleosiden, die andere Nucleobasen oder Analoga davon enthalten, entweder durch Binden mit diesen Nucleobasen oder Analoga oder ausgehend von vorgeformten Nucleosid-Derivaten.
Die beschriebenen Beispiele sind als Veranschaulichung für die Verfahren und Beispiele dieser Erfindung gedacht. Die Strukturen der synthetisierten Verbindungen wurden unter Verwendung von 1D- oder 2D-NMR-Verfahren, z.B. NOE-Experimenten, überprüft.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von bizyklischen Nucleosiden, die zusätzliche Ringe unterschiedlicher Größe und mit unterschiedlichen chemischen Strukturen enthalten. Von den beschriebenen Verfahren geht für Fachleute auf dem Gebiet der organischen Synthese eindeutig hervor, dass Zyklisieren anderer Nucleoside unter Verwendung ähnlicher Verfahren möglich ist, auch das Zyklisieren von Nucleosiden, die verschiedene C-Verzweigungen enthalten. Fachleute werden in der Lage sein, in der Literatur Ideen und Leitfäden zur Herstellung substituierter Nucleosidanalogon-Zwischenprodukte zu finden, so z.B. in WO 96/14329. Bezüglich Ringe unterschiedlicher chemischer Zusammensetzungen ist es eindeutig, dass unter Verwendung von ähnlichen Verfahren oder von Verfahren, die auf dem Gebiet der organischen Chemie durchwegs bekannt sind, die Synthese von beispielsweise Thio-Analoga aus den beispielsweise dargestellten Oxo-Analoga gleichfalls möglich ist wie die Synthese der entsprechenden Amino-Analoga (unter Verwendung von nucleophilen Substitutionsreaktionen oder reduktiver Alkylierung beispielsweise).
Im Abschnitt zu den Beispielen wird die Synthese der Amino-LNA-Analoga 73–74F beschrieben. Die Umsetzung von 74 und 74D zu herkömmlichen Grundbausteinen für Oligomerisation war durch 5'-O-DMT-Schutz und 3'-O-Phosphitylierung gemäß den Standardverfahren möglich. Für das Amino-LNA-Analogon ist der Schutz der 2'-Amino-Funktionalität für kontrollierte lineare Oligomerisation erforderlich. Solcher Schutz kann unter Verwendung von herkömmlichen Aminogruppenschutz-Verfahren wie z.B. Fmoc, Trifluoracetyl oder BOC erfolgen. Alternativ dazu kann eine N-Alkylgruppe (z.B. Benzyl, Methyl, Ethyl, Propyl oder funktionalisiertes Alkyl) während der Nucleosidtransformation und Oligomerisation auch beibehalten werden. In den 35 und 36 sind Vorgehensweisen unter Verwendung von N-Trifluoracetyl- und N-Methyl-Derivaten gezeigt. Wie in 37 hervorgehoben wird, wurde die Umsetzung von Nucleosid 75 zu dem 2'-Thio-LNA-Nucleosidanalogon 76D erfolgreich durchgeführt, wie auch die folgenden Synthesen des Phosphoramidit-Derivats 76F.
Verbindung 76F weist die erforderliche Struktur für automatisierte Synthese von 2'-Thio-LNA-Oligonucleotiden auf. Das N-Trifluoracetyl-2'-Amino-LNA-Synthon 74A weist die erforderliche Struktur für automatisierte Synthese von 2'-Amino-LNA-Oligonucleotiden auf.
Die Synthese der entsprechenden Cytosin-, Guanin- und Adenin-Derivate der 2'-Thio- und 2'-Amino-LNA-Nucleoside kann unter Verwendung von Vorgehensweisen durchgeführt werden, die analog zu jenen in den 35, 36 und 37 gezeigten sind. Alternativ dazu kann die Stereochemie rund um C-2' vor den Zyklisierungen unter Verwendung eines geeignet konfigurierten, z.B. eines Arabino-konfigurierten, Furanosesynthons oder durch Umkehren der Konfiguration rund um das C-2'-Kohlenstoffatom, beginnend bei einer Ribo-konfigurierten Nucleosid/Furanose, invertiert werden. Die darauf folgende Aktivierung des 2'-β-OH, z.B. durch Tosylierung, doppelter nucleophiler Substitution wie im zuvor beschriebenen Uracil/Thymin-Beispiel, könnte die erwünschten bizyklischen 2'-Thio-LNA- oder 2'-Amino-LNA-Nucleoside liefern. Die so erhaltenen und geeignet geschützten Cytosin-, Guanin- und Adenin-Analoga können unter Verwendung von herkömmlichen Reaktionen (DMT-Schutz und Phosphitylierung) wie zuvor für andere Beispiele beschrieben auf Oligomerisation vorbereitet werden.
Herstellung von Oligomeren
Unverzweigte, verzweigte (M. Grøtli und B. S. Sproat, J. Chem. Soc., Chem. Commun. 495 (1995); R. H. E. Hudson und M. J. Damha, J. Am. Chem. Soc. 115, 2119 (1993); M. Von Büren, G. V. Petersen, K. Rasmussen, G. Brandenburg, J. Wengel und F. Kirpekar, Tetrahedron 51, 8491 (1995)) und zyklische (G. Prakash und E. T. Kool, J. Am. Chem. Soc. 114, 3523 (1992)) Oligo- und Polynucleotide der Erfindung können unter Verwendung der Polymerisationsverfahren aus dem Bereich der Nucleinsäure-Chemie, die Fachleuten auf dem Gebiet der organischen Chemie durchwegs bekannt sind, hergestellt werden. Phosphoramidit-Chemie (S. L. Beaucage und R. P. Iyer, Tetrahedron 49, 6123 (1993); S. L. Beaucage und R. P. Iyer, Tetrahedron 48, 2223 (1992)) wurde eingesetzt, doch H-Phosphonat-Chemie, Phosphortriester-Chemie oder enzymatische Synthese z.B. könnte auch verwendet werden. Im Allgemeinen wurden Standard-Bindungsbedingungen und der Phosphoramidit-Ansatz verwendet, wobei jedoch für manche Monomere der Erfindung eine länger Bindungszeit und/oder wiederholtes Binden mit frischen Reagenzien und/oder die Verwendung von stärker konzentrierten Bindungsreagenzien eingesetzt wurden. Als eine andere Möglichkeit könnten auch aktivere Aktivatoren als 1H-Tetrazol verwendet werden, um die Geschwindigkeit der Bindungsreaktion zu steigern. Die Phosphoramidite 39, 46, 53, 57D, 61D und 66 banden sich mit zufrieden stellenden, > 95%igen schrittweisen Bindungsausbeuten. Ein reines Thiophosphat-LNA-Oligomer (Tabelle 7) wurde unter Verwendung von Standardverfahren synthetisiert. So wurde durch Austauschen der normalen, z.B. Iod/Pyridin/H₂O-, Oxidation, die für Synthese von Phosphordiester-Oligomeren verwendet wird, gegen eine Oxidation unter Verwendung von Beaucage-Reagens (im Handel erhältlich) das Thiophosphat-LNA-Oligomer effizient synthetisiert (schrittweise Bindungsausbeute ≥ 98%). Die 2'-Amino-LNA- und 2'-Methylamino-LNA-Oligonucleotide (Tabelle 9) wurden unter Verwendung von Amiditen 74A und 74F effizient synthetisiert (schrittweise Bindungsausbeute ≥ 98%). Die 2'-Thio-LNA-Oligonucleotide (Tabelle 8) wurden unter Verwendung von Amidit 76F mittels herkömmlichen Phosphoramidit-Verfahren wie zuvor für LNA-Oligonucleotide beschrieben effizient synthetisiert. Nach der Synthese der erwünschten Sequenz wurde die Arbeit unter Verwendung von Standardbedingungen fortgesetzt (Spaltung vom festen Träger und Entfernen von Schutzgruppen unter Verwendung von 30% Ammoniak bei 55°C 5 h lang). Die Reinigung von LNA-Oligonucleotiden erfolgte unter Verwendung von Einweg-Umkehrphasenreinigungs-Kassetten und/oder von Umkehrphasen-HPLC und/oder Fällung aus Ethanol oder Butanol. Kapillargelelektrophorese, Umkehrphasen-HPLC und MALDI-MS wurden eingesetzt, um die Reinheit der synthetisierten Oligonucleotid-Analoga zu überprüfen und um sicherzustellen, dass die erwünschte Anzahl an bizyklischen Nucleosidanaloga der Erfindung wie geplant eingebunden war.
Ein zusätzlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren für Oligonucleotid-Analoga, die LNA enthalten, das über nicht natürliche Internucleosid-Bindungen gebunden ist. Beispielsweise ist die Synthese der entsprechenden Thiophosphat- oder Phosphoramidat-Analoga unter Verwendung von durchwegs bekannten Vorgehensweisen auf dem Gebiet der Oligonucleotid-Chemie möglich (Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Bd. 20 (Sudhir Agrawal, Hrsg.), Humana Press, Totowa, NJ (1993); S. L. Beaucage und R. P. Iyer, Tetrahedron 49, 6123 (1993); S. L. Beaucage und R. P. Iyer, Tetrahedron 48, 2223 (1992); E. Uhlmann und A. Peyman, Chem. Rev. 90, 543).
Somit stellt die vorliegende Erfindung im Allgemeinen die Verwendung eines LNA wie hierin definiert zur Herstellung eines LNA-modifizierten Oligonucleotids bereit. Es gilt zu verstehen, dass LNA-modifiziertes Oligonucleotid normale Nucleoside (d.h. natürlich vorkommende Nucleoside wie beispielsweise Ribonucleoside und/oder Dioxyribonucleoside) sowie modifizierte Nucleoside umfassen kann, die sich von jenen unterscheiden, die durch die allgemeine Formel II definiert sind. In einer besonders interessanten Ausführungsform moduliert die Einbindung von LNA die Fähigkeit des Oligonucleotids, als ein Substrat für aktive Nucleinsäure-Enzyme zu wirken.
Weiters sind feste Trägermaterialien, die ein gegebenenfalls Nucleobasen-geschütztes und gegebenenfalls 5'-OH-geschütztes LNA darauf immobilisiert tragen, besonders interessant als Materialien für die Synthese von LNA-modifizierten Oligonucleotiden, in die ein LNA-Monomer am 3'-Ende eingebunden ist. In diesem Fall ist das feste Trägermaterial vorzugsweise CPG, z.B. ein leicht (im Handel) erhältliches CPG-Material, an das ein 3'-funktionalisiertes, gegebenenfalls Nucleobasen-geschütztes und gegebenenfalls 5'-OH-geschütztes LNA unter Verwendung der vom Hersteller für das bestimmte Material vorgegebenen Bedingungen gebunden wird. BioGenex Universial CPG Support (BioGenex, USA) kann z.B. verwendet werden. Die 5'-OH-Schutzgruppe kann z.B. eine DMT-Gruppe sein. 3'-funktionelle Gruppen sollten unter Berücksichtigung der für das betreffende CPG-Material anwendbaren Bedingungen ausgewählt werden.
Anwendungen
Die vorliegende Erfindung offenbart die überraschende Entdeckung, dass verschiedene neue Derivate von bizyklischen Nucleosidmonomeren (LNAs), wenn sie in Oligonucleotide eingebunden sind, die Affinität dieser modifizierten Oligonucleotide sowohl für komplementäre ssDNA als auch ssRNA im Vergleich zu den nicht modifizierten Oligonucleotiden drastisch steigert. Weiters offenbart sie die überraschende Entdeckung, dass sowohl vollständig aus auch teilweise LNA-modifizierte Oligonucleotide stark erhöhte Hybridisierungseigenschaften gegenüber ihren komplementären Nucleinsäuresequenzen aufweisen. Je nach Anwendung bietet also die Verwendung dieser LNAs die faszinierende Möglichkeit, entweder die Affinität eines Standard-Oligonucleotids stark zu erhöhen, ohne die Spezifität zu beeinträchtigen (konstante Größe des Oligonucleotids) oder die Spezifität signifikant zu steigern, ohne die Affinität zu beeinträchtigen (Reduktion der Größe des Oligonucleotids). Die vorliegende Erfindung offenbart auch die unerwartete Entdeckung, dass LNA-modifizierte Oligonucleotide zusätzlich zu stark gesteigerten Hybridisierungseigenschaften zahlreiche der nützlichen physikochemischen Eigenschaften von normalen DNA- und RNA-Oligonucleotiden aufweisen. Hierin dargestellte Beispiele umfassen ausgezeichnete Löslichkeit, eine Reaktion von LNA-modifizierten Oligonucleotiden auf Salze wie Natriumchlorid und Tetramethylammoniumchlorid, die jene der nicht modifizierten Oligonucleotide nachahmt, die Fähigkeit von LNA-modifizierten Oligonucleotiden, als Primer für zahlreiche verschiedene Polymerasen zu wirken, die Fähigkeit von LNA-modifizierten Nucleotiden, als Primer in einer Target-Amplifikationsreaktion unter Verwendung einer wärmestabilen DNA-Polymerase zu wirken, die Fähigkeit von LNA-modifizierten Oligonucleotiden, als ein Substrat für T4-Polynucleotidkinase zu wirken, die Fähigkeit von biotinylierten LNAs, PCR-Amplikone auf eine Straptavidin-beschichtete, feste Oberfläche sequenzspezifisch einzufangen, die Fähigkeit von immobilisierten LNA-modifizierten Oligonucleotiden, PCR-Amplikone sequenzspezifisch einzufangen, und sehr bedeutend die Fähigkeit von LNA-modifizierten Oligonucleotiden, auf doppelsträngige DNA durch Stranginvasion sequenzspezifisch abzuzielen. Somit werden Fachleute erkennen, dass diese neuen Nucleosid-Analoga äußerst nützliche Mittel zur allgemeinen Verbesserung der Leistung von Oligonucleotid-basierten Verfahren in Therapie- und Diagnoseverfahren sowie im Bereich der Molekularbiologie sind.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von monomeren LNAs gemäß der Erfindung, die mittels Verfahren und Vorrichtungen, die Fachleuten auf dem Gebiet der Oligonucleotid-Synthese bekannt sind, in Oligonucleotide eingebunden werden können.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von vollständig oder teilweise LNA-modifizierten Oligonucleotiden (Oligomeren), die in der Lage sind, auf sequenzspezifische Weise an komplementäre Oligonucleotide zu hybridisieren und dadurch entweder Duplices oder Triplices mit wesentlich höherer Affinität als die entsprechenden Komplexe, die aus nicht modifizierten Oligonucleotiden gebildet sind, zu bilden.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von LNAs zur Steigerung der Spezifität von normalen Oligonucleotiden ohne Beeinträchtigung der Affinität. Dies kann durch Reduktion der Größe (und dadurch der Affinität) des normalen Oligonucleotids zu solch einem Ausmaß, das dem Gewinn an Affinität entspricht, der aus der Einbindung von LNAs resultiert, erreicht werden.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von vollständig oder teilweise modifizierten Oligonucleotiden, die LNAs, normale Nucleoside und andere Nucleosid-Analoga enthalten.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist, die hohe Affinität von LNAs auszunutzen, um modifizierte Oligonucleotide mit extrem hoher Affinität zu schaffen, die in der Lage sind, sich an ihre Target-Sequenzen in einem dsDNA-Molekül mittels "Strang-Ersetzung" zu binden.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung verschiedener Klassen an LNAs, die, werden sie in Oligonucleotide eingebunden, sich in ihrer Affinität gegenüber ihren komplementären Nucleosiden unterscheiden. Gemäß der Erfindung kann dies entweder durch Substituieren der normalen Nucleobasen G, A, T, C und U durch Derivate, die beispielsweise veränderte Wasserstoffbindungs-Möglichkeiten aufweisen, oder durch die Verwendung von LNAs, die sich in ihrer Hauptkettenstruktur unterscheiden, erreicht werden. Die Fähigkeit solcher verschiedener LNAs erleichtert ausgezeichnetes Abstimmen der Affinität von modifizierten Oligonucleotiden.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von LNA-modifizierten Oligonucleotiden, die gegenüber Nucleasen resistenter sind als die nicht modifizierten Gegenstücke.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von LNA-modifizierten Oligonucleotiden, die RNAseH rekrutieren können.
Ein zusätzliches Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von LNAs, die als Substrate für DNA- und RNA-Polymerasen wirken können, wodurch sie ermöglichen, dass die Analoga entweder in eine wachsende Nucleinsäurekette eingebunden werden oder als Kettenterminatoren wirken.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von LNAs, die als therapeutische Mittel wirken können. Zahlreiche Beispiele für therapeutische Nucleosidanaloga sind bekannt, und hierin offenbarte ähnliche Derivate der Nucleosidanaloga können unter Verwendung der aus der Literatur bekannten Verfahren synthetisiert werden (E. De Clercq, J. Med. Chem. 1995, 38, 2491; P. Herdewijn und E. De Clercq: Classical Antiviral Agents und Design og New Antiviral Agents. In: A Textbook of Drug Design and Development; Eds. P. Krogsgaard-Larsen, T. Liljefors und U. Madsen; Harwood Academic Publishers, Amsterdam, 1996, p. 425; I. K. Larsen: Anticancer Agents. In: A Textbook of Drug Design and Development; Eds. P. Krogsgaard-Larsen, T. Liljefors und U. Madsen; Harwood Academic Publishers, Amsterdam, 1996, p. 460).
Für doppelsträngige RNA wurde gezeigt, dass sie antivirale Aktivität und Aktivität zur Tumorunterdrückung in sich trägt (Sharp et al., Eur. J. Biochem. 230(1), 97–103 (1995), Lengyel-P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(13), 5893–5895 (1993), und Laurent-Crawford et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 8(2), 285–290 (1992)). Es ist wahrscheinlich, dass doppelsträngige LNAs die Wirkung von therapeutisch aktiven, doppelsträngigen RNAs nachahmen können, wodurch solche doppelsträngigen LNAs potentielle therapeutische Wirkstoffe sind.
In dieser Beschreibung bezieht sich die Bezeichnung "natürliche Nucleinsäure" auf Nucleinsäuren im weitesten Sinne, wie beispielsweise Nucleinsäuren, die in intakten Zellen jedes beliebigen Ursprungs oder viralen Ursprungs vorhanden sind, Nucleinsäuren, die aus solchen Quellen mittels chemischer oder physikalischer Mittel freigesetzt werden, oder Nucleinsäuren, die aus solchen primären Quellen mittels Amplifikation gewonnen werden. Die natürliche Nucleinsäure kann einzel-, doppel- oder teilweise doppelsträngig sein und kann eine relativ reine Spezies oder ein Gemisch verschiedener Nucleinsäuren sein. Sie kann auch ein Bestandteil einer rohen biologischen Probe sein, die andere Nucleinsäuren und andere Zellkomponenten enthält. Andererseits bezieht sich die Bezeichnung "synthetische Nucleinsäuren" auf jede beliebige Nucleinsäure, die mittels chemischer Synthese hergestellt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von LNA-modifizierten Oligonucleotiden bei Nucleinsäure-basierten Therapie- und Diagnoseverfahren sowie in der Molekularbiologie. Die LNA-modifizierten Oligonucleotide können zur Detektion, Identifikation, zum Einfangen, zur Charakterisierung, Quantifizierung und Fragmentierung natürlicher oder synthetischer Nucleinsäuren sowie als Blocker für Translation und Transkription in vivo und in vitro verwendet werden. In zahlreichen Fällen wird es von Interesse sein, verschiedene Moleküle an LNA-modifizierte Oligonucleotide zu binden. Solche Moleküle können an jedes Ende des Oligonucleotids gebunden oder sie können an einer oder mehreren inneren Positionen angebunden werden. Alternativ dazu können sie an das Oligonucleotid über Abstandshalter gebunden werden, die am 5'- oder 3'-Ende angebunden sind.
Repräsentative Gruppen von solchen Molekülen sind DNA-Interkalatoren, photochemisch aktive Gruppen, thermochemisch aktive Gruppen, Chelat bildende Gruppen, Reportergruppen und Liganden. Im Allgemeinen können auch alle Verfahren zum Markieren von nicht modifizierten DNA- und RNA-Oligonucleotiden mit diesen Molekülen verwendet werden, um LNA-modifizierte Oligonucleotide zu markieren. Demähnlich lassen sich alle Verfahren, die zur Detektion von markierten Oligonucleotiden verwendet werden, im Allgemeinen auf die entsprechenden markierten LNA-modifizierten Oligonucleotide anwenden.
Therapie
Die Bezeichnung "Strang-Ersetzung" bezieht sich auf einen Prozess, durch den sich ein Oligonucleotid an seine komplementäre Target-Sequenz in einer doppelsträngigen DNA oder RNA so bindet, dass der andere Strang von diesem Target-Strang verdrängt wird.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden LNA-modifizierte Oligonucleotide, die in der Lage sind, "Strang-Ersetzung" durchzuführen, im Rahmen der Entwicklung von neuen pharmazeutischen Wirkstoffen, die auf dem "Antigen"-Ansatz basieren, genutzt. Im Gegensatz zu Oligonucleotiden, die in der Lage sind, Tripelhelices zu bilden, ermöglichen solche "Strang-Ersetzungs"-Oligonucleotide, dass jede beliebige Sequenz in einer dsDNA als Target herangezogen werden kann, und dies bei physiologischer/m Ionenstärke und pH.
Die "Strang-Ersetzungs"-Oligonucleotide können auch günstigerweise im Antisense-Ansatz eingesetzt werden, wenn die RNA-Targetsequenz aufgrund der intramolekularen Wasserstoffbindungen unzugänglich ist. Solche intramolekularen Strukturen können in mRNAs auftreten und können signifikante Probleme verursachen, wenn versucht wird, die Translation der mRNA durch den Antisense-Ansatz "einzustellen".
Andere Gruppen von zellulärer RNA, wie beispielsweise tRNAs, rRNAs, snRNAs und scRNAs, enthalten intramolekulare Strukturen, die für ihre Funktion wichtig sind. Diese Klassen hochstrukturierter RNAs kodieren nicht für Proteine, sondern nehmen (in Form von RNA/Protein-Partikel) an zahlreichen zellulären Funktionen, wie beispielsweise mRNA-Spleißen, Polyadenylierung, Translation, Bearbeiten, Aufrechterhaltung von Chromosom-Endintegrität usw., teil. Aufgrund ihres hohen Strukturgrades, der normale Oligonucleotide daran hindert oder sogar davon abhält, wirksam zu hybridisieren, haben diese Klassen von RNAs bis heute kein Interesse als Antisense-Targets erweckt.
Die Verwendung von Hochaffinitäts-LNA-Monomeren sollte die Konstruktion von Antisense-Sonden mit ausreichender Thermostabilität, um wirksam an solche Target-RNAs zu hybridisieren, erleichtern. Daher wird in einer bevorzugten Ausführungsform LNA verwendet, um dem Oligonucleotid ausreichend Affinität zu verleihen, um Hybridisierung an diese RNA-Klassen zu ermöglichen und dadurch die qualitative und/oder quantitative Funktion der Partikel, in denen die RNAs gefunden werden, zu modulieren.
In manchen Fällen kann es von Vorteil sein, die Expression eines Gens herabzuregulieren, während es in anderen Fällen von Vorteil sein kann, sie zu aktivieren. Wie Møllegaard et al. (N. E. Møllegaard; O. Buchardt; M. Egholm; P. E. Nielsen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3892 (1994)) zeigten, können Oligomere, die "Strang-Ersetzung" durchführen können, als RNA-Transkriptionsaktivatoren funktionieren. In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die LNAs, die "Strang-Ersetzung" durchführen können, verwendet, um Gene von therapeutischem Interesse zu aktivieren.
Bei der chemotherapeutischen Behandlung von zahlreichen Virusinfektionen und Krebserkrankungen erwiesen sich Nucleoside und Nucleosidanaloga als wirksam. LNA-Nucleoside sind als solche Nucleosid-basierten Wirkstoffe möglicherweise nützlich.
Verschiedene Arten an doppelsträngigen RNAs hemmen das Wachstum von mehreren Krebsarten. Duplices, die ein oder mehrere LNA-Oligonucleotid(e) einbinden, sind möglicherweise als solche doppelsträngige Wirkstoffe nützlich.
Die Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein pharmazeutisch aktives, LNA-modifiziertes Oligonucleotid oder ein pharmazeutisch aktives LNA-Monomer, wie zuvor definiert, in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Solche Zusammensetzungen können in einer Form vorliegen, die an orale, parenterale (intravenöse, intraperitoneale), intramuskuläre, rektale, intranasale, dermale, vaginale, bukkale, okulare oder pulmonale Verabreichung angepasst ist, vorzugsweise in einer Form, die an orale Verabreichung angepasst ist, und solche Zusammensetzungen können auf eine Fachleuten bekannte Weise, wie z.B. in "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17. Auflage, Alfonso R. Gennaro (Hrsg.), Mark Publishing Company, Easton, PA, USA (1985), und in jüngeren Auflagen sowie in den Monographien in der Reihe "Drugs and the Pharmaceutical Sciences" (Marcel Dekker) beschrieben wird, hergestellt werden.
Diagnoseverfahren
Mehrere diagnostische und molekularbiologische Verfahren wurden entwickelt, die Panels verschiedener Oligonucleotide verwenden, um eine Target-Nucleinsäure auf die Gegenwart einer Vielzahl möglicher Mutationen gleichzeitig zu analysieren. Typischerweise sind die Oligonucleotidpanels in einem vorbestimmten Muster auf einem festen Träger immobilisiert, sodass die Gegenwart einer bestimmten Mutation in der Target-Nucleinsäure durch die Position am festen Träger, an die sie hybridisiert, aufgezeigt werden kann. Eine wichtige Bedingung für die erfolgreiche Verwendung von aus verschiedenen Oligonucleotiden bestehenden Panels bei der Analyse von Nucleinsäuren ist, dass sie alle für die bestimmte Target-Sequenz unter der einen angewandten Hybridisierungsbedingung spezifisch sind. Da die Affinität und Spezifität von Standard-Oligonucleotiden gegenüber ihren komplementären Target-Sequenzen stark von ihrer Sequenz und Größe abhängt, war dieses Kriterium bis heute schwer zu erfüllen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden daher LNAs als ein Mittel zur Steigerung von Affinität und/oder Spezifität der Sonden und als ein Mittel zum Ausgleichen der Affinität unterschiedlicher Oligonucleotide zu ihren komplementären Sequenzen verwendet. Wie hierin offenbart kann solche Affinitätsmodulation durch z.B. Ersetzen ausgewählter Nucleoside im Oligonucleotid durch ein LNA, das eine ähnliche Nucleobase trägt, erreicht werden. Wie weiters hierin gezeigt wird, weisen verschiedene Klassen von LNAs unterschiedliche Affinitäten zu ihren komplementären Nucleosiden auf. Beispielsweise weist das 2-3-verbückte LNA mit der T-Nucleobase weniger Affinität zum A-Nucleosid auf als das entsprechende 2-4-verbrückte LNA. Folglich bietet die Verwendung verschiedener Klassen von LNAs einen zusätzlichen Grad an Feinabstimmung der Affinität eines Oligonucleotids.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die hohe Affinität und Spezifität von LNA-modifizierten Oligonucleotiden beim sequenzspezifischen Einfangen und der Reinigung von natürlichen und synthetischen Nucleinsäuren genutzt. In einem Aspekt werden die natürlichen oder synthetischen Nucleinsäuren mit dem LNA-modifizierten Oligonucleotid, das auf einer festen Oberfläche immobilisiert ist, kontaktiert. In diesem Fall treten Hybridisierung und Einfangen gleichzeitig auf. Die eingefangenen Nucleinsäuren können beispielsweise direkt auf der Oberfläche durch zahlreiche verschiedene Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, nachgewiesen, charakterisiert, quantifiziert oder amplifiziert werden, oder sie können von der Oberfläche freigesetzt werden, bevor solch eine Charakterisierung oder Amplifikation erfolgt, indem das immobilisierte, modifizierte Oligonucleotid und die gefangene Nucleinsäure Dehybridisierungsbedingungen, wie z.B. Wärme oder Verwendung von Puffer mit geringer Ionenstärke, unterworfen werden.
Der feste Träger kann aus einer breiten Palette von Polymermaterialien wie beispielsweise CPG (Controlled Pore Glass), Polypropylen, Polystyrol, Polycarbonat oder Polyethylen ausgewählt sein und kann zahlreiche verschiedene Formen aufweisen, wie beispielsweise ein Röhrchen, eine Mikrotiterplatte, ein Stab, ein Kügelchen, ein Filter usw. Das LNA-modifizierte Oligonucleotid kann am festen Träger über sein 5'- oder 3'-Ende (oder über den Terminus der Linker, die an das 5'- oder 3'-Ende gebunden sind) durch eine Vielzahl verschiedener chemischer oder photochemischer Verfahren, die üblicherweise zur Immobilisierung von Oligonucleotiden verwendet werden, oder durch nicht-kovalentes Binden, wie beispielsweise über Bindung eines biotinylierten, LNA-modifizierten Oligonucleotids an immobilisiertes Streptavidin, immobilisiert werden. Eine bevorzugte Ausführungsform zum Immobilisieren von LNA-modifizierten Oligonucleotiden an verschiedenen festen Trägern ist ein photochemisches Verfahren unter Verwendung eines photochemisch aktiven Anthrachinons, das kovalent an das 5'- oder 3'-Ende des modifizierten Oligonucleotids (gegebenenfalls über Linker) wie in WO 96/31557 beschrieben gebunden ist. Somit stellt die vorliegende Erfindung auch eine Oberfläche bereit, die ein LNA-modifiziertes Oligonucleotid trägt.
In einem anderen Aspekt trägt das LNA-modifizierte Oligonucleotid einen Liganden, der kovalent entweder an das 5'- oder das 3'-Ende gebunden ist. In diesem Fall wird das LNA-modifizierte Oligonucleotid mit den natürlichen oder synthetischen Nucleinsäuren in Lösung kontaktiert, wonach die gebildeten Hybride auf einem festen Träger gefangen werden, der Moleküle trägt, die den Liganden spezifisch binden können.
In wiederum einem anderen Aspekt werden LNA-modifizierte Oligonucleotide, die in der Lage sind, "Strang-Ersetzung" durchzuführen, zum Einfangen von natürlichen und synthetischen Nucleinsäuren ohne vorangehende Denaturierung verwendet. Solche modifizierten Oligonucleotide sind in Fällen besonders nützlich, in denen die Target-Sequenz durch normale Oligonucleotide aufgrund der raschen Bildung stabiler intramolekularer Strukturen schwierig oder unmöglich zu erreichen ist. Beispiele für Nucleinsäuren, die solche Strukturen aufweisen, sind rRNA, tRNA, snRNA und scRNA.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden LNA-modifizierte Oligonucleotide, die entworfen wurden, um hohe Spezifität aufzuweisen, als Primer zum Sequenzieren von Nucleinsäuren und als Primer in jeglichen der zahlreichen bekannten Amplifikationsreaktionen, wie beispielsweise der PCR-Reaktion, verwendet. Wie hierin gezeigt bestimmt das Design der LNA-modifizierten Oligonucleotide, ob das Oligonucleotid einer exponentialen oder linearen Target-Amplifikation standhält. Die Produkte der Amplifikationsreaktion können mittels zahlreicher Verfahren analysiert werden, die zur Analyse von mit normalen DNA-Primern gebildeten Amplifikationsprodukten einsetzbar sind. In dem bestimmten Fall, in dem die LNA-modifizierten Oligonucleotid-Primer entworfen werden, um einer linearen Amplifikation standzuhalten, tragen die resultierenden Amplikone einzelsträngige Enden, die für komplementäre Sonden ohne Denaturierung als Targets dienen können. Solche Enden könnten beispielsweise verwendet werden, um Amplikone durch andere komplementäre, LNA-modifizierte Oligonucleotide, die an eine feste Oberfläche gebunden sind, einzufangen.
In einem anderen Aspekt werden LNA-modifizierte Oligos, die zu "Strang-Ersetzung" in der Lage sind, als Primer in entweder linearen oder exponentiellen Amplifikationsreaktionen verwendet. Von der Verwendung solcher Oligos wird erwartet, dass sie die gesamten Amplikon-Ausbeuten durch wirksames Konkurrieren mit Amplikon-Rehybridisierung in späteren Stadien der Amplifikationsreaktion steigern. Demers et al. (Nucl. Acid Res., Bd. 23, 3050–3055 (1995)) offenbaren die Verwendung von nicht verlängerbaren Oligos mit hoher Affinität als ein Mittel zum Steigern der Gesamtausbeute einer PCR-Reaktion. Es wird angenommen, dass die Oligomere diese Wirkung durch Stören der Amplikon-Rehybridisierung in späteren Stadien der PCR-Reaktion hervorrufen. Es wird erwartet, dass LNA-modifizierte Oligos, die an ihrem 3'-Ende blockiert sind, für dieselbe positive Wirkung sorgen. Das Blockieren des 3'-Endes kann auf zahlreiche Wege erreicht werden, wie beispielsweise durch Austauschen der 3'-Hydroxygruppe gegen Wasserstoff oder Phosphat. Solche 3'-blockierten LNA-modifizierten Oligos können auch verwendet werden, um eng verwandte Nucleinsäuresequenzen auf ähnliche Weise wie von Yu et al. (Biotechniques 23, 714–716 (1997)) beschrieben selektiv zu amplifizieren.
In den letzten Jahren wurden neue Klassen an Sonden erfunden, die beispielsweise zur Echtzeit-Detektion von Amplikonen, die durch Target-Amplifikationsreaktionen gebildet wurden, verwendet werden können. Eine solche Klasse an Sonden wurde als "Molecular Beacons" bezeichnet. Diese Sonden werden als teilweise selbstkomplementäre Oligonucleotide synthetisiert, die ein Fluorophor an einem Ende und ein Quencher-Molekül am anderen Ende aufweisen. Befindet sich die Sonde frei in Lösung, so faltet sich die Sonde zu einer Haarnadelstruktur auf (gelenkt durch die selbstkomplementären Regionen), was den Quencher in ausreichender Nähe zum Fluorophor positioniert, um ihr fluoreszierendes Signal auszulöschen. Bei Hybridisierung an ihre Target-Nucleinsäure öffnet sich die Haarnadel und trennt dadurch das Fluorphor vom Quencher, wodurch ein fluoreszierendes Signal abgegeben wird.
Eine andere Klasse von Sonden wurde als "Taqman-Sonden" bezeichnet. Diese Sonden enthalten auch ein Fluorophor und ein Quencher-Molekül. Im Gegensatz zu den Molecular Beacons bleibt hier jedoch die Fähigkeit des Quenchers, das fluoreszierende Signal vom Fluorophor auszulöschen, nach Hybridisierung der Sonde an ihre Target-Sequenz erhalten. Anstelle dessen wird das fluoreszierende Signal nach Hybridisierung durch physikalisches Lösen entweder des Quenchers oder des Fluorophors von der Sonde durch die Wirkung der 5'-Exonuclease-Aktivität einer Polymerase, die die Synthese von einem Primer an Position 5' zur Bindungsstelle der Taqman-Sonde initiierte, erzeugt.
Hohe Affinität für die Targetstelle ist eine wichtige Eigenschaft in beiden Arten von Sonden, und folglich neigen solche Sonden dazu, sehr groß zu sein (typischerweise 30- bis 40-mer). Dadurch entstehen signifikante Probleme bei der Herstellung von hochqualitativen Sonden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird daher LNA verwendet, um die Herstellung und die daraus resultierende Leistung von Taqman-Sonden und Molecular Beacons durch Reduzieren ihrer Größe bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der erforderlichen Affinität zu verbessern.
In einem weiteren Aspekt werden LNAs verwendet, um neue Affinitätspaare (entweder vollständig oder teilweise modifizierte Oligonucleotide) zu konstruieren. Die Affinitätskonstanten können leicht über einen weiten Bereich eingestellt werden, und eine große Anzahl an Affinitätspaaren kann entworfen und synthetisiert werden. Ein Teil des Affinitätspaares kann an das Molekül von Interesse (z.B. Proteine, Amplikone, Enzyme, Polysaccharide, Antikörper, Haptene, Peptide, PNA usw.) durch herkömmliche Verfahren gebunden werden, während der andere Teil des Affinitätspaares an z.B. einen festen Träger wie Kügelchen, Membranen, Mikrotiter-Platten, Stäbchen, Röhrchen usw. gebunden werden kann. Der feste Träger kann aus einer breiten Palette an Polymermaterialien, wie z.B. Polypropylen, Polystyrol, Polycarbonat oder Polyethylen, ausgewählt werden. Die Affinitätspaare können zur selektiven Isolation, Reinigung, zum Einfangen und zur Detektion zahlreicher verschiedener, zuvor erwähnter Target-Moleküle verwendet werden.
Das Prinzip des Einfangens eines LNA-markierten Moleküls mittels Wechselwirkung mit einem anderen, komplementären LNA-Oligonucleotid (entweder vollständig oder teilweise modifiziert) kann verwendet werden, um eine unendliche Anzahl an neuen Affinitätspaaren zu schaffen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die hohe Affinität und Spezifität von LNA-modifizierten Oligonucleotiden zur Konstruktion von Sonden ausgenutzt, die für In-Situ-Hybridisierung nützlich sind. Beispielsweise könnte LNA verwendet werden, um die Größe herkömmlicher DNA-Sonden zu reduzieren, während die erforderliche Affinität beibehalten wird, wodurch die Kinetik der Sonde und ihre Fähigkeit, in das Probenexemplar einzudringen, gesteigert werden. Die Fähigkeit von LNA-modifizierten Oligonucleotiden, doppelsträngige Nucleinsäurestrukturen "Stranginvasion" erfahren zu lassen, ist bei In-situ-Hybridisierung auch von beträchtlichem Vorteil, da sie Hybridisierung ohne davor durchgeführte Denaturierung der Target-DNA/RNA ermöglicht.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden LNA-modifizierte Oligonucleotide, die in Antisense-Therapieverfahren verwendet werden, mit dem doppelten Zweck von hoher Affinität und der Fähigkeit, RNAseH zu rekrutieren, entworfen. Dies kann beispielsweise durch LNA-Segmente, die ein nicht modifiziertes, zentrales DNA-Segment flankieren, erreicht werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Set zur Isolierung, Reinigung, Amplifikation, Detektion, Identifikation, Quantifizierung oder zum Einfangen von natürlichen oder synthetischen Nucleinsäuren bereit, das einen Reaktionskörper und ein oder mehrere LNA-modifizierte Oligonucleotide (Oligomer) wie hierin definiert umfasst. Die LNA-modifizierten Oligonucleotide sind vorzugsweise an diesem Reaktionskörper immobilisiert.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Set zur Isolierung, Reinigung, Amplifikation, Detektion, Identifikation, Quantifizierung oder zum Einfangen von natürlichen oder synthetischen Nucleinsäuren bereit, das einen Reaktionskörper und ein oder mehrere LNAs wie hierin definiert umfasst. Die LNAs sind vorzugsweise an diesem Reaktionskörper (z.B. unter Verwendung der zuvor beschriebenen Immobilisierungsverfahren) immobilisiert.
Für die Sets gemäß der Erfindung ist der Reaktionskörper vorzugsweise ein festes Trägermaterial, z.B. ausgewählt aus Borsilicat-Glas, Natronkalk-Glas, Polystyrol, Polycarbonat, Polypropylen, Polyethylen, Polyethylenglykolterephthalat, Polyvinylacetat, Polyvinylpyrrolidinon, Polymethylmethacrylat und Polyvinylchlorid, vorzugsweise Polystyrol und Polycarbonat. Der Reaktionskörper kann in Form eines Proberöhrchens, einer Phiole, eines Objektträgers, einer Folie, eines Films, eines Kügelchens, eines Pellets, einer Scheibe, einer Platte, eines Rings, eines Stäbchens, eines Netzes, eines Filters, einer Schale, einer Mikrotiterplatte, eines Stabes oder eines mehrschneidigen Stabes vorliegen.
Den Sets liegt typischerweise eine Gebrauchsanweisung bei, die die optimalen Gebrauchsbedingungen für das Set beschreibt.
Die zuvor erwähnten Aspekte der Diagnose und der Therapie der vorliegenden Erfindung werden anhand der folgenden Beispiele veranschaulicht.
EXPERIMENTELLER TEIL
Allgemeines
Alle Reagenzien wurden bei gewerblichen Lieferanten erworben und wurden ohne weitere Reinigung verwendet. Nach Trocknen jeder beliebigen organischen Phase unter Verwendung von Na₂SO₄ wurde Filtration durchgeführt. Das Kieselgel (0,040–0,063 mm), das für Säulenchromatographie verwendet wurde, wurde bei Merck erworben. NMR-Spektren wurden bei 300 MHz oder 250 MHz für ¹H-NMR und bei 62,9 MHz für ¹³C-NMR und bei 202,33 MHz für ³¹P-NMR aufgezeichnet. δ-Werte sind in ppm relativ zu Tetramethylsilan als innerem Standard (¹H-NMR und ¹³C-NMR) und relativ zu 85% H₃PO₄ als externem Standard (³¹P-NMR) angegeben. Zuordnungen von NMR-Peaks sind gemäß der Standard-Nucleosidnomenklatur angegeben. EI-Massenspektren, FAB-Massenspektren und Plasmadesorptions-Massenspektren wurden aufgezeichnet, um Informationen bezüglich des Molekulargewichts von synthetisierten Verbindungen zu gewinnen. Oligonucleotid-Analoga wurden unter Verwendung der Phosphoramidit-Methodologie synthetisiert. Die Reinigung von 5'-O-DMT-ON- oder 5'-O-DMT-OFF-Oligonucleotid-Analoga erfolgte unter Verwendung von Einweg-Umkehrphasenchromatographie-Kassetten oder Umkehrphasen-HPLC, sofern erforderlich. Matrizen-gebundene Laserdesorptions-Massenspektren wurden erhalten, um das Molekulargewicht und die Monomerzusammensetzung von repräsentativen Oligonucleotidproben zu überprüfen. Kapiliargelelektrophorese wurde durchgeführt, um die Reinheit von repräsentativen Oligonucleotidproben zu überprüfen.
Die nachstehenden spezifischen Beschreibungen werden ergänzt durch die 2–41 und die Tabellen 1–10. Außer in den folgenden Beispielen anders angegeben, bezeichnet "LNA" die 2'-4'-verbrückte Variante, die mit der Formel Z in 2 veranschaulicht ist.
Herstellung von LNA-Monomeren
Beispiel 1
3-C-Allyl-1,2-O-isopropyliden-α-D-ribofuranose (0A). Verfahren 1: Eine Lösung von 5-O-t-Butyldimethylsilyl-1,2-O-isopropyliden-α-D-ribofuran-3-ulose (Y. Yoshimura, T. Sano, A. Matsuda und T. Ueda, Chem. Pharm. Bull. 36, 162 (1988)) (17,8 g, 58,9 mmol) in wasserfreiem THF (980 cm³) wurde bei 0°C gerührt, und 1 M Allylmagnesiumbromid in wasserfreiem Ether (130 cm³, 130 mmol) wurde zugetropft. Nach 2-stündigem Rühren wurde eine gesättigte wässrige Lösung von Ammoniumchlorid (800 cm³) zugesetzt, und das Gemisch wurde mit Dichlormethan (3 × 400 cm³) extrahiert. Die organische Phase wurde mit Salzlauge (3 × 450 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde in wasserfreiem THF (700 cm³) aufgelöst. Eine 1,1 M Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid in THF (54,4 cm³, 59,8 mmol) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 1 h lang gerührt und bis zur Trockenen eingedampft. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (1.700 cm³) aufgelöst und mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (3 × 500 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (98:2, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Furanose 0A als einen weißen Feststoff (9,42 g, 69%) zu ergeben. Verfahren 2: Furanose 0A wurde analog aus 5-O-t-Butyldiphenylsilyl-1,2-O-isopropyliden-α-D-ribofuran-3-ulose (T. F. Tam und B. Fraser-Reid, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 556 (1980)) (9,5 g, 22,2 mmol) unter Verwendung der folgenden Elemente synthetisiert: wasserfreies THF (425 cm³); eine 1 M Lösung von Allylmagnesiumbromid in wasserfreiem Ether (130 cm³, 130 mmol); eine gesättigte wässrige Lösung von Ammoniumchlorid (490 cm³); Ether zum Extrahieren (350 + 2 × 160 cm³); Salzlauge (2 × 160 cm³); eine 1,1 M Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid in THF (22,3 cm³, 24,6 mmol); wasserfreies THF (400 cm³); Dichlormethan (1.400 cm³); eine gesättigte wässrige Lösung von Natriumhydrogencarbonat (3 × 500 cm³); Salzlauge (500 cm³) und (Na₂SO₄).
δ_H ((CD₃)₂SO) 5.84 (1H, m, 2'-H), 5.65 (1H, d, J 3.8, 1-H); 5.12 (1H, d, J 6.1, 3'-H_a), 5.06 (1H, br s, 3'-H_b), 4.76 (1H, s, 3-OH), 4.64 (1H, t, J 5.4, 5-OH), 4.16 (1H, d, J 3.8, 2-H), 3.84 (1H, dd, J 2.2, 8.1, 4-H), 3.56 (1H, ddd, J 2.3, 5.6, 11.8, 5-H_a), 3.42 (1H, m, 5-H_b), 2.16 (1H, dd, J 6.1, 14.3, 1'-H_a), 1.98 (1H, dd, J 8.2, 14.3, 1'-H_b), 1.46 (3H, s, CH₃), 1.25 (3H, s, CH₃). δ_C (CDCl₃) 133.5 (C-2'), 117.9 (C-3'), 110.8 (C(CH₃)₂), 102.9 (C-1), 82.6, 81.0, 77.7 (C-2, C-3, C-4), 59.4 (C-5), 36.4 (C-1'), 26.4, 26.3 (CH₃) (Gef.; C, 57.4; H, 8.0; C₁₁H₁₈O₅ ber. C, 57.4; H, 7.9%).
Beispiel 2
3-C-Allyl-3,5-di-O-benzyl-1,2-O-isopropyliden-α-D-ribofuranose (0B). Eine 60%ige Suspension von Natriumhydrid (4,9 g, 123 mmol) in wasserfreiem DMF (100 cm³) wurde bei 0°C gerührt, und eine Lösung von Furanose 0A (9,42 g, 40,9 mmol) in wasserfreiem DMF (65 cm³) wurde über 45 min hinweg zugetropft. Die Lösung wurde 1 h lang bei 50°C gerührt und auf 0°C abgekühlt. Ein Gemisch von Benzylbromid (14,5 cm³, 121 mmol) mit wasserfreiem DMF (14,5 cm³) wurde zugetropft, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 18 h lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde bis zur Trockenen eingedampft, und eine Lösung des Rückstands in Dichlormethan (700 cm³) wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (2 × 450 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Petroleumether/Ethylacetat (9:1, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um die Verbindung 0B als Öl zu ergeben (14,5 g, 86%).
δ_H (CDCl₃) 7.39–7.21 (10H, m, Bn), 5.92 (1H, m, 2'-H), 5.71 (1H, d, J 3.8, 1-H), 5.17–5.09 (2H, m, 3'-H_a, 3'-H_b). 4.67 (2H, m, Bn), 4.60 (1H, d, J 12.2, Bn), 4.52 (1H, d, J 12.1, Bn), 4.43 (1H, m, 4-H), 4.42 (1H, d, J 3.8, 2-H), 3.73 (1H, dd, J 3.2, 10.8, 5-H_a), 3.66 (1H, dd, J 7.4, 10.8, 5-H_b), 2.50 (1H, dd, J 7.7, 14.9, 1'-H_a), 2.39 (1H, dd, J 6.5, 14.9, 1'-H_b), 1.60 (3H, s, CH₃), 1.34 (3H, s, CH₃). δ_C (CDCl₃) 138.7, 138.1 (Bn), 132.6 (C-2'), 128.3, 128.2, 127.7, 127.5, 127.4, 127.4 (Bn), 118.5 (C-3'), 112.6 (C(CH₃)₂), 104.1 (C-1), 86.5, 82.1, 80.4 (C-2, C-3, C-4), 73.4, 68.6 (Bn), 67.0 (C-5), 35.8 (C-1'), 26.8, 26.6 (CH₃). FAB-MS m/z 433 [M + Na]⁺ (Gef.: C, 73.4; H, 7.4; C₂₅H₃₀O₅ ber. C, 73.2; H, 7.4%).
Beispiel 3
3-C-Allyl-1,2-di-O-acetyl-3,5-di-O-benzyl-D-Ribofuranose (0C). Eine Lösung von Furanose 0B (12,42 g, 30,3 mmol) in 80%iger wässriger Essigsäure (150 cm³) wurde bei 90°C 3 h lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde mit Ethanol (3 × 75 cm³), Toluol (3 × 75 cm³) und wasserfreiem Pyridin (2 × 75 cm³) zusammen eingedampft und in wasserfreiem Pyridin (60 cm³) neuerlich aufgelöst. Essigsäureanhydrid (46 cm³) wurde zugesetzt, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur 48 h lang gerührt. Ein Gemisch aus Eis und Wasser (300 cm³) wurde zugesetzt, und das resultierende Gemisch wurde mit Dichlormethan (2 × 300 cm³) extrahiert. Die vereinigte organische Phase wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (3 × 200 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde eingedampft, und der Rückstand wurde unter Verwendung von Kieselgel-Säulenchromatographie mit Petroleumether/Ethylacetat (4:1, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um das anomere Gemisch 0C (β:α ≈ 2:1) als ein Öl (13,3 g, 97%) zu ergeben.
δ_C (CDCl₃) 169.7, 169.6 (C=O), 138.7, 138.4, 137.7, 137.6 (Bn), 132.4, 132.2 (C-2'), 128.4 128.4, 128.2, 128.2, 1 27.8, 127.7, 127.7, 127.6, 127.3, 127.3, 126.9, 126.8 (Bn), 118.5 (C-3'), 99.4, 93.5 (C-1), 84.8, 83.7, 83.2, 82.0, 79.1, 75.5 (C-2, C-3, C-4), 73.7, 73.5, 69.3, 68.7 (Bn), 66.1 (C-5), 35.5, 34.9 (C-1), 21.1, 21.0, 20.7, 20.6 (CH₃) (Gef. C, 68.7; H, 6.7; C₂₆H₃₀O₇ ber. C, 68.8; H, 6.6%).
Beispiel 4
1-(2-O-Acetyl-3-C-allyl-3,5-di-O-benzyl-β-D-ribofuranosyl)thymin (1). Zu einer gerührten Lösung des anomeren Gemischs 0C (β:α ≈ 2:1, 11,8 g, 26,0 mmol) (P. Nielsen, H. M. Pfundheller und J. Wengel, Chem. Commun., 825 (1997); P. Nielsen, H. M. Pfundheller, C. E. Olsen und J. Wengel, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 (1997) im Druck) und Thymin (6,55 g, 52,0 mmol) in wasserfreiem Acetonitril (250 cm³) wurde N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamid (44,9 cm³, 182 mmol) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rückfluss 1 h lang gerührt und auf 0°C gekühlt. Trimethylsilyltriflat (8,00 cm³, 44,0 mmol) wurde zugetropft, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur 12 h lang gerührt. Eine eiskalte gesättigte wässrige Lösung von Natriumhydrogencarbonat (270 cm³) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde mit Dichlormethan (3 × 125 cm³) extrahiert. Die organische Phase wurde dann mit gesättigten wässrigen Lösungen von Natriumhydrogencarbonat (2 × 125 cm³) und Salzlauge (2 × 125 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (98:2, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 1 als einen weißen Feststoff (11,6 g; 86%) zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 8.64 (1H, br s, NH), 7.75 (1H, d, J 1.1, 6-H), 7.41–7.25 (10H, m, Bn), 6.43 (1H, d, J 8.2, 1'-H), 5.88 (1H, m, 2''-H), 5.66 (1H, d, J 8.2, 2'-H), 5.12 (1H, s, 3''-H_a), 5.07 (1H, dd, J 1.5, 8.5, 3''-H_b), 4.85 (1H, d, J 11.2, Bn), 4.64 (2H, s, Bn), 4.63 (1H, d, J 11.2, Bn), 4.33 (1H, br s, 4'-H), 3.81 (1H, dd, J 2.7, 11.1, 5'-H_a), 3.65 (1H, m, 5'-H_b), 2.81–2.65 (2H, m, 1''-H_a, 1''-H_b), 2.08 (3H, s, COCH₃), 1.52 (3H, d, J 0.8, CH₃). δ_C (CDCl₃) 170.1 (C=O), 163.6 (C-4), 150.9 (C-2), 138.1, 136.6 (Bn), 136.0 (C-6), 131.6 (C-2''), 128.8, 128.4, 128.3, 127.6, 127.5, 127.1 (Bn), 118.5 (C-3''), 111.1 (C-5), 84.2, 83.4, 83.1, 77.4 (C-1', C-2', C-3', C-4'), 73.6, 69.2 (Bn), 65.6 (C-5'), 33.7 (C-1''), 20.8 (COCH₃), 11.9 (CH₃) (Gef.: C, 66.8; H, 6.3; N, 5.1. C₂₉H₃₂N₂O₇ ber. C, 66.9; H, 6.2; N, 5.4%).
Beispiel 5
1-(3-C-Allyl-3,5-di-O-benzyl-β-D-ribofuranosyl)thymin (2). Zu einer gerührten Lösung von Nucleosid 1 (11,6 g, 22,3 mmol) in Methanol (110 cm³) wurde Natriummethoxid (3,03 g, 55,5 mmol) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 16 h lang gerührt und mit verdünnter Salzsäure neutralisiert. Das Lösungsmittel wurde teilweise abgedampft, und der Rückstand wurde in Dichlormethan (2 × 400 cm³) aufgelöst. Die organische Phase wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (3 × 250 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, um 2 als einen weißen Feststoff (10,1 g, 95%) zu ergeben.
δ_C (CDCl₃) 8.77 (1H, br s, NH), 7.58 (1H, d, J 1.2, 6-H), 7.41–7.25 (10H, m, Bn), 6.14 (1H, m, 2''-H), 6.12 (1H, d, J 7.8, 1'-H), 5.23 (1H, m, 3''-H_a), 5.17 (1H, br s, 3''-H_b), 4.68 (1H, d, J 10.8, Bn), 4.59 (2H, s, Bn), 4.55 (1H, d, J 10.9, Bn), 4.39 (1H, br s, 4'-H), 4.26 (1H, dd J 7.8, 10.7, 2'-H), 3.84 (1H, dd, J 3.1, 11.0, 5'-H_a), 3.58 (1H, dd, J 1.4, 11.0, 5'-H_b), 3.04 (1H, d, J 10.8, 2'-OH), 2.82–2.78 (2H, m, 1''-H_a, 1''-H_b), 1.51 (3H, d, J 1.0, CH₃). δ_C (CDCl₃) 163.5 (C-4), 151.1 (C-2), 137.3, 136.7 (Bn), 136.0 (C-6), 132.1 (C-2''), 128.8, 128.5, 128.3, 127.9, 127.6 (Bn), 118.4 (C-3''), 111.1 (C-5), 87.4, 82.6, 81.1, 79.3 (C-1', C-2', C-3', C-4'), 73.7, 69.8 (Bn), 64.7 (C-5'), 35.1 (C-1''), 11.9 (CH₃). (Gef.: C, 67.8; H, 6.1; N, 5.5. C₂₇H₃₀N₂O₈ ber. C, 67.8; H, 6.3; N, 5.9%).
Beispiel 6
1-(3-C-Allyl-3,5-di-O-benzyl-2-O-methansulfonyl-β-D-ribofuranosyl)thymin (3). Zu einer gerührten Lösung von Nucleosid 2 (3,50 g, 7,31 mmol) in wasserfreiem Pyridin (23 cm³) bei 0°C wurde Methansulfonylchlorid (1,69 cm³, 21,89 mmol) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt, Wasser (100 cm³) wurde zugesetzt, und die Extraktion wurde unter Verwendung von Dichlormethan (3 × 150 cm³) durchgeführt. Die organische Phase wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (3 × 200 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (99:1) als Elutionsmittel gereinigt, um 3 als ein weißen Feststoff (3,64 g, 89%) zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 8.95 (1H, br s, NH), 7.71 (1H, d, J 1.1, 6-H), 7.39–7.25 (10H, m, Bn), 6.52 (1H, d, J 8.0, 1'-H), 5.90 (1H, m, 2''-H), 5.34 (1H, d, J 7.9, 2'-H), 5.20–5.09 (2H, m, 3''-H_a, 3''-H_b), 4.91 (1H, d, J 11.2, Bn), 4.68 (1H, d, J 11.3, Bn), 4.64 (2H, s, Bn), 4.33 (1H, br s, 4'-H), 3.81 (1H, dd, J 2.5, 11.1, 5'-H_a), 3.73 (1H, dd, J 1.1, 11.1, 5'-H_b), 3.08 (1H, dd, J 5.5, 5.7, 1''-H_a), 2.99 (3H, s, CH₃), 2.68 (1H, m, 1''-H_b), 1.51 (3H, d, J 0.8, CH₃). δ_C (CDCl₃) 163.4 (C-4), 150.8 (C-2), 137.9, 136.3 (Bn), 135.5 (C-6), 131.0 (C-2''), 128.8, 128.3, 127.5, 127.2 (Bn), 119.3 (C-3''), 11 1.6 (C-5), 84.1, 83.6, 82.4, 82.2 (C-1', C-2', C-3', C-4'), 73.7, 68.9 (Bn), 66.2 (C-5'), 38.7 (CH₃), 33.0 (C-1''), 11.9 (CH₃) (Gef.; C, 60.5; H, 5.8; N, 4.9. C₂₈H₃₂N₂C₈S ber. C, 60.4; H, 5.8; N, 5.0%).
Beispiel 7
1-(3-C-Allyl-3,5-di-O-benzyl-β-D-arabinofuranosyl)thymin (4). Eine Lösung von Nucleosid 3 (3,59 g, 6,45 mmol) in Ethanol (72 cm³), Wasser (72 cm³) und 1 M wässrigem Natriumhydroxid (20,6 cm³) wurde unter Rückfluss 18 h lang gerührt. Nach Neutralisierung mit verdünnter Salzsäure wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde in Dichlormethan (3 × 150 cm³) aufgelöst. Die organische Phase wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (3 × 200 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (99:1, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um 4 als weißen Feststoff (2,32 g, 74%) zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 7.60 (1H, d, J 1.2, 6-H), 7.50–7.23 (10H, m, Bn), 6.22 (1H, d, J 2.9, 1'-H), 5.80 (1H, m, 2''-H), 5.15–5.08 (2H, m, 3''-H_a, 3''-H_b), 4.86–4.33 (6H, m, 2 × Bn, 2'-H, 4'-H), 3.82–3.71 (2H, m, 5'-H_a, 5'-H_b), 2.72 (1H, m, 1''-H_a), 2.52 (1H, dd, J 7.6, 16.1, 1''-H_b), 1.70 (3H, d, J 0.9, CH₃). δ_C (CDCl₃) 165.1 (C-4), 150.4 (C-2), 138.4, 136.8 (Bn), 137.7 (C-6), 132.3 (C-2''), 128.77 128.4, 128.3, 128.0, 127.9, 127.6 (Bn), 118.5, (C-3''), 107.8 (C-5), 88.0, 87.8, 83.7 (C-1', C-3', C-4'), 73.7, 72.9, 69.4 (Bn, C-2'), 64.7 (C-5'), 31.1 (C-1''), 12.4 (CH₃) (Gef.: C, 67.5; H, 6.3; N, 5.3. C₂₇H₃₀N₂O₆, 0.25H₂O ber. C, 67.1; H, 6.4; N, 5.8%).
Beispiel 8
1-(3,5-Di-O-benzyl-3-C-(2-hydroxyethyl)-β-D-arabinofuranosyl)thymin (5). Zu einer gerührten Lösung von Nucleosid 4 (2,26 g, 4,68 mmol) in THF (12 cm³) und Wasser (12 cm³) wurde Natriumperiodat (3,04 g, 14,2 mmol) und eine 2,5%ige Lösung von Osmiumtetraoxid in tert-Butanol (Gew.-%, 0,603 cm³, 40 μmol) zugesetzt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 45 min lang gerührt. Wasser (25 cm³) wurde zugesetzt, und die Lösung wurde mit Dichlormethan (2 × 50 cm³) extrahiert. Die organische Phase wurde mit gesättigter wässriger Lösung von Natriumhydrogencarbonat (3 × 30 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde in THF (12 cm³) und Wasser (12 cm³) erneut aufgelöst. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt, und Natriumborhydrid (182 mg, 4,71 mmol) wurde zugesetzt. Nach 1,5-stündigem Rühren wurde Wasser (25 cm³) zugesetzt, und die Lösung wurde mit Dichlormethan (2 × 50 cm³) extrahiert. Die organische Phase wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (3 × 30 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (98:2, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um 5 als einen weißen Feststoff (1,13 g, 49%) zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 9.29 (1H, br s, NH), 7.47 (1H, d, J 1.1, 6-H), 7.38–7.25 (10H, m, Bn), 6.22 (1H, d, J 3.4, 1'-H), 4.62 (2H, s, Bn), 4.60 (1H, m, 4'-H), 4.46 (2H, s, Bn), 4.35 (1H, dd, J 3.4, 7.5, 2'-H), 3.83–3.73 (4H, m, 2 × 5'-H, 2 × 2''-H), 2.67 (1H, br s, OH), 2.07–2.01 (2H, m, 2 × 1''-H), 1.77 (3H, d, J 0.5, CH₃). δ_C (CDCl₃) 164.3 (C-4), 150.3 (C-2), 137.6, 137.4 (Bn, C-6), 136.7 (Bn), 128.6, 128.4, 128.2, 127.8, 127.6, 127.3, 127.1 (Bn), 108.4 (C-5), 88.0, 87.7, 81.6, 74.7 (C-1', C-2', C-3', C-4'), 73.7, 69.6 (Bn), 64.6 (C-5'), 57.7 (C-2''), 28.6 (C-1''), 12.4 (CH₃). FAB-MS m/z 483 [M + H]⁺, 505 [M + Na]⁺ (Gef.: C, 63.6; H, 6.2; N, 5.4. C₂₆H₃₀N₂O₇, 0.5H₂O ber. C, 63.5; H 6.4; N, 5.7%).
Beispiel 9
(1S,5R,6R,8R)-5-Hydroxy-6-(hydroxymethyl-8-(thymin-1-yl)-2,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan (6). Eine Lösung von Nucleosid 5 (1,08 g, 2,20 mmol) in wasserfreiem Pyridin (5,0 cm³) wurde bei 0°C gerührt, und eine Lösung von p-Toluolsulfonylchlorid (462 mg, 2,47 mmol) in wasserfreiem Pyridin (2,0 cm³) wurde zugetropft. Nach 20-stündigem Rühren bei Raumtemperatur und Zusatz eines Gemischs von Wasser und Eis (70 cm³) wurde Extraktion mit Dichlormethan (2 × 75 cm³) durchgeführt. Die organische Phase wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (3 × 50 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol. (99:1, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um ein Zwischenprodukt zu ergeben, das nach Eindampfen in wasserfreiem DMF (4,0 cm³) aufgelöst wurde. Die Lösung wurde zu einer gerührten Suspension von 60% Natriumhydrid (203 mg, 4,94 mmol) in wasserfreiem DMF (4,0 cm³) bei 0°C zugetropft. Das Gemisch wurde 18 h lang gerührt, und Wasser (20 cm³) wurde zugesetzt. Nach Neutralisierung mit Salzsäure wurde Dichlormethan (75 cm³) zugesetzt. Die organische Phase wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (3 × 50 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (98:2, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um einen weißen Feststoff (858 g) zu ergeben. Eine Lösung dieses weißen Feststoffs (846 mg, 1,80 mmol) in Ethanol (10,0 cm³) wurde bei Raumtemperatur gerührt, und 20% Palladiumhydroxid auf Kohlenstoff (400 mg) wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde mit Argon entgast und unter Wasserstoffatmosphäre gestellt. Nach 2-stündigem Rühren wurde das Gemisch direkt durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (97:3, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um 6 als einen weißen Feststoff (444 mg, 82%) zu ergeben.
δ_H ((CD₃)₂SO) 11.3 (1H, br s, NH), 7.36 (1H, d, J 1.1, 6-H), 5.80 (1H, d, J 4.3, 1'-H), 5.61 (1H, s, OH), 4.86 (1H, m, 5'-H_a), 3.89 (1H, d, J 4.2, 2'-H), 3.85 (1H, m, 2''-H_a), 3.83–3.64 (3H, m, 4'-H, 5'-H_b, 2''-H_b), 2.14 (1H, m, 1''-H_a), 1.81 (1H, m, 1''-H_b), 1.78 (3H, d, J 1.0, CH₃). δ_C (CD₃OD) 166.7 (C-4), 152.2 (C-2), 139.7 (C-6), 110.1 (C-5), 89.4, 89.1, 85.5, 85.2 (C-1', C-2', C-3', C-4'), 71.4 (C-2''), 61.6 (C-5'), 37.0 (C-1''), 12.7 (CH₃) (Gef.: C, 47.4; H, 5.7; N, 9.0. C₁₂H₁₆N₂O₆, H₂O ber. C, 47.7; H, 6.0; N, 9.3%).
Beispiel 10
(1S,5R,6R,8R)-6-(4,4'-Dimethoxytrityloxymethyl)-5-hydroxy-8-(thymin-1-yl)-2,7-dioxabicyclo[3.3.0]nonan (7). Eine Lösung von Nucleosid 6 (310 mg, 1,09 mmol) in wasserfreiem Pyridin (2,5 cm³) wurde bei Raumtemperatur gerührt, und 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (593 mg, 1,83 mmol) wurde zugesetzt. Nach 3-stündigem Rühren wurde zusätzliches 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (100 mg, 0,310 mmol) zugesetzt. Nach weiteren 2 h Rühren wurde Methanol (0,5 cm³) zugesetzt, und das Gemisch wurde eingedampft. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (5 cm³) aufgelöst und mit einer wässrigen gesättigten Lösung von Natriumhydrogencarbonat (3 × 5 cm³) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (Na₂SO₄) und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie mit Dichlormethan/Methanol (99:1, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um 7 als einen weißen Feststoff (618 mg, 97%) zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 9.04 (1H, br s, NH), 7.47–7.16 (10H, m, 6-H, DMT), 6.86–6.82 (4H, m, DMT), 6.06 (1H, d, J 4.1, 1'-H), 4.35 (1H, d, J 4.1, 2'-H), 4.03 (1H, m, 4'-H), 3.89 (1H, m, 2''-H_a), 3.79 (6H, s, 2 × OCH₃), 3.61 (1H, m, 5'-H_a), 3.32–3.26 (2H, m, 5'-H_b, 2''-H_b), 1.94–1.69 (2H, m, 1''-H_a, 1''-H_b), 1.89 (3H, s, CH₃). δ_C (CDCl₃) 163.4 (C-4), 158.6 (DMT), 150.1 (C-2), 144.3 (DMT), 137.2 (C-6), 135.6, 135.3, 129.9, 129.9, 128.9, 128.1, 127.9, 126.9, 125.2, 113.2 (DMT), 109.3 (C-5), 88.7, 87.3, 86.9, 83.5, 81.0 (DMT, C-1', C-2', C-3', C-4'), 69.7 (C-2''), 62.1 (C-5'), 55.1 (OCH₃), 36.5 (C-1''), 12.5 (CH₃).
Beispiel 11
(1S,5R,6R,8R)-5-(2-Cyanoethoxy(diisopropylamino)phosphinoxy)-6-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-8-(thymin-1-yl)-2,7-dioxabiyclo[3.3.0]nonan (8). Eine Lösung von Nucleosid 7 (436 mg, 0,743 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (2,2 cm³) und Diisopropylethylamin (0,62 cm³) wurde bei Raumtemperatur gerührt, und 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidochloridit (0,33 cm³, 1,46 mmol) wurde zugesetzt. Nach 1,5 h Rühren wurden Methanol (0,4 cm³) und Ethylacetat (5 cm³) zugesetzt, und das Gemisch wurde mit wässrigen gesättigten Lösungen von Natriumhydrogencarbonat (3 × 5 cm³) und Salzlauge (3 × 5 cm³) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (Na₂SO₄) und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie mit Dichlormethan/Triethylamin (97:3, Vol/.Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, die Lösungsmittel wurden abgedampft, um ein Öl zu ergeben, das in Toluol (1 cm³) aufgelöst wurde, und das Fällen aus Hexan bei –30°C ergab 8 als einen weißen Feststoff (517 mg, 88%). δ_p (CDCl₃) 142,0, 141,9.
Beispiel 12
1-(3,5-Di-O-benzyl-3-C-(2-hydroxyethyl)-β-D-ribofuranosyl)thymin (9). Zu einer gerührten Lösung von Nucleosid 2 (1,00 g, 2,09 mmol) in THF (5,4 cm³) und Wasser (5,4 cm³) wurden Natriumperiodat (1,34 g, 6,27 mmol) und eine 2,5%ige Lösung von Osmiumtetraoxid in tert-Butanol (Gew.-%, 0,265 cm³, 19 μmol) zugesetzt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 45 min lang gerührt. Wasser (25 cm³) wurde zugesetzt, und die Lösung wurde mit Dichlormethan (2 × 50 cm³) extrahiert. Die organische Phase wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (3 × 30 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde in THF (5,4 cm³) und Wasser (5,4 cm³) aufgelöst. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt, und Natriumborhydrid (79 mg, 2,08 mmol) wurde zugesetzt. Nach 1,5 h Rühren wurde Wasser (25 cm³) zugesetzt, und die Lösung wurde mit Dichlormethan (2 × 50 cm³) extrahiert. Die organische Phase wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (3 × 30 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (98:2, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 9 als einen weißen Feststoff (488 mg, 48%) zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 9.14 (1H, br s, NH), 7.60 (1H, d, J 1.1, 6-H), 7.40–7.22 (10H, m, Bn), 6.25 (1H, d, J 7.7, 1'-H), 4.59 (1H, d, J 7.1 Bn), 4.49 (1H, d, J 7.1 Bn), 4.39–3.30 (m, 8H, 4'-H, 2'-H, Bn, 5'-H_a, 5'-H_b, 2''-H_a, 2''-H_b), 2.23–2.00 (2H, m, 1''-H_a, 1''-H_b), 1.49 (3H, d, J 0.7, CH₃). δ_C (CDCl₃) 163.5 (C-4), 151.2 (C-2), 137.1, 136.5 (Bn), 135.7 (C-6), 128.7, 128.5, 1 28.2, 127.8, 127.6, 127.2 (Bn), 111.3 (C-5), 87.0, 82.7, 81.1, 78.3 (C-1', C-2', C-3', C-4'), 73.7, 69.6 (Bn), 64.4 (C-5'), 57.0 (C-2''), 32.4 (C-1''), 1 1.8 (CH₃) (Gef. C, 63.9; H, 6.3; N, 5.4. C₂₆H₃₀N₂O₇, 0.25H₂O ber. C, 64.1; H 6.3; N, 5.75%).
Beispiel 13
1-[3-C-(2-O-t-Butyldimethylsilyloxyethyl)-3,5-di-O-benzyl-β-D-ribofuranosyl]thymin (10). Ein Gemisch von Nucleosid 9 (1,80 g, 3,4 mmol) mit t-Butyldimethylsilylchlorid (0,585 g, 3,9 mmol) wurde in wasserfreiem Pyridin (20 cm³) aufgelöst. Nach 2 h bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch bis zur Trockenen eingedampft, zweimal zusammen mit Toluol (2 × 10 cm³) eingedampft und in Dichlormethan (150 cm³) neuerlich aufgelöst. Die Lösung wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (2 × 50 cm³) gewaschen und eingedampft, um einen Schaum zu ergeben. Dieses Material wurde durch präparative Kieselgel-HPLC unter Verwendung von Gradientenelution (0–3% Methanol in Dichlormethan, Vol.-%) gereinigt, um Nucleosid 10 als einen weißen Feststoff (1,86 g, 92%) zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 7.61 (1H, d, J 1.1, 6-H), 7.35–7.20 (10H, m, Bn), 6.27 (1H, d, J 7.9, 1'-H), 4.65–4.40 (4H, m, Bn, 2'-H), 4.37 (1H, s, Bn), 4.28 (1H, t, J 7.9, 4'-H), 4.35–3.55 (4H, m, 2''-H_a, 2''-H_b, 5'-H_a, 5'-H_b), 2.30–2.05 (2H, m, 1''-H_a, 1''-H_b), 1.46 (3H, s, 5-CH₃), 0.90 (9H, m, CH₃-C-Si), 0.08 (6H, m, CH₃-Si). δ_C (CDCl₃) 163.6 (C-6), 151.0 (C-2), 137.5, 136.6, 135.8 (C-5, Bn), 128.3, 128.1, 127.8, 127.2, 127.1, 126.8, 126.7 (Bn), 1 10.7 (C-4), 86.8, 82.5, 81.6, 78.3 (C-1', C-2', C-3', C-4'), 73.3, 69.8 (Bn), 64.46 (C-5'), 58.2 (C-2''), 32.9 (C-1''), 25.6, 25.4, 17.9, –3.9, –5.7 (TBDMS), 11.6 (CH₃). FAB⁺-MS: m/z 597.19 [M + H]⁺, 619.18 [M + Na]⁺ (Gef.: C, 64.2; H, 7.4; N, 4.2; C₃₂H₄₄O₇N₂Si ber. C, 64.4; H, 7.4; N, 4.7%).
Beispiel 14
1-[3-C-(2-t-Butyldimethylsilyloxyethyl)-3,5-di-O-benzyl-β-D-erythro-pentofuran-2-ulosyl]thymin (11). Ein Gemisch aus Nucleosid 10 (2,14 g, 3,59 mmol), 1,48 g (3,95 mmol) Pyridiniumdichromat (1,48 g, 3,95 mmol) und aktiviertem 3A-Molekularsiebpulver (4 g) wurde in wasserfreiem Dichlormethan (80 cm³) suspendiert. Nach dem Kühlen des Gemischs auf –10°C wurde Essigsäureanhydrid (10 cm³, 98 mmol) unter starkem Rühren zugetropft. Die Suspension wurde auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen, und das Rühren wurde 1,5 h lang fortgesetzt, wobei die Reaktion durch Zusatz von Triethylamin (20 cm³) gequencht wurde. Das Gemisch wurde mit Dichlormethan auf 300 cm³ verdünnt und wurde mit Wasser (2 × 200 cm³) gewaschen. Die organische Phase wurde eingedampft, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Flash-Chromatographie unter Verwendung eines Gradienten von 1,0, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5% Methanol in Dichlormethan (Vol.-%, Gesamtvolumen 250 cm³ jeweils) gereinigt, um Nucleosid 11 (1,89 g, 84,4%) als einen weißen Feststoff zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 7.35–7.20 (11H, m, Bn, 6-H), 6.40 (1H, s, 1'-H), 4.57 (1H, s, Bn), 4.52 (1H, s, Bn), 4.46 (1H, d, J 11.0, Bn), 4.29 (1H, d, J 11.0, Bn), 4.07 (1H, dd, J' 0.5, 2.2, 4'-H), 3.95–3.70 (4H, m, 2''-H_a, 2''-H_b, 5'-H_a, 5'-H_b), 2.05 (1H, m, 1''-H_a), 2.42 (1H, m, 1''-H_b), 1.42 (3H, d, J 1.1, 5-CH₃), 0.86 (9H, s, CH₃-C-Si), 0.01 (6H, s, CH₃-Si). δ_C (CDCl₃) 202.6 (C-2'), 163.7 (C-4), 151.2 (C-2), 137.7, 136.6, 136.5 (Bn, C-6), 128.7, 128.5, 128.2, 128.1, 127.7, 126.4, 126.3 (Bn), 110.9 (C-5), 84.5, 81.3, 80.2 (C-1, - C-3', C-4'), 73.6, 70.4 (Bn), 66.0 (C-5'), 57.6 (C-2''), 27.3 (C-1''), 25.9, 25.7, 18.2, –5.8, –5.9 (TBDMS), 11.7 (CH₃). FAB-MS m/z 595.14 [M + H]⁺ (Gef.: C, 64.1; H, 6.9; N, 4.5; C₃₂H₄₂O₇N₂Si ber. C, 64.6; H, 7.1; N, 4.7%).
Beispiel 15
(1S,5R,6R,8R)-1-Hydroxy-5-benzyloxy-6-benzyloxymethyl-8-(thymin-1-yl)-2,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan (12). Verbindung 11 (1,80 g, 30,0 mmol) wurde in 0,5% HCl in Methanol (Gew.-%, 20 cm³) aufgelöst, und das Gemisch wurde 30 min lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach Eindampfen bis zur Trockenen wurde der Rückstand in Dichlormethan (100 cm³) aufgelöst und mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (2 × 40 cm³) gewaschen. Die organische Phase wurde eingedampft, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Flash-Chromatographie, Elution mit 2% Methanol in Dichlormethan (Vol.-%), gereinigt, um Nucleosid 12 (1,35 g, 93,5%) als einen weißen Feststoff zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 7.37–7.27 (11H, m, Bn, 6-H), 5.87 (1H, s, 1'-H), 4.71 (2H, s, Bn), 4.64 (1H, d, J 12.0, Bn), 4.56 (1H, d, J 12.0, Bn), 4.36 (1H, t, J 5.7, 4'-H), 4.16 (1H, m, 2''-H_a), 3.96 (1H, m, 2''-H_b), 3.74 (2H, m, 5'-H_a, 5'-H_b), 2.35–2.15 (2H, m, 1''-H_a, 1''-H_b), 1.88 (3H, s, CH₃). δ_C (CDCl₃) 163.7 (C-4), 151.4 (C-2), 137.8, 137.3, 136.7 (Bn, C-6), 128.5, 128.4, 128.0, 127.8, 127.5 (Bn), 109.9 (C-5), 108.6 (C-2'), 88.8, 87.1, 80.9 (C-1', C-3', C-4'), 73.6, 68.5, 68.1, 67.9 (C-5', C-2'', Bn), 30.9 (C-1''), 12.6 (CH₃). FAB-MS: m/z 481.03 [M + H]⁺, 503.02 [M + Na]⁺ (Gef.: C, 64.6; H, 5.8; N, 5.7; C₂₆H₂₈O₇N₂ ber. C, 65.0; H, 5.9; N, 5.8%).
Beispiel 16
(1S,5R,6R,8R)-1,5-Dihydroxy-6-hydroxymethyl-8-(thymin-1-yl)-2,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan (13). Verbindung 13 wurde erfolgreich aus Verbindung 12 durch katalytisches Entfernen der Benzylschutzgruppe auf dieselbe Weise wie bei der Herstellung von 6 erhalten. Die Reinigung von 13 erfolgte durch Kieselgel-Säulenchromatographie, Elution mit Gradientenkonzentrationen (6 bis 14%) von Methanol in Dichlormethan. Analytische Mengen von Verbindung 13 (bis zu 15 mg) wurden zusätzlich durch Umkehrphasen-HPLC auf einer Säule (10 × 250 mm), die mit Nucleosil C18 (10 μm) gepackt war, gereinigt. Durchflussgeschwindigkeit: 8 cm³/min; Elutionsmittel: 0–10% Acetonitril in 60 min. Ausbeute: 82%.
δ_H (CD₃OD) 7.44 (1H d, J 1.2, 6-H), 5.83 (1H, s, 1'-H), 4.10–3.80 (5H, m, 5'-H_a, 5'-H_b, 2''-H_a, 2''-H_b, 4'-H), 2.39–2.25 (1H, m, 1''-H_a), 2.00–1.90 (1H, m, 1''-H_b), 1.87 (3H, d, J 1.2, CH₃). δ_C (CD₃OD) 166.3 (C-4), 152.7 (C-2), 139.8 (C-6), 110.0, 109.6 (C-2', C-5), 87.8, 85.8, 84.6 (C-1', C-3', C-4'), 68.8, 61.6 (C-5', C-2''), 35.6 (C-1''), 12.4 (CH₃). FAB-MS: m/z 301.03 [M + H]⁺ (Gef.: C, 46.6; H, 5.7; N, 8.5; C₁₂H₁₆O₇N₂ ber. C, 48.0; H, 5.4; N, 9.3%).
Beispiel 17
(1S,5R,6R,8R)-5-Benzyloxy-6-benzyloxymethyl-1-methoxy-8-(3-N-methylthymin-1-yl)-2,7-dioxabicylo[3.3.0]octan (14), (1S,5R,6R,8R)-5-Benzyloxy-6-benzyloxymethyl-1-hydroxy-8-(3-N-methylthymin-1-yl)-2,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan (15) und (1S,5R,6R,8R)-5-Benzyloxy-6-benzyloxymethyl-1-methoxy-8-(thymin-1-yl)-2,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan (16). Ein Gemisch aus Verbindung 12 (1,04 g, 2,16 mmol) und Natriumhydrid (171 mg einer 60%igen Suspension in Mineralöl, 4,30 mmol) wurde in wasserfreiem Dichlormethan (4 cm³) im Laufe von 10 min unter Rühren aufgelöst. Methyliodid (1 cm³, 16 mmol) wurde zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde bei 36°C 23 h lang inkubiert. Nach Eindampfen wurde der Rückstand durch Kieselgel-Säulenchromatographie, Elution mit einem Gradienten von 0,4–2,4% Methanol in Dichlormethan (Vol.-%), gereinigt, um die Produkte 14, 15 und 16 und das Ausgangsmaterial 12 (212 mg, 20,5%) zu ergeben. Verbindung 14 (47 mg, 4,3%).
δ_H (CDCl₃) 7.25–7.37 (11H, m, Bn, 6-H), 6.15 (1H, s, 1'-H), 4.74 (1H, d, J 11.5, Bn), 4.67 (1H, d, J 11.3, Bn), 4.62 (1H, d, J 12.1, Bn), 4.55 (1H, d, J 11.9, Bn), 4.34 (1H, t, J 5.6, 4'-H), 3.99, (1H, m, 2''-H_a), 4.22 (1H, m, 2''-H_b), 3.72 (2H, m, 5'-H_a, 5'-H_a), 3.41 (3H, s, CH₃-O), 3.35 (3H, s, CH₃-N³), 2.27 (1H, m, 1''-H_a), 2.41 (1H, m, 1''-H_b), 1.93 (3H, s, 5-CH₃), δ_C (CDCl₃) 163.3 (C-4), 151.0 (C-2), 138.2, 137.3, 135.7 (Bn, C-6), 128.3, 128.2, 127.8, 127.6, 127.4, 126.9 (Bn), 11 1.8 (C-5), 108.5 (C-2'), 89.1, 84.8, 79.5 (C-1', C-3', C-4'), 73.5, 68.4, 68.2, 67.3 (Bn, C-5', C-2''), 50.8 (CH₃-O), 32.6 (C-1''), 27.9 (CH₃-N), 13.2 (CH₃). FAB-MS: m/z 508.88 [M + H]⁺ (Gef.: C, 65.7; H, 6.9; N; 4.8; C₂₈H₃₂O₇N₂ ber. C, 66.1; H, 6.3; N, 5.5%). Verbindung 15 (97 mg, 9.1%). δ_H (CDCl₃) 7.37–7.28 (11H, m, Bn, 6-H), 5.86 (1H, s, 1'-H), 4.72 (2H, s, Bn), 4.64 (1H, d, J 11.9, Bn), 4.58 (1H, d, J 11.9, Bn), 4.37 (1H, t, J 5.6, 4'-H), 4.13 (1H, m, 2''-H_a), 3.93 (1H, m, 2''-H_b), 3.75 (2H, m, 5'-H_a, 5'-H_b), 3.34 (1H, s, CH₃-N), 2.32–2.16 (2H, m, 1''-H_a, 1''-H_b), 1.93 (3H, s, CH₃). δ_C (CDCl₃) 163.2 (C-4), 151.9 (C-2), 137.5, 137.1, 134.0 (Bn, C-6), 128.4, 128.3, 128.1, 127.9 127.7, 127.6, 127.3 (Bn), 108.8, 108.5 (C-2', C-5), 88.7 (C-1'), 88.0, 81.0 (C-3', C-4'), 73.5, 68.3, 67.9, 67.7 (Bn, C-5', C-2''), 30.6 (C-1''), 27.8 (CH₃-N), 13.2 (CH₃). FAB-MS m/z 495.28 [M + H]⁺, 517.24 [M + Na]⁺. Verbindung 16 (665 mg, 62.3%). δ_H (CDCl₃) 7.35–7.25 (11H, m, Bn, 6-H), 6.06 (1H, s, 1'-H), 4.73 (1H, d, J 11.5, Bn), 4.66 (1H, d, J 11.3, Bn), 4.61 (1H, d, J 11.9, Bn), 4.55 (1H, d, J 12.0, Bn), 4.34 (1H, t, J 5.6, 4'-H), 4.20 (1H, m, 2''-H_a), 3.98 (1H, m, 2''-H_b), 3.72 (2H, m, 5'-H_a, 5'-H_b), 3.40 (3H, s, CH₃-O), 2.45–2.35 (1H, m, 1''-H_a), 2.30–2.20 (1H, m, 1''-H_b), 1.90 (3H, d, J 1.1, CH₃). δ_C (CDCl₃) 163.2 (C-4), 150.1 (C-2), 138.2, 137.9, 137.3 (Bn, C-6), 128.4, 128.2, 127.8, 127.6 127.4, 127.1 (Bn), 110.8 (C-5), 109.3 (C-2'), 89.2, 84.2, 79.6 (C-1', C-3', C-4'), 73.6, 68.5, 68.3, 67.4 (Bn, C-5', C-2''), 50.8 (CH₃-O), 32.6 (C-1''), 12.5 (CH₃). FAB-MS m/z 495.22 [M + H]⁺, 517.23 [M + Na]⁺ (Gef.: C, 66.2; H, 7.2; N, 4.4; C₂₇H₃₀O₇N₂ ber. C, 65.6; H, 6.1; N, 5.7%).
Beispiel 18
(1S,5R,6R,8R)-5-Hydroxy-6-hydroxymethyl-1-methoxy-8-(thymin-1-yl)-2,7-dioxabicycly[3.3.0]octan (17). Zu einer Lösung von Nucleosid 16 (1,20 g, 2,43 mmol) in Methanol (10 cm³) wurden 20% Palladiumhydroxid auf künstlicher Kohle (250 mg) zugesetzt, und das Gemisch wurde sorgfältig unter reduziertem Druck entgast. Eine Wasserstoffatmosphäre wurde angelegt, und das Rühren wurde 12 h lang fortgesetzt. Der Katalysator wurde durch Filtration des Reaktionsgemischs durch eine Glassäule (1 × 8 cm), die mit Kieselgel in Methanol gepackt war, entfernt. Die Säule wurde zusätzlich mit Methanol (20 cm³) gewaschen. Alle Fraktionen wurden gesammelt, bis zur Trockenen eingedampft und mit Petroleumether zusammen eingedampft, um einen glasähnlichen Feststoff zu ergeben. Dieser Rückstand wird durch Kieselgel-Chromatographie, Elution mit einem Gradienten von 5–10% Methanol in Dichlormethan (Vol.-%), gereinigt. Die Fraktionen, die das Produkt enthalten, wurden gesammelt, vereinigt und bis zur Trockenen eingedampft. Der Rückstand wurde in wasserfreiem Methanol (5 cm³) aufgelöst, und wasserfreies Benzol (100 cm³) wurde zugesetzt. Lyophilisierung ergab Nucleosid 17 (0,61 g, 79%) als einen weißen Feststoff.
δ_H (CD₃OD) 7.45 (1H, s, 6-H), 5.93 (1H, s, 1'-H), 4.15–3.81 (5H, m, 5'-H_a, 5'-H_b, 2''-H_a, 2''-H_b, 4'-H), 3.43 (3H, s, CH₃-O), 2.47–2.40 (1H, m, 1''-H_a), 2.03–1.93 (1H, m, 1''-H_b), 1.92 (3H, s, CH₃). δ_C (CD₃OD) 164.1 (C-4), 150.1 (C-2), 138.3 (C-6), 109.6 (C-5), 108.3 (C-2'), 84.4, 84.1, 82.4 (C-1', C-3', C-4'), 68.0, 59.5 (C-5', C-2''), 49.6 (CH₃-O), 34.0 (C-1''), 10.5 (CH₃). FAB-MS m/z 315.13 [M + H]⁺, 337.09 [M + Na]⁺ (Gef.: C, 49.9; H, 5.7; N, 8.2; C₁₃H₁₈O₇N₂ ber. C, 49.7; H, 5.8; N, 8.9%).
Beispiel 19
(1S,5R,6R,8R)-6-(4,4'-Dimethoxytrityloxymethyl)-5-hydroxy-1-methoxy-8-(thymin-1-yl)-2,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan (18). Ein Gemisch von Verbindung 17 (0,95 g, 3,03 mmol) und 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (1,54 g, 4,77 mmol) wurde in wasserfreiem Pyridin (20 cm³) aufgelöst und 4 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde eingedampft, um einen öligen Rückstand zu ergeben, der mit Toluol (2 × 20 cm³) zusammen eingedampft wurde. Dichlormethan (50 cm³) und eine gesättigte wässrige Lösung von Natriumhydrogencarbonat (50 cm³) wurden zugesetzt, die organische Phase wurde getrennt und eingedampft, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-HPLC gereinigt (der Rückstand wurde in der Mindestmenge von Dichlormethan, das 0,5% Triethylamin (Vol.-%) enthielt, aufgelöst und auf die Säule, die mit demselben Lösungsmittel äquilibriert war, aufgetragen). Die Säule wurde gewaschen (Ethylacetat:Petroleumether:Triethylamin; 15:84,5:0,5 (Vol./Vol./Vol., 1.000 cm³), und das Produkt wurde in einem Gradienten von Methanol (0–2%) in Dichlormethan, das 0,5% Triethylamin (Vol.-%) enthielt, eluiert, um die Verbindung 18 (1,71 g, 92,8%) als weißen Feststoff zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 7.51–7.17 (10H, m, DMT, 6-H), 6.79–6.85 (4H, m, DMT), 6.04 (1H, s, 1'-H), 4.12–3.98 (3H, m, 5'-H_a, 5'-H_b, 4'-H), 3.77 (6H, s, CH₃-DMT), 3.49 (3H, s, CH₃-O), 3.45–3.32 (2H, m, 2''-H_a, 2''-H_b), 2.11–2.01 (1H, m, 1''-H_a), 1.94–1.87 (1H, m, 1''-H_b), 1.93 (3H, s, CH₃). δ_C (CDCl₃) 164.2 (C-4), 158.6, 144.7, 135.7, 130.1, 128.2, 127.9, 126.8, 113.2 (DMT), 150.7 (C-2), 137.7 (C-6), 109.8, 109.7 (C-5, C-2'), 86.5, 85.3, 85.0, 81.4 (DMT, C-1', C-3', C-4'), 69.2, 62.4 (C-5', C-2''), 55.2 (CH₃-DMT), 51.7 (CH₃-O), 35.5 (C-1''), 12.7 (CH₃). FAB-MS m/z 617.26 [M + H]⁺, 639.23 [M + Na]⁺ (Gef.: C, 66.4; H, 6.1; N, 4.2; C₃₄H₃₆O₉N₂ ber. C, 66.2; H, 5.9; N, 4.5%).
Beispiel 20
(1S,5R,6R,8R)-5-(2-Cyanoethoxy(diisopropylamino)phosphinoxy)-6-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-1-methoxy-8-(thymin-1-yl)-2,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan (19). Verbindung 18 (1,2 g, 1,95 mmol) wurde in wasserfreiem Dichlormethan (10 cm³) aufgelöst. N,N-Diisopropylethylamin (1,35 cm³, 7,8 mmol) und 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidochloridit (0,92 g, 3,9 mmol) wurden unter Rühren bei Raumtemperatur zugesetzt. Nach 72 h wurde das Gemisch durch Dichlormethan auf 100 cm³ verdünnt und durch eine gesättigte wässrige Lösung von Natriumhydrogencarbonat (50 cm³) gewaschen. Die organische Phase wurde eingedampft und bei Kieselgel-HPLC-Reinigung unter Verwendung eines Gradienten von Elutionsmittel B (Petroleumether:Dichlormethan:Ethylacetat:Pyridin; 45:45:10:0,5; Vol./Vol./Vol.) in Elutionsmittel A (Petroleumether:Dichlormethan:Pyridin; 50:50:0,5; Vol./Vol./Vol.) eingesetzt. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden konzentriert, zusammen mit Toluol (10 cm³) eingedampft und unter reduziertem Druck getrocknet. Der Rückstand wurde in wasserfreiem Benzol (20 cm³) aufgelöst und durch Addition dieser Lösung zu wasserfreiem Petroleumether (400 cm³) unter Rühren gefällt. Der resultierende weiße Feststoff wurde durch Filtration isoliert und getrocknet, um Verbindung 19 (0,96 g, 60,3%) zu ergeben. δ_P (CDCl₃) 142,64, 142,52. FAB-MS m/z 817,26 [M + H]⁺, 839,24 [M + Na]⁺ (Gefunden: C, 62,8; H, 6,4; N, 6,9; C₄₃H₅₃O₁₀N₄P ber. C, 63,2; H, 6,5; N, 6,9%).
Beispiel 21
1,2-O-Isopropyliden-3-C-vinyl-α-D-ribofuranose (20). Eine Lösung von 5-O-t-Butyldimethylsilyl-1,2-O-isopropyliden-α-D-erythro-pent-3-ulofuranose (Y. Yoshimura, T. Sano, A. Matsuda, T. Ueda, Chem. Pharm. Bull. 36, 162 (1988)) (6,05 g, 0,020 mol) in wasserfreiem THF (250 cm³) wurde bei 0°C gerührt, und eine 1 M Lösung von Vinylmagnesiumbromid in Ether (44 cm³, 44 mmol) wurde zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 2 h lang gerührt, wobei gesättigtes wässriges Ammoniumchlorid (200 cm³) zugesetzt wurde, und die Extraktion wurde unter Verwendung von Dichlormethan (3 × 300 cm³) durchgeführt.
Der vereinigte Extrakt wurde mit Salzlauge (3 × 250 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde entfernt, und der Rückstand wurde in wasserfreiem THF (225 cm³) neuerlich aufgelöst. Zu diesem Gemisch wurde eine 1 M Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid in THF (22 cm³, 22 mmol) zugesetzt, und das Rühren bei Raumtemperatur wurde 20 min lang fortgesetzt, wobei das Gemisch unter reduziertem Druck eingedampft wurde. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (500 cm³) aufgelöst und mit einer gesättigten Lösung von Natriumhydrogencarbonat (2 × 200 cm³) gewaschen. Die wässrige Phase wurde unter Verwendung von kontinuierlicher Extraktion 12 h lang extrahiert, und der vereinigte Extrakt wurde getrocknet (Na₂SO₄) und eingedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (99:1, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Furanose 20 als einen weißen Feststoff (3,24 g, 75%) zu erhalten.
δ_H (CDCl₃) 5.84 (1H, d, J 3.7, 1-H), 5.74 (1H, dd, J 11.0, 17.2, 1'-H), 5.52 (1H, dd, J 1.6, 17.1, 2'-H_a), 5.29 (1H, dd, J 1.3, 11.0, 2'-H_b), 4.21 (1H, d, J 3.7, 2-H), 3.98 (1H, t, J 5.7, 4-H), 3.68–3.64 (2H, m, 5-H_a, 5-H_b), 2.88 (1H, s, 3-OH), 1.99 (1H, t, J 6.3, 5-OH), 1.60 (3H, s, CH₃), 1.35 (3H, s, CH₃). δ_C (CDCl₃) 133.6 (C-1'), 116.2 (C-2'), 113.0 (C(CH₃)₂), 103.8 (C-1), 83.4, 82.4 (C-4, C-2), 79.6 (C-3), 61.3 (C-5), 26.5, 26.4 (CH₃).
Beispiel 22
3,5-Di-O-benzyl-1,2-O-isopropyliden-3-C-vinyl-α-D-ribofuranose (21). Eine 60%ige Suspension von Natriumhydrid (Gew.-%, 44,5 mmol) in wasserfreiem DMF (50 cm³) wurde bei 0°C gerührt, und eine Lösung von Furanose 20 (3,20 g, 14,8 mmol) in wasserfreiem DMF (35 cm³) wurde 30 min lang zugetropft. Das Gemisch wurde bei 50°C 1 h lang gerührt und daraufhin auf 0°C gekühlt. Eine Lösung von Benzylbromid (5,3 ml, 44,5 mmol) in wasserfreiem DMF (5,3 cm³) wurde zugetropft, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 20 h lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde eingedampft und in Dichlormethan (300 cm³) neuerlich aufgelöst, mit gesättigtem wässrigem Natriumhydrogencarbonat (3 × 200 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Die Lösungsmittel wurden unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Petroleumether/Ethylacetat (9:1, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Furanose 21 in Form eines weißen Feststoffes (5,36 g, 91%) zu erhalten.
δ_H (CDCl₃) 7.40–7.26 (10H, m, Bn), 5.90 (1H, d, J 3.6, 1-H), 5.72 (1H, dd, J 11.1, 17.9, 1'-H), 5.41 (1H, dd, J 0.7, 11.1, 2'-H_a), 5.30 (1H, dd, J 0.5, 17.8, 2'-H_b), 4.70–4.45 (6H, m, Bn, 2-H, 4-H), 3.69 (1H, dd, J 2.6, 10.8, 5-H_a), 3.50 (1H, dd, J 7.9, 10.9, 5-H_b), 1.64 (3H, s, CH₃), 1.40 (3H, s, CH₃). δ_C (CDCl₃) 138.6, 138.3 (Bn), 134.5 (C-1'), 128.3–127.4 (Bn), 118.2 (C-2'), 112.9 (C(CH₃)₂), 104.7 (C-1), 84.7, 81.1, 81.0 (C-2, C-3, C-4), 73.3 (C-5), 69.4, 67.0 (Bn), 26.8, 26.6 (CH₃).
Beispiel 23
1,2-Di-O-acetyl-3,5-di-O-benzyl-3-C-vinyl-α,β-D-ribofuranose (22). Eine Lösung von Furanose 21 (4,40 g, 11,1 mmol) in 80%iger wässriger Essigsäure (50 cm³) wurde bei 90°C 8 h lang gerührt. Die Lösungsmittel wurden entfernt, und der Rückstand wurde mit 99% Ethanol (3 × 25 cm³), Toluol (3 × 25 cm³) und wasserfreiem Pyridin (2 × 25 cm³) zusammen eingedampft und in wasserfreiem Pyridin (20 cm³) neuerlich aufgelöst. Essigsäureanhydrid (17 cm³) wurde zugesetzt, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur 48 h lang gerührt. Die Reaktion wurde mit eiskaltem Wasser (100 cm³) gequencht und mit Dichlormethan (2 × 100 cm³) extrahiert. Der vereinigte Extrakt wurde mit gesättigtem wässrigem Natriumhydrogencarbonat (3 × 100 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Petroleumether/Ethylenacetat (4:1, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Furanose 22 als ein Öl (4,27 g, 87%, α:β ≈ 1:1) zu erhalten.
δ_C (CDCl₃) 169.9, 169.8 (C=O), 139.0, 138.6, 138.0, 137.8 (Bn), 133.3, 132.4 (C-1'), 128.4–126.8 (Bn), 119.6, 119.5 (C-2'), 99.5, 94.0 (C-1), 85.4, 85.0, 84.3, 83.6, 77.7, 73.6, 73.5, 73.3, 70.0, 69.2, 67.5, 67.2 (C-2, C-3, C-4, C-5, Bn), 21.0, 20.9, 20.6, 20.4 (CH₃).
Beispiel 24
1-(2-O-Acetyl-3,5-di-O-benzyl-3-C-vinyl-β-D-ribofuranosyl)thymin (23). Zu einer gerührten Lösung von Verbindung 22 (4,24 g, 9,6 mmol) und Thymin (2,43 g, 19,3 mmol) in wasserfreiem Acetonitril (100 cm³) wurde N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamid (11,9 cm³, 48,1 mmol) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rückfluss 30 min lang gerührt. Nach Abkühlen auf 0°C wurde Trimethylsilyltriflat (3,2 cm³, 16,4 mmol) zugetropft, und die Lösung wurde 24 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde mit kaltem gesättigtem wässrigem Natriumhydrogencarbonat (100 cm³) gequencht, und das resultierende Gemisch wurde mit Dichlormethan (3 × 50 cm³) extrahiert. Der vereinigte Extrakt wurde mit gesättigtem wässrigem Natriumhydrogencarbonat (2 × 50 cm³) und Salzlauge (2 × 50 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Der Extrakt wurde unter reduziertem Druck eingedampft, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (99:1, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 23 in Form eines weißen Schaums (4,03 g, 83%) zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 8.78 (1H, br s, NH), 7.75 (1H, s, 6-H), 7.38–7.26 (10H, m, Bn), 6.49 (1H, d, J 8.1, 1'-H), 5.99–5.88 (2H, m, 2'-H und 1''-H), 5.54–5.48 (2H, m, 2''-H_a, 2''-H_b), 4.91–4.50 (4H, m, Bn), 4.34 (1H, s, 4'-H), 3.80 (1H, m, 5'-H_a), 3.54 (1H, m, 5'-H_b), 2.11 (3H, s, COCH₃), 1.48 (3H, s, CH₃). δ_C (CDCl₃) 170.1 (C=O), 163.8 (C-4), 151.0 (C-2), 138.9, 136.9 (Bn), 136.1 (C-6), 132.0 (C-1''), 128.7, 128.5, 128.2, 127.8, 127.7, 127.5, 127.5, 127.1 (Bn), 120.7 (C-2''), 111.3 (C-5), 85.4 (C-1'), 85.2 (C-3'), 84.3 (C-4'), 76.0 (C-2'), 73.7 (C-5'), 69.3, 67.6 (Bn), 20.6 (COCH₃), 11.7 (CH₃). Gef.: C, 66.3; H, 6.0; N, 5.1; C₂₈H₃₀N₂O₇ ber. C, 66.4 H, 6.0; N, 5.5%.
Beispiel 25
1-(3,5-Di-O-benzyl-3-C-vinyl-β-D-ribofuranosyl)thymin (24). Zu einer gerührten Lösung von Nucleosid 23 (3,90 g, 7,7 mmol) in wasserfreiem Methanol (40 cm³) wurde Natriummethoxid (0,83 g, 15,4 mmol) zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 42 h lang gerührt und dann mit verdünnter wässriger Salzsäure neutralisiert. Das Gemisch wurde mit Dichlormethan (2 × 150 cm³) extrahiert, dann wurde der vereinigte Extrakt mit gesättigtem wässrigem Natriumhydrogencarbonat (3 × 100 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, um Nucleosid 24 in Form eines weißen Schaums (3,48 g, 97%) zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 8.89 (1H, br s, NH), 7.60 (1H, d, J 0.9, 6-H), 7.36–7.26 (10H, m, Bn), 6.23 (1H, d, J 7.8, 1'-H), 5.98 (1H, dd, J 11.2, 17.7, 1''-H), 5.66 (1H, d, J 17.7, 2''-H_a), 5.55 (1H, d, J 11.5, 2''-H_b), 4.75–4.37 (6H, m, 2'-H, 4'-H, B_n), 3.84 (1H, dd, J 2.7, 10.8, 5'-H_a), 3.58 (1H, d, J 11.2, 5'-H_b), 3.23 (1H, d, J 10.6, 2'-OH), 1.50 (3H, s, CH₃). δ_C (CDCl₃) 163.7 (C-4), 151.3 (C-2), 138.0, 136.9 (Bn), 136.0 (C-6), 131.2 (C-1''), 128.8, 128.6, 128.3, 127.8, 127.7, 127.3 (Bn), 120.7 (C-2''), 111.3 (C-5), 87.3 (C-1'), 84.6 (C-3'), 81.4 (C-4'), 78.0 (C-2'), 73.7 (C-5'), 70.0, 66.4 (Bn), 11.8 (CH₃). Gef.: C, 66.8; H, 6.2; N, 5.9; C₂₆H₂₈N₂O₆ ber. C, 67.2; H, 6.1; N, 6.0%.
Beispiel 26
1-(3,5-Di-O-benzyl-2-O-methansulfonyl-3-C-vinyl-β-D-ribofuranosyl)thymin (25). Nucleosid 24 (2,57 g, 5,53 mmol) wurde in wasserfreiem Pyridin (18 cm³) aufgelöst und auf 0°C gekühlt. Methansulfonylchlorid (1,28 cm³, 16,6 mmol) wurde zugetropft, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 30 min lang gerührt. Die Reaktion wurde mit Wasser (5 cm³) gequencht, und das resultierende Gemisch wurde mit Dichlormethan (3 × 80 cm³) extrahiert. Der vereinigte Extrakt wurde mit gesättigtem wässrigem Natriumhydrogencarbonat (3 × 120 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck eingedampft, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (99:1, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 25 in Form eines gelben Schaums (2,53 g, 84%) zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 8.92 (1H, br s, NH), 7.71 (1H, d, J 1.4, 6-H), 7.41–7.28 (10H, m, Bn), 6.57 (1H, d, J 7.8, 1'-H), 5.99–5.61 (4H, m, 2'-H, 1''-H and 2''-H_a, 2''-H_b), 4.86–4.50 (4H, m, Bn), 4.37 (1H, dd, J 1.5, 2.4, 4'-H), 8.82 (1H, dd, J 2.6, 11.0, 5'-H_a), 3.55 (1H, dd, J 1.2, 11.0, 5'-H_b), 3.02 (3H, s, CH₃), 1.47 (3H, d, J 1.1, CH₃). δ_C (CDCl₃) 163.7 (C-4), 151.5 (C-2), 138.7, 136.7 (Bn), 135.7 (C-6), 130.9 (C-1''), 128.8, 128.5, 128.4, 127.6, 127.0 (Bn), 121.8 (C-2''), 111.9 (C-5), 85.1 (C-1'), 84.5 (C-3'), 84.0 (C-4'), 80.7 (C-2'), 73.7 (C-5'), 69.2, 67.7 (Bn), 38.9 (CH₃), 11.8 (CH₃).
Beispiel 27
1-(3,5-Di-O-benzyl-3-C-vinyl-β-D-arabinofuranosyl)thymin (26). Eine Lösung von Nucleosid 25 (2,53 g, 4,66 mmol) in einem Gemisch von Ethanol (50 cm³), Wasser (50 cm³) und 1 M wässrigem Natriumhydroxid (15 cm³) wurde unter Rückfluss 16 h lang gerührt. Das Gemisch wurde unter Verwendung von verdünnter wässriger Salzsäure neutralisiert, das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck abgedampft, und der Rückstand wurde mit Dichlormethan (3 × 120 cm³) extrahiert. Der vereinigte Extrakt wurde mit gesättigtem wässrigem Natriumhydrogencarbonat (3 × 150 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (99:1) als Elutionsmittel gereinigt, um 26 in Form eines weißen Schaums (1,61 g, 74%) zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 9.89 (1H, br s, NH), 7.50 (1H, d, J 1.1, 6-H), 7.41–7.26 (Bn), 6.28 (1H, d, J 2.8, 1'-H), 6.05 (1H, dd, J 11.1, 17.9, 1''-H), 5.58–5.50 (2H, m, 2''-H_a, 2''-H_b), 4.98 (1H, d, J 9.0, 2'-OH), 4.64–4.31 (6H, m, 2'-H, 4'-H, Bn), 3.73 (2H, m, 5'-H_a, 5'-H_b), 1.73 (1H, d, J 0.6, CH₃). δ_C (CDCl₃) 165.1 (C-4), 150.5 (C-2), 138.4, 138.0, 136.7 (C-6, Bn), 130.4 (C-1''), 128.8, 128.6, 128.5, 128.1, 128.0, 127.8 (Bn), 120.6 (C-2''), 108.1 (C-5), 88.6 (C-1'), 87.9 (C-3'), 87.2 (C-4'), 73.7 (C-2'), 71.8 (C-5'), 69.7, 66.3 (Bn), 12.3 (CH₃). Gef.: C, 66.8; H, 6.2; N, 5.9; C₂₆H₂₈N₂O₆ ber. C, 67.2; H, 6.1; N, 6.0.
Beispiel 28
1-(3,5-Di-O-benzyl-3-C-hydroxymethyl-β-D-arabinofuranosyl)thymin (27). Zu einer Lösung von Nucleosid 26 (2,00 g, 4,31 mmol) in einem Gemisch von THF (15 cm³) und Wasser (15 cm³) wurden Natriumperiodat (2,76 g, 12,9 mmol) und eine 2,5%ige Lösung von Osmiumtetraoxid in t-Butanol (Gew.-%, 0,54 cm³, 43 μmol) zugesetzt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 18 h lang gerührt und mit Wasser (50 cm³) gequencht, und das Gemisch wurde mit Dichlormethan (2 × 100 cm³) extrahiert. Der vereinigte Extrakt wurde mit gesättigtem wässrigem Natriumhydrogencarbonat (3 × 75 cm³) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde in einem Gemisch aus THF (15 cm³) und Wasser (15 cm³) erneut gelöst, und Natriumborhydrid (488 mg, 12,9 mmol) wurde zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 1 h lang gerührt, Wasser (50 cm³) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde mit Dicklormethan (2 × 100 cm³) extrahiert. Die vereinigte organische Phase wurde mit gesättigtem wässrigem Natriunhydrogencarbonat (3 × 75 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde entfernt, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (98:2, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 27 in Form, eines weißen Schaums (732 mg, 36%) zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 11.09 (1H, br s, NH), 7.41 (1H, d, J 1.0, 6-H), 7.38–7.26 (Bn), 6.16 (1H, d, J 2.6, 1'-H), 5.12 (1H, d, J 5.4, 2'-OH), 4.66–4.29 (6H, m, 2'-H, 4'-H, Bn), 4.02–3.96 (2H, m, 1''-H_a, 1''-H_b), 3.90 (1H, dd, J 7.2, 9.7, 5'-H_a), 3.79 (1H, dd, J 5.6, 9.7, 5'-H_b), 2.49 (1H, t, J 6.4, 1''-OH), 1.68 (3H, d, J 0.6, CH₃); δ_C (CDCl₃) 166.1 (C-4), 150.6 (C-2), 139.0, 137.9, 137.0 (C-6, Bn), 128.7, 128,6, 128.4, 128.3, 128.0 (Bn), 107.5 (C-5), 88.2 (C-1') 88.1 (C-3'), 84.2 (C-4'), 73.7 (C-5'), 72.1 (C-2'), 69.3, 65.4 (Bn), 58.6 (C-1''), 12.3 (CH₃).
Beispiel 29
(1R,2R,4R,5S)-1-Benzyloxy-2-benzyloxymethyl-4-(thymin-1-yl)-3,6-dioxabicyclo[3.2.0]heptan (28). Eine Lösung von Verbindung 27 (2,26 g, 4, 83 mmol) in wasserfreiem Pyridin (20 cm³) wurde bei –40°C gerührt, und eine Lösung von Methansulfonylchlorid (0,482 cm³, 4,83 mmol) in wasserfreiem Pyridin (10 cm³) wurde zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 17 h lang gerührt, Wasser (50 cm³) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde mit Dichlormethan (2 × 100 cm³) extrahiert. Die vereinigte organische Phase wurde mit gesättigtem wässrigem Natriumhydrogencarbonat (3 × 100 cm³) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (99:1, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um ein Zwischenprodukt zu erhalten, das nach Verdampfen der Lösungsmittel in wasserfreiem DMF (15 cm³) aufgelöst wurde. Diese Lösung wurde zu einer Suspension von 60% Natriumhydrid (461 mg, 11,5 mmol) in wasserfreiem DMF (15 cm³) bei 0°C zugetropft. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 30 min lang gerührt, dann mit Wasser (60 cm³) gequencht. Nach Neutralisierung unter Verwendung von verdünnter wässriger Satzsäure wurde das Gemisch in Dichlormethan (150 cm³) aufgelöst, mit gesättigtem wässrigem Natriumhydrogencarbonat (3 × 100 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Die Lösungsmittel wurden verdampft, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (99:1, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 28 in Form eines weißen Schaums (2,00 g, 93%) zu erhalten.
δ_H (CDCl₃) 9.13 (1H, br s, NH), 7.55 (1H, d, J 1.4, 6-H), 7.40–7.26 (Bn), 5.99 (1H, d, J 2.5, 1'-H), 5.30 (1H, d, J 2.7, 2'-H), 4.88–4.57 (6H, m, 1''-H_a, 1''-H_b, Bn), 4.22–4.19 (1H, m, 4'-H), 3.92 (1H, dd, J 6.2, 10.8, 5'-H_a), 3.82 (1H, dd, J 3.7, 10.8, 5'-H_b), 1.91 (3H, d, J 1.3, CH₃). δ_C (CDCl₃) 163.8 (C-4), 150.3 (C-2), 137.6 (C-6), 137.5, 137.0 (Bn), 128.7, 128.6, 128.2, 128.0, 127.8, 127.3 (Bn), 109.8 (C-5), 85.7 (C-3'), 84.1 (C-1'), 83.5 (C-4'), 79.7 (C-1''), 73.9 (C-2'), 73.6 (C-5'), 68.6, 67.8 (Bn), 12.4 (CH₃). FAB m/z 451 [M + H]⁺, 473 [M + Na]⁺. Gef.: C, 66.3; H, 5.9; N, 6.1; C₂₅H₂₆N₂O₆ ber. C, 66.7; H, 5.8; N; 6.2%.
Beispiel 30
(1R,2R,4R,5S)-1-Hydroxy-2-hydroxymethyl-4-(thymin-1-yl)-3,6-dioxabicyclo[3.2.0]heptan (29). Zu einer gerührten Lösung von Nucleosid 28 (180 mg, 0,40 mmol) in Ethanol (3 cm³) wurden 10% Palladiumhydroxid auf Kohlenstoff (90 mg) zugesetzt. Das Gemisch wurde mehrere Male mit Argon entgast und unter Wasserstoffatmosphäre gestellt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 6 h lang gerührt, dann durch Celite filtriert. Das Filtrat wurde unter reduziertem Druck eingedampft, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (96:4, Vol/.Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 29 in Form eines weißen Feststoffs (92 mg, 86%) zu ergeben.
δ_C (CD₃OD) 7.79 (1H, d, J 1.2, 6-H), 5.91 (1H, d, J 2.5, 1'-H), 4.96 (1H, d, J 2.5, 2'-H), 4.92 (1H, d, J 7.4, 1''-H_a), 4.58 (1H, dd, J 0.9, 7.4, 1''-H_b), 3.98 (1H, dd, J 7.3, 12.8, 5'-H_a), 3.87–3.82 (2H, m, 4'-H, 5'-H_b), 3.34 (2H, s, 3'-OH, 5'-OH), 1.87 (3H, d, J 1.3, CH₃). δ_C (CD₃OD) 166.5 (C-4), 152.1 (C-2), 140.1 (C-6), 110.1 (C-5), 91.2 (C-2'), 85.1 (C-1'), 84.0 (C-4'), 79.6 (C-3'), 78.6 (C-1''), 61.1 (C-5'), 12.3 (CH₃).
Beispiel 31
(1R,2R,4R,5S)-1-(2-Cyanoethoxy(diisopropylamino)phosphinoxy)-2-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-4-(thymin-1-yl)-3,6-dioxabicyclo[3.2.0]heptan (30). Zu einer Lösung von Diol 29 (250 mg, 0,925 mmol) in wasserfreiem Pyridin (4 cm³) wurde 4,4'-Dimethoxytritylchlorid. (376 mg, 1,11 mmol) zugesetzt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 18 h lang gerührt. Die Reaktion wurde mit Methanol (1,5 cm³) gequencht, und das Gemisch wurde unter reduziertem Druck eingedampft. Eine Lösung des Rückstands in Dichlormethan (30 cm³) wurde mit gesättigtem wässrigem Natriumhydrogencarbonat (3 × 20 cm³) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und eingedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (98:2, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um ein Zwischenprodukt zu ergeben, das in wasserfreiem Dichlormethan (7,0 cm³) aufgelöst wurde. N,N-Diisopropylethylamin (0,64 cm³, 3,70 mmol), gefolgt von 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidochloridit (0,41 cm³, 1,85 mmol), wurden zugesetzt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 25 h lang gerührt. Die Reaktion wurde mit Methanol (3 cm³) gequencht, und das Gemisch wurde in Ethylacetat (70 cm³) aufgelöst, mit gesättigtem wässrigem Natriumhydrogencarbonat (3 × 50 cm³) und Salzlauge (3 × 50 cm³) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Petroleumether/Dichlormethan/Ethylacetat/Triethylamin (100:45:45:10, Vol./Vol./Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt. Der erhaltene Rückstand wurde in Toluol (2 cm³) aufgelöst und unter Rühren aus Petroleumether bei –50°C gefällt. Nach Verdampfen der Lösungsmittel wurde der Rückstand mit wasserfreiem Acetonitril (4 × 5 cm³) zusammen eingedampft, um 30 in Form eines weißen Schaums (436 mg, 61%) zu ergeben. ³¹P-NMR (CDCl₃) 146,6.
Beispiel 32
3,5-Di-O-benzyl-4-C-hydroxymethyl-1,2-O-isopropyliden-α-D-ribofuranose (31). Zu einer Lösung von 3-O-Benzyl-4-C-hydroxymethyl-1,2-O-isopropyliden-α-D-ribofuranose (R. D. Youssefyeh, J. P. H. Verheyden und J. G. Moffatt, J. Org. Chem. 44, 1301 (1979)) (20,1 g, 0,064 mol) in wasserfreiem DMF (100 cm³) wurde bei –5°C eine Suspension von NaH (60 Gew.-% in Mineralöl, vier Portionen im Laufe von 1 h 30 min, insgesamt 2,85 g, 0,075 mol) zugesetzt. Benzylbromid (8,9 cm³, 0,075 mol) wurde zugetropft, und Rühren bei Raumtemperatur wurde 3 h lang fortgesetzt, währenddessen eiskaltes Wasser (50 cm³) zugesetzt wurde. Das Gemisch wurde mit EtOAc (4 × 100 cm³) extrahiert, und die vereinigte organische Phase wurde getrocknet (Na₂SO₄). Nach Eindampfen wurde der Rückstand durch Kieselgel-Säulenchromatographie-Elution mit 5% EtOAc in Petroleumether (Vol.-%) gereinigt, um Verbindung 31 (18,5 g, 71%) zu ergeben.
δ_C (CDCl₃) 138.0, 137.4, 128.5, 128.3, 128.0, 127.8, 127.6 (Bn), 113.5 (C(CH₃)₂), 104.4 (C-1), 86.5 (C-4), 78.8, 78.6 (Bn), 73.6, 72.6, 71.6 (C-2, C-3, C-5), 63.2, (C-1'), 26.7, 26.1 (CH₃).
Beispiel 33
4-C-(Acetoxymethyl)-3,5-di-O-benzyl-1,2-O-isopropyliden-α-D-ribofuranose (32). Zu einer Lösung von Furanose 31 (913 mg, 2,28 mmol) in wasserfreiem Pyridin (4,5 cm³) wurde Essigsäureanhydrid (1,08 cm³, 11,4 mmol) zugetropft, und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 3 h lang gerührt. Die Reaktion wurde durch Zusatz von eiskaltem Wasser (50 cm³) gequencht, und Extraktion erfolgte mit Dichlormethan (3 × 50 cm³). Die vereinigte organische Phase wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (2 × 50 cm³) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan als Elutionsmittel gereinigt, um Verbindung 32 als ein klares Öl (911 mg, 90%) zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 7.34–7.25 (10H, m, Bn), 5.77 (1H, d, J 3.6, 1-H), 4.78–4.27 (8H, m, Bn, H-5_a, H-5_b, H-3, H-2), 3.58 (1H, d, J 10.3, H-1'_a), 3.48 (1H, d, J 10.5, H-1'_b), 2.04 (3H, s, COCH₃), 1.64 (3H, s, CH₃), 1.34 (3H, s, CH₃). δ_C (CDCl₃) 171.1 (C=O), 138.2, 137.9, 128.6, 128.1, 128.0, 128.0, 127,8 (Bn), 1 14.0 (C(CH₃)₂), 104.5 (C-1), 85.4 (C-4), 79.3, 78.6 (C-2, C-3), 73.7, 72.7, 71.2 (Bn, C-5), 64.9 (C-1'), 26.7, 26.3 (C(CH₃)₂), 21.0 (COCH₃). Gef.: C, 67.0; H, 6.5; C₂₅N₃₀O₇, 1/4H₂O ber. C, 67.2; H, 6.9%.
Beispiel 34
4-C-(Acetoxymethyl)-1,2-di-O-acetyl-3,5-di-O-benzyl-D-ribofuranose (33). Eine Lösung von Furanose 32 (830 mg, 1,88 mmol) in 80% Essigsäure (10 cm³) wurde bei 90°C 4 h lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde mit Ethanol (3 × 5 cm³), Toluol (3 × 5 cm³) und wasserfreiem Pyridin (3 × 5 cm³) zusammen eingedampft und wurde in wasserfreiem Pyridin (3,7 cm³) neuerlich aufgelöst. Essigsäureanhydrid (2,85 cm³) wurde zugesetzt, und die Lösung wurde 72 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde in eiskaltes Wasser (20 cm³) gegossen, und das Gemisch wurde mit Dichlormethan (2 × 20 cm³) extrahiert. Die vereinigte organische Phase wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (2 × 20 cm³) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan als Elutionsmittel gereinigt, um 33 (β:α ≈ 1:3) in Form eines klaren Öls (789 mg, 86%) zu ergeben
δ_C (CDCl₃) 171,0, 170.3, 170.0, 169.3 (C=O), 138.1, 137.6, 136.3, 128.9, 128.6, 128.2, 128.0, 128.0, 127.9, 127.7, 124.0 (Bn), 97.8, 97.8 (C-1), 87.0, 85.0, 78.9, 74.5, 74.4, 73.8, 73.6, 72.0, 71.8, 71.0, 70.9, 64.6, 64.4 (C-2, C-3, C-4, Bn, C-5, C-1'), 21.0, 20.8, 20.6 (COCH₃). Gef.: C, 64.2; H, 6.3; C₂₆H₃₀O₉ ber. C, 64.2; H, 6.2%.
Beispiel 35
1-(4-C-(Acetoxymethyl)-2-O-acetyl-3,5-di-O-benzyl-β-D-ribofuranosyl)thymin (34). Zu einer gerührten Lösung des anomeren Gemisches 33 (736 mg, 1,51 mmol) und Thymin (381 mg, 3,03 mmol) in wasserfreiem Acetonitril (14,5 cm³) wurde N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamid (2,61 cm³, 10,6 mmol) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rückfluss 1 h lang gerührt, dann auf 0°C abgekühlt. Trimethylsilyltriflat (0,47 cm³, 2,56 mmol) wurde unter Rühren zugetropft, und die Lösung wurde bei 65°C 2 h lang gerührt. Die Reaktion wurde mit einer kalten gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (15 cm³) gequencht, und Extraktion erfolgte mit Dichlormethan (3 × 10 cm³) Die vereinigte organische Phase wurde mit gesättigten wässrigen Lösungen von Natriumhydrogencarbonat (2 × 10 cm³) und Salzlauge (2 × 10 cm³) gewaschen und wurde getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (98:2, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 34 in Form eines weißen festen Materials (639 mg, 76%) zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 8.98 (1H, br s, NH), 7.39–7.26 (11H, m, Bn, 6-H), 6.22 (1H, d, J 5.3, 1'-H), 5.42 (1H, t, J 5.4, 2'-H), 4.63–4.43 (5H, m, 3'-H, Bn), 4.41 (1H, d, J 12.2, 5'-H_a), 4.17 (1H, d, J 12.1, 5'-H_b), 3.76 (1H, d, J 10.2, 1''-H_a), 3.51 (1H, d, J 10.4, 1''-H_b), 2.09 (3H, s, COCH₃), 2.03 (3H, s, COCH₃), 1.53 (3H, d, J 0.9, CH₃). δ_C (CDCl₃) 170.8, 170.4 (C=O), 163.9 (C-4), 150.6 (C-2), 137.4 (C-6) 137.4, 136.1, 128.9, 128.8, 128.4, 1 28.2, 127,9 (Bn), 111.7 (C-5), 87.2, 87.2, 86.1 (C-1', C-3', C-4'), 77.6 (C-2'), 74.8, 73.9, 71.1, 63.8 (Bn, C-1'', C-5'), 20.9, 20.8 (COCH₃), 12.0 (CH₃). FAB-MS m/z 553 [M + H]⁺. Gef.: C, 62.7; H, 5.9; N, 4.7; C₂₉H₃₂N₂O₉ ber. C, 63.0; H, 5.8; N, 5.1%.
Beispiel 36
1-(3,5-Di-O-benzyl-4-C-(hydroxymethyl)-β-D-ribofuranosyl)thymin (35). Zu einer gerührten Lösung von Nucleosid 34 (553 mg, 1,05 mmol) in Methanol (5,5 cm³) wurde Natriummethoxid (287 mg, 5,25 mmol) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 10 min lang gerührt und dann mit verdünnter Salzsäure neutralisiert. Das Lösungsmittel wurde teilweise abgedampft, und Extraktion erfolgte mit Dichlormethan (2 × 20 cm³). Die vereinigte organische Phase wurde mit gesättigtem wässrigem Natriumhydrogencarbonat (3 × 20 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, um 35 in Form eines weißen Feststoffs (476 mg, 97%) zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 7.47 (1H, d, J 1.0 6-H), 7.36–7.22 (10H, m, Bn), 6.07 (1H, d, J 3.8, 1'-H), 4.87 (1H, d, J 11.7, Bn), 4.55 (1H, d, J 11.7, Bn), 4.50–4.32 (4H, m, Bn, 2'-H, 3'-H), 3.84–3.53 (4H, m, 5'-H_a, 5'-H_b, 1''-H_a, 1''-H_b), 1.50 (3H, d, J 1.1, CH₃). δ_C (CDCl₃) 164.3 (C-4), 151.3 (C-2), 137.6 (C-6) 136.4, 136.3, 128.8, 128.6, 128.4, 128.3, 127,9 (Bn), 111.1 (C-5), 91.1, 91.0, 88.1 (C-1', C-3', C-4'), 77.4 (C-2'), 74.8, 73.8, 71.4, 63,2 (Bn, C-5', C-1''), 12.0 (CH₃). FAB-MS m/z 491 [M + Na]⁺. Gef.: C, 63.4; H, 6.0; N, 5.5; C₂₅H₂₈N₂O₇, 1/4H₂O ber. C, 63.5; H, 6.1; N, 5.9%.
Beispiel 37
Zwischenprodukt 35A. Eine Lösung von Nucleosid 35 (225 mg, 0,48 mmol) in wasserfreiem Pyridin (1,3 cm³) wurde bei 0°C gerührt, und p-Toluolsulfonylchlorid (118 mg, 0,62 mmol) wurde in kleinen Portionen zugesetzt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 16 h lang gerührt, und zusätzliches p-Toluolsulfonylchlorid (36 mg, 0,19 mmol) wurde zugesetzt. Nach Rühren für weitere 4 h und Zusatz von eiskaltem Wasser (15 cm³) erfolgte Extraktion mit Dichlormethan (2 × 15 cm³). Die vereinigte organische Phase wurde mit gesättigtem wässrigem Natriumhydrogencarbonat (3 × 15 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (99:1, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um ein Zwischenprodukt 35A (140 mg) zu erhalten, das ohne weitere Reinigung im nächsten Schritt verwendet wurde.
Beispiel 38
(1S,3R,4R,7S)-7-Benzyloxy-1-benzyloxymethyl-3-(thymin-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (36). Zwischenprodukt 35A (159 mg) wurde in wasserfreiem DMF (0,8 cm³) aufgelöst. Die Lösung wurde zu einer gerührten Suspension von 60% Natriumhydrid in Mineralöl (Gew.-%, 32 mg, 0,80 mmol) in wasserfreiem DMF (0,8 cm³) bei 0°C zugetropft. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 72 h lang gerührt und dann unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (10 cm³) aufgelöst, mit gesättigtem wässrigem Natriumhydrogencarbonat (3 × 5 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (99:1, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um das bizyklische Nucleosid 36 in Form eines weißen Feststoffs (65,7 mg, 57%) zu erhalten.
δ_H (CDCl₃) 9.24 (1H, br s, NH), 7.49 (1H, s, 6-H), 7.37–7.26 (10H, m, Bn), 5.65 (1H, s, 1'-H), 4.70–4.71 (5H, m, Bn, 2'-H), 4.02–3.79 (5H, m, 3'-H, 5'-H_a, 5'-H_b, 1''-H_a, 1''-H_b), 1.63 (3H, s, CH₃). δ_C (CDCl₃) 164.3 (C-4), 150.1 (C-2), 137.7, 137.1 (Bn), 135.0 (C-6), 128.8, 128.7, 128.4, 128.0, 127.9 (Bn), 110.4 (C-5), 87.5, 87.3 (C-1', C-3'), 76.7, 75.8, 73.9, 72.3, 72.1 (Bn, C-5', C-2', C-4'), 64.5 (C-1''), 12.3 (CH₃). FAB-MS m/z 451 [M + H]⁺.
Beispiel 39
(1S,3R,4R,7S)-7-Hydroxy-1-hydroxymethyl-3-(thymin-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (37). Eine Lösung von Nucleosid 36 (97 mg, 0,215 mmol) in Ethanol (1,5 cm³) wurde bei Raumtemperatur gerührt, und 20% Palladiumhydroxid auf Kohlenstoff (50 mg) wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde mehrere Male mit Argon entgast und unter Wasserstoffatmosphäre mit einem Ballon gestellt. Nach 4-stündigem Rühren wurde das Gemisch durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (97:3, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 37 in Form eines weißen Feststoffs (57 mg, 98%) zu ergeben.
δ_H ((CD₃)₂SO) 11.33 (1H, br s, NH), 7.62 (1H, d, J 1.1 Hz, 6-H), 5.65 (1H, d, J 4.4 Hz, 3'-OH), 5.41 (1H, s, 1'-H), 5.19 (1H, t, J 5.6 Hz, 5'-OH), 4.11 (1H, s, 2'-H), 3.91 (1H, d, J 4.2 Hz, 3'-H), 3.82 (1H, d, J 7.7 Hz, 1''-H_a), 3.73 (1H, s, H'-5_a), 3.76 (1H, s, 5'-H_b), 3.63 (1H, d, J 7.7 Hz, 1''-H_b), 1.78 (3H, d, J 0.7 Hz, CH₃). δ_C (CDCl₃) 166.7 (C-4), 152.1 (C-2), 137.0 (C-6), 110.9 (C-5), 90.5, 88.4 (C-1', C-4'), 80.9, 72.5, 70.4 (C-2', C-3', C-5'), 57.7 (C-1''), 12.6 (CH₃). EI-MS m/z 270 [M]⁺.
Beispiel 40
(1R,3R,4R,7S)-1-(4,4'-Dimethoxytrityloxymethyl)-7-hydroxy-3-thymin-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (38). Zu einer Lösung von Nucleosid 37 (1,2 g, 4,44 mmol) in wasserfreiem Pyridin (5 cm³) wurde 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (2,37 g, 7,0 mmol) bei 0°C zugesetzt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 2 h lang gerührt, wobei die Reaktion mit eiskaltem Wasser (10 cm³) gequencht und mit Dichlormethan (3 × 15 cm³) extrahiert wurde. Die vereinigte organische Phase wurde mit gesättigten wässrigen Lösungen von Natriumhydrogencarbonat (3 × 10 cm³) und Salzlauge (2 × 10 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (98:2, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 38 in Form eines weißen Feststoffs (2,35 g, 93%) zu ergeben. δ_H (CDCl₃) 9.89 (1H, br s, NH), 7.64 (1H, s, 6-H), 7.47–7.13 (9H, m, DMT), 6.96–6.80 (4H, m, DMT), 5.56 (1H, s, 1'-H), 4.53 (1H, br s, 2'-H), 4.31 (1H, m, 3'-H), 4.04–3.75 (9H, m, 1''-H_a, 1''-H_b, 3'-OH, OCH₃), 3.50 (2H, br s, 5'-H_a, 5'-H_b), 1.65 (3H, s, CH₃). δ_C (CDCl₃) 164.47 (C-4), 158.66 (DMT), 150.13 (C-2), 144.56, 135.46, 135.35, 134.78, 130.10, 129.14, 128.03, 127.79, 127.05 (C-6, DMT), 113.32, 113.14 (DMT), 1 10.36 (C-5), 89.17, 88.16, 87.05 (C-1', C-4', DMT), 79.36, 71.81, 70.25, 58.38 (C-2', C-3', C-5', C-1''), 55.22 (OCH₃), 12.57 (CH₃). FAB-MS m/z 595 [M + Na]⁺, 573 [M + H]⁺.
Beispiel 41
(1R,3R,4R,7S)-7-(2-Cyanoethoxy(diisopropylamino)phosphinoxy)-1-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-3-(thymin-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (39). Zu einer Lösung von Nucleosid 38 (2,21 g, 3,86 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (6 cm³) bei Raumtemperatur wurden N,N-Diisopropylethylamin (4 cm³) und 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidochloridit (1 cm³, 4,48 mmol) zugesetzt, und das Rühren wurde 1 h lang fortgesetzt. MeOH (2 cm³) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde mit Ethylacetat (10 cm³) verdünnt und daraufhin mit gesättigten wässrigen Lösungen von Natriumhydrogencarbonat (3 × 5 cm³) und Salzlauge (3 × 5 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck abgedampft, und der Rückstand wurde durch basische Aluminiumoxid-Säulenchromatographie mit Dichlormethan/Methanol (99:1, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um 39 in Form eines weißen Schaums zu erhalten. Dieser Rückstand wurde in Dichlormethan (2 cm³) aufgelöst, und das Produkt wurde aus Petroleumether (100 cm³, gekühlt auf –30°C) unter kräftigem Rühren gefällt. Das Präzipitat wurde durch Filtration gesammelt und getrocknet, um Nucleosid 39 in Form eines weißen Feststoffs (2,1 g, 70%) zu ergeben. δ_P(CDCl₃) 149,06, 148,74. FAB-MS m/z 795 [M + Na]⁺, 773 [M + H]⁺.
Beispiel 42
1-(2-O-Acetyl-4-C-acetoxymethyl-3,5-di-O-benzyl-β-D-ribofuranosyl)uracil (40). Zu einer gerührten Lösung des anomeren Gemischs 33 (3,0 g, 6,17 mml) und Uracil (1,04 g, 9,26 mmol) in wasserfreiem Acetonitril (65 cm³) wurde N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamid (9,16 cm³, 37,0 mmol) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt und auf 0°C gekühlt. Trimethylsilyltrilfat (1,8 cm³, 10,0 mmol) wurde zugetropft, und die Lösung wurde bei 60°C 2 h lang gerührt. Die Reaktion wurde durch Zusatz einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (10 cm³) bei 0°C gequencht, und Extraktion erfolgte mit Dichlormethan (3 × 20 cm³). Die vereinigte organische Phase wurde mit Salzlauge (2 × 20 cm³) gewaschen und wurde getrocknet (Na₂SO₄). Die Lösungsmittel wurden unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde mit Kieselgel- Säulenohromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (99:1, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 40 in Form eines weißen Feststoffs (2,5 g, 75%) zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 9.57 (1H, br s, NH), 7.63 (1H, d, J 8.2, 6-H), 7.40–7.24 (10H, m, Bn), 6.18 (1H, d, J 4.5, 1'-H), 5.39–5.32 (2H, m, 2'-H, 5-H), 4.61 (1H, d, J 11.6, Bn), 4.49–4.40 (5H, m, 3'-H, Bn, 1''-H_a), 4.37 (1H, d, J 12.3, 1''-H_b), 3.76 (1H, d, J 10.1, 5'-H_a), 3.49 (1H, d, J 10.1, 5'-H_b), 2.09 (s, 3H, COCH₃), 2.04 (3H, s, COCH₃). δ_C (CDCl₃) 170.47, 169.94 (C=O), 163.32 (C-4), 150.30 (C-2), 140.24 (C-6), 137.15, 136.95, 128.65, 128.52, 128.32, 128.19, 128.02, 127.77 (Bn), 102.57 (C-5), 87.41, 86.14 (C-1', C-4'), 77.09, 74.84, 74.51, 73.75, 70.60, 63.73 (C-2', C-3', C-5', C-1'', Bn), 20.79, 20.68 (COCH₃). FAB-MS m/z 539 [M]⁺.
Beispiel 43
1-(3,5-Di-O-benzyl-4-C-hydroxymethyl-β-D-ribofuranosyl)uracil (41). Zu einer gerührten Lösung von Nucleosid 40 (2,0 g, 3,7 mmol) in Methanol (25 cm³) wurde Natriummethoxid (0,864 g, 95%, 16,0 mmol) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 10 min lang gerührt und mit 20%iger wässriger Salzsäure neutralisiert. Das Lösungsmittel wurde teilweise abgedampft, und der Rückstand wurde mit Ethylacetat (3 × 50 cm³) extrahiert. Die vereinigte organische Phase wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (3 × 20 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (98,5:1,5, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um 41 in Form eines weißen Feststoffs (1,58 g, 95%) zu ergeben. δ_H (CDCl₃) 9.95 (1H, br s, NH), 7.69 (d, J 8.1, 6-H), 7.35–7.17 (10H, m, Bn), 6.02 (1H, d, J 2.3, 1'-H), 5.26 (1H, d, J 8.1, 5-H), 4.80 (1H, d, J 11.7, Bn), 4.47 (1H, d, J 11.7, Bn), 4.45–4.24 (4H, m, Bn, 2'-H, 3'-H), 3.81 (1H, d, J 11.9, 1''-H_a), 3.69 (2H, br s, 2'-OH, 1''-OH), 3.67 (2H, m, 5'-H_a, 1''-H_b), 3.48 (1H, d, J 10.3, 5'-H_b). δ_C (CDCl₃) 163.78 (C-4), 150.94 (C-2), 140.61 (C-6), 137.33, 137.22, 128.59, 128.18, 128.01 (Bn), 102.16 (C-5), 91.46, 88.36 (C-1', C-4'), 76.73, 74.66, 73.71, 73.29, 70.81, 62.81 (C-2', C-3', C-5', C-1'', Bn). FAB-MS m/z 455 [M + H]⁺.
Beispiel 44
Zwischenprodukt 42. Eine Lösung von Nucleosid 41 (1,38 g, 3,0 mmol), wasserfreiem Pyridin (2 cm³) und wasserfreiem Dichlormethan (6 cm³) wurde bei –10°C gerührt, und p-Toluolsulfonylchlorid (0,648 g, 3,4 mmol) wurde in kleinen Portionen über 1 h hinweg zugesetzt. Die Lösung wurde bei –10°C 3 h lang gerührt. Die Reaktion wurde durch Zusatz von eiskaltem Wasser (10 cm³) gequencht, und das Gemisch wurde mit Dichlormethan (3 × 50 cm³) extrahiert. Die vereinigte organische Phase wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (3 × 20 cm³) gewaschen und wurde getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (99:1, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um das Zwischenprodukt 42 (0,9 g) zu ergeben, das ohne weitere Reinigung im nächsten Schritt verwendet wurde.
Beispiel 45
(1S,3R,4R,7S)-7-Benzyloxy-1-benzyloxymethyl-3-(uracil-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (43). Verbindung 42 (0,7 g) wurde in wasserfreiem DMF (3 cm³) aufgelöst, und eine 60%ige Suspension von Natriumhydrid (Gew.-%, 0,096 g, 24 mmol) wurde in vier Portionen über 10 min hinweg bei 0°C zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 12 h lang gerührt. Die Reaktion wurde mit Methanol (10 cm³) gequencht, und die Lösungsmittel wurden unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (20 cm³) aufgelöst, mit gesättigtem wässrigem Natriumhydrogencarbonat (3 × 6 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (99:1, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 43 (0,30 g, 60%) zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 9.21 (1H, br s, NH), 7.70 (1H, d, J 8.2, 6-H), 7.37–7.24 (10H, m, Bn), 5.65 (1H, s, 1'-H), 5.52 (1H, d, J 8.2, 5-H), 4.68–4.45 (5H, m, 2'-H, Bn), 4.02–3.55 (5H, m, 3'-H, 5'-H_a, 1''-H_a, 5'-H_b, 1''-H_b). δ_C (CDCl₃) 163.33 (C-4), 149.73 (C-2), 139.18 (C-6), 137.46, 136.81, 128.58, 128.54, 128.21, 128.10, 127.79, 127.53 (Bn), 101.66 (C-5), 87.49, 87.33 (C-1', C-4'), 76.53, 75.71, 73.77, 72.33, 72.00, 64.35 (C-2', C-3', C-5', C-1'', Bn). FAB-MS m/z 459 [M + Na]⁺.
Beispiel 46
(1S,3R,4R,7S)-Hydroxy-1-hydroxymethyl-3-(uracil-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (44). Zu einer Lösung von Verbindung 43 (0,35 g, 0,8 mmol) in absolutem Ethanol (2 cm³) wurde 20% Palladiumhydroxid auf Kohlenstoff (0,37 g) zugesetzt, und das Gemisch wurde mehrere Male mit Wasserstoff entgast und unter Wasserstoffatmosphäre 4 h lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (9:1, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 44 in Form eines weißen Feststoffs (0,16 g, 78%) zu ergeben.
δ_H (CD₃OD) 7.88 (1H, d, J 8.1, 6-H), 5.69 (1H, d, J 8.1, 5-H), 5.55 (1H, s, 1'-H), 4.28 (1H, s, 2'-H), 4.04 (1H, s, 3'-H), 3.96 (1H, d, J 7.9, 1''-H_a), 3.91 (2H, s, 5'-H), 3.76 (1H, d, J 7.9, 1''-H_b). δ_C (CD₃OD) 172.95 (C-4), 151.82 (C-2), 141.17 (C-6), 101.97 (C-5), 90.52, 88.50 (C-1', C-4'), 80.88, 72.51, 70.50, 57.77 (C-2', C-3', C-5', C-1''). FAB-MS m/z 257 [M + H]⁺.
Beispiel 47
(1R,3R,4R,7S)-1-(4,4'-Dimethoxytrityloxymethyl)-7-hydroxy-3-(uracil-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (45). Zu einer Lösung von Verbindung 44 (0,08 g, 0,31 mmol) in wasserfreiem Pyridin (0,5 cm³) wurde 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (0,203 g, 0,6 mmol) bei 0°C zugesetzt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 2 h lang gerührt. Die Reaktion wurde mit eiskaltem Wasser (10 cm³) gequencht und mit Dichlormethan (3 × 4 cm³) extrahiert. Die vereinigte organische Phase wurde mit gesättigten wässrigen Lösungen von Natriumhydrogencarbonat (3 × 3 cm³) und Salzlauge (2 × 3 cm³) gewaschen und wurde getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (98:2, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 45 als einen weißen Feststoff (0,12 g, 69%) zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 9.25 (1H, br s, NH), 7.93 (1H, d, J 7.2, 6-H), 7.50–7.15 (9H, m, DMT), 6.88–6.78 (4H, m, DMT), 5.63 (1H, s, 1'-H), 5.59 (1H, d, J 8.0, 5-H), 4.48 (1H, s, 2'-H), 4.26 (1H, s, 3'-H), 3.88 (1H, d, J 8.1, 1''-H_a), 3.85–3.55 (7H, m, 1''-H_b, OCH₃), 3.58–3.40 (2H, m, 5'-H_a, 5'-H_b). δ_C (CDCl₃) 164.10 (C-4), 158.60 (DMT), 150.45 (C-2), 147.53 (DMT), 144.51 (C-6), 139.72, 135.49, 135.37, 130.20, 129.28, 128.09, 127.85, 127.07 (DMT), 113.39, 113.17 (DMT), 101.79 (C-5), 88.20, 87.10, 86.87 (C-1', C-4', DMT), 79.25, 71.79, 69.70, 58.13 (C-2', C-3', C-5', C-1''), 55.33 (OCH₃). FAB-MS m/z 559 [M + H]⁺.
Beispiel 48
(1R,3R,4R,7S)-7-(2-Cyanoethoxy(diisopropylamino)posphinoxy)-1-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-3-(uracil-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (46). Zu einer Lösung von Verbindung 45 (0,07 g, 0,125 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (2 cm³) bei Raumtemperatur wurden N,N-Diisopropylethylamin (0,1 cm³) und 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidochloridit (0,07 cm³, 0,32 mmol) zugesetzt. Nach 1-stündigem Rühren wurde die Reaktion mit MeOH (2 cm³) gequencht, und das resultierende Gemisch wurde mit Ethylacetat (5 cm³) verdünnt und daraufhin mit gesättigten wässrigen Lösungen von Natriumhydrogencarbonat (3 × 2 cm³) und Salzlauge (3 × 2 cm³) gewaschen und wurde getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck abgedampft, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (99:1, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um einen weißen Schaum zu ergeben. Dieser Schaum wurde in Dichlormethan (2 cm³) aufgelöst, und das Produkt wurde aus Petroleumether (10 cm³, gekühlt auf –30°C) unter kräftigem Rühren ausgefällt. Das Präzipitat wurde durch Filtration gesammelt und wurde getrocknet, um Verbindung 46 in Form eines weißen Feststoffs (0,055 g, 58%) zu ergeben. δ_P (CDCl₃) 149,18, 149,02.
Beispiel 49
9-(2-O-Acetyl-4-C-acetoxymethyl-3,5-di-O-benzyl-β-D-ribofuranosyl)-2-N-isobutyrylguanin (47). Zu einer gerührten Suspension des anomeren Gemisches 33 (1,28 g, 5,6 mmol) und 2-N-Isobutyrylguanin (1,8 g, 3,7 mmol) in wasserfreiem Dichlorethan (60 cm³) wurde N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamid (4 cm³, 16,2 mmol) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rückfluss 1 h lang gerührt. Trimethylsilyltriflat (1,5 ml, 8,28 mmol) wurde bei 0°C zugetropft, und die Lösung wurde unter Rückfluss 2 h lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde 1,5 h lang auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Nach Verdünnung auf 250 cm³ durch Zusatz von Dichlormethan wurde das Gemisch mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (200 cm³) und Wasser (250 cm³) gewaschen. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von 1,25% (200 cm³) und 1,5% (750 cm³) Methanol in Dichlormethan (Vol.-%) als Elutionsmittel gereinigt, um 2,10 g (87%) eines weißen Feststoffs zu erhalten, der gemäß ¹H-NMR-Analyse aus drei Isomeren (im Verhältnis 12,5:2,5:1) bestand. Das Hauptprodukt, das unter diesen Bedingungen gebildet wurde, wird als Verbindung 47 angenommen (P. Garner, S. Ramakanth, J. Org. Chem. 53, 1294 (1988); H. Vorbruggen, K. Krolikiewicz, B. Bennua, Chem. Ber. 114, 1234 (1981)). Die einzelnen Isomere wurden nicht isoliert, und das Gemisch wurde für den nächsten Schritt verwendet. Für das Hauptprodukt 47 gilt:
δ_H (CDCl₃) 12.25 (br s, NHCO), 9.25 (br s, NH), 7.91 (s, 8-H) 7.39–7.26 (m, Bn), 6.07 (d, J 4.6, 1'-H), 5.80 (dd, J 5.8, J 4.7, 2'-H), 4.72 (d, J 5.9, 3'-H), 4.59–4.43 (m, Bn, 1''-H_a), 4.16 (d, J 12.1, 1''-H_b), 3.70 (d, J 10.1, 5'-H_a), 3.58 (d, J 10.1, 5'-H_b), 2.65 (m, CHCO), 2.05 (s, COCH₃), 2.01 (s, COCH₃), 1.22 (d, J 6.7, CH₃CH), 1.20 (d, J 7.0, CH₃CH). δ_C (CDCl₃) 178.3 (COCH), 170.6, 179.8 (COCH₃), 155.8, 148.2, 147.6 (Guanin), 137.6, 137.2 (Guanin, Bn), 128.5, 128.4, 128.2, 128.1, 128.0, 127.8, 127.7 (Bn), 121.2 (Guanin), 86.2, 86.0 (C-1', C-4'), 77.8 (C-3'), 74.9, 74.5, 73.7, 70.4 (Bn, C-2', C-5'), 63.5 (C-1''1), 36.3 (COCH), 20.8, 20.6 (COCH₃), 19.0 (CH₃CH). Für das Gemisch: FAB-MS m/z 648 [M + H]⁺, 670 [M + Na]⁺. Gef.: C, 60.8; H, 6.0; N, 10.4; C₃₃H₃₆N₅O₉ ber. C, 61.3; H, 5.6; N, 10.8%.
Beispiel 50
9-(3,5-Di-O-benzyl-4-C-hydroxymethyl-β-D-ribofuranosyl)-2-N-isobutyrylguanin (48). Eine Lösung des in Beispiel 49 beschriebenen Gemisches, das Verbindung 47 (2,10 g, 3,25 mmol) enthält, in THF/Pyridin/Methanol (2:3:4, Vol./Vol./Vol.) (40 cm³) wurde auf –10°C gekühlt, und Natriummethoxid (320 mg, 5,93 mmol) wurde der gerührten Lösung zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 10°C 30 min lang gerührt und mit 2 cm³ Essigsäure neutralisiert. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck abgedampft, und der Rückstand wurde zweimal in einem System von Dichlormethan/Wasser (2 × 100 cm³) extrahiert. Die organischen Fraktionen wurden vereinigt und unter reduziertem Druck eingedampft. Nach Co-Verdampfen mit Toluol wurde der Rückstand durch Kieselgel-Säulenchromatographie in einem Gradienten (2–7%) von Methanol in Dichlormethan (Vol.-%) gereinigt, um einen weißen Feststoff (1,62 g) zu ergeben. Gemäß ¹H-NMR bestand es aus drei Isomeren (im Verhältnis 13,5:1,5:1). Für das Hauptprodukt 48 gilt:
δ_H (CD₃OD) 8.07 (s, 8-H) 7.36–7.20 (m, Bn), 6.05 (d, J 3.9, 1'-H), 4.81 (d, J 11.5, Bn), 4.75 (m, 2'-H), 4.56 (d, J 11.5, Bn), 4.51–4.43 (m, Bn, 3'-H), 3.83 (d, J 11.7, 1''-H_a), 3.65 (d, J 11.7, 1''-H_b), 3.64 (d, J 10.6, 5'-H_a), 3.57 (d, J 10.3, 5'-H_b), 2.69 (m, CHCO), 1.20 (6H, d, J 6.8, CH₃CH). δ_C (CD₃OD) 181.6 (COCH), 157.3, 150.2, 149.5 (Guanin), 139.4, 139.3, 139.0 (Guanin, Bn), 129.5, 129.4, 129.3, 129.2, 129.1, 129.0, 128.9, 128.8 (Bn), 121.2 (Guanin), 90.7, 89.6 (C-1', C-4'), 79.2 (C-3'), 75.8, 74.5, 74.3, 72.2 (Bn, C-2', C-5'), 63.1 (C-1''), 36.9 (COCH), 19.4 (CH₃CH), 19.3 (CH₃CH). Für das Gemisch: FAB-MS m/z 564 [M + H]⁺.
Beispiel 51
Zwischenprodukt 49. Eine Lösung des in Beispiel 50 beschriebenen Gemisches, das 48 (1,6 g) in wasserfreiem Pyridin (6 cm³) enthält, wurde bei –20°C gerührt, und p-Toluolsulfonylchlorid (0,81 g, 4,27 mmol) wurde zugesetzt. Die Lösung wurde 1 h lang bei –20°C und 2 h lang bei –25°C gerührt. Dann wurde das Gemisch auf 100 cm³ durch Zusatz von Dichlormethan verdünnt und unverzüglich mit Wasser (2 × 100 cm³) gewaschen. Die organische Phase wurde abgetrennt und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol als Elutionsmittel (1–2 Vol.-%) gereinigt, um Zwischenprodukt 49 (980 mg) zu ergeben. Nach Elution von Verbindung 49 aus der Säule wurde das Ausgangsgemisch, das 48 (510 mg) enthielt, unter Verwendung von 8% Methanol in Dichlormethan (Vol.-%) als Elutionsmittel eluiert. Dieses Material wurde konzentriert, unter reduziertem Druck getrocknet und auf dieselbe Weise wie zuvor beschrieben behandelt, um zusätzlich 252 mg des Zwischenprodukts zu ergeben. Das Zwischenprodukt (1,23 g) wurde durch Kieselgel-HPLC (PrepPak-Cartridge, gepackt mit Porasil, 15–20 μm, 125A, Durchflussgeschwindigkeit 60 cm³/min, Elutionsmittel 0–4 Vol.-% von Methanol in Dichlormethan, 120 min) gereinigt. Fraktionen, die das Zwischenprodukt 49 enthielten, wurden gesammelt und konzentriert, um einen weißen Feststoff (1,04 g) zu ergeben. Gemäß ¹H-NMR bestand es aus zwei Hauptprodukten, nämlich aus 1''-O- und 2'-O-monotosylierten Derivaten in einem Verhältnis von ≈ 2:1. FAB-MS m/z 718 [M + H]⁺. Gefunden C, 60,4; H, 5,8; N, 9,3; C₃₆H₃₉N₅O₉S ber. C, 60,2; H, 5,5; N, 9,8%.
Beispiel 52
(1S,3R,4R,7S)-7-Benzyloxy-1-benzyloxymethyl-3-(2-N-isobutyrylguanin-9-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (50). Zu einer Lösung von Zwischenprodukt 49 (940 mg) in wasserfreiem THF (20 cm³) wurde eine 60%ige Suspension von Natriumhydrid (Gew.-%, 130 mg, 3,25 mmol) zugesetzt, und das Gemisch wurde 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Essigsäure (0,25 ml) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (100 cm³) aufgelöst und mit Wasser (2 × 100 cm³) gewaschen. Die organische Phase wurde abgetrennt und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (1–1,5 Vol.-%) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 50 als einen weißen Feststoff (451 mg, 57%) zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 12.25 (1H, br s, NHCO), 10.12 (1H, br s, NH), 7.84 (1H, s, 8-H), 7.31–7.15 (10H, m, Bn), 5.72 (1H, s, 1'-H), 4.60–4.46 (5H, m, Bn, 2'-H), 4.14 (1H, s, 3'-H), 4.02 (1H, d, J 7.9, 1''-H_a), 3.85 (1H, d, J 7.9, 1''-H_b), 3.78 (2H, s, 5'-H), 2.81 (1H, m, CHCO), 1.24 (3H, d, J 6.8, CH₃CH), 1.22 (3H, d, J 6.4, CH₃CH). δ_C (CDCl₃) 179.5 (COCH), 155.6, 148.1, 147.3 (Guanin), 137.3, 136.9, 136.0 (Guanin, Bn), 128.4, 128.3, 127.9, 127.8, 127.5, 127.4 (Bn), 121.2 (Guanin), 87.1, 86.2 (C-1', C-4'), 77.0 (C-3'), 73.6, 72.5, 72.1 (Bn, C-2', C-5'), 64.9 (C-1''), 36.1 (COCH), 19.0 (CH₃CH), 18.9 (CH₃CH). FAB-MS m/z 546 [M + H]⁺. Gef.: C, 163.3; H, 5.9; N; 12.5; C₂₉H₃₀N₅O₆ ber. C, 64.0; H, 5.6; N, 12.9%.
Alternative Herstellung von Verbindung 50. G1AQ. Zu einer Suspension von Verbindung 78 (1,5 g, 2,51 mmol), N2-Isobutyrylguanin (0,93 g, 4,06 mmol) in trockenem DCM (50 ml) wurde BSA (N,O-Bistrimethylsilylacetamid; 3,33 ml, 13,5 mmol) zugesetzt, und das Gemisch wurde 2 h lang unter Rückfluss erhitzt. Trimethylsilyltriflat (1,25 ml, 6,9 mmol) wurde dem Gemisch zugesetzt, und Rückflusserhitzen wurde zusätzliche 2 h lang fortgesetzt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, durch 200 ml DCM verdünnt und mit gesättigtem wässrigem NaHCO₃ und Wasser gewaschen. Chromatographie auf Kieselgelsäule (1–2,5% CH₃OH in Dichlormethan) ergab 1,05 g (55%) des erwünschten Monomers G1AQ und 380 mg an Isomeren mit höherer Mobilität, die durch Wiederholen des zuvor beschriebenen Verfahrens zu G1AQ umgesetzt wurden. Ammoniumhydroxid (12 ml einer 25%igen wässrigen Lösung) wurde zu einer Lösung von G1AQ (1,05 g in 12 ml Methanol) zugesetzt, und das Gemisch wurde 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach Einengung wurde das Produkt durch Kieselgel-Säulenchromatographie (1–3% CH₃OH in Dichlormethan) gereinigt, um 700 mg G3 in Form eines weißen Feststoffs zu erhalten. 700 mg von G3 in wasserfreiem THF (15 ml) wurden mit NaH (225 mg von 60%iger Suspension in Mineralöl) behandelt. 30 min später wurde die Reaktion durch Zusatz von 1,25 ml Essigsäure gequencht, und das Gemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in Dichlormethan aufgelöst, mit NaHCO₃ und Wasser gewaschen und durch Kieselgel-Chromatographie im Gradienten 0,5–3% Methanol/DCM gereinigt. Ausbeute: 400 mg (75%) von 50.
Beispiel 53
(1S,3R,4R,7S)-7-Hydroxy-1-hydroxymethyl-3-(2-N-isobutyrylguanin-9-yl)-2,5-di- oxabicyclo[2.2.1]heptan (51). Ein Gemisch von Nucleosid 50 (717 mg, 1,31 mmol) und 10% Palladium über Kohlenstoff (500 mg) wurde in Methanol (8 cm³) bei Raumtemperatur suspendiert. Das Gemisch wurde mehrere Male unter reduziertem Druck entgast und unter Wasserstoffatmosphäre gestellt. Nach 24-stündigem Rühren wurde das Gemisch durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Methanol/Dichlormethan (8–20 Vol.-%) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 51 in Form eines glasähnlichen Feststoffes (440 mg, 92%) zu ergeben. (CD₃OD) 8.12 (1H, br s, 8-H), 5.86 (1H, s, 1'-H), 4.50 (1H, s, 2'-H), 4.30 (1H, s, 3'-H), 4.05 (1H, d, J 8.0, 1''-H_a), 3.95 (2H, s, 5'-H), 3.87 (1H, d, J 7.9, 1''-H_b), 2.74 (1H, m, CHCO), 1.23 (6H, d, J 6.9, CH₃CH). δ_C (CD₃OD, (Signale aus dem Kohlenhydratteil) 90.2, 87.6 (C-1', C-4'), 81.1 (C-3'), 72.9, 71.3 (C-2', C-5'), 58.2 (C-1''), 37.1 (COCH), 19.5 (CH₃CH). FAB-MS m/z 366 [M + H]⁺.
Beispiel 54
(1R,3R,4R,7S)-1-(4,4'-Dimethoxytrityloxymethyl)-7-hydroxy-3-(2-N-isobutyrylguanin-9-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (52) Ein Gemisch aus Verbindung 51 (440 mg, 1,21 mmol) und 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (573 mg, 1,69 mmol) wurde in wasserfreiem Pyridin (7 cm³) aufgelöst und bei Raumtemperatur 4 h lang gerührt. Das Gemisch wurde unter reduziertem Druck eingedampft, um ein Öl zu ergeben. Extraktion erfolgte in einem System von Dichlormethan/Wasser (1:1, Vol./Vol., 40 cm³). Die organische Phase wurde abgetrennt und konzentriert, um eine Lösung in einem Mindestvolumen von Dichlormethan, das 0,5 Vol.-% Pyridin enthält, zu erhalten, die auf eine mit demselben Lösungsmittel äquilibrierte Kieselgelsäule aufgetragen wurde. Das Produkt wurde in Gradientenkonzentrationen von Methanol (0,6–2 Vol.-%) in Dichlormethan, das 0,5 Vol.-% Pyridin enthält, eluiert, um Verbindung 52 in Form eines weißen Feststoffs (695 mg, 86%) zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 12.17 (1H, br s, NHCO), 10.09 (1H, br s, NH), 7.87 (1H, s, 8-H), 7.42–6.72 (13H, m, DMT), 5.69 (1H, s, 1'-H), 4.59 (1H, s, 2'-H), 4.50 (1H, s, 3'-H), 3.98 (1H, d, J 8.1, 1''-H_a), 3.69–3.39 (9H m, DMT, 5'-H, 1''-H_b), 2.72 (1H, m, CHCO), 1.17 (6H, d, J 6.8, CH₃CH). δ_C (CDCl₃) 179.8 (COCH), 158.8, 144.5, 135.6, 135.5, 130.1, 128.1, 127.7, 126.9, 113.2 (DMT), 155.8, 147.9, 147.5, 137.0, 120.8 (Guanin), 87.6, 86.4, 86.1 (C-1', C-4', DMT), 79.7 (C-3'), 72.6, 71.4 (C-2', C-5'), 59.8 (C-1''), 55.2 (DMT), 36.1 (COCH), 19.1, 18.8 (CH₃CH). FAB-MS m/z 668 [M + H]⁺.
Beispiel 55
(1R,3R,4R,7S)-7-(2-Cyanoethoxy(diisopropylamino)phosphinoxy)-1-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-3-(2-N-isopropionylguanin-9-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (53). Verbindung 52 (670 mg, 1,0 mmol) wurde bei Raumtemperatur in wasserfreiem Dichlormethan (5 cm³), das N,N-Diisopropylethylamin (0,38 cm³, 4 mmol) enthielt, aufgelöst. 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidochloridit (0,36 cm³, 2,0 mmol) wurde unter Rühren zugetropft. Nach 5 h wurde Methanol (2 cm³) zugesetzt, und das Gemisch wurde auf 100 cm³ durch Zusatz von Dichlormethan verdünnt und mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (50 cm³) gewaschen. Die organische Phase wurde abgetrennt, und das Lösungsmittel wurde durch Abdampfen unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in der Mindestmenge an Dichlormethan/Petroleumether (1:1, Vol./Vol.), in der 0,5 Vol.-% Pyridin vorhanden waren, aufgelöst und wurde auf eine Säule aufgetragen, die mit Kieselgel gepackt war, das mit demselben Lösungsmittelgemisch äquilibriert war. Die Säule wurde mit Dichlormethan/Petroleum/Pyridin (75:25:0,5, Vol./Vol./Vol., 250 cm³) gewaschen, und das Produkt wurde unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Dichlormethan (0–1 Vol.-%), das 0,5 Vol.-% Pyridin enthielt, eluiert. Die das Hauptprodukt enthaltenden Fraktionen wurden eingedampft und mit Toluol zusammen eingedampft. Der Rückstand wurde in wasserfreiem Dichlormethan (5 cm³) aufgelöst und aus Petroleumether (100 cm³) ausgefällt, um nach Filtrieren und Trocknen Verbindung 53 in Form eines weißen Feststoffs (558 mg, 64%) zu ergeben. δ_P (CDCl₃) 148,17, 146,07. FAB-MS m/z 868 [M + 1]⁺.
Beispiel 56
1-(2-O-Acetyl-4-C-acetoxymethyl-3,5-di-O-benzyl-β-D-ribofuranosyl)-4-N-benzoylcytosin (54). Zu einer gerührten Lösung des anomeren Gemisches 33 (4,0 g, 8,22 mmol) und 4-N-Benzoylcytosin (2,79 g, 13,0 mmol) wurde N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamid (8,16 cm³, 33,0 mmol) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt und auf 0°C gekühlt. Trimethylsilyltriflat (3,0 cm³, 16,2 mmol) wurde zugetropft, und das Gemisch wurde bei 60°C 2 h lang gerührt. Gesättigte wässrige Lösungen von Natriumhydrogencarbonat (3 × 20 cm³) und Salzlauge (2 × 20 cm³) wurden nacheinander zugesetzt, und die getrennte organische Phase wurde getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (99:1, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Verbindung 54 in Form eines weißen Feststoffs (3,9 g, 74%) zu ergeben.
δ_H (CDCl₃), 8.28 (1H, d, J 7.5, 6-H), 7.94–7.90 (2H, m, Bz), 7.65–7.25 (13H, m, Bn, Bz), 7.16 (1H, d, J 7.1, 5-H), 6.22 (1H, d, J 2.8, 1'-H), 5.51 (1H, dd, J 2.8, 5.8, 2'-H), 4.62 (1H, d, J 11.6, Bn), 4.51 (1H, d, J 12.3, 1''-H_a), 4.49–4.34 (4H, m, 3'-H, Bn), 4.21 (1H, d, J 12.3, 1''-H_b), 3.85 (1H, d, J 10.3, 5'-H_a), 3.47 (1H, d, J 10.3, 5'-H_b), 2.13 (3H, s, COCH₃), 2.06 (3H, s, COCH₃). δ_C (CDCl₃) 170.52, 169.61 (C=O), 166.83, 162.27 (C-4, C=O), 154.26 (C-2), 145.26 (C-6), 137.25, 136.93, 133.18, 129.0, 128.75, 128.51, 128,45, 128.18, 128.10, 127.89, 127.71 (Bn, Bz), 96.58 (C-5), 89.42, 86.52 (C-1', C-4'), 76.21, 75.10, 74.17, 73.70, 69.70, 63.97 (C-2', C-3', Bn, C-5', C-1''), 20.82 (COCH₃). FAB-MS m/z 664 [M + Na]⁺, 642 [M + H]⁺. Gef.: C, 65.0; H, 5.7, N, 6.5; C₃₅H₃₅N₃O₉ ber. C, 65.5; H, 5.5; N, 6.5%.
Beispiel 57
1-(3,5-Di-O-benzyl-4-C-hydroxymethyl-β-D-ribofuranosyl)-4-N-benzoylcytosin (55). Zu einer gerührten Lösung von Nucleosid 54 (3,4 g, 5,3 mmol) in Methanol (20 cm³) wurde Natriummethoxid (0,663 g, 11,66 mmol) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 10 min lang gerührt und dann mit 20%iger wässriger Salzsäure neutralisiert. Das Lösungsmittel wurde teilweise abgedampft, und der Rückstand wurde mit Dichlormethan (3 × 50 cm³) extrahiert. Die vereinigte organische Phase wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (3 × 20 cm³) gewaschen und wurde getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (98,5:1,5, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Verbindung 55 in Form eines weißen Feststoffs (1,6 g, 54%) zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 9.95 (1H, br s, NH), 8.33 (1H, d, J 7.4, 6-H), 7.98 (2H, m, Bz), 7.60–7.12 (14H, m, Bn, Bz, 5-H), 6.17 (1H, d, J 1.6, 1'-H), 4.78 (1H, d, J 11.8, Bn), 4.48–4.27 (5H, m, Bn, 2'-H, 3'-H), 3.85 (1H, d, J 11.8, 5'-H_a), 3.66–3.61 (2H, m, 5'-H_b, 1''-H_a), 3.47 (1H, d, J 10.4, 1''-H_b). δ_C (CDCl₃) 167.5, 162.31 (C-4, C=O), 155.36 (C-2), 145.34 (C-6), 137.49, 137.08, 133.09, 133.01, 128.94, 128.67, 128.48, 128.30, 128.01, 127.90, 127.80 (Bn, Bz), 96.53 (C-5), 93.97, 89.35 (C-1', C-4'), 76.06, 75.28, 73.70, 72.76, 70.26, 62.44 (C-2', C-3', Bn, C-5', C-1''). FAB-MS m/z 558 [M + H]⁺.
Beispiel 58
Zwischenprodukt 56. Eine Lösung von Nucleosid 55 (2,2 g, 3,94 mmol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (60 cm³) wurde bei –20°C gerührt, und eine Suspension von 60% Natriumhydrid in Mineralöl (Gew.-%, 0,252 g, 6,30 mmol) wurde in sieben Portionen im Laufe von 45 min zugesetzt. Die Lösung wurde 15 min lang bei –20°C gerührt, woraufhin der Zusatz von p-Toluolsulfonylchlorid (0,901 g, 4,73 mmol) in kleinen Mengen erfolgte. Die Lösung wurde 4 h lang bei –20°C gerührt. Zusätzliches Natriumhydrid (0,252 g, 6,30 mmol) und p-Toluolsulfonylchlorid (0,751 g, 3,93 mmol) wurde zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 48 h lang bei –20°C gehalten. Die Reaktion wurde durch Zusatz von eiskaltem Wasser (50 cm³) gequencht, wobei Extraktion mit Dichlormethan (3 × 60 cm³) erfolgte. Die vereinigte organische Phase wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (3 × 20 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck abgedampft, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (99:1, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um das Zwischenprodukt 56 (1,80 g) zu erhalten.
Beispiel 59
(1S,3R,4R,7S)-7-Benzyloxy-1-benzyloxymethyl-3-(4-N-benzoylcytosin-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (57). Zwischenprodukt 56 (1,80 g) wurde in wasserfreiem DMF (30,0 cm³) aufgelöst, und eine 60%ige Suspension von Natriumhydrid in Mineralöl (Gew.-%, 0,16 g, 3,9 mmol) wurde in fünf Portionen im Laufe von 30 min bei 0°C zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 36 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde durch Zusatz von eiskaltem Wasser (70 cm³) gequencht, und das resultierende Gemisch wurde mit Dichlormethan (3 × 50 cm³) extrahiert. Die vereinigte organische Phase wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (3 × 30 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Die Lösungsmittel wurden unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (99,5:0,5, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Verbindung 57 in Form eines weißen Feststoffs (1,08 g, 79%) zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 8.95 (1H, br s, NH), 8.20 (1H, d, J 7.5, 6-H), 7.95–7.92 (2H, m, Bz), 7.66–7.22 (14H, m, Bn, Bz, 5-H), 5.78 (1H, s, 1'-H), 4.70–4.65 (3H, m, 2'-H, Bn), 4.60 (1H, d, J 11.6, Bn), 4.47 (1H, d, J 11.6, Bn), 4.05–3.78 (5H, m, 3'-H, 5'-H_a, 1''-H_a, 5'-H_b, 1''-H_b). δ_C (CDCl₃) 167.0, 162.36 (C-4, C=O), 154.5 (C-2), 144.58 (C-6), 137.46, 136.93, 133.35, 132.93, 129.11, 128.67, 728.50, 128.16, 128.11, 127.68, 127.60 (Bn), 96.35 (C-5), 88.38, 87.67 (C-1', C-4'), 76.14, 75.70, 73.79, 72.27, 72.09, 64.34 (Bn, C-5', C-1'', C-2', C-3'). FAB-MS m/z 540 [M + H]⁺. Gef.: C, 68.0; H, 5.5, N, 7.5; C₃₁H₂₉N₃O₆ ber. C, 69.0; H, 5.4; N, 7.8%).
Beispiel 60
(1S,3R,4R,7S)-7-Hydroxy-1-hydroxymethyl-3-(cytosin-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (57A). Zu einer Lösung von Nucleosid 57 (0,3 g, 0,55 mmol) in wasserfreiem Methanol (22 cm³) wurden 1,4-Cyclohexadien (5,0 cm³) und 10 Palladium auf Kohlenstoff (0,314 g) zugesetzt. Das Gemisch wurde unter Rückfluss 18 h lang gerührt. Zusätzliche 10% Palladium auf Kohlenstoff (0,380 g) und 1,4-Cyclohexadien (5,5 cm³) wurden zugesetzt, und das Gemisch wurde 54 h lang unter Rückfluss erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde durch ein Kieselgelkissen filtriert, das danach mit Methanol (1.500 cm³) gewaschen wurde. Das vereinigte Filtrat wurde unter reduziertem Druck eingedampft, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (92,5:7,5, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Verbindung 57A in Form eines weißen Feststoffs (0,051 g, 36%) zu ergeben.
δ_H ((CD₃)₂SO) 7.73 (1H, d, J 7.7, 6-H), 7.12–7.20 (2H, br s, NH₂), 5.74 (1H, d, J 7.7, 5-H), 5.61 (1H, br s, 3'-OH), 5.39 (1H, s, 1'-H), 5.12 (1H, m, 5'-OH), 4.08 (1H, s, 2'-H), 3.80 (1H, d, J 7.7, 1''-H_a), 3.81 (1H, s, 3'-H), 3.74 (2H, m, 5'-H_a, 5'-H_b), 3.63 (1H, d, J 7.7, 1''-H_b). δ_C ((CD₃)₂SO) 165.66 (C-4), 154.58 (C-2), 139.68 (C-6), 93.19 (C-5), 88.42, 86.73 (C-1', C-4'), 78.87, 70.85, 68.32, 56.04 (C-2', C-1'', C-3', C-5'). FAB-MS m/z 256 [M + H]⁺.
Beispiel 61
Zwischenprodukt 57B. Zu Nucleosid 57A (0,030 g, 0,11 mmol), suspendiert in wasserfreiem Pyridin (2,0 cm³), wurde Trimethylsiylchlorid (0,14 cm³, 1,17 mmol) zugesetzt, und Rühren wurde 1 h lang bei Raumtemperatur fortgesetzt. Benzoylchlorid (0,07 cm³, 0,58 mmol) wurde bei 0°C zugesetzt, und das Gemisch wurde 2 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abkühlen des Reaktionsgemischs auf 0°C wurde Wasser (3,0 cm³) zugesetzt. Nach 5-minütigem Rühren wurde eine wässrige Ammoniaklösung (1,5 cm³, 32 Gew.-%) zugesetzt, und Rühren wurde 30 min lang bei Raumtemperatur fortgesetzt. Das Gemisch wurde unter reduziertem Druck eingedampft, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (97,5:2,5, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um das Zwischenprodukt 57B als weißen Feststoff (0,062 g) zu ergeben.
Beispiel 62
(1R,3R,4R,7S)-1-(4,4'-Dimethoxytrityloxymethyl)-7-hydroxy-3-(4-N-benzoylcytosin-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (57C). Zu einer Lösung von Zwischenprodukt 57B (0,042 g, 0,11 mmol) in wasserfreiem Pyridin (1,5 cm³) wurde 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (0,06 g, 0,17 mmol) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 3,5 h lang gerührt, auf 0°C gekühlt, und eine gesättigte wässrige Lösung von Natriumhydrogencarbonat (20 cm³) wurde zugesetzt. Extraktion erfolgte unter Verwendung von Dichlormethan (3 × 10 cm³). Die vereinigte organische Phase wurde getrocknet (Na₂SO₄) und bis zur Trockenen unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol/Pyridin (98,0:1,5:0,5, Vol./Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 57C in Form eines weißen Feststoffs (0,031 g, ≈ 63% aus 57A) zu erhalten.
δ_H (C₅D₅N) 12.32 (1H, br s, NHCO), 8.75–7.06 (20H, m, DMT, Bz, H-5, H-6), 6.24 (1H, s, 1'-H), 5.11 (1-H, s, 2'-H), 4.90 (1H, s, 3'-H), 4.38 (1H, d, J 7.6, 1''-H_a), 4.10 (1H, d, J 7.6, 1''-H_b), 4.02 (1H, d, J 10.6, 5'-H_a), 3.87 (1H, d, J 10.6, 5'-H_b), 3.77, 3.76 (2 × 3H, 2 × s, 2 × OCH₃). δ_C (C₅D₅N) 169.00 (NHCO), 164.24 (C-2), 159.39 (DMT), 150.5, 145.62 (DMT), 144.31, 132.89, 130.82, 130.72, 129.09, 128.89, 128.60, 113.96 (DMT), 96.96, 89.01, 87.18, 79.91, 72.56, 70.25 (C-5, C-1', C-4', C-2', C-1'', C-3'), 59.51 (C-5'), 55.33 (OCH₃). FAB-MS m/z 662 [M + H]⁺.
Beispiel 63
(1R,3R,4R,7S)-7-(2-Cyanoethoxy(diisopropylamino)phosphinoxy)-1-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-3-(4-N-benzoylcytosin-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1] heptan (57D). Zu einer Lösung von Nucleosid 57C (0,025 g, 0,03 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (1,5 cm³) wurde N,N-Diisopropylethylamin (0,03 cm³, 0,17 mmol) zugesetzt, woraufhin Zutropfen von 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidochloridit (0,02 cm³, 0,09 mmol) erfolgte. Nach 5-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch auf 0°C gekühlt, Dichlormethan/Pyridin (10,0 cm³, 99,5:0,5, Vol./Vol.) wurde zugesetzt, und das Waschen erfolgte unter Verwendung einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (3 × 8 cm³). Die organische Phase wurde getrennt, getrocknet (Na₂SO₄) und bis zur Trockenen unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol/Pyridin (99,0:0,5:0,5, Vol./Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Amidit 57D in Form eines hellgelben Öls (0,038 g) zu ergeben. δ_P (CDCl₃) 147,93.
Beispiel 64
9-(2-O-Acetyl-4-C-acetyloxymethyl-3,5-di-O-benzyl-β-D-ribofuranosyl)-6-N-benzoyladenin (58). Zu einer gerührten Suspension des anomeren Gemisches 33 (5,0 g, 10,3 mmol) und 6-N-Benzoyladenin (3,76 g, 15,7 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (200 cm³) wurde N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamid (15,54 cm³, 61,8 mmol) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rückfluss 1 h lang gerührt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Trimethylsilyltriflat (7,0 cm³, 38,7 mmol) wurde zugetropft, und das Gemisch wurde 20 h lang unter Rückfluss erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und das Volumen unter reduziertem Druck auf ¼ reduziert. Dichlormethan (250 cm³) wurde zugesetzt, und die Lösung wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (3 × 50 cm³) und Wasser (50 cm³) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (Na₂SO₄) und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (99,5:0,5, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 58 als weißen Feststoff (3,65 g, 52%) zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 9.25 (1H, br s, NH), 8.71 (1H, s, 8-H), 8.24 (1H, s, 2-H), 8.0 (2H, d, J 7.5, Bz), 7.60–7.23 (13H, m, Bn, Bz), 6.35 (1H, d, J 4.6, 1'-H), 5.99 (1H, dd, J 4.9, 5.3, 2'-H), 4.78 (1H, d, J 5.6, 3'-H), 4.64–4.42 (5H, m, Bn, 1''-H_a), 4.25 (1H, d, J 12.1, 1''-H_b), 3.72 (1H, d, J 10.1, 5'-H_a), 3.56 (1H, d, J 10.1, 5'-H_b), 2.07 (3H, s, COCH₃), 2.02 (3H, s, COCH₃). δ_C (CDCl₃) 170.42, 169.72 (COCH₃), 164.60 (NHCO), 152.51 (C-6), 151.45 (C-2), 149.46 (C-4), 141.88 (C-8), 137.04, 137.00, 133.50, 132.60, 128.86, 128.66, 128.53, 128.41, 128.38, 128.18, 128.06, 127.91, 127.88, 127.79, 127.63, 123.26 (Bz, Bn, C-5), 86.38 (C-1'), 86.25 (C-4'), 77.74, 74.74, 74.44, 73.48 (C-2', C-3', 2 × Bn), 70.1 1 (C-1''), 63.42 (C-5'), 20.70, 20.54 (COCH₃). FAB-MS m/z 666 [M + H]⁺.
Beispiel 65
9-(3,5-Di-O-benzyl-4-C-hydroxymethyl-β-D-ribofuranosyl)-6-N-benzoyladenin (59). Zu einer gerührten Lösung von Nucleosid 58 (4,18 g, 6,28 mmol) in Methanol (50 cm³) wurde Natriummethoxid (0,75 g, 13,8 mmol) bei 0°C zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 2 h lang gerührt, und Eis wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde unter Verwendung einer 20%igen wässrigen Lösung von HCl neutralisiert. Extraktion erfolgte unter Verwendung von Dichlormethan (3 × 75 cm³), die organische Phase wurde abgetrennt, getrocknet (Na₂SO₄) und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (98,5:1,5, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 59 in Form eines weißen Feststoffs (2,68 g, 73%) zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 9.42 (1H, br s, NH), 8.58 (1H, s, H-8), 8.16 (1H, s, 2-H), 7.96 (2H, d, J 7.2, Bz), 7.52–7.08 (13H, m, Bn, Bz), 6.18 (1H, d, J 2.5, 1'-H), 4.85–4.38 (4H, m, Bn, 2'-H, 3'-H), 4.33 (2H, s, Bn) 3.90 (1H, d, J 11.9, 1''-H_a), 3.71 (1H, d, J 11.8, 1''-H_b), 3.50–3.39 (2H, m, 5-H). δ_C (CDCl₃) 164.98 (NHCO), 152.19 (C-6), 151.00 (C-2), 149.34 (C-4), 142.28 (C-8), 137.32, 137.25, 133.46, 132.70, 128.69, 128.49, 128.40, 128.11, 128.03, 127.94, 127.83, 127.62, (Bz, Bn), 122.92 (C-5), 90.94, 88.75 (C-1', C-4'), 77.65, 74.08, 73.44, 73.20, 71.12, 62.39 (C-1'', C-5', C-2', C-3', 2 × Bn). FAB-MS m/z 582 [M + H]⁺. Gef.: C, 65.6; H, 5.5; N, 11.7; C₃₂H₃₁N₅O₆ ber. C, 66.1; H, 5.4; N, 12.0%.
Beispiel 66
Zwischenprodukt 60. Eine Lösung von Nucleosid 59 (2,43 g, 4,18 mmol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (25 cm³) wurde bei –20°C gerührt, und eine 60%ige Suspension von Natriumhydrid in Mineralöl (Gew.-%, 0,28 g, 7,0 mmol) wurde in vier Portionen im Laufe von 30 min zugesetzt. Nach 1-stündigem Rühren wurde p-Toluolsulfonylchlorid (1,34 g, 7,0 mmol) in kleinen Mengen zugesetzt. Das Gemisch wurde bei –10°C 15 h lang gerührt. Eiskaltes Wasser (50 cm³) wurde zugesetzt, und Extraktion erfolgte mit Dichlormethan (3 × 50 cm³). Die vereinigte organische Phase wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (2 × 25 cm³) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (99:1, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um das Zwischenprodukt 60 (1,95 g) zu ergeben.
Beispiel 67
(1S,3R,4R,7S)-7-Benzyloxy-1-benzyloxymethyl-3-(6-N-benzoyladenin-9-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (61). Zwischenprodukt 60 (1,90 g) wurde in wasserfreiem DMF (20 cm³) aufgelöst, und eine 60%ige Suspension von Natriumhydrid in Mineralöl (Gew.-%, 0,16 g, 3,87 mmol) wurde in kleinen Mengen bei 0°C zugesetzt. Das Gemisch wurde 10 h lang bei Raumtemperatur gerührt und dann unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (75 cm³) aufgelöst, mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (2 × 25 cm³) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (99:1, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 61 als weißen Feststoff (1,0 g, ≈ 44% von 59) zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 8.71 (H, s, 8-H), 8.23 (1H, s, 2-H), 8.02 (2H, m, J 7.0, Bz), 7.99–7.19 (13H, m, Bn, Bz), 6.08 (1H, s, 1'-H), 4.78 (1H, s, 2'-H), 4.61–4.50 (4H, m, 2 × Bn), 4.24 (1H, s, 3'-H), 4.12 (1H, d, J 7.8, 1''-H_a), 4.00 (1H, d, J 7.9, 1''-H_b), 3.85–3.78 (2H, m, 5'-H_a, 5'-H_b). δ_C (CDCl₃) 164.61 (NHCO), 152.32 (C-6), 150.61 (C-2), 149.35 (C-4), 140.67 (C-8), 137.24, 136.76, 133.33, 132.66, 128.68, 128.39, 128.29, 127.94, 127.77, 127.51 (Bn, Bz), 123.43 (C-5), 87.14, 86.52 (C-1', C-4'), 77.21, 76.77, 73.56, 72.57, 72.27, 64.65 (C-2', C-3', C-1'', 2 × Bn, C-5'). FAB-MS m/z 564 [M + H]⁺. Gef.: C, 66.2; H, 5.5; N, 11.4; C₃₂H₂₉N₅O₅ ber. C, 66.2; H, 5.2; N, 12.4%.
Beispiel 68
(1S,3R,4R,7S)-7-Hydroxy-1-hydroxymethyl-3-(adenin-9-yl)2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (61A). Zu einer gerührten Lösung von Nucleosid 61 (0,80 g, 1,42 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (30 cm³) bei –78°C wurde 30 min lang BCl₃ (1 M Lösung in Hexan; 11,36 cm³, 11,36 mmol) zugetropft. Das Gemisch wurde 4 h lang bei –78°C gerührt, zusätzliches BCl₃ (1 M Lösung in Hexan, 16,0 cm³, 16,0 mmol) wurde zugetropft, und das Gemisch wurde bei –78°C 3 h lang gerührt. Dann wurde die Temperatur des Reaktionsgemischs langsam auf Raumtemperatur angehoben, und Rühren wurde 30 min lang fortgesetzt. Methanol (25,0 cm³) wurde bei –78°C zugesetzt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 12 h lang gerührt. Das Gemisch wurde unter reduziertem Druck eingedampft, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (92:8, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 61A in Form eines weißen Feststoff (0,332 g, 84%) zu ergeben.
δ_H ((CD₃)₂SO) 8.22 (1H, s, 8-H), 8.15 (1H, s, 2-H), 7.33 (2H, s, NH₂), 5.89 (1H, s, 1'-H), 5.83 (1H, d, J 4.2, 3'-OH), 5.14 (1H, t, J 5.9, 5'-OH), 4.14 (1H, s, 2'-H), 4.25 (1H, d, J 4.2, 3'-H), 3.92 (1H, d, J 7.8, 1''-H_a), 3.81–3.41 (3H, m, 5'-H_a, 5'-H_b, 1''-H_b). δ_C ((CD₃)₂SO) 155.90 (C-6), 152.64 (C-2), 148.35 (C-4), 137.72 (C-8), 118.94 (C-5), 88.48, 85.17 (C-1', C-4'), 79.09, 71.34, 69.83, 56.51 (C-2', C-3', C-1'', C-5'). FAB-MS m/z 280 [M + H]⁺.
Beispiel 69
(1S,3R,4R,7S)-7-Hydroxy-1-hydroxymethyl-3-(6-N-benzoyladenin-9-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (61B). Zu einer gerührten Lösung von Nucleosid 61A (0,32 g, 1,15 mmol) in wasserfreiem Pyridin (1 cm³) wurde Trimethylsilylchlorid (0,73 cm³, 5,73 mmol) zugesetzt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 20 min lang gerührt. Benzoylchlorid (0,67 cm³, 5,73 mmol) wurde bei 0°C zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 2 h lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 0°C gekühlt, und eiskaltes Wasser (15,0 cm³) wurde zugesetzt. Nach 5-minütigem Rühren wurde eine 32%ige (Gew.-%) wässrige Ammoniaklösung (1,5 cm³) zugesetzt, und das Gemisch wurde 30 min lang gerührt. Das Gemisch wurde bis zur Trockenen eingedampft und der Rückstand in Wasser (25 cm³) gelöst. Nach Eindampfen des Gemisches unter reduziertem Druck wurde der Rückstand durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (97:3, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 61B in Form eines weißen Feststoffs (0,55 g) zu ergeben. FAB-MS m/z 384 [M + H]⁺.
Beispiel 70
(1R,3R,4R,7S)-7-Hydroxy-1-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-3-(6-N-benzoyladenin-9-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (61C). Zu einer gerührten Lösung von Verbindung 61B (0,50 g) in wasserfreiem Pyridin (20 cm³) wurden 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (0,71 g, 2,09 mmol) und 4-N,N-Dimethylaminopyridin (DMAP) (0,1 g) zugesetzt. Nach 2-stündigem Rühren bei Raumtemperatur und 1-stündigem Rühren bei 50°C wurde das Reaktionsgemisch auf 0°C gekühlt, und eine gesättigte wässrige Lösung von Natriumhydrogencarbonat (100 cm³) wurde zugesetzt. Nach Extraktion unter Verwendung von Dichlormethan (3 × 50 cm³) wurde die vereinigte organische Phase getrocknet (Na₂SO₄) und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie, Elution mit Dichlormethan/Methanol/Pyridin (98,0:1,5:0,5), gereinigt, um Nucleosid 61C in Form eines weißen Feststoffs (0,36 g, ≈ 50% von 61A) zu ergeben.
δ_H (C₅D₅N) 12.52 (NHCO), 9.10 (2H, d, J 7.7, Bz), 8.88 (1H, s, 8-H), 8.50–7.11 (17H, m, DMT, Bz, 2-H), 6.65 (1H, s, H-1'), 5.25 (2H, s, H-2', H-3'), 4.71 (1H, d, J 7.8, 1''-H_a), 4.56 (1H, d, J 7.8, 1''-H_b), 4.20 (1H, d, J 10.8, 5'-H_a), 4.07 (1H, d, J 10.8, 5'-H_b), 3.82, 3.81 (2 × 3H, 2 × s, 2 × OCH₃). δ_C (C₅D₅N) 167.56 (NHCO), 159.24 (C-6), 152.50, 152.08, 151.81, 145.84, 141.45, 136.52, 136.28, 132.55, 130.76, 130.70, 129.32, 128.85, 128.76, 128.46, 127.38, 126.33 (DMT, Bz, C-2, C-4, C-8), 113.84 (C-5), 88.64, 87.20, 86.85, 80.52, 73.13, 72.16, 60.86 (C-1', C-4', DMT, C-2', C-3', C-1'', C-5'), 55.24 (OCH₃). FAB-MS m/z 686 [M + H]⁺. Gef.: C, 68.3; H, 5.0; N, 9.7; C₃₉H₃₅N₅O₇ ber. C, 68.3; H, 5.1; N, 10.2%).
Beispiel 71
(1R,3R,4R,7S)-7-(2-Cyanoethoxy(diisopropylamino)phosphinoxy)-1-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-3-(6-N-benzoyladenin-9-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (61 D). Zu einer Lösung von Verbindung 61C (190 mg, 0,277 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (1,5 cm³) wurden N,N-Diisopropylethylamin (0,16 cm³, 0,94 mmol) und 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidochloridit (0,1 cm³, 0,42 mmol) bei 0°C zugesetzt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen und 5 h lang gerührt. Die Lösung wurde durch Dichlormethan (50 cm³) verdünnt, mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (2 × 30 cm³) gewaschen und unter reduziertem Druck eingedampft. Die Produkte wurden durch Kieselgel-HPLC isoliert (PrepPak-Kassette, 25 × 100 mm, gepackt mit Prep Nova-Pak^® HR Silica 6 μm 60 Å; Gradient von Lösung B in Lösung A (von 0% bis 15% während 25 min und von 15% bis 100% während weiterer 25 min, Lösung A: Petroleum/Dichlormethan/Pyridin, 60/39,6/0,4, Vol./Vol./Vol.; Lösung B: Ethylacetat). Die die zwei Hauptprodukte enthaltenden Fraktionen (Retentionszeiten 30–40 min) wurden vereinigt, unter reduziertem Druck konzentriert, zusammen mit wasserfreiem Toluol (2 × 40 cm³) eingedampft und über Nacht in Vakuum getrocknet. Der Rückstand wurde in wasserfreiem Dichlormethan (4 cm³) aufgelöst und durch Zusatz dieser Lösung zu wasserfreiem Petroleumether (80 cm³) unter starkem Rühren gefällt. Das Präzipitat wurde durch Filtration gesammelt, mit Petroleumether (2 × 20 cm³) gewaschen und unter reduziertem Druck getrocknet, um Verbindung 61D (178 mg, 73%) in Form eines weißen Feststoffs zu ergeben. δ_P (CD₃CN) 148,42, 147,93.
Beispiel 72
1-(2,3-O-Isopropyliden-4-C-(4-toluolsulfonyloxymethyl)-β-D-ribofuranosyl)uridin (62). Zu einer gerührten Lösung von 1-(2,3-O-Isopropyliden-4'-C-hydroxymethyl-β-D-ribofuranosyl)uridin (2,0 g, 6,4 mmol) (R. Youssefyeh, D. Tegg, J. P. H. Verheyden, G. H. Jones und J. G. Moffat, Tetrahedron Lett. 5, 435 (1977); G. H. Jones, M. Taniguchi, D. Tegg und J. G. Moffat, J. Org. Chem. 44, 1309 (1979)) in wasserfreiem Pyridin (28 cm³) wurde p-Toluolsulfonylchlorid (1,46 g, 7,3 mmol), aufgelöst in wasserfreiem Pyridin (10 cm³), bei –30°C zugesetzt. Nach 30-minütigem Rühren wurde das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur erwärmen gelassen, und das Rühren wurde bei Raumtemperatur 12 h lang fortgesetzt. Die Reaktion wurde mit Methanol (4 cm³) gequencht, Kieselgel (2 g) wurde zugesetzt, und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung eines Gradienten von 0–3% Methanol in Dichlormethan (Vol.-%) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 62 in Form eines blassrötlichen Feststoffs (1,8 g, 60%) zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 9.80 (1H, br s, NH), 7.80 (2H, d, J 8.3, Ts), 7.46 (1H, d, J 8.1, 6-H), 7.35 (2H, d, J 8.01, Ts), 5.72 (1H, d, J 8.0, 5-H), 5.54 (1H, d, J 3.5, 1'-H), 5.08 (1H, dd, J 3.5', 6.4, 2'-H), 4.94 (1H, d, J 6.4, 3'-H), 4.18 (2H, s, 1''-H), 3.82–3.70 (2H, m, 5'-H), 2.45 (3H, s, Ts), 1.46, 1.29 (6H, s, CH₃). δ_C (CDCl₃) 163.6 (C-4), 150.4 (C-2), 145.2 (C-6), 142.9, 132.5, 129.9, 128.0 (Ts), 114.7 (OCO), 102.6 (C-5), 94.9, 87.6, 83.9, 81.5 (C-4', C-1', C-3', C-2'), 68.7, 63.5 (C-1'', C-5'), 26.4, 24.7 (CH₃), 21.7 (Ts). FAB-MS m/z 469 [M + H]⁺.
Beispiel 73
1-(4-C-(p-Toluolsulfonyloxymethyl-β-D-ribofuranosyl)uridin (63). Nucleosid 62 (1,33 g, 2,83 mmol) wurde in 80%iger Essigsäure (25 cm³) aufgelöst und bei 80°C 3 h lang gerührt, wobei das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt wurde. Der Rückstand wurde mit Ethanol (10 cm³) zusammen eingedampft und durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung eines Gradienten von 0–2% Methanol in Dichlormethan (Vol.-%) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 63 in Form eines weißen Feststoffs (391 mg, 33%) zu ergeben.
δ_H (CD₃OD) 7.81 (1H, d, J 8.1, 6-H), 7.77 (1H, d, J 8.4, Ts), 7.40 (2H, d, J 8.6, Ts), 5.74 (1H, d, J 6.6, 1'-H), 5.69 (1H, d, J 8.1, 5-H), 4.17–4.33 (2H, m, 2'-H, 3'-H), 3.67–3.62 (2H, m, 1''-H), 3.26–3.20 (2H, m, 5'-H), 2.43 (3H, s, Ts). δ_C (CD₃OD) 166.0 (C-4), 153.0 (C-2), 146.5 (C-6), 142.5, 130.9, 129,15 (Ts), 103.1 (C-5), 89.0, 87.2 (C-1', C-4'), 75.1, 72.7, 71.3, 63.8 (C-1'', C-3', C-2', C-5'), 21.6 (Ts).
Beispiel 74
(1S,3R,4R,7S)-7-Hydroxy-1-hydroxymethyl-3-(uracil-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (44). Zu einer gerührten Lösung von Nucleosid 63 (64 mg, 0,14 mmol) in wasserfreiem DMF (2 cm³) wurde langsam Natriumhydrid (8,4 mg, 21 mmol, 60% Suspension in Mineralöl, Gew.-%) in wasserfreiem DMF (2 cm³) bei 0°C zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf 120°C 6 h lang erhitzt. Nach Quenchen der Reaktion mit Wasser (2 cm³) wurden die Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung eines Gradienten von 5–7% Methanol in Dichlormethan (Vol.-%) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 44 in Form eines weißen Feststoffs (9 mg, 29%) zu ergeben. NMR-Daten standen im Einklang mit jenen, die zuvor für Verbindung 44 berichtet wurden.
Beispiel 75
(1S,3R,4R,7S)-7-Acetoxy-1-acetoxymethyl-3-(thymin-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (64). Zu einer gerührten Lösung von Nucleosid 37 (209,8 mg, 0,78 mmol) in wasserfreiem Pyridin (2,5 cm³) wurden Essigsäureanhydrid (0,3 cm³, 3,23 mmol) und eine katalytische Menge von DMAP (5 mg) zugesetzt. Nach 2-stündigem Rühren wurde Ethanol (4 cm³) zugesetzt, und das Gemisch wurde unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde in Dichlormethan neuerlich aufgelöst und mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (7 cm³), gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (Na₂SO₄) und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (97:3, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, woraus 64 in Form eines weißen Feststoffs (249 mg, 90%) hervorging.
^δC (CDCl₃) 169.59, 163.20, 149.50, 133.55, 1 10.64, 87.05, 85.38, 77.84, 71.70, 71.02, 58.60, 20.62, 20.53, 12.78. FAB-MS m/z 355 [M + H]⁺.
Beispiel 76
(1S,3R,4R,7S)-1-Hydroxymethyl-3-(5-methyl-4-N-benzoylcytosin-1-yl)-7-hydroxy-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (65). Zu einer Lösung von Nucleosid 64 (232,7 mg, 0,66 mmol) in wasserfreiem Acetonitril (3 cm³) wurde eine Lösung von 1,2,4-Triazol (420 mg, 6,1 mmol) und POCl₃ (0,12 cm³, 1,3 mmol) in wasserfreiem Acetonitril (5 cm³) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 0°C gekühlt, und wasserfreies Triethylamin (0,83 cm³) wurde zugesetzt, worauf das Gemisch 90 min lang bei Raumtemperatur gehalten wurde. Triethylamin (0,54 cm³) und Wasser (0,14 cm³) wurden zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde 10 min lang gerührt und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde in EtOAc aufgelöst und mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (2 × 9 cm³) und Wasser (9 cm³) gewaschen. Die wässrige Phase wurde mit Dichlormethan (3 × 20 cm³) extrahiert. Die vereinigte organische Phase wurde unter reduziertem Druck eingedampft, und der Rückstand wurde in Dioxan (4 cm³) neuerlich aufgelöst, worauf 32%iger wässriger Ammoniak (0,7 cm³) zugesetzt wurde. Nach 3-stündigem Rühren wurde das Reaktionsgemisch unter reduziertem Druck eingedampft und mit wasserfreiem Pyridin zusammen eingedampft. Der Rückstand wurde in wasserfreiem Pyridin (3,6 cm³) aufgelöst, und Benzoylchlorid (0,42 cm³, 3,6 mmol) wurde zugesetzt. Nach 2-stündigem Rühren wurde die Reaktion mit Wasser (1 cm³) gequencht, und das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde dann neuerlich in EtOAc aufgelöst und mit Wasser (3 × 7 cm³) gewaschen. Die organische Phase wurde unter reduziertem Druck bis zur Trockenen eingedampft, der Rückstand wurde in Pyridin/Methanol/Wasser (13:6:1, Vol./Vol./Vol., 14 cm³) bei 0°C aufgelöst, und eine 2 M Lösung von NaOH in Pyridin/Methanol/Wasser (13:6:1, Vol./Vol./Vol., 7 cm³) wurde zugesetzt. Nach 20-minütigem Rühren wurde das Reaktionsgemisch unter Verwendung einer 2 M Lösung von HCl in Dioxan neutralisiert, und das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (95:5, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 65 in Form eines weißen Schaums (94,6 mg, 38%) zu ergeben.
δ_H (CD₃OD) 8.21 (1H, br, s), 8.02 (1H, m), 7.84–7.9 (1H, m), 7.41–7.58 (4H, m), 5.61 (1H, s), 4.36 (1H, s), 4.10 (1H, s), 3.98 (1H, d, J 8.0), 3.94 (2H, s), 3.78 (1H, d, J 7.9), 2.11 (3H, d, J 1.0). δ_C (CD₃OD, ausgewählte Signale) 133.66, 132.90, 130.63, 129.50, 129.28, 128.65, 90.71, 88.86, 80.57, 72.47, 70.22, 57.53, 14.01. FAB-MS m/z 374 [M + H]⁺.
Beispiel 77
(1R,3R,4R,7S)-1-(4,4'-Dimethoxytrityloxymethyl)-3-(5-methyl-4-N-benzoylcytosin-1-yl)-7-O-(2-cyanoethoxy(diisopropylamino)phosphinoxy)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (66). Zu einer gerührten Lösung von Nucleosid 65 (82 mg, 0,22 mmol) in wasserfreiem Pyridin (1,5 cm³) wurde 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (80 mg, 0,24 mmol) zugesetzt, und Rühren wurde bei Raumtemperatur 12 h lang fortgesetzt. Zusätzliches 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (80 mg, 0,24 mmol) wurde zugesetzt, und Rühren wurde weitere 12 h lang fortgesetzt. Methanol (0,5 cm³) wurde zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol/Pyridin (98,5:1,0:0,5, Vol./Vol./Vol.) unterzogen. Das resultierende Zwischenprodukt (FAB-MS m/z 676) (50,2 mg) wurde zusammen mit wasserfreiem Acetonitril eingedampft und in wasserfreiem Dichlormethan (0,62 cm³) aufgelöst. N,N-Diisopropylethylamin wurde zugesetzt (0,1 cm³), woraufhin 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidochloridit (0,3 cm³, 0,11 mmol) zugesetzt wurde. Nach 3-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde Wasser (1 cm³) zugesetzt, und das resultierende Gemisch wurde mit Ethylacetat (10 cm³) verdünnt und mit gesättigten wässrigen Lösungen von Natriumhydrogencarbonat (3 × 6 cm³) und Salzlauge (3 × 6 cm³) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (Na₂SO₄) und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulen-HPLC gereinigt. Das wie für Verbindung 53 beschriebene Fällen ergab Verbindung 66 in Form eines weißen Feststoffs (29,5 mg, 0,03 mmol, 14%). δ_P (CH₃CN) 148,46, 147,49.
Beispiel 78
9-(4-(Hydroxymethyl)-2,3-O-isopropyliden-β-D-ribofuranosyl)-6-N-benzoyladenin (67). Ein Gemisch von Oxalylchlorid (0,93 ml, 10,75 mmol) und Dichlormethan (25 ml) wurde auf –70°C gekühlt. Dimethylsulfoxid (DMSO, 1,7 ml, 22 mmol) wurde unter kräftigem Rühren zugetropft. Das Gemisch wurde 10 min lang bei –70°C gerührt, und eine Lösung von 9-(2,3-O-Isopropyliden-β-D-ribofuranosyl)-6-N-benzoyladenin (3,4 g, 8,27 mmol) in Dimethylsulfoxid/Dichlormethan (1:9, Vol./Vol., 20 ml) wurde im Laufe von 5 min zugesetzt. Das Gemisch wurde bei –60°C 30 min lang gerührt. Triethylamin (7 ml, 50,3 mmol) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Die Lösung wurde durch Dichlormethan (50 ml) verdünnt und mit Wasser (3 × 100 ml) gewaschen. Wasserfraktionen wurden zusätzlich mit 100 ml Dichlormethan gewaschen. Die organische Phase wurde zu einer öligen Masse konzentriert, zusammen mit Dioxan (50 ml) eingedampft und neuerlich in 30 ml Dioxan aufgelöst. 37%iges wässriges Formaldehyd (2,95 ml, 33,4 mmol) und 2 M wässriges NaOH (8,26 ml) wurden zugesetzt; das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 10 min lang gerührt und auf 0°C abgekühlt. Natriumborhydrid (640 mg, 16,9 mmol) wurde zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur 15 min lang erwärmen gelassen. Die Reaktion wurde durch Zusatz von Essigsäure (5 ml) gequencht, und zu dem Gemisch wurden Dichlormethan und eine gesättigte wässrige Lösung von Natriumhydrogencarbonat (100 ml jeweils) zugesetzt. Die organische Phase wurde mit Wasser (100 ml) gewaschen, in Vakuum konzentriert, und das Produkt wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie (2,5 × 25 cm) unter Verwendung von 2–3,2 Vol.-% Methanol in Dichlormethan als Elutionsmittel isoliert. Die Ausbeute belief sich auf 1,85 g (50,7%) von Verbindung 67 in Form eines weißen Feststoffs.
δ_H (CDCl₃) 8.72 (1H, s), 8.14 (1H, s), 8.03–8.00 (2H, m), 7.60–7.57 (1H, m), 7.56–7.46 (2H, m), 6.00 (1H, d, J 4.9), 5.35 (1H, dd, J' 5.8, J'' 5.01, 5.13 (1H, d, J 5.8), 3.87–3.78 (4H, m), 1.65 (3H, s), 1.38 (3H, s). δ_C (CDCl₃) 164.8, 152.2, 150.4, 150.2, 142.6, 133.3, 132.9, 128.8, 128.0, 124.1, 114.7, 93.3, 90.2, 83.8, 82.5, 65.3, 62.9, 27.3, 25.1. FAB-MS: m/z 442 [M + H]⁺, 464 [M + Na]⁺.
Alternative Synthese von 67. Zu einer Lösung von 2',3'-O-Isopropylidenadenosin (15 g) in wasserfreiem Pyridin (250 ml) wurde Trimethylsilylchlorid (15,5 ml) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 20 min lang gerührt und auf 0°C gekühlt. Benzoylchlorid (17 ml) wurde zugetropft, und das Gemisch wurde 2–3 h lang bei Raumtemperatur gehalten. Wasser (50 ml) und 25%iges wässriges Ammoniumhydroxid. (100 ml) wurden zugesetzt, und Rühren wurde. 3 h lang fortgesetzt. Dann wurde das Gemisch unter reduziertem Druck konzentriert, zusammen mit Toluol (2 × 200 ml) und Dichlormethan (DCM) eingedampft, und gesättigtes Natriumhydrogencarbonat wurde zugesetzt. Die organische Phase wurde bis zur Trockenen eingedampft, um einen gelben Feststoff zu ergeben. Umkristallisierung aus Ethanol resultierte in 12,5 g (ca. 80%) eines weißen festen Zwischenmaterials. Oxalylchlorid (4,68 ml) in trockenem DCM (120 ml) wurde auf –70°C gekühlt. DMSO (8,5 ml) wurde unter kräftigem Rühren zugesetzt. Später (10 min) wurde eine Lösung des Zwischenprodukts, für das die Synthese zuvor beschrieben wurde, (17 g) in 10% DMSO/DCM (100 ml) zugetropft (20 min). Die Temperatur wurde über 30 min hinweg auf –50°C ansteigen gelassen, wonach die Reaktion mit Triethylamin (35 ml) gequencht wurde. Zu dem Gemisch wurde DCM (200 ml) zugesetzt, das mit Wasser (3 × 200 ml) gewaschen worden war. Das Zwischenprodukt wurde im Vakuum konzentriert, zusammen mit Dioxan eingedampft und in Dioxan (120 ml) neuerlich aufgelöst. Formaldehyd (37%) und 2 M wässriges Natriumhydroxid (40 ml) wurden zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde 1 h lang gerührt. Das Gemisch wurde mit Essigsäure (6 ml) neutralisiert, und DCM (400 ml) und gesättigtes Natriumhydrogencarbonat (400 ml) wurden zugesetzt. Die organische Phase wurde konzentriert. Das Produkt 67 wurde durch Säulenchromatographie (Kieselgel, 1,5–5,0% Methanol/DCM) gereinigt. Ausbeute: 8,5 g (46%) von 67. Die Daten entsprachen jenen, die zuvor in diesem Beispiel genannt wurden.
Beispiel 79
9-(2,3-O-Isopropyliden-4-(p-toluolsulfonyloxymethyl)-β-D-ribofuranosyl)-6-N-benzoyladenin (68) und 9-(4-Hydroxymethyl-2,3-O-isopropyliden-5-O-(p-toluolsulfonyl)-β-D-ribofuranosyl)-6-N-benzoyladenin. Ein Gemisch von Verbindung 67 (1,95 g, 4,42 mmol) mit p-Toluolsulfonylchlorid (1,26 g, 6,63 mmol) wurde in 10 ml wasserfreiem Pyridin bei 0°C aufgelöst. Das Reaktionsgemisch wurde 4 h lang gerührt und dann mit Dichlormethan (100 ml) verdünnt, mit Wasser gewaschen (2 × 100 ml) und unter reduziertem Druck konzentriert. Die Reinigung des Gemisches durch Kieselgel-Säulenchromatographie (2,5 × 20 cm) in einem Gradienten (1–4%) von Methanol in Dichlormethan ermöglichte das Isolieren von Ausgangsmaterial 67 (360 mg, 18,5%) und zwei strukturellen Isomeren, nämlich 68 (weniger polares Isomer; 971 mg, 36,7%) und 9-(4-Hydroxymethyl-2,3-O-isopropyliden-5-O-(4'-Toluolsulfonyl)-β-D-ribofuranosyl)-N⁶-benzoyladenin (stärker polares Isomer; 352 mg, 13,1%) als weiße Feststoffe.
68: δ_H (CDCl₃) 8.69 (1H, s), 8.11 (1H, s), 8.00 (2H, m), 7.79 (2H, m), 7.58–755 (1H, m), 7.50–7.46 (2H, m), 7.34–7.32 (2H, m), 5.88 (1H, d, J 4.9), 5.35 (1H, dd, J' 5.8, J'' 5.0), 5.13 (1H, d, J 5.8), 3.87–3.78 (4H, m), 1.65 (3H, s), 1.38 (3H, s). δ_C (CDCl₃) 164.7, 152.0, 150.2, 150.1, 144.9, 142.5, 133.2, 132.7, 132.3, 129.6, 128.6, 127.9, 127.8, 123.9, 114.6, 93.1, 87.9, 83.4, 81.6, 68.3, 64.4, 27.1, 25.0, 21.5. FAB-MS: m/z 596 [M + H].⁺
Beispiel 80
9-(4-(p-Toluolsulfonyloxymethyl)-β-D-ribofuranosyl)-6-N-benzoyladenin (69). Eine Lösung von Verbindung 68 (940 mg, 1,58 mmol) in 10 ml 90%iger wässriger Trifluoressigsäure wurde 30 min lang bei Raumtemperatur gehalten und in Vakuum zu einer öligen Masse konzentriert. Nach gleichzeitigem Eindampfen mit Methanol (2 × 20 ml) und Toluol (20 ml) wurde das Gemisch mittels Kieselgel-Säulenchromatographie (2 × 25 cm) in einem Gradienten von Methanol (2–5,0%) in Dichlormethan als Elutionsmittel gereinigt, um Verbindung 69 (825 mg, 94%) als weißen Feststoff zu ergeben.
δ_H (Methanol-d₄) 8.67 (1H, s), 8.53 (1H, s), 8.05 (2H, d, J 7.7), 7.75 (2H, d, J 8.2), 7.63 (1H, m), 7.53 (2H, m), 7.32 (2H, d, J 8.0), 5.94 (1H d, J 7.1), 4.9 2 (1H, dd, J' 7.1, J'' 5.3), 4.41 (1H, d, J 5.1), 4.38 (1H, d, J 10.2), 4.28 (1H, d, J 10.2), 3.80 (1H, d, J 12.0), 3.68 (1H, d, J 12.0), 2.35 (3H, s). δ_C (Methanol-d₄) 168.2, 152.9, 150.8, 151.2, 146.4, 144.9, 134.7, 134.1, 134.0, 130.8, 129.7, 129.4, 129.1, 125.1, 90.0, 88.4, 75.3, 73.1, 71.1, 64.2, 21.6. FAB-MS: m/z 556 [M + H].⁺
Beispiel 81
9-(4-(p-Toluolsulfonyloxymethyl)-3,5-O-(tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)-β-D-ribofuranosyl)-6-N-benzoyladenin (70). Zu einer Lösung von Verbindung 69 (780 mg, 1,40 mmol) in wasserfreiem Pyridin (7 ml) wurde 1,3-Dichlor-1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxan (500 μl, 1,57 mmol) bei 0°C zugesetzt. Nach 2-stündigem Rühren bei 0°C wurde zusätzliches 1,3-Dichlor-1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxan (50 μl, 0,16 mmol) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen, mit Dichlormethan (100 ml) verdünnt und mit Wasser (2 × 100 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde konzentriert, und der Rückstand wurde unter Verwendung von präparativer HPLC (PrepPak-Kassette, Porasil 15–20 μm 125 Å; Elutionsmittel: 0–3% Methanol in Dichlormethan (Vol.-%) in 120 min; Durchflussgeschwindigkeit: 60 ml/min) gereinigt. Konzentration in Vakuum ergab 870 mg (78%) von Verbindung 70 in Form eines weißen Feststoffs.
δ_H (CDCl₃) 8.65 (1H, s), 8.03 (2H, m), 8.00 (1H, s), 7.83 (2H, d, J 8.4), 7.58 (1H, m), 7.49 (2H, m), 7.34 (2H, d, J 8.4), 5.87 (1H, s), 5.70 (1H, d, J 6.2), 4.68 (1H, d, J 6.2), 4.59 (1H, d, J 10.8), 4.31 (1H, d, J 11.0), 3.91 (2H, s), 2.45 (3H, s), 1.03–0.84 (28H, m). δ_C (CDCl₃) 164.9, 152.2, 150.5, 150.0, 144.7, 142.9, 133.5, 132.9, 132.8, 129.7, 128.8, 128.1, 128.0, 123.6, 90.3, 85.3, 76.0, 75.0, 68.7, 65.2, 21.6, 17.5, 17.4, 17.2, 17.1, 17.0, 16.9, 13.1, 13.0, 12.5, 12.4. FAB-MS: m/z 798 [M + H].⁺
Beispiel 82
9-(2-O,4-C-Methylen-3,5-O-(tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)-β-D-ribofuranosyl)-6-N-benzoyladenin (71). Eine Lösung von Verbindung 70 (540 mg, 0,68 mmol) in wasserfreiem THF (20 ml) wurde auf 0°C gekühlt, und Natriumhydrid (130 mg von 60%iger Suspension in Mineralöl, 3,25 mmol) wurde unter Rühren zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 30 min lang gerührt und dann durch Zusatz von 750 μl Essigsäure neutralisiert. Dichlormethan (50 ml) wurde zugesetzt, das Gemisch wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (2 × 50 ml) gewaschen und unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde auf eine Kieselgelsäule (2,5 × 25 cm) aufgetragen, und das Produkt wurde in einer Gradientenkonzentration (0,5 bis 1,2%) von Methanol in Dichlormethan als Elutionsmittel eluiert, um Verbindung 71 (356 mg, 84%) in Form eines weißen Schaums zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 8,77 (1H, s), 8.28 (1H, s). 8.03 (2H, m), 7.59 (1H, m), 7.50 (2H, m), 6.08 (1H, s), 4.86 (1H, s), 4.56 (1H, s), 4.14 (1H, d, J 13.2), 4.06 (1H, d, J 7.7), 3.97 (1H, d, J 13.2), 3.89 (1H, d, J 7.7), 1.12–0.95 (28H, m). δ_C (CDCl₃) 164.8, 152.6, 150.5, 149.6, 140.7, 133.6, 132.7, 128.7, 127.9, 123.1, 89.4, 86.5, 78.9, 71.7, 71.2, 56.7, 17.3, 17.1, 17.0, 16.9, 16.8, 13.3, 13.1, 12.5, 12.2. FAB-MS: m/z 626 [M + H].⁺
Beispiel 83
7-Hydroxy-1-hydroxymethyl-3-(6-N-benzoyladenin-9-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (61B). Triethylamintrishydrofluorid (300 μl, 1,84 mmol) wurde zu einer Lösung von Verbindung 71 (420 mg, 0,067 mmol) in wasserfreiem THF (7 ml) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h lang bei Raumtemperatur gehalten und zu einem Öl konzentriert, das durch Kieselgel-Säulenchromatographie (2 × 25 cm), Elution mit 4–10% Methanol in Dichlormethan (Vol.-%), gereinigt wurde. Ausbeute 232 mg (92%) von Verbindung 61B in Form eines weißen Feststoffs. Die NMR-Daten waren mit jenen, die zuvor für 61B angegeben wurden, identisch.
Beispiel 84
1-(3,5-Di-O-benzyl-4-C-(p-toluolsulfonyloxymethyl)-2-O-p-toluolsulfonyl-β-D-ribofuranosyl)thymin (72). Eine Lösung von 1-(3,5-Di-O-benzyl-4-C-(hydroxymethyl)-β-D-ribofuranosyl)thymin 35 (1,48 g, 3,16 mmol), DMAP (1,344 g, 0,011 mol) und p-Toluolsulfonylchlorid (1,45 g, 7,6 mmol) in Dichlormethan (20 ml) wurde 3 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Dichlormethan (30 ml) verdünnt und mit gesättigten wässrigen Lösungen von Natriumhydrogencarbonat (3 × 20 ml) und Natriumchlorid (2 × 25 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Methanol:Dichlormethan (1:99, Vol./Vol.) als Elutionsmittel unterzogen, um Nucleosid 72 (1,95 g, 80%) als einen weißen Feststoff zu ergeben.
FAB-MS m/e 776. δ_C (CDCl₃) 162.9, 149.8 (C-2, C-4), 145.8, 145.2 (2 × Ts), 136.9. 136.8 (2 × Bn), 134.3 (C-6), 132.1, 132.0, 130.0, 129.9, 129.0 128.9, 128.4, 128.3, 128.2, 128.0, 127.7 (2 × Ts, 2 × Bn), 111.2 (C-5), 85.3, 84.0 (C-1', C-4'), 78.9, 78.3, 75.2, 74.3, 72.7, 69.1 (C-2', C-3', C-5', C-1'', 2 × Bn), 21.7 (2 × CH₃), 11.9 (CH₃). Anal. ber. für C₃₉H₄₀N₂S₂O₁₁: C, 60.30; H, 5.19; N, 3.61. Gef.: C, 59.95; H, 5.11, N 3.81.
Beispiel 85
1-(2-Benzylamino-2-desoxy-3,5-di-O-benzyl-2-N,4-C-methylen-β-D-ribofuranosyl)thymin (73). Eine Lösung von 72 (8,6 g, 11,1 mol) in Benzylamin (10 ml) wurde bei 130°C 36 h lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde direkt Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Methanol:Dichlormethan (1:99, Vol./Vol.) als Elutionsmittel unterzogen, um Nucleosid 73 (1,79 g, 30%) in Form eines weißen Feststoffs zu ergeben.
FAB-MS m/e 540. δ_C (CDCl₃) 163.9, 149.8 (C-2, C-4), 139.2, 137.6, 137.3 (3 × Bn), 135.6 (C-6), 128.5, 128.4, 128.3, 128.2, 128.0, 127.7, 127.0 (3 × Bn), 109.6 (C-5), 88.2, 86.3 (C-1', C-4'), 76.7, 73.8, 72.0, 66.0, 63.8, 57.9, 57.8 (C-2', C-3', C-5', C-1'', 3 × Bn), 12.2 (CH₃). Anal. berechnet für C₃₂H₃₃N₃O₅ × 0,5H₂O: C, 70,06; H, 6,25; N, 7,66. Gefunden: C, 70,00; H, 6,06; N, 7,50.
Beispiel 86
1-(2-Amino-2-desoxy-2-N,4-C-methylen-β-D-ribofuranosyl)thymin (74). Zu einer Lösung von Nucleosid 73 (1,62 g, 0,003 mol) in Ethanol (150 ml) wurde 20% Palladiumhydroxid auf Kohlenstoff (3 g) zugesetzt, und die Suspension wurde 5 Tage lang unter Wasserstoff gerührt. Der Katalysator wurde abfiltriert (Kiesegel) und mit Methanol (20 ml) gewaschen. Das vereinigte Filtrat wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um einen weißen Feststoff zu ergeben, der abfiltriert und mit Methanol:Dichlormethan (1:4, Vol./Vol.) gewaschen wurde, um ein monobenzyliertes Zwischenprodukt (0,82 g, 76%) zu ergeben.
FAB-MS: m/e 360 (M + H)⁺. ¹³C-NMR (DMSO-d₆, 250 MHz): 163,7, 149.8 (C-2, C-4), 138.2 (Bn), 134.9 (C-6), 128.2, 127.5, 127.4 (Bn), 107.8 (C-5), 87.8, 87.6 (C-1', C-4'), 72.7, 68.9, 65.9, 61.7, 49.4 (C-2', C-3', C-5', C-1'', Bn), 11.9 (CH₃). Anal. ber. für C₁₈H₂₁N₃O₅: C, 60.16; H, 5.89; N, 11.69. Gef.: C, 59.86; H, 5.61; N, 11.56.
Ein Gemisch aus diesem Zwischenprodukt (0,1 g, 0,29 mmol), Ammoniumformiat (0,085 g, 1,35 mmol), und 10% Palladium auf Kohlenstoff (130 mg) in wasserfreiem Methanol (7 ml) wurde unter Rückfluss 2 h lang erhitzt. Der Katalysator wurde abfiltriert (Kieselgel) und mit Methanol (15 ml) gewaschen, und das vereinigte Filtrat wurde bis zur Trockenen unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Methanol:Dichlormethan (1:9, Vol./Vol.) als Elutionsmittel unterzogen, um die Titelverbindung 74 (0,053 g, 71%) in Form eines weißen Feststoffs zu ergeben.
FAB-MS m/e 270. δ_H (DMSO-d₆) 11.29 (bs, 1H, NH), 7.73 (d, 1H, J 1.1, 6-H), 5.31 (s, 1H, 1'-H), 5.29 (br s, 1H, 3'-OH), 5.13 (m, 1H, 5'-OH), 3.81 (s, 1H, 3'-H), 3.69 (m, 2H, 5'-H), 3.23 (s, 1H, 2'-H), 2.88 (d, 1H, J 9.8, 1''-H_a), 2.55 (d, 1H, J 9.8, 1''-H_b), 1.77 (d, 3H, J 0.8, CH₃). δ_C (DMSO-d₆) 164.0, 150.1 (C-2, C-4), 135.6 (C-6), 107.8 (C-5), 89.5, 87.9 (C-1', C-4'), 68.7, 61.9, 57.1, 49.4, (C-2', C-3', C-5', C-1''). Anal. ber. für C₁₁H₁₅N₃O₂ × 0.5H₂O: C, 47.48; H, 5.80; N, 15.10. Gef.: C, 47.54; H, 5.30; N, 14.79.
Alternatives Verfahren für die Umsetzung von 73 zu 74. Zu einer Lösung von 73 (0,045 g, 0,0834 mmol) in Methanol (6 ml) wurde 10% Palladium auf Kohlenstoff (0,118 g) und – in drei Portionen im Laufe von 3 h – Ammoniumformiat (0,145 g, 0,0023 mol) zugesetzt. Die Suspension wurde 4,5 h unter Rückfluss erhitzt. Der Katalysator wurde abfiltriert (Kieselgel) und mit Methanol (4 × 3 ml) gewaschen. Das vereinigte Filtrat wurde konzentriert, und der Rückstand wurde Säulenchromatographie auf Kieselgel unter Verwendung von Methanol:Dichlormethan (1:9, Vol./Vol.) als Elutionsmittel unterzogen, um Nucleosid 74 (0,015 g, 67%) zu ergeben. Die spektroskopischen Daten standen mit den zuvor in diesem Beispiel für 74 angegeben Daten in Übereinstimmung.
Beispiel 87
1-(2-Amino-2-desoxy-2-N,4-C-methylen-2-N-trifluoracetyl-β-D-ribofuranosyl)thymin (74-COCF₃). Zu einer Suspension von Nucleosid 74 (0,050 g, 0,186 mmol) in Methanol (2 ml) wurden DMAP (0,013 mg, 0,106 mmol) und Ethyltrifluoracetat (0,029 ml, 0,242 mmol) zugesetzt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 2,5 h lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde Säulenchromatographie auf Kieselgel unter Verwendung von Methanol:Dichlormethan (2,5:97,5, Vol./Vol.) als Elutionsmittel unterzogen, um das Titelnucleosid 74-COCF₃ in Form eines weißen Feststoffs nach Abdampfen der Lösungsmittel unter reduziertem Druck zu ergeben (0,0055 g, 81%).
FAB-MS m/z 366 [M + H]⁺. ¹³C NMR (CD₃OD, 62.9 MHz) δ 166.5, 157.7 (q, ²J_C,F 37.5 Hz, COCF₃), 157.6 (q, ²J_C,F 37.2 Hz, COCF₃), 151.8, 136.8, 136.8, 117.6 (d, ¹J_C,F 287.5 Hz, CF₃), 117.5 (d, ¹J_C,F 286.5 Hz, CF₃), 110.8, 110.8, 90.7, 89.3, 87.7, 87.3, 70.1, 68.6, 66.2, 66.2, 64.5, 57.9, 53.3, 12.7. Anal. ber. für C₁₃H₁₄N₃O₆F₃: C; 42.8; H, 3.9; N, 11.5. Gef.: C, 42.5; H, 4.0; N, 11.2.
Beispiel 88
1-(2-Amino-2-desoxy-5-O-4,4'-dimethoxytrityl-2-N,4-C-methylen-2-N-trifluoracetyl-β-D-ribofuranosyl)thymin (74-DMT). Zu einer Lösung von Nucleosid 74-COCF₃ (0,030 g, 0,082 mmol) in wasserfreiem Pyridin (0,6 ml) bei 0°C wurde (20 min lang) 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (0,054 g, 0,159 mmol), aufgelöst in wasserfreiem Pyridin:Dichlormethan (0,6 ml, 1:1, Vol./Vol.), zugetropft, und das Gemisch wurde 10 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Ein Gemisch aus Eis und Wasser wurde zugesetzt (5 ml), und das resultierende Gemisch wurde mit Dichlormethan (3 × 5 ml) extrahiert. Die vereinigte organische Phase wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (3 × 2 ml) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und filtriert. Das Filtrat wurde bis zur Trockenen unter reduziertem Druck eingedampft, und der Rückstand wurde Säulenchromatographie auf Kieselgel unter Verwendung von Methanol:Dichlormethan:Pyridin (1,5:98,0:0,5, Vol./Vol./Vol.) als Elutionsmittel unterzogen, um nach Abdampfen der Lösungsmittel unter reduziertem Druck Nucleosid 74-DMT in Form eines weißen Feststoffs (0,051 g, 93%) zu erhalten.
FAB-MS m/z 667 [M]⁺, 668 [M + H]⁺. FAB-HRMS ber. für C₃₄H₃₂N₃O₈F₃ ⁺: 667.2142. Gef.: 667.2146. ¹³C NMR (C₅D₅N, 100.6 MHz) δ 165.1, 165.0, 159.5, 159.5, 151.4, 145.7, 136.3, 136.1, 134.8, 134.6, 130.9, 130.9, 130.9, 128.9, 128.9, 128.7, 128.7, 128.4, 127.7, 123.2, 114.1, 114.1, 114.0, 110.4, 89.4, 87.9, 87.5, 87.4, 87.2. 70.8,.69.0, 66.0, 64.4, 60.5, 60.2, 55.5, 53.6, 53.4, 49.9, 13.2, 13.1.
Beispiel 89
1-(2-Amino-3-O-(2-cyanoethoxy(diisopropylamino)phosphino-2-desoxy)-5-O-4,4'-dimethoxytrityl-2-N,4-C-methylen-2-N-trifluoracetyl-β-D-ribofuranosyl)thymin (74A). Zu einer Lösung von Nucleosid 74-DMT (0,121 g, 0,181 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (2 ml) wurden N,N-Diisopropylethylamin (0,093 ml, 0,54 mmol) und 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidochloridit (0,057 ml, 0,26 mol) bei 0°C zugesetzt, und das Gemisch wurde 10 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde mit Dichlormethan (20 ml) verdünnt, mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (3 × 10 ml) extrahiert, getrocknet (Na₂SO₄) und filtriert. Das Filtrat wurde bis zur Trockenen unter reduziertem Druck eingedampft, und der Rückstand wurde Säulenchromatographie auf Kieselgel unter Verwendung von Methanol:Dichlormethan:Pyridin (1,5:98,0:0,5, Vol./Vol./Vol.) als Elutionsmittel unterzogen, um das rohe Produkt (0,107 g) nach Abdampfen der Lösungsmittel unter reduziertem Druck zu erhalten. Der Rückstand wurde in wasserfreiem Dichlormethan (1 ml) aufgelöst, und durch Zutropfen zu kräftig gerührtem Petroleumether (60–80°C, 30 ml) bei –30°C wurde Nucleotid 74A ausgefällt, um nach Filtration einen weißen Feststoff (0,090 g, 57%) zu ergeben.
FAB-MS m/z 868 [M + H]⁺, 890 [M + Na]⁺. ³¹P-NMR (CD₃CN, 121,5 MHz) δ 150,4, 150,2, 148,8, 149,1.
Beispiel 90
1-(2-Amino-2-N,4-C-methylen-3,5-O-(tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)-β-D-ribofuranosyl)thymin (74B). Zu einer Lösung von Nucleosid 74 (0,20 g, 0,74 mmol) in wasserfreiem Pyridin (3 ml) bei –15°C wurde (im Laufe von 3 h) 1,3-Dichlor-1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxan (0,305 ml, 0,0011 mol) zugetropft, und das Gemisch wurde 10 h lang bei Raumtemperatur gerührt. MeOH (3 ml) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde bis zur Trockenen unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde Säulenchromatographie auf Kieselgel unter Verwendung von Methanol:Dichlormethan (1:99, Vol./Vol.) unterzogen, um Nucleosid 74B nach Abdampfen der Lösungsmittel unter reduziertem Druck in Form eines weißen Feststoffs (0,370 mg, 97%) zu ergeben.
FAB-MS m/z 512 [M + H]⁺. ¹H NMR ((CD₃)₂SO, 400 MHz) δ 11.37 (bs, 1H), 7.48 (s, 1H), 5.32 (s, 1H), 4.06 (d, 1H, J 13.5 Hz), 4.00 (s, 1H), 3.84 (d, 1H, J 13.5 Hz), 3.41 (s, 1H), 2.92 (d, 1H, J 10.2 Hz), 2.64 (d, 1H, J 10.2 Hz), 1.74 (s, 3H), 1.10–0.92 (m, 28H).¹³C NMR ((CD)₃SO₂, 62.9 MHz) δ 163.8, 149.8, 134.1, 107.9, 89.5, 87.9, 70.1, 61.1, 57.9, 49.3, 17.2, 17.2, 17.0, 16.9, 16.8, 16.7, 12.6, 12.2, 11.7. Anal. ber. für C₂₃H₄₁N₃O₆Si₂: C, 54.0; H, 8.1; N, 8.2. Gef.: C, 54.0; H, 8.3; N, 7.8.
Beispiel 91
1-(2-Desoxy-2-methylamino-2-N,4-C-methylen-3,5-O-(tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)-β-D-ribofuranosyl)thymin (74C). Zu einer Lösung von Nucleosid 74B (0,33 g, 0,64 mmol) in wasserfreiem THF:Dichlormethan (4:1, Vol./Vol.) bei –10°C wurde (im Laufe von 30 min) 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU, 0,125 ml, 0,836 mmol) und Methyliodid (0,05 ml, 0,79 mmol) zugetropft, und das Gemisch wurde 48 h lang bei 10°C gerührt. Zusätzliches DBU (0,05 ml, 0,33 mmol) und Methyliodid (0,020 ml, 0,32 mmol) wurden (im Laufe von 15 min) dem Reaktionsgemisch zugetropft, und Rühren bei 10°C wurde 24 h lang fortgesetzt. Das Gemisch wurde bis zur Trockenen unter reduziertem Druck eingedampft, und der Rückstand wurde Säulenchromatographie auf Kieselgel unter Verwendung von Methanol:Dichlormethan (1:99, Vol./Vol.) als Elutionsmittel unterzogen, um Nucleosid 74C in Form eines weißen Feststoffs (0,25 g, 74%) nach Abdampfen der Lösungsmittel zu ergeben.
FAB-MS m/z 526 [M + H]⁺. ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 8.19 (bs, 1H), 7.65 (d, 1H, J 1.3 Hz), 5.59 (s, 1H), 4.11 (s, 1H), 4.05 (d, 1H, J 13.2 Hz), 3.87 (d, 1H, J 13.2 Hz), 3.44 (s, 1H), 2.98 (d, 1H, J 9.5 Hz), 2.71 (d, 1H, J 9.5 Hz), 2.72 (s, 3H), 1.91 (d, 1H, J 1.1 Hz), 1.12–0.96 (m, 28H). ¹³C NMR (CDCl₃, 62.9 MHz) δ 163.7, 149.6, 135.2, 109.7, 90.9, 85.7, 71.4, 67.3, 58.6, 58.2, 41.2, 17.5, 17.4, 17.3, 17.2, 17.1, 16.9, 13.3, 13.1, 13.0, 12.6, 12.1. Anal. ber. für C₂₄H₄₄N₃O₆Si₂, 0.25H₂O: C, 54.4; H, 8.3; N, 7.9. Gef.: C, 54.4; H, 8.1; N, 7.7.
Beispiel 92
1-(2-Desoxy-2-methylamino-2-N,4-C-methylen-β-D-ribofuranosyl)thymin (74D). Zu einer Lösung von Nucleosid 74C (0,40 g, 0,76 mmol) in THF bei Raumtemperatur wurde eine Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid in THF (1,0 M, 2,2 ml, 2,2 mmol) zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde 20 min lang gerührt, worauf Pyridin:Wasser:Methanol (6 ml, 3:1:1, Vol./Vol./Vol.) zugesetzt wurde. Das Gemisch wurde zu Dowex-50 × 200-Harz (2,2 g, H⁺- (Pyridinium-) Form, 100–200 Mesh), in Pyridin:Wasser:Methanol (6 ml, 3:1:1, Vol./Vol./Vol.) suspendiert, zugesetzt, und das resultierende Gemisch wurde 20 min lang gerührt. Nach Filtration wurde der Rückstand mit Pyridin:Wasser:Methanol (3 × 3 ml, 3:1:1, Vol./Vol./Vol.) gewaschen, und das vereinigte Filtrat wurde bis zur Trockenen unter reduziertem Druck eingedampft, um einen öligen Rückstand nach gleichzeitigem Eindampfen mit Methanol (2 × 5 ml) zu erhalten. Säulenchromatographie auf Kieselgel unter Verwendung von Methanol:Dichlormethan (1:49, Vol./Vol.) als Elutionsmittel ergab Nucleosid 74D in Form eines weißen Feststoffs nach Abdampfen der Lösungsmittel unter reduziertem Druck (0,17 g, 79%).
FAB-MS m/z 284 [M + H]⁺. FAB-HRMS ber. für (C₁₂H₁₈N₃O₅ ⁺: 284.12465. Gef.: 284.12402. ¹H NMR ((CD₃)₂SO, 400 MHz) δ 11.3 (bs, 1H, NH), 7.70 (d, 1H, J 1.1 Hz, 6-H), 5.50 (s, 1H, 1'-H), 5.26 (d, 1H, J 4.9 Hz, 3'-OH), 5.12 (t, 1H, J 5.7 Hz, 5'-OH), 3.87 (d, 1H, J 4.8 Hz, 3'-H), 3.67 (d, 2H, J 5.5 Hz, 5'-H), 3.12 (s, 1H, 2'-H), 2.87 (d, 1H, J 9.3 Hz, 5''-H_a), 2.56 (s, 3H, NCH₃), 2.52–2.49 (1H, m, 5''-H_b), 1.77 (s, 3H, CH₃). ¹H NMR (CD₃OD, 400 MHz) δ 7.80 (d, 1H, J 1.3 Hz, 6-H), 5.71 (s, 1H, 1'-H), 4.07 (s, 1H, 3'-H), 3.83 (s, 2H, 5'-H), 3.36 (s, 1H, 2'-H), 3.08 (d, 1H, J 9.9 Hz, 5''-H_a), 2.68 (s, 3H, NCH₃), 2.57 (d, 1H, J 9.9 Hz, 5''-H_b), 1.88 (d, 3H, J 1.1 Hz, CH₃). ¹³C NMR (CD₃OD, 62.9 MHz) δ 166.6, 151.9, 137.4, 110.4, 91.3, 85.2, 71.4, 69.1, 59.4, 58.7, 40.2, 12.2.
Beispiel 93
1-(2-Desoxy-5-O-4,4'-dimethoxytrityl-2-methylamino-2-N,4-C-methylen-β-D-ribofuranosyl)thymin (74E). Zu einer Lösung von Nucleosid 74D (0,135 g, 0,477 mmol) in wasserfreiem Pyridin (1,5 ml) bei 0°C wurde (im Laufe von 20 min) eine Lösung von 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (0,238 g, 0,702 mmol) in wasserfreiem Pyridin:Dichlormethan (1,0 ml, 1:1, Vol./Vol.) zugetropft, und das resultierende Gemisch wurde 10 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Ein Gemisch aus Eis und Wasser wurde zugesetzt (5 ml), und das Gemisch wurde mit Dichlormethan (3 × 10 ml) extrahiert. Die vereinigte organische Phase wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (3 × 5 ml) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und filtriert. Das Filtrat wurde bis zur Trockenen unter reduziertem Druck eingedampft, und der Rückstand wurde Säulenchromatographie auf Kieselgel unter Verwendung von Methanol:Dichlormethan:Pyridin (1:98:1, Vol./Vol./Vol.) als Elutionsmittel unterzogen, um Nucleosid 74E in Form eines weißen Feststoffs nach Abdampfen der Lösungsmittel unter reduziertem Druck zu erhalten (0,20 g, 72%).
FAB-MS m/z 586 [M + H]⁺. ¹H NMR (C₅D₅N, 400 MHz) δ 13.2 (bs, 1H), 7.98 (d, 1H, J 1.3 Hz), 7.98–7.00 (m, 13H), 6.12 (s, 1H), 4.78 (d, 1H, J 3.7 Hz), 3.88–3.79 (m, 4H), 3.71 (s, 3H), 3.71 (s, 3H), 3.29 (d, 1H, J 9.3 Hz), 2.84 (d, 1H, J 9.3 Hz), 2.81 (s, 3H), 1.85 (d, 3H, J 0.9 Hz). ¹³C NMR (C₅D₅N, 62.9 MHz) δ 165.1, 159.2, 151.4, 145.9, 136.5, 136.4, 130.8, 130.7, 128.7, 128.4, 127.4, 113.8, 109.6, 89.8, 86.8, 85.1, 72.0, 68.7, 60.9, 59.4, 55.2, 40.1, 13.1. Anal. ber. für C₃₃H₃₅N₃O₇, 0.25H₂O: C, 67.2; H, 6.1; N, 7.1. Gef.; C, 67.2; H, 6.2; N, 6.9.
Beispiel 94
1-(3-O-(2-Cyanoethoxy(diisopropylamino)phosphino)-5-O-4,4'-dimethoxytrityl-2-methylamino-2-N,4-C-methylen-2-desoxy-β-D-ribofuranosyl)thymin (74F). Zu einer Lösung von Nucleosid 74E (0,130 g, 0,222 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (2 ml) bei 0°C wurden N,N-Diisopropylethylamin (0,088 ml, 0,514 mmol) und 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidochloridit (0,065 ml, 0,291 mmol) zugesetzt, und das Gemisch wurde 10 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Dichlormethan (30 ml) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (3 × 10 ml) extrahiert, getrocknet (Na₂SO₄) und filtriert. Das Filtrat wurde bis zur Trockenen unter reduziertem Druck eingedampft, und der Rückstand wurde Säulenchromatographie auf Kieselgel unter Verwendung von Methanol:Dichlormethan:Pyridin (0,5:98,5:1,0, Vol./Vol./Vol.) als Elutionsmittel unterzogen, um das rohe Produkt (0,120 g) nach Abdampfen der Lösungsmittel unter reduziertem Druck zu erhalten. Der Rückstand wurde in wasserfreiem Dichlormethan (1 ml) aufgelöst, und durch Zutropfen zu kräftig gerührtem Petroleumether (60–80°C, 30 ml) bei –30°C fiel Nucleotid 74F aus und ergab nach Filtration einen weißen Feststoff (0,090 g, 52%). ³¹P-NMR (CD₃CN, 121,5 MHz) δ 147,7.
Beispiel 95
1-(3,5-Di-O-benzyl-4-C-(p-toluolsulfonyloxymethyl)-2-O-p-toluolsulfonyl-β-D-ribofuranosyl)uracil (75). Zu einer gerührten Lösung von 1-(3,5-Di-O-benzyl-4-C-hydroxymethyl-β-D-ribofuranosyl)uracil 41 (3,55 g, 7,81 mmol) in Dichlormethan (50 cm³) wurden DMAP (3,82 g) und p-Toluolsulfonylchlorid (4,47 g, 23,5 mmol) bei Raumtemperatur zugesetzt. Das Rühren wurde 2 h lang fortgesetzt, und Dichlormethan (100 cm³) wurde zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (2 × 75 cm³) gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Die organische Phase wurde unter reduziertem Druck eingedampft, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (99,5:0,5, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 75 (4,65 g, 78%) in Form eines weißen Feststoffs zu erhalten. δ_H (CDCl₃) 8.49 (1H, br s, NH), 7.67 (1H, d, J 8.3, 6-H), 7.51–7.03 (18H, m, Bn, Ts), 6.0 (1H, d, J 7.6, 1'-H), 5.05 (1H, m, 2'-H), 4.91 (2H, m, 5-H, Bn), 4.56 (2H, m, Bn), 4.42 (1H, d, J 10.4, Bn), 4.31 (1H, d, J 4.9, 3'-H), 4.05 (2H, m, 1''-H), 3.75–3.64 (2H, m, 5'-H), 2.41 (3H, s, CH₃), 2.34 (3H, s, CH₃). δ_C (CDCl₃) 162.2 (C-4), 149.5 (C-2), 146.0, 145.3 (Ts), 139.0 (C-6), 136.7, 131.9, 130.0, 129.9, 128.9, 128.7, 128.5, 128.4, 128.3, 128.2, 128.0, 127.6 (Bn, Ts) 102.7 (C-5), 85.5 (1'-C), 84.4 (4'-C), 79.2, 78.3, 75.1, 74.3, 72.4, 69.1 (Bn, 3'-C, 2'-C, 5'-C, 1''-C), 21.7, 21.6 (Ts). FAB-MS m/z 763. Gef.: C, 61.2; H, 4.4; N, 3.3; C₃₈H₃₈N₂O₁₁S₂ ber. C, 59.8; H, 5.0; N,3.6.
Beispiel 96
1-(2-Desoxy-3,5-di-O-benzyl-2-S,4-C-methylen-2-mercapto-β-D-ribofuranosyl)thymin (76). Zu einer gerührten Lösung von Nucleosid 75 (3,70 g, 4,86 mmol) in DMF (40 cm³) wurde Kaliumthioacetat (0,83 g, 7,28 mmol) zugesetzt. Das Gemisch wurde gerührt und bei 110°C 80 h lang erhitzt. Nach Eindampfen unter reduziertem Druck wurde H₂O (100 cm³) zugesetzt. Extraktion erfolgte mit Dichlormethan (4 × 50 cm³), und die vereinigte organische Phase wurde getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (99,6:0,4, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 76 (1,65 g, 75%) in Form eines weißen Feststoffs zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 9.08 (1H, br s, NH), 7.98 (1H, d, J 8.1, 6-H), 7.39–7.20 (10H, m, Bn), 5.85 (1H, s, 1'-H), 5.26 (1H, d, J 8.1, 5-H), 4.61 (1H, d J 11.4, 5'-H), 4.56 (2H, s, Bn), 4.45 (1H, d, J 11.4, Bn), 4.14 (1H, d, J 1.7, 3'-H), 3,82 (2H, m, Bn), 3.72 (1H, d, J 1.9, 2'-H), 3.02 (1H, d, J 9.9, 1''-H_a), 2.78 (1H, d, J 9.9, 1''-H_b). δ_C (CDCl₃) 163.4 (C-4), 150.0 (C-2), 139.9 (C-6), 137.2, 136.8, 128.6, 128.5, 128.2, 127.9, 127.7 (Bn), 100.8 (C-5), 90.8, 88.8 (C-1', C-4'), 76.5, 73.8, 72.0, 70.0 (2 × Bn, C-3', C-5'), 49.52 (C-2'), 35.63 (C-1''). FAB-MS m/z 453. Gef.: C, 63.4; H, 5.1; N, 5.9; C₂₄H₂₄N₂O₅S ber. C, 63.7; H, 5.3; N, 6.1.
Beispiel 97
1-(2-O-p-Toluolsulfonyl-4-C-(p-toluolsulfonyloxymethyl)-β-D-ribofuranosyl)uracil (76A). Zu einer Lösung von Verbindung 75 (0,80 g, 1,0 mmol) in absolutem Ethanol (2 cm³) wurde 20% Palladiumhydroxid auf Kohlenstoff (0,80 g) zugesetzt, das Gemisch wurde mehrere Male mit Wasserstoff entgast, und das Rühren wurde unter Wasserstoff 48 h lang fortgesetzt. Der Katalysator wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde unter reduziertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (99:1, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 76A (0,30 g, 49%) in Form eines weißen Feststoffs zu ergeben.
δ_H (CD₃OD) 7.67 (4H, m), 7.45 (1H, d, J 8.2 Hz), 7.34 (4H, m), 5.86 (1H, d, J 8.0 Hz), 5.40 (1H, d, J 8.1 Hz), 4.95 (1H, m), 4.35 (1H, d, J 5.0 Hz), 4.17 (2H, m), 3.61 (2H, s), 2.40 (6H, s). δ_C (CD₃OD) 165.4, 151.6, 147.5, 146.6, 141.3, 134.0, 133.8, 131.4, 130.9, 129.2, 128.9, 103.7, 88.0, 85.4, 80.7, 72.4, 71.0, 64.3, 21.7, 21.6. FAB-MS m/z 583 [M + H]⁺.
Beispiel 98
1-(3,5-O-(Tetraisopropyldisiloxa-1,3-diyl)-2-O-p-toluolsulfonyl-4-C-(p-toluolsulfonyloxymethyl)-β-D-ribofuranosyl)uracil (76B). Zu einer gerührten Lösung von Nucleosid 76A (0,27 g, 0,46 mmol) in wasserfreiem Pyridin (4 cm³) wurde 1,3-Dichlor-1,1,3,3-tetraisopropylidisiloxan (0,22 cm³, 0,70 mmol) zugesetzt. Nach 48 h Rühren wurde das Gemisch auf 0°C gekühlt, und eine gesättigte wässrige Lösung von Natriumhydrogencarbonat (15 cm³) wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde mit Dichlormethan (3 × 10 cm³) extrahiert, und die vereinigte organische Phase wurde getrocknet (Na₂SO₄) und filtriert. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck abgedampft, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (99,5:0,5, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 76B (0,37 g, 97%) in Form eines weißen Feststoffs zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 8.70 (1H, br s), 7.80 (4H, m), 7.36 (4H, m), 6.98 (1H, d, J 8.1 Hz), 5.64 (1H, d, J 8.0 Hz), 5.18 (2H, m), 4.98 (1H, d, J 7.0 Hz), 4.39–4.32 (2H, m), 3.92–3.76 (2H, s), 2.45 (6H, s), 1.27–0.66 (28H, m) δ_C (CDCl₃) 162.9, 149.3, 145.6, 144.8, 143.9, 132.9, 130.1, 129.9, 128.2, 128.1, 102.2, 94.6, 84.7, 80.4, 72.8, 67.8, 64.6, 21.7, 17.3, 17.2, 17.1, 16.9, 16.8, 13.1, 12.8, 12.3. FAB-MS m/z 825 [M + H]⁺.
Beispiel 99
1-(2-Desoxy-2-mercapto-2-S,4-C-methylen-3,5-O-(tetraisopropyldisiloxa-1,3-diyl)-β-D-ribofuranosyl)uracil (76C). Zu einer gerührten Lösung von Nucleosid 76B (0,26 g, 0,32 mmol) in DMF (5 cm³) wurde Kaliumthioacetat (0,054 g, 0,47 mmol) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 110°C 20 h lang gerührt. Nach Eindampfen des Gemisches unter reduziertem Druck wurde H₂O (20 cm³) zugesetzt. Extraktion erfolgte mit Dichlormethan (3 × 10 cm³), und die vereinigte organische Phase wurde getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (99,25:0,75, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 76C (0,125 g, 77%) in Form eines weißen Feststoffs zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 8.55 (1H, br s), 8.02 (1H, d, J 8.1 Hz), 5.82 (1H, s, 1'-H), 5.65 (1H, d, J 8.1 Hz), 4.37 (1H, d, J 2.1 Hz), 4.10 (1H, d, J 13.2 Hz), 3.90 (1H, d, J 13.1 Hz), 3.53 (1H, d, J 2.1 Hz), 2.92 (1H, d, J 10.1 Hz), 2.74 (1H, d, J 10.0 Hz), 1.30–0.80 (28H, m). δ_C (CDCl₃) 163.2, 149.8, 139.6, 100.9, 91.4, 90.7, 71.5, 59.8, 51.5, 34.4, 17.5, 17.3, 17.1, 16.9, 15.5, 13.6, 13.3, 13.1, 12.9, 12.3. FAB-MS m/z 515 [M + H]⁺.
Beispiel 100
1-(2-Desoxy-2-mercapto-2-S,4-C-methylen-β-D-ribofuranosyl)uracil (76D). Zu einer gerührten Lösung von Nucleosid 76C (25 mg, 0,049 mmol) in THF (1,0 cm³) wurde eine Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid (0,20 cm³ einer 1 M Lösung in THF, 0,20 mmol) bei 0°C zugesetzt. Nach 1-stündigem Rühren des Gemisches bei 0°C wurde H₂O (5 cm³) zugesetzt, und das Gemisch wurde eingedampft. Der Rückstand wurde mit Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (97:3, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 76D (9,0 mg, 69%) in Form eines weißen Feststoffs zu ergeben.
δ_H (CD₃OD) 8.19 (1H, d, J 8.1 Hz, 6-H), 5.77 (1H, s, 1'-H), 5.65 (1H, d, J 8.1 Hz, 5-H), 4.31 (1H, d, J 2.1 Hz, 3'-H), 3.86 (2H, s, 5'-H), 3.53 (1H, d, J 2.2 Hz, 2'-H), 2.93 (1H, d, J 10.3 Hz, 1''-H_a), 2.73 (1H, d, J 10.3 Hz, 1''-H_b). δ_C (CD₃OD) 166.5, 152.0, 141.7, 101.2, 92.1, 92.0, 71.4, 59.9, 53.6, 35.4. FAB-MS m/z 273 [M + H]⁺.
Beispiel 101
1-(2-Desoxy-5-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2-mercapto-2-S,4-C-methylen-β-D-ribofuranosyl)uracil (76E). Zu einer Lösung von 76D (0,2 g, 0,37 mmol) in wasserfreiem Pyridin (5 cm³) wurde 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (0,186 g, 0,55 mmol) bei Raumtemperatur zugesetzt. Die Lösung wurde 5 h lang gerührt, worauf das Reaktionsgemisch auf 0°C gekühlt wurde. Eine gesättigte wässrige Lösung von Natriumhydrogencarbonat (30 cm³) wurde zugesetzt, und das resultierende Gemisch wurde mit Dichlormethan (3 × 50 cm³) extrahiert. Die vereinigte organische Phase wurde abgetrennt und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie mit Dichlormethan/Methanol/Pyridin (98,5:1,0:0,5, Vol./Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 76E in Form eines weißbräunlichen Feststoffs (0,175 g, 83%) zu ergeben.
δ_C (CDCl₃) 164.5, 159.4, 151.6, 145.7, 139.9, 136.4, 136.0, 135.6, 130.9, 130.8, 128.8, 128.5, 128.4, 127.5, 127.4, 122.7, 113.9, 101.5, 91.7, 90.2, 87.6, 71.8, 61.9, 55.3, 53.7, 36.2, 30.6. FAB-MS m/z 574 [M]⁺, 575 [M + H]⁺ (Gef.: C, 65.2; H, 5.4; N, 5.0; C₃₁H₃₀N₂O₇S ber. C, 64.8; H, 5.3; N, 4.9%).
Beispiel 102
1-(3-O-(2-Cyanoethoxy(diisopropylamino)phosphino)-(2-desoxy-5-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2-mercapto-2-S,4-C-methylen-β-D-ribofuranosyl)uracil (76F). Zu einer Lösung von 76E (0,160 g, 0,28 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (2 cm³) bei 0°C wurden N,N-Diisopropylethylamin (0,27 cm³) und 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidochloridit (97 mg, 0,42 mmol) zugesetzt. Rühren wurde bei Raumtemperatur 5 h lang fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 0°C gekühlt, und eine gesättigte wässrige Lösung von Natriumhydrogencarbonat (30 cm³) wurde zugesetzt. Extraktion erfolgte unter Verwendung von Dichlormethan (3 × 20 cm³), und die vereinigte organische Phase wurde getrocknet (Na₂SO₄) und bis zur Trockenen unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol/Pyridin (99:0,5:0,5 Vol./Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um einen weißen Schaum zu ergeben. Dieser Rückstand wurde in Dichlormethan (2 cm³) aufgelöst, und das Produkt wurde aus Petroleumether (100 cm³, gekühlt auf –40°C) unter kräftigem Rühren ausgefällt. Das Präzipitat wurde durch Filtration gesammelt und wurde schließlich getrocknet, um Nucleosid 76F in Form eines weißen Feststoffs (95 mg, 44%) zu ergeben. δ_P (CDCl₃) 148,9, 149,0.
Beispiel 103
3,5-Di-O-benzyl-1,2-O-isopropyliden-4-C-(p-toluolsulfonyloxymethyl)-β-D-ribofuranose (77). Eine Lösung von 3,5-Di-O-benzyl-4-C-hydroxymethyl-1,2-O-isopropyliden-α-D-ribofuranose 31 (15,38 g, 38,4 mmol), wasserfreiem Pyridin (20 cm³) und wasserfreiem Dichlormethan (80 ml) wurde bei –5°C gerührt. p-Toluolsulfonylchlorid (8,75 g, 46,0 mmol), aufgelöst in wasserfreiem Dichlormethan (8 cm³), wurde im Laufe von 15 min zugesetzt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 17 h lang gerührt. Die Reaktion wurde mit eiskaltem H₂O (200 cm³) gequencht. Extraktion erfolgte mit Dichlormethan (5 × 150 cm³), und die vereinigte organische Phase wurde mit gesättigten wässrigen Lösungen von Natriumhydrogencarbonat (3 × 100 cm³) und Salzlauge (3 × 100 cm³) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (98,5:1,5, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um 77 in Form eines klaren Öls (17,4 g, 82%) zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 7.79–7.19 (14H, m, Bn), 5.66 (1H, d, J 3.6, 1-H), 4.69–4.20 (8H, m, Bn, 5-H_a, 5-H_b, 3-H, 2-H), 3.53 (1H, d, J 10.3, 1'-H_a), 3.46 (1H, d, J 10.3, 1'-H_b), 2.40 (3H, s, CH₃), 1.29 (3H, s, CH₃), 1.26 (3H, s, CH₃). δ_C (CDCl₃) 144.6, 137.9, 137.3, 133.0, 129.8, 128.4, 128.3, 128.1, 128.0, 127.9, 127.7, 127.6 (aronatisch), 113.6 (C(CH₃)₂), 104.2, (C-1), 84.7 (C-4), 79.0, 78.7, 73.7, 72.7, 70.7, 70.2, (Bn, C-2, C-3, C-5, C-1'), 26.3, 26.0 (C(CH₃)₂), 21.6 (CH₃). FAB-MS m/z 555 [M + H]⁺. (Gef.: C, 64.8; H, 6.2; C₃₀H₃₄O₈S ber. C, 64.9; H, 6.1%).
Beispiel 104
1,2-Di-O-acetyl-3,5-di-O-benzyl-4-C-(p-toluolsulfonyloxymethyl)-α,β-D-ribofuranose (78). Eine Lösung von Furanose 77 (17,4 g, 31,4 mmol) in 80%iger Essigsäure (250 cm³) wurde bei 60°C 20 h lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde in Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mit Toluol (3 × 20 cm³) zusammen eingedampft. Der Rückstand wurde in wasserfreiem Pyridin (100 cm³) aufgelöst. Essigsäureanhydrid (14,2 cm³) wurde zugesetzt, und die Lösung wurde 15 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde durch Zusatz von eiskaltem H₂O (200 cm³) gequencht, und das Gemisch wurde mit Dichlormethan (4 × 150 cm³) extrahiert. Die vereinigte organische Phase wurde mit gesättigten wässrigen Lösungen von Natriumhydrogencarbonat (2 × 125 cm³) und Salzlauge (3 × 150 cm³) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (98,5:1,5, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um 78 (α,β ≈ 1:1) in Form eines klaren Öls (13,5 g, 72%) zu ergeben.
δ_C (CDCl₃) 169.8, 169.6, 69.4, 168.8 (C=O), 144.7, 137.7, 137.5, 132.8, 129.7, 129.6, 128.5, 128.4, 128.3, 128.2, 128.0, 127.8, 127.7, 127.6 (Bn), 97.4, 94.2 (C-1), 86.4, 84.2 (C-4), 78.9, 77.5, 74.5, 74.1, 73.7, 73.5, 71.8, 70.6, 70.5, 69.6, 69.5 (Bn, C-2, C-3, C-1'), 21.6, 21.0, 20.8, 20.6, 20.4 (COCH₃, C(CH₃)₂). FAB-MS m/z 599 [M + H]⁺.
Alternatives Verfahren für die Herstellung von Verbindung 78.
3-O-Benzyl-1,2:5,6-di-O-isopropyliden-α-D-glucofuranose (30B). Zu einer Lösung von 1,2:5,6-Di-O-isopropyliden-α-D-allofuranose (30A) (erhalten bei Pfanstiehl Laboratories Inc.) (40 g) in Dimethylformamid bei 0°C wurde Natriumhydrid in kleineren Mengen zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h lang gerührt, und Benzylbromid wurde 1 h lang zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 16 h lang gerührt. Methanol wurde zugesetzt, um die Reaktion zu quenchen, und Dimethylformamid wurde unter Druck entfernt. Der Sirup wurde mit Ethylacetat extrahiert und mit Salzlauge gewaschen. Eindampfen der Ethylacetatschicht ergab einen Halbfeststoff (93%). Homogen nach DC.
3-O-Benzyl-1,2-O-isopropyliden-α-D-glucofuranose (30C). Teilweise Hydrolyse von 30B (50 g) wurde in 75%iger Essigsäure innerhalb von 20 h erreicht. Konzentration zu einem geringeren Volumen und Extraktion mit Ethylacetat ergaben 30C, 40 g (90%). Homogen nach DC.
3-O-Benzyl-1,2-O-isopropyliden-α-D-ribopentodialdofuranose (30D). Eine Lösung von 30C (40 g) in Wasser/Methanol (1:1) wurde langsam unter Rühren zu einer Lösung von Natriumperiodat in Wasser bei 0°C zugesetzt. Die Reaktion wurde 2 h lang gerührt, Ethylenglykol wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde mit Ethylacetat extrahiert. Der getrocknete Extrakt wurde eingedampft, um 30D, 32 g (89%), zu ergeben. Homogen nach DC. In diesem Schritt ist der Zusatz von Methanol für den Abschluss der Reaktion wesentlich.
3-O-Benzyl-4-(hydroxymethyl)-1,2-O-isopropyliden-α-D-erythropentofuranose (30E). Wässriges 37%iges Formaldehyd und 1 N Natriumhydroxid wurden bei 0°C zu einer gerührten Lösung von 30D (32 g) in Wasser und Tetrahydrofuran (1:1) zugesetzt, die Reaktion wurde 16 h lang fortgesetzt, in Ethylacetat extrahiert und mit Salzlauge gewaschen. Durch Eindampfen der organischen Schicht wurde ein Sirup erhalten, der aus Ether/Petroleumether in Form eines weißen Feststoffes, 23 g, auskristallisierte, das Filtrat war ein Öl, das sich als ein niedrigschmelzender Feststoff, 10 g, verfestigte, und die Gesamtausbeute von 30E belief sich auf 92%. [23 g (weißer Feststoff war zu 99% rein nach DC), 10 g von niedrigschmelzendem Feststoff (hatte rascher wandernde Verunreinigungen nach DC, etwa zu 75% rein)). In diesem Schritt ist der Zusatz von Tetrahydrofuran für die Dauer und den Abschluss der Reaktion sehr wichtig.
3,5-Di-O-benzyl-4-C-hydroxymethyl-1,2-O-isopropyliden-α-D-ribofuranose (31). Benzylierung von 30E (20 g) mit NaH 60% und BnBr bei –10°C ergab ein Gemisch von zwei Isomeren. Flash-Säulenchromatographie ergab 31 als das Hauptisomer, 14 g (54%). Homogen nach DC.
3,5-Di-O-benzyl-1,2-O-isopropyliden-4-C-tosyl-α-D-ribofuranose (77). Eine Lösung von 31 (12,5 g) in Pyridin bei 0°C wurde mit p-Toluolsulfonylchlorid behandelt, und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 14–16 h lang fortgesetzt. Durch Entfernen von Pyridin, Extraktion mit Methylenchlorid und gesättigter Bicarbonatlösung wurde 77, 14 g (80%), erhalten. Homogen nach DC.
1,2-Di-O-acetyl-3,5-di-O-benzyl-4-C-tosyl-D-ribofuranose (78). Hydrolyse von 77 (14 g) erfolgte in 75%iger Essigsäure bei 65°C 18 h lang. Das Lösungsmittel wurde unter Druck entfernt, und der Rückstand wurde mit Ethanol (3 × 100), Toluol (3 × 50) und wasserfreiem Pyridin (2 × 50) behandelt. (Diese Verbindung 78 kristallisierte aus Petroleumether als feiner weißer Feststoff aus.) Der Rückstand wurde in trockenem Pyridin aufgenommen und mit Essigsäureanhydrid bei Raumtemperatur 8 h lang behandelt. Extraktion mit Ethylacetat und gesättigtem Bicarbonat und darauf folgendes Waschen mit Salzlauge erbrachte 78 in Form eines Gemisches aus α- und β-Anomeren, 12 g (83%). Ein direkter Vergleich mit einer authentischen Probe von 78 (DC, HPLC, NMR) bestätigte seine Identität und Reinheit.
Beispiel 105
1-(2-O-Acetyl-3,5-di-O-benzyl-4-C-(p-toluolsulfonyloxymethyl)-β-D-ribofuranosyl)thymin (79). Zu einer gerührten Lösung des anomeren Gemisches 78 (12,8 g, 21,4 mmol) und Thymin (5,38 g, 42,7 mmol) in wasserfreiem Acetonitril (182 cm³) wurde N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamid (31,68 ml, 128,23 mmol) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt, und das Rühren wurde bei 60°C 1,5 h lang fortgesetzt. Nach Abkühlen auf 0°C wurde Trimethylsilyltriflat (6,57 ml, 30,33 mmol) zugetropft, und das Gemisch wurde bei 60°C 10 h lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit einer eiskalten gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (90 ml) neutralisiert. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, und das Filtrat wurde unter reduziertem Druck auf die Hälfte des Volumens eingeengt. Extraktion erfolgte unter Verwendung von Dichlormethan (4 × 200 cm³). Die vereinigte organische Phase wurde mit gesättigten wässrigen Lösungen von Natriumhydrogencarbonat (3 × 150 cm³) und Salzlauge (3 × 150 ml) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (99:1 bis 98:2, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 79 in Form eines weißen Feststoffs (13,1 g, 92%) zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 9.04 (s, 1H, NH), 7.73–7.19 (15H, m, 6-H, aromatisch), 5.94 (1H, d, J 5.5, 1'-H), 5.37 (1H, d, J 5.6, 2'-H), 4.57–4.40 (5H, m, 3'-H, 5'-H_a, 5'-H_b, Bn), 4.14 (2H, s, Bn), 3.75 (1H, d, J 10.2, 1''-H_a), 3.57 (1H, d, J 10.2, 1''-H_b), 2.41 (3H, s, CH₃C₆H₅), 2.02 (3H, s, COCH₃), 1.54 (3H, s, CH₃). δ_C (CDCl₃) 169.8 (C=O), 163.5 (C-4), 150.2 (C-2), 145.0, 136.8, 135.6, 132.1, 129.7, 128.5, 128.0, 127.9, 127.8, 127.5 (aromatisch), 113.5 (C-5), 86.8, 85.3, 77.6, 74.6, 74.3, 73.6, 70.8, 68.8 (Bn, C-1', C-3', C-2', C-4'), 21.3 (CH₃), 20.5 (COCH₃), 11.8 (CH₃). FAB-MS m/z 665 [M + H]⁺ (Gef.: C, 61.2; H, 5.3; N, 4.1; S, 4.7, C₃₄H₃₆O₁₀N₂S ber. C, 61.4; H, 5.4; N, 4.2; S, 4.8).
Beispiel 106
1-(3,5-Di-O-benzyl-4-C-(p-toluolsulfonylmethyl)-β-D-ribofuranosyl)thymin (80). Nucleosid 79 (13,1 g, 19,7 mmol) wurde in einer Lösung von Ammoniak in Methanol (200 cm³, hergestellt durch Verdünnen von gesättigtem methanolischem Ammoniak mit einem entsprechenden Volumen an Methanol) aufgelöst und bei Raumtemperatur 4 h lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend eingedampft, und der Rückstand wurde in Dichlormethan (400 cm³) aufgelöst. Die organische Phase wurde mit Salzlauge (3 × 150 cm³) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (99,5:0,5, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 80 in Form eines weißen Feststoffs (10,7 g, 87%) zu ergeben.
δ_H (CDCl₃) 9.66 (s, 1H, NH), 7.71–7.21 (15H, m, 6-H, (aromatisch), 5.72 (1H, d, J 5.1, 1'-H), 4.75, 4.55 (2H, jeweils d, J 11.5, Bn), 4.51 (2H, s, Bn), 4.37 (1H, t, J 5.4, 2'-H), 4.30–4.12 (3H, m, 3-H, Bn), 3.76 (1H, d, J 10.2, 1''-H_a), 3.59 (1H, d, J 10.2, 1''-H_b), 2.39 (3H, s, CH₃C₆H₅), 1.48 (3H, s, CH₃). δ_C (CDCl₃) 163.8 (C-4), 150.9 (C-2), 145.0, 137.0, 136.9, 135.9, 132.3, 129.8, 128.7, 128.6, 128.2, 128.1, 128.0, 127.6 (aromatisch), 111.0 (C-5), 89.6, 85.3, 78.4, 74.5, 73.8, 71.1, 69.7, (Bn, C-1', C-3', C-2', C-4', C-1''), 21.6 (CH₃), 12.0 (CH₃). FAB-MS m/z 623 [M + H]⁺ (Gef.: C, 61.5; H, 5.2; N, 4.4; S, 5.2, C₃₂H₃₄O₉N₂S ber. C, 61.7; H, 5.4; N, 4.5; S, 5.1).
Beispiel 107
(1S,3R,4R,7S)-7-Benzyloxy-1-benzoyloxymethyl-3-(thymin-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (36). Zu einer gerührten Lösung von Nucleosid 80 (10,65 g, 17,1 mmol) in wasserfreiem DMF (150 cm³) wurde eine 60%ige Suspension von Natriumhydrid in Mineralöl (0,9 g, 22,2 mmol) in kleinen Mengen bei 0°C zugesetzt. Das Gemisch wurde bei 0°C 15 h lang gerührt, worauf zusätzliches 60%iges Natriumhydrid (0,205 g, 5,12 mmol) zugesetzt wurde, und das Reaktionsgemisch wurde zusätzliche 22 h lang bei 0°C gerührt. Methanol (20 cm³) wurde zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde anschließend unter reduziertem Druck auf sein halbes Volumen eingeengt. Eiskaltes H₂O (300 cm³) wurde zugesetzt, und Extraktion erfolgte mit Dichlormethan (5 × 150 cm³). Die vereinigte organische Phase wurde mit gesättigten wässrigen Lösungen von Natriumhydrogencarbonat (3 × 40 cm³) und Salzlauge (3 × 40 cm³) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan/Methanol (99,5:0,5, Vol./Vol.) als Elutionsmittel gereinigt, um Nucleosid 36 in Form eines weißen Feststoffs (7,1 g, 92%) zu ergeben. Spektroskopische Daten standen im Einklang mit den zuvor angegebenen Daten für 36 (Gefunden C, 66,2; H, 5,8; N, 6,1; C₂₅H₂₆N₂O₆ ber. C, 66,6; H, 5,8; N, 6,2).
Beispiel 108
3,5-Di-O-benzyl-1,2-O-isopropyliden-4-C-methansulfonyloxymethyl-α-D-ribofuranose (200). Zu einer gerührten Lösung von Furanose 31 (2,16 g, 5,39 mmol) in wasserfreiem Pyridin (3 ml) bei 0°C wurde Methansulfonylchlorid (0,61 ml, 16,0 mmol) zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde 20 min lang bei Raumtemperatur gerührt, mit eiskaltem Wasser (300 ml) gequencht und mit Dichlormethan (2 × 300 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit gesättigtem wässrigem Natriumhydrogencarbonat (300 ml) gewaschen und dann getrocknet (MgSO₄). Das Lösungsmittel wurde durch Destillieren unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Chromatographie über Kieselgel mit Dichlormethan als Elutionsmittel gereinigt, um das Produkt 200 in Form eines klaren Öls (2,55 g, 99%) zu ergeben.
¹H NMR (CDCl₃): δ 7.37–7.24 (10H, m, Bn), 5.78 (1H, d, J 3.8 Hz, H-1), 4.85 (1H, d, J 11.7 Hz, Bn), 4.73 (1H, d, J 11.9 Hz, Bn), 4.64 (1H, dd, J 4.0, 5.3 Hz, H-2), 4.54 (1H, d, J 11.9 Hz, H-5'), 4.52 (1H, d, J 11.9 Hz, Bn), 4.46 (1H, d, J 11.9 Hz, H-5'), 4.41 (1H, d, J 11.8 Hz, Bn), 3.60 (1H, d, J 10.4 Hz, H-5), 3.50 (1H, d, J 10.5 Hz, H-5), 3.06 (3H, s, SO₂CH₃), 1.68 (3H, s, CH₃), 1.34 (3H, s, CH₃); ¹³C NMR (CDCl₃): δ 137.79, 137.31, 128.54, 128.48, 128.1 6, 128.01, 127.87, 127.79 (Bn), 1 13.66 (C(CH₃)₂), 104.46 (C-1), 84.88 (C-4), 78.48, 78.41 (C-2, C-3), 73.65, 72.63, 70.78, 70.16 (Bn, C-5, C-5'), 37.84 (SO₂CH₃), 26.20 (CH₃), 25.69 (CH₃); MS FAB: 501 (M + Na, 100%). Gef.: C, 60.37; H, 6.29; S, 6.53; C₂₄H₃₀O₈S ber. C, 60.24; H, 6.32; S, 6.70%.
Beispiel 109
Methyl-3,5-di-O-benzyl-4-C-methansulfonyloxymethyl-α-D-ribofuranosid (201). Eine Lösung von Furanose 200 (1,133 g, 2,37 mmol) in methanolischer Salzsäure (20 Gew.-%, 31,7 ml) und Wasser (4,4 ml) wurde bei Raumtemperatur 2 h lang gerührt. Nach Neutralisierung mit Natriumhydrogencarbonat (s) wurde die Lösung mit Dichlormethan (2 × 150 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser (150 ml) gewaschen und dann getrocknet (MgSO₄). Das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Chromatographie über Kieselgel mit Dichlormethan:Methanol (99:1) als Elutionsmittel gereinigt, um das Produkt 201 (β:α ≈ 2:1) als ein klares Öl (1,018 g, 95%) zu ergeben;
¹H NMR (CDCl₃): δ 7.39–7.22 (m, Bn), 4.86 (br s, Bn), 4.69–3.99 (m, Bn, H-5', H-1, H-2, H-3), 3.68 (d, J 8.9 Hz, H-5 β), 3.51 (d, J 9.8 Hz, H-5 α), 3.46 (s, OCH₃ α), 3.34 (d, J 9.1 Hz, H-5 β), 3.32 (d, J 9.7 Hz, H-5 α), 3.28 (s, OCH₃ β), 2.97 (3H, s, SO₂CH₃ β), 2.93 (3H, s, SO₂CH₃ α); ¹³C NMR (CDCl₃): δ 137.74, 136.98, 128.70, 128.64, 128.58, 128.56, 128.37, 128.21, 128.15, 128.09, 127.98, 127.86, 127.83 (Bn), 107.54 (C-1 β), 103.39 (C-1 α), 84.65, 83.18, 81.90, 78,87 (C-4, C-3), 75.04, 74.07, 73.73, 73.70, 73.38, 72.56, 72.11, 70.85, 70.55, 70.20 (C-2, Bn, C-5, C-5'), 55.90 (OCH₃ α), 54.96 (OCH₃ β), 37.18 (SO₂CH₃ β), 37.07 (SO₂CH₃ α); MS FAB: 475 (M + Na, 25%). Gef.: C, 58.40; H, 6.33; C₂₄H₃₀O₈S ber. C, 58.39; H, 6.24%.
Beispiel 110
(3R)- und (3S)-(1S,4R,7S)-7-Benzyloxy-1-benzyloxymethyl-3-methoxy-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (202 und 203). Eine Lösung von 201 (3,32 g, 7,34 mmol) in wasserfreiem DMF (25 ml) wurde bei 0°C gerührt, und eine 60%ige Öldispersion von Natriumhydrid (700 mg, 16,9 mmol) wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 90 min lang gerührt, mit Wasser (300 ml) gequencht und mit Diethylether (2 × 300 ml) extrahiert. Der vereinigte Extrakt wurde mit Wasser (200 ml) gewaschen und getrocknet (MgSO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Chromatographie über Kieselgel mit Dichlormethan als Elutionsmittel gereinigt, um die zwei Produkte 202 und 203 als klare Öle (1,571 g, 60% bzw. 0,777 g, 30%) zu ergeben. (1S,3R,4R,7S)-7-Benzyloxy-1-benzyloxymethyl-3-methoxy-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (202).
¹H NMR (CDCl₃): δ 7.36–7.26 (10H, m, Bn), 4.81 (1H, s, H-1), 4.65 (1H, d, J 11.9 Hz, Bn), 4.61 (2H, s, Bn), 4.56 (1H, d, J 11.9 Hz, Bn), 4.11 (1H, s, H-2), 4.09 (1H, s, H-3), 4.01 (1H, d, J 7.5 Hz, H-5'), 3.80–3.77 (3H, m, H-5', H-5), 3.39 (3H, s, OCH₃); ¹³C NMR (CDCl₃): δ 138.05, 137.36, 128.47, 128.44, 127.88, 127.73, 127.63 (Bn), 104.97 (C-1), 85.13 (C-4), 79.16 (C-3), 77.18 (C-2), 73.64 (Bn),. 72.26, 72.10 (Bn, C-5'), 66.50 (C-5), 55.34 (OCH₃); MS FAB: 379 (M + Na, 28%). Gef.: C, 70.55; H, 6.97; C₂₁H₂₄O₅ ber. C, 70.77; H, 6.79%.
(1S,3R,4R,7S)-7-Benzyloxy-1-benzyloxymethyl-3-methoxy-2,5-dixoabicyclo[2.2.1]heptan (203).
¹H NMR (CDCl₃): δ 7.36–7.26 (10H, m, Bn), 5.00 (1H, s, H-1), 4.67–4.54 (4H, m, Bn), 4.18 (1H, s, H-2), 3.99 (1H, s, H-3), 3.99–3.90 (2H, m, H-5'), 3.75–3.68 (2H, m, H-5), 3.49 (3H, s, OCH₃); ¹³C NMR (CDCl₃): δ 137.83, 137.53, 1 28.51, 128.48, 127.96, 127.82, 127.71, 127.62 (Bn), 104.05 (C-1), 88.44 (C-4), 79.54 (C-3), 77.16 (C-2), 73.68 (Bn), 72.61 (C-5'), 72.24 (Bn), 65.73 (C-5), 56.20 (OCH₃); MS FAB: 379 (M + Na, 100%).
Beispiel 111
(1R,2S,3S)-2-Benzyloxy-3-benzyloxymethyl-1-(methoxy(thymin-1-yl)methyl)-3-trimethylsilyloxytetrahydrofuran (204). Eine Lösung von 202 (216 mg, 0,606 mmol) und Thymin (153 mg, 1,22 mmol) in wasserfreiem Acetonitril (9,3 ml) wurde BSA (N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamid, 0,90 ml, 3,6 mmol) zugesetzt und unter Rückfluss 15 min lang gerührt. Die Lösung wurde auf 0°C gekühlt, und Trimethylsilyltriflat (0,153 ml, 0,777 mmol) wurde zugetropft. Nach 18 h Rühren bei Raumtemperatur und 24 h Rühren bei 60°C wurde die Reaktion mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (20 ml) gequencht, und Extraktion erfolgte unter Verwendung von Dichlormethan (2 × 50 ml). Der vereinigte Extrakt wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (50 ml) gewaschen und getrocknet (MgSO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Chromatographie über Kieselgel mit Dichlormethan/Methanol (98:2) als Elutionsmittel gereinigt, um das Produkt 204 (Gemisch aus Diastereomeren ≈ 1,7:1) in Form eines Feststoffs (196 mg, 67%) zu ergeben.
¹H NMR (CDCl₃): δ 7.36–7.14 (m, Bn, H-6), 5.77 (1H, d, J 7.9 Hz, H-1'), 5.57 (1H, d, J 5.8 Hz, H-1'), 4.68–4.43 (m, Bn, H-2'), 4.12–3.68 (m, H-5', H-5', H-3'), 3.32 (s, OCH₃), 3.24 (s, OCH₃), 1.93 (d, J 0.9 Hz, CH₃), 1.86 (d, J 1.1 Hz, CH₃), 0.14 (s, Si(CH₃)₃), 0.12 (s, Si(CH₃)₃); ¹³C NMR (CDCl₃): δ 163.68, 163.55 (C-4), 151.58, 151.07 (C-2), 137.84, 137.74, 137.32 (Bn), 135.93, 135.10 (C-6), 128.57, 128.42, 128.41, 128.10, 127.95, 127.85, 127.77, 127.74 (Bn), 111.38, 111.01 (C-5), 86.89, 85.61, 85.40, 84.72, 83.40, 83.31, 82.10 (C-1', C-2', C-3', C-4'), 75.20, 73.98, 73.62, 73.59, 72.55, 72.13, 71.04, 70.74 (Bn, C-5', C-5''), 56.82, 56.54 (OCH₃), 12.47, 12.38 (CH₃), 1.72, 1.69 (Si(CH₃)₃); MS FAB: 555 (M + H, 65%), 577 (M + Na, 70%). Gef.: C, 62.76; H, 6.88; N, 4.94; C₂₉H₃₈N₂O₇Si ber. C, 62.79; H, 6.90; N, 5.05%.
Beispiel 112
(1R,2S,3S)-2-Benzyloxy-3-benzyloxymethyl-1-(methoxy(6-N-benzoyladenin-9-yl)methyl)-3-trimethylsilyloxytetrahydrofuran (205). Eine Lösung von 202 (240 mg, 0,673 mmol) und 6-N-Benzoyladenin (301 mg, 1,26 mmol) in wasserfreiem Acetonitril (8,2 ml) wurde BSA (0,67 ml, 2,7 mmol) zugesetzt und bei Raumtemperatur 1 h lang gerührt. Die Lösung wurde auf 0°C gekühlt, und Trimethylsilyltriflat (0,25 ml, 1,33 mmol) wurde zugetropft. Nach 18-stündigem Rühren bei 65°C wurde die Reaktion mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (50 ml) gequencht und mit Dichlormethan (2 × 50 ml) extrahiert. Der vereinigte Extrakt wurde getrocknet (MgSO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Chromatographie über Kieselgel mit Dichlormethan:Methanol (98:2) als Elutionsmittel gereinigt, um das Produkt 205 (Gemisch von Diastereomeren ≈ 1,8:1) in Form eines Feststoffes (185 mg, 41%) zu ergeben.
¹H NMR (CDCl₃): δ 8.78 (s, H-8), 8.21 (s, H-2), 8.17 (s, H-2), 8.03–8.00 (m, Bz), 7.61–7.49 (m, Bz), 7.36–7.23 (m, Bn), 7.07–7.04 (m, Bz), 5.85 (1H, d, J 7.9 Hz, H-1'), 5.76 (1H, d, J 6.0 Hz, H-1'), 4.74–4.40 (m, Bn, H-2'), 4.22–3.62 (m, H-5', H-5', H-3'), 3.33 (s, OCH₃), 3.24 (s, OCH₃), 0.15 (s, Si(CH₃)₃), 0.14 (s, Si(CH₃)₃); ¹³C NMR (CDCl₃): δ 164.68 (HNC=O), 153.17, 152.99 (C-6), 149.47 (C-2), 141.82, 141.66 (C-8), 137.74, 137.71, 137.65 (Bn), 133.87, 132.87, 132.78 (Bz), 128.97, 128.93, 128.45, 128.42, 128.38, 128.14, 127.97, 127.88, 127.82, 127.78 (Bn, Bz), 123.66, 122.85 (C-5), 86.41, 86.23, 85.70, 85.24, 84.78, 83.73, 83.58, 82.79 (C-1', C-2', C-3', C-4'), 75.32, 74.55, 73.61, 72.18, 71.98, 70.85, 70.59 (Bn, C-5', C-5''), 57.23, 57.04 (OCH₃), 1.78 (Si(CH₃)₃); MS FAB: 668 (M + H, 50%), 690 (M + Na, 100%). Gef.: C, 64.07; H, 6.01; N, 9.94; C₂₉H₃₈N₂O₇Si, 0.5H₂O ber. C, 63.88; H, 6.25; N, 10.34%.
Beispiel 113
(1R,2R,3R)-2-Benzyloxy-3-benzyloxymethyl-3-hydroxytetrahydrofurfural (206). Eine Lösung von 202/203 (252 mg, 0,707 mmol) in 80%iger Essigsäure (3,8 ml) wurde bei 90°C 2 h lang gerührt, worauf das Lösungsmittel durch Destillation unter reduziertem Druck entfernt wurde. Der Rückstand wurde in Toluol (3 × 10 ml) zusammen eingedampft, um das Produkt 206 in Form eines Öls (242 mg, 100%) zu ergeben.
¹H NMR (CDCl₃): δ 9.66 (1H, d, J 0.8 Hz, H-1), 7.36–7.25 (10H, m, Bn), 4.68 (1H, d, J 11.9 Hz, Bn), 4.60–4.39 (5H, m, Bn, H-2, H-3), 3.98–3.92 (2H, m, H-5), 3.85 (1H, d, J 9.3 Hz, H-5'), 3.52 (1H, d, J 9.2 Hz, H-5'); ¹³C NMR (CDCl₃): δ 203.64 (C-1), 137.39, 137.19, 128.61, 128.54, 128.29, 128.12, 127.87, 127.83 (Bn), 87.17, 87.05 (C-4, C-2), 80.98 (C-3), 75.00, 73.70, 71.86 (Bn, C-5'), 67.84 (C-5); MS FAB: 707 (2 × M + Na, 100%).
Beispiel 114
(1S,3S,4R,7S)-3-Acetoxy-7-benzyloxy-1-benzyloxymethyl-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (207). Zu einer gerührten Lösung von 206 (230 mg, 0,672 mmol) in wasserfreiem Pyridin (2,0 ml) wurde Essigsäureanhydrid (0,18 ml, 1,91 mmol) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 23 h lang bei Raumtemperatur gerührt, Wasser (0,13 ml) wurde zugesetzt, und das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in Toluol (3 × 10 ml) co-eingedampft und durch Chromatographie über Kieselgel mit Dichlormethan:Methanol (99:1) als Elutionsmittel gereinigt, um das Produkt 207 in Form eines klaren Öls (56,7 mg, 23%) zu ergeben;
¹H NMR (CDCl₃): δ 7.38–7.26 (10H, m, Bn), 6.00 (1H, s, H-1), 4.68 (1H, d, J 12.0 Hz, Bn), 4.62 (1H, d, J 12.2 Hz, Bn), 4.60 (1H, d, J 12.4 Hz, Bn), 4.56 (1H, d, J 12.2 Hz, Bn), 4.17 (1H, s, H-2), 4.14 (1H, s, H-3), 4.01 (1H, d, J 7.7 Hz, H-5'), 3.81–3.78 (3H, m, H-5', H-5), 20.06 (3H, s, COCH₃); ¹³C NMR (CDCl₃): δ 169.18 (C=O), 137.92, 137.48, 128.52, 128.45, 128.03, 127.77, 127.73, 127.68 (Bn), 95.95 (C-1), 86.49 (C-4), 78.27, 76.58 (C-3, C-2), 73.65 (Bn), 72.26, 71.96 (Bn, C-5'), 65.49 (C-5), 20.98 (COCH₃); MS FAB: 407 (M + Na, 55%). Gef.: C, 68.80; H, 6.11; C₂₂H₂₄O₆ ber. C, 68.74; H, 6.29%.
Beispiel 115
(1S,3S,4R,7S)-3-(6-N-Benzoyladenin-9-yl)-7-benzyloxy-1-benzyloxymethyl-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (208). Eine Lösung von Furanose 207 (167 mg, 0,434 mmol) und 6-N-Benzoyladenin (194 mg, 0,813 mmol) in wasserfreiem Acetonitril (5,3 ml) wurde BSA (0,43 ml, 1,76 mmol) zugesetzt und bei Raumtemperatur 1 h lang gerührt. Die Lösung wurde auf 0°C gekühlt, und Trimethylsilyltriflat (0,16 ml, 0,86 mmol) wurde zugetropft. Nach 2-stündigem Rühren bei 65°C wurde die Reaktion mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (40 ml) gequencht, und das Gemisch wurde mit Dichlormethan (2 × 50 ml) extrahiert. Der vereinigte Extrakt wurde getrocknet (MgSO₄). Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Chromatographie über Kieselgel mit Dichlormethan:Methanol (98:2) als Elutionsmittel gereinigt, um das Produkt 208 in Form eines Feststoffes (111 mg, 45%) zu ergeben;
¹H NMR (CDCl₃): δ 8.82 (1H, s, H-8), 8.14 (1H, s, H-2), 7.59–7.26 (15H, m, Bz, Bn), 6.74 (1H, s, H-1'), 4.92 (1H, s, H-2'), 4.74–4.39 (4H, m, Bn), 4.42 (1H, s, H-3'), 4.19–4.10 (2H, m, H-5''), 3.92 (1H, d, J 11.8 Hz, H-5'), 3.88 (1H, d, J 11.5 Hz, H-5'); MS FAB: 564 (M + H, 100%).
Beispiel 116
Methyl-2-O-acetyl-3,5-di-O-benzyl-4-C-methansulfonyloxymethyl-D-ribofuranosid (209). Zu einer gerührten Lösung von 201 (687 mg, 1,52 mmol) in wasserfreiem Pyridin (4 ml) bei 0°C wurde Essigsäureanhydrid (0,43 ml, 4,56 mmol) zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt, mit gesättigtem wässrigem Natriumhydrogencarbonat (75 ml) gequencht und mit Dichlormethan (150 + 75 ml) extrahiert. Der vereinigte Extrakt wurde getrocknet (MgSO₄), das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Chromatographie über Kieselgel mit Dichlormethan als Elutionsmittel gereinigt, um das Produkt 209 in Form eines klaren Öls (β:α ≈ 3:1, 750 mg, 100%) zu ergeben; MS FAB: 463 (M-OCH₃, 100%), 517 (M + Na, 28%); Gefunden: C, 58,53; H, 6,16; C₂₄H₃₀O₉S ber. C, 58,29; H, 6,11%.
Methyl-2-O-acetyl-3,5-di-O-benzyl-4-C-methansutfonyloxymethyl-β-D-ribofuranosid (209β).
¹H NMR (CDCl₃): δ 7.36–7.18 (10H, m, Bn), 5.27 (1H, d, J 4.9 Hz, H-2), 4.88 (1H, s, H-1), 4.55–4.44 (6H, m, H-5', Bn), 4.35 (1H, d, J 5.0 Hz, H-3), 3.73 (1H, d, J 9.2 Hz, H-5), 3.38 (1H, d, J 9.3 Hz, H-5), 3.30 (3H, s, OCH₃), 2.95 (3H, s, SO₂CH₃), 2.11 (3H, s, OCCH₃); ¹³C NMR (CDCl₃): δ 169.91 (C=O), 137.83, 137.28, 128.49, 128.44, 127.99, 127.87, 127.77 (Bn), 105.40 (C-1), 82.65, 81.05, 74.55, 73.62, 73.56, 71.86, 70.22 (C-2, C-3, C-4, C-5, C-5', Bn), 55.03 (OCH₃), 37.14 (SO₂CH₃), 20.73 (OCCH₃).
Methyl-2-O-acetyl-3,5-di-O-benzyl-4-C-methansulfonyloxymethyl-α-D-ribofuranosid (209α).
¹H NMR (CDCl₃): δ 7.36–7.18 (10H, m, Bn), 5.09 (1H, d, J 4.5 Hz, H-1), 4.95 (1H, dd, J 4.5, 6.8 Hz, H-2), 4.65–4.44 (6H, m, H-5', Bn), 4.27 (1H, d, J 6.6 Hz, H-3), 3.49 (1H, d, J 9.9 Hz, H-5), 3.46 (3H, s, OCH₃), 3.36 (1H, d, J 9.9 Hz, H-5), 2.92 (3H, s, SO₂CH₃), 2.14 (3H, s, OCCH₃); ¹³C NMR (CDCl₃): δ 170.41 (C=O), 137.59, 137.28, 128.56, 128.51, 128.49, 128.44, 127.98, 127.88 (Bn), 102.35 (C-1), 84.25, 77.53, 74.66, 73.67, 72.12, 70.39, 70.28 (C-2, C-3, C-4, C-5, C-5', Bn), 56.07 (OCH₃), 36.94 (SO₂CH₃), 20.63 (OCCH₃).
Beispiel 117
Phenyl-2-O-acetyl-3,5-di-O-benzyl-4-C-methansulfonyloxymethyl-1-thio-β-D-ribofuranosid (210). Verfahren a. Eine gerührte Lösung von 209 (738 mg, 1,49 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (6,4 ml) wurde Phenylthiotrimethylsilan (2,42 ml, 12,8 mmol) zugesetzt und auf 0°C gekühlt. Trimethylsilyltriflat (0,67 ml, 3,67 mmol) wurde zugetropft, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur 4 h lang gerührt. Die Reaktion wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (100 ml) gequencht und mit Dichlormethan (2 × 200 ml) extrahiert. Der vereinigte Extrakt wurde getrocknet (MgSO₄), und das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde durch Chromatographie über Kieselgel mit Dichlormethan als Elutionsmittel gereinigt, um das Produkt 210 in Form eines klaren Öls (564 mg, 66%) und nicht umgesetztes Ausgangsmaterial (191 mg, 26%) zu ergeben. Verfahren b. Eine gerührte Lösung von 211 (86 mg, 0,165 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (0,49 ml) wurde Phenylthiotrimethylsilan (0,16 ml, 0,825 mmol) zugesetzt und auf 0°C gekühlt. Trimethylsilyltriflat (0,037 ml, 0,206 mmol) wurde zugesetzt, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur 2 h lang gerührt. Die Reaktion wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (15 ml) gequencht, und das resultierende Gemisch wurde mit Dichlormethan (2 × 25 ml) extrahiert. Der vereinigte Extrakt wurde getrocknet (MgSO₄), und das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde durch Chromatographie über Kieselgel mit Dichlormethan als Elutionsmittel gereinigt, um das Produkt 210 in Form eines klaren Öls (75 mg, 79%) zu ergeben;
¹H NMR (CDCl₃): δ 7.47–7.19 (15H, m, Bn, SPh), 5.48 (1H, d, J 3.6 Hz, H-2), 5.34 (1H, dd, J 3.7, 5.2 Hz, H-1), 4.54–4.36 (7H, m, H-3, H-5', Bn), 3.66 (1H, d, J 9.7 Hz, H-5), 3.48 (1H, d, J 9.5 Hz, H-5), 2.89 (3H, s, SO₂CH₃), 2.09 (3H, s, OCCH₃); ¹³C NMR (CDCl₃): δ 169.93 (C=O), 137.69, 137.08, 132.65, 132.45, 129.15, 128.53, 128.52, 128.18, 128.14, 128.08, 127.91, 127.85 (Bn, SPh), 87.99, 84.35, 80.34, 75.33, 74.20, 73.67, 70.83, 69.34 (C-1, C-2, C-3, C-4, C-5, C-5', Bn), 37.27 (SO₂CH₃), 20.68 (OCCH₃); MS FAB: 463 (M-SPh, 100%), 595 (M + Na, 24%); Gef.: C, 61.17; H, 5.55; C₂₉H₃₂O₈S₂ ber. C, 60.82; H, 5.63%.
Beispiel 118
1,2-Di-O-acetyl-3,5-di-O-benzyl-4-C-methansulfonyloxymethyl-D-ribofuranose (211). Eine Lösung von 201 (150 mg; 0,313 mmol) in 80%iger wässriger Essigsäure (1,5 ml) wurde bei 90°C 3 h lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde in Ethanol (3 × 5 ml), Toluol (3 × 5 ml) und Pyridin (2 × 5 ml) co-eingedampft. Der Rückstand wurde in wasserfreiem Pyridin (0,62 ml) aufgelöst, Essigsäureanhydrid (0,47 ml) wurde zugesetzt, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur 16 h lang gerührt. Die Reaktion wurde mit Wasser (50 ml) gequencht, und das resultierende Gemisch wurde mit Dichlormethan (2 × 50 ml) extrahiert. Der vereinigte Extrakt wurde mit einer wässrigen gesättigten Lösung von Natriumhydrogencarbonat (50 ml) gewaschen und getrocknet (MgSO₄). Das Lösungsmittel wurde eingedampft, und der Rückstand wurde mittels Säulenchromatograhpie über Kieselgel mit Dichlormethan als Elutionsmittel gereinigt, um das Produkt 211 in Form eines Öls (99 mg, 60%) zu erhalten;
¹H NMR (CDCl₃): δ 7.39–7.21 (m, Bn), 6.38 (d, J 4.6 Hz, H-1 β), 6.15 (s, H-1 α), 5.35 (d, J 4.9 Hz, H-2 α), 5.17 (dd, J 6.3, 4.9 Hz, H-2 β), 4.69–4.23 (m, H-3, Bn), 3.64 (d, J 9.7 Hz, H-5 α), 3.52 (d, J 10.1 Hz, H-2 β), 3.45 (d, J 9.7 Hz, H-5 α), 3.39 (d, J 9.9 Hz, H-2 β), 2.99 (s, SO₂CH₃ α), 2.96 (s, SO₂CH₃ β), 2.14, 2.13, 2.06, 1.90 (4 × s, COCH₃); ¹³C NMR (CDCl₃): δ 169.68, 169.00 (C=O), 137.68, 137.05, 128.60, 128.55, 128.50, 128.21, 128.12, 128.04, 127.94, 127.82, 127.79 (Bn), 99.35 (C-1 α), 94.24 (C-1 β), 86.36 (C-4 β), 84.28 (C-4 α), 79.15, 77.47, 74.58, 74.06, 73.73, 73.56, 71.67, 70.57, 70.19, 69.84 (Bn, C-2, C-3, C-5, C-5'), 37.61 (SO₂CH₃ β), 37.48 (SO₂CH₃ α), 21.07, 20.74, 20.63, 20.39 (COCH₃); MS FAB: 545 (M + Na, 13%). Gef.: C, 57.70; H, 5.56; C₂₅H₃₀O₁₀S ber. C, 57.46; H, 5.79%.
Beispiel 119
(3R)- und (3S)-(1S,4R,7S)-7-Benzyloxy-1-benzyloxymethyl-3-phenylthio-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (212). Eine Lösung von 210 (553 mg, 0,966 mmol) in mit Ammoniak (35 ml) gesättigtem Methanol wurde bei Raumtemperatur 2 h lang gerührt, worauf das Lösungsmittel durch Destillation unter reduziertem Druck entfernt wurde. Der Rückstand wurde in wasserfreiem DMF (3,5 ml) neuerlich aufgelöst, und die Lösung wurde bei 0°C gerührt. Eine 60%ige Suspension von Natriumhydrid (118 mg, 2,88 mmol) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 12 h lang gerührt. Die Reaktion wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (100 ml) gequencht, und das resultierende Gemisch wurde mit Dichlormethan (2 × 100 ml) extrahiert. Der vereinigte Extrakt wurde getrocknet (MgSO₄), und das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde durch Chromatographie über Kieselgel mit Dichlormethan als Elutionsmittel gereinigt, um das Produkt 212 in Form eines klaren Öls (404 mg, 96%) zu ergeben. MS FAB: 435 (M + H, 35%), 457 (M + Na, 16%); Gefunden: C, 71,76; H, 6,18; C₂₆H₂₆O₄S ber. C, 71,86; H, 6,03%.
(1S,3R,4R,7S)-7-Benzyloxy-1-benzyloxymethyl-3-phenylthio-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (212β).
¹H NMR (CDCl₃): δ 7.46–7.26 (15H, m, Bn, SPh), 5.35 (1H, s, H-1), 4.68–4.56 (4H, m, Bn), 4.31 (1H, s, H-2), 4.10 (1H, s, H-3), 4.09 (1H, d, J 7.3 Hz, H-5'), 3.93 (1H, d, J 7.8 Hz, H-5'), 3.79 (2H, m, H-5); ¹³C NMR (CDCl₃): δ 138.03, 137.45, 133.42, 132.36, 129.19, 128.55, 128.46, 128.05, 127.84, 127.83, 127.76 (Bn, SPh), 89.96 (C-1), 87.18 (C-4), 79.71 (C-2), 79.40 (C-3), 73.64 (Bn), 73.23 (C-5'), 72.30 (Bn), 66.31 (C-5). (1S,3S,4R,7S)-7-Benzyloxy-1-benzyloxymethyl- 3-phenylthio-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (212α).
¹H NMR (CDCl₃): δ 7.52–7.19 (15H, m, Bn, SPh), 5.52 (1H, s, H-1), 4.70–4.50 (4H, m, Bn), 4.41 (1H, s, H-2), 4.18 (1H, d, J 7.8 Hz, H-5'), 4.08 (1H, d, J 8.4 Hz, H-5'), 4.07 (1H, s, H-3), 3.78 (1H, d, J 11.3 Hz, H-5), 3.72 (1H, d, J 11.5 Hz, H-5); ¹³C NMR (CDCl₃): δ 137.89, 137.46, 135.29, 130.93, 129.13, 128.99, 128.57, 128.48, 127.81, 127.76, 127.58, 126.95 (Bn, SPh), 91.87 (C-1), 88.59 (C-4), 80.07, 79.14 (C-2, C-3), 73.65, 73.40, 72.04 (Bn, C-5'), 65.62 (C-5).
Beispiel 120
(3R)- und (3S)-(1S,4R,7S)-7-Benzyloxy-1-benzyloxymethy]-3-(thymin-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (36 + 213). Thymin (175 mg, 1,38 mmol) wurde in Hexamethyldisilazan (6,8 ml) unter Rückfluss gerührt, und Ammoniumsulfat (5 mg) wurde zugesetzt. Nach 16 h Rühren wurde die klare Lösung auf 40°C gekühlt, und das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter reduziertem Druck entfernt. Zu dem Rückstand wurde eine Lösung von 212 (201 mg, 0,463 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (4,6 ml) und 4 Å-Molekularsieb (180 mg) zugesetzt. Nach 10-minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde NBS (107 mg, 0,602 mmol) zugesetzt, und das Gemisch wurde weitere 30 min lang gerührt. Die Reaktion wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumthiosulfat (25 ml) gequencht, und das resultierende Gemisch wurde mit Dichlormethan (2 × 50 ml) extrahiert. Der vereinigte Extrakt wurde getrocknet (MgSO₄) und eingedampft, und der Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie über Kieselgel mit Dichlormethan:Methanol (97:3) als Elutionsmittel gereinigt, um das Produkt 36 + 213 in Form eines anomeren Gemisches (β:α ≈ 1:2) (127 mg, 61%) zu ergeben;
¹H NMR (CDCl₃): δ 7.49 (d, J 0.9 Hz, H-6 β), 7.46 (d, J 1.0 Hz, H-6 α), 7.39–7.25 (m, Bn), 5.94 (s, H-1' α), 5.64 (s, H-1' β), 4.71–4.50 (m, Bn, H-2'), 4.23 (s, H-3' α), 4.16 (d, J 8.6 Hz, H-5'' α), 4.09–3.78 (m, H-5', H-5'', H-3' β), 1.94 (d, J 0.9 Hz, CH₃ α), 1.62 (d, J 1.2 Hz, CH₃ β); MS FAB: 551 (M + H, 96%).
Beispiel 121
(3R)- und (3S)-(1S,4R,7S)-7-Hydroxy-1-hydroxymethyl-3-(thymin-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (37 + 214). Eine Lösung von 36 + 213 (175 mg, 0,39 mmol) in Ethanol (2,7 ml) wurde bei Raumtemperatur gerührt, und 20% Palladiumhydroxid auf Kohlenstoff (50 mg) wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde mehrere Male mit Argon entgast und unter Wasserstoffatmosphäre gestellt. Nach 18 h Rühren wurde das Gemisch mittels Säulenchromatographie über Kieselgel mit Dichlormethan:Methanol (95:5) als Elutionsmittel gereinigt, um ein Gemisch von 37 und 214 (1:1,2) (26 mg, 25%) zu ergeben;
¹H NMR (CD₃OD): δ 7.78 (d, J 1.3 Hz, H-6 α), 7.73 (d, J 1.2 Hz, H-6 β), 5.88 (s, H-1' α), 5.53 (s, H-1' β), 4.38 (s, H-2' α), 4.34 (s, H-3' α), 4.26 (s, H-2' β), 4.08–3.69 (m, H-5', H-5'', H-3' β), 1.92 (d, J 1.2 Hz, CH₃ α), 1.88 (d, J 1.1 Hz, CH₃ β); ¹³C NMR (CD₃OD): δ 138.00 (C-6 α), 136.96 (C-6 β), 110.80 (C-5 β), 110.08 (C-5 α), 92.49, 89.01 (C-4', C-1' α), 90.46, 88.37 (C-4', C-1' β), 80.89, 74.27, 73.34 (C-2', C-3', C-5' α), 80.59, 72.47, 70.39 (C-2', C-3', C-5' β), 59.29 (C-5'' α), 57.61 (C-5'' β), 12.52 (CH₃ α), 12.39 (CH₃ β); MS EI: 270 (M⁺, 100%).
Herstellung von LNA-Phosphoramiditen
Beispiel 122
4-N-Benzoyl-LNA-C [(1R,3R,4R,7S)-3-(4-N-benzoylcytosin-1-yl)-1-(hydroxymethyl)-7-hydroxy-2,5-dioxabicyclo{2.2.1}heptan]. LNA-C (Formel Z) wurde in absolutem Ethanol aufgenommen und unter Rückfluss erhitzt. Zu der unter Rückfluss erhitzten Lösung wurde Benzoesäureanhydrid (2 Äquivalente) zugesetzt, und der Reaktion folgte HPLC (Elutionsmittel: 20% Acetonitril in 0,1 M TEAA, pH 7,0, Durchflussgeschwindigkeit: 1 ml/min, Novapak C-18 analytische Säule). Zusätzliches Anhydrid wurde in Intervallen von 0,5–2 h zugesetzt, bis keine Steigerung des Produkts mehr mittels HPLC beobachtet werden konnte. Das Reaktionsgemisch wurde auf einem Rotavapor konzentriert. Der Rückstand wurde wiederholt mit Ether gewaschen, filtriert und getrocknet, um einen weißen Feststoff zu ergeben. Ausbeute: 45%.
Allgemeines Verfahren zur Dimethoxytritylierung von basengeschützten LNA-Nucleosiden (LNA-C^Bz, LNA-T, LNA-G^iBu, LNA-A^Bz). Basengeschütztes LNA-Nucleosid wurde mit Pyridin (2×) zusammen eingedampft und wurde mit Dimethoxytritylchlorid (1,5 Äquivalente) in Pyridin (≈ 10 ml/g Nucleosid) gerührt. Der Reaktion folgte HPLC (50% Acetonitril in 0,1 M TEAA, pH 7,0, 5 min lang, 50–100% Acetonitril in 10 min und 100% Acetonitril für 5 min, Durchflussgeschwindigkeit: 1 ml/min, Novapak C-18 Säule). Als > 95% des Ausgangsmaterials umgesetzt war, wurde das Reaktionsgemisch in Eis gekühlt. Die Reaktion wurde durch Zusatz von kaltem gesättigtem NaHCO₃ (≈ 15 ml × Vol. von Pyridin) gequencht. Das Gemisch wurde mit Dichlormethan (3 × die Hälfte des Vol. von Natriumbicarbonat) extrahiert. Organische Extraktionen wurden vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und auf einem Rotavapor konzentriert. Der Rückstand wurde in Vakuum getrocknet und durch Kieselgel-Chromatographie unter Verwendung von 0,5%·Pyridin und 0–2% Methanol in Dichlormethan als Elutionsmittel gereinigt. Fraktionen, die reine Produkte enthielten, wurden vereinigt und auf einem Rotavapor konzentriert. Der Rückstand wurde mit wasserfreiem Acetonitril (3×) zusammen eingedampft und in Vakuum getrocknet.
Allgemeines Verfahren für Phosphitylierung von geschützten LNA-Nucleosiden. Basengeschütztes Dimethoxytrityl-LNA-Nucleosid wurde mit wasserfreiem Dichlormethan (2×) zusammen eingedampft und in wasserfreiem Dichlormethan (10 ml/g Nucleosid von A, G & T und ≈ 30 ml/g für C) aufgenommen. Zu diesem wurden Bis(diisopropylamino)(2-cyanoethyl)phosphit (1,05–1,10 Äquivalente) und dann Tetrazol (0,95 Äquivalente) zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt, und auf die Reaktion folgte HPLC (70% Acetonitril in 0,1 M TEAA, pH 7, 2 min, 70–100% Acetonitril in 8 min, und 100% Acetonitril in 5 min, Durchflussgeschwindigkeit: 1 ml/min, Novapak-C-18-Säule). Als die Reaktion zu mehr als > 90% vorangeschritten war und kein weiterer Anstieg der Amiditbildung unter weiterem Rühren beobachtet werden konnte, wurde das Gemisch in Eis gekühlt. Es wurde mit Dichlormethan (≈ 15- bis 20-mal das Originalvolumen) verdünnt und mit kaltem gesättigtem Natriumbicarbonat (2×) und anschließend mit kalter Salzlauge (1×) gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und am Rotavapor konzentriert. Der Rückstand wurde mit wasserfreiem Acetonitril (3×) zusammen eingedampft und in Vakuum über Nacht getrocknet. HPLC-Reinheit lag im Bereich von 93–98%.
Herstellung von LNA-Nucleosid-5'-Triphosphaten
Beispiel 123
Synthese von LNA-Nucleosid-5'-Triphosphaten. (Tetrahedron Letters 29, 4525 (1988)). In einem 13 × 100-mm-Polypropylenröhrchen wurden die Nucleoside 37, 44, 51, 4-N-benzoyliertes 57A oder 61B (93,8 μmol) in 1 ml Pyridin (getrocknet über CaH₂) suspendiert. Die Lösung wurde in einer Speedvac unter hohem Vakuum bis zur Trockenen eingedampft. Der Rückstand wurde zweimal in Acetonitril (getrocknet über CaH₂) resuspendiert und bis zur Trockenen eingedampft. Das Nucleosid wurde in 313 μl Trimethylphosphat (getrocknet über 4 Å-Molekularsiebe) suspendiert, zu dem 30,1 mg Proton Sponge^TM (1,5 Äquivalente) zugesetzt wurden. Das Gemisch wurde versiegelt, verwirbelt und auf 0°C gekühlt. POCl₃ (9,8 μl, 1,1 Äquivalente) wurde während des Verwirbelns zugesetzt. Die Reaktion wurde bei 0°C 2,5 h lang laufen gelassen. Während dieses Intervalls wurden 469 μmol Natriumpyrophosphat (5 Äquivalente) in 5 ml Wasser aufgelöst und durch 5 ml Dow-50-H⁺-Ionenaustauschharz durchgeführt. Sobald das ablaufende Medium sauer wurde, wurde es in 220 μl Tributylamin gesammelt und zu einem Sirup eingedampft. Das TBA-Pyrophosphat wurde dreimal zusammen mit trockenem Acetonitril eingedampft. Schließlich wurde das trockene Pyrophosphat in 1,3 ml DMF (4 Å-Siebe) aufgelöst. Nach 2,5 h Reaktionsdauer wurden das TBA-Pyrophosphat und 130 μl Tributylamin der Nucleosidlösung unter heftigem Verwirbeln zugesetzt. Nach 1 min wurde die Reaktion durch Zusatz von 3 ml 0,1 M Triethylammoniumacetat, pH 7,5, gequencht. Ein Test durch Mono-Q-Chromatographie zeigte 49% Nucleosid-5'-Triphosphat. Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser auf 100 ml verdünnt und auf eine Q-Sepharose-Ionenaustauschsäule adsorbiert, mit Wasser gewaschen und mit einem linearen Gradienten von 0 bis 700 mM NaCl in 5 mM Natriumphosphat, pH 7,5, eluiert. Triphosphat-hältige Fraktionen wurden durch Mono-Q-Ionenaustausch- Chromatographie getestet. Triphosphat-hältige Fraktionen wurden gesammelt und bis zum Punkt von NaCl-Sättigung konzentriert. Das Produkt wurde an einer C₁₈-Kartusche entsalzt. Das Triphosphat wurde durch UV-Spektroskopie quantifiziert und auf 10 mM Lösung eingestellt. Die Ausbeute lag im Bereich von 17–44%. Mittels dieses Verfahrens hergestellte LNA-Nucleoside waren U, T, A, G und C.
Herstellung von LNA-modifizierten Oligonucleotiden
Beispiel 124
Synthese von Oligonucleotiden, die LNAs der Formel V, X, Y und Z^T, Z^U, Z^G, Z^C, Z^A, Z^Mec enthalten. Die bizyklischen Nucleosid-3'-O-Phosphoramidit-Analoga 8, 19, 30, 39, 46, 53, 57D, 61D und 66 sowie im Handel erhältliche 3'-O-Phosphoramidite wurden verwendet, um Beispiel-LNA-Oligonucleotide der Erfindung (in der Größenordnung von 0,2 bis 5 μmol) zu synthetisieren, die eines oder mehrere der LNAs vom Typ V, X, Y und Z^T, Z^U, Z^G, Z^C, Z^A und Z^Mec enthielten. Die Reinheit und Zusammensetzung der synthetisierten LNA-Oligonucleotide wurden durch Kapillargelelektrophorese und/oder HPLC und/oder MALDI-MS überprüft. Im Allgemeinen wurde zufrieden stellende Bindungswirksamkeit bei allen diesen Monomeren erreicht. Die beste Bindungswirksamkeit (~95–100%) wurde für die LNAs 39, 46, 53, 57D, 61D und 66 (die zu LNA-Monomeren der Formel Z führen) erreicht, die äußerst zufrieden stellende Resultate ergeben, wenn gänzlich modifizierte LNA-Oligonucleotide synthetisiert werden oder wenn LNAs in sonst nicht modifizierte DNA- oder RNA-Stränge oder LNAs in ein reines Thiophosphat-Oligonucleotid eingebunden werden. LNA-Oligonucleotide wurden in reinem Wasser aufgelöst, und die Konzentration wurde als OD₂₆₀ bestimmt. Die Löslichkeit war in allen Fällen ausgezeichnet. Bei einfacher DNA/RNA-Synthese und bei teilweise modifizierten LNA-Oligomeren wurde ein Standard-CPG-Träger oder ein Polystyrol-Träger verwendet. Bei der Synthese von vollständig modifizierten LNA-Oligomeren (z.B. 5'-d(GTGATATGC)-3') wurde ein BioGenex Universial CPG-Träger (BioGenex, USA) verwendet, oder es wurden LNA-derivatisierte Träger verwendet.
Beispiele 125
Synthese von Thiophosphat-LNA-Oligonucleotiden. Das reine Thiophosphat-LNA (Tabelle 7) wurde an einem automatisierten DNA-Synthesegerät unter Verwendung von ähnlichen Bedingungen wie zuvor beschrieben (Beispiel 124) synthetisiert. Beaucage-Reagens wurde als Sulfidierungsmittel eingesetzt. Die Ausbeute des schrittweisen Bindens belief sich auf > 98%. Nach Abschluss der Synthesen erfolgten Entschützung und Abspaltung vom festen Träger unter Verwendung von konzentriertem Ammoniak (55°C, 14 h).
Beispiel 126
Synthese von 2'-Thio-LNA-Oligonucleotiden. Die 2'-Thio-LNA-Oligonucleotide (die das Monomer U^S (Formel Z (Thio-Variante) aus 2), 37, Tabelle 8, enthielten) wurden an einem automatisierten·DNA-Synthesegerät unter Verwendung von Standardbedingungen (Beispiel 124) synthetisiert. Die Ausbeute des schrittweisen Bindens für Amidit 76F betrug etwa 85% (12 min Bindungen; es wird angenommen, dass verbesserte Reinheit von Amidit 76F in einer höheren Bindungsausbeute resultiert). Nach Abschluss der Synthesen erfolgten Entschützung und Spaltung vom festen Träger unter Verwendung von konzentriertem Ammoniak (55°C, 8 h).
Beispiel 127
Synthese von 2'-Amino-LNA-Oligonucleotiden. Mittels Verfahren, die jenen aus Beispiel 126 ähnlich sind, wurden 2'-Amino-LNA-Oligonucleotide (die Monomer T^NH und Monomer T^NMe (Formel Z (Amino-Varianten) aus 2), 35 und 36, enthielten) wirksam an einem automatisierten DNA-Synthesegerät unter Verwendung der Amidite 74A und 74F effizient hergestellt (≥ 98% Ausbeute bei schrittweisem Binden).
Beispiel 128
Fluorescein-Markierung von LNA-Oligomeren. LNA-Oligomere (Formel Z aus 2) AL16 (5'-d(TGTGTGAAATTGTTAT)-3'; LNA-Nucleotide fettgedruckt) und AL17 (5'-d(ATAAAGTGTAAAG)-3'; LNA-Nucleotide fettgedruckt) wurden erfolgreich mit Fluorescein unter Verwendung des "FluoroAmp T4 Kinase Green Oligonucleotide Labeling System", wie vom Hersteller (Promega) beschrieben, markiert. Kurz zusammengefasst wurden 16 nmol entweder von LNA-Oligomer AL16 oder AL17 mit 5'-Thiophosphat in einem 50-μl-Reaktionspuffer markiert, der T4-Kinase und γ-S-ATP enthielt. Die Reaktionen wurden 2 h lang bei 37°C inkubiert. Die thiophosphorylierten LNA-Oligos wurden durch den Zusatz von 5 μl Oligonucleotid-Fällungsmittel (Promega) und 165 μl eiskaltem (–20°C) 95%igem Ethanol gefällt. Nach dem Zentrifugieren wurden die Pellets einmal mit 500 μl eiskaltem (–20°C) 70%igem Ethanol gewaschen und in 25 μl PBSE-Puffer neuerlich aufgelöst. Frisch hergestellte 5-Maleinimidfluorescein-Lösung (50 μg in 5 μl DMSO) wurde den thiophosphorylierten LNA-Oligos zugesetzt, und die Reaktionsgemische wurden bei 68°C 30 min lang inkubiert. Zusätzliches 5-Maleinimidfluorescein (50 μg in 5 μl DMSO) wurde an jedes LNA-Oligo angebunden, und die Reaktionsgemische wurden zusätzliche 60 min lang inkubiert. Nach Inkubation wurden 10 μl Oligonucleotid-Fällungsmittel zu jedem Reaktionsgemisch zugesetzt, gefolgt von 180 μl eiskaltem (–20°C) und 100 μl N,N-Dimethylformamid. Die Fluorescein-markierten LNA-Oligos wurden durch Zentrifugation isoliert, woraufhin das Absaugen des Überstands folgte. Die Fluorescein-markierten LNA-Oligomere wurden durch Umkehrphasen-HPLC wie folgt gereinigt: Säule Delta-Pack C-18, 300A, 0,4 × 30 cm; Elutionsmittel 0–50% Acetonitril in 0,04 M Triethylammoniumpuffer (pH 7,0); Durchflussgeschwindigkeit 1,5 ml/min. Die LNA-Oligos enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und unter reduziertem Druck (Ölpumpe und Speedvac-System) im Laufe von 12 h eingedampft.
Hybridisierungsdaten
Beispiel 129
Thermostabilität von Oligonucleotiden, die Monomere der Formel V, X, Y und Z^T, Z^U, Z^G, Z^C, Z^A und Z^MeC enthalten. Die Thermostabilität der LNA-modifizierten Oligonucleotide wurde spektralphotometrisch unter Verwendung eines Spektralphotometers, ausgestattet mit einem wärmeregulierten Peltier-Element, bestimmt. Hybridisierungsgemische von 1 ml wurden hergestellt, die einen der 3 verschiedenen Puffer (10 mM Na₂HPO₄, pH 7,0, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA; 10 mM Na₂HPO₄, pH 7,0, 0,1 mM EDTA; 3 M Tetrametylammoniumchlorid (TMAC), 10 mM Na₂HPO₄, pH 7,0, 0,1 mM EDTA) und äquimolare (1 μM oder 1,5 μM) Mengen der unterschiedlichen, LNA-modifizierten Oligonucleotide und deren komplementären oder fehlgepaarten DNA- oder RNA-Oligonucleotide enthielten. Identische Hybridisierungsgemische wurden unter Verwendung der nicht modifizierten Oligonucleotide als Vergleichsbeispiele hergestellt. Die T_m's wurden als die erste Ableitung der Schmelzkurven erhalten. Die Tabellen 1 bis 4 fassen die Resultate zusammen (LNAs sind durch Fettdruck markiert). 2 veranschaulicht die verwendeten monomeren LNAs. Die Nomenklatur V, X, Y und Z^T, Z^U, Z^G, Z^C, Z^A, Z^MeC bezieht sich auf die Strukturen V, X, Y und Z aus 2. In den Tabellen sind die Nucleobasen der LNA-Monomere angegeben. Weiters lautet die für die Thio- und Amino-Varianten der LNA-Struktur Z der letzten zwei Tabellen verwendete Nomenklatur z.B. Z^TS bzw. Z^TNH.
LNAs, die Struktur Z enthalten, wurden besonders sorgfältig untersucht (siehe Tabelle 1). Waren drei Z^T-Reste in ein Oligonucleotid von gemischter Sequenz eingebunden, so waren die T_m's, die in NaCl-Puffer sowohl mit komplementärer DNA- (10) als auch RNA- (16) Oligonucleotiden erhalten wurden, wesentlich höher (RNA: rund 7°C und DNA: rund 5°C pro Modifikation) als die T_m der entsprechenden Duplices mit nicht modifizierten Oligonucleotiden (1 und 8). Ähnliche Resultate wurden für LNAs erhalten, die zwei Z^T-Reste und einen von Z^G- (21 und 24B) oder Z^U- (25), Z^C- (69), Z^MeC- (65) und Z^A- (58) Resten enthielten. Wurden Fehlpaarungen in die Target-RNA- oder -DNA-Oligonucleotide eingeführt, so fiel die T_m der LNA-modifizierten Oligonucleotide in allen Fällen signifikant (11–15A und 17; 18–20 und 22–24A; 26–31; 57 und 59–60; 63–64 und 66 sowie 67), was ganz eindeutig zeigt, dass die LNA-modifizierten Oligonucleotide an ihre Target-Sequenzen hybridisieren und somit den Watson-Crick-Wasserstoffbindungs-Regeln folgen. In allen Fällen war der Abfall der T_m der LNA-modifizierten Oligonucleotide bei der Einführung von Fehlpaarungen gleich oder höher als jener der T_m der entsprechenden nicht modifizierten Oligonucleotide (2–7 und 9; 33–38), was zeigt, dass die LNA-modifizierten Oligonucleotide zumindest so spezifisch sind wie ihre natürlichen Gegenstücke. Ein Herabsetzen der Ionenstärke des Hybridisierungspuffers (von 10 mM Na₂HPO₄, pH 7,0, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA auf 10 mM Na₂HPO₄, pH 7,0, 0,1 mM EDTA) senkt die T_m der LNA-modifizierten Oligonucleotide für ihre komplementären DNA-Oligos (40, 41) oder RNA-Oligonucleotide (40A, 41A). Eine ähnliche Wirkung ist bei den nicht modifizierten Oligonucleotiden und ihrem komplementären DNA-Oligo (39) oder RNA-Oligo (39A) zu beobachten.
Der Zusatz von 3 M Tetramethylammoniumchlorid (TMAC) zum Hybridisierungspuffer erhöht die T_m der LNA-modifizierten Oligonucleotide für ihre komplementären DNA-Oligos (10, 21, 25) signifikant. Darüber hinaus gleicht TMAC die Unterschiede bezüglich der T_m's der verschiedenen Oligonucleotide aus, die im NaCl-Puffer beobachtet werden (niedrigste T_m im NaCl-Puffer 44°C und höchste T_m 49°C gegenüber 56°C und 57°C bei TMAC). Das Einführen von Fehlpaarungen senkt die T_m der LNA-modifizierten Oligonucleotide für deren DNA-Targets (11–13, 18–20 und 26–28) wesentlich. Ein ähnliches Bild ergibt sich für die nicht modifizierten Vergleichs-Oligonucleotide (1–4 und 32–35).
Die Daten mit dem niedrigen Salzpuffer zeigen, dass LNA-modifizierte Oligonucleotide eine Empfindlichkeit gegenüber der Ionenstärke des Hybridisierungspuffers aufweisen, die jener von normalen Oligonucleotiden ähnlich ist. Von den T_m-Daten mit dem TMAC-Puffer leiten die Erfinder ab, dass TMAC eine T_m-ausgleichende Wirkung auf LNA-modifizierte Oligonucleotide aufweist, die jener Wirkung ähnlich ist, die bei normalen DNA-Oligonucleotiden beobachtet wird. LNA- modifizierte Oligonucleotide behalten ihre ausgezeichnete Spezifität in beiden Hybridisierungspuffern bei.
Das vollständig modifizierte LNA-Oligonucleotid, das alle vier Monomere enthält (71 und 75), das beinahe vollständig modifizierte LNA-Oligonucleotid (mit Ausnahme eines 3'-terminalen DNA-Nucleosids), das sowohl Z^G als auch Z^T enthält (41 und 41A), und das teilweise modifizierte Oligonucleotid, das einen zentralen Block von Z^T und Z^G enthält (40 und 40A), weisen im Vergleich zum nicht modifizierten Kontroll-Oligonucleotid (39 und 39A; 1 und 8) auch wesentlich gesteigerte Affinität auf. Dies zeigt, dass LNAs der Formel Z sehr nützlich zur Herstellung von sowohl vollständig als auch teilweise modifizierten Oligomeren sind. Die Erfinder merken an, dass das beinahe vollständig modifizierte Oligomer (41 und 41A) eine einzigartig hohe Affinität sowohl für komplementäre RNA (> 93°C) als auch DNA (83°C) aufweist. Eine ähnliche extreme Affinität (sowohl für RNA als auch für DNA) wurde beim beinahe vollständig modifizierten LNA-Oligomer, das ausschließlich Z^T enthielt (Tabelle 1: 52 und 53), und beim vollständig modifizierten LNA-Oligomer (71 und 75) beobachtet. Die Affinität des teilweise modifizierten Poly-T-Oligonucleotids hing von den Positionen und der Anzahl von eingebundenen Z^T-Monomeren (44–51) ab. Während die T_m's der RNA-Targets (45, 47, 49 und 51) in allen Fällen höher waren als die der entsprechenden nicht modifizierten Oligonucleotide (43), wurde eine niedrigere T_m mit dem DNA-Target (46) verzeichnet. Da das Mischsequenz-Oligonucleotid, das 3 Z^T-Reste enthielt, eine wesentlich gesteigerte Affinität für sein DNA- (10) und RNA-Target (16) im Vergleich zu den nicht modifizierten Vergleichs-Oligonucleotiden (1 und 8) aufwies, lässt dies darauf schließen, dass andere Bindungsmotive als Watson-Crick (wie beispielsweise das Hoogsteen-Bindungsmotiv) für Poly-T-Oligonucleotide möglich sind und dass diese Bindungsmotive gewissermaßen von der präzisen Architektur des modifizierten Oligonucleotids beeinflusst werden. In allen Fällen resultierte die Einführung von einzelnen Basenfehlpaarungen in den Komplex zwischen dem vollständig Z^T-modifizierten Poly-T-Oligonucleotid und einem DNA-Target (54–56) in einem signifikanten Abfall der T_m.
Oligonucleotide, die LNAs mit einer der Strukturen V (Tabelle 2), X (Tabelle 3) und Y (Tabelle 4) aufwiesen, wurden im Zusammenhang mit vollständig und teilweise modifizierten Poly-T-Sequenzen analysiert. Die vollständig modifizierten Oligonucleotide von Struktur V und Y zeigten einen Anstieg der T_m (wobei diese dennoch sehr viel niedriger als jene der Z^T-modifizierten Oligonucleotide war) sowohl mit RNA- (Tabelle 2, 14, und Tabelle 4, 14) als auch mit DNA-Targets (Tabelle 2, 13, und Tabelle 4, 13) im Vergleich zu den nicht modifizierten Oligonucleotiden (Tabelle 1, 42 und 43). Die teilweise modifizierten Oligonucleotide, die Monomere der Struktur V und Y enthielten, verhielten sich ähnlich wie teilweise modifizierte Oligonucleotide, die Z^T enthielten, wobei dies möglicherweise auf die Homopolymer-Beschaffenheit der zuvor beschriebenen Sequenz zurückzuführen ist. Oligonucleotide, die X^T enthielten, wiesen in allen Fällen eine stark reduzierte T_m im Vergleich zu den Vergleichs-DNA-Oligonucleotiden auf.
Beispiel 130
Ein vollständig modifiziertes LNA-Oligonucleotid bildet stabile Hybride mit komplementärer DNA sowohl in anti-paralleler als auch in paralleler Ausrichtung. Ein vollständig modifiziertes LNA-Oligonucleotid wurde an seine komplementäre DNA sowohl in anti-paralleler als auch in paralleler Ausrichtung hybridisiert. Hybridisierungslösungen (1 ml) enthielten 10 mM Na₂HPO₄ (pH 7), 100 mM NaCl und 0,1 mM EDTA und 1 μM von beiden der zwei Oligonucleotide. Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, produzierte sowohl die anti-parallele (71) als auch die parallele Bindungsausrichtung (77) stabile Duplices. Die anti-parallele Ausrichtung ist hierbei eindeutig die stabilere von den zweien. Dennoch ist sogar der parallele Duplex signifikant stabiler als der entsprechende anti-parallele Duplex der nicht modifizierten DNA-Oligonucleotide (Tabelle 1, 1).
Beispiel 131
LNA-Monomere können verwendet werden, um die Affinität von RNA-Oligomeren für ihre komplementären Nucleinsäuren zu steigern. Die Thermostabilität von Komplexen zwischen einem 9-mer-RNA-Oligonucleotid, das 3 LNA-T-Monomere (Z^T) enthält, und den komplementären DNA- oder RNA-Oligonucleotiden wurden spektralphotometrisch gemessen. Hybridisierungslösungen (1 ml) enthielten 10 mM Na₂HPO₄, pH 7,0, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA und 1 μM von jedem der zwei Oligonucleotide. Identische Hybridisierungsgemische unter Verwendung der nicht modifizierten RNA-Oligonucleotide wurden als Vergleichsbeispiele gemessen. Wie in Tabelle 5 gezeigt wird, hybridisiert das LNA-modifizierte RNA-Oligonucleotid sowohl an sein komplementäres DNA- (1) als auch RNA- (3) Oligonucleotid. Wie zuvor für LNA-modifizierte DNA-Oligonucleotide beobachtet, ist die Bindungsaffinität des LNA-modifizierten RNA-Oligonucleotids zum RNA-Komplement (3) am stärksten. In beiden Fällen ist die Affinität des LNA-modifizierten RNA-Oligonucleotids wesentlich höher als jene der nicht modifizierten Kontrollen (2 und 4). Tabelle 5 zeigt auch, dass die Spezifität gegenüber DNA- und RNA-Targets in LNA-modifizierten RNA-Oligonucleotiden beibehalten wird.
Beispiel 132
LNA-LNA-Basenpaarung. RNA- oder DNA-Oligonucleotide, die drei Z^T-LNA-Monomere enthalten, oder ein Oligonucleotid, das ausschließlich aus LNA-Z-Monomeren besteht, wurden an komplementäre nicht modifizierte DNA-Oligonucleotide oder DNA-Oligonucleotide, die drei Z^A-LNA-Monomere enthielten, hybridisiert, und die T_m der Hybride wurden spektralphotometrisch gemessen. Hybridisierungslösungen (1 ml) enthielten 10 mM Na₂HPO₄, pH 7,0, 100 mM NaCl und 0,1 mM EDTA und 1 μM von beiden der zwei Oligonucleotide. Wie in Tabelle 6 gezeigt hybridisieren alle der LNA-modifizierten Oligonucleotide an die komplementären, nicht modifizierten DNA-Oligonucleotide (2 und 3) sowie die komplementären, LNA-modifizierten Oligonucleotide (4, 5 und 6). Wie zuvor beobachtet wurde, erhöht die Gegenwart von LNA-Monomeren in einem Strang eines Hybrids (2 und 3) die T_m im Vergleich zum nicht modifizierten Kontroll-Hybrid (1) signifikant. Die Gegenwart von LNA-LNA-Basenpaaren im Hybrid erhöht die T_m sogar noch stärker (4 und 5). Darüber hinaus kann ein hochstabiles Hybrid zwischen einem vollständig modifizierten LNA-Oligonucleotid und einem teilweise LNA-Z^A- modifizierten DNA-Oligonucleotid (6) gebildet werden. Dies stellt das erste Beispiel für LNA-LNA-Basenpaare in einem Hybrid dar.
Beispiel 133
Ein reines LNA-Monothiophosphat-Oligonucleotid weist relativ geringere gesenkte Thermostabilität gegenüber komplementärer DNA und RNA auf als das entsprechende reine Thiophosphat-DNA-Oligonucleotid. Die Thermostabilität eines reinen Monothiophosphat-DNA-Oligonucleotids, das drei Z^T-LNA-Monomere (LNA-Oligonucleotid) enthält, und des entsprechenden reinen Monothiophosphat-Vergleichs-DNA-Oligonucleotids gegenüber komplementärer DNA und RNA wurde unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 132 beschrieben bewertet, jedoch ohne EDTA (Tabelle 7). Es wurde beobachtet, dass das reine LNA-Monothiophosphat-Oligonucleotid, das drei LNA-Z^T-Monomere enthielt, im Vergleich zum entsprechenden Vergleichs-LNA-Oligonucleotid (Tabelle 1, 10 und 16) nur einen geringfügigen Abfall der Thermostabilität aufwies (Tabelle 7, 3 und 4). Das entsprechende reine Monothiophosphat-DNA-Oligonucleotid (Tabelle 7, 1 und 2) wies im Vergleich zum entsprechenden Vergleichs-DNA-Oligonucleotid (Tabelle 1, 1 und 8) signifikant erniedrigte Thermostabilität auf. Dies hat wichtige mögliche Auswirkungen auf die Verwendung von reinen oder teilweise reinen Monothiophosphat-LNA-Oligonucleotiden in Antisense-Anwendungen und anderen therapeutischen Verwendungen. Somit wurde die Kompatibilität von LNA-Monomeren und nicht modifizierten Monomeren in einem Monothiophosphat-Oligonucleotid bewiesen. Daraus kann geschlossen werden, dass solche Konstrukte zusätzlich zu den durch LNA verstärkten Hybridisierungseigenschaften sowohl Rnase-N-Aktivität als auch Nuclease-Resistenz aufweisen.
Beispiel 134
2'-Thio-LNA zeigt Nucleinsäure-Erkennungseigenschaften, die mit jenen von LNA (Monomer Z) vergleichbar sind. Die Hybridisierungsbedingungen waren wie in Beispiel 132 beschrieben, jedoch ohne EDTA. Die Ergebnisse für die 2'-Thio-LNAs (Tabelle 8) zeigen eindeutig eine positive Wirkung auf die Wärmestabilität von Duplices gegenüber DNA und RNA durch das Einführen von 2'-Thio-LNA-Monomer U^S (Die Monomere entsprechen Formel Z aus 2, worin die Methylenoxybrücke durch eine Methylenthiobrücke ersetzt wurde). Diese Wirkung (ΔT_m ~ +5°C/Modifikation gegenüber DNA; ΔT_m ~ +8°C/Modifikation gegenüber RNA) ist vergleichbar mit jener, die für das Ausgangs-LNA beobachtet wurde. Das Bild verkompliziert sich durch das gleichzeitige Einführen von zwei Modifikationen (der 2'-Thio-Funktionalität und von Uracil anstelle von Thymin). Da jedoch auch schon davor gleiche Schmelztemperaturen für die LNA-Thymin- und -Uracil-Monomere beobachtet wurden und da von den Vergleichsbeispielen, die 2'-Desoxyuridin anstelle von Thymidin, sofern überhaupt eines, enthielten, angenommen werden würde, dass sie niedrigere T_m-Werte aufwiesen, ist der Vergleich relevant.
Beispiel 135
2'-Amino-LNA (Monomer Z^TNH und 2'-Methylamino-LNA (Monomer Z^TNMe) zeigen Nucleinsäure-Erkennungseigenschaften, die mit jenen von einem Ausgangs-LNA (Monomer Z) vergleichbar sind. Die Hybridisierungsbedingungen waren wie in Beispiel 132 beschrieben, jedoch ohne EDTA. Die Schmelzergebnisse für die 2'-Amino-LNAs (Tabelle 9) weisen eindeutig auf eine positive Wirkung auf die Wärmestabilität von Duplices gegenüber DNA und RNA durch das Einführen von 2'-Amino-LNA-Monomeren T^NH oder T^NMe hin (die Monomere entsprechen Formel Z aus 2, worin die Methylenoxybrücke durch eine Methylenaminobrücke bzw. Methylen-(N-methyl)aminobrücke ersetzt wurde). Diese Wirkung (ΔT_m ~ +3°C/Modifikation gegenüber DNA; und ΔT_m ~ +6°C bis +8°C/Modifikation gegenüber RNA) ist vergleichbar mit jener, die für das Ausgangs-LNA beobachtet wurde. Es gilt anzumerken, dass die gesteigerte Wärmeaffinität auch bei einem Oligo zu beobachten ist, das aus einem Gemisch aus 2'-Alkylamino-LNA-Monomeren und nicht alkylierten 2'-Amino-LNA-Monomeren zusammengesetzt ist.
LNA und LNA-modifizierte Oligonucleotide als Substrate für Enzyme
Beispiel 136
3'-Exonucleolytische Stabilität von Oligomeren 5'-V^T ₁₃T und 5'-Z^T ₁₃T. Eine Lösung von Oligonucleotiden (0,2 OD) in 2 ml des folgenden Puffers (0,1 M Tris-HCl, pH 8,6, 0,1 M NaCl, 14 mM MgCl₂) wurde bei 25°C mit 1,2 U SVPDE (Schlangengift-Phosphodiesterase) verdaut. Während des Verdaus wurde ein Anstieg des Absorptionsvermögens bei 260 nm beobachtet. Die nicht modifizierte Kontrolle T₁₄ hingegen war nach 10 min Verdau vollständig abgebaut, 5-Z^T ₁₃T und 5'-V^T ₁₃T verblieben 60 min lang intakt.
Beispiel 137
LNA-modifizierte Oligos als Substrate für T4-Polynucleotidkinase. 20 pmol von jedem Primer (FP2: 5'-GGTGGTTTGTTTG-3'; DNA-Sonde), (AL2: 5'-GGTGGTTTGTTTG-3', LNA-Nucleoside fettgedruckt) und (AL3: 5'-GGTGGTTTGTTTG-3', LNA-Nucleoside fettgedruckt) wurden mit T4-Polynucleotidkinase (5 Einheiten; New England Biolabs) und 6 μl γ-³²P-ATP (3.000 Ci/mmol, Amersham) in einem Puffer, der 70 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl₂, 5 mM Dithiotretiol (Endvolumen 20 μl) enthielt, vermischt. Die Proben wurden 40 min lang bei 37°C inkubiert und danach 5 min lang auf 65°C erhitzt. Zu jeder der Reaktionen wurden 2 μl tRNA (1 μg/μl), 29 μl 3 M Ammoniumacetat und 100 μl Ethanol zugesetzt. Die Reaktionen wurden bei –20°C 30 min lang inkubiert, und die markierten Oligos wurden durch 30-minütige Zentrifugation bei 15.000 g ausgefällt. Das Pellet wurde in 20 μl H₂O resuspendiert. Die Proben (1 μl) wurden mit einem Ladepuffer (Formamid (pH 8,0), 0,1% Xylolcyanol FF, 0,1% Bromphenolblau und 10 mM EDTA) vermischt und auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel (16% Acrylamid/Bisacrylamid-Lösung, 7 M Harnstoff, 1 × TBE und 0,1 mM EDTA) in einem TBE-Laufpuffer (90 mM Tris-HCl (pH 8,3), 90 mM Borsäure und 2,5 mM Dinatrium-EDTA-2-H₂O) Elektrophorese unterzogen. Das Gel wurde an einem Geltrockner (BioRad Modell 583) getrocknet, und im Laufe von 20 min wurde davon ein Autoradiogramm auf einem Röntgenfilm (CL-XPosure-Film, Pierce 34075) gemacht.
Das Ergebnis ist in 6 gezeigt (FP2: Bahn 1 und 2; AL2: Bahn 3 und 4; AL3: Bahn 5 und 6). Drei Schlüsse können auf der Grundlage dieses Versuchs gezogen werden. Erstens kann geschlossen werden, dass teilweise und vollständig LNA-modifizierte Oligos ausgezeichnete Mimetika von natürlicher Nucleinsäure bezüglich ihrer Fähigkeit sind, als Substrat für eine Nucleinsäure-spezifische, Enzym-artige Polynucleotidkinase zu wirken. Zweitens kann geschlossen werden, dass LNA-modifizierte Oligos durch Verfahren, die normalerweise verwendet werden, um herkömmliche Nucleinsäuren zu fällen, wirksam gefällt werden können. Tatsache ist, dass die relativen Signalintensitäten der nicht modifizierten (Bahn 1, 2), teilweise modifizierten (Bahn 3, 4) und vollständig modifizierten (Bahn 5, 6) Oligos im Autoradiogramm darauf schließen lassen, dass, je mehr LNA-Nucleoside ein herkömmliches DNA-Oligo enthält, es umso effizienter durch Salz/Alkohol-Verfahren ausgefällt werden kann. Drittens zeigen die ähnlichen Positionen der Signale im Autoradiogramm der nicht modifizierten, teilweise und vollständig modifizierten Oligos, dass das Einbinden von LNA-Nucleosiden in ein DNA-Oligo seine Elektrophorese-Mobilität in Polyacrylamidgelen nicht verändert.
Beispiel 138
3'-End-Markieren von LNA-hältigen Oligonucleotiden mit terminaler Desoxynucleotidyltransferase. Oligonucleotide, die LNA-Monomere enthalten, wurden unter Verwendung des Enzyms terminale Desoxynucleotidyltransferase am 3'-Ende markiert. Die Sequenz und das Ausmaß der LNA-Modifikation waren wie folgt (worin LNA-Monomere fettgedruckt sind):

Kontrolle 5' GGT GGT TTG TTT G 3'

(1) 5' GGT GGT TTG TTT G 3'

(2) 5' GGT GGT TTG TTT G 3'

(3) 5' GGT GGT TTG TTT G 3'
Oligonucleotid (50 pmol) wurde mit 250 μCi [α-³²P]ddATP (3.000 Ci/mmol) und 100 Einheiten terminaler Desoxynucleotidyltransferase in 250 μl 100 mM Kakodylatpuffer pH 7,2, 2 mM CoCl₂ und 0,2 mM 2-Mercaptoethanol bei 37°C 2 Stunden lang inkubiert. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von Formamid-Ladepuffer und 5-minütiges Erhitzen auf 100°C gestoppt, bevor sie auf Eis gegeben wurde. Proben (0,2 pmol) wurden auf einem 19%igen Acrylamidgel, das 7 M Harnstoff enthielt, laufen gelassen, und der Prozentsatz an Einbindung von Radioaktivität in die Oligonucleotid-Banden wurde mittels eines Phosphorimagers (Molecular Dynamics) quantifiziert. Die Ergebnisse zeigen Einbindung von Radioaktivität in allen Fällen, einschließlich des Oligonucleotids mit einem hohen LNA-Gehalt: Kontrolle 94,9%, (1) 39,7%, (2) 83,7%, (3) 31,7%. Die Erfinder schließen daraus, dass LNA-modifizierte Oligos Substrate für das TdT-Enzym sind.
Beispiel 139
Die Fähigkeit von terminaler Desoxynucleotidyltransferase (TdT), LNA-modifizierte Oligonucleotide mit einem Schwanz zu versehen, hängt von der Architektur des Oligomers ab. Die folgenden 15-mer-Primer und ein Gemisch aus 8 bis 32 Basen-Oligonucleotidmarkern wurden mit [γ³³P]-ATP und T4-Polynucleotidkinase am 5'-Ende markiert (worin LNA-Monomere fettgedruckt sind):

P1 5'-TGC ATG TGC TGG AGA-3'

P2 5'-GC ATG TGC TGG AGA T-3'

PZ1 5'-TGC ATG TGC TGG AGA-3'

PZ2 5'-GC ATG TGC TGG AGA T-3'
Die Reaktionsgemische wurden 5 min lang nach dem Markieren gesiedet, um jegliche PNK-Aktivität zu entfernen. 4 pmol von jedem markierten Primer, 25 Einheiten von terminaler Desoxynucleotidyltransferase und 16 μM dATP wurden in 25 μl 100 mM Kakodylatpuffer, pH 7,2, 2 mM CoCl₂ und 0,2 mM 2-Mercaptoethanol 90 min lang bei 37°C inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von Formamid-Stopplösung gestoppt, und die Reaktionsprodukte wurden auf einem 19%igen Polyacrylamid-7M-Harnstoffgel mit den markierten Markern laufen gelassen. Autoradiographie erfolgte unter Verwendung von Biomax-Film auf dem trockenen Gel. Wie in 22 gezeigt, ergaben P1 (Bahn 2), P2 (Bahn 4) und PZ1 (Bahn 3) alle einen Schwanz, der auf Grundlage der 8–32 Basenmarker (Bahnen 1 und 6) auf mehr als 70 Basen Länge geschätzt wurde. Primer PZ2 (Bahn 5) wurde unter diesen Reaktionsbedingungen nicht verlängert. Die Erfinder schließen daraus, dass das TdT-Enzym LNA-Monomere innerhalb des Oligonucleotids, jedoch nicht am äußersten 3'-Ende tolerieren.
Beispiel 140
LNA-Thymidin-5'-triphosphat (LNA-TTP) als ein Substrat für terminale Desoxynucleotidyltransferase (TdT). Um die Fähigkeit des Triphosphates von LNA-TTP (Beispiel 123), von terminaler Desoxynucleotidyltransferase als Substrat angenommen zu werden, zu testen, wurde eine Reaktion zum Versehen eines Oligonucleotides mit einem Schwanz durchgeführt. Ein 15-mer-Primer (Sequenz: 5'-TGC ATG TGC TGG AGA-3') und ein Gemisch aus 8- bis 32-Basen-Oligonucleotidmarker wurde mit [γ³³P]-ATP und T4-Polynucleotidkinase am 5'-Ende markiert. Die Reaktionsgemische wurden nach dem Markieren 5 min lang gesiedet, um jegliche PNK-Aktivität zu entfernen. 4 pmol des markierten Primers, 25 Einheiten von terminaler Desoxynucleotidyltransferase und 32, 64 oder 128 μM dTTP oder LNA-TTP wurden in 25 μl 100 mM Kakodylatpuffer, pH 7,2, 2 mM CoCl₂ und 0,2 mM 2-Mercaptoethanol 90 min lang bei 37°C inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von Formamid-Stopplösung gestoppt, und die Reaktionsprodukte wurden auf 19%igem Polyacrylamid-7M-Harnstoffgel mit den markierten Markern laufen gelassen. Autoradiographie unter Verwendung von Biomax-Film wurde auf dem trockenen Gel durchgeführt. Wie in 10 gezeigt produzierten Reaktionen mit entweder 32 μM dTTP (Bahn B), 64 μM dTTP (Bahn C) oder 128 μM dTTP (Bahn D) alle Oligonucleotide mit Schwanz, die auf Grundlage von 8–32-Oligonucleotidmarkern (in den äußersten linken und rechten Bahnen ersichtlich) auf mehr als 100 Nucleotide in ihrer Länge geschätzt wurden. Die LNA-TTP-Reaktionen (32 μM dTTP (Bahn E), 64 μM dTTP (Bahn F) oder 128 μM dTTP (Bahn G)) resultierten alle darin, dass der Primer durch eine Base verlängert wurde, und in ~50% der Fälle wurde er durch noch eine weitere Base verlängert. Dieses Ergebnis ist jenem sehr ähnlich, das für Ribonucleotide und TdT erhalten wurde. Die Erfinder schließen daraus, dass LNA-abgeleitete Triphosphate durch das TdT-Enzym erkannt und in ein DNA- OligonuCleotid eingebunden werden können. Diese letzte Erkenntnis, dass sich LNA-TTP an die Polymerase binden kann, unterstreicht die Möglichkeit, LNA-Monomer-Derivate erfolgreich als Nucleosid-Wirkstoffe einzusetzen.
Beispiel 141

Exonuclease-freie Klenow-Fragment-DNA-Polymerase I kann LNA-Adenosin-, -Cytosin-, -Guanosin- und -Uridin-5'-Triphosphate (LNA ATP, LNA CTP, LNA GTP, LNA UTP) in einen DNA-Strang einbinden. Ein Primer-Extensionstest wurde verwendet, um die LNA-NTP's (siehe Beispiel 123), Ribonucleotide, als Substrate für Exonuclease-freie Klenow-Fragment-DNA-Polymerase I (EFK) zu bewerten. Der Test verwendete einen ³³P-5'-End-markierten 15-mer-Primer, der an eine der vier verschiedenen 24-mer-Matrizen hybridisiert war. Die Sequenzen des Primers und der Matrizen sind (LNA-Monomer fettgedruckt):

Primer	5' TGCATGTGCTGGAGA 3'
Matrize 1	3' ACGTACACGACCTCTACCTTGCTA 5'
Matrize 2	3' ACGTACACGACCTCTCTTGATCAG 5'
Matrize 3	3' ACGTACACGACCTCTTGGCTAGTC 5'
Matrize 4	3' ACGTACACGACCTCTGAACTAGTC 5'

1 pmol ³³P-markierter Primer wurde an 2 pmol Matrize in ×2 Klenow-Puffer hybridisiert. Zu dem wurde entweder 4 μM dNTPαS oder 500 μM LNA NTP oder ein Gemisch aus 4 μM dNTPαS und 500 μM LNA NTP zugesetzt. Zwei Einheiten von EFK-DNA-Polymerase wurden zu jeder Reaktion zugesetzt. 2 mU anorganische Pyrophosphatase wurden zu jeder der Reaktionen zugesetzt. Primer plus Matrize plus Enzym-Kontrollen wurden auch durchgeführt. Alle Reaktionen erfolgten in einem Gesamtvolumen von 20 μl. Die Reaktionen wurden bei 37°C 3 min lang inkubiert. Die Reaktionen wurden dann durch die Zugabe von 10 μl Formamid-EDTA-Stopplösung gestoppt. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem 19%igen Polyacrylamid-7M-Harnstoffgel getrennt, und die Produktfragmente wurden durch Vergleich mit einem ³³P-markierten 8–32-Basen-Oligonucleotid-Maßstab nach Belichten des Kodak-Biomax-Autoradiogrammfilms der Größe nach bestimmt.
20 zeigt das Ergebnis mit LNA-UTP unter Verwendung von Matrize 1. Die Bahnen (1–12) sind den folgenden Reaktionen zuzuordnen: Einbindung von LNA-UTP durch EFK. Bahn 1 – Primer, Matrize und Enzym. Bahn 2 – plus dTTPαS. Bahn 3 – plus LNA UTP. Bahn 4 – plus dTTPαS. Bahn 5 – plus LNA UTP und dGTPαS. Bahn 6 – plus dATPαS, dGTPαS und dTTPαS. Bahn 7 – plus LNA UTP, dCTPαS, dGTPαS und dTTPαS. Bahn 8 – plus dGTPαS. Bahn 9 – plus dCTPαS, dGTPαS und dTTPαS. Bahn 10 – plus LNA UTP, dATPαS, dCTPαS und dGTPαS. Bahn 11 – plus dATPαS, dCTPαS und dGTPαS. Bahn 12 – alle 4 dNTPαS. Die Bahnen an beiden Seiten zeigen die 8–32-Basen-Oligonucleotidmarker, die für die Größeneinstufung der Produkte verwendet wurden.
Wie aus 20 hervorgeht, ist LNA UTP spezifisch als ein "T" eingebunden. Weitere Extension von einem LNA-UTP-abgeschlossenen 3'-Ende mit dNTPαS tritt sehr langsam auf.
21 zeigt das Ergebnis mit LNA-ATP, LNA-CTP und LNA-GTP unter Verwendung von Matrize 2–4. Die Bahnen (1–21) sind den folgenden Reaktionen zuzuordnen: Bahnen 1, 7, 13 und 17 – Primer, Matrize und Enzym. Bahn 2 – plus dGTPαS. Bahn 3 – plus dATPαS und dGTPαS. Bahn 4 – plus LNA GTP. Bahn 5 – plus dGTPαS und LNA ATP. Bahn 6 – plus LNA ATP und LNA GTP. Bahn 8 – plus dATPαS. Bahn 9 – plus dATPαS und dCTPαS. Bahn 10 – plus LNA ATP. Bahn 11 – plus dCTPαS und LNA ATP. Bahn 12 – plus dATPαS und LNA CTP. Bahn 14 – plus dTTPαS. Bahn 15 – plus dGTPαS und dTTPαS. Bahn 16 – plus dTTPαS und LNA GTP. Bahn 18 – plus dCTPαS. Bahn 19 – plus dCTPαS und dTTPαS. Bahn 20 – plus LNA CTP. Bahn 21 – dTTPαS und LNA CTP. Die Bahnen an beiden Seiten zeigen die 8–32-Basen-Oligonucleotidmarker, die für die Größeneinstufung der Produkte verwendet wurden.
Die Versuche, bei denen Matrize 2 eingesetzt wurde (Bahnen 1–6), zeigen, dass LNA GTP in der Lage ist, das +1-Produkt mit wirksamer Extension des Primers zu produzieren (Bahn 4). Das Hinzufügen von dGTPαS und LNA ATP resultiert hauptsächlich im +2-Produkt (Bahn 5). Dies rührt von der Einbindung von dGTPαS her, um das +1-Produkt zu ergeben, woraufhin Extension mit LNA ATP erfolgt. Es gibt Hinweise auf eine geringe Menge an +3-Produkt von der darauf folgenden Einbindung von LNA ATP. Die Versuche unter Verwendung von Matrize 3 (Bahnen 7–12) zeigen, dass LNA ATP wirksam eingebunden wird, um das +1-Produkt zu ergeben (Bahn 10). Extension dieses Produkts mit dCTPαS erfolgt langsam (Bahn 11). Das Hinzufügen von dATPαS und LNA CTP resultiert in den +2- und +3-Produkten (Bahn 12). Die Abwesenheit von signifikantem +1-Produkt zeigt, dass das Hinzufügen des ersten LNA CTP effizient ist, dass jedoch das Hinzufügen des zweiten LNA CTP langsam ist. Die Ergebnisse aus den Versuchen mit Matrizen 1 (Bahnen 13–16) und 4 (Bahnen 17–21) zeigen ähnliche Tendenzen wie jene mit den anderen Matrizen. LNA CTP wird wirksam eingebunden, um das +1-Produkt auf Matrize 4 zu bilden (Bahn 20). Extension dieses Produkts durch dTTPαS erfolgt wiederum langsam (Bahn 21). Das Hinzufügen von LNA GTP und dTTPαS zu den Reaktionen auf Matrize 1 resultiert im +2-Produkt (Bahn 16). Wiederum zeigt dies, dass das Hinzufügen eines einzelnen LNA-Triphosphats relativ effizient ist, jedoch der Zusatz von darauf folgenden LNA-Triphosphaten eher langsam ist.
Beispiel 142
LNA-Monomere können verwendet werden, um die Resistenz eines Oligonucleotids gegen Verdau durch Exonuclease III zu stärken. Um die Resistenz der LNA-hältigen Oligonucleotide gegen Verdau durch Exonuclease III zu testen, wurde die folgende Reaktion durchgeführt. Die folgenden 15-mer-Primer und 8–32-Basen-Oligonucleotidmarker wurden mit [γ³³P]-ATP und T4-Polynucleotidkinase 5'-End-markiert (LNA-Monomer fettgedruckt):

P2 5'-GC ATG TGC TGG AGA T-3'

PZ2 5'-GC ATG TGC TGG AGA T-3'
Die Reaktionsgemische wurden nach dem Markieren 5 min lang gesiedet, um jegliche PNK-Aktivität zu entfernen. 8 pmol von jedem Primer wurden an 25 pmol Matrize (Sequenz: 3' ACG TAC ACG ACC TCT ACC TTG CTA-5') in ×2 Klenow-Puffer hybridisiert. 10 Einheiten von Exonuclease III wurden zu jeder der Reaktionen zugesetzt. Auch wurden Kontrollen durchgeführt, die 1 μl Wasser anstelle des Enzyms zugesetzt bekamen. Die Reaktionen wurden bei 37°C 5 min lang inkubiert. Die Reaktionen wurden durch den Zusatz von 10 μl Formamid/EDTA-Stopplösung gestoppt. Die Reaktionen wurden bei 95°C 3 min lang erhitzt, bevor sie auf ein 19%iges Polyacrylamid-7M-Harnstoffgel geladen wurden. Das Gel wurde in 10% Essigsäure/10% Methanol fixiert, bevor es auf 3MM-Papier übertragen und dort getrocknet wurde. Das getrocknete Gel wurde 3 h lang einem Phosphor-Screen ausgesetzt. Der Phosphor-Screen wurde am Storm-860-Instrument von Molecular Dynamics unter Verwendung der Image-Quant-Software analysiert. Die Phosphor-Screen-Analyse zeigte, dass in Abwesenheit des Enzyms die Bande von Volllängen-P2 99% des Signals und die Bande von Volllängen-PZ2 96% des Signals darstellte. In Gegenwart des Enzyms waren nur 20% des Volllängen-P2-Produkts nach 5 min Inkubation übrig. Es verblieben jedoch nach derselben Behandlung 62% des Volllängen-PZ2-Produkts. Dies zeigt, dass ein einzelnes LNA-Monomer am 3'-Ende eines Oligonucleotids die Resistenz gegen Verdau durch Exonuclease III stärken kann.
PCR-Anwendungen
Beispiel 143
LNA-Monomere können verwendet werden, um die Leistung von biotinylierten DNA-Oligos beim sequenzspezifischen Einfangen von PCR-Amplikonen in einem MTP-Format signifikant zu steigern. Zwei DIG-markierte Amplikone von pUC19 wurden durch PCR-Amplifikation wie folgt gebildet:
PCR-Reaktionsgemisch für Amplikon 1

1 μl pUC19 (1 ng/μl),
1 μl Rückwärts-Primer (5'-AACAGCTATGACCATG-3') (20 μM),
1 μl Vorwärts-Primer (5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3') (20 μM),
10 μl dUTP-Mischung (2 mM dATP, 2 mM dCTP, 2 mM dGTP und 6 mM dUTP),
1,5 μl DIG-11-dUTP (1 mM)
10 μl 10 × Taq-Puffer (Boehringer Mannheim inkl. MgCl₂)
1 μl Taq-Polymerase (Boehringer Mannheim) 5 U/μl
H₂O auf 100 μl

PCR-Reaktionsgemisch für Amplikon 2

1 μl pUC19 (1 ng/μl),
0,4 μl Primer 3 (5'-GATAGGTGCCTCACTGAT-3') (50 μM),
0,4 μl Primer 4 (5'-GTCGTTCGCTCCAAGCTG-3') (50 μM),
10 μl dUTP-Mischung (2 mM dATP, 2 mM dCTP, 2 mM dGTP und 6 mM dUTP),
1,5 μl DIG-11-dUTP (1 mM)
10 μl 10 × Taq-Puffer (Boehringer Mannheim inkl. MgCl₂)
1 μl Taq-Polymerase (Boehringer Mannheim) 5 U/μl
H₂O auf 100 μl

PCR-Reaktion: (Zyklierer: Perkin Elmer 9600) 94°C 5 min; Zusatz von Polymerase; 94°C 1 min, 45°C 1 min, 70°C 2 min (29 Zyklen) 72°C 10 min.
10 μl von jeder PCR-Reaktion wurde auf einem Standard-Agarosegel analysiert, und die erwarteten Fragmente von etwa 100 bp und 500 bp wurden beobachtet. 10 μl von DIG-markiertem Amplikon 1 oder Amplikon 2 wurden mit 5 pmol von 5'-biotinylierter Einfangsonde in 1 × SSC (0,15 M NaCl, 15 mM Citrat, pH 7,0) in einem Gesamtvolumen von 450 μl vermischt. Die folgenden Einfangsonden wurden verwendet: B-DNA1 (Biotin-ATGCCTGCAGGTCGAC-3'; DNA-Sonde spezifisch für Amplikon 1), B-DNA2 (Biotin-GGTGGTTTGTTTG-3'; DNA-Sonde spezifisch für Amplikon 2) und B-LNA2 (Biotin-GGTGGTTTGTTTG-3', LNA-Nucleoside in Fettdruck; LNA-Sonde spezifisch für Amplikon 2). Die Reaktionen wurden 5 min lang auf 95°C erhitzt, um Amplikone zu denaturieren, und wurden auf 25°C 15 min lang abkühlen gelassen, um Hybridisierung zwischen der Sonde und dem Target-Amplikonstrang zu erleichtern. Nach Hybridisierung wurden 190 μl von jeder Reaktion auf eine Streptavidin-beschichtete Mikroplatte (Pierce, Kat.-Nr. 15124) übertragen und eine Stunde lang bei 37°C inkubiert. Nach Waschen der Platte mit phosphatgepufferte Salzlösung (PBST, 0,15 M Na⁺, pH 7,2, 0,05% Tween 20, 3 × 300 μl) wurden 200 μl Peroxidase-markierter Anti-DIG-Antikörper zugesetzt (Boehringer Mannheim, verdünnt 1:1000 in PBST). Die Platten wurden 30 min lang bei 37°C inkubiert und gewaschen (PEST, 3 × 300 μl). Die Wells wurden durch Zusatz von 100 μl Substratlösung (0,1 M Citrat-Phosphat-Puffer pH 5,0, 0,66 mg/ml o-Phenylendiamindihydrochlorid, 0,012% H₂O₂) auf Peroxidaseaktivität getestet. Die Reaktion wurde nach 8 min durch Zusatz von 100 μl H₂SO₄ (0,5 M) gestoppt, und die Absorption bei 492 nm wurde in einem Mikroplattenleser abgelesen. Wie in 3 gezeigt verhielten sich die nicht modifizierten Bio-DNA-Einfangsonden (B-DNA1 und B-DNA2) beide wie erwartet, d.h. sie fangen beide nur das Target-PCR-Amplikon ein. Verglichen mit der B-DNA1-Sonde ist die B-DNA2-Sonde eher ineffizient beim Einfangen seines zugehörigen Amplikons. Die Einfangeftizienz der B-DNA2-Sonde kann jedoch durch Substituieren von 12 der 13 DNA-Nucleoside durch die entsprechenden LNA-Nucleoside drastisch verbessert werden. Wie in 3 gezeigt wird, führt die Verwendung der B-LNA2-Sonde anstelle der B-DNA2-Sonde zu einem Anstieg der. Empfindlichkeit des Tests um mehr als das Zehnfache. Zugleich behält das B-LNA2 die Fähigkeit des nicht modifizierten B-DNA2 bei, zwischen dem zugehörigen und dem nicht zugehörigen Amplikon wirksam zu unterscheiden, was die ausgezeichnete Spezifität von LNA-Oligos unterstreicht. Die Erfinder schließen daraus, dass 1) Biotin, das kovalent an ein LNA-modifiziertes Oligo gebunden ist, seine Fähigkeit beibehält, sich an Streptavidin zu binden, dass 2) LNA-modifizierte Oligos in einem MTP-basierten Amplikon-Einfangtest wirksam arbeiten und dass 3) LNA ein Mittel zur drastischen Verbesserung der Leistung herkömmlicher DNA-Oligos beim Affinitäts-Einfangen von PCR-Amplikonen bietet.
Beispiel 144
Ein LNA-substituiertes Oligo ist in der Lage, sein zugehöriges PCR-Amplikon durch Stranginvasion einzufangen. Zwei identische Sets an 10 μl Reaktionen von Amplikon 1 oder 2 (hergestellt wie in Beispiel 143) wurden entweder mit 1, 5 oder 25 pmol der B-LNA2-Einfangsonde (Biotin-GGTGGTTTGTTTG-3', LNA-Nucleoside fettgedruckt; Sonde spezifisch für Amplikon 2) in 1 × SSC (0,15 M NaCl, 15 mM Citrat, pH 7,0) in einem Gesamtvolumen von 450 μl vermischt. Ein Set an Reaktionen wurde 5 min lang auf 95°C erhitzt, um Amplikone zu denaturieren, und wurde auf 25°C gekühlt, um Hybridisierung zwischen der Sonde und dem Target-Amplikonstrang zu erleichtern. Das andere Set an Reaktionen wurde ohne Denaturierung belassen. Aus jeder der Reaktionen wurden 190 μl auf eine mit Streptavidin beschichtete Mikroplatte (Pierce, Kat.-Nr. 15124) übertragen und 1 h lang bei 37°C inkubiert. Nach Waschen der Platte mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBST, 0,15 M Na⁺, pH 7,2, 0,05% Tween 20, 3 × 300 μl) wurden 200 μl Peroxidase-markierte Anti-DIG-Antikörper zugesetzt (Boehringer Mannheim, verdünnt 1:1000 in PBST). Die Platten wurden 30 min lang bei 37°C inkubiert und gewaschen (PBST, 3 × 300 μl). Die Wells wurden durch Zusatz von 100 μl Substratlösung (0,1 M Citrat-Phosphat-Puffer pH 5,0, 0,66 mg/ml o-Phenylendiamindihydrochlorid, 0,012% H₂O₂) auf Peroxidaseaktivität getestet. Die Reaktion wurde nach 10 min durch Zusatz von 100 μl H₂SO₄ (0,5 M) gestoppt, und die Absorption bei 492 nm wurde in einem Mikroplattenleser abgelesen. Wurden die Amplikone vor der Hybridisierung mit der Einfangsonde denaturiert (4A), so konnten die Erfinder ein effizientes und sequenzspezifisches Amplikoneinfangen beobachten, das jenem aus Beispiel 143 ähnlich war. Das Steigern der Konzentration des B-LNA2 von 1 auf 5 pmol führt zu einer Steigerung der Einfangeffizienz. Eine weitere Steigerung auf 25 pmol der Sonde resultiert in einem rückläufigen Signal. Diese Beobachtung stimmt mit der Sättigung der zur Verfügung stehenden Biotin-Bindungsstellen am Streptavidin-MTP überein. Wurden Amplikone vor der Hybridisierung mit der Einfangsonde nicht denaturiert (4B), so konnten die Erfinder auch ein effizientes und sequenzspezifisches Amplikoneinfangen beobachten. Tatsächlich zeigen die Daten, dass Amplikoneinfangen ohne Denaturierung gleich effizient und spezifisch erfolgt wie Amplikoneinfangen mit Denaturierung. Dies weist ganz stark darauf hin, dass die Bio-LNA2-Sonde in der Lage ist, sich an seine Targetsequenz durch Stranginvasion zu binden. Dem Wissen der Erfinder zufolge stellt dies das allererste Beispiel für sequenzspezifisches Targeting von dsDNA unter physiologischen Salzbedingungen durch eine gemischte Purin/Pyrimidin-Sonde dar. Neben diesem Potential, einen weiten Bereich der Grundlagenforschung und zahlreiche DNA-Diagnoseverfahren zu vereinfachen, kann diese unerwartete Eigenschaft von LNA-modifizierten Oligos von enormer Bedeutung für die Entwicklung wirksamer neuer Arzneimittel durch den Antisense-Ansatz, insbesondere durch den Anti-Gen-Ansatz, sein.
Beispiel 145
Ein LNA-substituiertes Oligo, immobilisiert an einer festen Oberfläche, funktioniert effizient beim sequenzspezifischen Einfangen eines PCR-Amplikons. Wells einer Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatte (Boehringer Mannheim) wurden 1 h lang entweder mit 5 pmol der B-DNA2-Sonde (Biotin-GGTGGTTTGTTTG-3; DNA-Sonde spezifisch für Amplikon 2) oder der B-LNA2-Sonde (Biotin-GGTGGTTTGTTTG-3', LNA-Nucleoside fettgedruckt; LNA-Sonde spezifisch für Amplikon 2) in einem Gesamtvolumen von 100 μl 1 × SCC (0,15 M NaCl, 15 mM Citrat, pH 7,0) inkubiert. Insgesamt wurden vier Wells mit der B-DNA2-Sonde, vier Wells mit der B-LNA2-Sonde und vier Wells mit Puffer alleine inkubiert. Nach Inkubation wurden die Wells dreimal mit 1 × SSC gewaschen. DIG-markiertes Amplikon1 (60 μl) oder Amplikon2 (60 μl) (hergestellt in Beispiel 143) wurde mit 540 μl von 1 × SSC vermischt, durch Hitze bei 95°C 5 min lang denaturiert und (100 μl) zu den Mikroplattenwells übertragen. Zwei der Wells, die entweder B-DNA2, B-LNA2 oder keine Einfangsonde enthielten, erhielten Amplikon1, und zwei der Wells, die B-DNA2, B-LNA2 oder keine Einfangsonde enthielten, erhielten Amplikon2. Nach 1 Stunde bei 37°C wurde die Platte dreimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBST, 0,15 M Na⁺, pH 7,2, 0,05% Tween 20, 3 × 300 μl) gewaschen, und 200 μl von Peroxidase-markierten Anti-DIG-Antikörpern wurden zugesetzt (Boehringer Mannheim, verdünnt 1:1000 in PBST). Die Platten wurden 30 min lang bei 37°C inkubiert und dreimal mit 300 μl PBST gewaschen. Die Wells wurden durch Zusatz von 100 μl Substratlösung (0,1 M Citrat-Phosphat-Puffer pH 5,0, 0,66 mg/ml o-Phenylendiamindihydrochlorid, 0,012% H₂O₂) auf Peroxidaseaktivität getestet. Die Reaktion wurde nach 6 min durch Zusatz von 100 μl H₂SO₄ (0,5 M) gestoppt, und die Absorption bei 492 nm wurde in einem Mikroplattenleser abgelesen. Wie in 5 gezeigt fängt die LNA-modifizierte Einfangsonde (B-LNA2) ihr spezifisches Amplikon (Amplikon2) sehr effizient und signifikant besser (eine ca. fünffache Steigerung der Empfindlichkeit) ein als die entsprechende, nicht modifizierte DNA-Einfangsonde (B-DNA2). Kein Signal wurde erhalten, wenn die B-LNA2-Sonde mit dem nicht zugehörigen Amplikon (Amplikon1) inkubiert wurde, was die ausgezeichnete Spezifität der B-LNA2-Sonde unterstreicht. Die Erfinder schließen daraus, dass LNA-modifizierte Oligos wirksam beim sequenzspezifischen Einfangen von PCR-Amplikonen funktionieren, wenn sie an einer festen Oberfläche immobilisiert sind. Sie schließen daraus weiter, dass die Verwendung von LNA-modifizierten Oligos anstelle herkömmlicher DNA-Oligos für ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis sorgt. Somit stellt LNA ein Mittel zur signifikanten Verbesserung der Leistung gängiger DNA-basierter Tests zur Verfügung, die immobilisierte Einfangsonden verwenden, wie beispielsweise das Anordnungsformat, in dem zahlreiche immobilisierte Sonden verwendet werden, um das Auftreten mehrerer verschiedener Target-Sequenzen in einer Probe gleichzeitig nachzuweisen.
Beispiel 146
Vollständig vermischte LNA-Monomere können verwendet werden, um die Leistung von immobilisierten biotinylierten DNA-Oligos beim sequenzspezifischen Einfangen von PCR-Amplikonen in einem MTP-Format signifikant zu steigern. Drei DIG-markierte Amplikone von Nras-Sequenz (Verw.: Nucleic Acid Research, Bd. 13, Nr. 14, 52–55 (1985)) wurden durch PCR-Amplifikation wie folgt gebildet:
PCR-Primer:

Vorwärts-Primer: 5'-CCAGCTCTCAGTAGTTTAGTACA-3' Basen 701–723 gemäß dem NAR-Verweis.
910-bp-Rückwärts-Primer: 5'-GTAGAGCTTTCTGGTATGACACA-3' Basen 1612–1590 (Rückwärts-Sequenz gemäß NAR-Verw.).
600-bp-Rückwärts-Primer: 5'-TAAGTCACAGACGTATCTCAGAC-3' Basen 1331–1308 (Rückwärts-Sequenz gemäß NAR-Verw.).
200-bp-Rückwärts-Primer: 5'-CTCTGTTTCAGACATGAACTGCT-3' Basen 909–886 (Rückwärts-Sequenz gemäß NAR-Verw.).

PCR-Reaktionsgemisch für Nras-Amplikone: 2,3 μl menschliche genomische Placenta-DNA (440 ng/μl), 50 μl 10 × PCR-Puffer (ohne MgCl₂ Perkin Elmer), 30 μl 25 mM MgCl₂, 50 μl dNTP-Mischung (2 mM dATP, dCTP, dGTP und 1,8 mM dTTP), 10 μl 1 mM Dig-11-dUTP, 10 μl 25 μM Vorwärtsprimer, 10 μl 25 μM Rückwärts-Primer, 5 μl 5 U/μl AmpliTaq Gold (Perkin Elmer) und Wasser auf 500 μl. PCR-Reaktion: Das obige Gemisch wurde für alle Nras-PCR-Produkte hergestellt. Der einzige Unterschied lag im Rückwärts-Primer 910 bp, 600 bp oder 200 bp, der einmal zugesetzt wurde. Die PCR-Gemische wurden auf zehn PCR-Röhrchen aliquot aufgeteilt und in einem Perkin Elmer 9600 unter den folgenden Bedingungen zykliert: 95°C 3 min; 55°C 2 min, 72°C 3 min, 95°C 1 min (30. Zyklen); 55°C 2 min, 72°C 10 min und 4°C Einweichen. 10 μl von jeder PCR-Reaktion wurde auf einem Standard-Agarosegel analysiert, und die erwarteten Fragmente von etwa 910 bp, 600 bp und 200 bp wurden beobachtet. Testbedingungen: Wells einer Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatte (Boehringer Mannheim; Bindungskapazität von 20 pmol Biotin pro Well) wurden 1 h lang in 5 × SSCT (0,75 M NaCl, 75 mM Citrat, pH 7,0, 0,1% Tween 20) bei 37°C entweder mit 1 pmol DNA-Nras-Cap A (Biotin-5'-TTCCACAGCACAA-3'), LNA/DNA-Nras-Cap A (Biotin-5'-TTCCACAGCACAA-3'), LNA-Nras-Cap A (Biotin-5'-TTCCACAGCACAA-3'), DNA-Nras-Cap B (Biotin-5'-AGAGCCGATAACA-3'), LNA/DNA-Nras-Cap B (Biotin-5'-AGAGCCGATAACA-3') oder LNA-Nras-Cap B (Biotin-5'-AGAGCCGATAACA-3') inkubiert; LNA-Nucleoside sind fettgedruckt. Die Nras-Cap-A-Einfangsonden fangen Amplikone Nras 910, Nras 600 und Nras 200 ein. Nras-Cap-B-Einfangsonden fangen spezifische Amplikone Nras 910 und Nras 600 ein. Nach Inkubation mit den unterschiedlichen Einfangsonden wurden die Wells in 5 × SSCT gewaschen, und 5 μl native oder denaturierte (95°C 5 min und 10 min auf Eis) DIG-markierte Amplikone (Nras 910, Nras 600 oder Nras 200) in 95 μl 1 × SSCT (0,15 M NaCl, 15 mM Citrat, pH 7,0, 0,1% Tween 20) wurden pro Well zugesetzt und 1 h lang bei 37°C inkubiert. Die Wells wurden dreimal in phosphatgepufferter Salzlösung (1 × PBST, 0,15 M Na⁺, pH 7,2, 0,05% Tween 20) gewaschen und 30 min lang bei 37°C mit 200 μl Peroxidase-markierten Anti-DIG-Antikörpern (Boehringer Mannheim, verdünnt 1:1000 in 1 × PBST) inkubiert. Schließlich wurden die Wells dreimal in 1 × PBST gewaschen und auf Peroxidaseaktivität durch Zusatz von 100 μl Substratlösung (0,1 M Citrat- Phosphat-Puffer, pH 5,0, 0,66 mg/ml o-Phenylendiamindihydrochlorid, 0,012% H₂O₂) getestet, die Reaktion wurde nach 9 min durch Zusatz von 100 μl 0,5 M H₂SO₄ gestoppt und vierfach in H₂SO₄ verdünnt, bevor die Absorption bei 492 nm in einem Mikrotiterplattenleser abgelesen wurde. Wie in 23A gezeigt wird, fangen Einfangsonden, die mit 12 LNA-Nucleosiden (LNA Nras Cap A und LNA Cap B) versehen sind, die spezifischen Amplikone ohne vorangehende Denaturierung (native Amplikone) sehr effizient ein. Einfangsonden, die mit 4 LNA-Nucleosiden (LNA/DNA Nras Cap A und LNA/DNA Nras Cap B) versehen sind, fangen dieselben Amplikone mit einer geringeren Effizienz ein, und die DNA-Einfangsonden (DNA Nras Cap A und DNA Nras Cap B) fangen die spezifischen Amplikone gar nicht ein. Das Kontrollamplikon, Nras 200, wird nicht durch die LNA-Cap-B- oder die LNA/DNA-Nras-Cap-B-Sonden eingefangen, was auf die ausgezeichnete Spezifität der mit LNA versehenen Einfangsonden hinweist. 23B zeigt denselben Versuch, der mit denaturierten Amplikonen durchgeführt wurde. Im Wesentlichen tritt dasselbe Bild zu Tage, mit dem grundlegenden Unterschied jedoch, dass die Einfangeffizienz im Allgemeinen höher liegt. Die Erfinder schließen daraus, dass LNA-modifizierte Oligos, die gemischte LNA-Nucleoside (A-, T-, G- oder C-LNA-Nucleoside) enthalten, in sequenzspezifischem Einfangen von PCR-Amplikonen effizient funktionieren, wenn sie an einer festen Oberfläche immobilisiert sind. Sie schließen weiters daraus, dass LNA ein Mittel zum Aufbau von Einfangsonden bietet, das beim Amplikoneinfangen ohne vorangehende Denaturierung, d.h. beim Einfangen durch Strangersetzung, wirksam funktioniert. Diese Fähigkeit ermöglicht beträchtliches Vereinfachen von gängigen Amplikon-Detektionsformaten, die auf DNA basieren.
Beispiel 147
LNA-modifizierte Oligos funktionieren als Primer für Nucleinsäurepolymerasen. Die Fähigkeit eines LNA-modifizierten Oligos (5'-GGTGGTTTGTTTG-3', LNA-Nucleoside fettgedruckt), als Primer bei Matrizen-gelenkter enzymatischer Verlängerung zu dienen, wurde mit 3 unterschiedlichen Klassen an Polymerasen untersucht: Einer Umkehrtranskriptase M-MuLV (Boehringer Mannheim), die sowohl RNA als auch DNA als Matrize verwenden kann, der Klenow-Polymerase, die für Standard-DNA-Polymerasen repräsentativ ist, und eine thermostabile Polymerase, BM-TAQ (Boehringer Mannheim). Als Kontrolle wurden Extensionsreaktionen unter Verwendung des identischen, nicht modifizierten DNA-Primers (5'-GGTGGTTTGTTTG-3') durchgeführt. Die LNA- und DNA-Primer wurden mit ³²P-γ-ATP wie zuvor in Beispiel 137 beschrieben markiert. Ein 50-mer-DNA-Oligo (5'-AAAAATCGACGCTCAAGTCAGAAAAGCATCTCACAAACAAACAAACCACC-3') wurde als Matrize verwendet. Die Reaktion mit M-MuLV (Boehringer Mannheim) enthielt 2 μl entweder vom markierten LNA-Primer oder DNA-Primer (10 μM), 2 μl von DNA-Matrize (10 μM), 2 μl von 2 mM dNTP, 2 μl von 10 × Puffer (500 mM Tris-HCl, 300 mM KCl, 60 mM MgCl₂, 100 mM DTT, pH 8,3 (37°C)), 1 μl Enzym (20 U/μl) und Wasser auf 20 μl. Die Reaktionen wurden bei 37°C 60 min lang inkubiert. Die Reaktion mit Klenow-Polymerase (USB) enthielt 2 μl entweder von markiertem LNA- oder DNA-Primer (10 μM), 2 μl von DNA-Matrize (10 μM), 2 μl von 2 mM dNTP, 2 μl von 10 × Puffer (100 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl₂, 75 mM DTT, pH 7,5), 1 μl Enzym (10 U/μl) und Wasser auf 20 μl. Die Reaktionen wurden bei 37°C 60 min lang inkubiert. Die Reaktion mit BM-Taq (Boehringer Mannheim) enthielt 2 μl entweder vom markierten LNA- oder DNA-Primer (10 μM), 2 μl von DNA-Matrize (10 μM), 2 μl von 2 mM dNTP, 2 μl von 10 × Puffer (100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl₂, 50 mM KCl, pH 8,3), 1 μl Enzym (5 U/μl) und Wasser auf 20 μl. Die Reaktionen wurden bei einer Ausgangstemperatur von 37°C inkubiert, die pro Minute um 1°C bis zu 60°C erhöht wurde, wo die Reaktionen 30 min lang gehalten wurden. Am Ende der Inkubationszeit wurden die Reaktionen durch Zusatz von 10 μl Ladepuffer (0,25 (Gew./Vol.) Bromphenolblau, 0,25% (Gew./Vol.) Xylolcyanol, 80 Vol.-% Formamid) gestoppt. Die Proben wurden 1 min lang auf 95°C erhitzt, auf Eis gegeben, und 2 μl wurden auf ein 8%iges Sequenzierungs-Polyacrylamidgel geladen und auf einem Life Technologies Inc. BRL Modell 52 Elektrophorese unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel auf der Glasplatte getrocknet und Autoradiographie (Röntgen-Film: Kodak X-Omat AR) unterzogen. Wie in 7 gezeigt, wurden sowohl bei LNA- als auch bei DNA-Primer reine und ähnliche Extensionsprodukte beobachtet, sofern entweder die Klenow-Polymerase (Bahn 3) oder die BM-Taq-Polymerase (Bahn 5) verwendet wurde. Wurde M-MuLV-Umkehrtranskriptase verwendet (Bahn 2), so kann ein Extensionsprodukt nur im Fall des LNA-Primers nachgewiesen werden. Die markierten LNA- und DNA-Primer, die keiner enzymatischen Verlängerung unterzogen wurden, sind in den Bahnen 1, 4 und 6 zu sehen. Die Erfinder schließen daraus, dass die Einbindung von LNA-Nucleosiden in herkömmliche DNA-Oligos das Erkennen des Oligo/Matrizen-Duplex durch Nucleinsäurepolymerasen nicht unterbindet. Sie schließen weiters, dass LNA-modifizierte Oligos gleich effizient als Primer wirken wie nicht modifizierte DNA-Oligos.
Beispiel 148
LNA-modifiziertes Oligo funktioniert als Primer in Target-Amplifikationsverfahren. Die Fähigkeit von LNA-modifizierten Oligos, als Primer bei PCR-Amplifikation zu wirken, wurde an drei Oligos untersucht, die sich nur in ihrer Anzahl an enthaltenen LNA-Nucleosiden unterschieden: 4 LNA-Nucleoside (AL2-Primer: 5'-GGTGGTTTGTTTG-3', LNA-Nucleoside fettgedruckt), 1 LNA-Nucleosid (AL10-Primer: 5'-GGTGGTTTGTTTG-3', LNA-Nucleosid fettgedruckt) und kein LNA-Nucleosid (FP2-Primer: 5'-GGTGGTTTGTTTG-3'). Die PCR-Reaktionen (100 μl) enthielten entweder keine Matrize (Kontrolle), 0,01 ng, 0,1 ng oder 1 ng Matrize (pU19-Plasmid), 0,2 μM Rückwärts-Primer (5'-GTGGTTCGCTCCAAGCTG-3'), 0,2 μM entweder von AL2-, AL10- oder FP2-Vorwärts-Primer, 200 μM von dATP, dGTP, dCTP und dTTP, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl und 2,5 U der BM-Taq-Polymerase. Insgesamt wurden 50 Zyklen (mit zusätzlich 2,5 U Taq-Polymerase, die nach den ersten 30 Zyklen zugesetzt wurden) an einem Techne Genius Thermozykliergerät durchgeführt, die jeweils aus 94°C 1 min – 45°C 1 min – 72°C 1,5 min bestanden. Nach dem letzten Zyklus wurden die Reaktionen bei 72°C 3 min lang und dann über Nacht bei 4°C inkubiert. Zu 30 μl von jeder Reaktion wurden 6 μl Ladepuffer (0,25% (Gew./Vol.) Bromphenolblau und 40 Vol.-% Glycerin) zugesetzt, und die Proben (zusammen mit einem Amplisize^TM-Größenmarker) wurden auf ein 2%iges Agarosegel geladen und 45 min lang bei 150 V Elektrophorese unterzogen. Schließlich wurde das Gel mit Ethidiumbromid gefärbt und photographiert. Wie in 8 gezeigt bilden die PCR-Reaktionen unter Verwendung des nicht modifizierten Vorwärts-Primers FP2 und des nicht modifizierten Rückwärts-Primers nachweisbare Amplikone mit korrekten Größen mit allen Mengen von verwendeten Matrizen (Bahn 9: 0,01 ng Matrize, Bahn 10: 0,1 ng und Bahn 11: 1 ng). Kein Signal wurde bei der Kontrollreaktion ohne Matrize erhalten (Bahn 12). Wurde der FP2-Vorwärts-Primer durch den Primer ersetzt, der 1 zentrales LNA-Nucleosid (AL10) enthielt, so wurden auch Amplikone mit allen Mengen von verwendeten Matrizen nachgewiesen (Bahn 5: 0,01 ng, Bahn 6: 0,1 ng und Bahn 7: 1 ng). Dies weist eindeutig darauf hin, dass der AL10-Primer eine exponentielle Amplifikation unterstützt, d.h. dass der AL10-Primer sowohl verlängert werden kann als auch als Matrize in seiner Gesamtheit verwendet werden kann. Die Kontrollreaktion ohne Matrize (Bahn 8) bildete wiederum kein Amplikon. Wurde der FP2-Vorwärts-Primer durch den Primer ersetzt, der 4 zentrale LNA-Nucleoside enthielt (AL2), so können in keiner der Reaktionen Amplikone mit korrekter Größe nachgewiesen werden (Bahn 1: 0,01 ng Matrize, Bahn 2: 0,1 ng, Bahn 3: 1 ng und Bahn 4: keine Matrize). Bei der höchsten Konzentration an Matrize jedoch (1 ng) tritt eine hochmolekulare Bande im Gel auf (Bahn 3). Dies jedoch ist ein Artefakt des RP1-Primers, wie die Kontrollreaktion zeigt, in der jeder der Primer AL2 (Bahn A), AL10 (Bahn B), FP2 (Bahn C) und RP1 (Bahn D) auf seine Fähigkeit getestet wurde, ein Amplikon mit der höchsten Menge an Matrize (1 ng) zu produzieren. Da für AL2 in Beispiel 147 gezeigt wurde, dass er als Primer wirkt, weist die Abwesenheit von nachweisbaren Amplikonen stark darauf hin, dass im die Fähigkeit fehlt, als Matrize zu wirken, d.h. dass der Block der 4 aufeinanderfolgenden LNA-Nucleoside das Voranschreiten der Polymerase blockiert, wodurch die Reaktion zu einer linearen Amplifikation umgewandelt wird (deren Produkt durch das verwendete Versuchsverfahren nicht nachweisbar ist). Die Erfinder schließen daraus, dass LNA-modifizierte Oligos als Primer zur PCR-Amplifikation verwendet werden können. Sie schließen weiters, dass der Amplifikationsgrad (der von gänzlich exponentieller zu linearer Amplifikation reicht) durch die Architektur des LNA-modifizierten Oligos gesteuert werden kann. Die Erfinder weisen darauf hin, dass die Möglichkeit, das Voranschreiten der Polymerase durch Einbinden von LNA-Nucleosiden in den Primer zu blockieren, die Bildung von Amplikonen erleichtert, die einzelsträngige Enden aufweisen. Solche Enden sind für Hybridisierung ohne Denaturierung des Amplikons leicht zugänglich, und diese Eigenschaft könnte in zahlreichen Anwendungsbereichen sehr nützlich sein.
Beispiel 149
Ein LNA-modifiziertes Oligomer, das ein 5'-Anthrachinon trägt, kann kovalent an einen festen Träger durch Bestrahlung immobilisiert werden, und das immobilisierte Oligomer ist beim Einfangen eines komplementären DNA-Oligos effizient. Entweder 25 pmol/μl oder 12,5 pmol/μl eines Anthrachinon-DNA-Oligos (5'-AQ-CAG CAG TCG ACA GAG-3') oder eines LNA-modifizierten Anthrachinon-DNA-Oligos (5'-AQ-CAG CAG TCG ACA GAG-3'; LNA-Monomer ist unterstrichen) wurden in 0,2 M LiCl auf einem Polycarbonat-Objektträger (Nunc) mit 1 μl/Fleck aufgesprenkelt. Die Oligos wurden 15 min lang mit weichem UV-Licht bestrahlt. Nach Bestrahlung wurde der Objektträger dreimal in Milli-Q-Wasser gewaschen und luftgetrocknet. 25 ml von 0,5 pmol/μl von komplementärem biotinyliertem Oligomer (5'-Biotin-CTC TGT CGA CTG CTG-3') wurden an die immobilisierten Oligomere in 5 × SSCT (75 mM Citrat, 0,75 M NaCl, pH 7,0, 0,1% Tween 20) bei 50°C 2 h lang hybridisiert. Nach viermaligem Waschen mit 1 × SSCT und einmaligem Waschen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBST, 0,15 M Na⁺, pH 7,2, 0,05% Tween 20) wurden 25 ml PBST, die 0,06 μg/ml Streptavidin-konjugierte Meerrettichperoxidase und 1 μg/ml Streptavidin enthielt, dem Objektträger zugesetzt. Der Objektträger wurde 30 min lang inkubiert und viermal mit 25 ml PBST gewaschen. Der Objektträger wurde unter Verwendung von chemolumineszierendem Substrat (SuperSignal; Pierce) gemäß der Beschreibung des Herstellers und von Röntgen-Film (CL-XPosure-Film, Pierce 34075) sichtbar gemacht. Wie in 9 gezeigt brachte sowohl das AQ-DNA-Oligo als auch das AQ-LNA-modifizierte DNA-Oligo ein eindeutig nachweisbares Signal hervor. Die Erfinder schließen daraus, dass Anthrachinon-gebundene, LNA-modifizierte DNA-Oligos wirksam an eine feste Oberfläche durch Bestrahlung gebunden werden können und dass auf diese Weise gebundene Oligos in der Lage sind, an ihre komplementären Target-DNA-Oligos zu hybridisieren.
Beispiel 150
Hybridisierung und Detektion an einer Anordnung mit unterschiedlichen, LNA-modifizierten, Cy3-markierten 8-meren. Vorbereitung der Objektträger. Glas-Objektträger wurden unter Verwendung einer 10%igen Lösung von Aminopropyltriethoxysilan in Aceton aminosilanisiert und dann mit Aceton gewaschen. Die folgenden Oligonucleotide wurden auf die Objektträger aufgesprenkelt:
Zehn Wiederholungs-Spots, etwa 1 nl pro Spot, wurden für jedes Oligonucleotid aus jedem Stift auf jeden der 12 Objektträger durchgeführt.
Sonden (LNA-Monomere fettgedruckt):

a) Seq.-Nr. aZ1 5'-Cy3-CTT CAT AC-3'
b) Seq.-Nr. aZ2 5'-Cy3-CTT CAT AC-3'
c) Seq.-Nr. aZ3 5'-Cy3-CTT CAT AC-3'
d) Seq.-Nr. 16 5'-Cy3-CTT CAT AC-3'

Objektträger und Hybridisierungsbedingungen:

Objektträger 1, 2 und 3 hybridisiert mit aZ1-Sonde zu 300 fmol/μl, 30 fmol/μl, 3 fmol/μl
Objektträger 4, 5 und 6 hybridisiert mit aZ2-Sonde zu 300 fmol/μl, 30 fmol/μl, 3 fmol/μl
Objektträger 7, 8 und 9 hybridisiert mit aZ3-Sonde zu 300 fmol/μl, 30 fmol/μl, 3 fmol/μl
Objektträger 10, 11 und 12 hybridisiert mit Seq.-16-Sonde zu 300 fmol/μl, 30 fmol/μl, 3 fmol/μl

Eine Sonde, die in 30 μl Hybridisierungspuffer (5 × SSC, 7% Natriumlaurylsarcosin) verdünnt war, wurde entlang der Länge eines jeden Objektträgers pipettiert, mit einem Deckglas zugedeckt und in eine Kunststoffbox auf ein Kunststoff-Insert platziert, das auf einem mit Wasser befeuchteten Papiertuch lag. Die Boxen wurden mit Aluminiumfolie zugedeckt, um ihren Inhalt vor Lichteinfall zu schützen, und über Nacht bei +4°C inkubiert.
Waschen der Objektträger: Die Deckgläser wurden entfernt und die Objektträger in Ständer (6 Objektträger pro Ständer) eingeführt, die in Glasobjektträger-Schalen platziert und in Folie eingewickelt wurden:
Nach dem Waschen wurden die Objektträger unter Luftstrahl getrocknet und gescannt. Die Fluoreszenz wurde an einem Objektträger-Scanner dargestellt, und die Daten wurden durch ImageQuant-Software (Molecular Dynamics) analysiert. Wie in 11 gezeigt, kann weder mit der nicht modifizierten Sonde (Objektträger 10–12), noch mit der einzeln LNA-modifizierten Sonde aZ1 (Objektträger 1–3) noch der einzeln LNA-modifizierten Sonde aZ2 (Objektträger 4–6) noch der dreifach LNA-modifizierten Sonde aZ3 (Objektträger 7–9) eine Bindung der Cy3-markierten Sonden an das fehlgepaarte Oligo 3 beobachtet werden (d.h. das erhaltene Signal mit dem fehlgepaarten Oligo 3 ist mit dem Hintergrundsignal vergleichbar). Bezüglich des komplementären Oligo 6 werden spezifische Signale in allen Fällen beobachtet. Die Intensität dieser Signale steht eindeutig mit der Anzahl an in den Sonden vorhandenen LNAs und mit der Konzentration der Sonden in Zusammenhang. Jeder LNA-T-Rest erhöhte die Signalstärke um etwa einen Faktor von 2 im Vergleich zur normalen DNA-Oligosonde, d.h. aZ1 und aZ2 = 2 × Signal von Sequenz 16, und aZ3 = 8 × Signal von Sequenz 16. Die Unterscheidung zwischen Paarung und Fehlpaarung funktioniert gut mit den LNA-T-Basenersetzungen, und mit der erhöhten Signalstärke scheint das Erkennen von Fehlpaarungen noch einfacher zu sein.
Beispiel 151

Hybridisierung und Detektion von End-Fehlpaarungen an einer Anordnung mit LNA-modifizierten Cy3-markierten 8-meren. Vorbereitung der Objektträger. Glasobjektträger wurden unter Verwendung einer 10%igen Lösung von Aminopropyltriethoxysilan in Aceton aminosilanisiert und daraufhin mit Aceton gewaschen. Die folgenden Oligonucleotide wurden bei 1 pmol/μl auf die Objektträger ausgesprenkelt:

Seq.-Nr. 9	5'-GTGTGGAG-3'
Seq.-Nr. 15	5'-GTGTGGAA-3'
Seq.-Nr. 131	5'-GTGTGGAT-3'
Seq.-Nr. 132	5'-GTGTGGAC-3'
Seq.-Nr. 133	5'-ATGTGGAA-3'
Seq.-Nr. 134	5'-CTGTGGAA-3'
Seq.-Nr. 135	5'-TTGTGGAA-3'

Zehn Wiederholungs-Spots bei etwa 1 nl pro Spot wurden für jedes Oligonucleotid aus jedem der 6 Stifte auf jedem der 12 Objektträger durchgeführt. Sonden (LNA-Monomere fettgedruckt): DNA

Sonde Nr. 1:	5'-Cy3-TTCCACAC-3'
Sonde Nr. 2:	5'-Cy3-GTCCACAC-3'
Sonde Nr. 3:	5'-Cy3-ATCCACAC-3'
Sonde Nr. 4:	5'-Cy3-CTCCACAC-3'
Sonde Nr. 5:	5'-Cy3-TTCCACAT-3'
Sonde Nr. 6:	5'-Cy3-TTCCACAG-3'

LNA

Sonde Nr. 35Z-1:	5'-Cy3-TTCCACAC-3'
Sonde Nr. 35Z-2:	5'-Cy3-GTCCACAC-3'
Sonde Nr. 35Z-3:	5'-Cy3-ATCCACAC-3'
Sonde Nr. 35Z-4:	5'-Cy3-CTCCACAC-3'
Sonde Nr. 35Z-5:	5'-Cy3-TTCCACAT-3'

Sonde Nr. 35Z-6: 5'-Cy3-TTCCACAG-3'

Sonden mit LNA-Monomeren wurde 35Z- als Teil der Sequenznummer vorangestellt. Spezifische LNA-Monomere werden in Kursiv/Fettschrift angegeben und befinden sich an den 3'- und 5'-Enden der LNA-Oligos.
Objektträger und Hybridisierungsbedingungen: Jede Sondensequenz wurde an einen eigenen Objektträger hybridisiert, und alle Sondenkonzentrationen beliefen sich auf 1 fmol/μl. Jede Sonde wurde in Hybridisierungspuffer (5 × SSC, 7% Natriumlaurylsarcosin) verdünnt, davon wurden 30 μl entlang der Länge eines jeden Objektträgers pipettiert, mit einem Deckglas abgedeckt und in eine Kunststoffbox auf ein Kunststoff-Insert platziert, das auf einem mit Wasser befeuchteten Papiertuch lag. Die Boxen wurden mit Aluminiumfolie zugedeckt, um ihren Inhalt vor Lichteinfall zu schützen, und über Nacht bei +4°C inkubiert.
Waschen der Objektträger. Die Deckgläser wurden entfernt und die Objektträger in Ständer (8 Objektträger pro Ständer) eingeführt, die in Glasobjektträger-Schalen platziert und in Folie eingewickelt wurden. Alle Objektträger wurden in 5 × SSC 2 × 5 min lang bei +4°C gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Objektträger unter Luftstrahl getrocknet und gescannt. Die Fluoreszenz wurde an einem Objektträger-Scanner dargestellt, und die Daten wurden mittels ImageQuant Software (Molecular Dynamics) analysiert.
Schlussfolgerungen: Wie in den 12 und 13 gezeigt, sind die Sonden, die LNA-Nucleoside an ihren 5'- und 3'-Enden aufweisen, im Großteil der Fälle signifikant besser beim Unterscheiden zwischen korrekt gepaarten und fehlgepaarten Target-Sequenzen als ihre nicht modifizierten Oligonucleotid-Gegenstücke.
Für DNA-Oligos waren C=T-Fehlpaarungen am schwierigsten zu erkennen, beispielsweise wenn Sondensequenz 1 an Targetsequenz 132 hybridisierte und wenn Sondensequenz 5 an Targetsequenz 134 hybridisierte. Andere Fehlpaarungen waren sichtbar, wie beispielsweise T=T- und G=T-Fehlpaarungen, doch diese Spots waren weniger intensiv, beispielsweise wenn Sondensequenzen 5 bzw. 6 jeweils an Targetsequenz 135 hybridisierten. Die LNA-Oligos reduzierten diese C=T- und T=T-Fehlpaarungs-Spotintensität signifikant zu vergleichbaren Intensitäten anderer Fehlpaarungen. Die relative Spot-Intensitäten von Sondensequenzen 1, 2 und 3 waren für die DNA- und LNA-Oligos ähnlich. Bei Sondensequenzen 4, 5 und 6 jedoch ergaben die LNA-Oligos signifikant erhöhte Spot-Intensität, wenn sie an ihre Paarungs-Targetsequenzen 9, 133 bzw. 134 hybridisierten.
Beispiel 152

Hybridisierung und Detektion von End-Fehlpaarungen an einem Anordnung mit AT und vollständig LNA-modifizierten Cy3-markierten 8-meren. Vorbereitung der Objektträger. Glas-Objektträger wurden unter Verwendung einer 10%igen Lösung von Aminopropyltriethoxysilan in Aceton aminosilanisiert und dann mit Aceton gewaschen. Die folgenden Oligonucleotide wurden bei 1 pmol/μl auf die Objektträger ausgesprenkelt:

Zehn Wiederholungsspots, mit etwa 1 nl pro Spot, wurden für jedes Oligonucleotid von jedem der 6 Stifte auf jedem der 36 Objektträger durchgeführt. Sonden: (LNA-Monomere fettgedruckt): DNA:

Sonde Nr. 1:	5'-Cy3-TTCCACAC-3'
Sonde Nr. 2:	5'-Cy3-GTCCACAC-3'
Sonde Nr. 3:	5'-Cy3-ATCCACAC-3'
Sonde Nr. 4:	5'-Cy3-CTCCACAC-3'

Sonde Nr. 5:	5'-Cy3-TTCCACAT-3'
Sonde Nr. 6:	5'-Cy3-TTCCACAG-3'

AT LNA:

Sonde Nr. ATZ-1:	5'-Cy3-TTCCACAC-3'
Sonde Nr: ATZ-2:	5'-Cy3-GTCCACAC-3'
Sonde Nr. ATZ-3:	5'-Cy3-ATCCACAC-3'
Sonde Nr. ATZ-4:	5'-Cy3-CTCCACAC-3'
Sonde Nr. ATZ-5:	5'-Cy3-TTCCACAT-3'
Sonde Nr. ATZ-6:	5'-Cy3-TTCCACAG-3'

AII LNA:

Sonde Nr. AIIZ-1:	5'-Cy3-TTCCACAC-3'
Sonde Nr. AIIZ-2:	5'-Cy3-GTCCACAC-3'
Sonde Nr. AIIZ-3:	5'-Cy3-ATCCACAC-3'
Sonde Nr. AIIZ-4:	5'-Cy3-CTCCACAC-3'
Sonde Nr. AIIZ-5:	5'-Cy3-TTCCACAT-3'
Sonde Nr. AIIZ-6:	5'-Cy3-TTCCACAG-3'

Sonden mit LNA-Monomeren tragen die Vorsilbe ATZ- oder AIIZ- als Teil der Sequenznummer. Spezifische LNA-Monomere sind in Kursivschrift für die LNA-Oligos angegeben.
Objektträger und Hybridisierungsbedingungen: Jede Sondensequenz wurde an einen separaten Objektträger hybridisiert, und alle Sondenkonzentrationen beliefen sich auf 1 fmol/μl. Jede Sonde wurde in Hybridisierungspuffer (5 × SSC, 7% Natriumlaurylsarcosin) verdünnt, von dem 30 μl entlang der Länge jedes Objektträgers pipettiert wurden, mit einem Deckglas abgedeckt und in eine Kunststoffbox auf ein Kunststoff-Insert platziert, das auf einem mit Wasser befeuchteten Papiertuch lag. Die Boxen wurden mit Aluminiumfolie zugedeckt, um ihren Inhalt vor Lichteinfall zu schützen, und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.
Waschen der Objektträger. Die Deckgläser wurden entfernt und die Objektträger in Ständer (9 Objektträger pro Ständer) eingeführt, die in Glasobjektträger-Schalen platziert und in Folie eingewickelt wurden. Alle Objektträger wurden in 5 × SSC 2 × 5 min lang bei Raumtemperatur gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Objektträger unter Luftstrahl getrocknet und gescannt. Die Fluoreszenz wurde an einem Objektträger-Scanner dargestellt, und die Daten wurden mittels ImageQuant Software (Molecular Dynamics) analysiert.
Schlussfolgerungen: Wie in den 15A, 15B und 15C gezeigt, lag die durchschnittliche Intensität von DNA-Hybridisierung bei Raumtemperatur bei etwa 10% der Intensität, die mit den AT- oder vollständig LNA-modifizierten Oligos erreicht wurde. Keine Spots wurden an den Objektträgern gesehen, die mit DNA-Sonden 5 und 6 hybridisierten. Diese Bedingungen waren daher für die DNA-Sonden nicht optimal. Die Paarung/Fehlpaarung-Unterscheidung funktioniert jedoch mit den LNA-Nucleosidersetzungen an den A- und T-Basen sehr gut. Die Stringenz für die reinen LNA-Oligos kann eventuell nicht ausreichend groß sein, da die Paarung/Fehlpaarung-Unterscheidung nicht so gut war wie im Fall der AT-LNA-Oligos. Die Oligos mit LNA-Modifikationen funktionierten gut, und die Fehlpaarungen, die am schwierigsten zu erkennen waren, sind:
Sonde 1 an Target 135 = CT-Fehlpaarung
Sonde 2 an Target 131 = GT-Fehlpaarung
Sonde 3 an Target 15 = AA-Fehlpaarung
Sonde 4 an Target 131 = CT-Fehlpaarung
Sonde 5 an Target 135 = TT-Fehlpaarung
Sonde 6 an Target 135 = GT-Fehlpaarung
Sonde 6 an Target 133 = GA-Fehlpaarung
Die AT-LNA-Oligos ergaben gute Unterscheidung, wo sich diese Fehlpaarungs-Spotintensitäten typischerweise auf höchstens 50% der Intensität der Paarungsspots beliefen. Bei diesen Fehlpaarungen ergaben die reinen LNA-Oligos Fehlpaarungs-Spotintensitäten von etwa 50 bis 70% der Paarungsspotintensitäten.
Allgemein gesprochen ermöglichen LNA-Modifikationen die Verwendung von höheren Temperaturen für Hybridisierungs- und Waschschritte, und End-Fehlpaarungen können erkannt werden. Diese Resultate sind zumindest so gut wie jene von DNA-Sonden, die bei 4°C hybridisierten (siehe Beispiel 151).
Beispiel 153
Verwendung von [α³³P]-ddNTP's und ThermoSequenase^TM-DNA-Polymerase zum Sequenzieren von DNA-Matrizen, die LNA-T-Monomere enthalten. Radioaktiv markierte Terminationssequenzierungsreaktionen wurden durchgeführt, um die Fähigkeit des LNA-T-Monomers zu testen, als eine Matrize für DNA-Polymerasen angenommen zu werden. Der 15-mer-Primer (Sequenz: 5'-TGC ATG TGC TGG AGA-3') wurde verwendet, um die folgenden kurzen Oligonucleotidsequenzen zu primen (LNA-Monomer fettgedruckt):

Matrize 1 3'-ACG TAC ACG ACC TCT ACC TTG CTA-5'

Matrize TZ1 3'-ACG TAC ACG ACC TCT ACC TTG CTA-5'
Die folgenden Reaktionsmischungen wurden hergestellt: Matrize-1-Gemisch:

2 μl ×16 ThermoSequenase-Puffer

6 μl Primer 2 pmol/μl

6 μl Matrize 1 1 pmol/μl

4 μl Wasser

2 μl ThermoSequenase-DNA-Polymerase (4 U/μl)

20 μl Gesamtvolumen

Matrize-TZ1-Gemisch:

2 μl ×16 ThermoSequenase-Puffer

6 μl Primer 2 pmol/μl

6 μl Matrize TZ1 1 pmol/μl

4 μl Wasser

2 μl ThermoSequenase-DNA-Polymerase (4 U/μl)

20 μl Gesamtvolumen
2 μl Nucleotidgemisch (7,5 μM jedes dNTP) wurden zu jedem der 8 Eppendorf-Röhrchen zugesetzt. 0,5 μl [α³³P]-ddATP wurden den Röhrchen 1 und 5 zugesetzt. 0,5 μl [α³³P]-ddCTP wurden zu den Röhrchen 2 und 6 zugesetzt. 0,5 μl [α³³P]-ddGTP wurden zu den Röhrchen 3 und 7 zugesetzt. 0,5 μl [α³³P]-ddTTP wurden zu den Röhrchen 4 und 8 zugesetzt. 4,5 μl von Matrize-1-Gemisch wurden zu jedem der Röhrchen 1–4 zugesetzt. 4,5 μl von Matrize-TZ1-Gemisch wurden zu jedem der Röhrchen 5–8 zugesetzt. Alle Reaktionen wurden bei 60°C 3 min lang inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zusatz von 4 μl Formamid/EDTA-Stopplösung gestoppt. Die Reaktionen wurden 3 min lang auf 95°C erhitzt, bevor sie auf ein 19%iges Polyacrylamid-7M-Harnstoffgel geladen wurden. Das Gel wurde in 10% Essigsäure/10% Methanol fixiert, bevor es auf 3MM-Papier transferiert und getrocknet wurde. Kodak-Biomax-Autoradiographiefilm wurde mit dem getrockneten Gel belichtet.
Die Ergebnisse, sind in 18 (Spur 1–4) und 19 (Bahn 5–8) abgebildet. Die– Spuren entsprechen den folgenden Reaktionen: 18: Bahn 1 – ddATP-Spur. Bahn 2 – ddCTP-Spur. Bahn 3 – ddGTP-Spur. Bahn 4 – ddTTP-Spur. Bahn 5 – 8–32-Basen-Oligomarker; 19: Bahn A – 8–32-Basen-Oligomarker. Bahn 5 – ddATP-Spur. Bahn 6 – ddCTP-Spur. Bahn 7 – ddGTP-Spur. Bahn 8 – ddTTP-Spur.
Wie aus den 18 und 19 hervorgeht, kann die gesamte Sequenz von beiden Matrizen leicht vom Autoradiogramm abgelesen werden. Die Sequenz ist 5'-TGG AAC GTA-3', was der Matrizensequenz 3'-ACC TTG CTA-5' entspricht. Dies zeigt, dass ein einzelnes LNA-T-Monomer als eine Matrize für DNA-Polymerasen wirken kann. Das LNA-T-Monomer wird spezifisch als "T" mit eingebundenem ddATP kopiert.
Therapeutische Anwendungen
Beispiel 154
LNA-modifizierte Oligos können in Zellen transferiert werden. Versuch mit radioaktiv markierten LNA-Oligos. 10 pmol eines Oligodesoxynucleotids (ODN) (ODN Nr. 10: 5'-TTA ACG TAG GTG CTG GAC TTG TCG CTG TTG TAC TT-3', ein 35-mer, komplementär zu menschlichem Cathepsin D) und 10 pmol von zwei LNA-Oligos: AL16 (5'-d(TGT GTG AAA TTG TTA T)-3', LNA-Nucleoside fettgedruckt) und AL17 (5'-d(ATA AAG TGT AAA G)-3', LNA-Nucleoside fettgedruckt) wurden mit T4-Polynucleotidkinase (10 Einheiten, BRL Kat.-Nr. 510-8004SA), 5 μl γ-³²P-ATP 5000 Ci/mmol, 10 μCi/μl (Amersham) in Kinasepuffer (50 mM Tris/HCl pH 7,6, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 0,1 mM EDTA) vermischt. Die Proben wurden 45 min lang bei 37°C inkubiert und anschließend 10 min lang auf 68°C erhitzt und dann auf +0°C gebracht. Nicht eingebundene Nucleotide wurden durch das Führen über Chroma-Spin-TE-10-Säulen (Clontech Kat.-Nr. K1320-1) entfernt. Die Ausbeuten beliefen sich auf 5 × 10⁵ cpm/μl, 2 × 10⁵ cpm/μl und 0,8 × 10⁵ cpm/μl für ODN Nr. 10, AL16 bzw. AL17. Menschliche Brustkrebszellen MCF-7, die ursprünglich von der Human Cell Culture Bank (Mason Research Institute, Rockville) erhalten wurden, wurden in DME/F12-Kulturmedium (1:1), ergänzt mit 1% wärmeinaktiviertem fötalem Kälberserum (Gibco BRL), 6 ng/ml Rinderinsulin (Novo) und 2,5 mM Glutamax (Life Technologies), in 25-cm²-Zellkulturkolben (Nunclon, NUNC) kultiviert und in einem befeuchteten Inkubator bei 37°C, 5% CO₂, 20% O₂, 75% N₂, inkubiert. Die MCF-7-Zellen waren zur Zeit des Versuchs etwa zu 40% konfluent. Eine geringe Menge (weniger als 0,1 pmol) der kinasierten Oligos wurden mit 1,5 μg pEGFP-NI-Plasmid (Clontech Kat.-Nr. 60851) vermischt und mit 100 μl verdünntem FuGENE6-Transfektionsmittel (Boehringer Mannheim Kat.-Nr. 1 814 443), Verdünnung: 5 μl FuGENE6 in 95 μl DME/F12-Kulturmedium ohne Serum, vermischt. Das FuGENE6/DNA/Oligo-Gemisch wurde dem Kulturmedium (5 ml) von haftenden wachsenden MCF-7-Zellen direkt zugesetzt und mit den Zellen unter strenger Berücksichtigung der Anweisungen des Herstellers 18 Stunden lang inkubiert. Drei Arten von Versuchen wurden durchgeführt. 1) ODN Nr. 10 + pEGFP-NI; 2) AL16 + pEGFP-NI; 3)AL17 + pEGFP-NI. Zelluläre Aufnahme von DNA/LNA-Material wurde durch Entfernen von FuGENE6/DNA/Oligo-Gemisch, das Medium enthielt, untersucht (eine Aliquote wurde in eine Szintillationsphiole übertragen). Die Zellen wurden einmal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, frisches Kulturmedium wurde zugesetzt, und die Zellen wurden durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Etwa 30% der transfizierten Zellen enthielten grün fluoreszierendes Material, was darauf hinweist, das etwa 30% der Zellen das pEGFP-NI-Plasmid aufgenommen hatten und nun das grün fluoreszierende Protein, das durch dieses Plasmid kodiert wird, exprimierten. Nach der Fluoreszenzmikroskopie wurden die haftenden MCF-7-Zellen aus den Kulturkolben entfernt. Kurz beschrieben wurde das Kulturmedium entfernt, dann wurden die Zellen mit einer Lösung von 0,25% Trypsin (Gibco BRL), 1 mM EDTA in PBS (ohne Mg²⁺ und Ca²⁺) gespült, 1 ml Trypsin/EDTA wurde zugesetzt, und die Zellen wurden 10 min lang bei 37°C inkubiert. Während der Inkubation lösten sich die Zellen und konnten leicht resuspendiert und in die Szintillationsphiolen übertragen werden. Die Zellen wurden dann durch Zusatz von 10 ml Optifluor-Szintillationsmischung (Packard Kat.-Nr. 6013199) vollständig aufgelöst, und die Phiolen wurden in einem Szintillationszähler Wallac 1409 gezählt. Die Resultate waren wie folgt: 1) ODN Nr. 10 + pEGFP-NI: etwa 1,4% der zugesetzten Radioaktivität waren mit zellulärem Material assoziiert; 2) AL16 + pEGFP-NI: etwa 0,8% der zugesetzten Radioaktivität waren mit zellulärem Material assoziiert; 3) AL17 + pEGFP-NI: etwa 0,4% der zugesetzten Radioaktivität waren mit zellulärem Material assoziiert. Die Erfinder schließen daraus, dass 0,4–0,8% der zugesetzten LNA-Oligos von den Zellen aufgenommen wurden.
Beispiel 155
LNA wird lebenden menschlichen MCF-7-Brustkrebszellen wirksam zugeführt. Um die Effizienz der LNA-Aufnahme durch menschliche MCF-7-Zellen zu verbessern, wurden verschiedene Transfektionsmittel mit unterschiedlichen Konzentrationen von 5'FITC-markierten LNAs und DNA getestet. Die in der nachstehenden Tabelle beschriebenen Oligonucleotide wurden getestet.
Tabelle: Getestete Oligonucleotide
AL16 und AL17 wurden enzymatisch mit FITC wie in Beispiel 128 beschrieben markiert. EQ3009-01 und EQ3008-01 wurden mit FITC mittels herkömmlicher Festphasenchemie markiert. Drei Transfektionsmittel wurden getestet: FuGENE-6 (Boehringer Mannheim Kat.-Nr. 1 814 443), SuperFect (Quiagen Kat.-Nr. 301305) und Lipofectin (Gibco BRL Kat.-Nr. 18292-011). Menschliche MCF-7-Brustkrebszellen wurden wie zuvor (Beispiel 154) beschrieben kultiviert. Drei Tage vor den Versuchen wurden die Zellen bei einer Zelldichte von etwa 0,8 × 10⁴ Zellen pro cm² überimpft. Je nach Versuchstyp wurden die MCF-7-Zellen in Standard-T25-Kolben (Nunc, LifeTechnologies Kat.-Nr. 163371A), 24-Well-Multischalen (Nunc, LifeTechnologies Kat.-Nr. 143982A) oder Objektträgerkolben (Nunc, Life Technologies Kat.-Nr. 170920A) überimpft. Die Versuche wurden durchgeführt, wenn Zellen 30–40% konfluent waren. Zelluläre Aufnahme von LNA und DNA wurde unter serumfreien Bedingungen untersucht, d.h. dass das normale Serum, das DME/F12-Medium enthielt, entfernt und durch DME/F12 ohne Serum ersetzt wurde, bevor das Transfektionsgemisch zu den Zellen zugesetzt wurde. Unter diesen Bedingungen zeigte sich SuperFect gegenüber den MCF-7-Zellen toxisch. Transfektionsgemische, die aus SuperFect und entweder Plasmid-DNA (pEGFP-N1, Clontech Kat.-Nr. 6085-1), Oligo-DNA oder Oligo-LNA bestanden, waren gegenüber MCF-7-Zellen gleich toxisch. Im Gegensatz zu SuperFect funktionierten FuGene6 und Lipofectin mit Plasmid-DNA (pEGFP-N1) gut. Dennoch war nur Lipofectin zu wirksamer Zufuhr von Oligonucleotiden zu lebenden MCF-7 in der Lage. Kurz beschrieben wurde wirksame Zufuhr von FITC-markiertem LNA und DNA zu MCF-7-Zellen durch Kultivieren der Zellen in DME/F12 mit 1% FCS zu etwa 40% Konfluenz erhalten. Das Lipofectin-Reagens wurde dann 40× in DME/F12-Medium ohne Serum verdünnt und mit dem Oligo zu einer Konzentration von 750 nM Oligo kombiniert. Der Oligo-Lipofectin- Komplex konnte sich 15 min lang bei Raumtemperatur bilden und wurde dann weiter mit serumfreiem Medium zu einer Endkonzentration von 250 nM Oligo, 0,8 μg/ml Lipofectin, verdünnt. Dann wurde das Medium von den Zellen entfernt und durch das den Oligo-Lipofectin-Komplex enthaltende Medium ersetzt. Die Zellen wurden bei 37°C 6 h lang inkubiert, einmal mit DME/F12-Medium ohne Serum gespült und weitere 18 h lang in DME/F12 mit 1% FCS bei 37°C inkubiert. Das Resultat des Versuchs wurde entweder direkt an lebenden Zellen in Kulturkolben oder in 24-Well-Multischalen oder an Zellen, die in Objektträgerschalen kultiviert und in 4% eiskaltem PFA fixiert wurden, bewertet. In allen Fällen wurde ein Leica-DMRB-Fluoreszenzmikroskop, ausgestattet mit einer CCD-Kamera mit hoher Auflösung, verwendet. Das Resultat mit lebenden Zellen ist in 16 gezeigt, und das Resultat mit fixierten Zellen, die in Objektträgerkolben kukltiviert waren, ist in 17 gezeigt. Sowohl die Zellen in 16 als auch in 17 wurden mit dem FITC-markierten AL16-LNA-Molekül transfiziert. Durch Zählen der Gesamtanzahl an Zellen und grün fluoreszierenden Zellen in mehreren Feldern konnten die Erfinder beobachten, dass FITC-markiertes AL16-LNA in etwa 35% der MCF-7-Zellen transfiziert war. Es ist wichtig, anzumerken, dass die Erfinder erkannten, dass das LNA vorzugsweise in den Nuclei der Zellen lokalisiert war (17). Darauf muss hingewiesen werden, da nukleare Aufnahme von fluoreszierenden Oligos mit ihrer Antisense-Aktivität zusammenhängt (Stein C. A. et al., Making sense of antisense: A debate. In: HMS Beagle: A BioMedNet Publication (http:/hmsbeagle.com/06/cutedge/overwiev.htm) (1997)). Das Erhöhen der Menge von Oligo und Lipofectin bis zu einer Endkonzentration von 1.250 nM Oligo und 4 μg/ml Lipofectin steigerte den Prozentsatz von grün fluoreszierenden Zellen nur marginal. Ein weiteres Erhöhen der Konzentration war für die Zellen toxisch. Ähnliche Resultate wurden mit den anderen LNAs und der FITC-markierten Oligo-DNA erhalten (siehe die Tabelle oben). Die Erfinder schließen Folgendes daraus: 1) LNA kann lebenden MCF-7-Brustkrebszellen durch Lipofectin-vermittelte Transfektion wirksam zugeführt werden. 2) Ein beachtlich hoher Anteil, 30% oder mehr der Zellen, wird unter Verwendung einer Endkonzentration von 250 nM LNA, 0,8 μg Lipofectin pro ml Wachstumsmedium ohne Serum, transfiziert. Ein Erhöhen der Konzentrationen von LNA und Lipofectin bis zum Fünffachen steigerte das Transfektionsergebnis nur marginal. 3) Das Verfahren transfizierte das LNA in die Nuclei der Zellen, was laut Literatur ein positiver Hinweis darauf ist, dass solche transfizierten LNAs Antisense-Wirkungen auf Zellen zeigen können.
Beispiel 156
LNA-modifizierte Oligos können in Zellen transfiziert werden. Versuch mit Fluorescein-markierten LNA-Oligos. Zwei LNA-Oligos: AL16 (5'-TGT GTG AAA TTG TTA T-3', LNA-Nucleoside fettgedruckt) und AL17 (5'-ATA AAG TGT AAA G-3', LNA-Nucleoside fettgedruckt) wurden mit Fluorescein wie in Beispiel 128 beschrieben markiert. Menschliche MCF-7-Brustkrebszellen wurden wie in Beispiel 154 beschrieben kultiviert. Drei Versuchstypen wurden eingesetzt. 1) etwa 1,5 μg FITC-markiertes AL16; 2) etwa 1,5 μg FITC-markiertes AL17; und 3) etwa 0,75 μg FITC-markiertes AL16 und 0,75 μg pRSVβgal-Plasmid (ein Plasmid, das die durch das bakterielle Lac-Z-Gen kodierte Enzym-β-Galactosidase exprimiert, Tulchinsky et al., PNAS 89, 9146–9150 (1992)). Die zwei LNA-Oligos und das LNA-Plasmidgemisch wurden mit FuGENE6 vermischt und zu den MCF-7-Zellen wie in Beispiel 154 beschrieben zugesetzt. Nach 18 Stunden Inkubation wurde zelluläre Aufnahme der LNA-Oligos durch Fluoreszenzmikroskopie der Zellkulturen bewertet. Ein Teil der behandelten Zellen enthielten grün fluoreszierendes Material (siehe 16), was darauf hinweist, dass Zellen das Fluorescein-markierte LNA aufnehmen. Das Fluorescein-markierte AL16 schien in dieser Hinsicht dem Fluorescein-markierten AL17 überlegen zu sein. Nach Fluoreszenzmikroskopie wurde das Kulturmedium von den Zellen entfernt, die sowohl mit Fluorescein-markiertem AL16 als auch pRSVβgal behandelt worden waren. Die Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen, in 2 Vol.-% Formaldehyd, 0,2 Vol.-% Glutaraldehyd bei 4°C 5 min lang fixiert, und β-Galactosidase-hältige Zellen wurden mit X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indoyl-β-D-Galactopyranosid) blau gefärbt, das sich in Gegenwart von β-Galactosidase-Aktivität von farblos zu blau verfärbt. Die X-gal-Färbung zeigte, dass das pRSVβgal wirksam in die Zellen transfiziert worden war. Die Erfinder schließen daraus, dass das die Fluorescein-LNA-Oligos von den Zellen aufgenommen wurden.
Beispiel 157
LNA-modifizierte Oligos sind unter Zellkulturbedingungen relativ stabil. Gemäß der Fluoreszenzmikroskopie, die in Beispiel 156 beschrieben wurde, wurden Zellen, die nur mit dem Fluorescein-markierten AL16-LNA behandelt wurden, 3 zusätzliche Tage inkubieren gelassen. Während dieser Phase schien sich die Anzahl an grün fluoreszierenden Zellen nicht zu verändern. Die Erfinder schließen daraus, dass die Fluorescein-markierten LNA-Oligos unter den in Zellkultur vorherrschenden Bedingungen eine gute Stabilität aufweisen.
Beispiel 158
Blockade durch Antisense-blockierte Nucleinsäuren (LNA) von [D-Ala2]deltorphin-induzierter Antinozizeption im Warmwasser-Schwanzzucktest bei Ratten bei Bewusstsein. Männlichen Sprague-Dawley-Ratten (300 g) wurde ein intrathekaler (i.th.) Polyethylenkatheter implantiert, und sie konnten sich zumindest 5 Tage lang erholen, bevor die Injektionsserie (einschließlich der Kontrollen) gestartet wurde. Die Antisense-LNA-Verbindungen (12,5 und 2,5 μg pro Injektion) wurden in einem Volumen von 5 μl zweimal täglich (8.00 und 17.00 Uhr) 3 Tage lang verabreicht. Keine Zeichen von nicht spezifischen Wirkungen oder Toxizität konnten verzeichnet werden, wie Beobachtungen des Bewegungsverhaltens und Messungen des Körpergewichts zeigten. Am Tag nach der letzten Injektion wurde den Ratten [D-Ala2]deltorphin (60 μg, i.th.) injiziert, und die Ratten wurden mittels Warmwasser- (52°C) Schwanzzucktest auf δ-Opioid-Rezeptor-vermittelte Antinozizeption getestet. Die Daten sind in 14 als Mediane auf Grundlage der Ergebnisse von 6–8 Tieren pro Gruppe dargestellt (Daten umgerechnet zu maximal möglicher Reaktion in Prozent, % MPE). Statistische Analysen wurden mittels Kruskal-Wallis-Einweg-ANOVA durch Ränge durchgeführt, gefolgt von Vergleichen zwischen behandelten Tieren und Kontrolltieren. Wie in 14 gezeigt produzierte Deltorphin eine robuste antinozizeptive Wirkung bei mit Salzlösung behandelten Tieren. Diese Reaktion war in beiden Antisense-LNA-Gruppen (12,5 und 2,5 μg) im Vergleich zu den mit Salzlösung behandelten Kontrollen statistisch signifikant unterdrückt.
LNA-Feststoffträger
Beispiel 159
Allgemeines Verfahren für DMT-LNA-Nucleosidsuccinate. Basengeschütztes DMT-LNA-Nucleosid und Bernsteinsäureanhydrid (1,5 Äquivalente) wurden in wasserfreiem Ethylendichlorid (~10 ml/g Nucleosid) aufgenommen. Dem Gemisch wurde Triethylamin (2 Äquivalente) zugesetzt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Reaktion wurde HPLC (unter denselben Bedingungen wie bei Tritylierung) durchgeführt. Nach abgeschlossener Reaktion (> 95%) wurde das Reaktionsgemisch konzentriert, zusammen mit Ethylendichlorid und Acetonitril eingedampft und in Vakuum getrocknet, um Triethylamin zu entfernen. Der Rückstand wurde in Ethylendichlorid oder Ethylacetat (100 ml/g vom Ausgangsnucleosid) aufgelöst und mit kalter 10%iger Zitronensäure (3 × 80 ml/g) und kaltem Wasser (3 × 80 ml/g) gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und mit oder ohne Zusatz von 1–2 Äquivalenten Triethylamin konzentriert. Der verbleibende Feststoff wurde mit wasserfreiem Acetonitril (2–3×) zusammen eingedampft und in Vakuum getrocknet, um ein reines Produkt als weißen Feststoff zu ergeben.
Allgemeines Verfahren für LNA-Nucleosidträger. Basengeschütztes DMT-LNA-Nucleosidsuccinat (freie Säure oder Triethylammoniumsalz, 65 μmol/g Träger), Amino-derivatisierter Träger (Primer Support^TM 30HL, 160 μmol Aminogruppen/g Träger), DMAP (3 mg/g Träger) und 1-(3-[Dimethylamino)propyl)-3-ethylcarbodimidhydrochlorid (80 mg/g Träger) wurden in wasserfreiem Pyridin (6 ml/g Träger) aufgenommen. Zu diesem Gemisch wurde Triethylamin (16 μl/g Träger) zugesetzt, und das Gemisch wurde über Nacht in einer Schüttelvorrichtung bei 150 U/min gehalten. Der Träger wurde filtriert und mit Methanol (3 × 10 ml/g Träger) und Dichlormethan (3 × 10 ml/g Träger) gewaschen. Nach Lufttrocknen wurde der Träger in Vakuum 0,5 h lang getrocknet. Dazu wurden 6% DMAP in wasserfreiem Acetonitril (Cap A, ~3 ml/g Träger) und ein Gemisch aus 20% Essigsäureanhydrid/30% 2,4,6-Collidin/50% Acetonitril (Cap B, ~3 ml/g Träger) zugesetzt. Das Gemisch wurde 5 h lang im Schüttler aufbewahrt. Der Träger wurde filtriert, mit wasserfreiem Dichlormethan (2 × 10 ml/g Träger) gewaschen und wie oben getrocknet. Es wurde in einem Gemisch aus Cap A und Cap B (Gesamtvolumen 6 ml/g Träger) resuspendiert und über Nacht im Schüttler aufbewahrt. Der Träger wurde filtriert, mit Methanol (6 × 10 ml/g Träger) und Dichlormethan (3 × 10 ml/g Träger) gewaschen und an der Luft getrocknet. Er wurde weitere 5–6 hin Vakuum getrocknet. Die Ladung wurde mittels Dimethoxytrityl-Test bestimmt und bei etwa 40 μmol/g festgestellt.
Beispiel 160
Erststrang-cDNA-Synthese unter Verwendung von Poly-dT-Primern, die LNA-T-Monomere enthalten. Die Reaktionen wurden durchgeführt, um die Fähigkeit von LNA-T-Resten-hältigen Poly-dT-Primern zu testen, Erststrang-cDNA-Synthese zu primen. Die folgenden Poly-dT-Primer wurden getestet (LNA-Monomere fettgedruckt):
RTZ1 5'-TTT TTT TTT TTT TT-3'
RTZ2 5'-TTT TTT TTT TTT TT-3'
RTZ3 5'-TTT TTT TTT TTT TT-3'
RTZ4 5'-TTT TTT TTT TTT TT-3''
RTZ5 5'-TTT TTT TTT T-3'
Poly-dT-Primer mit einer Region hoher Sequenzhomologie aus RPK0140-Set Cy-Farbstoff-cDNA-Markierungsset (Amersham Pharmacia Biotech) wurde als Kontrolle eingesetzt
Die Reaktionen wurden wie folgt für jeden der obigen Primer angelegt:

1 μl Arabidopsis-mRNA 0,5 μg/μl

2 μl Poly-dT-Primer 8 pmol/μl

4 μl ×5 AMV Umkehrtranskriptase-Puffer

1 μl Wasser

8 μl Gesamtvolumen
Dieses Gemisch wurde dann bei 75°C 3 min lang erhitzt und anschließend bei Raumtemperatur zumindest 10 min abkühlen gelassen.

Die folgenden Elemente wurden zu jeder der Reaktionen zugesetzt:

1 μl	80 mM Natriumpyrophosphat
1 μl	Menschlicher Placenta-Ribonucleaseinhibitor 20 U/μl
7 μl	0,5 mM dNTP-Lösung
2 μl	[α³³P]-dATP 10 mCi/ml 3.000 Ci/mmol
1 μl	AMV-Umkehrtranskriptase 20 U/μl
20 μl	Gesamtvolumen

Die Reaktionen wurden bei 42°C 2 h lang inkubiert. Die Reaktionen wurden dann bei 95°C 3 min lang erhitzt, bevor sie auf ein 6%iges Polyacrylamid-7M-Harnstoffgel geladen wurden. Das Gel wurde in 10% Essigsäure/10% Methanol fixiert, bevor es auf ein 3MM-Papier übertragen und getrocknet wurde. Mit dem getrockneten Gel wurde über Nacht ein Kodak-Biomax-Autoradiographiefilm entwickelt.
Die Autoradiographie zeigte eindeutig, dass die LNA-hältigen Oligonucleotidprimer RTZ1–4 in der Lage waren, cDNA-Synthese wirksam zu primen. Die Menge und Intensität der cDNA-Produkte, die in diesen Reaktionen produziert wurden, entsprach jener, die mit dem Poly-dT-Kontroll-Oligonucleotid mit einer Region hoher Sequenzhomologie produziert wurde. RTZ5 produzierte ein wenig cDNA, die Ausbeute war jedoch signifikant geringer als jene, die mit dem Kontroll-Oligoprimer produziert wurde.
Beispiel 161
LNA-modifizierte Oligonucleotide, die kovalent an Sepharose-Kügelchen gebunden sind, wirken effizient beim sequenzspezifischen Einfangen von RNA-Molekülen. Drei Oligos wurden mittels chemischer Verfahren (Amy Mueller) zur Bewertung von Poly-(rA)-Bindung synthetisiert.

– NH₂(T8)-T Kontrolle

– NH₂(T15)-T Kontrolle

– NH₂(LNA-T8)-T Test
200 nmol von jedem Oligo wurden an 50 mg vorbereiteter CNBr-aktivierter Sepharose 4B (Pharmacia) gemäß den beiliegenden Anweisungen gebunden. Nicht umgesetzte Bindungsstellen am Harz wurden in 100 nM Tris, pH 8,0, blockiert.
Tabelle der Daten zur Oligobindung
Oligo-gebundene Harze wurden in zwei Teile (~25 mg Harz jeweils) zur Poly-(rA)-Bindungsanalyse in doppelter Ausführung geteilt. Poly-(rA) Pharmacia Nr. 27-4110-01 (aufgelöst bei 28,2 A₂₆₀-Einheiten/ml in Bindungspuffer) wurden für die Bindung verwendet. Fünf (5) A₂₆₀-Einheiten wurden an doppelt vorhandene 25-mg-Teile von jedem Oligo-gebundenem Harz pro SOP QC 5543 gebunden. Ungebundenes "Durchbruch"-Poly-(rA) wurde durch A₂₆₀-Absorption quantifiziert und zur Berechnung der gebundenen verwendet. Die Weiterentwicklung des gebundenen Poly-(rA) wurde mittels Waschen mit niedergehaltigem Salzpuffer und mehreren Elutionen nachvollzogen. Wie in Tabelle 10 gezeigt funktionieren sowohl die LNA- als auch die DNA-beschichteten Kügelchen beim Einfangen von Poly-(rA)-Targetmolekülen wirksam. Die LNA-beschichteten Kügelchen binden das Poly-(rA)-Target jedoch sehr viel stärker als die DNA-beschichteten Kügelchen, wie die Poly-(rA)-Elutionsprofile der verschiedenen Kügelchen zeigen. Die Erfinder schließen daraus, dass 1) ein LNA-T9-Oligo zum Einfangen von RNA-Molekülen, die einen Abschnitt von A-Resten enthalten, wirksam ist und dass 2) die eingefangenen RNA-Moleküle sehr viel stärker an die LNA-T9-Oligokügelchen gebunden werden als an das Kontroll-DNA-T9- und -DNA-T16-Oligo.

Claims

Oligomer (nachstehend als "LNA-modifiziertes Oligonucleotid" bezeichnet), umfassend zumindest ein Nucleosidanalogon (nachstehend als "LNA" bezeichnet) der allgemeinen Formel I
worin: X ausgewählt ist aus -O-, -S-, -N(R^N*)-, -C(R⁶R^6*)-, -O-C(R⁷R^7*)-, -C(R⁶R^6*)-O-, -S-C(R⁷R^7*)-, -C(R⁶R^6*)-S-, -N(R^N*)-C(R⁷R^7*)-, -C(R⁶R^6*)-N(R^N*)- und -C(R⁶R^6*)-C(R⁷R^7*)-; B ausgewählt ist aus Wasserstoff, Hydroxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-4-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-4-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_1-4-Acyloxy, Nucleobasen, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden; P die Resteposition für eine Internucleosid-Bindung an ein folgendes Monomer oder eine 5'-terminale Gruppe, wie Internucleosid-Bindung oder 5'-terminale Gruppe, die gegebenenfalls den Substituenten R⁵ umfasst, bezeichnet; einer der Substituenten R², R³ und R^3* eine Gruppe P* ist, die eine Internucleosid-Bindung an ein vorangehendes Monomer oder eine 3'-terminale Gruppe bezeichnet; die Substituenten R^2* und R^4* zusammen ein Biradikal, ausgewählt aus -O-, -S-, -N(R*)-, (CR*R*)_r+s+1-, -(CR*R*)_r-S-(CR*R*)_s-, -(CR*R*)_r-N(R*)-(CR*R*)_s-, -O-(CR*R*)_r+s-O-, -S-(CR*R*)_r+s-O-, -O-(CR*R*)_r+s-S-, -N(R*)-(CR*R*)_r+s-O-, -O- (CR*R*)_r+s-N(R*)-, -S-(CR*R*)_r+s-S-, -N(R*)-(CR*R*)_r+s-N(R*)-, -N(R*)-(CR*R*)_r+s-S- und -S-(CR*R*)_r+s-N(R*)-, bezeichnen; worin jeder R* unabhängig voneinander aus der aus Wasserstoff, Halogen, Azido, Cyano, Nitro, Hydroxy, Mercapto, Amino, Mono- oder Di(C_1-6-alkyl)amino, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden bestehenden Gruppe ausgewählt ist und/oder zwei benachbarte (nicht geminale) R* zusammen eine Doppelbindung bezeichnen können, und jedes der r und s im Bereich von 0 bis 3 liegt, unter der Voraussetzung, dass die Summe r + s = 1–4 ergibt; jeder der Substituenten R^1*, R², R³, R^3*, R⁵, R^5*, R⁶ und R^6*, R⁷ und R^7*, die vorhanden und in P und P* nicht eingebunden sind, unabhängig voneinander aus der aus Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertem C_1-12-Alkyl, gegebenenfalls substituier tem C_2-12-Alkenyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-12-Alkinyl, Hydroxy, C_1-12-Alkoxy, C_2-12-Alkenyloxy, Carboxy, C_1-12-Alkoxycarbonyl, C_1-12-Alkylcarbonyl, Formyl, Aryl, Aryloxycarbonyl, Aryloxy, Arylcarbonyl, Heteroaryl, Heteroaryloxycarbonyl, Heteroaryloxy, Heteroarylcarbonyl, Amino, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)amino, Carbamoyl, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)aminocarbonyl, Amino-C_1-6-alkylaminocarbonyl, Mono- und Di(C_1-6-alkylamino-C_1-6-alkylaminocarbonyl, C_1-6-Alkylcarbonylamino, Carbamido, C_1-6-Alkanoyloxy, Sulfon, C_1-6-Alkylsulfonyloxy, Nitro, Azido, Sulfanyl, C_1-6-Alkylthio, Halogen, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wobei Aryl und Heteroaryl gegebenenfalls substituiert sein können und wobei zwei geminale Substituenten zusammen Oxo, Thioxo, Imino oder gegebenenfalls substituiertes Methylen bezeichnen oder zusammen ein Spiro-Biradikal bilden können, bestehend aus einer 1–5 Kohlenstoffatom(e) langen Alkylenkette, die gegebenenfalls unterbrochen und/oder durch ein(e) oder mehrere Heteroatom(e)/-gruppe(n), ausgewählt aus -O-, -S- und -(NR^N)-, terminiert ist, wobei R^N aus Wasserstoff und C_1-4-Alkyl ausgewählt ist und worin zwei benachbarte (nicht gemina le) Substituenten eine zusätzliche Bindung, die zu einer Doppelbindung führt, bezeichnen können; und R^N*, sofern er vorhanden und nicht in ein Biradikal eingebunden ist, aus Wasserstoff und C_1-4-Alkyl ausgewählt ist; und basische Salze und Säureadditionssalze davon.
Oligomer nach Anspruch 1 oder 2, umfassend 1–10.000 LNA der allgemeinen Formel I und 0–10.000 Nucleoside, ausgewählt aus natürlich vorkommenden Nucleosiden und Nucleosidanaloga, unter der Voraussetzung, dass die Summe der Anzahl der Nucleoside und die Anzahl der LNA zumindest 2, vorzugsweise zumindest 3, beispielsweise eine Summe im Bereich von 2–15.000, ergibt.
Oligomer nach Anspruch 3, worin zumindest ein LNA eine Nucleobase als Substituenten B umfasst.
Oligomer nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin einer der Substituenten R³ und R^3* P* bezeichnet.
Oligomer nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das/die LNA folgende Formel Ia aufweist/aufweisen:
worin P, P*, B, X, R^1*, R², R^2*, R³, R^3*, R^4*, R⁵ und R^5* wie in den Ansprüchen 1 bis 4 definiert sind.
Oligomer nach Anspruch 5, worin R^3* P* bezeichnet.
Oligomer nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das/die LNA folgende Formel aufweist/aufweisen:
Oligomer nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin X aus -(CR⁶R^6*)-, -O-, -S- und -N(R^N*)- ausgewählt ist.
Oligomer nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin R^3* P* bezeichnet.
Oligomer nach Anspruch 9, worin X O ist, R² aus Wasserstoff, Hydroxy und gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy ausgewählt ist und R^1*, R³, R⁵ und R^5* Wasserstoff bezeichnen.
Oligomer nach Anspruch 10, worin das Biradikal aus -O-, -(CH₂)_0-1-S-(CH₂)_1-3- und -(CH₂)_0-1-N(R)-(CH₂)_1-3- ausgewählt ist.
Oligomer nach Anspruch 11, worin das Biradikal aus -S-CH₂- und -N(R)-CH₂- ausgewählt ist.
Oligomer nach einem der Ansprüche 9 bis 12, worin B aus Nucleobasen ausgewählt ist.
Oligomer nach einem der vorangehenden Ansprüchen, worin das Oligomer zumindest ein LNA, worin B aus Adenin und Guanin ausgewählt ist, und zumindest ein LNA, worin B aus Thymin, Cytosin und Uracil ausgewählt ist, umfasst.
Oligomer nach Anspruch 10, worin das Biradikal -(CH₂)_2-4- ist.
Oligomer nach einem der Ansprüche 9 bis 15, worin ein R* aus der aus Wasserstoff, Hydroxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden bestehenden Gruppe ausgewählt ist und jegliche verbleibende Substituenten R* Wasserstoff sind.
Oligomer nach einem der Ansprüche 9 bis 16, worin eine Gruppe R* im Biradikal aus zumindest einem LNA aus der aus DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Oligomer nach einem der Ansprüche 9 bis 17, worin das/die LNA die allgemeine Formel Ia aufweist/aufweisen.
Oligomer nach Anspruch 1 der allgemeinen Formel Ia
worin: X -O- ist; B aus der aus Nucleobasen, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden bestehenden Gruppe ausgewählt ist; P die Resteposition einer Internucleosid-Bindung mit einem nachfolgenden Monomer oder eine 5'-terminale Gruppe bezeichnet, wobei solch eine Internucleosid-Bindung oder 5'-terminale Gruppe gegebenenfalls den Substituenten R⁵ umfasst; R^3* eine Gruppe P*, die eine Internucleosid-Bindung an ein vorangehendes Monomer bezeichnet, oder eine 3'-terminalen Gruppe ist; R^2* und R^4* in Anspruch 1 definiert sind; und basische Salze und Säureadditionssalze davon.
Oligomer nach Anspruch 19, worin ein R* aus der aus Wasserstoff, Hydroxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy; gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden bestehenden Gruppe ausgewählt ist und jegliche verbleibende Substituenten R* Wasserstoff sind.
Oligomer nach Anspruch 19 oder 20, worin das Biradikal aus -O-, -(CH₂)_0-1-S-(CH₂)_1-3-, -(CH₂)_0-1-N(R)-(CH₂)_1-3- und -(CH₂)_2-4- ausgewählt ist.
Oligomer nach Anspruch 21, worin das Biradikal aus -O-CH₂-, -S-CH₂- und -N(R)-CH₂- ausgewählt ist.
Oligomer nach einem der Ansprüche 19 bis 22, worin B aus Nucleobasen ausgewählt ist.
Oligomer nach Anspruch 23, worin das Oligomer zumindest ein LNA, worin B aus Adenin und Guanin ausgewählt ist, und zumindest ein LNA, worin B aus Thymin, Cytosin und Uracil ausgewählt ist, umfasst.
Oligomer nach einem der Ansprüche 19 bis 24, worin R² aus Wasserstoff, Hydroxy und gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy ausgewählt ist und R^1*, R³, R⁵ und R^5* Wasserstoff bezeichnen.
Oligomer nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin jede Internucleosid-Bindung des/der LNA aus Bindungen ausgewählt ist, die aus 2 bis 4, vorzugsweise 3, Gruppen/Atomen, ausgewählt aus -CH₂-, -O-, -S-, -NR^H-, >C=O, >C=NR^H, >C=S, Si(R'')₂-, -SO-, -S(O)₂-, -P(O)₂-, -P(O,S)-, -P(S)₂-, -PO(R'')-, -PO(OCH₃)- und -PO(NHR^H)-, bestehen, worin R^H aus Wasserstoff und C_1-4-Alkyl und R^H aus C_1-6-Alkyl und Phenyl ausgewählt ist.
Oligomer nach Anspruch 26, worin jede Internucleosid-Bindung des/der LNA aus -CH₂-CH₂-CH₂-, -CH₂-CO-CH₂-, -CH₂-CHOH-CH₂-, -O-CH₂-O-, -O-CH₂-CH₂-, -O-CH₂-CH=, -CH₂-CH₂-O-, -NR^H-CH₂-CH₂-, -CH₂-CH₂-NR^H-, -CH₂-NR^H-CH₂-, -O-CH₂-CH₂-NR^H-, -NR^H-CO-O-, -NR^H-CO-NR^H-, -NR^H-CS-NR^H-, -NR^H-C(=NR^H)-NR^H-, -NR^H-CO-CH₂-NR^H-, -O-CO-O-, -O-CO-CH₂-O-, -O-CH₂-CO-O-, -CH₂-CO-NR^H-, -O-CO-NR^H-, -NR^H-CO-CH₂, -O-CH₂-CO-NR^H-, -O-CH₂-CH₂-NR^H-, -CH=N-O-, -CH₂-CNR^H-O-, -CH₂-O-N=, -CH₂-O-NR^H-, -CO-NR^H-CH₂-, -CH₂-NR^H-O-, -CH₂-NR^H-CO-, -O-NR^H-CH₂-, -O-NR^H-, -O-CH₂-S-, -S-CH₂-O-, -CH₂-CH₂-S-, -O-CH₂-CH₂-S-, -S-CH₂-CH=, -S-CH₂-CH₂-, -S-CH₂-CH₂-O-, -S-CH₂-CH₂-S-, -CH₂-S-CH₂-, -CH₂-SO-CH₂-, -CH₂SO₂-CH₂-, -O-SO-O-, -O-S(O)₂-O-, -O-S(O)₂-CH₂-, -O-S(O)₂-NR^H-, -NR^H-S(O)₂-CH₂-, -OS(O)₂-CH₂-, -O-P(O)₂-O-, -O-P(O,S)-O-, O-P(S)₂-O-, -S-P(O)₂-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)₂-O-, -O-P(O)₂-S-, -O-P(O,S)-S-, -O-P(S)₂-S-, -S-P(O)₂-S-, -S-P(O,S)-S-, -S-P(S)₂-S-, -O-PO(R'')-O-, -O-PO(OCH₃)-O-, -O-PO(BH₃)-O-, -O-PO(NHR^N)-O-, -O-P(O)₂-NR^H-, -NR^H-P(O)₂-O-, -O-P(O,NR^H)-O-, und O-Si(R'')₂-O-. ausgewählt ist.
Oligomer nach Anspruch 27, worin jede Internucleosid-Bindung des/der LNA aus -CH₂-CO-NR^H-, -CH₂-NR^H-O-, -S-CH₂-O-, -O-P(O)₂-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)₂-O-, -NR^H-P(O)₂-O-, -O-P(O,NR^H)-O-, -O-PO(R'')-O-, -O-PO(CH₃)-O- und -OPO(NHR^N)-O- ausgewählt ist, worin R^H aus Wasserstoff und C_1-4-Alkyl und R'' aus C_1-6-Alkyl und Phenyl ausgewählt ist.
Oligomer nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin jeder der Substituenten R^1*, R², R^2*, R³, R^3*, R^4*, R⁵, R^5*, R⁶, R^6*, R⁷ und R^7* des/der LNA, die vorhanden sind und in P, P* oder dem/den Biradikal(en) nicht eingebunden sind, unabhängig voneinander aus der aus Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyl, Hydroxy, C_1-6-Alkoxy, C_2-6-Alkenyloxy, Carboxy, C_1-6-Alkoxycarbonyl, C_1-6-Alkylcarbonyl, Formyl, Amino, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)amino, Carbamoyl, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)aminocarbonyl, C_1-6-Alkylcarbonylamino, Carbamido, Azido, C_1-6-Alkanoyloxy, Sulfon, Sulfanyl, C_1-6-Alkylthio, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden und Halogen bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wobei zwei geminale Substituenten zusammen Oxo bezeichnen können und worin R^N*, sofern vorhanden und nicht in ein Biradikal eingebunden, aus Wasserstoff und C_1-4-Alkyl ausgewählt ist.
Oligomer nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin X aus -O-, -S- und -N(R^N*)- ausgewählt ist und jeder der Substituenten R^1*, R², R³, R^3*, R⁵, R^5* R⁶, R^6*, R⁷ und R^7* des/der LNA, die vorhanden sind und in P, P* oder dem/den Biradikal(en) nicht eingebunden sind, Wasserstoff bezeichnet.
Oligomer nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin P eine 5'-terminale Gruppe ist, ausgewählt aus Wasserstoff, Hydroxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkylcarbonyloxy, gegebenenfalls substituiertem Aryloxy, Monophosphat, Di phosphat, Triphosphat und -W-A', worin W aus -O-, -S- und -N(R^H)-, wobei R^H aus Wasserstoff und C_1-6-Alkyl ausgewählt ist, und A' aus DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden ausgewählt ist.
Oligomer nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin P* eine 3'-terminale Gruppe ist, ausgewählt aus Wasserstoff, Hydroxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkylcarbonyloxy, gegebenenfalls substituiertem Aryloxy und -W-A', worin W aus -O-, -S- und -N(R^H)-, wobei R^H aus Wasserstoff und C_1-6-Alkyl ausgewählt ist, und A' aus DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden ausgewählt ist.
Oligomer nach einem der vorangehenden Ansprüche, das folgende Formel V aufweist: G-[Nu-L]_n(0)-{[LNA-L]_m(q)-[Nu-L]_n(q)}_q-G* Vworin: q = 1–50 ist; jedes von n(0), ..., n(q) unabhängig voneinander 0–10.000 ist; jedes von m(1), ..., m(q) unabhängig voneinander 1–10.000 ist; unter der Voraussetzung, dass die Summe von n(0), ..., n(q) und m(1), ..., m(q) 2–15.000 ergibt; G eine 5'-terminale Gruppe bezeichnet; jedes der Nu unabhängig voneinander ein aus natürlich vorkommenden Nucleosiden und Nucleosidanaloga ausgewähltes Nucleosid bezeichnet; jedes LNA unabhängig voneinander ein Nucleosidanalogon bezeichnet; jedes L unabhängig voneinander eine Internucleosid-Bindung zwischen zwei Gruppen, ausgewählt aus Nu und LNA, bezeichnet oder L zusammen mit G* eine 3'-terminale Gruppe bezeichnet; und jedes LNA-L unabhängig voneinander ein Nucleosidanalogon der allgemeinen Formel I bezeichnet:
worin die Substituenten B, P, P*, R^1*, R², R^2*, R³, R^4*, R⁵ und R^5* und X in den Ansprüchen 1 bis 32 definiert sind.
Oligomer nach einem der vorangehenden Ansprüchen, weiters umfassend ein PNA-Mono- oder -Oligomersegment der Formel
worin B wie für obige Formel I definiert ist, AASC Wasserstoff oder eine Aminosäureseitenkette bezeichnet, t = 1–5 und w = 1–50 ist.
Oligomer nach einem der vorangehenden Ansprüche, (a) das im Vergleich mit nativem Oligonucleotid eine erhöhte Spezifität gegenüber komplementärer ssRNA oder ssDNA aufweist; oder (b) das im Vergleich mit nativem Oligonucleotid eine erhöhte Affinität gegenüber komplementärer ssRNA oder ssDNA aufweist; oder (c) das in der Lage ist, an eine Zielsequenz in einem dsDNA- oder dsRNA-Molekül durch "Strangverschiebung" oder durch Bildung einer Tripelhelix zu binden; oder (d) das gegen Nucleasen resistenter ist als das native Oligonucleotid; oder (e) das Nucleinsäure-katalytische Aktivität aufweist(LNA-modifizierte Ribozyme).
Oligomer, umfassend zumindest ein bi- oder trizyklisches Nucleosidanalogon, das dem Oligomer eine Schmelztemperatur (Tm) mit einem komplementären DNA-Oligonucleotid verleiht, die zumindest 2,5°C höher als jene des entsprechenden, nicht modifizierten Vergleichs-Oligonucleotids ist, das kein Nucleosidanalogon umfasst.
Oligomer nach Anspruch 36, worin die Tm zumindest 2,5 × N°C höher ist, wobei N die Anzahl an Nucleosidanaloga ist.
Oligomer, umfassend zumindest ein bi- oder trizyklisches Nucleosidanalogon, das dem Oligomer eine Tm mit einem komplementären RNA-Oligonucleotid verleiht, die zumindest 4,0°C höher als jene des entsprechenden, nicht modifizierten Vergleichs-Oligonucleotids ist, das kein Nucleosidanalogon umfasst.
Oligomer nach Anspruch 38, worin die Tm zumindest 4,0 × N°C höher ist, wobei N die Anzahl der Nucleosidanaloga ist.
Oligomer nach einem der Ansprüche 36 bis 39, worin das Oligomer wie in einem der Ansprüche 1 bis 35 definiert ist, wobei das zumindest eine Nucleosidanalogon die Formel I aufweist, worin B eine Nucleobase ist.
Oligomer nach einem der Ansprüche 36 bis 39, worin das Oligomer, wenn es mit einem teilweise komplementären DNA-Oligonucleotid, das eine oder mehrere fehlende Übereinstimmung(en) mit obigem Oligomer aufweist, hybridisiert wird, eine Reduktion der Tm als Resultat der genannten fehlenden Übereinstimmungen aufweist, die gleich der oder höher als die Reduktion ist, die im Falle des entsprechenden, nicht modifizierten Vergleichs-Oligonucleotids beobachtet werden würde, das keinerlei Nucleosidanaloga umfasst.
Oligomer nach einem der Ansprüche 36 bis 39, (a) das im Wesentlichen dieselbe Empfindlichkeit der Tm gegenüber der Ionenstärke des Hybridisierungspuffers aufweist wie jene des entsprechenden, nicht modifizierten Vergleichs-Oligonucleotids; oder (b) das zumindest zu 30% modifiziert ist; oder (c) das eine wesentlich höhere 3'-exonucleolytische Stabilität aufweist als jene des entsprechenden, nicht modifizierten Vergleichs-Oligonucleotids.
Oligomer nach Anspruch 1, umfassend ein 2'-Thio-LNA-Monomer, das den Nucleotiden aus der Formel U^S, entspricht, die der Formel Z aus 2 entspricht, worin die Methylenoxy-Brücke durch eine Methylenthio-Brücke substituiert wurde.
Oligomer nach Anspruch 43, das aus der aus 5'-d(GTGAU^SATGC)-3', 5'-d(GU^SGAU^SAU^SGC)-3' und 5'-d(GU^SGU^SU^SU^SU^SGC)-3' bestehenden Gruppe ausgewählt ist, worin die LNA-Monomere fettgedruckt und Nucleotide der Formel U^S sind, die die Thio-Variante der Formel Z aus 2 ist.
Oligomer nach Anspruch 1, umfassend ein 2'-Amino-LNA-Monomer, entsprechend dem Nucleotid der Formel T^NH oder T^NMe, die der Formel Z aus 2 entsprechen, worin die Methylenoxy-Brücke durch eine Methylenamino-Brücke bzw. Methylen-(N-methyl)amino-Brücke substituiert wurde.
Oligomer nach Anspruch 45, das aus der aus 5'-d(GTGAT^NHATGC)-3', 5'-d(GTGAT^NHATGC)-3', 5'-d(GT^NHGAT^NHAT^NHGC)-3', 5'-d(GT^NHGAT^NHAT^NHGC)-3', 5'-d(GTGAT^NMeATGC)-3', 5'-d(GTGAT^NMeATGC)-3', 5'-d(GT^NMeGAT^NMeAT^NMeGC)-3', 5'-d(GT^NMeGAT^NMeAT^NMeGC)-3', 5'd(GT^NMeGT^NHT^NMeT^NHT^NMeGC)-3', und 5'-d(GT^NMeGT^NHT^NMeT^NHT^NMeGC)-3' bestehenden Gruppe ausgewählt ist, worin das fettgedruckte LNA-Monomer ein Amino-Z-(T^NH-) oder ein Methylamino-Z-(T^NMe-) Monomer ist.
Oligomer nach Anspruch 1, worin das LNA das (1S,3R,4R,7S)-7-Hydroxy-1-hydroxymethyl-3-(thymin-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan-, (1S,3R,4R,7S)-7-Hydroxy-1-Hydroxymethyl-3-(cytosin-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan-, (1S,3R,4R,7S)-7-Hydroxy-1-Hydroxymethyl-3-(uracil-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan-, (1S,3R,4R,7S)-7-Hydroxy-1-Hydroxymethyl-3-(guanin-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan- oder (1S,3R,4R,7S)-7-Hydroxy-1-Hydroxymethyl-3-(adenin-1-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan-Gerüst aufweist und worin die Methylen-Brücke durch Methylenthio oder Methylenamin substituiert wurde.
Oligomer nach Anspruch 1, das ein durchwegs Monothiophosphat enthaltendes Oligonucleotid ist.
LNA-modifiziertes Oligonucleotid (Oligomer), wie es in einem der vorangehenden Ansprüche definiert ist, gebunden an eine aus der aus Proteinen, Ampliconen, Enzymen, Polysacchariden, Antikörpern, Haptenen, Peptiden und PNA bestehenden Gruppe ausgewählten Verbindung.
Nucleosidanalogon (nachstehend als LNA bezeichnet) der allgemeinen Formel II:
worin: X ausgewählt ist aus -O-, -S-, -N(R^N*)-, -C(R⁶R^6*)-, -O-C(R⁷R^7*)-, CR(R⁶R^6*)-O-, -S-C(R⁷R^7*)-, -C(R⁶R^6*)-S-, -N(R^N*)-C(R⁷R^7*)-, -C(R⁶R^6*)-N(R^N*)- und -C(R⁶R^6*)-C(R⁷R^7*)-; B ausgewählt ist aus Wasserstoff, Hydroxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-4-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-4-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_1-4-Acyloxy, Nucleobasen, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden; einer der Substituenten R², R³ und R^3* eine Gruppe Q* ist; jedes Q und Q* unabhängig voneinander aus Wasserstoff, Azido, Halogen, Cyano, Nitro, Hydroxy, Prot-O-, Act-O-, Mercapto, Prot-S-, Act-S-, C_1-6-Alkylthio, Amino, Prot-N(R^H)-, Act-N(R^H)-, Mono- oder Di(C_1-6-alkyl)amino, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyloxy, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkinyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkinyloxy, Monophosphat, Diphosphat, Triphosphat, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen, Liganden, Carboxy, Sulfon, Hydroxymethyl, Prot-O-CH₂-, Act-O-CH₂-, Aminomethyl, Prot-N(R^H)-CH₂-, Act-N(R^H)-CH₂-, Carboxymethyl und Sulfonmethyl ausgewählt ist, wobei Prot eine Schutzgruppe für -OH, -SH bzw. -NH(R^H) ist, Act eine Aktivierungsgruppe für -OH, -SH bzw. -NH(R^H) ist und R^H aus Wasserstoff und _C1-6-Alkyl ausgewählt ist; R^2* und R^4* zusammen ein Biradikal bezeichnen, ausgewählt aus -O-, -S-, -N(R^*)-, -(CR^*R^*)_r+s+1-, -(CR^*R^*)_r-S-(CR^*R^*)_s-, -(CR^*R^*)_r-N(R^*)-(CR^*R^*)_s-, -O-(CR^*R^*)_r+s-O-, -S-(CR^*R^*)_r+s-O-, -O-(CR^*R^*)_r+s-S-, -N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-O-, -O-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)-, -S-(CR^*R^*)_r+s-S-, -N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)-, -N(R^*)-(CR^*R^*)_r+s-S-, und -S-(CR^*R^*)_r+s-N(R^*)-; worin jeder R* unabhängig voneinander aus Wasserstoff, Halogen, Azido, Cyano, Nitro, Hydroxy, Mercapto, Amino, Mono- oder Di(C_1-6-alkyl)amino, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden ausgewählt ist und/oder zwei benachbarte (nicht geminale) R* zusammen eine Doppelbindung bezeichnen können und jeder Wert von r und s = 0–3 ausmacht, unter der Voraussetzung, dass die Summe r + s = 1–4 ergibt; jeder der Substituenten R^1*, R², R³, R^3*, R⁵ und R^5*, die nicht in Q oder Q* eingebunden sind, unabhängig voneinander aus Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertem C_1-12-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-12-Alkenyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-12-Alkinyl, Hydroxy, C_1-12-Alkoxy, C_2-12-Alkenyloxy, Carboxy, C_1-12-Alkoxycarbonyl, C_1-12-Alkylcarbonyl, Formyl, Aryl, Aryloxycarbonyl, Aryloxy, Arylcarbonyl, Heteroaryl, Heteroaryloxycarbony, Heteroaryloxy, Heteroarylcarbonyl, Amino, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)amino, Carbamoyl, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)aminocarbonyl, Amino-C_1-6-alkylaminocarbonyl, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)amino-C_1-6-alkylaminocarbonyl, C_1-6-Alkylcarbonylamino, Carbamido, C_1-6-Alkanoyloxy, Sulfon, C_1-6-Alkylsulfonyloxy, Nitro, Azido, Sulfanyl, C_1-6-Alkylthio, Halogen, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden ausgewählt ist, wobei Aryl und Heteroaryl gegebenenfalls substituiert sein können und wobei zwei geminale Substituenten zusammen Oxo, Thioxo, Imino oder gegebenenfalls substituiertes Methylen bezeichnen können oder gemeinsam ein Spiro-Biradikal, bestehend aus einer 1–5 Kohlenstoffatom(en) langen Alkylenkette, die gegebenenfalls unterbrochen und/oder durch ein(e) oder mehrere Heteroatom(e)/-gruppe(n), ausgewählt aus -O-, -S- und -(NR^N)-, terminiert ist, worin R^N aus Wasserstoff und C_1-4-Alkyl ausgewählt ist, und worin zwei benachbarte (nicht geminale) Substituenten eine zusätzliche Bindung, die zu einer Doppelbindung führt, bezeichnen können; und R^N*, wenn er vorhanden und nicht in ein Biradikal eingebunden ist, aus Wasserstoff und C_1-4-Alkyl ausgewählt ist; und basische Salze und Säureadditionssalze davon; und worin jede chemische Gruppe (umfassend jede Nucleobase), die unter den bei Oligonucleotid-Synthese vorherrschenden Bedingungen reaktiv ist, gegebenenfalls durch eine funktionelle Gruppe geschützt ist.
Nucleosidanalogon nach Anspruch 50, worin die Gruppe B aus Nucleobasen und durch funktionellen Gruppen geschützte Nucleobasen ausgewählt ist.
Nucleosidanalogon nach Anspruch 50 oder 51, worin X aus -O-, -S- und -N(R^N*)- ausgewählt ist.
Nucleosidanalogon nach einem der Ansprüche 50 bis 52, worin jeder der Substituenten R^1*, R², R³, R^3*, R⁵ und R^5*, die vorhanden und in Q oder Q* nicht eingebunden sind, unabhängig voneinander aus Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyl, Hydroxy, C_1-6-Alkoxy, C_2-6-Alkenyloxy, Carboxy, C_1-6-Alkoxycarbonyl, C_1-6-Alkylcarbonyl, Formyl, Amino, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)amino, Carbamoyl, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)aminocarbonyl, C_1-6-Alkylcarbonylamino, Carbamido, C_1-6-Alkanoyloxy, Sulfon, Sulfanyl, C_1-6-Alkylthio, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen, Liganden und Halogen ausgewählt ist, worin zwei geminale Substituenten zusammen Oxo bezeichnen können, und worin R^N*, wenn er vorhanden und nicht in einem Biradikal eingebunden ist, aus Wasserstoff und C_1-6-Alkyl ausgewählt ist, unter der Voraussetzung, dass jegliches Hydroxy, Amino, Mono(C_1-6-alkyl)amino, Sulfanyl und Carboxy gegebenenfalls geschützt ist.
Nucleosidanalogon nach einem der Ansprüche 50 bis 53, worin jeder der Substituenten R^1*, R², R³, R^3* und R⁵, R^5*, R⁶, R^6*, die vorhanden sind und in Q* nicht eingebunden sind, Wasserstoff bezeichnen.
Nucleosidanalogon nach einem der Ansprüche 50 bis 54, worin R^3* Q* bezeichnet.
Nucleosidanalogon nach einem der Ansprüche 50 bis 55, worin: Q unabhängig aus Wasserstoff, Azido, Halogen Cyano, Nitro, Hydroxy, Prot-O-, Mercapto, Prot-S-, C_1-6-Alkylthio, Amino, Prot-N(R^H)-, Mono- oder Di(C_1-6-alkyl)amino, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyloxy, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkinyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkinyloxy, Monophosphat, Diphosphat, Triphosphat, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen, Liganden, Carboxy, Sulfon, Hydroxymethyl, Prot-O-CH₂-, Aminomethyl, Prot-N(R^H)-CH₂-, Carboxymethyl und Sulfonmethyl ausgewählt ist, wobei Prot eine Schutzgruppe für -OH, -SH bzw. -NH(R^H) ist und R^H aus Wasserstoff und C_1-6-Alkyl ausgewählt ist; und Q* unabhängig aus Wasserstoff, Azido, Halogen Cyano, Nitro, Hydroxy, Act-O-, Mercapto, Act-S-, C_1-6-Alkylthio, Amino, Act-N(R^H)-, Mono- oder Di(C_1-6-alkyl)amino, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyloxy, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkinyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkinyloxy, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen, Liganden, Carboxy und Sulfon ausgewählt ist, wobei Act eine Aktivierungsgruppe für -OH, -SH bzw. -NH(R^H) ist und R^H aus Wasserstoff und C_1-6-Alkyl ausgewählt ist.
Nucleosidanalogon nach einem der Ansprüche 50 bis 56 mit der allgemeinen Formel IIa:
worin die Substituenten Q, B, R^1*, R², R^2*,R³, R^3*, R^4*, R⁵ und R^5* in einem der Ansprüche 53 bis 59 definiert sind.
Nucleosidanalogon nach einem der Ansprüche 50 bis 56 mit der allgemeinen Formel:
Nucleosidanalogon nach Anspruch 57 oder 58, worin R^3* Q* bezeichnet.
Nucleosidanalogon nach einem der Ansprüche 57 bis 59, worin X O ist, R² aus Wasserstoff, Hydroxy und gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy ausgewählt ist und R¹, R³, R⁵ und R^5* Wasserstoff bezeichnen.
Nucleosidanalogon nach Anspruch 60, worin das Biradikal aus -O-, -(CH₂)_0-1-S-(CH₂)_1-3- und -(CH₂)_0-1-N(R)-(CH₂)_1-3- ausgewählt ist.
Nucleosidanalogon nach Anspruch 61, worin das Biradikal aus -S-CH₂- und -N(R)-CH₂- ausgewählt ist.
Nucleosidanalogon nach einem der Ansprüche 59 bis 62, worin B aus Nucleobasen ausgewählt ist.
Nucleosidanalogon nach Anspruch 63, worin das Oligomer zumindest ein LNA, worin B aus Adenin und Guanin ausgewählt ist, und zumindest ein LNA, worin B aus Thymin, Cytosin und Uracil ausgewählt ist, umfasst.
Nucleosidanalogon nach Anspruch 60, worin das Biradikal -(CH₂)_2-4-, vorzugsweise -(CH₂)₂-, ist.
Nucleosidanalogon nach einem der Ansprüche 58 bis 65, worin ein R* aus Wasserstoff, Hydroxy gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden ausgewählt ist und jegliche verbleibenden Substituenten R* Wasserstoff sind.
Nucleosidanalogon nach einem der Ansprüche 58 bis 66, worin eine Gruppe R* im Biradikal von zumindest einem LNA aus DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden ausgewählt ist.
Nucleosidanalogon nach einem der Ansprüche 58 bis 67, worin das/die LNA die allgemeine Formel Ia aufweist/aufweisen.
Nucleosidanalogon nach Anspruch 50 mit der allgemeinen Formel IIa
worin: X -O- ist; B ausgewählt ist aus Nucleobasen, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden; R^3* eine Gruppe Q* ist; jedes Q und Q* unabhängig voneinander aus Wasserstoff, Azido, Halogen, Cyano, Nitro, Hydroxy, Prot-O-, Act-O-, Mercapto, Prot-S-, Act-S-, C_1-6-Alkylthio, Amino, Prot-N(R^H)-, Act-N(R^H)-, Mono- oder Di(C_1-6-alkyl)amino, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyloxy, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkinyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkinyloxy, Monophosphat, Diphosphat, Triphosphat, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen, Liganden, Carboxy, Sulfon, Hydroxymethyl, Prot-O-CH₂-, Act-O-CH₂-, Aminomethyl, Prot-N(R^H)-CH₂-, Act-N(R^H)-CH₂-, Carboxymethyl und Sulfonmethyl ausgewählt ist, wobei Prot eine Schutzgruppe für -OH, -SH bzw. -NH(R^H) ist, Act eine Aktivierungsgruppe für -OH, -SH bzw. -NH(R^H) ist und R^H aus Wasserstoff und C_1-6-Alkyl ausgewählt ist; R^2* und R^4* zusammen ein Biradikal bezeichnen, ausgewählt aus -O-, -S-, -N(R*)-, -(CR*R*)_r+s+1-, -(CR*R*)_r-S-(CR*R*)_s-, -(CR*R*)_r-N(R*)-(CR*R*)_s-, -O-(CR*R*)_r+s-O-, -S-(CR*R*)_r+s-O-, -O-(CR*R*)_r+s-S-, -N(R*)-(CR*R*)_r+s-O-, -O-(CR*R*)_r+s-N(R*)-, -S-(CR*R*)_r+s-S-, -N(R*)-(CR*R*)_r+s-N(R*)-, -N(R*)-(R*R*)_r+s-S-, und -S-(CR*R*)_r+s-N(R*)-; worin jeder R* unabhängig voneinander aus Wasserstoff, Halogen, Azido, Cyano, Nitro, Hydroxy, Mercapto, Amino, Mono- oder Di(C_1-6-alkyl)amino, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden ausgewählt ist und/oder zwei benachbarte (nicht geminale) R* zusammen eine Doppelbindung bezeichnen können und jeder Wert von r und s = 0–3 ausmacht, unter der Voraussetzung, dass die Summe r + s = 1–4 ergibt; jeder der Substituenten R^1*, R², R³, R⁵ und R^5* unabhängig voneinander aus Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyl, Hydroxy, C_1-6-Alkoxy, C_2-6-Alkenyloxy, Carboxy, C_1-6-Alkoxycarbonyl, C_1-6-Alkylcarbonyl, Formyl, Amino, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)amino, Carbamoyl, Mono- und Di(C_1-6-alkyl)aminocarbonyl, C_1-6-Alkylcarbonylamino, Carbamido, Azido, C_1-6-Alkanoyloxy, Sulfon, Sulfanyl, C_1-6-Alkylthio, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen, Liganden und Halogen ausgewählt ist, wobei zwei geminale Substituenten zusammen Oxo bezeichnen können; und basische Salze und Säureadditionssalze davon; und mit der Voraussetzung, dass jede chemische Gruppe (umfassend jede Nucleobase), die unter den bei Oligonucleotid-Synthese vorherrschenden Bedingungen reaktiv ist, gegebenenfalls durch eine funktionelle Gruppe geschützt ist.
Nucleosidanalogon nach Anspruch 69, worin ein R* aus Wasserstoff, Hydroxy, gegebenenfalls subbtituiertem C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelat bildenden Gruppen, Reportergruppen und Liganden ausgewählt ist und jeder verbleibende Substituent R* Wasserstoff ist.
Nucleosidanalogon nach Anspruch 69 oder 70, worin das Biradikal aus -O-, -(CH₂)_0-1-S-(CH₂)_1-3-, -(CH₂)_0-1-N(R)-(CH₂)_1-3- und -(CH₂)_2-4- ausgewählt ist.
Nucleosidanalogon nach Anspruch 71, worin das Biradikal aus -S-CH₂- und -N(R)-CH₂- ausgewählt ist.
Nucleosidanalogon nach einem der Ansprüche 69 bis 72, worin B aus Nucleobasen ausgewählt ist.
Nucleosidanalogon nach Anspruch 73, worin das Oligomer zumindest ein LNA, worin B aus Adenin und Guanin ausgewählt ist, und zumindest ein LNA, worin B aus Thymin, Cytosin und Uracil ausgewählt ist, umfasst.
Nucleosidanalogon nach Anspruch 69, worin B eine Nucleobase bezeichnet, X -O- ist, R^2* und R^4* zusammen ein Biradikal bezeichnen, ausgewählt aus -(CH₂)_0-1-S-(CH₂)_1-3- und -(CH₂)_0-1-N(R^N)-(CH₂)_1-3-, worin R^N aus Wasserstoff und C_1-4-Alkyl ausgewählt ist, Q Prot-O- bezeichnet, R^3* Q* ist, das Act-OH bezeichnet, und R^1*, R², R³, R⁵ und R^5* jeweils Wasserstoff bezeichnen, worin Act und Prot wie in Anspruch 56 definiert sind.
Nucleosidanalogon nach Anspruch 75, worin B eine Nucleobase bezeichnet, X -O- ist, R^2* und R^4* zusammen ein Biradikal bezeichnen, ausgewählt aus -(CH₂)_0-1-S-(CH₂)_1-3- und -(CH₂)_0-1-N(R^N)-(CH₂)_1-3-, worin R^N aus Wasserstoff und C_1-4-Alkyl ausgewählt ist, Q aus Hydroxy, Mercapto, C_1-6-Alkylthio, Amino, Mono- oder Di(C_1-6-alkyl)amino, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyloxy, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkinyloxy, Monophosphat, Diphosphat und Triphosphat ausgewählt ist, R^3* Q* ist, das aus Wasserstoff, Azido, Halogen, Cyano, Nitro, Hydroxy, Mercapto, C_1-6-Alkylthio, Amino, Mono- oder Di(C_1-6-alkyl)amino, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyloxy, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkinyl und gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkinyloxy ausgewählt ist, R³ aus Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkenyl und gegebenenfalls substituiertem C_2-6-Alkinyl ausgewählt ist und R^1*, R², R⁵ und R^5* jeweils Wasserstoff bezeichnen.
Nucleosidanalogon nach einem der Ansprüche 50 bis 76, worin die Aktivierungsgruppe Act-O- aus der aus gegebenenfalls substituiertem O-Phosphoramidit, gegebenenfalls substituiertem O-Phosphortriester, gegebenenfalls substituiertem O-Phosphordiester, gegebenenfalls substituiertem H-Phosphonat und gegebenenfalls substituiertem O-Phosphonat bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Nucleosidanalogon nach Anspruch 77, worin die Aktivierungsgruppe Act-O-O-Phosphoramidit der Formel -O-P(OR^X)-N(R^Y)₂ ist, worin R^X eine gegebenenfalls substituierte Alkylgruppe bezeichnet und jeder der R^Y gegebenenfalls substituierte Alkylgruppen bezeichnet oder die Gruppe -N(R^Y)₂ eine Morpholinogruppe (-N(CH₂CH₂)₂O) bildet.
Nucleosidanalogon nach Anspruch 78, worin R^X 2-Cyanoethyl bezeichnet und die zwei R^Y identisch sind und Isopropyl(N,N-diisopropyl-O-(2-cyanoethyl)phosphoramidit) bezeichnen.
Nucleosidanalogon nach Anspruch 78, das aus 1-(2-Amino-3-(O-(2-cyanoethoxy(diisopropylamino)phosphino]-2-deoxy-5-O-4,4'-dimethoxytrityl-2-N,4-C-methylen-2-N-trifluoracetyl-β-D-ribofuranosyl)thymin, 1-(3-O-(2-Cyanoethoxy(diisopropylamino)phosphino)-2-deoxy-5-O-4,4'-dimethoxytrityl-2-methylmino-2-N,4-C-methylen-β-D-ribofuranosyl)thymin, 1-(3-O-(2-Cyanoethoxy(diisopropylamino)phosphino)-(2-deoxy-5-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2-mercapto-2-S,4-C-methylen-β-D-ribofuranosyl)uracil ausgewählt ist.
Verfahren zur Herstellung linearer, verzweigter und ringförmiger Oligo- und Polynucleotide nach einem der Ansprüche 1 bis 49, wobei das Verfahren ein Poly- merisationsverfahren der Nucleinsäure-Chemie, ausgewählt aus Phosphoramidit-Chemie, H-Phosphonat-Chemie, Phosphortriester-Chemie oder enzymatischer Synthese umfasst.
Verfahren zur Synthese eines durchwegs Thiophosphat enthaltenden LNA-Oligomers unter Einsatz von Standardverfahren durch Austauschen der normalen Iod/Pyridin/H₂O-Oxidation, die zur Synthese von Phosphordiester-Oligomeren verwendet wird, durch eine Oxidation mittels des Beaucage-Reagens unter stufenweisem Koppeln.
Verwendung eines wie in einem der Ansprüche 50 bis 82 definierten LNA zur Herstellung eines LNA-modifizierten Oligonucleotids (eines Oligomers) nach einem der Ansprüche 1 bis 49.
Verwendung nach Anspruch 83, worin das LNA-modifizierte Oligonucleotid normale Nucleoside, wie Ribonucleoside und/oder Dioxyribonucleoside, sowie modifizierte Nucleoside, die sich von jenen in den Ansprüchen 50 bis 82 definierten unterscheiden, umfasst.
Verwendung nach Anspruch 84, worin das LNA-modifizierte Oligonucleotid durch Festphasen- und/oder Lösungsphasensynthese hergestellt wird.
Verwendung nach Anspruch 83, worin die Inkorporation von LNA die Fähigkeit des Oligonucleotids moduliert, als ein Substrat für Nucleinsäure-aktive Enzyme zu agieren.
Verwendung eines in einem der Ansprüche 50 bis 80 definierten LNA zur Herstellung eines Konjugats aus einem LNA-modifizierten Oligonucleotid und einer aus Proteinen, Ampliconen, Enzymen, Polysacchariden, Antikörpern, Haptenen, Peptiden und PNA ausgewählten Verbindung.
Verwendung eines in einem der Ansprüche 50 bis 80 definierten LNA als ein Substrat für an Nucleinsäuren aktive Enzyme.
Verwendung nach Anspruch 88, worin der Substituent Q in der Formel 1 in Anspruch 62 ein Triphosphat bezeichnet oder worin das LNA als ein Substrat für DNA- und RNA-Polymerasen eingesetzt wird.
LNA, wie in einem der Ansprüche 50 bis 80 definiert, oder LNA-modifiziertes Oligonucleotid, wie in einem der Ansprüche 1 bis 49 definiert, für den Einsatz als Therapeutikum oder für diagnostische Zwecke.
LNA für den Einsatz als Therapeutikum nach Anspruch 90, worin das LNA für den Einsatz als ein Antisense-, Antigen- oder Gen-aktivierendes Therapeutikum oder als ein Aptamer für therapeutische Anwendungszwecke vorgesehen ist.
LNA für den Einsatz als Therapeutikum nach Anspruch 91, worin das LNA-modifizierte Oligonucleotid RNAseH rekrutiert oder das LNA-modifizierte Oligonucleotid zumindest eine Internucleosid-Bindung umfasst, die keine Phosphat-Diester-Bindung ist.
Festes Trägermaterial, auf dem ein gegebenenfalls Nucleobase-geschütztes und gegebenenfalls 5'-OH-geschütztes LNA immobilisiert ist.
Verwendung eines oder mehrerer LNA, wie in einem der Ansprüche 50 bis 80 definiert, bei der Herstellung einer festen Oberfläche, auf die LNA-modifizierte Oligonucleotide unterschiedlicher Sequenzen gebunden werden.
Verwendung nach Anspruch 94, worin: (a) die LNA-modifizierte Oligonucleotide in einem vorbestimmten Muster gebunden werden; oder (b) die LNA eingesetzt werden, um die Tm der entsprechenden, nicht modifizierten Vergleichs-Oligonucleotide auszugleichen; oder (c) die LNA-modifizierten Oligonucleotide im Vergleich zu nativem Oligonucleotid eine erhöhte Affinität gegenüber komplementärer ssDNA oder ssRNA aufweisen; oder (d) die LNA-modifizierten Oligonucleotide im Vergleich zu nativem Oligonucleotid eine erhöhte Spezifität gegenüber komplementärer ssDNA oder ssRNA aufweisen.
Verwendung LNA-modifizierter Oligomere (Ribozyme) nach einem der Ansprüche 1 bis 49 in der Sequenz-spezifischen Spaltung von Ziel-Nucleinsäuren.
Verwendung von LNA-modifiziertem Oligonucleotid (einem Oligomer), wie in einem der Ansprüche 1 bis 49 definiert, in Diagnostik-Verfahren zur Isolierung, Reinigung, Amplifikation, Detektion, Identifikation, Quantifizierung oder zum Einfang von natürlichen oder synthetischen Nucleinsäuren.
Verwendung nach Anspruch 97, worin das Oligonucleotid eine photochemisch aktive Gruppe, eine thermochemisch aktive Gruppe, eine Chelat bildende Gruppe, eine Reportergruppe oder einen Liganden umfasst, was die direkte oder indirekte Detektion des Oligonucleotids oder die Immobilisierung des Oligonucleotids auf einem festen Träger erleichtert.
Verwendung nach Anspruch 97, worin: (a) die photochemisch aktive Gruppe, die thermochemisch aktive Gruppe, die Chelat bildende Gruppe, die Reportergruppe oder der Ligand einen Abstandhalter (K) umfasst, wobei dieser Abstandhalter eine chemisch abspaltbare Gruppe umfasst; oder (b) die photochemisch aktive Gruppe, die thermochemisch aktive Gruppe, die Chelat bildende Gruppe, die Reportergruppe oder der Ligand über das Biradikal (d.h. als R*) von zumindest einem der LNA des Oligonucleotids gebunden ist.
Verwendung nach Anspruch 97: (a) zum Einfangen und zur Detektion natürlich vorkommender oder synthetischer, doppelsträngiger oder einzelsträngiger Nucleinsäuren wie RNA oder DNA; oder (b) zur Reinigung der natürlich vorkommenden, doppelsträngigen oder einzelsträngigen Nucleinsäuren wie RNA oder DNA; oder (c) als eine Sonde bei In-situ-Hybridisierung, bei Southern-Hybridisierung, Dot-blot-Hybridisierung, reverser Dot-blot-Hybridisierung oder Northern-Hybridisierung; oder (d) beim Aufbau eines Affinitätspaares; oder (e) als ein Primer in einer Nucleinsäure-Sequenzierungsreaktion oder in Primer-Extensionsreaktionen; oder (f) als ein Primer in einer Nucleinsäure-Amplifikationsreaktion.
Verwendung nach Anspruch 100(f), worin: (i) die Amplifikationsreaktion eine PCR-Reaktion ist; oder (ii) der Primer so angepasst ist, dass die Amplifikationsreaktion eine im Wesentlichen lineare Reaktion ist; oder (iii) der Primer so angepasst ist, dass die Amplifikationsreaktion eine im Wesentlichen exponentielle Reaktion ist.
Verwendung nach Anspruch 100 oder 101, worin die Nucleinsäure-Amplifikationsreaktion in einem doppelsträngigen DNA-Produkt resultiert, die zumindest ein einzelsträngiges Ende umfasst.
Verwendung eines LNA-modifizierten Oligonucleotids (eines Oligomers), wie in einem der Ansprüche 1 bis 49 definiert, (a) als ein Aptamer in der Molekulardiagnostik oder (b) als ein Aptamer in RNA-vermittelten katalytischen Prozessen oder (c) als ein Aptamer zur spezifischen Bindung von Antibiotika, Arzneimitteln, Aminosäuren, Peptiden, Strukturproteinen, Proteinrezeptoren, Proteinenzymen, Sacchariden, Polysacchariden, biologischen Cofaktoren, Nucleinsäuren oder Triphosphaten oder (d) als ein Aptamer bei der Trennung von Enantiomeren aus racemischen Gemischen durch stereospezifisches Binden oder (e) für Markierungszellen oder (f) für die In-vivo- oder In-vitro-Hybridisierung an für Nicht-Proteine kodierende Zell-RNA, wie tRNA, rRNA, snRNA und scRNA, oder (g) für die In-vivo- oder In-vitro-Hybridisierung an für Nicht-Proteine kodierende Zell-RNA, wie tRNA, rRNA, snRNA und scRNA, oder (h) beim Aufbau von Taqman-Sonden oder Molecular Beacons (molekularen Leuchtsignalen).
Verwendung nach Anspruch 103, worin die Markierung ermöglicht, die Zellen von nicht markierten Zellen zu trennen.
Set zur Isolierung, Reinigung, Amplifikation, Detektion, Identifikation, Quantifizierung oder zum Einfang natürlicher oder synthetischer Nucleinsäuren, wobei das Set einen Reaktionskörper und ein oder mehrere LNA-modifizierte Nucleotide (Oligomer), wie in einem der Ansprüche 1 bis 49 definiert, umfasst.
Set nach Anspruch 105, worin die LNA-modifizierten Nucleotide auf obigem Reaktionskörper immobilisiert sind.
Verwendung von zur Gänze oder teilweise phosphorylierten Monothiophosphat-LNA-Oligonucleotiden in Antisense- oder anderen therapeutischen Anwendungen.