DE69109100T2

DE69109100T2 - Oligonukleotid-analoge.

Info

Publication number: DE69109100T2
Application number: DE69109100T
Authority: DE
Inventors: Edward Mcdonald Wilmington De 19810 Huie; George Leonard Wilmington De 19803 Trainor
Original assignee: DuPont Merck Pharmaceutical Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Pharma Co
Priority date: 1990-04-10
Filing date: 1991-02-25
Publication date: 1995-08-31
Anticipated expiration: 2011-02-26
Also published as: WO1991015500A1; CA2079777A1; US5470967A; ZA912660B; AU639770B2; AU7458191A; ATE121416T1; HK109495A; IE73244B1; ES2071989T3; EP0517796A1; JP3050595B2; IE911176A1; NZ237723A; DE69109100D1; DK0517796T3; EP0517796B1; IL97804A; JPH05506014A; CA2079777C

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung bezieht sich auf neue Verbindungen, in denen eine oder mehrere Internucleotid-Phosphodiester-Bindungen in Oligonucleotid-Analoga durch eine Bindung auf Schwefelgrundlage ersetzt worden sind.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Der Vorrat an Substanzen, die für therapeutische Zwecke zur Verfügung stehen, besteht hauptsächlich aus organischen Verbindungen mit verhältnismäßig niedrigem Molekulargewicht. Vor kurzem hat sich der Vorrat unter Einschließen proteinartiger Materialien, die auf Wirksamkeit, Spezifität und Stabilität ausgelegt wurden, erweitert. Zunehmende Aufmerksamkeit wird nun auf das therapeutische Potential anderer Klassen von Biomakromoleküle einschließlich Nukleinsäuren gerichtet.
Nukleinsäuren sind lineare Phosphopentosepolymere, die Adenin(A), Guanin- (G), Cytosin- (C) und Thymin- (T) [oder das verwandte Uracil (U)] Basenseitengruppen tragen. Die Pentose kann Ribose (RNA) oder 2'-Deoxyribose (DNA) sein. Sie sind attraktive Kandidaten für Therapeutika, was auf ihre großen Selektivitätsmöglichkeiten zurückzuführen ist. Die Grundlage für diese hohe Selektivität ist die wohlbekannte Fähigkeit einer Nukleinsäure, eine antiparallele, zweisträngige Helixstruktur (oder Duplex) mit ihrem strukturellen Gegenstück durch die Bildung von Wasserstoffbindungen zwischen den Basen an gegenüberliegenden Strängen (Watson-Crick-Basenpaare) zu bilden. Komplementarität ist als Paarbildung von G mit C und A mit T (oder U) an gegenüberliegenden Strängen definiert. Duplexe mit perfekter Komplementarität sind thermodynamisch bevorzugt. Bei kurzen [(20 Reste oder Nucleotide (nt)] Oligonucleotiden kann eine einzige ungeeignete oder fehlerhafte Paarbildung den Duplex bedeutend destabilisieren. Auf diese Weise kann man im Prinzip eine einzelne Stelle in einem menschlichen Genom mit 3 x 10&sup9; nt (das gesamte genetische Material eines Menschen) mit einem Oligonucleotid mit 16-20 nt selektiv ansprechen. Dies ist eine wesentlich größere Selektivität als man im allgemeinen mit traditionellen Mitteln mit niedrigem Molekulargewicht erreichen kann. Mit diesem Grad möglicher Selektivität kann man den Weg in Aussicht nehmen, eine therapeutische Wirkung auf der Ebene der Genexpression auszuüben. Bei Virusmitteln, die über einen Einbau ihres genetischen Materials in das Wirtssystem wirken, kann man sich das Blockieren eines der vielen am Einbau und der Vermehrung beteiligten Schritte vorstellen.
Die meisten Versuche, Nukleinsäuren als komplementäre adressierte therapeutische Mittel zu verwenden, haben einsträngige Ziele umfaßt. Derartige Ziele schließen Boten-RNA (mRNA) und einsträngige virale Genome ein. In derartigen Fällen sind die Nukleinsäuren des Reagenzes zum Ziel komplementär und werden als "Anti-Sinn-Reagenzien" bezeichnet. Das Verfahren zum Verwenden derartiger Mittel, um eine spezifische Wirkung auszuüben, wird hier als "Anti-Sinn-Zielen"1-3,32 bezeichnet.
Kürzlich ist eine zweite hochspezifische Bindungsweise von Nukleinsäuren untersucht wurden. Es ist gefunden worden, daß gewisse Duplex-DNA-Sequenzen einen dritten Strang unter Bilden einer Dreifach-Helix oder Triplex binden4. Die Triplexbildung umfaßt die Bildung von Basentripletts, wobei die zusätzliche Base Wasserstoffbindungen im sogenannten Hoogsteen-Modus bildet. Zum Binden auf eine derartige Weise entworfene Reagenzien werden hierin als "Triplex-Reagenzien" bezeichnet und das Verfahren des Verwendens derartiger Reagenzien zum Ausüben einer spezifischen Wirkung wird als "Triplex-Ziele" bezeichnet. Der Vorteil des Wegs des Triplett-Zielens ist der, daß man doppelsträngige genomische DNA direkt ansprechen kann. Der Nachteil ist der, daß wenigstens derzeit nicht alle Sequenzen auf diese Weise angesprochen werden können.
Die Leichtigkeit der Synthese und die chemische Stabilität einfacher, nicht-modifizierter Oligodesoxynucleotide hat zu einer weitverbreiteten Untersuchung ihrer Verwendung als Anti-Sinn-Reagenzien geführt. Dieser Weg ist mit wechselndem Erfolgsgrad in vitro unter anderem gegen das Human-Immunschwächevirus (HIV), Rous-Sarkomvirus und c-myc-Onkogenexpression verwendet worden
Einfache Oligodesoxynucleotid-Anti-Sinn-Reagenzien können ihre Wirkungen auf einem von zwei oder beiden Wegen ausüben. Sie können ihr Ziel einfach durch Duplexbildung binden, wodurch die verfügbare Konzentration an funktionellem einsträngigem Ziel verringert wird. Wahlweise kann in dem Fall, wo das Ziel eine einsträngige RNA ist, das RNA/DNA-Hybrid als Substrat für endogene Ribonuklease H (RNaseH) dienen. RNaseH ist ein Enzym, das den RNA-Strang eines RNA/DNA-Hybrids durch Phosphodiesterbindungshydrolyse spaltet. Die Vermittlung von RNaseH kann ein Anti-Sinn-Reagenz bei Konzentrationen wirksam sein lassen, die beträchtlich unter denen liegen, welche zum Bewegen des gesamten Ziels zum Hybrid erforderlich sind, da das Reagenz selbst nicht gespalten wird und jedes Molekül die Spaltung vieler Zielmoleküle bestimmen kann.
Eine Anzahl Wege der strukturellen Abwandlung zum Verbessern der Funktion von Oligodesoxynucleotiden als Anti-Sinn-Mittel ist untersucht worden. Eine Klasse Änderungen umfaßt das Anbringen chemischer Anhängsel an das Reagenz zum Stabilisieren des Reagenz/Ziel-Duplex oder zum Spalten des Ziels an der Bindungsstelle. Von über bewegliche Abstandsgruppen befestigten Acridinderivaten ist gezeigt worden, daß sie die thermodynamische Stabilität des Duplex durch Interkalation verbessern&sup5;. Ähnlich können Oligodesoxynucleotide, die mit Abstandsgruppen versehene Psoralene tragen, auf die Bestrahlung des Duplex folgend kovalent mit dem Ziel vernetzt werden&sup6;. Das Vernetzen kann auch durch die Verwendung mit Abstandsgruppen versehener Alkylierungsmittel bewerkstelligt werden&sup7;.Die Spaltung des Ziels durch die Verwendung von Oligodesoxynucleotiden, die mit Abstandsgruppen versehene Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)/Eisen&sup8; oder 1,10- Phenanthrolin/Kupfer&sup9; tragen, ist in vitro gezeigt worden. Zahlreiche andere Befestigungen sind für diesen Zweck beschrieben worden. Die Funktionalisierung mit Poly(L-lysin) ist zum Verbessern des Transports eingesetzt worden³¹.
Die Verwendung von Oligodesoxynucleotiden als Anti-Sinn-Reagenzien in vivo wird jedoch durch zwei grundlegende Probleme gehemmt. Das erste Problem ist das, daß kleine einzelsträngige Oligodesoxynucleotide durch endogene Nukleasen rasch verdaut werden. In der Folge ist es schwierig, hohe in-vitro-Konzentrationen aufrechtzuerhalten. Das zweite Problem ist, daß Oligodesoxynucleotide stark geladen sind und ungefähr eine volle negative Ladung je Nucleotidrest besitzen. Dies führt im allgemeinen zu einer verringerten Transportrate durch Membranen, was in einigen Fällen den Zugang zu der endgültigen Wirkungsstelle einschränkt. Diese beiden Effekte vereinen sich unter Liefern einer verhältnismäßig geringen Bioverfügbarkeit.
Das Befestigen chemischer Funktionalitäten (wie vorstehend beschrieben) an den Termini von Oligodesoxynucleotiden kann in einigen Fällen eine verstärkte Nukleaseresistenz liefern. alpha-Oligodesoxynucleotide, bei denen die Bindung der Base an den Ribofuranosylring von beta- zu alpha- geändert worden ist, bilden parallelsträngige Duplexe und zeigen eine erhöhte Nukleaseresistenz¹&sup0;.
Bei mehreren Wegen, die Stabilitäts- und Transportprobleme zu lösen, ist das zentrale Phosphoratom in der Verknüpfung behalten worden, aber gebundene Atome sind ersetzt oder modifiziert worden. O-Alkylphosphotriester sind ungeladen, sind aber voluminöser als die natürliche Bindung und zeigen eine etwas verringerte chemische Stabilität11,12. Phosphorothioatdiester besitzen eine Isostruktur zur natürlichen Bindung und zeigen eine erhöhte Resistenz gegenüber Nucleasen, sind aber noch immer geladen¹³. Methylphosphonate sind ungeladen und beträchtlich lipophiler, vollständig ersetzte Hybride sind aber keine Substrate von RNaseH¹&sup4;.
Eine fundamentale Schwierigkeit mit diesen Analoga ist die Tatsache, daß sie alle aus einem einzigen Austausch der nichtverbrückenden Sauerstoffatome in der Phosphodiesterbindung stammen. Da dieser Phosphor innerhalb der Verbindung prochiral ist, führt der nicht-spezifische Austausch eines Sauerstoffs zur Bildung eines chiralen Zentrums und somit zu einem Diastereomerenpaar. Jeder zusätzliche nicht-spezifische Austausch verdoppelt die Zahl der vorhandenen Diastereomeren. Diese Diastereomeren besitzen unterschiedliche physikalische Eigenschaften, welche die Analyse erschweren, und in einigen Fällen ist gezeigt worden, daß sie sehr unterschiedliche Fähigkeiten zum Bilden von Hybriden besitzen³&sup4;. So sind Oligodesoxynucleotidanaloga mit mehrfachem Bindungsaustausch iln allgemeinen komplexe Gemische von Arten, die eine sehr unterschiedliche biologische Wirksamkeit besitzen können.
Das Problem des Diastereomerengemischs kann durch den Austausch beider Brückensauerstoffe in der Phosphodiesterbindung gegen die gleiche chemische Gruppe umgangen werden. Nach diesen Grundsätzen sind Phosphorodithioatdiester untersucht worden¹&sup5;. Wie die Phosphorothioatbindung ist diese Struktureinheit jedoch noch immer geladen.
Wege, die ausgedehntere Modifizierungen umfassen, sind ebenfalls berichtet worden. Der Austausch der Phosphodiesterbindung durch ein neutrales Carbamat mit einem Kohlenstoffzentrum ist untersucht worden16,17. Die Planarität der Carbamatbindung stellt sicher, daß seine Einführung keine Diastereomeren erzeugt, sie stellt aber eine Abkehr von der tetraedrischen Geometrie des Phosphodiesters mit Folgen dar, welche noch nicht vollständig erforscht worden sind. Von wenigstens einem Derivat ist gezeigt worden, daß es mit einem komplementären Ziel einen Duplex bilden kann. Über die Nukleaseempfindlichkeit des Carbamats und die Fähigkeit, RNaseH zu aktivieren ist noch nicht berichtet worden.
Mehrere kürzliche Untersuchungen haben sich auf Oligodesoxynucleotide mit einem teilweisen Austausch der Phosphodiesterbindung konzentriert. Das Grundprinzip ist hier, daß man ein ausgewogenes Profil wünschenswerter Eigenschaften (z.B. Nukleaseresistenz, Hybridstabilität, RNaseH-Aktivität usw.) errichten kann. Obschon diese Untersuchungen nützlich sind, ist es unwahrscheinlich, daß sie zu einer allgemeinen Lösung der vorstehend aufgeführten Probleme führen.
Bei einigen Analoga wird die Situation durch die Beobachtung, daß biologische Wirkungen in einer nicht-spezifischen Weise ausgeübt werden, weiter kompliziert18,19. Die Herkunft dieser Wirkungen bleibt unbekannt.
Die beschriebene Auf zählung von Modifikationen, die bei Versuchen zum Verstärken der Funktion von Oligodesoxynucleotiden als Anti-Sinn-Reagenzien erforscht wurden, ist repräsentativ aber keinesfalls erschöpfend. Zwei kürzliche Übersichten1,2 und eine sich mit diesem Themengebiet beschäftigende Monographie³² sind umfassend.
Eine Reihe natürlich vorkommender Sulfamoylnucleosidantibiotika und einige synthetische Analoga sind beschrieben worden21-24. Außerdem sind DNA-Analoga, die Sulfide, Sulfoxide und Sulfone als Verbindungsgruppen zwischen Untereinheiten enthalten, die zum Bilden von Bindungen mit neutralen Oligonucleotiden befähigt sind, beschrieben worden³³. Von dem β-Zerfall von P³²-Oligonukleotiden wird erwartet, daß er sulfatverknüpfte Oligonucleotide ergibt; derartige sulfatverknüpfte Oligonucleotide sind jedoch nicht berichtet worden.
Die Anmelder haben eine neue Reihe von Verbindungen entwickelt, in denen eine oder mehrere Internucleotid-Phosphodiesterbindun gen in Oligonucleotid-Analogen gegen eine Bindung auf Schwefelgrundlage ausgetauscht wurden. Diese Bindung ist zum Phosphodiester isostrukturell und isaelektronisch. Die Anmelder haben gefunden, daß die Bindung synthetisch zugänglich, chemisch widerstandsfähig, Nuklease-resistent und zum Unterstützen der Duplexbildung befähigt sind. Verbindungen dieser Erfindung besitzen ein ausgezeichnetes Leistungsvermögen als Anti-Sinn- und Triplex-Reagenzien zur therapeutischen Kontrolle der Nucleinsäurefunktion. Außerdem besitzen derartige Verbindungen ein Leistungsvermögen als antivirale Mittel und eine Brauchbarkeit als Hybridisierungssonden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Durch diese Erfindung wird eine Verbindung der Formel
bereitgestellt,
A ist H, OH, OR&sub8;, OQ oder Halogen;
B ist eine natürlich vorkommende Nucleinsäurebase oder eine synthetische, modifizierte Nucleinsäurebase;
Y ist RN oder O;
Z ist R7N oder O;
M ist S(=O)=O, P(=O)-O&supmin;, P(=O)-S&supmin;, P(=S)-S&supmin;, P(=O)-OR&sub3;, P(=O)- R9,
vorausgesetzt, daß wenigstens ein M S(=O)=O ist und wenn M S(=O)=O ist, nur eines von Y und Z O ist;
n ist 1 - 200;
R ist H oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl;
R&sub1; ist H&sub2;PO&sub3;, H&sub3;P&sub2;O&sub5;, H&sub4;P&sub3;O&sub7; und ihre geeigneten Salze, H oder eine Schutzgruppe;
R&sub2; ist H&sub2;PO&sub3;, H&sub3;P&sub2;O&sub5;, H&sub4;P&sub3;O&sub7; und ihre geeigneten Salze, H oder eine Schutzgruppe;
R&sub3; ist C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl oder Cyanethyl;
R&sub4; ist H oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl;
R&sub5; ist H oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl;
R&sub6; ist H oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl;
R&sub7; ist H oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl;
R&sub8; ist C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl;
R&sub9; ist C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl oder Gyanethyl und
Q ist eine Schutzgruppe.
In einem weiteren Aspekt dieser Erfindung werden Zwischenprodukte bereitgestellt:
worin:
A H, OH, OR&sub2;, OQ oder Halogen ist;
B eine natürlich vorkommende Nucleinsäurebase oder synthetische, modifizierte Nucleinsäurebase ist;
Y RN oder O ist;
Z R&sub1;N oder O ist;
X eine geeignete Abgangsgruppe ist;
Q eine Schutzgruppe ist;
R H oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl ist;
R&sub1; H oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl ist und
R&sub2; C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl oder
ist.
Weiter wird durch diese Erfindung ein Anti-Sinn-, Triplex- und antivirales Reagenz bereitgestellt.
In einem weiteren Aspekt dieser Erfindung wird eine Hybridisierungssonde bereitgestellt.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1. zeigt das Schmelzprofil der modifizierten Oligodesoxynucleotide 9a:9c (Kreise) und der beiden Oligodesoxynucleotide, die eine einzige Sulfamatbindung in jedem Strang enthalten, 9b:9d (geschlossene Quadrate). Der Puffer enthielt 200 mM Natrium bei pH 7,0.
Figur 2. Figur 2a zeigt ein HPLC-Chromatogramm eines Standardgemischs von dC, T, dG und dA. Figur 2b zeigt ein HPLC-Chromatogramm des sich aus der verlängerten Verdauung von Oligodesoxynucleotid 9c ergebenden Produktgemischs. Die angewandten HPLC- Bedingungen waren wie folgt analytische C18 Rainin-Säule (4,6 mm x 25 cm) mit Schutz, 1,0 ml/min Durchfluß und ein Gradient aus 10% Wasser/Methanol (Lösungsmittel B) in 50 mM KH&sub2;PO&sub4;/Wasser (Lösungsmittel A) von 0-20 min = 3,0% Lös. B/Lös. A), 20-40 min = 3-40% Lös. B/Lös. A (linear), 40-45 min = 40% Lös. B/Lös. A.
Figur 3. Diese Figur ist eine Photographie eines Autoradiogramms eines 20%igen denaturierenden Polyacrylamidgels, welche die Spaltung sulfamat- oder phosphatgebundener Oligonucleotide durch Nsi I veranschaulicht.
Figur 4. zeigt das Schmelzprofil von d(AsA) gegenüber Polyuridin in einem Puffer aus 10 mM Magnesium H bei pH 7,5.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Alle früheren Versuche zum Austauschen der Phosphodiesterbindung in Oligodesoxynucleotidanaloga zum Zweck des Verstärkens der Funktion als Anti-Sinn-Reagenz stellen Teillösungen dar. Kein einziger Phosphodiesteraustausch besitzt ein völlig befriedigendes Eigenschaftsprofil. Die Anmelder haben eine Liste chemischer, biochemischer und strbktureller Kriterien erstellt, die, falls sie von einer Verbindung erfüllt werden, wahrscheinlich zu besseren Funktionen, wie etwa Anti-Sinn-, antiviralen und Triplex-Funktionen, führt. Die Bindung sollte: 1) isostrukturell (isoelektronisch und isoster) mit dem Phosphodiester; 2) Nuklease-resistent; 3) ungeladen bei physiologischem pH; 4) achiral; 5) chemisch stabil unter physiologischen Bedingungen; 6) synthetisch zugänglich und 7) der Analyse zugänglich sein.
Die Anmelder haben Verbindungen mit wenigstens einer neuen Bindung mit einem Schwefelzentrum entwickelt, die alle diese Kriterien erfüllt. Diese Bindungen sind Sulfamatester. Vorstellungsmäßig leiten sich diese vom Sulfatdiester ab, der mit dem Phosphodiester isoster und isoelektronisch ist. Der Ersatz eines Brückensauerstoffs durch einen Stickstoffliefert einen Sulfamatester. Die Anmelder haben gefunden, daß die Internucleotid-Sulfamatbindung synthetisch zugänglich, chemisch widerstandsfähig, Nuklease-resistent und zum Unterstützen der Duplexbildung befähigt ist.
Die neue Verbindung dieser Erfindung wird durch die Formel:
dargestellt,
A ist H, OH, OR&sub8;, OQ oder Halogen;
B ist eine natürlich vorkommende Nucleinsäurebase oder eine synthetische, modifizierte Nucleinsäurebase;
Y ist RN oder O;
Z ist R&sub7;N oder O;
M ist S(=O)=O, P(=O)-O&supmin;, P(=O)-S&supmin;, P(=S)-S&supmin;, P(=O)-OR&sub3;, P(=O)- R&sub9;,
vorausgesetzt, daß wenigstens
ein M S(=O)=O ist und wenn M S(=O)=O ist, nur eines von Y und Z O ist;
n 1 - 200 ist;
R H oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl ist;
R&sub1; H&sub2;PO&sub3;, H&sub3;P&sub2;O&sub5;, H&sub4;P&sub3;O&sub7; und ihre geeigneten Salze, H oder eine Schutzgruppe ist;
R&sub2; H&sub2;PO&sub3;, H&sub3;P&sub2;O&sub5;, H&sub4;P&sub3;O&sub7; und ihre geeigneten Salze, H oder eine Schutzgruppe ist;
R&sub3; C1-4-Alkyl oder Cyanethyl ist;
R&sub4; H oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl ist;
R&sub5; H oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl ist;
R&sub6; H oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl ist;
R&sub7; H oder C&sub1;&submin;4-Alkyl ist;
R&sub8; C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl ist;
R&sub9; C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl oder Cyanethyl ist und
Q eine Schutzgruppe ist.
Was die Base (B) betrifft, ist keine grundlegende Einschränkung beabsichtigt. Es können sowohl die natürlich vorkommenden Nucleotidbasen als auch synthetische modifizierte Nucleinsäurebasen, wie etwa Inosin, Deazaadenosin usw., eingeschlossen ein. Vorzugsweise ist B ein Rest der natürlich vorkommenden Nucleotidbasen Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin oder Uracil30,33.
Hinsichtlich des Zuckers ist jedes Ribonucleotid, Desoxyribonucleotid und Didesoxyribonucleotid möglich. Zucker mit einer Halogensubstitution (A ist Halogen) und einer geänderten Zuckerkonfiguration (z.B. Arabinoside und alpha-Riboside) können ebenfalls in Betracht gezogen werden³&sup0;.
In der vorstehenden Verbindung ist n 1-200. Ein n von bis zu 200 ist durch Standardverfahren zugänglich.
Was die Internucleotidbindung (M) betrifft, haben die Anmelder sowohl die Herstellung von Verbindungen mit nur einer einzigen Bindung auf Schwefelgrundlage als auch die Herstellung vollständig ausgetauschter Verbindungen gezeigt. Verbindungen, wo wenigstens eine der Bindungen auf Schwefelgrundlage in der Nähe eines Terminus der Verbindung liegt, werden als besonders nützlich angesehen. Derartige Verbindungen sind im wesentlichen vor Exonukleaseaktivität geschützt. Verbindungen, die nicht vollständig durch die Bindungen auf Schwefelgrundlage ausgetauscht sind, umfassen durch M definierte Bindungen, die sowohl in DNA, RNA als auch dem Fachmann bekannten, synthetischen, modifizierten Nucleotiden angetroffen werden. Es versteht sich, daß Materialien mit jeglichem Grad eines teilweisen Austausches von Bindungen auf Phosphorgrundlage durch die Verfahren, welche die Anmelder entwickelt haben, zugänglich sein sollten. Weiter können Verbindungen mit gemischten Ribosestrukturen (z.B. Einzelstränge, die sowohl Ribonucleotide als auch Desoxyribonucleotide enthalten) hergestellt werden.
Wo Substituenten R Alkyl sind, wird erwartet, daß Alkyl mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen brauchbar ist.
Außerdem kann man die chemischen Anhängsel an die Verbindungen dieser Erfindung zu Zwecken des Stabilisierens des Duplex, Vernetzens oder Spaltens einer Zielsequenz oder zum Erleichtern des Transports (siehe unten) anbringen5-9,31.
Im Gegensatz zur Phosphodiesterbindung besitzt das Sulfamat eine Ausrichtung. Die Bindung kann hinsichtlich der Verbindungstermini auf eine von zwei Arten gerichtet sein. Die beiden Formen werden abhängig davon, ob sich der Stickstoff auf der 3'- oder 5'-Seite des gebundenen Schwefels befindet, als 3'-NSO oder 5'- NSO bezeichnet. 3'-NSO-Sulfamatbindung 5'-Terminus Base 3'-Terminus 5'-NSO-Sulfamatbindung

Synthese

Vorstellungsmäßig kann ein disubstituiertes Sulfamat durch die Reaktion einer Hydroxyverbindung mit einem Sulfamoyl-X [worin X eine geeignete Abgangsgruppe ist] (Schema 1) oder durch die Reaktion einer Aminoverbindung mit Alkoxysulfonyl-X (Schema 2) hergestellt werden. Im allgemeinen ist die Abgangsgruppe (X) eine Gruppe, die leicht ersetzt wird (Beispiele schließen Halogenid, Azid, Sulfonate usw.) ein. Gleichwertige Reaktionen mit Reagenzien mit reduziertem Schwefel (z.B. Sulfinylgruppen), gefolgt von der Oxidation können auch in Betracht gezogen werden. Schema
Diese beiden Wege sind zur Herstellung der sulfamatverknüpften Oligonucleotidderivate möglich, welche Gegenstand dieser Anmeldung sind. Die Anmelder haben eine spezifische Ausführungsform von Schema 1 als besonders wirksam erkannt. In diesem Verfahren wird ein 5'-N-(X-sulfonyl)-5'-amino-5'-desoxynucleosidzwischenprodukt mit einem Hydroxy-tragenden Nucleosid oder Hydroxytragenden Oligonucleotid unter Liefern eines 3'-NSO-sulfamatverknüpften Derivats umgesetzt. Nucleosid oder Oligonucleotid
In diesem Verfahren ist X eine geeignete Abgangsgruppe, wie etwa ein Halogenid, Sulfonat oder eine Azidogruppe, wobei die Azidogruppe bevorzugt ist. Ähnlich können 5'-NSO-sulfamatverknüpfte Derivate durch Umsetzen eines 3'-N-(X-sulfonyl)-3'-amino-3'- desoxynucleosids mit einem Hydroxy-tragenden Nucleosid oder Hydroxy-tragenden Oligonucleotid hergestellt werden. Nucleosid oder Oligonucleotid
Diese Verfahren werden im allgemeinen in Anwesenheit einer Base ausgeführt, können aber auch durch Metallionen erleichtert werden.
Das Schlüsselzwischenprodukt in diesen Verfahren, die N-(X- sulfonyl)-3'-amino-3'-desoxynucleoside, können bequem durch die Reaktion des entsprechenden Amino-desoxynucleosids mit einem bifunktionellen Sulfonierungsmittel X-SO&sub2;-X' hergestellt werden. Zum Beispiel wird das N-(Azidosulfonyl)-amino-desoxynucleosid bei X = Azido durch Umsetzen des Amino-desoxynucleosids mit Azidosulfonylchlorid hergestellt.
Diese N-(X-sulfonyl)-3,-amino-3'-desoxynucleosidzwischenprodukte können auch mit Amino-tragenden Nucleosiden oder Amino-tragenden Oligonucleotiden unter Liefern Sulfamid-verknüpfter Oligonucleotidderivate umgesetzt werden, welche ebenfalls Gegenstand dieser Anmeldung sind.
Die Zwischenprodukte dieser Erfindung sind Verbindungen der Formel:
worin:
A H, OH, OR&sub2;, OQ oder Halogen ist;
B eine natürlich vorkommende Nucleinsäurebase oder synthetische, modifizierte Nucleinsäurebase ist;
Y RN oder O ist;
Z R&sub1;N oder O ist;
X eine geeignete Abgangsgruppe ist;
Q eine Schutzgruppe ist;
R H oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl ist;
R&sub1; H oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl ist und
R&sub2; C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl oder
ist.
Die Strategie zur Einführung der Sulfamatbindung in größere Verbindungen dieser Erfindung hängt vom gewünschten Substitutionsgrad ab. Zur Einführung in eine einzelne Stelle oder nur einige wenige Stellen, wird ein Block-Dimer-Weg bevorzugt. Bei diesem Weg wird die Standardchemie der automatisierten Oligonucleotidsynthese auf der Grundlage des stufenweisen Hinzufügens einzelner Nucleotide (3'-an-5'-Wachstum) über Nucleosidphosphoroamidite eingesetzt³&sup9;. An einem ausgewählten Punkt in der Synthese wird ein Block-Dimer Phosphoramidit dieser Erfindung durch 5'-Dimethoxytrityl geschütztes, sulfamatverknüpftes Dinucleosid-3'-phosphoramidit an Stelle des normalen Reagenzes verwendet. Dies führt zur Addition der beiden durch ein Sulfamat verknüpften Nucleotide an den 5'-Terminus der wachsenden Kette. Das Block-Multimer dieser Erfindung würde es erlauben, n auf einanderfolgende Sulfamatbindungen einzuführen.
Die Block-Multimer-Phosphoramiditverbindung dieser Erfindung hat die Formel:
A ist H, OH, OR&sub4;, OQ oder Halogen;
B ist eine natürlich vorkommende Nucleinsäurebase oder synthetische, modifizierte Nucleinsäurebase;
n ist 1 - 200;
R&sub1; ist C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl;
R&sub2; ist Dialkylamino, Morpholino, Piperidino oder Pyrrolidino;
R&sub3; ist C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl;
R&sub4; ist C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl;
Y ist RN oder O;
Z ist RN oder O;
R ist H oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl;
Q ist eine Schutzgruppe und
V ist eine Schutzgruppe.
Von Substituenten R, R&sub1;, R&sub3; und R&sub4; mit Alkyl mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen wird erwartet, daß sie brauchbar sind.
V ist eine Schutzgruppe, die unter basischen Bedingungen gespalten werden kann; Beispiele schließen Cyanoethyl und Methyl ein.
Bei allen Verbindungen dieser Erfindung ist Q Alkyl oder eine Schutzgruppe, die etwa aus Acyl, Trialkylsilyl, Cyanoethyl oder einem Tetrahydropyran ausgewählt ist.
Wo der Substituent A einen Sauerstoff enthält, sind drei Schutzebenen vorstellbar. In einem Fall wäre die Schutzgruppe Q der Spaltung unter denselben Bedingungen wie für V zugänglich. Eine weitere Möglichkeit ist, Q aus Stabilitätsgründen gegenüber den zum Entfernen von V verwendeten Entschützungsbedingungen stabil zu machen. Der letzte Fall wäre, wenn Q überhaupt nicht entfernt würde, zum Beispiel eine Alkylgruppe.
Der Punkt der Stabilität der Sulfamatbindung ist ein wichtiger bei diesem Weg. Zuerst muß die Bindung der wiederholten Behandlung unter den Bedingungen des Kreislaufs standhalten können: 1) Entfernen der 5'-Tritylgruppe mit mäßig starker Säure; 2) Kuppeln mit einem Tetrazol-aktivierten Phosphoroamidit und 3) Oxidation mit Iod unter basischen Bedingungen. Die Anmelder haben gefunden, daß die Internukleotidbindung gegenüber wiederholten Behandlungen unter diesen Bedingungen völlig stabil ist. Zweitens muß die Bindung den Bedingungen standhalten können, die zum Spalten des entstehenden Oligonucleotids aus dem Harz und Entfernen der Schutzgruppen von den Nucleotidbasen erforderlich sind. Der Schutz der Base umfaßt im allgemeinen das Blockieren der exocyclischen Aminogruppen durch Acylierung (für C, A: Benzoylierung; für G: Isobutyrylierung). Sowohl die Spaltung vom Harz als auch die Basendeprotektionierung werden im allgemeinen durch Behandeln mit konzentriertem wäßrigem Ammoniak durchgeführt. Die Spaltung aus dem Harz erfolgt rasch bei Raumtemperatur, aber ein vollständiges Entschützen der Base erfordert eine längere Behandlung bei erhöhten Temperaturen. Die Sulfamatbindung ist gegenüber dieser längeren Behandlung mit wäßrigem Ammoniak völlig beständig.
Unter Anwenden des Block-Dimer-Wegs kann man Verbindungen, Oligonucleotidanaloga, synthetisieren, die eine bis mehrfache Sulfamatbindungen tragen. Die einzigen Einschränkungen sind, daß die erste Bindung (am 3'-Terminus) kein Sulfamat sein darf und man keine aufeinanderfolgenden Sulfamate einführen darf. (Diese Einschränkungen können durch die Verwendung eines Harz-verknüpften Sulfamat-Blockdimers als Starter beziehungsweise durch die Verwendung von Blockmultimeren überwunden werden.)
Eine unterschiedliche Strategie wird zur Synthese von Verbindungen eingesetzt, wo alle Internucleotidbindungen durch das Sulfamat ersetzt werden sollen. Hier wird eine schrittweise Synthese bevorzugt. Die Synthese wird in 5'-3'-Richtung unter Hinzufügen einer einzigen Nucleotideinheit auf einmal durchgeführt. Das 3'- geschützte 5'-Azidosulfonamidomonomer wird in situ aktiviert und an das 3'-Hydroxyl des wachsenden Oligonucleotids angefügt.
Diese Richtung der Kettensynthese ist zu der in der normalen automatisierten Oligonucleotidsynthese eingesetzten entgegengesetzt. Somit sind die beiden Verfahren nicht einfach vereinbar. Es ist jedoch möglich, Kreisläufe zu entwickeln, wo entweder das Sulfamat oder der Phosphodiester nach Wunsch hinzugefügt werden können. Es sollte zum Beispiel möglich sein, unter Verwenden eines 5'-geschützten 3'-Azidosulfonamidomonomers Sulfamatbindungen an jedem gewünschten Punkt einzuführen. Dies ist eine Folge der Verlängerungsrichtung, die nun von 3' nach 5' dieselbe Richtung wie bei der Phosphoroamiditverlängerung verwendet ist.
Im allgemeinen ist der Weg mit einem aktivierten Monomer dem Block-Dimer-Weg darin überlegen, daß a) alle möglichen Sequenzen angesprochen werden können und b) nur vier gegenüber sechzehn Reagenzien benötigt werden.

Brauchbarkeit

Die Verbindungen dieser Erfindung sollen als Anti-Sinn-Reagenzien (d.h. in Therapeutika) Anwendung finden, da diese Verbindungen im wesentlichen diejenigen physikalischen Eigenschaften gezeigt haben, von denen gezeigt worden ist, daß sie mit der Anti-Sinn-Funktion in anderen Systemen korrelieren. Ähnlich erwarten die Anmelder, daß diese Reagenzien bei Triplex-Ziel- Anwendungen wirksam sein können.
Es gibt andere mögliche therapeutische Anwendungen. Zum Beispiel kann von Sulfamatanaloga von 2',5'-Oligoadenosinen erwartet werden, daß sie antivirale Eigenschaften zeigen²&sup6;.
Man könnte erwarten, daß Sulfamat-ausgetauschte Oligodesoxynucleotide einige derselben nicht-sequenzspezifischen antiviralen Wirksamkeiten zeigen, die bei anderen Analoga beobachtet wurden18,19.
Es gibt auf Forschungsgebieten ebenfalls viele mögliche Anwendungen. Die sulfamatverknüpften Systeme können als Hybridisierungssonden, als ReagenzLen für die Mutagenese und als strukturelle Analoga für die Untersuchung von Protein/Nukleinsäure-Wechselwirkungen nützlich sein. Ein Austausch einer Sulfamatbindung kann nützliche Eigenschaften verleihen, wenn sie in katalytische RNA-Systeme eingebaut wird³&sup5;.
Eine ähnliche Brauchbarkeit wird für die analoge Oligonucleotidverbindung erwartet, worin M S(=O)=O ist und sowohl Y als auch Z 0 sind.

Duplexbildung

Um als Anti-Sinn-Reagenz wirksam zu sein, muß die Verbindung dieser Erfindung die Fähigkeit zum Erkennen (damit hybridisieren, damit paaren, damit einen Duplex bilden) einer komplementären Sequenz behalten. Bei kurzen Oligonucleotiden kann dies bequem durch Beobachten der Änderungen bei der UV-Absorption getestet werden, welche die Duplexbildung begleiten. Im allgemeinen wird die Absorption bei 260 nm als Funktion der Temperatur gemessen.
Um die Wirkung des Austauschens einer einzelnen Phosphodiesterbindung durch das Sulfamat auf die Duplexbildung zu untersuchen, wurde ein Paar modifizierte komplementäre 18-mere, die jedes eine einzelne Sulfamatbindung besaßen, mit einem entsprechenden Paar nicht-modifizierter 18-mere verglichen. Die beiden Paare zeigten praktisch identische Schmelzprofile (gleichmäßige S- Kurven), wobei die Kurve für das modifizierte Paar zu einer geringfügig niedrigeren Temperatur verschoben war. Daß die Größenordnung der Absorptionsänderung identisch ist und die Kurven in der Gestalt nahezu identisch sind, legt nahe, daß der Duplex durch die Sulfamatbindung nur sehr wenig gestört ist und er ein Ein-Domänen-Schmelzen erleidet. Die geringfügig niedrigere Übergangstemperatur zeigt, daß der modifizierte Duplex unter diesen Bedingungen geringfügig weniger stabil als sein nichtmodifiziertes Gegenstück ist.
Versuche zum Zeigen des Paarens eines T-Homopolymers, das überall Sulfamatbindungen trägt, mit einem kurzen dA-Homopolymer (mit Phosphodiestern) sind erfolglos gewesen. Dies ist etwas verblüffend, aber ein ähnliches Phänomen ist bei Carbamaten und Methylphosphonaten beobachtet worden: oligoT (und U) paaren sich schlecht oder überhaupt nicht mit polyA, Sequenzen mit anderen Basen paaren sich jedoch gut117,20. Dies kann eine Besonderheit von oligoT sein, wenn die Bindung ungeladen ist.
Das Paaren eines sulfamatverknüpften Adenosindimers mit polyU ist gezeigt worden. Hier war die Wechselwirkung mit einer etwa 10 Grad höheren Übergangstemperatur als das entsprechende nichtmodifizierte Adenosindimer sehr stark.

Nukleaseresistenz:

Zur Stabilität in vivo ist es erwünscht, daß ein Anti-Sinn- Reagenz gegenüber Exonukleasen, welche von jedem Terminus aus in einer schrittweisen Art verdauen, und Endonukleasen, die in der Mitte der Kette spalten, widerstandsfähig ist.
Zum Test auf Exonukleaseresistenz wurden mehrere Verbindungen dieser Erfindung mit einer einzigen Sulfamatbindung einer längeren Behandlung mit einem Gemisch aus einer Exonuklease, Schlangengift-Phosphodiesterase und alkalischer Phosphatase (zum Erleichtern der Analyse) unterzogen. In jedem Fall wurde die Sulfamatbindung unversehrt zurückgewonnen (als Dimer), wobei der Rest der Verbindungen vollständig in ihre Nucleosidbestandteile verdaut wurde.
Die Endonukleaseresistenz wurde durch Untersuchen der Spaltung eines kurzen doppelsträngigen Oligomers getestet, welches die Nsi 1 Restriktionsendonuklease-Erkennungssequenz enthielt. Diese Endonuklease schneidet normalerweise beide Stränge innerhalb ihrer Erkennungssequenz in einer versetzten Art und Weise.
Der Austausch der Phosphodiesterbindung an der Spaltungsstelle in einem oder beiden Strängen verlieh den (dem) veränderten Strang (Strängen) Widerstandsfähigkeit gegenüber einer Spaltung.

BEISPIELE

Beispiel 1

Herstellung von N6-Benzoyl-3'-O-t-butyldimethylsilyl-5'-sulfamoylazido-2',5'-dideoxyadenosin

Ein Gemisch aus 8,9 g (24 mMol) 5'-Azido-N6-benzoyl-2',5'-dideoxyadenosin (welches wie in Zitat 36 hergestellt werden kann), 5,4 g (35 mMol) t-Butyldimethylsilylchlorid und 3,3 g (48 mMol) Imidazol in 100 ml wasserfreiem Dimethylformamid (DMF) wurde 20 h bei Raumtemperatur (RT) gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde zwischen halbgesättigter Kochsalzlösung und EtOAc (2 x 200 ml) verteilt. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet (getrocknet) und eingedampft (einged.). Reinigung durch Chromatographie an Kieselgel (Kieselgel (240-400 mesh) von EM Science) mittels 20 bis 40% EtOAc/DCM ergab 11,1 g 5'-Azido-N6-benzoyl-3'-O-t-butyldimethylsilyl-2',5,-dideoxyadenosin als weißen Schaum:
NMR (300MHz,d&sub6;-DMSO) δ 11.25 (br,1H), 8.78 (s,1H), 8.71 (s,1H), 8.05 (m,2H), 7.5-7.7 (m,3H), 6.52 (t,1H,J=7Hz), 4.72 (m, 1H), 4.02 (m, 1H), 3.67 (dd,1H,J=13,7HZ), 3.56 (dd,1H,J=13,5Hz), 3.09 (m,1H), 2.43 (m,1H), 0.92 (s,9H), 0.14 (s,6H).
Ein Gemisch aus 5,08 g (10,4 mMol) 5'-Azido-N6-benzoyl-3'-O-t- butyldimethylsilyl-2',5'-dideoxyadenosin und 2,1 g 10% Pd/C in 69 ml Ethanol und 3,0 ml Essigsäure wurde 4 h unter 1 atm Wasserstoff gerührt. Die Anschläminung wurde durch Celit unter Waschen mit Methanol filtriert. p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (1,97 g, 10,4 mMol) wurde zugesetzt und das Gemisch wurde bis zur Auflösung gerührt. Die Lösung wurde einged. und der sich daraus ergebende Feststoff wurde an Kieselgel (1 bis 12% Methanol/DCM) unter Ergeben von 4,63 g 5'-Amino-N6-benzoyl-3'-O-t- butyldimethylsilyl-2',5'-dideoxyadenosin-p-toluolsulfonsäuresalz chromatographiert:
NMR (300MHz,d&sub6;-DMSO) δ 8.76 (s,1H), 8.74 (s,1H), 8.05 (d,2H,J=8Hz), 7.67 (t,1H,3-8Hz), 7.57 (t,2H,J=8Hz), 7.48 (d,2H,J=8Hz), 7.11 (d,2H,J=8Hz), 6.53 (t,IH,J=7Hz), 4.68 (m,1H), 4.01 (m,1H), 3.06 (m,2H), 2.56 (m,1H), 2.39 (m,1H), 2.29 (s,3H), 0.93 (s,9H), 0.15 (s,6H).
Ein Gemisch aus 4,24 g (6,68 mMol) 5'-Amino-N6-benzoyl-3'-O-t- butyldimethylsilyl-2',5'-dideoxyadenosin und 4A Molekularsieb (~ 5 g) in 10 ml wasserfreiem Acetonitril und 20 ml wasserfreiem DCM wurde 2 h unter Stickstoff gerührt. Nach Zufügen von 0,93 ml (6,68 mMol) Triethylamin wurde das Gemisch 5 min gerührt und 0,42 ml Chlorsulfonylazid (1M in Acetonitril) wurden zugesetzt. Nach 1 h Rühren der Reaktion wurde die Anschlämmung filtriert und das Filtrat wurde zwischen Wasser und EtOAc (2 x 100 ml) verteilt. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und einged. Reinigung mittels Chromatographie an Kieselgel (1 bis 3% MeOH/DCM) ergab 0 , 89 g N6-Benzoyl-3'-O-t-butyldimethylsilyl-5'-sulfamoylazido- 2',5'-dideoxyadenosin als weißen Schaum:
NMR (300MHz,d&sub6;-DMSO) δ 11.22 (br,1H), 9.28 (br,1H), 8.75 (s,1H), 8.71 (s,1H), 8.05 (d,2H,J=8Hz), 7.66 (t,1H,J=8Hz), 7.56 (t,2H,J=8Hz), 6.52 (t,1H,J=8Hz), 4.67 (m, 1H), 4.00 (m, 1H), 3.07 (m,1H), 2.34 (m,1H), 0.93 (s,9H), 0.15 (s,6H). IR (KBr) 3400, 3080 2950, 2930, 2880, 2860, 2130, 1700, 1610, 1585, 1510, 1370, 1170 cm&supmin;¹.

Beispiel 2

Herstellung von N6-Benzoyl-3'-O-t-butyldimethylsilyl-5'-sulfamoylazido-2',5'-dideoxycytidin

Ein Gemisch aus 12,09 g (35,1 mMol) 5'-Azido-N6-benzoyl-2',5'- dideoxycytidin (das wie in Zitat 36 hergestellt werden kann), 7,94 g (52,7 mMol) t-Butyldimethylsilylchlorid und 4,78 g (70,3 mMol) Imidazol wurden in 70 ml wasserfreiem DMF 20 h unter Stickstoff bei Raumtemperatur gerührt. Das DMF wurde im Vakuum entfernt und das sich daraus ergebende Gemisch wurde in DCM gelöst und eine Kieselgelsäule wurde direkt damit beladen. Eine 25% EtOAc/DCM-Lösung wurde zum Eluieren des Produkts van der Säule verwendet. Eind. der das Produkt enthaltenden Fraktionen ergab 13,35 g 5'-Azido-N6-benzoyl-3'-O-t-butyldimethylsilyl- 2',5'-dideoxycytidin als weißen Schaum:
NMR (300MHz,d&sub6;-DMSO) δ 11.31 (br,1H), 8.18 (d,1H,J=8Hz), 8.01 (m,2H), 7.63 (m,1H), 7.56 (t,2H,J=7Hz), 7.39 (d,1H,J=8Hz), 6.20 (t,1H,J=7Hz), 4.38 (m,1H), 3.96 (m, 1H), 3.68 (dd,1H,J=13,6Hz), 3.61 (dd,1H,J=13,5Hz), 2.30 (m,1H), 0.88 (s,9H), 0.10 (s,6H).
Ein Gemisch aus 6,88 g (15 mMol) 5'-Azido-N6-benzoyl-3'-O-t- butyldimethylsilyl-2',5'-dideoxycytidin und 3,0 g 10% Pd/C in 130 ml Ethanol und 5 ml Essigsäure wurde 4 h unter 1 atm Wasserstoff gerührt. Die Anschlämmung wurde durch Celit unter Waschen mit Methanol filtriert. p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (2,85 g, 15 mMol) wurde zugesetzt und das Gemisch wurde bis zur Auflösung gerührt. Die Lösung wurde einged. und der sich daraus ergebende Feststoff wurde an Kieselgel (1 bis 12% Methanol/DCM) unter Ergeben von 6,32 g reinem 5'-Amino-N6-benzoyl-3'-O-t-butyldimethylsilyl-2',5'-dideoxycytidin-p-toluolsulfonatsalz als lohfarbenem Feststoff chromatographiert: NMR (300 MHz, d&sub6;- DMSO) δ 8.31 (d,1H,J=8Hz), 8.02 (d,2N,J=8Hz), 7.64 (m, 1H), 7.52 (m,4H), 7.38 (d,1H,3-8Hz), 7.12 (d,2H,J=8Hz), 6.19 (t,1H,J=6.5Hz), 4.43 (m,1H), 3.97 (m,1H), 3.02 (m,2H), 2.30 (m,5H), 0.89 (s,9H), 0.11 (s,6H).
Ein Gemisch aus 3,40 g (5,63 mMol) 5'-Amino-N6-benzoyl-3'-O-t- butyldimethylsilyl-2',5'-dideoxycytidin-p-toluolsulfonatsalz und 4Å Molekularsieb ( 5 g) in 30 ml 50% wasserfreiem DCM/Acetonitril wurde 1 h unter Stickstoff gerührt. Nach Kühlen auf 0ºC wurden 0,78 ml (5,63 mMol) Triethylamin zugesetzt und das Rühren wurde 10 min fortgesetzt. Schließlich wurden 3,9 ml (3,9 mMol) Chlorsulfonylazid (1M in Acetonitril) zugesetzt, das Kühlbad wurde entfernt und die Reaktion wurde 2,5 h gerührt. Die Anschlämmung wurde filtriert und das Filtrat wurde zwischen halbgesättigter Kochsalzlösung und 300 ml EtOAc verteilt. Die organische Schicht wurde mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und einged. Reinigung durch Chromatographie an Kieselgel (1 bis 4% Methanol/DCM) ergab 0,99 g Produkt, daß zwei Verunreinigungen enthielt. Die weitere Chromatographie lieferte reines N6-Benzoyl-3'-O-t-butyldimethylsilyl-5'-sulfamoylazido-2',5'-dideoxycytidin als weißen Schaum:
NMR (300 MHz, d&sub6;-DMSO) δ 11,27 (br, 1H), 9,30 (br, 1H), 8,21 (d,1H,J=8Hz), 8.01 (m,2H), 7.62 (m,1H), 7.50 (t,2H,J=8Hz), 1 7.37 (d,1H,J=8Hz), 6.17 (t,IH,J=6.5Hz), 4.39 (m,1H), 3.95 (m,1N), 3.35 (m,2H), 2.27 (m,2H), 0.89 (s,9H), 0.10 (s,6H).

Beispiel 3

Herstellung von 3'-O-t-Butyldimethylsilyl-N4-isobutyryl-O6-(4- nitrophenethyl)-5'-sulfamoylazido-2',5,-dideoxyguanosin

Mittels des Verfahrens in Zitat 37 ergaben 5,00 g (17,5 mMol) 2'-Deoxyguanosin (Sigma, St. Louis, MO), 63 ml wasserfreies DCM, 13 ml wasserfreies Pyridin und 9,3 ml (88 mMol) Isobutyrylchlorid 10,34 g rohes N4, (3',5'-O)-Tri-isobutyryl-2'-deoxyguanosin.
Nach Lösen von 10,34 g (~17 mMol) rohem N4,(3',5'-O)-Tri-isobutyryl-2'-deoxyguanosin in 70 ml wasserfreiem DCM unter Stickstoff wurden 8,91 g (34 mMol) Triphenylphosphin und 5,68 g (34 mMol) 4-Nitrophenethylalkohol zugesetzt und unter Rühren gelöst. Nach Kühlen auf 0 ºC wurden während 5 Minuten (min) 5,3 ml (34 mMal) Azodicarbonsäurediethylester zugesetzt. Das Kältebad wurde entfernt und die Reaktion wurde 18 h gerührt. Eine DSC des Reaktionsgemisches (10% Methanol/DCM) zeigte an, daß noch etwas Ausgangsmaterial zugegen war. Triphenylphosphin (4,45 g), 4- Nitrophenethylalkohol (5,30 g) und Azodicarbonsäurediethylester (2,65 ml) wurden nacheinander zugesetzt und das Gemisch wurde noch eine h gerührt. Das Lösungsmittel wurde abgedampft und der Rückstand wurde direkt bei der nächsten Reaktion verwendet. Eine Probe wurde durch Chromatographie an Kieselgel (1 bis 5% Methanol/DCM) unter Ergeben von N4,(3',5',-O)-Tri-isobutyryl-O6-(4- nitrophenethyl)-2'-deoxyguanosin als weißem Schaum gereinigt:
NMR (300MHz,CdCl&sub3;) δ 8.17 (d,2H,J=8Hz), 8.07 (br,1H), 7.97 (s,1H), 7.53 (d,2H,J=8Hz), 6.36 (dd,1H,J=7,6Hz), 5.43 (m,1H), 4.84 (t,2H,J=7Hz, 4.54 (dd,1H,J=12,5Hz), 4.39 (m,2H), 3.33 (t,2H,J=7Hz), 2.5- 3.1 (m,5H), 1.39 (d,6H,J=7Hz), 1.32 (d,6H,J=7Hz), 1.26 (d,3H,J=7Hz), 1.24 (d,3H,J=7Hz);
Rohes N4, (3',5',-O)-Tri-isobutyryl-O6-(4-nitrophenethyl)-2'-deoxyguanosin (~ 17 mMol) wurde in 400 ml Methanol gelöst und 400 ml 27%iges Ammoniumhydroxid wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde trübe, daher wurde genug Methanol (100 ml) zugesetzt, um die Reaktion homogen zu machen. Nach 20 h Rühren bei RT wurden die Lösungsmittel abged. und der Rückstand wurde in 100 ml DCM aufgenommen. Genug Hexan, um die Reaktion trübe zu machen, wurde zugesetzt. Nach Stehen über Nacht wurden die hellgelben Kristalle unter Ergeben von 5,83 g N4-Isobutyryl-O6-(4-nitrophenethyl)- 2'-deoxyguanosin gesammelt. Eine zweite Kristallisation ergab zusätzliches Material für insgesamt 8,60 g N4-Isobutyryl-O6-(4- nitrophenethyl)-2'-deoxyguanosin:
NMR (300MHz,20% d4-methanol/CDCl&sub3;) δ 8.18 (d,2H,J=9Hz), 8.17 (s,1H), 7.57 (d,2H,J=9Hz), 6.38 (t,1N,J=7Hz), 4.84 (t,2H,J=7Hz), 4.72 (m, 1H), 4.07 (q,1H,J=4Hz), 3.83 (ddd,2H,J=33,12,4Hz), 3.33 (t,2H,J=7Hz), 2.75-2.9 (m,2H), 2.44 (ddd,1H,J=14,7,4Hz), 1.37 (d,6H,J=8Hz).
Eine Lösung von 7,28 g (14,9 mMol) N4-Isobutyryl-O6-(4-nitrophenethyl)-2'-deoxyguanosin in 75 ml wasserfreiem Pyridin wurde unter Stickstoff auf 0ºC gekühlt. Nach Zusetzen von 2,84 g (14,9 mMol) p-Toluolsulfonylchlorid wurde die Reaktion 2 h bei 0ºC und anschließend 18 h bei 5ºC gerührt. Das Pyridin wurde abged. und der Rückstand wurde zwischen Wasser und EtOAc verteilt. Die organische Schicht wurde mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und unter Ergeben von 6,22 g einged. Die Reinigung durch Chromatographie an Kieselgel (1 bis 5% Methanol/DCM) ergab 4,08 g N4-Isobutyryl-O6-(4-nitrophenethyl)-5'O-p-toluolsulfonyl-2'- deoxyguanosin als weißen Schaum:
(300MHz,20% d&sub6;-DMSO) δ 10.34 (br,1H), 8.24 (s,1H), 8.19 (d,2H,J=8Hz), 7.67 (d,2H,J=8Hz), 7.61 (d,2H,J=8Hz), 7.22 (d,2H,J=8Hz), 6.38 (t,1H,J=7Hz), 5.46 (d,1H,J=5Hz), 4.82 (t,2H,J=7Hz), 4.64 (m, 1H), 4.33 (ddd,2H,J=26,12,8Hz), 3.97 (m,1H), 3.35 (t,2H,J=7Hz), 2.82 (m,2H), 2.27 (s,3H), 1.12 (d,3H,J=7Hz), 1.10 (d,3H,J=7Hz).
Eine Lösung aus 4,08 g (6,35 mMol) N4-Isobutyryl-O6-(4-nitrophenethyl)-5'O-p-toluolsulfonyl-2'-deoxyguanosin und 467 mg (9,52 mMol) Lithiumazid (Kodak, Rochester, NY) in 21 ml wasserfreiem DMF wurde 3 h auf 10ºC erhitzt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde zwischen Wasser und EtOAc verteilt. Die organische Schicht wurde mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und einged., um 3,95 g Rohprodukt zu ergeben. Reinigung durch Chromatographie an Kieselgel (1 bis 10% Methanol/DCM) ergab 1,47 g weniger polares Material und 419 mg polareres Material. Das weniger polare Material war ein weißer Schaum und wurde als 5'-Azido-N4-isobutyryl-O6-(4-nitrophenethyl)-2',5'-dideoxyguanosin erkannt:
NMR (300MHz, d&sub6;-DMSO) δ 10.40 (br,1H), 8.41 (s,1H), 8.18 (d,2H,J=8Hz), 7.64 (d,2H,J=8Hz), 6.37 (t,1H,J=7Hz), 5.46 (d,1H,J=4Hz), 4.79 (t,2H,J=7Hz), 4.63 (m,1H), 3.97 (m, 1H), 3.86 (dd,1H,J=13,8HZ), 3.53 (dd,1H,J=13.5Hz), 3.36 (t,2H,J=7Hz), 3.05 (m,1H), 2.84 (m,1H), 2.28 (ddd,1H,J=14,6,3Hz), 1.12 (d,6H,J=8Hz).
Auf dieselbe Weise wie für 5'-Azido-N6-benzoyl-3'O-t-butyldimethylsilyl-2',5'-dideoxycytidin wurden 1,47 g (2,87 mMol) 5'- Azido-N4-isobutyryl-O6-(4-nitrophenethyl)-2',5'-dideoxyguanosin, 0,65 g (4,3 mMol) t-Butyldimethylsilylchlorid, 0,39 g (5,7 mMol) Imidazol und 10 ml wasserfreies DMF verwendet, um nach Chromatographie an Kieselgel (10% EtOAc/DCM) 1,49 g 5'-Azido-3'-O-t- butyldimethylsilyl-N4-isobutyryl-O6-(4-nitrophenethyl)-2',5,- dideoxyguanosin als weißen Schamn zu erhalten:
NMR (300MHz, d&sub6;-DMSO) δ 10.40 (br,1H), 8.40 (s,1H), 8.18 (d,2H,J=9Hz), 7.65 (d,2H,J=9Hz), 6.35 (t,1H,J=7Hz), 4.78 (t,2H,3-7Hz), 4.73 (m, 1H), 3.94 (m, 1H), 3.84 (dd,1H,J=13,8Hz), 3.56 (dd,1H,J=13,5Hz), 3.31 (t,2H,J=7Hz), 3.10 (m, 1H), 2.82 (m,1H), 2.29 (m, 1H), 1.10 (d,6H,J=7Hz), 0.89 (S, 9H), 0.14 (s,3H), 0.12 (s,3H).
Ein Gemisch von 100 mg (0,159 mMol) 5'-Azido-3'-O-t-butyldimethylsilyl-N4-isobutyryl-O6-(4-nitrophenethyl)-2',5'-dideoxyguanosin, 0,064 ml (0,64 mMol) 1,3-Propandithiol, 0,089 ml (0,64 mMol) Triethylamin und 1 ml Methanol wurde 4 Tage bei RT unter Stickstoff gerührt. Nach Zusetzen von 0,5 ml Essigsäure wurde die Reaktion im Vakuum eingeengt. Reinigung durch Chromatographie an Kieselgel (1 bis 15% Methanol/DCM) ergab 121 mg Essigsäuresalz des Produkts. Dieses Material wurde zwischen gesättigtem Kaliumcarbonat und EtOAc verteilt. Die organische Schicht wurde getrocknet und einged., um 91 mg 5'-Amino-3'-O-t-butyldimethylsilyl-N4-isobutyryl-O6-(4-nitrophenethyl)-2',5'-dideoxyguanosin zu ergeben:
NMR (300MHz, CDCl&sub3;) δ 8.17 (d,2H,J=8Hz), 7.98 (s,1H), 7.90 (br,1H), 7.52 (d,2H,J=8Hz), 6.28 (t,1H,J=7Hz), 4.80 (t,2H,J=7Hz), 4.71 (m,1H), 3.93 (q,1H,J=4Hz), 3.32 (t,2H,J=7Hz), 3.04 (dd,1H,J=14,4Hz), 2.93 (dd,1H,J=14,6Hz), 2.84 (m,1H), 2.39 (m,1H), 1.28 (d,6H,J=7Hz), 0.93 (s,9H), 0.13 (s,3H), 0.11 (s,3H).
Eine Lösung von 90 mg (0,15 mMol) 5'-Amino-3'-O-t-butyldimethylsilyl-N4-isobutyryl-O6-(4-nitrophenethyl)-2',5'-dideoxyguanosin in 2 ml wasserfreiem DCM wurde bei RT unter Stickstoff gerührt, während 0,11 ml Chlorsulfonylazid (1M Acetonitril) zugesetzt wurden. Nach 1 h Rühren wurde die Lösung zwischen halbgesättigter Kochsalzlösung und EtOAc verteilt. Die organische Schicht wurde mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und einged. Der Rückstand wurde durch Chromatographie an Kieselgel (1 bis 3% Methanol/DCM) unter Ergeben von 18 mg 3'-O-t-Butyldimethylsilyl N4-isobutyryl-O6-(4-nitrophenethyl)-5'-sulfamoylazido-2',5'-dideoxyguanosin gereinigt: NMR (300 MHz, CDCl&sub3;) 6 8,67 (br,1H), 8.46 (t,1H,J=6Hz), 8.16 (d,2H,J=8Hz)1 7.61 (s,1H), 7.54 (d,2H,J=8Hz), 6.17 (dd,1H,J=8,6Hz), 4.67 (m,3H), 4.17 (m,1H), 3.57 (m, 1H), 3.34 (t,2H,J=7Hz), 2.98 (m,1H), 2.65 (m,1H), 2.25 (m,1H), 1.27 (d,3H,J=7Hz), 1.26 (d,3H,J=7Hz), 0.93 (s,9H), 0.16 (s,3H), 0.14 (s,3H).

Beispiel 4

Herstellung von 3'-O-t-Butyldimethylsilyl-5'-sulfamoylazido-5'- deoxythymidin

Eine Lösung von 25,0 g (93,6 mMol) 5'-Azido-5'-deoxythymidin (das wie in Zitat 36 hergestellt werden kann), 21,1 g (140 mMol) t-Butyldimethylsilylchlorid und 12,7 g (187 mMol) Imidazol in 190 ml wasserfreiem DMF wurde 18 h bei RT unter Stickstoff gerührt. Das DMF wurde im Vakuum entfernt. Das Öl wurde zwischen Ether (500 ml) und 1N NaOH (2 x 300 ml) verteilt. Die wäßrigen Schichten wurden mit Eis gekühlt und 650 ml 1N HCl wurden zugesetzt. Das Produkt wurde mit EtOAc (2 x 750 ml) extrahiert und die organische Schicht wurde mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und einged. Nach 24 h Verbleiben im Hochvakuum kristallisierte das Öl unter Ergeben von 27,9 g 5'-Azido-3'-O-t- butyldimethylsilyl-5'-deoxythymidin als weißer Feststoff: NMR (300MHz,d&sub6;-DMSO) δ 11.34 (br,1H), 7.50 (s,1H), 6.16 (t,1H,J=7Hz), 4.3G (m, 1H), 3.84 (m,1H), 3.55 (m,2H), 2.34 (m,1H), 2.05 (m,1H), 1.79 (s,3ZH), 0.86 (s,9H), 0.08 (s, 6H).
Ein Gemisch aus 15,0 g (39,3 mMol) 5'-Azido-3'-O-t-butyldimethylsilyl-5'-deoxythymidin und 4,0 g 10% Pd/C in 200 ml EtOAc wurde 4,5 h unter 1 atm Wasserstoff heftig gerührt. Die Anschlämmung wurde unter Spülen mit Methanol durch Celite filtriert. Das Filtrat wurde unter Ergeben von 15,5 g dickem Öl einged. (enthält etwas Lösungsmittel). Eine Probe wurde durch Chromatographie an Kieselgel (2-10% Methanol/DCM) unter Ergeben reinen 5'-Amino-3'-O-t-butyldimethylsilyl-5'-deoxythymidins als weißer Feststoff gereinigt:
NMR (300MHz,d&sub6;-DMSO) δ 7.64 (s,1H), 6.13 (dd,1H,J=8,6Hz), 4.37 (m,1H), 3.65 (m,1H), 2.78 (m,2H), 2.21 (m,1H), 2.01 (ddd,1H,J=12,6,4Hz), 1.79 (s,3H), 0.88 (s,9H), 0.08 (s,6H).
Ein Gemisch aus 5,52 g 5'-Amino-3'-O-t-butyldimethylsilyl-5'- deoxythymidin und 168 mg Ammoniumsulfat in 150 ml Hexamethyldisilazan (HDMS) wurde zur Auflösung unter Stickstoff erhitzt. Nach 18 Stunden Rühren bei RT wurde die Anschlämmung 2 h auf 80ºC erhitzt. Das HDMS wurde im Vakuum unter Ergeben eines dicken Öls entfernt, das in 45 ml wasserfreiem Acetonitril unter Stickstoff gelöst wurde. Diese Lösung wurde einem Tropftrichter zugesetzt und innnerhalb 25 Minuten in 10 ml auf 0ºC vorgekühltes Chlorsulfonylazid (1M in Acetonitril) getropft. Nach der Zugabe wurde das Kältebad entfernt und das Gemisch wurde 1 h gerührt. Die Reaktion wurde auf 200 ml halbgesättigte Kochsalzlösung gegossen und mit EtOAc (2 x 200 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und einged., um 5,29 g Feststoff zu ergeben. Reinigung durch Chromatographie an Kieselgel (1 bis 5% Methanol/DCM) ergab 3,70 g ziemlich reines 3'-O-t-Butyldimethylsilyl-5'-sulfamoylazido-5'-deoxythymidin als lohfarbenen Schaum:
NMR (300MHz,CDCl&sub3;) δ 8.57 (br,1H), 7.02 (s,1H), 6.88 (br,1H), 5.75 (t,1H,J=8Hz), 4.49 (m,1H), 4.04 (m, 1H), 3.48 (m,2H), 2.72 (m,1R), 2.18 (m,1H), 1.92 (s,3H), .89 (s,9H), .11 (m,6H).

Beispiel 5

Herstelluna von 3'-O-Acetyl-5'-sulfamoylazido-5'-deoxythymidin

Ein Gemisch aus 1,00 g (3,53 mMol) 5'-Amino-3'-O-acetyl-5'- deoxythymidin (das wie in Zitat 38 hergestellt werden kann) und 94 mg Ammoniumsulfat wurden in 20 ml HMDS 18 bei RT unter Stickstoff gerührt. Die Anschlämmung wurde 24 h gelinde erwärmt (60ºC). Das HMDS wurde im Vakuum in eine Falle bei -78ºC entfernt. Acetonitril (40 ml) wurde unter Stickstoff unter Ergeben einer homogenen Lösung zugesetzt. Nach Zusetzen von 5,0 ml Chlorsulfonylazid (1,0 M in Acetonitril) zu der Reaktion wurde das Gemisch 1,5 h gerührt. Wasser (50 ml) wurde zugesetzt und das Produkt wurde mit EtOAc (2 x 150 ml) extrahiert. Die Organischen Schichten wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und unter Ergeben von 0,89 g eines Feststoffs einged. Reinigung durch Chromatographie an Kieselgel (1 bis 5% Methanol/DCM) ergab 0,64 g reines 3'-O-Acetyl-5'-sulfamoylazido-5'-deoxythymidin als Schaum:
NMR (300MHz,d6-DMSO) δ 11.40 (Br,1H), 9.31 (Br,1H), 7.59 (s,1H), 6.17 (dd,1H,J=7.5,6.5Hz), 5.14 (m,1H), 4.03 (m,1H), 3.44 (m,2H), 2.47 (m,1H), 2.25 (m,1H), 2.07 (s,3H), 1.80 (s,3H); IR (Film) 3200, 2920, 2840, 2135, 1730, 1685, 1365, 1240, 1170 cm&supmin;¹; Massenspektrum (FAB) gern. 388.98 m/z, ber. für C&sub1;&sub2;H&sub1;&sub6;N&sub6;O&sub7;S 389.08 (M+H);

Beispiel 6

Herstellung von 5'-Diinethoxytrityl-3'-sulfamoylazido-3'-deoxythymidin

Eine Anschlämmung von 2,17 g 3'-Azido-3'-deoxythymidin (Aldrich, Milwaukee, WI) und 0,91 g 10% Pd/C in 25 in1 Ethanol wurde 4 h unter 1 atm Wasserstoff heftig gerührt. Das Gemisch wurde durch Celite filtriert, mit Methanol gewaschen und das Filtrat wurde einged. Reinigung durch Chromatographie an Kieselgel (2 bis 40% Methanol/DCM) ergab 1,72 g 3'-Amino-3'-deoxythymidin als hellgelben Feststoff: NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ 7,76 (s,1H), 6.07 (t,1H,J=6Hz), 4.97 (m,1H), 3.5-3.7 (m,3H), 3.39 (q,1H,J=7Hz), 3.33 (br,2H), 1.9-2.15 (m,2H), 1.77 (s,3H).
Eine Lösung von 1,04 g 3'-Amino-3'-deoxythyinidin, 0,90 ml Triethylamin und 1,5 ml Trifluoressigsäureethylester in 10 ml Methanol wurde 20 h bei RT unter Stickstoff gerührt. Eindampfen ergab ein Produkt, das ohne Reinigung verwendet wurde. Eine Probe wurde der Säulenchromatographie an Kieselgel (1 bis 20% Methanol/DCM) unter Liefern reinen 3'-Trifluoracetamido-3'- deoxythymidins unterzogen:
NMR (300MHz,d6-DMSO) δ 11.33 (br,1H), 9.84 (br,1H), 7.76 (s, 1H), 6.26 (t,1H,J=7Hz), 5.15 (t,1H,J=5Hz), 4.47 (m,1H), 3.89 (m,1H), 3.6 (m,2H), 2.27 (m,2H), 1.78 (s, 3H).
Einer Lösung rohen 3'-Trifluoracetamido-3'-deoxythymidins in Pyridin wurden 1,2 ml Triethylamin, 0,10 g N,N-Dimethylaininopyridin und 2,2 g Dimethoxytritylchlorid unter Stickstoff zugesetzt. Nach 18 h Rühren wurde das Lösungsmittel einged. Das dunkle Öl wurde zwischen halbgesättigtem Bicarbonat und EtOAc verteilt. Die organische Schicht wurde mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und einged. Reinigung durch Chromatographie an Kieselgel (1 bis 7% Methanol/DCM) ergab 2,18 g reines 5re Dimethoxytrityl-3'-trifluoracetamido-3'-deoxythymidin als gelben Feststoff:
NMR (300MHZ,CDCl&sub3;) δ 6.89 (br,1H), 8.31 (d,1H,J=7Hz), 7.65 (s, 1H), 7.2-7.45 (m, 9H); 6.84 (d,4H,J=9Hz), 6.51 (t,1H,J=7Hz), 4.72 (m,1H), 4.09 (m,1H), 3.78 (s, 6H), 3.53 (m,2H), 2.45 (m,2H), 1.64 (s,3H).
Eine Lösung von 1,54 g 5'-Dimethoxytrityl-3'-trifluoracetamido- 3'-deoxythymidin in Methanol wurde bei RT mit Ammoniakgas gesättigt. Das Reaktionsgefäß wurde 4 Tage verschlossen. Nachdem das Lösungsmittel abged. war, wurde der Rückstand mittels Chromatographie an Kieselgel (1 bis 10% Methanol/DCM) unter Ergeben von 1,17 g 3'-Amino-5'-O-dimethoxytrityl-3'-deoxythyinidin gereinigt: NMR (300MHz,d6-DMSO)
δ 7.51 (s,1H), 7.2-7.45 (m, 9H), 6.88 (d,4H,J=8Hz), 6.14 (t,1H,J=6Hz), 3.74 (s, 6H), 3.68 (m,1H), 3.50 (q,1H,J=7Hz), 3.33 (br,2H), 3.21 (m,2H), 2.21 (m,1H), 2.03 (m,1H), 1.47 (s,3H).
Auf dieselbe Weise wie bei Beispiel 4 wurden 605 mg 3'-Amino-5'- O-dimethoxytrityl-3'-deoxythyrnidin, 20 ml HDMS, 0,78 ml Chlorsulfonylazid (1M in Acetonitril) und 6 ml wäßriges Acetonitril zum Erhalten (nach Reinigung an Kieselgel mittels 1 bis 5% Methanol/DCM) von 217 mg 5'-Dimethoxytrityl-3'-sulfamoylazido- 3'-deoxythymidin als hellorangefarbenem Feststoff verwendet:
NMR (300MHz,CDCl&sub3;) δ 7.58 (s, 1H), 7.2-7.4 (m, 9H), 6.85 (d,4H,J=9Hz), 6.55 (t,1H,J=7Hz), 4.31 (m, 1H), 4.23 (m,1H), 3.78 (s, 6H), 3.50 (dd,1H,J=11,3Hz), 3.39 (dd,1H,J=11,3Hz), 2.46 (m,2H), 1.47 (s,3H).

Beispiel 7

Herstellung des sulfamatverknüpften Dimers d(AsT)

Ein Gemisch von 480 mg Verbindung des Beispiels 4 und 493 mg N6- Benzoyl-5'-dimethoxytrityl-2'-deoxyadenosin (Aldrich, Milwaukee, Wl) in 7 ml trockenem Acetonitril wurde 2 h mit etwas 4Å Mol.sieb gerührt. Der Reaktion wurden 0,17 ml Triethylamin zugesetzt und es wurde 18 h gerührt. Das Gemisch wurde filtriert und einged. Reinigung durch Chromatographie an Kieselgel (1-7% Methanol/DCM) ergab 621 mg (DMTO)ABzsT(OTBDMS) als weißen Feststoff: NMR (300MHz,d6-DMSO) δ 11.33 (3,1H), 11.23 (br,1H), 8.58 (s,1H), 8.57 (s,1H), 8.51 (br,1H), 8.05 (m,2H), 7.5-7.7 (m,4H), 7.34 (m,2H), 7.21 (m,7H), 6.80 (dd,4H,J=8,5Hz), 6.52 (t,1H,J=7Hz), 6.14 (t,1H,J=7Hz), 5.28 (m,1H), 4.37 (m,2H), 3.81 (m,1H), 3.71 (s,6H), 3.29 (m,4H), 3.14 (dd,1H,J=17,5Hz), 2.78 (m,1H), 2.26 (m,1H), 2.04 (m,1H), 1.77 (s,3H), 0.87 (s,9H), 0.09 (s,6H). Massenspektrum (FAB) m/z 1075.47 (M+H zugeordnet), ber. für C&sub5;&sub4;H&sub6;&sub2;N&sub8;O&sub1;&sub2;SSi + H 1075.40. IR (CH&sub2;Cl&sub2;) 3380, 3180, 3060, 2960, 2930, 2860, 1695, 1610, i585, 1510, 1360, 1180, 1250 CM-1.
Das vollständig geschützte Dimer, (DMTO)ABzsT(OTBDMS), wurde mit insgesamt 6 ml 1M Tetra-n-butylammoniumfluorid/THF (Aldrich) in vier gleichen aliquoten Mengen in Abständen von einer h behandelt (ein kleines s bezeichnet die Sulfamatbindung). Nach der letzten Zugabe wurde die Reaktion 1 h gerührt. Die Lösung wurde zwischen 1M Natriumdihydrogenphosphat und Essigsäureethylester (EtOAc) verteilt. Die organische Schicht wurde mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und einged. Das Rohprodukt wurde unter Ergeben von 420 mg (DMTO)ABzsT(OH) als Feststoff an Kieselgel chrom. (1-7% Methanol/DCM): NMR (300 MHz, d&sub6;- DMSO) x 11.31 (Br,1H), 11.22 (br,1H), 8.58 (s,2H), 8.47 (br,1H), 8.03 (m,2H), 7.45-7.7 (m,4H), 7.34 (m,2H), 7.20 (m,7H), 6.81 (dd,4H,J=8,5Hz), 6.52 (t,1H,J=7Hz), 6.14 (t,1H,J=7Hz), 5.39 (d,1H,J=5Hz), 5.29 (m,1H), 4.38 (m,2H), 4.17 (m,1H), 3.80 (m,1H), 3.72 (s,6H), 3.3 (m,4H), 3.14 (m,1H), 2.79 (m,1H), 2.4 (m,1H), 2.15 (m,1H), 1.76 (s,3H). IR (KBr) 3400, 3180, 3055, 2955, 2930, 2830, 1690, 1610, 1580, 1510, 1360, 1250, 1180 cm- 1. Massenspektrum (FAB) 961.66 (M+H), ber. für C&sub4;&sub8;H&sub4;&sub8;N&sub8;O&sub1;&sub2;S + H 961.07.
Einer Lösung von 102 mg (DMTO)ABzsT(OH) in 5 ml Acetonitril wurden 0,22 ml Dichloressigsäure zugesetzt. Die orangefarbene Lösung wurde 15 min bei RT gerührt. Nach Gießen der Reaktion in halbgesättigtes Bicarbonat wurde das Produkt mit EtOAc (2 x 40 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und einged. Reinigung durch Chromatographie an Kieselgel (1-10% Methanol/DCM) ergab 68 mg (HO)ABzsT(OH): NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ 11,33 (br,1H), (HO)ABzsT(OH): NMR (300MHz,d6-DMSO) δ 11.33 (br,1H), 11.26 (br,1H), 8.77 (s,1H), 8.70 (s,1H), 8.47 (br,1H), 8.06 (d,2H,J=8Hz), 7.66 (t,1H,J=8Hz), 7.59 (s,1H), 7.55 (d,2H,J=8Hz), 6.52 (t,1H,J=7Hz), 6.18 (t,1H,J=7Hz), 5.41 (d,1H,J=5Hz), 5.32 (t,1H,J=5Hz), 5.23 (m,1H), 4.25 (m, 1H), 4.19 (m,1H), 3.82 (m,1H), 3.65 (m,2H), 3.0-3.3 (m,3H), 2.78 (m,1H), 2.0-2.3 (m,2H), 1.79 (s,3H). IR (KBr) 3420, 1690, 1620, 1585, 1360, 1175 cm&supmin;¹. Massenspektrum (FAB) gem. 659.23 (M+H), ber. für C27H30N8O10S + H: 659.19.
Eine Anschlämmung von 31 mg (HO)ABzsT(OH) in 3 ml Methanol wurde bei RT mit Ammoniakgas gesättigt. Die Reaktion wurde verschlossen und 4 h auf 55ºC erhitzt. Das Lösungsmittel wurde einged. Reinigung durch Chromatographie an Kieselgel (Methanol/DCM- Gradient) ergab 19 mg d(AST): NMR
(300MHz,d6-DMSO) δ [Teilspektrum] 8.34 (s,1H), 8.14 (s,1H), 7.35 (s,1H), 7.41 (br,2H), 6.37 (dd,1H,J=9,6Hz), 6.17 (t,1H,J=7Hz), 5.67 (br,1H), 5.39 (d,1H,J=5Hz), 5.18 (m,1H), 4.2 (m,2H), 3.81 (m,1H), 3,63 (m,2H), 3.19 (m,1H), 3.01 (m,1H), 2.66 (m,1H), 2.18 (m,1H), 1.78 (s,3H).

Beispiel 8

Herstellung eines sulfamatesterverknüpften dA-Nucleosiddimers d(AsA)

Ein Gemisch aus 57 mg (0,10 mMol) Verbindung des Beispiels 1, 65 mg (0,10 mMol) und N6-Benzoyl-5'-dimethoxytrityl-2'-deoxyadenosin (Aldrich) in 0,5 ml Acetonitril wurde bei RT unter Stickstoff gerührt. Triethylamin, 0,028 ml (0,2 mMol) wurde zugesetzt und die Reaktion wurde 20 h gerührt. Nach Eindampfen des Gemischs und Reinigung durch chromatographie an Kieselgel (1-3% Methanol/DCM) wurden 87 mg vollständig geschütztes Dimer, (DMTO)ABzsABz(OTBDMS) erhalten: NNR (Teilspektrum) (300MHz,d6-DMSO) δ 11.23 (br,2H), 8.66 (s,1H), 8.65 (s,1H), 8.58 (s,1H), 8.56 (s,1H), 8.56 (br,1H), 8.04 (d,4H,J=8Hz), 7.5-7.7 (m,6H), 7.15-7.35 (m,9H), 6.77 (dd,4H,J=8,6Hz), 6.53 (t,1H,J=7Hz), 6.47 (t,1H,J=7Nz), 5.27 (m, 1H), 4.64 (m,1H), 4.34 (m,1H), 4.01 (m,1H), 3.68 (s,6H), 3.02 (m,1H), 2.78 (m,1H), 2.36 (m,1H), 0.91 (s,9H), 0.15 (s,6H).
51 mg (DMTO)ABzsABz(OTBDMS) wurden unter Stickstoff mit insgesamt 1,5 ml 1M Tetra-n-butylammoniumf luorid in THF behandelt, das in drei aliquoten Mengen in Abstanden von 1 h zugesetzt wurde. Die Reaktion wurde nach der letzten Fluoridreagenzzugabe 1 h bei RT gerührt. Die Reaktion wurde zwischen 1M Natriumdihydrogenphos phat und EtOAc verteilt. Die organische Schicht wurde mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und einged. Reinigung durch Säulenchromatographie an Kieselgel (1-6% Methanol/DCM) ergab 36 mg reines (DMTO)d(ABzsABz)(OH): NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ 11.22 (br,2H), 8.67 (s,1H), 8.65 (s,1H), 8.58 (br,2H), 8.54 (br,1H), 8.05 (d,4H,J=7Hz), 7.5-7.7 (m,6H), 7.33 (m,2H), 7.2 (m,7H), 6.79 (dd,4H,J=7Hz), 6.52 (t,1H,J=7Hz), 6.47 (t,1H,J=7Hz), 5.53 (d,1H,3=5Hz), 5.37 (m,1H), 4.45 (m,1H), 4.34 (m,1H), 4.01 (m,1H), 3.69 (s,6H), 3.1-3.5 (m,5H(est.)), 2.7-2.95 (m,2H), 2.38 (m,1H).
21 mg (DMTO)d(ABzsABz)(OH) wurden in einem verschlossenen Gläschen 3 Tage bei RT mit 3 ml gesättigtem NH&sub3;/MeOH behandelt. Das Lösungsmittel wurde eingedampft und der Rückstand wurde mit 1 ml 80% HOAc/Wasser 45 min bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wurde mittels einer Vakuumpumpe/Rotationsverdampfers und eines Wasserbads bei RT entfernt. Reines d(AsA) wurde durch HPLC erhalten: C8 Rainin 10 mm x 25 cm Säule (mit Schutz), Gradient = 10-60% MeOH/Wasser (linear), Durchfluß = 3,5 ml/min, Probe in 20% MeoH/Wasser gelöst, 6c bei 21,2 min eluiert. NMR (Teilspektrum) (300 MHz, d4-MeOH, alle chemischen Verschiebungen bezogen auf MeCH @ 3.30) δ 8.23 (s,1H), 8.20 (s,1H), 8.19 (s,1H), 8.11 (s,1H), 6.37 (m,2H), 5.22 (d,1H,J=6Hz), 4.59 (m,1H), 4.33 (m,1H), 4.16 (dd,1H,J=7,4Hz), 3.74 (dq,2H,J=13,3Hz), 3.47 (m,2H), 2.85-3.0 (m,2H), 2.69 (ddd,1H,J=13,6,1.5Hz), 2.37 (ddd,1H,J=13,6,3Hz).

Beispiel 9

Herstellung eines Oligonucleotids mit einem an-die 2'- oder 3'- Stellung eines Ribonucleosids gebundenen Sulfamat [((Ph)&sub3;CO)[rU]sT(OTBDMS)]

Einer Lösung von 200 mg 5'-Trityluridin (Sigma, St. Louis, MO) und 189 mg 3'-O-t-Butyldimethylsilyl-5'-sulfamoylazido-5'-deoxythymidin (aus Beispiel 4) in 2,5 ml wasserfreiem Acetonitril wurden unter Stickstoff 0,11 ml Triethylamin zugesetzt. Nach 20 h Rühren bei RT wurde das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand wurde durch Chromatographie an Kieselgel (1 bis 7% Methanol/DCM) unter Ergeben von 81 mg Hauptprodukt als ein Fleck bei der DSC gereinigt. Die analytische HPLC zeigt ein 50:50- Produktgemisch. Präp. HPLC (C8 10 x 250 mm Säule mit Schutz (Rainin), Gradient: während 25 min 80-90% Methanol/0,1 M Triethylammoniumbicarbonat, Durchfluß = 4 ml/min, Probe: 10-15 mg/Injektion) lieferte reines [((Ph)&sub3;Co)[rU]sT(QTBDMS)] (2'-verknüpft) und reines [((Ph)3CO)[rU]sT(OTBDMS)] (3'-verknüpft). 2'- verknüpft: Retentionszeit = 16,61 min.; NMR (300Hz,d6-DMSO) δ 11.47 (br,1H), 11.34 (br,1H), 8.39 (br,1H), 7.69 (d,1H,J=8Hz), 7.25-7.4 (m,15H), 6.15 (dd,1H,J=7,6Hz), 5.93 (d,1H,J=4Hz), 5.71 (m,1H), 5.49 (d,1H,J=8Hz), 5.01 (m,1H), 4.42 (m,1H), 4.36 (m,1H), 3.99 (m,1H), 3.78 (m,1H), 3.23 (m,2H), 2.25 (m,1H), 2.03 (m,1H), 1.77 (s,3H), 0.87 (s,9H), 0.09 (s,6H).
3'-verknüpft: Ret.zeit = 18,15 min.; NMR (300 MHz, d&sub6;-DMSO) δ 11.46 (br,1H), 11.33 (br,1H), 8.37 (br,1H), 7.65 (d,1H,J=9Hz), 7.35-7.5 (m,16H), 6.13 (dd,1H,J=8,6Hz), 6.07 (br,1H), 5.79 (d,1H,J=6Hz), 4,87 (m,1H), 4.47 (m,1H), 4.34 (m,1H), 4.29 (m,1H), 3.80 (m,1H), 3.1-3.4 (m,7H), 2.24 (m,1H), 2.03 (m,1H), 1.76 (m,1H), 0.87 (s,9H), 0.08 (s,6H).

Beispiel 10

Herstellung eines sulfamatesterverknüpften Block-Dimer-phosphoroamidits [(DMTO)ABzsT(OP(OCH&sub2;CH&sub2;CN)N(iPr&sub2;))]

Nach Lösen von 294 mg (DMTO)AB2ST(OH) in 3 ml trockenem DCM wurden 116 ul 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphorodiamidit (Aldrich, Milwaukee, WI) und 31 mg Diisopropylainrnoniumtetrazolidsalz (hergestellt durch Mischen gleicher Mengen Tetrazol und Diisopropylamin) zugesetzt und das Gemisch wurde 1 h gerührt. Die Reaktion war nach DSC (10% Methanol/DCM) nicht vollständig. Weitere 60 ul 4d und 15 mg Tetrazolsalz wurden zugesetzt und das Rühren wurde 1 weitere h fortgesetzt. Die Reaktion wurde zwischen halbgesättigtem Bicarbonat und EtOAc verteilt. Die organische Schicht wurde mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und einged. Das Produkt wurde an Kieselgel (1-5% Methanol/DCM mit 0,5% Pyridin) unter Ergeben von 452 mg halbreinem [(DMTO)ABzsT(OP(OCH&sub2;CH&sub2;CN)N(iPr&sub2;))] chrom. Dieses Material wurde in 3 ml DCM gelöst und dies wurde 150 ml Pentan bei -78ºC unter Rühren zugesetzt. Der Niederschlag wurde filtriert und gesammelt. Man wiederholte dieses Verfahren einmal. Der weiße Feststoff wurde aus trockenem Pyridin (2x) gefolgt von trockenem Toluol eingedampft. Es wurde [(DMTO)ABzsT(OP(OCH&sub2;CH&sub2;CN)N(iPr&sub2;))] als weißer Feststoff erhalten (ohne weitere Reinigung verwendet): ³¹P-NMR (300 MHz, d&sub6;-DMSO) δ 151,133 (s), 150, 596 (s) geringfügige Verunreinigungen bei 15-21ppm); ¹H NMR (300MHz,d6-DMSO) δ 11.33 (br,1H), 11.21 (br(1H), 8.58 (s,2H), 8.52 (br,1H), 8.03 (m,2H), 7.1-7.7 (m), 6.80 (m,4H), 6.52 (t,1H,J=7Hz), 6.15 (t,1H,J=7Hz), 5.18 (m,1H), 4.46 (m,1H), 4.37 (m,1H), 3.9-4.1 (m), 2.88 (t,2H,J=6Hz), 2.77 (q,2H,J=6Hz), 2.2 (m,1H), 1.76 (s,3H), 1.17 (m). Massenspektrum (FAB) gem. 1161.76 (M+H), ber. für C57H65N10O13PS + H 1161.43.

Beispiel 11

Herstellung von Oligodeoxyribonucleotiden mit einer einzigen Sulfamatbindung

Das Oligodeoxynucleotid 5'd(GCGTGCATGC[AsT]CGTACG)3' (9c) wurde auf dem automatischen CODER-DNA-Synthetisierer im 1 Mikromol-Maßstab nach Standardvorschriften mit dem Block-Dimer-Phosphoroamidit ((DMTO)ABzsT(OP(OCH&sub2;CH&sub2;CN)N(iPr&sub2;))) (aus Beispiel 10) in einer am X-Anschluß angebrachten 0,1M Acetonitrillösung synthetisiert. Das Oligomer wurde von dem festen Träger mittels 27% Ammoniumhydroxid unter langsamer Elution während 1 h gespalten. Diese Lösung wurde in ein verschlossenes Gläschen verbracht und 4 h auf 55ºC erhitzt. Nach dem Eindampf en an einem Rotationsverdampfer wurde das Rohprodukt durch HPLC (C8-Säule, 10 mm x 25 cm) mittels eines linearen Gradienten von 5-15% Acetonitril/0,1 M Triethylammoniumacetat (TEAA) gereinigt. Das ölige Produkt wurde aus 50% Ethanol/Wasser eingedampft, bis ein weißes Pulver erhalten wurde. Das gereinigte Produkt besaß eine Retentionszeit von 9,00 min. (analytische C8-Säule von 10 cm, 1,0 ml/min, 5-20% CH&sub3;CN/0,1M TEAA während 15 min). Eine 5,0 ODs 9c/ml Wasser (steril) enthaltende Vorratslösung wurde hergestellt und im Gefrierschrank aufbewahrt.

Beispiel 12

Paaren eines Paares Oligodeoxvribonucleotide mit einzelnen Sulfamatbindungen

Der verwendete Puffer war wäßriges 10 mM Natriumphosphat, pH 7,00, das 200 mM Natriumchlorid und 0,1 M EDTA enthielt. Die Referenzzellen enthielten diesen Puffer. Man ließ komplementäre Stränge (jeweils 1,5 uM) bei 15ºC paaren und anschließend wurde die Uv-Absorption bei 260 nm gemessen, wobei die Temperatur auf 75ºC erhöht wurde (0,4ºC/min). Die sich daraus ergebenden Schmelzkurven werden in Figur 1 dargestellt. Die geschlossenen Rauten zeigen Daten des Oligonucleotidpaars 9a:9c (geschätzte Tm = 68ºC) und die offenen Quadrate zeigen Daten des Oligonticleotidpaars 9b:9d (geschätzte Tm = 72ºC). [Siehe nachstehend zu den Oligonucleotidsequenzen 9a, 9b und 9d.]

Beispiel 13

Nachweis der Exonukleasewiderstandsfähigkeit eines Oligodeoxyribonucleotids mit einer einzigen Sulfamatbindung

Die verwendeten Enzymvorratslösungen waren 1,8 Einheiten/ml SVP (Phosphodiesterase 1, Sigma, St. Louis, MO) und 147 Einheiten/ml AP (alkalische Phosphatase,Sigma, St. Louis, MO). Die verwendeten Pufferlösungen waren Tris (100 mM, pH 9) und MgCl&sub2; (50 mM). Die Verdauung wurde in 1,5 ml-Eppendorfröhrchen durch 18 h Inkubieren von 0,1 abs. Einheiten der Verbindung des Beispiels 14 mit 25,6 ul Tris-Puffer, 24 ul MgCl&sub2;-Puffer, 10 ul SVP-Vorratslösung und 13,6 ul AP-Vorratslösung bei 37ºC durchgeführt. Als nächstes wurde 2,5M Natriumacetat zugesetzt, gefolgt von 250 ul Ethanol. Nach 30 min Kühlen auf -78ºC und Zentrifugieren (12K Upm, 10 min) wurde der Überstand mit Ethanol auf 1 ml verdünnt und erneut zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und an einem Speed-Vac eingedampft. Der Rückstand wurde erneut in 1,0 ml sterilem Wasser gelöst und bei 4ºC gelagert, bis er analysiert wurde. Figur 2a zeigt ein HPLC-Chromatogramm eines Standardgemischs von dC, T, dG und dA. Figur 2b zeigt ein HPLC- Chromatogramm des Produktgemischs, das sich aus der längeren Verdauung von Oligodeoxynucleotid 9c ergibt. Es ist zu erkennen, daß wenn das die Sulfamatesterbindung enthaltende ODN über einen ausgedehnten Zeitraum verdaut wird, das Block-Dimer unversehrt daraus hervorgeht. Ein HPLC-Chromatogramm einer Probe des völlig entschützten Block-Dimers d(AsT), das unabhängig synthetisiert wurde (siehe Beispiel 19), bestätigte, daß der als [AST] gekennzeichnete Peak dieselbe Retentionszeit wie das synthetische Material besaß. Dies zeigt, daß die Sulfamatesterbindung gegenüber Exonukleasen äußerst widerstandsfähig ist.

Beispiel 14

Nachweis der Exonukleasewiderstandsfähigkeit eines Oligodeoxvribonucleotids mit einer einzigen Sulfamatbindung

Das Oligonucleotid 9a wurde wie in Beispiel II für 9c beschrieben synthetisiert. Die Oligonucleotide 9b und 9d wurden durch dem Fachmann wohlbekannte Standardverf ahren hergestellt. Die zusätzlichen Sequenzen sind:
9a 5'd (CGTACGATGC[AsT]GCACGC)3'
9b 5'd (CGTACGATGCATGCACGC)3'
9d 5'd (GCGTGCATGCATCGTACG)3'
Jeder der vier Oligomerstränge 9a-9d (10-100 pMol Enden) wurde mittels T4-Polynucleotidkinase (10 Einheiten) mit γ-³²P-ATP (3000 Ci/mMol) am 5'-Ende markiert. Die Stränge wurden durch Phenol : Chloroform-Extraktion, Chloroformextraktion, Etherextraktion und zwei aufeinanderfolgende Ethanolfällungen gereinigt. Überschüssiges ATP wurde mittels einer NACS PrePac-Säule gemäß der Standardvorschrift (BRL, Bethesda, MD) entfernt.
Die am 5'-Ende markierten, einzelsträngigen Oligomeren (12000 cpm, ~ 1 pMol) wurden mit ihren unmarkierten Gegenstücken (10 pMol) in 11 ul Puffer gepaart, welcher 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl&sub2; und 100 mM NaCl enthielt. Das Gemisch wurde 15 min auf 80ºC erhitzt und anschließend 60 min langsam auf Raumtemperatur gekühlt. Restriktionsendonuklease Nsi I (10 Einheiten in 1 ul) und 7 ul Enzymreaktionspuffer wurden jeder gepaarten Probe zugesetzt. Die Duplex-DNA- und Nsi I-Gemische wurde 60 min bei 37ºC abgestellt. Die Proben wurden durch den Zusatz von 10 ul 7,5 M Ammoniumacetat, 1 ul tRNA und 90 ul 100% Ethanol ethanolgefällt. Die Proben wurden 15 min bei 14000 Upm bei Raumtemperatur zentrifugiert, überstehende Flüssigkeit wurde entfernt und die DNA-Pellets wurden im Vakuum getrocknet. Die Proben wurden erneut in 3 ul Formamidfarbstoff suspendiert, der 80% entionisiertes Formamid, 0,1% Xylolcyanol und 0,1% Bromphenolblau enthielt und 20% denaturierendes Polyacrylamidgel wurde damit beladen. Die Proben wurden zwei Stunden der Elektrophorese bei 2000 V unterzogen. Das Gel wurde 8-24 Stunden bei 70ºC einem Kodak XAR-Film ausgesetzt. Die Ergebnisse werden in Figur 3 dargestellt. Bahn 1 und 2 enthalten mit Strang 9c beziehungsweise 9d gepaarten Strang 9a; Bahn 3 und 4 enthalten mit Strang 9c beziehungsweise 9d gepaarten Strang 9b; Bahn 5 und 6 enthalten mit Strang 9b beziehungsweise 9a gepaarten Strang 9c; Bahn 7 und 8 enthalten mit Strang 9b beziehungsweise 9a gepaarten Strang 9d. -S- zeigt die Sulfamatbindung an und -P- zeigt die Phosphodiesterbindung an.

Beispiel 15

Paaren eines Sulfamat-verknüpften A-Nucleosiddimers mit PolyU

Der verwendete Puffer war 10 mM Magnesiumchlorid und Tris (Base) und wurde mit 0,1M HCl auf pH 7,5 eingestellt. Die Referenzzelle enthielt diesen Puffer. Die Probenzelle enthielt 0,660 OD Einheiten PolyU (Sigma, St. Louis, MO) und 0,330 OD Einheiten d-AsA in 1,00 ml Puffer. Die Zellen wurden 1 Stunde bei 0,6ºC äquilibriert und die Temperatur wurde um 1ºC/min ansteigen lassen. Das Schmelzprofil wird in Figur 4 dargestellt. Die Tm wird zu 15-18ºC mit einem hypochromen Effekt von 35% geschätzt. Der berichtete Literaturwert für das entsprechende natürliche Phosphodiesterdimer, d-ApA beträgt 7,6ºC²&sup5;. Dieses Beispiel zeigt, daß nur Sulfamatbindungen enthaltende Oligodeoxynucleotide mit ihren komplementären, nicht-modifizierten Gegenstücken hybridisieren können und daß die Hybride eine größere Stabilität besitzen können.

Beispiel 16

Nachweis der Stabilität des Sulfamats, wenn es in 2'- oder 3'- Stellung eines Ribonucleotids gebunden ist

Eine Lösung von 1 mg 3'-verknüpftem ((Ph)&sub3;CO)[rU]sT(OTBDMS) (aus Beispiel 9) in 3 ml 27%igem Ammoniumhydroxid wurde 24 h in einem verschlossenen Gläschen inkubiert. Das Lösungsmittel wurde einged. Als der Rückstand durch HPLC analysiert wurde (analytische C18-Rainin-Säule (4,6 mm x 25 cm) mit Schutz, Durchfluß von 1,5 ml/min und linearer Gradient von 80-90% Methanol/Wasser während 15 min) hatte sich nichts vom Peak bei 12,375 min in 2'- verknüpftes ((Ph)&sub3;CO)[rU]sT(OTBDMS) (Ret.zeit 11,110 min) umgewandelt. Als 1 mg Probe 2'-verknüpftes ((Ph)&sub3;CO)[rU]sT(OTBDMS) in derselben Weise behandelt wurde, wurde ebenfalls keine Äquilibrierung beobachtet. Dies zeigt, daß sulfamatverknüpfte Oligoribonucleotidderivate hinsichtlich der Spaltung und Wanderung basenstabil sind.
1. G. Zon, Pharmaceut. Res., 5, 539-549 (1988).
2. P. S. Miller und P.O.P.Ts'O, in Ann. Rep. Med. Chem., No. 23, Vinick, Hrsg., S. 295-304, Academic Press, New York (1988).
3. "Antisense RNA and DNA", Reihe Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor (1988).
4. H. E. Moser und P. B. Dervan, Science, 238, 645-650 (1987).
5. C. Cazenave, N. Loreau, N. T. Thuong, J.-J. Toulme und C. Helene, Nucl. Acids Res., 15, 4717-4736 (1987).
6. U. Pieles und U. Englisch, Nucl. Acids. Res., 17, 285-299 (1989).
7. V. V. Vlassov, V. F. Zarytova, I. V. Kitiavin, S. V. Mamaev und M. A. Podyminogin, Nucl. Acids. Res., 14, 4065-4076 (1986).
8. B. C. F. Chu und L. E. Orgel, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82, 963-967 (1985).
9. C. B. Chen and D. S. Sigman, J. Amer. Chem. Soc., 110, 6570-6572 (1988).
10. F. Morvan, B. Rayner, J.-L. Imbach, S. Thenet, J. -R. Bertrand, J. Paoletti, C. Malvy und C. Paoletti, Nucl. Acids Res., 15, 3421-3437 (1987).
11. M. Weinfeld und D. C. Livingston, Biochem., 25, 5083-5091 (1986).
12. H. M. Moody, M. H. P. van Genederen, L. H. Koole, H. J. M. Kocken, E. M. Meijer, and H. M. Buck, Nucl. Acids Res., 17, 4769-4782 (1989).
13. M. Matsukura, K. Shinozuka, G. Zon, H. Mitsuya, M. Reitz, J. S. Cohen und S. Broder, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84, 7706-7710 (1987).
14. P. J. Furdon, Z. Dominski und R. Kole, Nucl. Acids. Res., 17, 9193-9204 (1989).
15. W. K.-D. Brill, J. -Y. Tang, Y. -X. Ma und M. H. Caruthers, J. Amer. Chem. Soc., 111, 2321-2322 (1989).
16. J. M. Coull, D. V. Carlson und H. L. Weith, Tet. Lett., 28, 745-748 (1987).
17. E. P. Stirchak, J. E. Summerton und D. D. Weller, J. Org. Chem., 52, 4202-4206 (1987).
18. S. Agrawal, J. Goodchild, M. P. Civeira, A. H. Thronton, P. S. Sarin und P. C. Zamecnik, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85, 7079-7083 (1988).
19. M. H. Caruthers, W. K -D. Brill, Y. -X. Ma, W. S. Marshall, J. Nielsen, H. Sasmor und J. -Y. Tang, J. Cell. Biochem., Supp. 13D, 17 (1989).
20. Von C. Blonski bei der Konferenz über "Recognition Studies in Nucleic Acids", Sheffield, England, 16.-21. April 1989, vorgestelltes Poster.
21. D. A. Shuman, R. K. Robins und M. J. Robins, J. Amer. Chem. Soc., 91, 3391-3392 (1969).
22. G. R. Gough, D. N. Nobbs, J. C. Middleton, F. Penglis-Caredes, and M. H. Maguire, J. Med. Chem., 21, 520-525 (1978).
23. K. Isono, M. Uramoto, H. Kusakabe, N. Miyata, T. Koyama, M. Ubukata, S. K. Sethi und J. A. McCloskey, J. Antibiot., 37, 670-672 (1984).
24. M. Ubukata und K. Isono, Tet. Lett., 27, 3907-3908 (1986).
25. P. S. Miller, K. N. Fang, N. S. Kondo, und P. 0. P. Ts'o, J. Amer. Chem. Soc., 93, 6657-6665 (1971).
26. Charachon, G., Sobol, R. W. Bisbal, C., Salehzada, T., Silhol, M., Charubula, R., Pfleiderer, W., Lebleu, B. & Suhadolnik, Biochemistry, 29, 2550-2555 (1990).
27. Zamecnik, P. R., Goodchild, J., Taguchi, Y. und Sarin, P.S., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83, (1986), S. 1028- 1032.
28. Harel-Bellan, A. Ferris, D. K., Vinocour, M., Holt, J. T., und Farrar, W. L., J. Immunol., 140, (1988) 2431-2435.
29. Walder, R. Y., und Walder, J. A., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, (1988), 5011-5015.
30. Principles of Nucleic Acid Structures, (1984) Springer- Verlag, New York, S. 51-104, 159-200.
31. Lamaitre, M., Bayard, B. und Leblew, B. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 648-652.
32. "Oligodeoxynucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression", Topics in Moiecuiar and Structural Biology series, CRC Press Inc., Boca Raton, Florida (1989).
33. S. Benner, WO 89/12060.
34. P. S. Miller, I. Yano, E. Yano, C. Carroll, K. Joyaraman und P. Tso, Biochem., 18, 5134-5143 (1979).
35. R. B. Waring, Nucl. Acids Res., 17, 10281-10293 (1989).
36. I. Yamamoto, M. Sekine und T. Hata, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 306-310 (1980).
37. Charubala, Uhlmann, Beter und Pfleiderer, Synthesis, 965 (1984)
38. T.-S. Lin, J. Pharm. Sci., 73, 1568-1570 (1984).
39. Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Hrsg. von M. J. Gait, IRL Press Ltd., Washington, DC (1984).
Alle Verweise sind hierin eingeschlossen.

Claims

1. Verbindung der Formel

A ist H, OH, OR&sub8;, OQ oder Halogen;

B ist eine natürlich vorkommende Nucleinsäurebase oder eine synthetische, modifizierte Nucleinsäurebase;

Y ist KN oder O;

Z ist R- oder O;

M ist S(=O)=O, P (=O)-O&supmin;, P(=O)-S&supmin;, P(=S)-S&supmin;, P(=O)-OR&sub3;, P(=O)- R&sub9;,

vorausgesetzt, daß wenigstens ein M S(=O)=O ist und wenn M S(=O)=O ist, nur eines von Y und Z O ist;

n 1 - 200 ist;

R H oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl ist;

R&sub1; H&sub2;PO&sub4;, H&sub3;P&sub2;O&sub5;, H&sub4;P&sub3;O&sub7; und ihre geeigneten Salze, H oder eine Schutzgruppe ist;

R&sub2; H&sub2;PO&sub3;, H&sub3;P&sub2;O&sub5;, H&sub4;P&sub3;O&sub7; ünd ihre geeigneten Salze, H oder eine Schutzgruppe ist;

R&sub3; C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl oder Cyanethyl ist;

R&sub4; H oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl ist;

R&sub5; H oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl ist;

R&sub6; H oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl ist;

R&sub7; H oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl ist;

R&sub8; C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl ist;

R&sub9; C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl oder Cyanethyl ist und

Q eine Schutzgruppe ist.

2. Verbindung des Anspruchs 1, worin wenn M S(=O)=O ist, eines von Y oder Z RN oder R&sub7;N ist und R oder R&sub7; H ist.

3. Verbindung des Anspruchs 1, worin R Alkyl mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen ist.

4. Verbindung des Anspruchs 1, worin R&sub3; Alkyl mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen ist.

5. Verbindung des Anspruchs 1, worin R&sub4; Alkyl mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen ist.

6. Verbindung des Anspruchs 1, worin R&sub5; Alkyl mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen ist.

7. Verbindung des Anspruchs 1, worin R&sub6; Alkyl mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen ist.

8. Verbindung des Anspruchs 1, worin R&sub7; Alkyl mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen ist.

9. Verbindung des Anspruchs 1, worin R&sub8; Alkyl mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen ist.

10. Verbindung des Anspruchs 1, worin R&sub9; Alkyl mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen ist.

11. Verbindung des Anspruchs 1, worin der Substituent A in 2'- Stellung ist.

12. Verbindung des Anspruchs 1, worin A aus der aus H und OH bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

13. Verbindung des Anspruchs 1, worin B Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin oder Uracil ist.

14. Verbindung des Anspruchs 1, worin wenigstens ein M S(=O)=O ist und sich im wesentlichen in der Nähe eines Terminus der Verbindung befindet.

15. Verbindung des Anspruchs 1, worin M S(=O)=O ist.

16. Verbindung des Anspruchs 1, worin M S(=O)=O oder P(=O)-O&supmin; ist.

17. Verbindung des Anspruchs 16, worin eines von Y oder Z RN oder R- ist und R oder R- H ist.

18. Verbindung der Formel

worin:

A H, OH, OR&sub2;, OQ oder Halogen ist;

B eine natürlich vorkommende Nucleinsäurebase oder synthetische, modifizierte Nucleinsäurebase ist;

Y RN oder O ist;

Z R&sub1;N oder O ist;

X eine geeignete Abgangsgruppe ist;

Q eine Schutzgruppe ist;

R H oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl ist;

R&sub1; H oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl ist und

R&sub2; C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl ist.

19. Verbindung der Formel:

worin

A H, OH, OR&sub2;, OQ oder Halogen ist;

Y RN oder O ist;

Z R&sub1;N oder O ist;

X eine geeignete Abgangsgruppe ist;

Q eine Schutzgruppe ist;

R H oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl ist;

R&sub1; H oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl ist und

R&sub2; C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl ist.

20. Verbindung des Anspruchs 18 oder 19, worin X aus der aus Halogeniden, Azid und Sulfonaten bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

21. Verbindung des Anspruchs 18 oder 19, worin R Alkyl mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen ist.

22. Verbindung des Anspruchs 17 oder 18, worin R&sub1; Alkyl mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen ist.

23. Verbindung des Anspruchs 17 oder 18, worin R&sub2; Alkyl mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen ist.

24. Verfahren zum Herstellen der Verbindung des Anspruchs 1, worin M S(=O)=O ist, welches das Zusammenbringen der Verbindung des Anspruchs 18 oder 19 mit einem Hydroxy oder Amino tragenden Nucleosid, Nucleotid oder Oligonucleotid umfaßt.

25. Verfahren des Anspruchs 24, wobei ein Metallkatalysator verwendet wird.

26. Verbindung der Formel:

A ist H, OH, OR&sub4;, OQ oder Halogen;

B ist eine natürlich vorkommende Nucleinsäurebase oder synthetische, modifizierte Nucleinsäurebase;

n ist 1 - 200;

R&sub1; ist C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl;

R&sub2; ist Dialkylamino, Morpholino, Piperidino oder Pyrrolidino;

R&sub3; ist C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl;

R&sub4; ist C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl;

Y ist RN oder O;

Z ist RN oder O;

R ist H oder C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl;

Q ist eine Schutzgruppe und

V ist eine Schutzgruppe.

27. Verbindung des Anspruchs 26, worin V Cyanethyl oder Methyl ist.

28. Verbindung des Anspruchs 1, 18, 19 oder 26, worin Q aus der aus C&sub1;-C&sub5;-Trialkylsilyl, C&sub1;-C&sub5;-Alkyl, Acyl, Cyanethyl oder Tetrahydropyran bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

29. Verbindung des Anspruchs 26, worin R Alkyl mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen ist.

30. Verbindung des Anspruchs 26, worin R&sub1; Alkyl mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen ist.

31. Verbindung des Anspruchs 26, worin R&sub3; Alkyl mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen ist.

32. Verbindung des Anspruchs 26, worin R&sub4; Alkyl mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen ist.

33. anti-Sinnreagenz, das die Verbindung des Anspruchs 1 umfaßt.

34. Antivirales Reagenz, das die Verbindung des Anspruchs 1 umfaßt.

35. Hybridisierungssonde, welche die Verbindung des Anspruchs 1 umfaßt.

36. Triplexreagenz, das die Verbindung des Anspruchs 1 umfaßt.

37. anti-Sinnreagenz, das die Verbindung des Anspruchs 1 umfaßt, worin M S(--O)=O ist und Y und Z beide O sind.

38. Antivirales Reagenz, das die Verbindung des Anspruchs 37 umfaßt.

39. Triplexreagenz, das die Verbindung des Anspruchs 37 umfaßt.