TW202140043A - 4’-o-亞甲基膦酸酯核酸及其類似物 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於適合作為有效且穩定之RNA干擾劑之核酸及其類似物。

Description

4'-O-亞甲基膦酸酯核酸及其類似物
本發明係關於核酸及其類似物，及適用於使用根據本文提供之說明書提供之核酸及其類似物調節靶基因在細胞中之表現之方法。本發明亦提供包含本說明書之核酸及其類似物之醫藥上可接受之組合物及使用該等組合物治療各種疾患之方法。
由修飾之核酸調節基因表現作為實驗室中之研究工具及臨床中之治療途徑均顯示巨大潛力。數類基於寡核苷酸或核酸之治療劑已處於臨床研究中，包括反義寡核苷酸(ASO)、短干擾RNA (siRNA)、適體、核糖核酸酵素、外顯子跳躍或剪接改變之寡核苷酸、mRNA及CRISPR。化學修飾在克服寡核苷酸療法面臨之障礙中發揮關鍵作用，包括改善核酸酶穩定性、RNA結合親和力及寡核苷酸之藥物動力學性質。在過去三十年間，已針對寡核苷酸研發各種化學修飾策略，包括糖、核鹼基及磷酸二酯主鏈之修飾(Deleavey及Darma, CHEM. BIOL. 2012, 19(8):937-54；Wan及Seth, J. MED. CHEM. 2016, 59(21):9645-67；及Egli及Manoharan, ACC. CHEM. RES. 2019, 54(4):1036-47)。
ASO及siRNA療法中最廣泛使用之主鏈修飾中之一者係硫磷酸酯(PS)鍵聯，其用硫原子置換非橋接氧中之一者。儘管此修飾增加核酸酶抗性並改善治療寡核苷酸之藥物動力學而不損害其等生物功能，在臨床前模型及臨床中均已知毒性，諸如發炎、腎毒性、肝毒性及血小板減少症(Frazier, TOXICOL. PATHOL. 2015, 43(1):78-89)。據信毒性係由ASO經由PS鍵聯結合至蛋白質之強烈趨勢引起(Shen等人，NAT. BIOTECH. 2019, 37:640-50)。此外，該等PS鍵聯係對掌性的，導致2N 個非對映體，及N為主鏈中PS鍵聯之數量。儘管已努力數十年(Stec等人，NUCLEIC ACID RES. 1991, 1(21):5883-8及J. AM. CHEM. SOC. 1998, 120(29):7156-67；Agrawal等人，TETRAHEDRON 1995, 6(5):1051-4；Iyer等人，J. AM. CHEM. SOC. 2000, 112(3), 1253-4；及Oka等人，J. AM. CHEM. SOC. 2008, 130(47):16031-7)，包括具有PS鍵聯經定義之立體化學之寡核苷酸之化學合成中之最新發展(Iwamoto等人，NAT. BIOTECH. 2017, 35(9):845-51)，但該等方法仍缺乏高立體選擇性及高合成效率，且其等一般不為穩健及可獲得的。期望發展不僅可維持PS鍵聯之所需性質(諸如核酸酶抗性、RNA結合親和力及適當之藥物動力學)，但亦可減輕毒性而不損害生物功能之新穎核苷酸間鍵聯。理想地，該等新穎鍵聯應為非對掌性的。即使無法避免對掌性，控制立體化學仍應係穩健且容易獲得的。
最近，已報導電荷中性烷基膦酸酯鍵聯並用於置換ASO中之PS鍵聯來降低毒性並增加治療窗(Migawa等人，NUCLEIC ACIDS RES. 2019, 47(11):5465-79及Shen等人，2019)。然而，此等烷基膦酸酯鍵聯為對掌性的，在併入位點附近不支持RNase H介導之活性，且在固相合成後，在去保護寡核苷酸所需之鹼性條件下更易於股裂解。
此領域中針對疾病(尤其癌症)之有效治療存在持續需求。適用於調節靶基因在細胞中之表現之核酸治療劑有希望作為治療劑。因此，仍需找到適合作為治療劑之核酸及其類似物。
本申請案係關於發揮作用以調節靶基因在細胞中之表現之包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之新穎核酸或其類似物，及其製備方法及其用途。本發明提供之核酸及其類似物係穩定的並結合至RNA標靶以引起堪比其等硫磷酸酯(PS)對應體之RNase H活性且亦適用於剪接轉換及RNAi中。本發明提供之核酸及其類似物亦可用於其他機制(諸如剪接轉換、RNAi等)中。併入4′-O-亞甲基膦酸酯鍵聯向核苷酸間鍵聯賦予核酸酶穩定性，不於磷原子處產生對掌性中心，且保留蛋白質(例如RNase H或Ago2)結合可需之磷酸酯主鏈之負電荷以發揮有效之基因沉默活性，其與電荷中性烷基膦酸酯途徑相反(Migawa等人，2019)。
合適之包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物包括核酸抑制劑分子，諸如dsRNAi抑制劑分子、反義寡核苷酸、miRNA、核糖核酸酵素、安塔戈米爾(antagomir)、適體及ssRNAi抑制劑分子。特定言之，本發明提供核酸及其類似物，其等可用作細胞內RNA含量之調節劑，然後細胞內RNA含量由如本文描述之核酸及其類似物降低。核酸抑制劑分子可通過多種機制(例如藉由RNA干擾(RNAi))調節RNA表現。本發明提供之核酸及其類似物之優勢在於，與細胞內RNA含量之調節一致，廣泛範圍之藥理活性係可能的。另外，本說明書提供使用有效量之如本文描述之核酸及其類似物以治療或改善疾病病症(諸如癌症、病毒感染或遺傳疾患)之方法。
現已發現本發明之核酸及其類似物及其醫藥上可接受之組合物可有效作為細胞內RNA含量之調節劑。此等核酸及其類似物包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I表示：
Figure 02_image003
I 或其醫藥上可接受之鹽，其中各變量如本文定義並描述。
本發明之核酸及其類似物及其醫藥上可接受之組合物適用於治療與細胞內RNA含量之調節相關聯之各種疾病、疾患或病症。此等疾病、疾患或病症包括彼等本文描述者。
由本發明提供之核酸及其類似物亦適用於研究生物及病理現象中之基因表現；研究身體組織中之RNA含量；及活體外或活體內比較評估新穎RNA干擾劑。
相關申請案之交叉參考
本申請案根據35 U.S.C. § 119(e)主張2020年1月15日申請之美國臨時專利申請案第62/961,360號；2020年2月12日申請之美國臨時專利申請案第62/975,352號；及2020年3月19日申請之美國臨時專利申請案第62/991,738號之權益，其等中之各者之內容係以全文引用之方式併入本文中。 1.本發明之某些實施例之一般描述：
改善RNAi效價及持續時間之5′端磷酸酯模擬物之4′-O-亞甲基膦酸酯化學已描述於WO 2018/045317及U.S. 2019/177729中，其等全部內容係以參考之方式併入本文中。此類型之化學類似物不僅模擬磷酸酯基團之靜電及/或空間性質，但亦具有極佳之代謝穩定性，且可與標準寡核苷酸固相合成完全相容。
本發明之核酸及其類似物，及其組合物適合作為RNA干擾劑。在一些實施例中，本發明提供之核酸或其類似物在細胞中抑制基因表現。
在某些實施例中，本發明提供包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I表示：
Figure 02_image005
I 或其醫藥上可接受之鹽，其中： B係核鹼基或氫； R1 及R2 獨立地係氫、鹵素、R5 、-CN、-S(O)R、-S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ，或： 相同碳上之R1 及R2 連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之3至7員飽和或部分不飽和環； 各R獨立地係氫、合適之保護基，或視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環，或： 相同原子上之兩個R基團連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧、矽及硫之雜原子之4至7員飽和、部分不飽和或雜芳基環； R3 係氫、合適之保護基、合適之前藥，或視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環； 各R4 獨立地係氫、合適之前藥、R5 、鹵素、-CN、-NO2 、-OR、-SR、-NR2 、-S(O)2 R、-S(O)2 NR2 、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2 、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2 、-OP(O)R2 、-OP(O)(OR)2 、-OP(O)(OR)NR2 、-OP(O)(NR2 )2 -、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2 、-N(R)S(O)2 R、-N(R)P(O)R2 、-N(R)P(O)(OR)2 、-N(R)P(O)(OR)NR2 、-N(R)P(O)(NR2 )2 、-N(R)S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ； 各R5 獨立地係視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環； X1 係O、S或NR； X2 係-O-、-S-、-B(H)2 -或共價鍵； X3 係-O-、-S-、-Se-或-N(R)-； Y1 係結合至核苷、核苷酸或寡核苷酸之2′或3′端之連接基； Y2 係氫、保護基、胺基亞磷酸酯類似物、結合至核苷、核苷酸或寡核苷酸之4′或5′端之核苷酸間連接基，或結合至撐體之連接基； Z係-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2 -；及 n係0、1、2、3、4或5。 2.化合物及定義：
本發明之化合物(即，核酸及其類似物)包括彼等本文一般描述者，並由本文揭示之類別、子類及種類進一步闡述。如本文使用，除非另有說明，否則下列定義應適用。出於本發明之目的，化學元素係根據元素週期表，CAS版，化學及物理手冊，第75版識別。另外，有機化學之一般原理描述於「Organic Chemistry」, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999，及「March’s Advanced Organic Chemistry」，第5版，Smith, M.B.及March, J.編，John Wiley & Sons, New York: 2001中，其等之全部內容係以引用之方式併入本文中。
如本文使用，術語「脂族」或「脂族基團」意謂直鏈(即，未分支)或分支鏈、經取代或未經取代之烴鏈，該烴鏈完全飽和或含有一或多個不飽和單元，或完全飽和或含有一或多個不飽和單元，但不為芳族之單環烴或雙環烴(本文中亦稱為「碳環」、「環脂族」或「環烷基」)，其具有結合至分子之剩餘部分之單點。除非另有規定，否則脂族基團含有1至6個脂族碳原子。在一些實施例中，脂族基團含有1至5個脂族碳原子。在其他實施例中，脂族基團含有1至4個脂族碳原子。在又其他實施例中，脂族基團含有1至3個脂族碳原子，且在又其他實施例中，脂族基團含有1至2個脂族碳原子。在一些實施例中，「環脂族」 (或「碳環」或「環烷基」)係指完全飽和或含有一或多個不飽和單元，但不為芳族之單環C3 -C6 烴，其具有結合至分子之剩餘部分之單點。合適之脂族基團包括(但不限於)直鏈或分支鏈、經取代或未經取代之烷基、烯基、炔基及其雜合體，諸如(環烷基)烷基、(環烯基)烷基或(環烷基)烯基。
如本文使用，術語「橋接雙環」係指具有至少一個橋之任何雙環環系統，即碳環形或雜環形，飽和或部分不飽和。如由IUPAC定義，「橋」係連接兩個橋頭之一或多個原子或價鍵之未分支鏈，其中「橋頭」係結合至三個或更多個骨架原子(排除氫)之環系統之任何骨架原子。在一些實施例中，橋接雙環基團具有7至12個環成員及0至4個獨立地選自氮、氧或硫之雜原子。此等橋接雙環基團為此項技術中熟知且包括彼等下文列舉之基團，其中各基團於任何可取代碳或氮原子處結合至分子之剩餘部分。除非另有規定，否則橋接雙環基團視需要經一或多個如針對脂族基團列舉之取代基取代。另外，或或者，橋接雙環基團之任何可取代氮視需要經取代。例示性橋接雙環包括：
Figure 02_image007
Figure 02_image009
術語「低碳數烷基」係指C1-4 直鏈或分支鏈烷基。例示性低碳數烷基係甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基及第三丁基。
術語「低碳數鹵代烷基」係指經一或多個鹵素原子取代之C1-4 直鏈或分支鏈烷基。
術語「雜原子」意謂氧、硫、氮、磷或矽中之一或多者(包括氮、硫、磷或矽之任何氧化形式；任何鹼性氮之第四銨化形式；或雜環之可取代氮，例如N (如於3,4-二氫-2H-吡咯基中)、NH (如於吡咯啶基中)或NR+ (如於N-取代之吡咯啶基中))。
如本文使用，術語「不飽和」意謂具有一或多個不飽和單元之部分。
如本文使用，術語「二價C1-8 (或C1-6 )飽和或不飽和、直鏈或分支鏈烴鏈」係指如本文定義之直鏈或分支鏈之二價伸烷基、伸烯基及伸炔基鏈。
術語「伸烷基」係指二價烷基。「伸烷基鏈」係聚亞甲基，即，-(CH2 )n -，其中n係正整數，較佳自1至6、自1至4、自1至3、自1至2，或自2至3之正整數。經取代之伸烷基鏈係其中一或多個亞甲基氫原子經取代基置換之聚亞甲基。合適之取代基包括彼等下文針對經取代之脂族基團描述者。
術語「伸烯基」係指二價烯基。經取代之伸烯基鏈係其中一或多個氫原子經取代基置換之含有至少一個雙鍵之聚亞甲基。合適之取代基包括彼等下文針對經取代之脂族基團描述者。
如本文使用，術語「環丙烯基」係指具有下列結構之二價環丙基：
Figure 02_image011
。
術語「鹵素」意謂F、Cl、Br或I。
單獨或作為較大部分之一部分如於「芳烷基」、「芳烷氧基」或「芳氧基烷基」中使用之術語「芳基」係指具有總計五至十四個環成員之單環或雙環環系統，其中該系統中之至少一個環係芳族的且其中該系統中之各環含有3至7個環成員。術語「芳基」可與術語「芳基環」互換使用。在本發明之某些實施例中，「芳基」係指可攜載一或多個取代基之芳族環系統，其包括(但不限於)苯基、聯苯、萘基、蒽基及類似物。如本文使用，術語「芳基」之範圍內亦包括其中芳族環稠合至一或多個非芳族環之基團，諸如二氫茚基、苯鄰二醯亞胺基、萘二甲醯亞胺基、菲啶基或四氫萘基，及類似物。
單獨或作為較大部分(例如，「雜芳烷基」或「雜芳烷氧基」)之一部分使用之術語「雜芳基」及「雜芳-」係指具有5至10個環原子，較佳5、6或9個環原子；具有環陣列中共用之6、10或14個π電子；且除碳原子外，亦具有一至五個雜原子之基團。術語「雜原子」係指氮、氧或硫，且包括氮或硫之任何氧化形式，及鹼性氮之任何第四銨化形式。雜芳基包括(但不限於)噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、異噁唑基、噁二唑基、噻唑基、異噻唑基、噻二唑基、吡啶基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲哚嗪基、嘌呤基、萘啶基及蝶啶基。如本文使用，術語「雜芳基」及「雜芳-」亦包括其中雜芳族環稠合至一或多個芳基、環脂族或雜環基環之基團，其中該基團或結合點係於該雜芳族環上。非限制性實例包括吲哚基、異吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、異喹啉基、噌嗪基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、4H-喹啉基、哢唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基及吡啶并[2,3-b]-1,4-噁嗪-3(4H)-酮。雜芳基可為單或雙環的。術語「雜芳基」可與術語「雜芳基環」、「雜芳基」或「雜芳族」互換使用，該等術語中之任一者包括視需要經取代之環。術語「雜芳烷基」係指經雜芳基取代之烷基，其中該等烷基及雜芳基部分獨立地視需要經取代。
如本文使用，術語「雜環」、「雜環基」、「雜環基團」及「雜環」可互換使用且係指為飽和或部分不飽和的且除碳原子外亦具有一或多個(較佳一至四個雜原子)之穩定之5至7員單環或7至10員雙環雜環部分，如上文定義。當參考雜環之環原子使用時，術語「氮」包括經取代之氮。作為一實例，在具有0至3個選自氧、硫或氮之雜原子之飽和或部分不飽和環中，該氮可為N (如於3,4-二氫-2H-吡咯基中)、NH (如於吡咯啶基中)或+ NR (如於N-取代之吡咯啶基中)。
雜環可於任何雜原子或碳原子處結合至其懸垂基，其導致穩定結構且環原子中之任一者可視需要經取代。此等飽和或部分不飽和雜環基團之實例包括(但不限於)四氫呋喃基、四氫噻吩基吡咯啶基、哌啶基、吡咯啉基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、十氫喹啉基、噁唑啶基、哌嗪基、二噁烷基、二氧雜環戊烷基、二氮呯基、氧氮呯基、硫氮呯基、嗎啉基及奎寧環基。術語「雜環」、「雜環基」、「雜環基環」、「雜環形基團」、「雜環部分」及「雜環基團」在本文中可互換使用，且亦包括其中雜環基環稠合至一或多個芳基、雜芳基或環脂族環之基團，諸如吲哚啉基、3H-吲哚基、苯并二氫哌喃基、菲啶基或四氫喹啉基。雜環基可為單或雙環的。術語「雜環基烷基」係指經雜環基取代之烷基，其中該等烷基及雜環基部分獨立地視需要經取代。
如本文使用，術語「部分不飽和」係指包括至少一個雙鍵或三鍵之環部分。如本文定義，術語「部分不飽和」意欲包含具有多個不飽和位點之環，但無意包括芳基或雜芳基部分。
如本文描述，本發明之化合物可含有「視需要經取代之」部分。一般而言，術語「經取代」，無論是否在術語「視需要」之前，均意謂指定部分之一或多個氫係經合適之取代基置換。除非另有說明，否則「視需要經取代之」基團可於該基團之各可取代位置具有合適之取代基，且當任何給定結構中之多於一個位置可經多於一個選自規定基團之取代基取代時，該取代基於每個位置處均可相同或不同。本發明設想之取代基之組合係較佳彼等導致形成穩定或化學可行之化合物者。如本文使用，術語「穩定」係指出於本文揭示之目的中之一或多者，化合物在經受容許其等產生、偵測，且在某些實施例中，其等回收、純化及使用之條件時，大體上不改變。
「視需要經取代之」基團之可取代碳原子上之合適之單價取代基獨立地係鹵素；-(CH2 )0-4 Ro ；-(CH2 )0-4 ORo ；-O(CH2 )0-4 Ro 、-O-(CH2 )0-4 C(O)OR°；-(CH2 )0-4 CH(ORo )2 ；-(CH2 )0-4 SRo ；可經R°取代之-(CH2 )0-4 Ph；可經R°取代之-(CH2 )0-4 O(CH2 )0-1 Ph；可經R°取代之-CH=CHPh；可經R°取代之-(CH2 )0-4 O(CH2 )0-1 -吡啶基；-NO2 ；-CN；-N3 ；-(CH2 )0-4 N(Ro )2 ；-(CH2 )0-4 N(Ro )C(O)Ro ；-N(Ro )C(S)Ro ；-(CH2 )0-4 N(Ro )C(O)NRo 2 ；-N(Ro )C(S)NRo 2 ；-(CH2 )0-4 N(Ro )C(O)ORo ；-N(Ro )N(Ro )C(O)Ro ；-N(Ro )N(Ro )C(O)NRo 2 ；-N(Ro )N(Ro )C(O)ORo ；-(CH2 )0-4 C(O)Ro ；-C(S)Ro ；-(CH2 )0-4 C(O)ORo ；-(CH2 )0-4 C(O)SRo ；-(CH2 )0-4 C(O)OSiRo 3 ；-(CH2 )0-4 OC(O)Ro ；-OC(O)(CH2 )0-4 SR-、SC(S)SR°；-(CH2 )0-4 SC(O)Ro ；-(CH2 )0-4 C(O)NRo 2 ；-C(S)NRo 2 ；-C(S)SRo ；-SC(S)SR°、-(CH2 )0-4 OC(O)NRo 2 ；-C(O)N(ORo )Ro ；-C(O)C(O)Ro ；-C(O)CH2 C(O)Ro ；-C(NORo )Ro ；-(CH2 )0-4 SSRo ；-(CH2 )0-4 S(O)2 Ro ；-(CH2 )0-4 S(O)2 ORo ；-(CH2 )0-4 OS(O)2 Ro ；-S(O)2 NRo 2 ；-(CH2 )0-4 S(O)Ro ；-N(Ro )S(O)2 NRo 2 ；-N(Ro )S(O)2 Ro ；-N(ORo )Ro ；-C(NH)NRo 2 ；-P(O)2 Ro ；-P(O)Ro 2 ；-OP(O)Ro 2 ；-OP(O)(ORo )2 ；SiRo 3 ；-(C1-4 直鏈或分支鏈伸烷基)O-N(Ro )2 ；或-(C1-4 直鏈或分支鏈伸烷基)C(O)O-N(Ro )2 ，其中各Ro 可如下文定義經取代且獨立地係氫、C1-6 脂族、-CH2 Ph、-O(CH2 )0-1 Ph、-CH2 -(5至6員雜芳基環)，或具有0至4個獨立地選自氮、氧或硫之雜原子之5至6員飽和、部分不飽和或芳基環，或儘管上文定義，但Ro 兩次單獨出現均連同其等中間原子一起形成具有0至4個獨立地選自氮、氧或硫之雜原子之3至12員飽和、部分不飽和或芳基單環或雙環，其可如下文定義經取代。
Ro (或Ro 兩次單獨出現均連同其等中間原子一起形成之環)上之合適之單價取代基獨立地係鹵素、-(CH2 )0-2 Rl 、-(鹵基Rl )、-(CH2 )0-2 OH、-(CH2 )0-2 ORl 、-(CH2 )0-2 CH(ORl )2 ；-O(鹵基Rl )、-CN、-N3 、-(CH2 )0-2 C(O)Rl 、-(CH2 )0-2 C(O)OH、-(CH2 )0-2 C(O)ORl 、-(CH2 )0-2 SRl 、-(CH2 )0-2 SH、-(CH2 )0-2 NH2 、-(CH2 )0-2 NHRl 、-(CH2 )0-2 NRl 2 、-NO2 、-SiRl 3 、-OSiRl 3 、-C(O)SRl 、-(C1-4 直鏈或分支鏈伸烷基)C(O)ORl 或-SSRl ，其中各Rl 未經取代或在前面帶有「鹵基」之情況下係僅經一或多個鹵素取代，且獨立地選自C1-4 脂族、-CH2 Ph、-O(CH2 )0-1 Ph，或具有0至4個獨立地選自氮、氧或硫之雜原子之5至6員飽和、部分不飽和或芳基環。Ro 之飽和碳原子上之合適之二價取代基包括=O及=S。
「視需要經取代之」基團之飽和碳原子上之合適之二價取代基包括下列：=O、=S、=NNR* 2 、=NNHC(O)R* 、=NNHC(O)OR* 、=NNHS(O)2 R* 、=NR* 、=NOR* ,-O(C(R* 2 ))2-3 O-或-S(C(R* 2 ))2-3 S-，其中R* 每次單獨出現均選自氫、可如下文定義經取代之C1-6 脂族，或具有0至4個獨立地選自氮、氧或硫之雜原子之未經取代之5至6員飽和、部分不飽和或芳基環。結合至「視需要經取代之」基團之鄰位可取代碳之合適之二價取代基包括：-O(CR* 2 )2-3 O-，其中R* 每次單獨出現均選自氫、可如下文定義經取代之C1-6 脂族，或具有0至4個獨立地選自氮、氧或硫之雜原子之未經取代之5至6員飽和、部分不飽和或芳基環。
R* 之脂族基團上之合適之取代基包括鹵素、-Rl 、-(鹵基Rl )、-OH、-ORl 、-O(鹵基Rl )、-CN、-C(O)OH、-C(O)ORl 、-NH2 、-NHRl 、-NRl 2 或-NO2 ，其中各Rl 未經取代或在前面帶有「鹵基」之情況下係僅經一或多個鹵素取代，且獨立地係C1-4 脂族、-CH2 Ph、-O(CH2 )0-1 Ph，或具有0至4個獨立地選自氮、氧或硫之雜原子之5至6員飽和、部分不飽和或芳基環。
「視需要經取代之」基團之可取代氮上之合適之取代基包括-R† 、-NR† 2 、-C(O)R† 、-C(O)OR† 、-C(O)C(O)R† 、-C(O)CH2 C(O)R† 、-S(O)2 R† 、-S(O)2 NR† 2 、-C(S)NR† 2 、-C(NH)NR† 2 或-N(R† )S(O)2 R† ；其中各R† 獨立地係氫、可如下文定義經取代之C1-6 脂族、未經取代之OPh，或具有0至4個獨立地選自氮、氧或硫之雜原子之未經取代之5至6員飽和、部分不飽和或芳基環，或儘管上文定義，但R† 兩次單獨出現均連同其等中間原子一起形成具有0至4個獨立地選自氮、氧或硫之雜原子之未經取代之3至12員飽和、部分不飽和或芳基單環或雙環。
R† 之脂族基團上之合適之取代基獨立地係鹵素、-Rl 、-(鹵基Rl )、-OH、-ORl 、-O(鹵基Rl )、-CN、-C(O)OH、-C(O)ORl 、-NH2 、-NHRl 、-NRl 2 或-NO2 ，其中各Rl 未經取代或在前面帶有「鹵基」之情況下係僅經一或多個鹵素取代，且獨立地係C1-4 脂族、-CH2 Ph、-O(CH2 )0-1 Ph，或具有0至4個獨立地選自氮、氧或硫之雜原子之5至6員飽和、部分不飽和或芳基環。
除非另有說明，否則本文繪示之結構亦旨在包括結構之所有異構(例如，對映體、非對映體及幾何(或構象))形式；例如，各非對稱中心之R及S構型、Z及E雙鍵異構體，及Z及E構象異構體。因此，本發明化合物之單一立體化學異構體及對映體、非對映體，及幾何(或構象)混合物係於本發明之範圍內。除非另有說明，否則本發明之化合物之所有互變異構形式係於本發明之範圍內。另外，除非另有說明，否則本文繪示之結構亦旨在包括不同之處僅在於存在一或多個同位素富集原子之化合物。例如，具有本發明結構之包括由氘或氚置換氫，或由13 C-或14 C富集之碳置換碳之化合物係於本發明之範圍內。此等化合物適合(例如)作為分析工具、生物分析中之探針或根據本發明之治療劑。
除非內文另有明確規定，否則如本文使用，單數形式「一」、「一個」及「該」包括複數個參考物。例如，對「一種方法」之參考包括本文描述之類型之一或多種方法及/或步驟，及/或熟習此項技術者一經閱讀本發明等等即將顯而易見。
除非另有說明，否則如本文使用，術語「及/或」用於本發明中以意謂「及」或「或」。
如本文使用，術語「4′-O-亞甲基膦酸酯」係指本文描述之所有經取代之亞甲基類似物(例如，經甲基、二甲基、乙基、氟、環丙基等取代之亞甲基)及所有膦酸酯類似物(例如，硫磷酸酯、二硫磷酸酯、磷酸二酯等)。
如本文使用，術語「5′端核苷酸」係指位於寡核苷酸之5′端之核苷酸。在本申請案中，該5′端核苷酸亦可稱為「N1核苷酸」。
如本文使用，術語「適體」係指對特定標靶(包括核酸、蛋白質、特定全細胞或特定組織)具有結合親和力之寡核苷酸。適體可使用此項技術中已知的方法獲得，例如，藉由自大量核酸隨機序列庫活體外選擇獲得。Lee等人，NUCLEIC ACID RES., 2004, 32:D95-D100。
如本文使用，術語「安塔戈米爾」係指對特定標靶(包括外源性RNAi抑制劑分子或天然miRNA之引導股)具有結合親和力之寡核苷酸(Krutzfeldt等人，NATURE 2005, 438(7068):685-689)。
雙股RNAi抑制劑分子包含兩個寡核苷酸股：反義股及正義股。反義股或其區域與靶核酸之相應區域部分、大體上或完全互補。另外，雙股RNAi抑制劑分子之反義股或其區域與該雙股RNAi抑制劑分子之正義股或其區域部分、大體上或完全互補。在某些實施例中，該反義股亦可含有與靶核酸序列非互補之核苷酸。該等非互補核苷酸可於互補序列之任一側上或可於互補序列之兩側上。在某些實施例中，在反義股或其區域與正義股或其區域部分或大體上互補之情況下，該等非互補核苷酸可位於一或多個互補區(例如，一或多個誤配)之間。雙股RNAi抑制劑分子之反義股亦稱為引導股。
如本文使用，術語「正則RNA抑制劑分子」係指兩股核酸，各長21個核苷酸，及中心互補區長19個鹼基對，以於3′端中之各者處形成雙股核酸及兩個核苷酸懸垂物。
如本文使用，術語「互補」係指兩個核苷酸(例如，在兩個相對之核酸上或在單核酸股之相對區上)之間的結構關係，該結構關允許該等兩個核苷酸彼此形成鹼基對。例如，與相對核酸之嘧啶核苷酸互補之一個核酸之嘌呤核苷酸可藉由彼此形成氫鍵鹼基配對在一起。在一些實施例中，互補核苷酸可以沃森-克裡克方式或以容許形成穩定之雙螺旋之任何其他方式鹼基配對。「完全互補」或100%互補係指其中第一寡核苷酸股或第一寡核苷酸股之區段之各核苷酸單體可與第二寡核苷酸股或第二寡核苷酸股之區段之各核苷酸單體形成鹼基對之情況。小於100%互補係指其中兩個寡核苷酸股(或兩個寡核苷酸股之兩個區段)之一些(但非所有)核苷酸單體可彼此形成鹼基對之情況。「實質性互補」係指兩個寡核苷酸股(或兩個寡核苷酸股之區段)顯示彼此90%或更大之互補性。「足夠互補」係指靶mRNA與核酸抑制劑分子之間的互補性，使得由靶mRNA編碼之蛋白質之量減少。
如本文使用，術語「互補股」係指與另一股部分、大體上或完全互補之雙股核酸抑制劑分子之一股。
如本文使用，術語「習知反義寡核苷酸」係指由下列機制中之一者顯示靶基因之表現之單股寡核苷酸：(1)空間位阻，例如，反義寡核苷酸藉由直接干擾(例如)基因之轉錄、前mRNA之剪接及mRNA之轉譯干擾涉及基因表現及/或編碼蛋白之產生之事件順序中之一些步驟；(2)由RNase H誘導靶基因之RNA轉錄本之酶消化；(3)由RNase L誘導靶基因之RNA轉錄本之酶消化；(4)由RNase P誘導靶基因之RNA轉錄本之酶消化；(5)由雙股RNase誘導靶基因之RNA轉錄本之酶消化；及(6)組合空間位阻並在相同之反義寡核苷酸中誘導酶消化活性。習知反義寡核苷酸不具有諸如RNAi抑制劑分子之RNAi作用機制。RNAi抑制劑分子可以數種方式與習知反義寡核苷酸區分，包括要求Ago2與RNAi反義股組合，使得該反義股將該Ago2蛋白引向預期靶標且Ago2需在此使該標靶沉默。
簇狀規則間隔之短回文重複序列(「CRISPR」)係參與防禦入侵噬菌體及質體之微生物核酸酶系統。Wright等人，Cell, 2016, 164:29-44。此原核系統已適用於編輯真核細胞之基因體中之受關注之靶核酸序列。Cong等人，SCIENCE, 2013, 339:819-23；Mali等人，SCIENCE, 2013, 339:823-26；Woo Cho等人，NAT. BIOTECHNOLOGY, 2013, 31(3):230-232。如本文使用，術語「CRISPR RNA」係指包含「CRISPR」 RNA (crRNA)部分及/或反式活化之crRNA (tracrRNA)部分之核酸，其中該CRISPR部分具有與靶核酸部分、大體上或完全互補之第一序列及與tracrRNA部分足夠互補之第二序列(亦稱為示蹤劑配偶序列)，使得該示蹤劑配偶序列與tracrRNA部分雜合以形成引導RNA。該引導RNA與核酸內切酶(諸如Cas核酸內切酶(例如，Cas9))形成複合物並引導該核酸酶介導該靶核酸之裂解。在某些實施例中，該crRNA部分係融合至該tracrRNA部分以形成嵌合引導RNA。Jinek等人，SCIENCE, 2012, 337:816-21。在某些實施例中，該crRNA部分之第一序列包括約16至約24個核苷酸，較佳約20個核苷酸，該等核苷酸與該靶核酸雜合。在某些實施例中，該引導RNA係約10至500個核苷酸。在其他實施例中，該引導RNA係約20至100個核苷酸。
如本文使用，術語「遞送劑」係指與寡核苷酸複合或結合至寡核苷酸並介導其進入細胞內之轉染劑或配體。該術語包含陽離子脂質體，例如，其等具有結合至該寡核苷酸之負電荷之淨正電荷。此術語亦包含如本文描述之結合物(諸如GalNAc及膽固醇)，該等結合物可共價結合至寡核苷酸以引導遞送至某些組織。本文亦描述其他特定之合適之遞送劑。
如本文使用，術語「脫氧核糖核苷酸」係指於糖部分之2′-位置具有氫基之核苷酸。
如本文使用，術語「二硫化物」係指含有基團
Figure 02_image013
之化學化合物。通常，各硫原子共價結合至烴基。在某些實施例中，至少一個硫原子共價結合至除烴外之基團。鍵聯亦稱為SS鍵或二硫鍵。
如本文使用，參考核酸(例如，寡核苷酸)之術語「雙螺旋」係指通過核苷酸之兩個反平行序列之互補鹼基配對形成之雙螺旋結構。
如本文使用，術語「賦形劑」係指可包括於組合物中，(例如)以提供或有助於所需一致性或穩定效應之非治療劑。
如本文使用，術語「呋喃糖」係指具有五員環結構之醣，其中該環結構具有由
Figure 02_image015
表示之4個碳原子及一個氧原子，其中數字表示該五員環結構中該等4個碳原子之位置。
如本文使用，術語「麩胱甘肽」 (GSH)係指具有結構
Figure 02_image017
之三肽。GSH係以約1至10 mM之濃度存在於細胞中。GSH減少麩胱甘肽敏感鍵(包括二硫鍵)。在該過程中，將麩胱甘肽轉化為其氧化形式，麩胱甘肽二硫化物(GSSG)。一經氧化，則使用NADPH作為電子供體，可由麩胱甘肽還原酶將麩胱甘肽還原。
如本文使用，術語「麩胱甘肽敏感化合物」或「麩胱甘肽敏感部分」可互換使用且係指含有至少一個麩胱甘肽敏感鍵(諸如二硫鍵或磺醯基)之任何化學化合物(例如，寡核苷酸、核苷酸或核苷)或部分。如本文使用，「麩胱甘肽敏感寡核苷酸」係包含至少一個含有麩胱甘肽敏感鍵之核苷酸之寡核苷酸。麩胱甘肽敏感部分可位於糖部分之2’-碳或3’-碳且包含磺醯基或二硫鍵。在某些實施例中，麩胱甘肽敏感部分可與胺基亞磷酸酯寡核苷酸合成方法相容，如描述(例如)於國際專利申請案第PCT/US2017/048239號中，其係以全文引用之方式併入本文中。麩胱甘肽敏感部分亦可位於含磷核苷酸間鍵聯處。在某些實施例中，麩胱甘肽敏感部分係選自彼等如PCT/US2013/072536中描述者，其係以全文引用之方式併入本文中。
如本文使用，術語「核苷酸間連接基」或「核苷酸間鍵聯」係指可共價連接兩個核苷部分之化學基團。通常，該化學基團係含有磷酸或亞磷酸酯基團之含磷鍵聯基團。磷酸連接基意欲包括磷酸二酯鍵聯、二硫磷酸酯鍵聯、硫磷酸酯鍵聯、磷酸三酯鍵聯、硫烷基膦酸酯鍵聯、硫烷基磷酸三酯鍵聯、胺基亞磷酸酯鍵聯、膦酸酯鍵聯及/或硼烷磷酸酯鍵聯。許多含磷鍵聯為此項技術中熟知，如揭示(例如)於美國專利第3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,194,599；5,565,555；5,527,899；5,721,218；5,672,697及5,625,050號中。在其他實施例中，該寡核苷酸含有一或多個不含磷原子之核苷酸間連接基，此等短鏈烷基或環烷基核苷酸間鍵聯、混合雜原子及烷基或環烷基核苷酸間鍵聯，或一或多個短鏈雜芳族或雜環核苷酸間鍵聯，包括(但不限於)彼等具有矽氧烷主鏈；硫化物、亞碸及碸主鏈；甲醯基及硫甲醯基主鏈；亞甲基甲醯基及硫甲醯基主鏈；核糖乙醯基主鏈；含烯烴主鏈；胺基磺酸酯主鏈；亞甲基亞胺基及亞甲基肼基主鏈；磺酸酯及磺醯胺主鏈；及醯胺主鏈者。非含磷鍵聯為此項技術中熟知，如揭示(例如)於美國專利第5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269及5,677,439號中者。
如本文使用，術語「環」係指由單股核酸形成之結構，其中位於特定單股核苷酸區側翼之互補區以該等互補區之間的該單股核苷酸區自雙螺旋形成或沃森-克裡克鹼基配對排除之方式雜合。環係任何長度之單股核苷酸區。環之實例包括存在於諸如髮夾及四環之結構中之未配對核苷酸。
如本文使用，術語「微小RNA」、「成熟微小RNA」、「miRNA」及「miR」可互換使用且係指在植物及動物之基因體中編碼之非編碼RNA分子。通常，成熟微小RNA長約18至25個核苷酸。在某些情況下，高度保守、內源性表現之微小RNA藉由結合至特定mRNA之3′-未轉譯區(3′-UTR)調節基因之表現。某些成熟微小RNA似乎起源於通常長數百個核苷酸之長內源性初級微小RNA轉錄本(亦稱為預微小RNA、初始微小RNA、初始mir、初始miR或初始預微小RNA) (Lee等人，EMBO 1, 2002, 21(17), 4663-4670)。
如本文使用，術語「修飾之核苷」係指含有修飾或通用核鹼基或修飾之糖中之一或多者之核苷。該等修飾或通用核鹼基(本文中亦稱為鹼基類似物)一般位於核苷糖部分之1‘-位置且係指除1’-位置處之腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶外之核鹼基。在某些實施例中，該修飾或通用核鹼基係含氮鹼基。在某些實施例中，該修飾之核鹼基不含有氮原子。參見例如，美國公開專利申請案第20080274462號。在某些實施例中，該修飾之核苷酸不含有核鹼基(脫鹼基)。修飾之糖(本文中亦稱為糖類似物)包括修飾之脫氧核糖或核糖部分，例如，其中該修飾發生於該糖之2′、3′、4′或5′-碳位置。該修飾之糖亦可包括非天然替代碳結構，諸如彼等存在於上鎖核酸(「LNA」) (參見，例如，Koshkin等人(1998), TETRAHEDRON, 54, 3607-3630)；橋接核酸(「BNA」) (參見，例如，美國專利第7,427,672號及Mitsuoka等人(2009), NUCLEIC ACIDS RES., 37(4):1225-38)；及解鎖核酸(「UNA」) (參見，例如，Snead等人(2013), MOLECULAR THERAPY - NUCLEIC ACIDS, 2, e103 (doi:10.1038/mtna.2013.36))中者。本發明之內文中之合適之修飾或通用核鹼基或修飾之糖係經本文描述。
如本文使用，術語「修飾之核苷酸」係指含有修飾或通用核鹼基、修飾之糖或修飾之磷酸酯中之一或多者之核苷酸。該等修飾或通用核鹼基(本文中一般亦稱為核鹼基)通常位於核苷糖部分之1‘-位置且係指除於1’-位置之腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶外之核鹼基。在某些實施例中，該修飾或通用核鹼基係含氮鹼基。在某些實施例中，該修飾之核鹼基不含有氮原子。參見例如，美國公開專利申請案第20080274462號。在某些實施例中，該修飾之核苷酸不含有核鹼基(脫鹼基)。修飾之糖(本文中亦稱為糖類似物)包括修飾之脫氧核糖或核糖部分，例如，其中該修飾發生於該糖之2′-、3′-、4′-或5′-碳位置。該修飾之糖亦可包括非天然替代碳結構，諸如彼等存在於上鎖核酸(「LNA」) (參見，例如，Koshkin等人(1998), TETRAHEDRON, 54, 3607-3630)、橋接核酸(「BNA」) (參見，例如，美國專利第7,427,672號及Mitsuoka等人(2009), NUCLEIC ACIDS RES., 37(4):1225-38)；及解鎖核酸(「UNA」) (參見，例如，Snead等人(2013), MOLECULAR THERAPY - NUCLEIC ACIDS, 2, e103(doi: 10.1038/mtna.2013.36))中者。修飾之磷酸酯基團係指該磷酸酯基團之修飾不發生於天然核苷酸中且包括如本文描述之非天然生成之磷酸酯模擬物。如本文描述，修飾之磷酸酯基團亦包括非天然生成之核苷酸間連接基，包括含磷核苷酸間連接基及非含磷連接基兩者。本發明之內文中之合適之修飾或通用核鹼基、修飾之糖或修飾之磷酸酯係經本文描述。
如本文使用，術語「裸核酸」係指未調配於保護脂質奈米顆粒或其他保護調配物中並因此當活體內投與時曝露於血液及內體/溶酶體隔室之核酸。
如本文使用，術語「天然核苷」係指與糖(例如，脫氧核糖或核糖或其類似物)鍵聯之N-糖苷中之雜環含氮鹼基。該等天然雜環含氮鹼基包括腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶及胸腺嘧啶。
如本文使用，術語「天然核苷酸」係指與連接至磷酸酯基團之糖(例如，核糖或脫氧核糖或其類似物)鍵聯之N-糖苷中之雜環含氮鹼基。該等天然雜環含氮鹼基包括腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶及胸腺嘧啶。
如本文使用，術語「核酸或其類似物」係指任何天然或修飾之核苷酸、核苷、寡核苷酸、習知反義寡核苷酸、核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、核糖核酸酵素、RNAi抑制劑分子、反義寡核苷酸(ASO)、短干擾RNA (siRNA)、正則RNA抑制劑分子、適體、安塔戈米爾、外顯子跳躍或剪接改變寡核苷酸、mRNA、miRNA，或包含本文描述之4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯中之一或多者之CRISPR核酸酶系統。在某些實施例中，本發明提供之核酸或其類似物用於反義寡核苷酸、siRNA及切丁酶受質siRNA中，包括彼等描述於U.S. 2010/331389、U.S. 8,513,207、U.S. 10,131,912、U.S 8,927,705、CA 2,738,625、EP 2,379,083及EP 3,234,132中者，其等中之各者之全部內容係以引用之方式併入本文中。
如本文使用，術語「核酸抑制劑分子」係指減少或消除靶基因之表現之寡核苷酸分子，其中該寡核苷酸分子含有特異性靶向靶基因mRNA中之序列之區域。通常，該核酸抑制劑分子之靶向區包含與靶基因mRNA上之序列足夠互補之序列以將該核酸抑制劑分子之效應引向規定靶基因。該核酸抑制劑分子可包括核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸，及/或修飾之核苷酸。
如本文使用，術語「核鹼基」係指天然核鹼基、修飾之核鹼基或通用核鹼基。該核鹼基係位於可併入核酸雙螺旋內之修飾之核苷酸中之核苷酸糖部分之1′位置(或可併入核酸雙螺旋內之核苷酸糖部分取代中之相等位置)之雜環部分。因此，本發明提供包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸及其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I表示，其中該核鹼基一般係嘌呤或嘧啶鹼基。在一些實施例中，該核鹼基亦可包括共同鹼基鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)，或其衍生物，諸如適用於製備寡核苷酸之受保護之衍生物。在一些實施例中，核鹼基G、A及C中之各者獨立地包含選自以下之保護基：異丁醯基、乙醯基、二氟乙醯基、三氟乙醯基、苯氧基乙醯基、異丙基苯氧基乙醯基、苯甲醯基、9-茀基甲氧基羰基、苯氧基乙醯基、二甲基甲脒、二丁基甲脒及N,N-二苯基胺甲酸酯。核鹼基類似物可與dsRNA中之其他鹼基或鹼基類似物形成雙螺旋。核鹼基類似物包括彼等適用於本發明之核酸及其類似物及方法中者，例如，彼等揭示於BenneR之美國專利第5,432,272及6,001,983號及Manoharan之美國專利公開案第20080213891號中者，其等均以引用之方式併入本文中。核鹼基之非限制性實例包括次黃嘌呤(I)、黃嘌呤(X)、3β-D-呋喃核糖基-(2,6-二胺基嘧啶) (K)、3-O-D-呋喃核糖基-(1-甲基-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5,7(4H,6H)-二酮) (P)、異胞嘧啶(異C)、異鳥嘌呤(異G)、1-β-D-呋喃核糖基-(5-硝基吲哚)、1-β-D-呋喃核糖基-(3-硝基吡咯)、5-溴尿嘧啶、2-胺基嘌呤、4-硫基-dT、7-(2-噻吩基)-咪唑并[4,5-b]吡啶(Ds)及吡咯-2-甲醛(Pa)、2-胺基-6-(2-噻吩基)嘌呤(S)、2-側氧基吡啶(Y)、二氟甲苯基、4-氟-6-甲基苯并咪唑、4-甲基苯并咪唑、3-甲基異喹諾酮基、5-甲基異喹諾酮基及3-甲基-7-丙炔基異喹諾酮基、7-氮雜吲哚基、6-甲基-7-氮雜吲哚基、亞咪唑并吡啶基、9-甲基-亞咪唑并吡啶基、吡咯并吡嗪基、異喹諾酮基、7-丙炔基異喹諾酮基、丙炔基-7-氮雜吲哚基、2,4,5-三甲基苯基、4-甲基吲哚基、4,6-二甲基吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲蒽基、芘基、芪基(stilbenzyl)、四烯基、稠五苯基，及其結構衍生物(Schweitzer等人，J. ORG. CHEM., 59:7238-7242 (1994)；Berger等人，NUCLEIC ACIDS RESEARCH, 28(15):2911-2914 (2000)；Moran等人，J. AM. CHEM. SOC., 119:2056-2057 (1997)；Morales等人，J. AM. CHEM. SOC., 121:2323-2324 (1999)；Guckian等人，J. AM. Chem. Soc., 118:8182-8183 (1996)；Morales等人，J. Am. Chem. Soc., 122(6):1001-1007 (2000)；McMinn等人，J. Am. Chem. Soc., 121:11585-11586 (1999)；Guckian等人，J. Org. Chem., 63:9652-9656 (1998)；Moran等人，Proc. Natl. Acad. Sci., 94:10506-10511 (1997)；Das等人，J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1:197-206 (2002)；Shibata等人，J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1: 1605-1611 (2001)；Wu等人，J. Am. CHEM. SOC., 122(32):7621-7632 (2000)；O'Neill等人，J. ORG. CHEM., 67:5869-5875 (2002)；Chaudhuri等人，J. AM. CHEM. SOC., 117:10434-10442 (1995)；及美國專利第6,218,108號)。鹼基類似物亦可為通用鹼基。
如本文使用，術語「核苷」係指天然核苷或修飾之核苷。
如本文使用，術語「核苷酸」係指天然核苷酸或修飾之核苷酸。
如本文使用，術語「核苷酸位置」係指如自核苷酸於5′端計數，該核苷酸於寡核苷酸中之位置。例如，核苷酸位置1係指寡核苷酸之5′端核苷酸。
如本文使用，如本文使用之術語「寡核苷酸」係指在自2至2500個核苷酸之範圍內之核苷酸之聚合形式。寡核苷酸可為單股或雙股的。在某些實施例中，該寡核苷酸具有500至1500個核苷酸，通常，例如，其中該寡核苷酸用於基因療法中。在某些實施例中，該寡核苷酸係單股或雙股的且具有7至100個核苷酸。在某些實施例中，該寡核苷酸係單股或雙股的且具有15至100個核苷酸。在另一實施例中，該寡核苷酸係具有15至50個核苷酸之單股或雙股，通常，例如，其中該寡核苷酸係核酸抑制劑分子。在另一實施例中，該寡核苷酸係具有25至40個核苷酸之單股或雙股，通常，例如，其中該寡核苷酸係核酸抑制劑分子。在又另一實施例中，該寡核苷酸係單股或雙股的且具有19至40或19至25個核苷酸，通常，例如，其中該寡核苷酸係雙股核酸抑制劑分子並形成至少18至25個鹼基對之雙螺旋。在其他實施例中，該寡核苷酸係單股的且具有15至25個核苷酸，通常，例如，其中該寡核苷酸核苷酸係單股RNAi抑制劑分子。通常，如本文描述，該寡核苷酸含有一或多個含磷核苷酸間連接基。在其他實施例中，如本文描述，該核苷酸間連接基係非含磷鍵聯。
如本文使用，術語「懸垂物」係指於雙股核酸抑制劑分子之任一股之任一端之末端非鹼基配對核苷酸。在某些實施例中，該懸垂物由一個股或一個區延伸超過與第一股或第一區形成雙螺旋之互補股之末端產生。可通過鹼基對之氫鍵結形成雙螺旋之兩個寡核苷酸區中之一者或兩者可具有延伸超過兩個聚核苷酸或區共用之互補性之3′及/或5′端之5′及/或3′端。延伸超過該雙螺旋之3’及/或5’端之單股區稱為懸垂物。
如本文使用，術語「醫藥組合物」包含藥理有效量之磷酸酯類似物-修飾之寡核苷酸及醫藥上可接受之賦形劑。如本文使用，「藥理有效量」、「治療有效量」或「有效量」係指本發明之磷酸酯類似物-修飾之寡核苷酸有效產生預期藥理、治療或預防結果之量。
如本文使用，術語「醫藥上可接受之賦形劑」意謂該賦形劑適用於與人類及/或動物一起使用而無與合理之收益/風險比相稱之過度不良副作用(諸如毒性、刺激及過敏反應)。
如本文使用，術語「醫藥上可接受之鹽」係指彼等於合理之醫學判斷範圍內，適用於與人類及低等動物之組織接觸而無毒性、刺激、過敏反應及類似物，且與合理之收益/風險比相稱之鹽。醫藥上可接受之鹽為此項技術中熟知。例如，S. M. Berge等人，於J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19中詳細描述醫藥上可接受之鹽，該案以引用之方式併入本文中。本發明之核酸及其類似物之醫藥上可接受之鹽包括彼等來源於合適之無機及有機酸及鹼者。醫藥上可接受之無毒酸加成鹽之實例係胺基與無機酸(諸如鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸及過氯酸)或有機酸(諸如乙酸、草酸、馬來酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸或丙二酸)或藉由使用此項技術中使用之其他方法(諸如離子交換)形成之鹽。其他醫藥上可接受之鹽包括己二酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙烷磺酸鹽、甲酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、葡萄糖酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氫碘化物、2-羥基-乙烷磺酸鹽、乳糖醛酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、十二烷基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲烷磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、對甲苯磺酸鹽、十一酸鹽、戊酸鹽，及類似物。
來源於適當鹼之鹽包括鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽、銨鹽及N+ (C1-4 烷基)4 鹽。代表性鹼金屬鹽或鹼土金屬鹽包括鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽，及類似物。其他醫藥上可接受之鹽包括視需要無毒銨鹽、第四銨鹽，及使用相對離子(諸如鹵離子、氫氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低碳數烷基磺酸根及芳基磺酸根)形成之胺陽離子。
如本文使用，術語「合適之前藥」意欲指示可在生理條件下或藉由溶劑分解轉化為本文描述之生物活性核酸或其類似物之化合物。因此，術語「前藥」係指醫藥上可接受之生物活性核酸或其類似物之前體。前藥在向個體投與時可為非活性的，但(例如)藉由水解活體內轉化為活性化合物。該前藥化合物通常在哺乳動物有機體中提供可溶性、組織相容性或延遲釋放之優勢(參見，例如，Bundgard, H., DESIGN OF PRODRUGS (1985)，第7至9、21至24頁(Elsevier, Amsterdam)。前藥之討論提供於Higuchi, T.等人，「Pro-drugs as Novel Delivery Systems」， A.C.S. Symposium Series，第14卷，及於BIOREVERSIBLE CARRIERS IN DRUG DESIGN，Edward B.編，Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987中，其等中之兩者均以全文引用之方式併入本文中。術語「前藥」亦旨在包括任何共價結合之載劑，當向哺乳動物個體投與此前藥時，該等載劑活體內釋放活性化合物。如本文描述，活性化合物之前藥可藉由以使得修飾以例行性操作或活體內裂解為親代活性化合物之方式修飾該活性化合物中存在之官能基製備。前藥包括其中羥基、胺基或巰基結合至當向哺乳動物個體投與活性化合物之前藥時，裂解以分別形成游離羥基、游離胺基或游離巰基之任何基團之化合物。合適之前藥之實例包括(但不限於)麩胱甘肽、醯氧基、硫醯氧基、2-碳烷氧基乙基、二硫化物、硫胺素(thiaminal)，及磷原子-修飾之核酸之烯醇酯衍生物。術語「前寡核苷酸」或「前核苷酸」或「核酸前藥」係指已修飾為寡核苷酸之前藥之寡核苷酸。膦酸酯及磷酸酯前藥可參見(例如)Wiener等人，「Prodrugs or phosphonates and phosphates: crossing the membrane」 TOP. CURR. CHEM. 2015, 360:115-160，其全部內容係以引用之方式併入本文中。
如本文使用，術語「胺基亞磷酸酯」係指含氮三價磷衍生物。本文描述合適之胺基亞磷酸酯之實例。
如本文使用，「效價」係指必須活體內或活體外投與以針對細胞中之預期靶標獲得特定程度活性之寡核苷酸或其他藥物之量。例如，在1 mg/kg之劑量下抑制個體中之標靶之表現達90%之寡核苷酸具有比在100 mg/kg之劑量下抑制個體中之標靶之表現達90%之寡核苷酸更大之效價。
如本文使用，術語「保護基」在習知化學意義上用作在所需反應之某些條件下可逆地使官能基無反應性之基團。在所需反應後，可移除保護基以將受保護之官能基去保護。所有保護基在不降解較大比例之合成中之分子之條件下應係可移除的。
如本文使用，術語「本發明提供之核酸」係指本文列舉之任何屬、亞屬及/或物種。
如本文使用，術語「核糖核苷酸」係指於糖部分之2’-位置具有羥基之天然或修飾之核苷酸。
如本文使用，術語「核糖核酸酵素」係指特異性識別並裂解獨特靶核酸序列(其可為DNA或RNA)之催化核酸分子。各核糖核酸酵素具有催化組分(亦稱為「催化域」)及由兩個結合域(一個域在該催化域之任一側)構成之靶序列結合組分。
如本文使用，術語「RNAi抑制劑分子」係指(a)具有正義股(客體)及反義股(引導)之雙股核酸抑制劑分子(「dsRNAi抑制劑分子」)，其中該反義股或該反義股之部分由阿戈納特(Argonaute 2) (Ago2)核酸內切酶用於裂解靶mRNA，或(b)具有單反義股之單股核酸抑制劑分子(「ssRNAi抑制劑分子」)，其中該反義股(或該反義股之部分)由該Ago2核酸內切酶用於裂解靶mRNA。
雙股RNAi抑制劑分子包含兩個寡核苷酸股：反義股及正義股。該正義股或其區域與該雙股RNAi抑制劑分子之反義股或其區域部分、大體上或完全互補。在某些實施例中，該正義股亦可含有與該反義股非互補之核苷酸。該等非互補核苷酸可在該互補序列之任一側上或可在該互補序列之兩側上。在某些實施例中，在該正義股或其區域與該反義股或其區域部分或大體上互補之情況下，該等非互補核苷酸可位於一或多個互補區(例如，一或多個誤配)之間。該正義股亦稱為客體股。
如本文使用，術語「全身投與」係指藥物於血流中之活體內全身吸收或聚集，接著分佈在整個體內。
如本文使用，術語「靶位點」、「靶序列」、「靶核酸」、「靶區」、「靶基因」可互換使用且係指「經靶向」以(例如)用於由RNAi抑制劑分子介導之裂解之RNA或DNA序列，該RNAi抑制劑分子於其引導/反義區內含有與該靶序列部分、大體上或完全或足夠互補之序列。
如本文使用，術語「四環」係指形成有助於相鄰沃森-克裡克雜合核苷酸之穩定性之穩定二級結構之環(單股區)。不限於理論，四環可藉由堆疊相互作用穩定相鄰沃森-克裡克鹼基對。另外，四環中核苷酸之間的相互作用包括(但不限於)非沃森-克裡克鹼基配對、堆疊相互作用、氫鍵結及接觸相互作用(Cheong等人，NATURE 1990；346(6285):680-2；Heus及Pardi, SCIENCE 1991；253(5016):191-4)。四環使相鄰雙螺旋之熔化溫度(Tm)增加，其熔化溫度高於自由隨機鹼基構成之簡單模型環結構預期之熔化溫度。例如，四環可在10 mM NaHPO4 中向包含長度為至少2個鹼基對之雙螺旋之髮夾賦予至少50℃、至少55℃、至少56℃、至少58℃、至少60℃、至少65℃或至少75℃之熔化溫度。四環可含有核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、修飾之核苷酸，及其組合。在某些實施例中，四環由四個核苷酸構成。在某些實施例中，四環由五個核苷酸構成。
RNA四環之實例包括四環之UNCG家族(例如，UUCG)、四環之GNRA家族(例如，GAAA)，及CUUG四環。(Woese等人，PNAS, 1990, 87(21):8467-71；Antao等人，NUCLEIC ACIDS RES., 1991, 19(21):5901-5)。DNA四環之實例包括四環之d(GNNA)家族(例如，d(GTTA)、四環之d(GNRA))家族、四環之d(GNAB)家族、四環之d(CNNG)家族，及四環之d(TNCG)家族(例如，d(TTCG))。(Nakano等人，BIOCHEMISTRY, 2002, 41(48):14281-14292。Shinji等人，NIPPON KAGAKKAI KOEN YOKOSHU, 2000, 78(2):731)。
如本文使用，「通用鹼基」係指位於修飾之核苷酸中核苷酸糖部分之1′位置，或核苷酸糖部分取代中之相等位置之雜環部分，即當存在於核酸雙螺旋中時，可放置於多於一種類型之鹼基之對面而不改變雙螺旋結構(例如，磷酸酯主鏈之結構)。另外，該通用鹼基不破壞其所在單股核酸雙螺旋至靶核酸之能力。含有通用鹼基之單股核酸雙螺旋靶核酸之能力可藉由熟習此項技術者顯而易見之方法(例如，UV吸光度、圓二色性、凝膠位移、單股核酸酶敏感性等)分析。另外，可改變觀測形成雙螺旋之條件以確定雙螺旋穩定性或形成(例如，溫度)，因為熔化溫度(Tm)與核酸雙螺旋之穩定性相關。相較於與靶核酸恰好互補之參考單股核酸，含有通用鹼基之單股核酸與該靶核酸形成Tm低於與該互補核酸形成之雙螺旋之Tm之雙螺旋。然而，相較於其中通用鹼基已經鹼基置換以產生單一誤配之參考單股核酸，含有該通用鹼基之單股核酸與該靶核酸形成Tm高於與具有該誤配鹼基之核酸形成之雙螺旋之Tm之雙螺旋。
一些通用鹼基可藉由在該通用鹼基與所有鹼基鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U)之間在形成鹼基對之條件下形成氫鍵進行鹼基配對。通用鹼基不為與僅一個單一互補鹼基形成鹼基對之鹼基。在雙螺旋中，通用鹼基可與雙螺旋之相對股上與其相對之G、C、A、T及U中之各者不形成氫鍵、形成一個氫鍵，或形成多於一個氫鍵。較佳地，該等通用鹼基不與雙螺旋之相對股上與其相對之鹼基相互作用。在雙螺旋中，通用鹼基之間的鹼基配對發生但不改變磷酸酯主鏈之雙螺旋結構。通用鹼基亦可藉由堆疊相互作用與相同核酸股上之相鄰核苷酸中之鹼基相互作用。此等堆疊相互作用穩定該雙螺旋，尤其在該通用鹼基不與該雙螺旋之相對股上與其相對放置之鹼基形成任何氫鍵之情況下。通用結合核苷酸之限制性實例包括肌苷、1-O-D-呋喃核糖基-5-硝基吲哚，及/或1-β-D-呋喃核糖基-3-硝基吡咯(Quay等人之美國專利申請公開案第20070254362號；Van Aerschot等人，An acyclic 5-nitroindazole nucleoside analogue as ambiguous nucleoside, NUCLEIC ACIDS RES. 1995 Nov. 11; 23(21):4363-70；Loakes等人，3-Nitropyrrole and 5-nitroindole as universal bases in primers for DNA sequencing and PCR, NUCLEIC ACIDS RES. 1995 Jul. 11; 23(13):2361-6；Loakes及Brown，5-Nitroindole as a universal base analogue, NUCLEIC ACIDS RES. 1994 Oct. 11; 22(20):4039-43)。 3.例示性實施例之描述：
如上文描述，在某些實施例中，本發明提供包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I表示：
Figure 02_image019
I 或其醫藥上可接受之鹽，其中： B係核鹼基或氫； R1 及R2 獨立地係氫、鹵素、R5 、-CN、-S(O)R、-S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ，或： 相同碳上之R1 及R2 連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之3至7員飽和或部分不飽和環； 各R獨立地係氫、合適之保護基，或視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環，或： 相同原子上之兩個R基團連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧、矽及硫之雜原子之4至7員飽和、部分不飽和或雜芳基環； R3 係氫、合適之保護基、合適之前藥，或視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環、具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環； 各R4 獨立地係氫、合適之前藥、R5 、鹵素、-CN、-NO2 、-OR、-SR、-NR2 、-S(O)2 R、-S(O)2 NR2 、 - S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2 、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2 、-OP(O)R2 、-OP(O)(OR)2 、-OP(O)(OR)NR2 、-OP(O)(NR2 )2 -、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2 、-N(R)S(O)2 R、-N(R)P(O)R2 、-N(R)P(O)(OR)2 、-N(R)P(O)(OR)NR2 、-N(R)P(O)(NR2 )2 、-N(R)S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ； 各R5 獨立地係視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環； X1 係O、S或NR； X2 係-O-、-S-、-B(H)2 -或共價鍵； X3 係-O-、-S-、-Se-或-N(R)-； Y1 係結合至核苷、核苷酸或寡核苷酸之2′或3′端之連接基； Y2 係氫、保護基、胺基亞磷酸酯類似物、結合至核苷、核苷酸或寡核苷酸之4′或5′端之核苷酸間連接基，或結合至撐體之連接基； Z係-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2 -；及 n係0、1、2、3、4或5。
如上文定義及本文描述，B係核鹼基或氫。
在一些實施例中，B係核鹼基。在一些實施例中，B係核鹼基類似物。在一些實施例中，B係修飾之核鹼基。在一些實施例中，B係通用核鹼基。在一些實施例中，B係氫。
在一些實施例中，B係選自
Figure 02_image021
、
Figure 02_image023
、
Figure 02_image025
、
Figure 02_image027
、
Figure 02_image029
，及
Figure 02_image031
。
在一些實施例中，B係選自彼等表1中繪示者。
如上文定義及本文描述，R1 及R2 獨立地係氫、鹵素、R3 、-CN、-S(O)R、-S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ，或相同碳上之R1 及R2 連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之3至7員飽和或部分不飽和環。
在一些實施例中，R1 及R2 獨立地係氫。在一些實施例中，R1 及R2 獨立地係氘。在一些實施例中，R1 及R2 獨立地係鹵素。在一些實施例中，R1 及R2 獨立地係R5 。在一些實施例中，R1 及R2 獨立地係-CN。在一些實施例中，R1 及R2 獨立地係-S(O)R。在一些實施例中，R1 及R2 獨立地係-S(O)2 R。在一些實施例中，R1 及R2 獨立地係-Si(OR)2 R。在一些實施例中，R1 及R2 獨立地係-Si(OR)R2 。在一些實施例中，R1 及R2 獨立地係-SiR3 。在一些實施例中，相同碳上之R1 及R2 連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之3至7員飽和或部分不飽和環。
在一些實施例中，R1 係甲基及R2 係氫。
在一些實施例中，R1 及R2 係選自彼等表1中繪示者。
如上文定義及本文描述，各R獨立地係氫、合適之保護基，或視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環，或相同原子上之兩個R基團連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧、矽及硫之雜原子之4至7員飽和、部分不飽和或雜芳基環。
在一些實施例中，R係氫。在一些實施例中，R係合適之保護基。在一些實施例中，R係視需要經取代之C1-6 脂族。在一些實施例中，R係視需要經取代之苯基。在一些實施例中，R係具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之視需要經取代之4至7員飽和或部分不飽和雜環。在一些實施例中，R係具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之視需要經取代之5至6員雜芳基環。在一些實施例中，相同原子上之兩個R基團連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧、矽及硫之雜原子之4至7員飽和、部分不飽和或雜芳基環。
在一些實施例中，R選自彼等下表1中繪示者。
如上文定義及本文描述，R3 係氫、合適之保護基、合適之前藥，或視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環。
在一些實施例中，R3 係氫。在一些實施例中，R3 係合適之保護基。在一些實施例中，R3 係合適之前藥。在一些實施例中，R3 係合適之磷酸酯/膦酸酯前藥，其係麩胱甘肽敏感部分。在一些實施例中，R3 係選自彼等如國際專利申請案第PCT/US2017/048239號中描述者之麩胱甘肽敏感部分，該案以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，R3 係視需要經取代之C1-6 脂族。在一些實施例中，R3 係視需要經取代之苯基。在一些實施例中，R3 係具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之視需要經取代之4至7員飽和或部分不飽和雜環。在一些實施例中，R3 係具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之視需要經取代之5至6員雜芳基環。
在一些實施例中，R3 係甲基。在一些實施例中，R3 係乙基。在一些實施例中，R3 係
Figure 02_image033
。在一些實施例中，R3 係
Figure 02_image035
。在一些實施例中，R3 係
Figure 02_image037
。
在一些實施例中，R3 係選自彼等下表1中繪示者。
如上文定義及本文描述，各R4 獨立地係氫、合適之前藥、R5 、鹵素、-CN、-NO2 、-OR、-SR、-NR2 、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 、-S(O)2 R、-S(O)2 NR2 、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2 、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2 、-OP(O)R2 、-OP(O)(OR)2 、-OP(O)(OR)NR2 、-OP(O)(NR2 )2 -、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2 、-N(R)S(O)2 R、-N(R)P(O)R2 、-N(R)P(O)(OR)2 、-N(R)P(O)(OR)NR2 、-N(R)P(O)(NR2 )2 、-N(R)S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 。
在一些實施例中，R4 係氫。在一些實施例中，R4 係氘。在一些實施例中，R4 係合適之前藥。在一些實施例中，R4 係合適之磷酸酯/膦酸酯前藥，其係麩胱甘肽敏感部分。在一些實施例中，R4 係選自彼等如國際專利申請案第PCT/US2013/072536號中描述者之麩胱甘肽敏感部分，該案以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，R4 係R5 。在一些實施例中，R4 係鹵素。在一些實施例中，R4 係-CN。在一些實施例中，R4 係-NO2 。在一些實施例中，R4 係-OR。在一些實施例中，R4 係-SR。在一些實施例中，R4 係-NR2 。在一些實施例中，R4 係-S(O)2 R。在一些實施例中，R4 係-S(O)2 NR2 。在一些實施例中，R4 係-S(O)R。在一些實施例中，R4 係-C(O)R。在一些實施例中，R4 係-C(O)OR。在一些實施例中，R4 係-C(O)NR2 。在一些實施例中，R4 係-C(O)N(R)OR。在一些實施例中，R4 係-C(R)2 N(R)C(O)R。在一些實施例中，R4 係-C(R)2 N(R)C(O)NR2 。在一些實施例中，R4 係-OC(O)R。在一些實施例中，R4 係-OC(O)NR2 。在一些實施例中，R4 係-OP(O)R2 。在一些實施例中，R4 係-OP(O)(OR)2 。在一些實施例中，R4 係-OP(O)(OR)NR2 。在一些實施例中，R4 係-OP(O)(NR2 )2 -。在一些實施例中，R4 係-N(R)C(O)OR。在一些實施例中，R4 係-N(R)C(O)R。在一些實施例中，R4 係-N(R)C(O)NR2 。在一些實施例中，R4 係-N(R)P(O)R2 。在一些實施例中，R4 係-N(R)P(O)(OR)2 。在一些實施例中，R4 係-N(R)P(O)(OR)NR2 。在一些實施例中，R4 係-N(R)P(O)(NR2 )2 。在一些實施例中，R4 係-N(R)S(O)2 R。在一些實施例中，R4 係-Si(OR)2 R。在一些實施例中，R4 係-Si(OR)R2 。在一些實施例中，R4 係-SiR3 。
在一些實施例中，R4 係羥基。在一些實施例中，R4 係氟。在一些實施例中，R4 係甲氧基。在一些實施例中，R4 係
Figure 02_image039
。
在一些實施例中，R4 選自彼等表1中繪示者。
如上文定義及本文描述，各R5 獨立地係視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環。
在一些實施例中，R5 係視需要經取代之C1-6 脂族。在一些實施例中，R5 係視需要經取代之苯基。在一些實施例中，R5 係具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之視需要經取代之4至7員飽和或部分不飽和雜環。在一些實施例中，R5 係具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之視需要經取代之5至6員雜芳基環。
在一些實施例中，R5 係選自下表1中繪示者。
如上文定義及本文描述，X1 係O、S或NR。
在一些實施例中，X1 係O。在一些實施例中，X1 係S。在一些實施例中，X1 係NR。
在一些實施例中，X1 係選自下表1中繪示者。
如上文定義及本文描述，X2 係-O-、-S-、-B(H)2 -或共價鍵。
在一些實施例中，X2 係-O-。在一些實施例中，X2 係-S-。在一些實施例中，X2 係-B(H)2 -。在一些實施例中，X2 及R3 形成-BH3 。在一些實施例中，X2 係共價鍵。在一些實施例中，X2 係構成硼烷磷酸酯(boranophosphate)主鏈之共價鍵。
在一些實施例中，X2 係選自下表1中繪示者。
如上文定義及本文描述，X3 係-O-、-S-、-Se-或-N(R)-。
在一些實施例中，X3 係-O-。在一些實施例中，X3 係-S-。在一些實施例中，X3 係-Se-。在一些實施例中，X3 係-N(R)-。
在一些實施例中，X3 係選自下表1中繪示者。
如上文定義及本文描述，Y1 係連結至核苷、核苷酸或寡核苷酸之2′或3′端之連接基。
在一些實施例中，Y1 係連結至核苷、核苷酸或寡核苷酸之2′端之連接基。在一些實施例中，Y1 係連結至核苷、核苷酸或寡核苷酸之3′端之連接基。
在一些實施例中，Y1 之連接基係鍵。在一些實施例中，Y1 之連接基係-C(R)2 -。在一些實施例中，Y1 之連接基係-CH2 -。
在一些實施例中，Y1 係
Figure 02_image041
。在一些實施例中，Y1 係
Figure 02_image043
。在一些實施例中，Y1 係
Figure 02_image045
。在一些實施例中，Y1 係
Figure 02_image047
。在一些實施例中，Y1 係
Figure 02_image049
。在一些實施例中，Y1 係
Figure 02_image051
。在一些實施例中，Y1 係
Figure 02_image053
。在一些實施例中，Y1 係
Figure 02_image055
。在一些實施例中，Y1 係
Figure 02_image057
。在一些實施例中，Y1 係
Figure 02_image059
。在一些實施例中，Y1 係
Figure 02_image061
。在一些實施例中，Y1 係
Figure 02_image063
。在一些實施例中，Y1 係
Figure 02_image065
。在一些實施例中，Y1 係
Figure 02_image067
。在一些實施例中，Y1 係
Figure 02_image069
。在一些實施例中，Y1 係
Figure 02_image071
。
在一些實施例中，Y1 係選自彼等下表1中繪示者。
如上文定義及本文描述，Y2 係氫、保護基、胺基亞磷酸酯類似物、結合至核苷、核苷酸或寡核苷酸之4′或5′端之核苷酸間連接基，或結合至撐體之連接基。
在一些實施例中，Y2 係氫。在一些實施例中，Y2 係保護基。在一些實施例中，Y2 係胺基亞磷酸酯類似物。在一些實施例中，Y2 係下式胺基亞磷酸酯類似物：
Figure 02_image073
，其中R3 、X2 及E中之各者獨立地如本文描述。在一些實施例中，Y2 係結合至核苷、核苷酸或寡核苷酸之4′端之核苷酸間連接基。在一些實施例中，Y2 係結合至核苷、核苷酸或寡核苷酸之5′端之核苷酸間連接基。在一些實施例中，Y2 係結合至撐體之連接基。
在一些實施例中，Y2 係苯甲醯基。在一些實施例中，Y2 係第三丁基二甲基矽基。在一些實施例中，Y2 係
Figure 02_image075
。在一些實施例中，Y2 係
Figure 02_image077
。在一些實施例中，Y2 係
Figure 02_image079
。在一些實施例中，Y2 係
Figure 02_image081
。在一些實施例中，Y2 係
Figure 02_image083
。
在一些實施例中，Y2 係選自彼等下表1中繪示者。
如上文顯示，在Y1 之一些實施例中，Y3 係結合至核苷、核苷酸或寡核苷酸之2′或3′端之連接基。
在一些實施例中，Y3 係結合至核苷、核苷酸或寡核苷酸之2′端之連接基。在一些實施例中，Y3 係結合至核苷、核苷酸或寡核苷酸之3′端之連接基。
在一些實施例中，Y3 係選自彼等下表1中繪示者。
如上文顯示，在Y2 之一些實施例中，Y4 係氫、保護基、胺基亞磷酸酯類似物、結合至核苷、核苷酸或寡核苷酸之4′或5′端之核苷酸間連接基，或結合至撐體之連接基。
在一些實施例中，Y4 係氫。在一些實施例中，Y4 係保護基。在一些實施例中，Y4 係胺基亞磷酸酯類似物。在一些實施例中，Y4 係下式胺基亞磷酸酯類似物：
Figure 02_image085
，其中R3 、X2 及E中之各者獨立地如本文描述。在一些實施例中，Y4 係結合至核苷、核苷酸或寡核苷酸之4′端之核苷酸間連接基。在一些實施例中，Y4 係結合至核苷、核苷酸或寡核苷酸之5′端之核苷酸間連接基。在一些實施例中，Y4 係結合至撐體之連接基。
在一些實施例中，Y4 係苯甲醯基。在一些實施例中，Y4 係第三丁基二甲基矽基。在一些實施例中，Y4 係
Figure 02_image086
。在一些實施例中，Y2 係
Figure 02_image088
。在一些實施例中，Y4 係
Figure 02_image090
。
在一些實施例中，Y4 係選自彼等下表1中繪示者。
如上文定義及本文描述，Z係-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2 -。
在一些實施例中，Z係-O-。在一些實施例中，Z係-S-。在一些實施例中，Z係-N(R)-。在一些實施例中，Z係-C(R)2 -。
在一些實施例中，Z係選自彼等下表1中繪示者。
如上文定義及本文描述，n係0、1、2、3、4或5。
在一些實施例中，n係0。在一些實施例中，n係1。在一些實施例中，n係2。在一些實施例中，n係3。在一些實施例中，n係4。在一些實施例中，n係5。在一些實施例中，n係選自彼等下表1中繪示者。
在一些實施例中，包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物於4′-C位置不包含甲基取代。在一些實施例中，由式I表示之4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯不為
Figure 02_image092
。
在一些實施例中，本發明提供包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I表示，其中X3 係-O-，n係1，且連接性及立體化學如顯示，藉此形成式I-a-1核酸或其類似物：
Figure 02_image094
， I-a-1 或其醫藥上可接受之鹽，其中： B、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 、Y1 、Y2 及Z中之各者如上文定義。
在一些實施例中，本發明提供包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I表示，其中X3 係-O-，Y2 係合適之羥基保護基(PG)，n係1，且連接性及立體化學如顯示，藉此形成式I-a-2核酸或其類似物：
Figure 02_image096
， I-a-2 或其醫藥上可接受之鹽，其中： B、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 、Y1 及Z中之各者如上文定義。
在一些實施例中，本發明提供包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I表示，其中X3 係-O-，Y2 係氫，n係1，且連接性及立體化學如顯示，藉此形成式I-a-3核酸或其類似物：
Figure 02_image098
， I-a-3 或其醫藥上可接受之鹽，其中： B、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 、Y1 及Z中之各者如上文定義。
在一些實施例中，本發明提供包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I表示，其中X3 係-O-，Y2 係胺基亞磷酸酯
Figure 02_image100
，n係1，且連接性及立體化學如顯示，藉此形成式I-a-4核酸或其類似物：
Figure 02_image102
， I-a-4 或其醫藥上可接受之鹽，其中： B、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 、Y1 及Z中之各者如上文定義。
在一些實施例中，本發明提供包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I表示，其中X3 係-O-，Y2 係結合至撐體
Figure 02_image104
之連接基，n係1，且連接性及立體化學如顯示，藉此形成式I-a-5核酸或其類似物：
Figure 02_image106
， I-a-5 或其醫藥上可接受之鹽，其中： B、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 、Y1 及Z中之各者如上文定義。
在一些實施例中，本發明提供包含4′’-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I表示，其中X3 係-O-，n係1，連接性及立體化學如顯示，及Y1 係結合至核苷
Figure 02_image108
之3′-羥基之共價鍵，其中Y1 之PG係合適之羥基保護基，藉此形成式I-b-1核酸或其類似物：
Figure 02_image110
， I-b-1 或其醫藥上可接受之鹽，其中： B、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 、Y2 及Z中之各者如上文定義。
在一些實施例中，本發明提供包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I表示，其中X3 係-O-，Y2 係合適之羥基保護基PG1 ，n係1，連接性及立體化學如顯示，及Y1 係結合至核苷
Figure 02_image112
之3′-羥基之共價鍵，其中Y1 之PG係合適之羥基保護基，藉此形成式I-c-1核酸或其類似物：
Figure 02_image114
， I-c-1 或其醫藥上可接受之鹽，其中： B、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 及Z中之各者如上文定義。
在一些實施例中，本發明提供包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I表示，其中X3 係-O-，Y2 係氫，n係1，連接性及立體化學如顯示，及Y1 係結合至核苷
Figure 02_image116
之3′-羥基之共價鍵，其中Y1 之PG係合適之羥基保護基，藉此形成式I-d-1核酸或其類似物：
Figure 02_image118
， I-d-1 或其醫藥上可接受之鹽，其中： B、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 及Z中之各者如上文定義。
在一些實施例中，本發明提供包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I表示，其中X3 係-O-，Y2 係胺基亞磷酸酯
Figure 02_image120
，n係1，連接性及立體化學如顯示，及Y1 係結合至核苷
Figure 02_image121
之3′-羥基之共價鍵，其中Y1 之PG係合適之羥基保護基，藉此形成式I-e-1核酸或其類似物：
Figure 02_image122
， I-e-1 或其醫藥上可接受之鹽，其中： B、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 及Z中之各者如上文定義。
在一些實施例中，本發明提供包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I表示，其中X3 係-O-，Y2 係結合至撐體
Figure 02_image124
之連接基，n係1，連接性及立體化學如顯示，及Y1 係結合至核苷
Figure 02_image126
之3′-羥基之共價鍵，其中Y1 之PG係合適之羥基保護基，藉此形成式I-f-1核酸或其類似物：
Figure 02_image127
， I-f-1 或其醫藥上可接受之鹽，其中： B、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 、Y1 及Z中之各者如上文定義。
在一些實施例中，本發明提供包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I表示，其中X3 係-O-，n係1，連接性及立體化學如顯示，及Y1 係結合至核苷
Figure 02_image129
之3′-羥基之共價鍵，藉此形成式I-g-1核酸或其類似物：
Figure 02_image131
， I-g-1 或其醫藥上可接受之鹽，其中： B、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 、Y2 及Z中之各者如上文定義。
在一些實施例中，本發明提供包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I表示，其中X3 係-O-，n係1，連接性及立體化學如顯示，及Y1 係結合至寡核苷酸
Figure 02_image133
之3′-羥基之共價鍵，藉此形成式I-h-1核酸或其類似物：
Figure 02_image135
， I-h-1 或其醫藥上可接受之鹽，其中： B、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 、Y2 、Y3 及Z中之各者如上文定義。
在一些實施例中，本發明提供包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I表示，其中X3 係-O-，n係1，連接性及立體化學如顯示，及Y1 係結合至寡核苷酸
Figure 02_image137
之3′-羥基之共價鍵，藉此形成式I-i-1寡核苷酸：
Figure 02_image139
， I-i-1 或其醫藥上可接受之鹽，其中： B、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 、Y2 、Y3 及Z中之各者如上文定義。
在一些實施例中，本發明提供包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I表示，其中X3 係-O-，Y2 係合適之羥基保護基PG1 ，n係1，連接性及立體化學如顯示，及Y1 係結合至寡核苷酸
Figure 02_image141
之3′-羥基之共價鍵，藉此形成式I-j-1寡核苷酸：
Figure 02_image142
， I-j-1 或其醫藥上可接受之鹽，其中： B、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 、Y3 及Z中之各者如上文定義。
在一些實施例中，本發明提供包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I表示，其中X3 係-O-，Y2 係氫，n係1，連接性及立體化學如顯示，及Y1 係結合至寡核苷酸
Figure 02_image144
之3′-羥基之共價鍵，藉此形成式I-k-1寡核苷酸：
Figure 02_image146
， I-k-1 或其醫藥上可接受之鹽，其中： B、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 、Y3 及Z中之各者如上文定義。
在一些實施例中，本發明提供包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I表示，其中X3 係-O-，Y2 係
Figure 02_image148
，n係1，連接性及立體化學如顯示，及Y1 係結合至寡核苷酸
Figure 02_image149
之3′-羥基之共價鍵，藉此形成式I-l-1寡核苷酸：
Figure 02_image150
， I-l-1 或其醫藥上可接受之鹽，其中： B、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 、Y3 及Z中之各者如上文定義。
在一些實施例中，本發明提供包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I表示，其中X3 係-O-，Y2 係結合至撐體
Figure 02_image152
之連接基，n係1，連接性及立體化學如顯示，及Y1 係結合至寡核苷酸
Figure 02_image153
之3′-羥基之共價鍵，藉此形成式I-m-1寡核苷酸：
Figure 02_image154
， I-m-1 或其醫藥上可接受之鹽，其中： B、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 、Y3 及Z中之各者如上文定義。
在一些實施例中，本發明提供包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I表示，其中X3 係-O-，n係1，連接性及立體化學如顯示，及Y1 係結合至寡核苷酸
Figure 02_image156
之3′-羥基之亞甲基，藉此形成式I-n-1寡核苷酸：
Figure 02_image158
， I-n-1 或其醫藥上可接受之鹽，其中： B、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 、Y2 、Y3 及Z中之各者如上文定義。
在一些實施例中，本發明提供包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I表示，其中X3 係-O-，n係1，連接性及立體化學如顯示，及Y1 係結合至寡核苷酸
Figure 02_image160
之3′-碳之亞甲基，藉此形成式I-o-1寡核苷酸：
Figure 02_image162
， I-o-1 或其醫藥上可接受之鹽，其中： B、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 、Y2 、Y3 及Z中之各者如上文定義。
在一些實施例中，本發明提供包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I表示，其中X3 係-O-，n係1，連接性及立體化學如顯示，Y1 係結合至核苷
Figure 02_image164
之3′-羥基之共價鍵，及Y2 係
Figure 02_image165
，藉此形成式I-p-1寡核苷酸：
Figure 02_image167
， I-p-1 或其醫藥上可接受之鹽，其中： B、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 、Y4 及Z中之各者如上文定義。
在一些實施例中，本發明提供包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I表示，其中X3 係-O-，n係1，連接性及立體化學如顯示，Y1 係結合至核苷
Figure 02_image169
之3′-羥基之共價鍵，及Y2 係
Figure 02_image170
，藉此形成式I-q-1寡核苷酸：
Figure 02_image172
， I-q-1 或其醫藥上可接受之鹽，其中： B、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 、Y4 及Z中之各者如上文定義。
在某些實施例中，本發明提供寡核苷酸-配體結合物，其包含長度為15至30個核苷酸之反義股及任何上文揭示之核酸類似物中之一或多者，及長度為10至53個核苷酸之正義股，其中該正義股與該反義股形成雙螺旋區且該正義股包含一或多個配體部分。在某些實施例中，該配體部分係GalNAc。
在某些實施例中，反義股於5’端處包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯。
在某些實施例中，本發明提供寡核苷酸-配體結合物或其醫藥上可接受之鹽，其包含： 長度為36個核苷酸之正義股，於位置3、5、8、10、12、13、15及17處包含2'-氟修飾之核苷酸，於位置1、2、4、6、7、9、11、14、16、18至27及31至36處包含2'-O-甲基修飾之核苷酸，及於位置1與2處之核苷酸之間包含一個硫磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中於位置27至30處之核苷酸形成四環，及於位置28至30處之核苷酸中之各者於2’位置處結合至單價GalNac部分；及 長度為22個核苷酸之反義股，於位置3、4、5、7、10、14、16及19處包含2'-氟修飾之核苷酸，於位置1、2、6、8、9、11、12、13、15、17、18及20至22處包含2'-O-甲基修飾之核苷酸，及於位置2與3之核苷酸之間、於位置20與21之核苷酸之間，及於位置21與22之核苷酸之間包含三個硫磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中於位置1及2處之核苷酸形成具有下列結構之4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯：
Figure 02_image174
，其中各B獨立地係如本文描述之核鹼基，例如，腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶。
在一些實施例中，正義股之位置27至30形成GAAA四環。
在一些實施例中，於2’位置處結合至單價GalNac部分之核苷酸具有下列結構：
Figure 02_image176
，其中B係如本文描述之核鹼基，例如，腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶；X係O、S或N；及L係鍵、點擊化學柄，或長度為1至20個包含、連續、共價結合之原子之連接子，選自由以下組成之群：經取代及未經取代之伸烷基、經取代及未經取代之伸烯基、經取代及未經取代之伸炔基、經取代及未經取代之伸雜烷基、經取代及未經取代之伸雜烯基、經取代及未經取代之伸雜炔基，及其組合。在一些實施例中，L係縮醛連接子。在一些實施例中，X係O。
在一些實施例中，於2’位置處結合至單價GalNac部分之核苷酸具有下列結構：
Figure 02_image178
，其中B係如本文描述之核鹼基，例如，腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶。
在一些實施例中，本發明提供具有如圖4中顯示之GalXC2之結構之寡核苷酸-配體結合物。
包含本發明之4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之例示性核酸及其類似物闡述於下表1中。 表1：例示性核酸及其類似物
I-# 結構 I-# 結構
I-1
Figure 02_image180
 I-2
Figure 02_image182
I-3
Figure 02_image184
 I-4
Figure 02_image186
I-5
Figure 02_image188
 I-6
Figure 02_image190
I-7
Figure 02_image192
 I-8
Figure 02_image194
I-9
Figure 02_image196
 I-10
Figure 02_image198
I-11
Figure 02_image200
 I-12
Figure 02_image202
I-13
Figure 02_image204
 I-14
Figure 02_image206
I-15
Figure 02_image208
 I-16
Figure 02_image210
I-17
Figure 02_image212
 I-18
Figure 02_image214
在一些實施例中，本發明提供包含闡述於上表1中之本發明之4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，或其醫藥上可接受之鹽。 4.提供核酸及其類似物之一般方法
包含本文描述之4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸及其類似物可使用此項技術中已知的各種合成方法(包括標準胺基亞磷酸酯方法)製得。可使用任何胺基亞磷酸酯合成方法以合成本發明提供之核酸。在某些實施例中，胺基亞磷酸酯用於固相合成方法中以產生反應性中間物亞磷酸酯化合物，其等接著使用已知方法氧化以產生膦酸酯修飾之寡核苷酸，該等寡核苷酸通常具有磷酸二酯或硫磷酸酯核苷酸間鍵聯。本發明之寡核苷酸合成可使用技術已知方法以自5′至3′或自3′至5′之方向進行。
在某些實施例中，合成本發明提供之核酸之方法包括(a)經由共價鍵聯將核苷或其類似物結合至撐體；(b)將核苷胺基亞磷酸酯或其類似物偶合至步驟(a)之核苷或其類似物上之反應性羥基以於其間形成核苷酸間鍵，其中該撐體上任何未偶合之核苷或其類似物用封端試劑封端；(c)用氧化劑氧化該核苷酸間鍵；及(d)用後續核苷胺基亞磷酸酯或其類似物反復重複步驟(b)至(c)以形成核酸或其類似物，其中至少步驟(a)之核苷或其類似物、步驟(b)之核苷胺基亞磷酸酯或其類似物或步驟(d)之後續核苷胺基亞磷酸酯或其類似物中之至少一者包含如本文描述之含有膦酸酯之部分。通常，重複偶合、封端/氧化步驟及視需要去保護步驟，直至該寡核苷酸達成所需長度及/或序列，然後使其自該撐體裂解。
在繪示特定保護基、離去基或轉化條件之下文方案A中，一般技術者應知曉其他保護基、離去基及轉化條件亦合適且經審慎考慮。需額外保護基策略之方案A類中設想之某些反應性官能基(例如，-N(H)-、-OH等)亦經審慎考慮並由一般技術者知曉。此等基團及轉化詳細描述於March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, M. B. Smith及J. March，第5版，John Wiley & Sons, 2001、Comprehensive Organic Transformations, R. C. Larock，第2版，John Wiley & Sons, 1999及Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene及P. G. M. Wuts，第3版，John Wiley & Sons, 1999中，其等中之各者係以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，本發明之核酸及其類似物一般根據下文闡述之方案A及方案B製備： 方案A：以3ʹ至5ʹ方向進行之本發明之核酸及其類似物之合成及本發明之寡核苷酸之合成
Figure 02_image216
如上文方案A中繪示，諸如藉由使用路易士酸(例如，BF3 -OEt2 )將式A1核酸或其類似物偶合至式A2 P(V)化合物，以形成包含(但不限於) 4ʹ-O-亞甲基膦酸酯之式A3核酸或其類似物。然後首先將式A3核酸或其類似物去保護(例如，水解)以形成包含(但不限於)氫4ʹ-O-亞甲基膦酸酯之式A4核酸或其類似物，接著與式A5核苷酸或其類似物縮合以形成包含(但不限於)本發明之4ʹ-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之式I-b核酸或其類似物。然後將式I-b核酸或其類似物去保護以形成式I-g核酸或其類似物並與式A6胺基亞磷酸酯類似物反應以形成包含(但不限於)本發明之4ʹ-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之式I-h核酸或其類似物。然後氧化式I-h核酸或其類似物提供包含(但不限於)本發明之4ʹ-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之式I-i寡核苷酸化合物。B、E、PG、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 、X3 、Y2 、Y3 、Z及n中之各者如上文定義及本文描述。 方案B：以5ʹ至3ʹ方向進行之本發明之核酸及其類似物及寡核苷酸之合成
Figure 02_image218
如上文方案B中繪示，首先選擇性將包含(但不限於)本發明之4ʹ-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之式I-c核酸或其類似物去保護以形成本發明之式I-d核酸或其類似物及然後與P(III)形成試劑反應以形成本發明之式I-e核酸或其類似物。對選擇式I-c核酸或其類似物中之PG1 及PG以容許選擇性移除PG1 之指導提供於本發明中並詳細描述於Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene及P. G. M. Wuts，第3版，John Wiley & Sons, 1999中，其等中之各者係以全文引用之方式併入本文中。然後包含(但不限於)本發明之4ʹ-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之式I-e核酸或其類似物可與式A8核苷酸或其類似物縮合以形成包含(但不限於)本發明之4ʹ-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之式I-p核酸或其類似物。然後氧化式I-p核酸或其類似物提供包含(但不限於)本發明之4ʹ-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之式I-q寡核苷酸化合物。B、E、PG、PG1 、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 、X3 、Y4 、Z及n中之各者如上文定義及本文描述。
熟習此項技術者應知曉本發明之核酸或其類似物中存在之各種官能基(諸如脂族基團、醇、羧酸、酯、醯胺、醛、鹵素及腈)可藉由此項技術中熟知的技術相互轉化，該等技術包括(但不限於) 還原、氧化、酯化、水解、部分氧化、部分還原、鹵化、脫水、部分水合及水合。參見例如，「March’s Advanced Organic Chemistry」，第5版，Smith, M.B.及March, J.編，John Wiley & Sons, New York: 2001，其等中之各者係以全文引用之方式併入本文中。此等相互轉化可需前述技術中之一或多者，且合成本發明提供之核酸之某些方法下文描述於範例中。
根據一項態樣，本發明提供製備包含4ʹ-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之寡核苷酸化合物之方法，其中該4ʹ-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I-i表示：
Figure 02_image220
I-i 或其醫藥上可接受之鹽，該方法包括以下步驟： (a)    提供包含4ʹ-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4ʹ-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I-h表示：
Figure 02_image222
I-h 或其醫藥上可接受之鹽，及 (b)    氧化包含式I-h之核酸或其類似物以形成包含式I-i之寡核苷酸化合物，其中： 各B係核鹼基或氫； R1 及R2 獨立地係氫、鹵素、R5 、-CN、-S(O)R、-S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ，或： 相同碳上之R1 及R2 連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之3至7員飽和或部分不飽和環； 各R獨立地係氫、合適之保護基，或視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環，或： 相同原子上之兩個R基團連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧、矽及硫之雜原子之4至7員飽和、部分不飽和或雜芳基環； R3 係氫、合適之保護基、合適之前藥，或視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環； 各R4 獨立地係氫、合適之前藥、R5 、鹵素、-CN、-NO2 、-OR、-SR、-NR2 、-S(O)2 R、-S(O)2 NR2 、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2 、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2 、-OP(O)R2 、-OP(O)(OR)2 、-OP(O)(OR)NR2 、-OP(O)(NR2 )2 -、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2 、-N(R)S(O)2 R、-N(R)P(O)R2 、-N(R)P(O)(OR)2 、-N(R)P(O)(OR)NR2 、-N(R)P(O)(NR2 )2 、-N(R)S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ； 各R5 獨立地係視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環； 各X1 獨立地係O、S或NR； 各X2 獨立地係-O-、-S-、-B(H)2 -或共價鍵； X3 係-O-、-S-、-Se-或-N(R)-； Y2 係氫、保護基、胺基亞磷酸酯類似物、結合至核苷、核苷酸或寡核苷酸之4ʹ或5ʹ端之核苷酸間連接基，或結合至撐體之連接基； Y3 係結合至核苷酸、核苷或寡核苷酸之2ʹ或3ʹ端之連接基； 各Z獨立地係-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2 -；及 各n獨立地係0、1、2、3、4或5。
根據一項態樣，本發明提供製備包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之寡核苷酸化合物之方法，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I-q表示：
Figure 02_image224
I-q 或其醫藥上可接受之鹽，該方法包括以下步驟： (a)    提供包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4’-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I-p表示：
Figure 02_image226
I-p 或其醫藥上可接受之鹽，及 (b)    氧化包含式I-p之核酸或其類似物以形成包含式I-q之寡核苷酸化合物，其中： 各B係核鹼基或氫； PG係合適之羥基保護基； R1 及R2 獨立地係氫、鹵素、R5 、-CN、-S(O)R、-S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ，或： 相同碳上之R1 及R2 連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之3至7員飽和或部分不飽和環； 各R獨立地係氫、合適之保護基，或視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環，或： 相同原子上之兩個R基團連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧、矽及硫之雜原子之4至7員飽和、部分不飽和或雜芳基環； R3 係氫、合適之保護基、合適之前藥，或視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環； 各R4 獨立地係氫、合適之前藥、R5 、鹵素、-CN、-NO2 、-OR、-SR、-NR2 、-S(O)2 R、-S(O)2 NR2 、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2 、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2 、-OP(O)R2 、-OP(O)(OR)2 、-OP(O)(OR)NR2 、-OP(O)(NR2 )2 -、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2 、-N(R)S(O)2 R、-N(R)P(O)R2 、-N(R)P(O)(OR)2 、-N(R)P(O)(OR)NR2 、-N(R)P(O)(NR2 )2 、-N(R)S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ； 各R5 獨立地係視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環； 各X1 獨立地係O、S或NR； 各X2 獨立地係-O-、-S-、-B(H)2 -或共價鍵； 各X3 獨立地係-O-、-S-、-Se-或-N(R)-； Y4 係氫、保護基、胺基亞磷酸酯類似物、結合至核苷、核苷酸或寡核苷酸之4′或5′端之核苷酸間連接基，或結合至撐體之連接基； 各Z獨立地係-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2 -；及 各n獨立地係0、1、2、3、4或5。
氧化包含式I-h之核酸或其類似物以形成包含式I-i之寡核苷酸化合物或包含式I-p之核酸或其類似物以形成包含式I-q之寡核苷酸化合物可使用已知氧化條件進行。熟習此項技術者應知曉P(III)氧化為P(V)可藉由各種試劑(諸如過氧化氫、氫過氧化物、過氧化物、過酸、碘，及其混合物)進行。過氧化氫可在溶劑(諸如乙腈)之存在下使用。氫過氧化物(即，ROOH)包括其中R係烷基或芳基及其鹽之過氧化物，包括(但不限於)第三丁基過氧化物(tBuOOH)。過氧化物包括烷基、芳基，或混合烷基/芳基過氧化物，及其鹽。過酸包括(但不限於)烷基及芳基過酸，包括氯過氧苯甲酸(mCPBA)。使用鹼性鹵素(諸如溴(Br2 )、氯(Cl2 )或碘(I2 ))可在水及其他組分(諸如吡啶、四氫呋喃及水)之存在下進行。或者，亦審慎考慮在TEMPO之存在下之Cl2 水溶液。因此，術語「氧化劑」包括「硫化劑」，亦認為其具有與「硫雜化試劑」相同之含義。已用於合成含有硫磷酸酯(PS)鍵之寡核苷酸之硫化試劑之實例包括元素硫、二苯甲醯基四硫化物、3-H-1,2-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物(Beaucage試劑)、二硫化四乙胺甲硫醯基(TETD)及雙(O,O-二異丙氧基硫膦基)二硫化物(Stec試劑)。製造硫磷酸酯二酯鍵聯之氧化試劑包括苯乙醯基二硫化物(PADS)，如由Cole等人描述於美國專利第6,242,591號中。在某些實施例中，該氧化係使用於水性吡啶中之碘進行。
在某些態樣中，本發明提供製備包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之寡核苷酸化合物之方法，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I-i-1表示：
Figure 02_image228
I-i-1 或其醫藥上可接受之鹽，該方法包括以下步驟： (a)    提供包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I-h-1表示：
Figure 02_image230
I-h-1 或其醫藥上可接受之鹽，及 (b)    氧化包含式I-h-1之核酸或其類似物以形成包含I-i-1之寡核苷酸化合物，其中： B、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 、Y2 、Y3 及Z中之各者如本文描述及上文定義。
在某些態樣中，本發明提供製備包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之寡核苷酸化合物之方法，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I-q-1表示：
Figure 02_image232
I-q-1 或其醫藥上可接受之鹽，該方法包括以下步驟： (a)    提供包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I-p-1表示：
Figure 02_image234
I-p-1 或其醫藥上可接受之鹽，及 (b)    氧化包含式I-p-1之核酸或其類似物以形成包含式I-q-1之寡核苷酸化合物，其中： B、PG、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 、Y4 及Z中之各者如本文描述及上文定義。
根據一項態樣，本發明提供製備包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物之方法，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I-h表示：
Figure 02_image236
I-h 或其醫藥上可接受之鹽，該方法包括以下步驟： (a)    提供包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I-g表示：
Figure 02_image238
I-g (b)    使包含式I-g之核酸或其類似物與式A6胺基亞磷酸酯類似物反應：
Figure 02_image240
A6 以形成包含式I-h之核酸或其類似物，其中： 各B係核鹼基或氫； R1 及R2 獨立地係氫、鹵素、R5 、-CN、-S(O)R、-S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ，或： 相同碳上之R1 及R2 連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之3至7員飽和或部分不飽和環； 各R獨立地係氫、合適之保護基，或視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環，或： 相同原子上之兩個R基團連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧、矽及硫之雜原子之4至7員飽和、部分不飽和或雜芳基環； R3 係氫、合適之保護基、合適之前藥，或視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環； 各R4 獨立地係氫、合適之前藥、R5 、鹵素、-CN、-NO2 、-OR、-SR、-NR2 、-S(O)2 R、-S(O)2 NR2 、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2 、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2 、-OP(O)R2 、-OP(O)(OR)2 、-OP(O)(OR)NR2 、-OP(O)(NR2 )2 -、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2 、-N(R)S(O)2 R、-N(R)P(O)R2 、-N(R)P(O)(OR)2 、-N(R)P(O)(OR)NR2 、-N(R)P(O)(NR2 )2 、-N(R)S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ； 各R5 獨立地係視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環； E係鹵素或-NR2 ； X1 係O、S或NR； 各X2 獨立地係-O-、-S-、-B(H)2 -或共價鍵； X3 係-O-、-S-、-Se-或-N(R)-； Y2 係氫、保護基、胺基亞磷酸酯類似物、結合至核苷、核苷酸或寡核苷酸之4′或5′端之核苷酸間連接基，或結合至撐體之連接基； Y3 係結合至核苷、核苷酸或寡核苷酸之2′或3′端之連接基； 各Z獨立地係-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2 -；及 各n獨立地係0、1、2、3、4或5。
根據一項態樣，本發明提供製備式I-e核酸或其類似物之方法：
Figure 02_image242
I-e 或其醫藥上可接受之鹽，該方法包括以下步驟： (a)    提供式I-d核酸或其類似物：
Figure 02_image244
I-d (b)    使式I-d核酸或其類似物與P(III)形成試劑反應以形成式I-e核酸或其類似物，其中： 各B係核鹼基或氫； PG係合適之羥基保護基； R1 及R2 獨立地係氫、鹵素、R5 、-CN、-S(O)R、-S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ，或： 相同碳上之R1 及R2 連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之3至7員飽和或部分不飽和環； 各R獨立地係氫、合適之保護基，或視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環，或： 相同原子上之兩個R基團連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧、矽及硫之雜原子之4至7員飽和、部分不飽和或雜芳基環； R3 係氫、合適之保護基、合適之前藥，或視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環； 各R4 獨立地係氫、合適之前藥、R5 、鹵素、-CN、-NO2 、-OR、-SR、-NR2 、-S(O)2 R、-S(O)2 NR2 、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2 、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2 、-OP(O)R2 、-OP(O)(OR)2 、-OP(O)(OR)NR2 、-OP(O)(NR2 )2 -、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2 、-N(R)S(O)2 R、-N(R)P(O)R2 、-N(R)P(O)(OR)2 、-N(R)P(O)(OR)NR2 、-N(R)P(O)(NR2 )2 、-N(R)S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ； 各R5 獨立地係視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環； E係鹵素或-NR2 ； X1 係O、S或NR； 各X2 獨立地係-O-、-S-、-B(H)2 -或共價鍵； X3 係-O-、-S-、-Se-或-N(R)-； 各Z獨立地係-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2 -；及 各n獨立地係0、1、2、3、4或5。
根據一項實施例，上文步驟(b)中之式A6胺基亞磷酸酯類似物係包含常用於胺基亞磷酸酯寡核苷酸合成中之胺基亞磷酸酯部分之核苷、核苷酸或寡核苷酸。在一些實施例中，胺基亞磷酸酯或其類似物係使用P(III)形成試劑製備。在一些實施例中，該P(III)形成試劑係2-氰乙基N,N-二異丙基氯胺基亞磷酸酯或2-氰乙基二氯化磷。在某些實施例中，該P(III)形成試劑係2-氰乙基N,N-二異丙基氯胺基亞磷酸酯。一般技術者應知曉在步驟(b)中分別由包含式I-d或式I-g之核酸或其類似物之羥基或X3 部分取代P(III)類似物中之離去基係在有或無合適鹼之存在下達成。此等合適鹼為此項技術中熟知且包括有機及無機鹼。在一些實施例中，該鹼係三級胺，諸如三乙胺或二異丙基乙胺。在某些實施例中，該鹼係4,5-二氰基咪唑。
在某些態樣中，本發明提供製備包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物之方法，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I-h-1表示：
Figure 02_image246
I-h-1 或其醫藥上可接受之鹽，該方法包括以下步驟： (a)    提供包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I-g-1表示：
Figure 02_image247
I-g-1 或其醫藥上可接受之鹽，及 (b)    使包含式I-g-1之核酸或其類似物與式A6胺基亞磷酸酯類似物反應：
Figure 02_image249
A6 以形成包含式I-h-1之核酸或其類似物，其中： B、E、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 、Y2 、Y3 及Z中之各者如本文描述及上文定義。
在某些態樣中，本發明提供製備式I-e-1核酸或其類似物之方法：
Figure 02_image251
I-e-1 或其醫藥上可接受之鹽，該方法包括以下步驟： (a)    提供式I-d-1核酸或其類似物：
Figure 02_image253
I-d-1 或其醫藥上可接受之鹽，及 (b)    使式I-d-1核酸或其類似物與P(III)形成試劑反應以形成式I-e-1核酸或其類似物，其中： B、PG、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 及Z中之各者如本文描述及上文定義。
根據一項態樣，本發明提供製備包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物之方法，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I-g表示：
Figure 02_image255
I-g 或其醫藥上可接受之鹽，該方法包括以下步驟： (a)    提供包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I-b表示：
Figure 02_image257
I-b 或其醫藥上可接受之鹽，及 (b)    將包含式I-b之核酸或其類似物去保護以形成包含式I-g之核酸或其類似物，其中： 各B係核鹼基或氫； PG係合適之羥基保護基； R1 及R2 獨立地係氫、鹵素、R5 、-CN、-S(O)R、-S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ，或： 相同碳上之R1 及R2 連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之3至7員飽和或部分不飽和環； 各R獨立地係氫、合適之保護基，或視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環，或： 相同原子上之兩個R基團連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧、矽及硫之雜原子之4至7員飽和、部分不飽和或雜芳基環； R3 係氫、合適之保護基、合適之前藥，或視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環； 各R4 獨立地係氫、合適之前藥、R5 、鹵素、-CN、-NO2 、-OR、-SR、-NR2 、-S(O)2 R、-S(O)2 NR2 、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2 、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2 、-OP(O)R2 、-OP(O)(OR)2 、-OP(O)(OR)NR2 、-OP(O)(NR2 )2 -、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2 、-N(R)S(O)2 R、-N(R)P(O)R2 、-N(R)P(O)(OR)2 、-N(R)P(O)(OR)NR2 、-N(R)P(O)(NR2 )2 、-N(R)S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ； 各R5 獨立地係視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環； X1 係O、S或NR； 各X2 獨立地係-O-、-S-、-B(H)2 -或共價鍵； X3 係-O-、-S-、-Se-或-N(R)-； Y2 係氫、保護基、胺基亞磷酸酯類似物、結合至核苷、核苷酸或寡核苷酸之4′或5′端之核苷酸間連接基，或結合至撐體之連接基； 各Z獨立地係-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2 -；及 各n獨立地係0、1、2、3、4或5。
根據一項態樣，本發明提供製備式I-d核酸之方法：
Figure 02_image259
I-d 或其醫藥上可接受之鹽，該方法包括以下步驟： (a)    提供包含式I-c之核酸或其類似物：
Figure 02_image261
I-c 或其醫藥上可接受之鹽，及 (b)    將包含式I-d之核酸或其類似物去保護以形成包含式I-c之核酸或其類似物，其中： 各B係核鹼基或氫； PG係合適之羥基保護基； PG1 係保護基； R1 及R2 獨立地係氫、鹵素、R5 、-CN、-S(O)R、-S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ，或： 相同碳上之R1 及R2 連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之3至7員飽和或部分不飽和環； 各R獨立地係氫、合適之保護基，或視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環，或： 相同原子上之兩個R基團連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧、矽及硫之雜原子之4至7員飽和、部分不飽和或雜芳基環； R3 係氫、合適之保護基、合適之前藥，或視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環； 各R4 獨立地係氫、合適之前藥、R5 、鹵素、-CN、-NO2 、-OR、-SR、-NR2 、-S(O)2 R、-S(O)2 NR2 、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2 、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2 、-OP(O)R2 、-OP(O)(OR)2 、-OP(O)(OR)NR2 、-OP(O)(NR2 )2 -、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2 、-N(R)S(O)2 R、-N(R)P(O)R2 、-N(R)P(O)(OR)2 、-N(R)P(O)(OR)NR2 、-N(R)P(O)(NR2 )2 、-N(R)S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ； 各R5 獨立地係視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環； X1 係O、S或NR； 各X2 獨立地係-O-、-S-、-B(H)2 -或共價鍵； X3 係-O-、-S-、-Se-或-N(R)-； 各Z獨立地係-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2 -；及 各n獨立地係0、1、2、3、4或5。
根據本文描述之實施例，在上文步驟(b)中去保護保護基(例如，PG或PG1 )包括彼等詳細描述於Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene及P. G. M. Wuts，第3版，John Wiley & Sons, 1999中之保護基，其等中之各者係以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，該保護基係合適之羥基保護基、合適之胺基保護基或合適之巰基保護基。
如本文使用，片語「合適之羥基保護基」為此項技術中熟知且當連同其結合之氧原子一起時，係獨立地選自酯、醚、矽基醚、烷基醚、芳基烷基醚及烷氧基烷基醚。此等酯之實例包括甲酸酯、乙酸酯、碳酸酯及磺酸酯。特定實例包括甲酸酯、苯甲醯基甲酸酯、氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、對氯苯氧基乙酸酯、3-苯基丙酸酯、4-側氧基戊酸酯、4,4-(伸乙基二硫)戊酸酯、新戊酸酯(三甲基乙醯基)、巴豆酸酯、4-甲氧基-巴豆酸酯、苯甲酸酯、對苯甲酸苯甲酯、2,4,6-三甲基苯甲酸酯、碳酸酯，諸如甲基、9-茀基甲基、乙基、2,2,2-三氯乙基、2-(三甲基矽基)乙基、2-(苯基磺醯基)乙基、乙烯基、烯丙基及對硝基苯甲基。此等矽基醚之實例包括三甲基矽基、三乙基矽基、第三丁基二甲基矽基、第三丁基二苯基矽基、三異丙基矽基，及其他三烷基矽基醚。烷基醚包括甲基、苯甲基、對甲氧基苯甲基、3,4-二甲氧基苯甲基、三苯甲基、第三丁基、烯丙基，及烯丙氧基羰基醚或衍生物。烷氧基烷基醚包括縮醛，諸如甲氧基甲基、甲硫基甲基、(2-甲氧基乙氧基)甲基、苯甲氧基甲基、β-(三甲基矽基)乙氧基甲基，及四氫哌喃醚。芳基烷基醚之實例包括苯甲基、對甲氧基苯甲基、3,4-二甲氧基苯甲基、鄰硝基苯甲基、對硝基苯甲基、對鹵基苯甲基、2,6-二氯苯甲基、對氰基苯甲基，及2-及4-吡啶甲基。在一些實施例中，合適之羥基保護基係酸不穩定基團，諸如三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr)、4,4’,4’’-三甲氧基三苯甲基、9-苯基-呫噸-9-基、9-(對甲苯基)-呫噸-9-基、苯基二苯并哌喃(pixyl)、2,7-二甲基苯基二苯并哌喃，及類似物，其等適用於在酸敏感寡核苷酸之溶液相及固相合成期間使用(例如)二氯乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸或乙酸去保護。該第三丁基二甲基矽基在用於在合成期間移除DMTr基團之酸性條件下穩定但可在用氟化物源(例如，四丁基氟化銨或氫氟吡啶)裂解並去保護RNA寡聚物後移除。
如本文使用，片語「合適之胺基保護基」為此項技術中熟知且當連同其結合之氮一起時，包括(但不限於)芳烷基胺、胺甲酸酯、烯丙胺、醯胺，及類似物。胺之單保護基之實例包括第三丁氧基羰基(BOC)、乙氧基羰基、甲氧基羰基、三氯乙氧基羰基、烯丙氧基羰基(Alloc)、苯甲基側氧基羰基(CBZ)、烯丙基、苯甲基(Bn)、茀基甲基羰基(Fmoc)、乙醯基、氯乙醯基、二氯乙醯基、三氯乙醯基、三氟乙醯基、苯乙醯基、苯甲醯基，及類似物。胺之雙保護基之實例包括經兩個獨立地選自彼等上文描述為單保護基之取代基取代之胺，且進一步包括環醯亞胺，諸如鄰苯二甲醯亞胺、順丁烯二醯亞胺、琥珀醯亞胺、2,2,5,5-四甲基-1,2,5-氮雜二矽環戊烷、疊氮化物，及類似物。應知曉胺基保護基一經酸水解，即形成其鹽化合物。例如，當藉由用酸(諸如鹽酸)處理移除胺基保護基時，則所得胺化合物將呈其鹽酸鹽形成。一般技術者應知曉多種酸適用於移除酸不穩定之胺基保護基並因此審慎考慮多種鹽形式。
如本文使用，片語「合適之巰基保護基」進一步包括(但不限於)二硫化物、硫醚、矽基硫醚、硫酯、硫碳酸酯及硫胺甲酸酯，及類似物。此等基團之實例包括(但不限於)烷基硫醚、苯甲基及經取代之苯甲基硫醚、三苯基甲硫基醚，及三氯乙氧基羰基硫酯等等。
在某些態樣中，本發明提供製備包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物之方法，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I-g-1表示：
Figure 02_image263
I-g-1 或其醫藥上可接受之鹽，該方法包括以下步驟： (a)    提供包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I-b-1表示：
Figure 02_image265
I-b-1 或其醫藥上可接受之鹽，及 (b)    將包含式I-b-1之核酸或其類似物去保護以形成包含式I-g-1之核酸或其類似物，其中： B、PG、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 、Y2 及Z中之各者如本文描述及上文定義。
在某些態樣中，本發明提供製備式I-d-1核酸或其類似物之方法：
Figure 02_image267
I-d-1 或其醫藥上可接受之鹽，該方法包括以下步驟： (a)    提供式I-c-1核酸或其類似物：
Figure 02_image269
I-c-1 或其醫藥上可接受之鹽，及 (b)    將式I-d-1核酸或其類似物去保護以形成式I-c-1核酸或其類似物，其中： B、PG、PG1 、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 及Z中之各者如本文描述及上文定義。
根據一項態樣，本發明提供製備包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物之方法，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I-b表示：
Figure 02_image271
I-b 或其醫藥上可接受之鹽，該方法包括以下步驟： (a)    提供式A4核酸或其類似物：
Figure 02_image273
A4 或其醫藥上可接受之鹽，及 (b)    縮合式A4核酸或其類似物與式A5核苷或其類似物：
Figure 02_image275
A5 以形成包含式I-b之核酸或其類似物，其中： 各B係核鹼基或氫； PG係合適之羥基保護基； R1 及R2 獨立地係氫、鹵素、R5 、-CN、-S(O)R、-S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ，或： 相同碳上之R1 及R2 連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之3至7員飽和或部分不飽和環； 各R獨立地係氫、合適之保護基，或視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環，或： 相同原子上之兩個R基團連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧、矽及硫之雜原子之4至7員飽和、部分不飽和或雜芳基環； R3 係氫、合適之保護基、合適之前藥，或視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環； 各R4 獨立地係氫、合適之前藥、R5 、鹵素、-CN、-NO2 、-OR、-SR、-NR2 、-S(O)2 R、-S(O)2 NR2 、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2 、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2 、-OP(O)R2 、-OP(O)(OR)2 、-OP(O)(OR)NR2 、-OP(O)(NR2 )2 -、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2 、-N(R)S(O)2 R、-N(R)P(O)R2 、-N(R)P(O)(OR)2 、-N(R)P(O)(OR)NR2 、-N(R)P(O)(NR2 )2 、-N(R)S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ； 各R5 獨立地係視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環； X1 係O、S或NR； 各X2 獨立地係-O-、-S-、-B(H)2 -或共價鍵； X3 係-O-、-S-、-Se-或-N(R)-； Y2 係氫、保護基、胺基亞磷酸酯類似物、結合至核苷、核苷酸或寡核苷酸之4′或5′端之核苷酸間連接基，或結合至撐體之連接基； 各Z獨立地係-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2 -；及 各n獨立地係0、1、2、3、4或5。
根據一項態樣，本發明提供製備包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物之方法，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I-p表示：
Figure 02_image277
I-p 或其醫藥上可接受之鹽，該方法包括以下步驟： (a)    提供式I-e核酸或其類似物：
Figure 02_image279
I-e 或其醫藥上可接受之鹽，及 (b)    縮合式I-e核酸或其類似物與式A8核苷或其類似物：
Figure 02_image281
A8 以形成包含式I-p之核酸或其類似物，其中： 各B係核鹼基或氫； PG係合適之羥基保護基； R1 及R2 獨立地係氫、鹵素、R5 、-CN、-S(O)R、-S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ，或： 相同碳上之R1 及R2 連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之3至7員飽和或部分不飽和環； 各R獨立地係氫、合適之保護基，或視需要經取代之選自以下之基團：C1-6 脂族、苯基，具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環，或： 相同原子上之兩個R基團連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧、矽及硫之雜原子之4至7員飽和、部分不飽和或雜芳基環； R3 係氫、合適之保護基、合適之前藥，或視需要經取代之選自以下之基團：C1-6 脂族、苯基，具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環； 各R4 獨立地係氫、合適之前藥、R5 、鹵素、-CN、-NO2 、-OR、-SR、-NR2 、-S(O)2 R、-S(O)2 NR2 、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2 、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2 、-OP(O)R2 、-OP(O)(OR)2 、-OP(O)(OR)NR2 、-OP(O)(NR2 )2 -、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2 、-N(R)S(O)2 R、-N(R)P(O)R2 、-N(R)P(O)(OR)2 、-N(R)P(O)(OR)NR2 、-N(R)P(O)(NR2 )2 、-N(R)S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ； 各R5 獨立地係視需要經取代之選自以下之基團：C1-6 脂族、苯基，具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環； E係鹵素或-NR2 ； X1 係O、S或NR； 各X2 獨立地係-O-、-S-、-B(H)2 -或共價鍵； X3 係-O-、-S-、-Se-或-N(R)-； Y4 係氫、保護基、胺基亞磷酸酯類似物、結合至核苷、核苷酸或寡核苷酸之4′或5′端之核苷酸間連接基，或結合至撐體之連接基； 各Z獨立地係-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2 -；及 各n獨立地係0、1、2、3、4或5。
根據一些實施例，上文步驟(b)中之縮合包括使用縮合劑。用於縮合式A4核酸或其類似物與式A5核苷或其類似物或包含式I-e之核酸或其類似物與式A8核苷或其類似物之縮合劑可包括磺醯氯，諸如甲烷磺醯氯、甲苯磺醯氯、2,4,6-三異丙基苯磺醯氯或均三甲苯-2-磺醯氯；磺醯基四唑，諸如1-甲苯磺醯基四唑、1-(均三甲苯-2-磺醯基)四唑或1-(2,4,6-三異丙基苯磺醯基)四唑；磺醯基三唑，諸如3-硝基-1-甲苯磺醯基-1,2,4-三唑、3-硝基-1-(均三甲苯-2-磺醯基)-1,2,4-三唑或3-硝基-1-(2,4,6-三異丙基苯磺醯基)-1,2,4-三唑；或類似物。在某些實施例中，該縮合劑係三異丙基苯磺醯氯。縮合期間，鹼可共同存在。因此使用之鹼之實例包括三乙胺、乙基二異丙胺、吡啶、二甲基吡啶、咪唑、N-甲基咪唑、N-甲基苯并咪唑，或類似物。在某些實施例中，該鹼係N-甲基咪唑。
在某些態樣中，本發明提供製備包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物之方法，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I-b-1表示：
Figure 02_image283
I-b-1 或其醫藥上可接受之鹽，該方法包括以下步驟： (a)    提供式A4-1核酸或其類似物：
Figure 02_image285
A4-1 或其醫藥上可接受之鹽，及 (b)    縮合包含式A4-1之核酸或其類似物與式A5-1核苷或其類似物：
Figure 02_image287
A5-1 以形成包含式I-b-1之核酸或其類似物，其中： B、PG、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 、Y2 及Z中之各者如本文描述及上文定義。
在某些態樣中，本發明提供製備包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物之方法，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I-p-1表示：
Figure 02_image289
I-p-1 或其醫藥上可接受之鹽，該方法包括以下步驟： (a)    提供式I-e-1核酸或其類似物：
Figure 02_image291
I-e-1 或其醫藥上可接受之鹽，及 (b)    縮合式I-e-1核酸或其類似物與式A8-1核苷或其類似物：
Figure 02_image293
A8-1 以形成包含式I-p-1之核酸或其類似物，其中： B、PG、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 、Y4 及Z中之各者如本文描述及上文定義。
根據一項態樣，本發明提供製備包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之寡核苷酸化合物之方法，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式A4表示：
Figure 02_image295
A4 或其醫藥上可接受之鹽，該方法包括以下步驟： (a)    提供式A3核酸或其類似物：
Figure 02_image297
A3 或其醫藥上可接受之鹽，及 (b)    將式A3核酸或其類似物去保護以形成式A4核酸或其類似物，其中： B係核鹼基或氫； R1 及R2 獨立地係氫、鹵素、R5 、-CN、-S(O)R、-S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ，或： 相同碳上之R1 及R2 連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之3至7員飽和或部分不飽和環； 各R獨立地係氫、合適之保護基，或視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環，或： 相同原子上之兩個R基團連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧、矽及硫之雜原子之4至7員飽和、部分不飽和或雜芳基環； R3 係氫、合適之保護基、合適之前藥，或視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環； 各R4 獨立地係氫、合適之前藥、R5 、鹵素、-CN、-NO2 、-OR、-SR、-NR2 、-S(O)2 R、-S(O)2 NR2 、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2 、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2 、-OP(O)R2 、-OP(O)(OR)2 、-OP(O)(OR)NR2 、-OP(O)(NR2 )2 -、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2 、-N(R)S(O)2 R、-N(R)P(O)R2 、-N(R)P(O)(OR)2 、-N(R)P(O)(OR)NR2 、-N(R)P(O)(NR2 )2 、-N(R)S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ； 各R5 獨立地係視需要經取代之基團，該基團選自C1-6 脂族、苯基、具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環； X1 係O、S或NR； 各X2 獨立地係-O-、-S-、-B(H)2 -或共價鍵； X3 係-O-、-S-、-Se-或-N(R)-； Y2 係氫、保護基、胺基亞磷酸酯類似物、結合至核苷、核苷酸或寡核苷酸之4′或5′端之核苷酸間連接基，或結合至撐體之連接基； Z係-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2 -；及 n係0、1、2、3、4或5。
在某些實施例中，Y2 係保護基。
根據本文描述之實施例，在上文步驟(b)中去保護式A3可包括去保護上文揭示或本文定義之任何合適之保護基。在某些實施例中，式A3核酸或類似物包含4′-O-亞甲基膦酸酯且單去保護係在鹼性水性條件下進行。合適之鹼金屬氫氧化物(例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鋰及氫氧化鋇)、金屬碳酸酯(例如，碳酸鋰、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸鈣、碳酸銫)、碳酸氫鈉、有機胺(例如，三乙胺、N,N-二異丙基乙胺(DIEA)、N-甲基嗎啉、N-乙基嗎啉、三丁胺、1,4-二氮雜雙環[2.2.2]辛烷(DABCO)、N-甲基咪唑(NMI)、吡啶、2,6-二甲基吡啶、2,4,6-三甲吡啶、4-二甲基胺基吡啶(DMAP)、1,8-雙(二甲基胺基)萘(「質子海綿」)、1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、1,5-二氮雜雙環[4.3.0]壬-5-烯(DBN)、7-甲基-1,5,7-三氮雜雙環[4.4.0]癸-5-烯(MTBD)、2-第三丁基-1,1,3,3-四甲基胍、2,8,9-三甲基-2,5,8,9-四氮雜-1-磷雙環[3.3.3]十一烷或磷腈鹼)。
在某些態樣中，本發明提供製備式A4-1核酸或其類似物之方法：
Figure 02_image299
A4-1 或其醫藥上可接受之鹽，該方法包括以下步驟： (a)    提供式A3-1核酸或其類似物：
Figure 02_image301
A3-1 或其醫藥上可接受之鹽，及 (b)    將式A4-1核酸或其類似物去保護以形成式A3-1核酸或其類似物，其中： B、PG、R1 、R2 、R3 、R4 、X1 、X2 、Y2 及Z中之各者如本文描述及上文定義。
在某些實施例中，Y2 係保護基。 5.用途、調配物及投與 醫藥上可接受之組合物
根據另一實施例，本發明提供包含含有本發明之4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物及醫藥上可接受之載劑、佐劑或媒劑之組合物。本發明之組合物中提供之核酸之量可有效量測地調節靶基因於生物樣本或病患中之表現。在某些實施例中，本發明之組合物係經調配以向需此組合物之病患投與。在一些實施例中，本發明之組合物係經調配用於向病患非經腸或經口投與。在一些實施例中，該組合物包含醫藥上可接受之載劑、佐劑或媒劑，及核酸抑制劑分子，其中該核酸抑制劑分子包含至少一種包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核苷酸或其類似物，如本文描述。
如本文使用，術語「病患」意謂動物，較佳哺乳動物，及最佳人類。
術語「醫藥上可接受之載劑、佐劑或媒劑」係指不破壞調配其之本發明提供之核酸之藥理活性之無毒載劑、佐劑或媒劑。可用於本發明之組合物中之醫藥上可接受之載劑、佐劑或媒劑包括(但不限於)離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白(諸如人類血清白蛋白)、緩衝物質(諸如磷酸鹽)、甘胺酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸之部分甘油酯混合物、水、鹽或電解質(諸如硫酸魚精蛋白)、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠體二氧化矽、三矽酸鎂、聚乙烯吡咯啶酮、基於纖維素之物質、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇及羊毛脂。
「醫藥上可接受之衍生物」意謂本發明提供之核酸之任何無毒鹽、酯、酯之鹽或其他衍生物，一經向受體投與，其即可直接或間接提供本發明提供之核酸或抑制活性代謝物或其殘餘物。
如本文使用，術語「抑制活性代謝物或其殘餘物」意謂代謝物或其殘餘物亦適用於調節靶基因在生物樣本或病患中之表現。
本發明之組合物可經口、非經腸、藉由吸入噴霧劑、局部、經直腸、經鼻、經頰、經陰道或經由植入式貯庫投與。如本文使用之術語「非經腸」包括皮下、靜脈內、肌內、關節內、滑膜內、胸骨內、鞘內、肝內、病灶內及顱內注射或輸注技術。較佳地，該等組合物係調配成液體形式以用於非經腸投與，例如，藉由皮下、肌內、靜脈內或硬膜外注射。適用於非經腸投與之劑型通常包含一或多種適用於非經腸投與之媒劑，包括(以實例說明之)無菌水溶液、鹽水、低分子量醇(諸如丙二醇)、聚乙二醇、植物油、明膠、脂肪酸酯(諸如油酸乙酯)，及類似物。非經腸調配物可含有糖、醇、抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑、使該調配物與預期受體之血液等滲之溶質，或懸浮劑或增稠劑。適當之流動性可(例如)藉由使用表面活性劑維持。可將液體調配物凍乾並儲存以後續用無菌可注射溶液重溶使用。
本發明之組合物之無菌可注射形式可為水性或油質懸浮液。此等懸浮液可根據此項技術中已知的技術使用合適之分散劑或潤濕劑及懸浮劑調配。該無菌可注射製劑亦可為於無毒非經腸可接受之稀釋劑或溶劑中之無菌可注射溶液或懸浮液，例如作為於1,3-丁二醇中之溶液。在可接受之媒劑及溶劑中，可採用水、林格氏溶液及等滲氯化鈉溶液。另外，無菌、固定油習知用作溶劑或懸浮介質。
出於此目的，可採用任何溫和之固定油(包括合成單或雙甘油酯)。脂肪酸(諸如油酸及其甘油酯衍生物)適用於製備可注射劑，同樣天然之醫藥上可接受之油(諸如橄欖油或蓖麻油)，尤其以其等聚氧乙烯化形式，亦適用於製備可注射劑。此等油溶液或懸浮液亦可含有長鏈醇稀釋劑或分散劑(諸如羧甲基纖維素)或常用於調配醫藥上可接受之劑型(包括乳液及懸浮液)之類似分散劑。其他常用表面活性劑(諸如Tweens、Spans及常用於製造醫藥上可接受之固體、液體或其他劑型之其他乳化劑或生物利用度增強劑)亦可用於調配之目的。
本發明之醫藥上可接受之組合物可以任何經口可接受之劑型經口投與，該等劑型包括(但不限於)膠囊、錠劑、水性懸浮液或溶液。在經口使用之錠劑之情況下，常用載劑包括乳糖及玉米澱粉。通常，亦添加潤滑劑(諸如硬脂酸鎂)。關於以膠囊形式經口投與，有用之稀釋劑包括乳糖及乾燥玉米澱粉。當經口使用需水性懸浮液時，活性成分與乳化劑及懸浮劑組合。視需要，亦可添加某些甜味劑、調味劑或著色劑。經調配用於經口投與之本發明之組合物可與或不與食物一起投與。在一些實施例中，本發明之醫藥上可接受之組合物不與食物一起投與。在其他實施例中，本發明之醫藥上可接受之組合物與食物一起投與。
或者，本發明之醫藥上可接受之組合物可以用於直腸投與之栓劑之形式投與。此等組合物可藉由混合藥劑與合適之非刺激性賦形劑製備，該組合物在室溫下係固體但在直腸溫度下係液體並因此將在直腸中融化以釋放藥物。此等材料包括可可脂、蜂蠟及聚乙二醇。
本發明之醫藥上可接受之組合物亦可局部投與，尤其當治療目標包括藉由局部應用易接近之區域或器官(包括眼、皮膚或下腸道之疾病)時。針對此等區域或器官中之各者易於製備合適之局部調配物。
下腸道之局部應用可受直腸栓劑調配物(參見上文)或受合適之灌腸劑調配物影響。亦可使用局部透皮貼劑。
關於局部應用，可將本發明提供之醫藥上可接受之組合物調配成含有活性組分懸浮或溶解於一或多種載劑中之合適之軟膏。用於局部投與本發明之核酸或其類似物之載劑包括(但不限於)礦物油、液體石蠟脂、白石蠟脂、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蠟及水。或者，可將本發明提供之醫藥上可接受之組合物調配成含有活性組分懸浮或溶解於一或多種醫藥上可接受之載劑中之合適之洗劑或乳膏。合適之載劑包括(但不限於)礦物油、去水山梨醇單硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鯨蠟酯蠟、鯨蠟硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇及水。
關於眼科用途，可將本發明提供之醫藥上可接受之組合物調配成於等滲、pH經調整之無菌鹽水中之微粉化懸浮液，或較佳地，調配成於等滲、pH經調整之無菌鹽水中之溶液，該等組合物有或無防腐劑(諸如苯紮氯銨)。或者，關於眼科用途，可將醫藥上可接受之組合物調配成軟膏(諸如石蠟脂)。
本發明之醫藥上可接受之組合物亦可由鼻噴霧劑或吸入劑投與。此等組合物係根據醫藥調配物之領域中熟知的技術製備且可製備成於鹽水中之溶液，採用苯甲醇或其他合適之防腐劑、增強生物利用度之吸收促進劑、碳氟化合物，及/或其他習知增溶劑或分散劑。
在某些實施例中，本發明提供之核酸(例如，核酸抑制劑分子)可與化合物之其他分子、分子結構或混合物混合、囊封、共軛或另外結合，該等化合物包括(例如)脂質體及脂質，諸如彼等揭示於美國專利第6,815,432、6,586,410、6,858,225、7,811,602、7,244,448及8,158,601號中者；聚合材料，諸如彼等揭示於美國專利第6,835,393、7,374,778、7,737,108、7,718,193、8,137,695號及美國公開專利申請案第2011/0143434、2011/0129921、2011/0123636、2011/0143435、2011/0142951、2012/0021514、2011/0281934、2011/0286957及2008/0152661號中者；有助於攝取、分佈或吸收之殼體(capsid)、類殼體(capsoid)或受體靶向分子，其等中之各者係以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，將本發明提供之核酸(例如，核酸抑制劑分子)調配成脂質奈米顆粒(LNP)。一經混合脂質與核酸以形成複合物，通常即自發形成脂質-核酸奈米顆粒。取決於所需之粒度分佈，所得奈米顆粒混合物可視需要使用(例如)熱桶擠壓機(諸如LIPEX®擠壓機(Northern Lipids, Inc))擠壓通過聚碳酸酯膜(例如，100 nm截斷)。為製備用於治療用途之脂質奈米顆粒，可期望移除使用之溶劑(例如，乙醇)以形成奈米顆粒及/或交換緩衝劑，該移除可藉由(例如)透析或切向流過濾進行。製造含有核酸抑制劑分子之脂質奈米顆粒之方法為此項技術中已知，如揭示(例如)於美國公開專利申請案第2015/0374842及2014/0107178號中，其等中之各者係以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，LNP包含含有陽離子脂質體及聚乙二醇化脂質之脂質核心。該LNP可進一步包含一或多種包膜脂質，諸如陽離子脂質、結構性或中性脂質、固醇、聚乙二醇化脂質，或其混合物。
在某些實施例中，本發明提供之核酸共價結合至配體，該配體將該核酸引導遞送至受關注之組織。已探究許多此等配體。參見，例如，Winkler, THER. DELIV., 2013, 4(7): 791-809。例如，本發明提供之核酸可結合至多個配體部分(例如，N-乙醯半乳胺糖(GalNAc))以將該核酸引導攝取至肝內。參見，例如，WO 2016/100401。可使用之其他配體包括(但不限於)甘露糖-6-磷酸酯、膽固醇、葉酸鹽、轉鐵蛋白及半乳糖(關於其他特定例示性配體，參見，例如，WO 2012/089352)。通常，當本發明提供之核酸結合至配體時，該核酸係作為裸核酸投與，其中亦未將寡核苷酸調配於LNP或其他保護包衣中。在某些實施例中，該裸核酸內之各核苷酸於糖部分之2’-位置，通常經2’-F或2’-OMe修飾。
此等醫藥組合物可藉由習知滅菌技術滅菌或可經無菌過濾。所得水溶液可經包裝以原樣使用，或凍乾，該凍乾製劑係在投與前與無菌水性賦形劑組合。該等製劑之pH通常將在3與11之間，更佳在5與9之間或在6與8之間，且最佳在7與8之間，諸如7至7.5。固體形式之醫藥組合物可包裝於多個單劑量單位中，該等單劑量單位各含有固定量之上文提及之一或多種藥劑，諸如包裝於錠劑或膠囊之密封包裝中。固體形式之醫藥組合物亦可以靈活量包裝於容器中，諸如包裝於針對局部可應用之乳膏或軟膏設計之可壓縮管中。
可與載劑材料組合以產生單一劑型之組合物之本發明之核酸或其類似物之量將取決於治療之宿主、特定之投與模式而變化。較佳地，應調配本發明提供之組合物使得可向接受此等組合物之病患投與劑量在0.01與100 mg/kg體重/天之間的核酸或其類似物。
亦應瞭解用於任何特定病患之特定劑量及治療方案將取決於各種因素，包括採用之特定核酸或其類似物之活性、年齡、體重、一般健康、性別、飲食、投與時間、排泄率、藥物組合，及主治醫師之判斷及治療中之特定疾病之嚴重程度。本發明之核酸或其類似物於該組合物中之量亦將取決於該組合物中之特定核酸或其類似物。 核酸及其類似物及醫藥上可接受之組合物之用途
本文描述之核酸及其類似物及組合物一般適用於調節細胞內RNA含量。本發明提供之包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物可用於調節靶基因在細胞中之表現之方法中。通常，此等方法包括以足以調節靶基因之表現之量將本發明提供之核酸抑制劑分子引入細胞內。在某些實施例中，該方法係活體內進行。該方法亦可活體外或離體進行。在某些實施例中，該細胞係哺乳動物細胞，包括(但不限於)人類細胞。
在某些實施例中，本發明提供之包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物(例如，核酸抑制劑分子)可用於治療有需要病患之方法中。通常，此等方法包括向有需要病患投與治療有效量之包含如本文描述之本發明提供之核酸抑制劑分子之醫藥組合物。
如本文使用，如本文描述，術語「治療(treatment、treat及treating)」係指逆轉、緩解疾病或疾患，或其一或多種症狀，延遲其發作，或抑制其進展。在一些實施例中，治療可在已發展一或多種症狀後投與。在其他實施例中，治療可在缺乏症狀之情況下投與。例如，治療可在症狀發作前向易感個體投與(例如，鑑於症狀史及/或鑑於基因或其他易感因素)。治療亦可在症狀已解決後繼續，例如來防止或延遲其等復發。
在某些實施例中，本文揭示之醫藥組合物可適用於治療或預防有需要病患中與病毒感染相關之症狀。一項實施例係關於治療病毒感染之方法，其包括向個體投與包含治療有效量之本發明提供之包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物(例如，核酸抑制劑分子)之醫藥組合物，如本文描述。此等病毒感染之非限制性實例包括HCV、HBV、HPV、HSV或HIV感染。
在某些實施例中，本文揭示之醫藥組合物可適用於治療或預防有需要病患中與癌症相關之症狀。一項實施例係關於治療癌症之方法，其包括向個體投與包含治療有效量之本發明提供之核酸抑制劑分子之醫藥組合物，如本文描述。此等癌症之非限制性實例包括膽道癌、膀胱癌、移行細胞癌、尿路上皮癌、腦癌、膠質瘤、星形細胞瘤、乳癌、化生癌、宮頸癌、宮頸鱗狀細胞癌、直腸癌、結腸直腸癌、結腸癌、遺傳性非息肉性結腸直腸癌、結腸直腸腺癌、胃腸道間質瘤(GIST)、子宮內膜癌、子宮內膜間質肉瘤、食道癌、食道鱗狀細胞癌、食管腺癌、眼黑素瘤、葡萄膜黑色素瘤、膽囊癌、膽囊腺癌、腎細胞癌、透明細胞腎細胞癌、移行細胞癌、尿路上皮癌、腎母細胞瘤、白血病、急性淋巴細胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性粒單核細胞白血病(CMML)、肝癌、肝惡性瘤、肝腫瘤、肝細胞癌、膽管癌、肝母細胞瘤、肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、間皮瘤、B細胞淋巴瘤、非何傑金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、彌漫型大B細胞淋巴瘤、被套細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、非何傑金氏淋巴瘤、前體T淋巴細胞淋巴瘤/白血病、外週T細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、鼻咽癌(NPC)、成神經細胞瘤、口咽癌、口腔鱗狀細胞癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臓癌、胰導管腺癌、假乳頭狀腫瘤、腺泡細胞癌。前列腺癌、前列腺腺癌、皮膚癌、黑色素瘤、惡性黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、小腸癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric carcinoma)、胃腸道間質瘤(GIST)、子宮癌或子宮肉瘤。通常，本發明之特徵為藉由投與治療有效量之如本文描述之醫藥組合物治療肝癌、肝惡性瘤、肝腫瘤、肝細胞癌、膽管癌及肝母細胞瘤之方法。
在某些實施例中，本文揭示之醫藥組合物可適用於治療或預防與增生性、發炎性、自體免疫性、神經、眼、呼吸、代謝、皮膚病學、聽覺、肝、腎，或感染性疾病相關之症狀。一項實施例係關於治療增生性、發炎性、自體免疫性、神經、眼、呼吸、代謝、皮膚病學、聽覺、肝、腎，或感染性疾病之方法，其包括向個體投與包含治療有效量之本發明提供之核酸抑制劑分子之醫藥組合物，如本文描述。通常，該疾病或病症係肝疾病。
在一些實施例中，本發明提供減少靶基因在個體中之表現之方法，其包括以足以減少該靶基因之表現之量向有需要個體投與醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含如本文描述之本發明提供之含有4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸抑制劑分子或其類似物及如本文亦描述之醫藥上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，本發明提供之核酸抑制劑分子係如本文描述之RNAi抑制劑分子，包括dsRNAi抑制劑分子或ssRNAi抑制劑分子。
靶基因可為來自任何哺乳動物之靶基因，諸如人類靶基因。任何基因可根據本發明方法沉默。例示性靶基因包括(但不限於) VII因子、Eg5、PCSK9、TPX2、apoB、SAA、TTR、HBV、HCV、RSV、PDGF β基因、Erb-B基因、Src基因、CRK基因、GRB2基因、RAS基因、MEKK基因、JNK基因、RAF基因、Erk1/2基因、PCNA(p21)基因、MYB基因、JUN基因、FOS基因、BCL-2基因、週期蛋白D基因、VEGF基因、EGFR基因、週期蛋白A基因、週期蛋白E基因、WNT-1基因、β-連環蛋白基因、c-MET基因、PKC基因、NFKB基因、STAT3基因、存活素基因、Her2/Neu基因、拓撲異構酶I基因、拓撲異構酶II α基因、p73基因、p21(WAF1/CIP1)基因、p27(KIP1)基因、PPM1D基因、RAS基因、窖蛋白I基因、MIB I基因、MTAI基因、M68基因、腫瘤抑制基因中之突變、p53腫瘤抑制基因、LDHA，及其組合。
在一些實施例中，本發明提供之包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸抑制劑分子或其類似物使靶基因沉默且因此可用於治療患有特徵在於靶基因之非所需表現之疾患或處於其風險下之個體。例如，在一些實施例中，該本發明提供之核酸抑制劑分子使β-連環蛋白基因沉默，且因此可用於治療患有特徵在於非所需之β-連環蛋白表現之疾患(例如，腺癌或肝細胞癌)或處於其風險下之個體。
通常，本發明提供之核酸(例如，核酸抑制劑分子)係經靜脈內或皮下投與。然而，本文揭示之醫藥組合物亦可藉由此項技術中已知的任何方法投與，該方法包括(例如)經口、頰、舌下、直腸、陰道、尿道內、局部、眼內、鼻內及/或耳內，該投與可包括錠劑、膠囊、顆粒、水性懸浮液、凝膠、噴霧劑、栓劑、油膏、軟膏，或類似物。
在某些實施例中，醫藥組合物係經由全身投與(諸如經由靜脈內或皮下投與)遞送至個體或有機體中之相關組織或細胞(諸如肝)。在其他實施例中，該醫藥組合物係經由局部投與或全身投與遞送。在某些實施例中，該醫藥組合物係經由局部投與(諸如經由肺部遞送)遞送至相關組織或細胞(諸如肺細胞及組織)。
本文揭示之核酸或其類似物之治療有效量可取決於投與途徑及病患之身體特性，諸如個體之大小及重量、疾病進展或滲透之程度、個體之年齡、健康及性別。
在某些實施例中，如本文描述之本發明提供之核酸係在20微克至10毫克每公斤體重受體每天、100微克至5毫克每公斤體重受體每天，或0.5至2.0毫克每公斤體重受體每天之劑量下投與。
本發明之醫藥組合物可每天或間歇投與。例如，本發明之核酸或其類似物之間歇性投與可每週一至六天、每月一至六天、每週一次、每隔一週一次、每月一次、每隔一月一次，或每年一次或兩次或分為每年、每月、每週或每日多個劑量投與。在一些實施例中，間歇性給藥可意謂週期性投與(例如每日投與一天、一週或連續二至八週，然後停藥，不投與長達一週、長達一個月、長達兩個月、長達三個月或長達六個月或以上)或其可意謂間隔數天、數週、數月或數年投與。
在本發明之治療方法之任一者中，核酸或其類似物可作為單一療法單獨或與此項技術中已知的額外療法組合向個體投與。 範例縮寫 Ac：乙醯基 AcOH：乙酸 ACN：乙腈 Ad：金剛烷基 AIBN：2,2'-偶氮二異丁腈 Anhyd：無水 Aq：水性 B2 Pin2 ：雙(頻哪醇合)二硼-4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-二(1,3,2-二氧雜硼烷) BINAP：2,2'-雙(二苯基膦基)-1,1'-聯萘 BH3 ：硼烷 Bn：苯甲基 Boc：第三丁氧基羰基 Boc2 O：二碳酸二第三丁基酯 BPO：過氧化苯甲醯n BuOH：正丁醇 CDI：羰基二咪唑 COD：環辛二烯 d：天 DABCO：1,4-重氮基雙環[2.2.2]辛烷 DAST：二乙基胺基三氟化硫 dba：二亞苯甲基丙酮 DBU：1,8-重氮基雙環[5.4.0]十一碳-7-烯 DCE：1,2-二氯乙烷 DCM：二氯甲烷 DEA：二乙胺 DHP：二氫哌喃 DIBAL-H：氫化二異丁基鋁 DIPA：二異丙胺 DIPEA或DIEA：N,N-二異丙基乙胺 DMA：N,N-二甲基乙醯胺 DME：1,2-二甲氧基乙烷 DMAP：4-二甲基胺基吡啶 DMF：N,N-二甲基甲醯胺 DMP：戴斯-馬丁過碘烷 DMSO：二甲基亞碸 DMTr：4,4’-二甲氧基三苯甲基 DPPA：二苯基磷醯基疊氮化物 dppf：1,1’-雙(二苯基膦基)二茂鐵 EDC或EDCI：1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 ee：對映體過量 ESI：電噴霧電離 EA：乙酸乙酯 EtOAc：乙酸乙酯 EtOH：乙醇 FA：甲酸 h或hr：小時 HATU：六氟磷酸N,N,N’,N’-四甲基-O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)脲鎓 HCl：鹽酸 HPLC：高效液相層析術 HOAc：乙酸 IBX：2-二氧碘基苯甲酸 IPA：異丙醇 KHMDS：六甲基二矽氮化鉀 K2 CO3 ：碳酸鉀 LAH：氫化鋁鋰 LDA：二異丙基胺基鋰 L-DBTA：二苯甲醯基-L-酒石酸 m-CPBA：間氯過氧苯甲酸 M：莫耳 MeCN：乙腈 MeOH：甲醇 Me2 S：二甲硫 MeONa：甲醇鈉 MeI：碘甲烷 min：分鐘 mL：毫升 mM：毫莫耳 mmol：毫莫耳 MPa：兆帕斯卡 MOMCl：甲基氯甲基醚 MsCl：甲烷磺醯氯 MTBE：甲基第三丁基醚 nBuLi：正丁基鋰 NaNO2 ：亞硝酸鈉 NaOH：氫氧化鈉 Na2 SO4 ：硫酸鈉 NBS：N-溴琥珀醯亞胺 NCS：N-氯琥珀醯亞胺 NFSI：N-氟苯磺醯亞胺 NMO：N-甲基嗎啉N-氧化物 NMP：N-甲基吡咯啶 NMR：核磁共振o C：攝氏溫度 Pd/C：碳載鈀 Pd(OAc)2 ：乙酸鈀 PBS：磷酸鹽緩衝鹽水 PE：石油醚 POCl3 ：氧氯化磷 PPh3 ：三苯膦 PyBOP：六氟磷酸(苯并三唑-1-氧基)三吡咯啶基鏻 Rel：相對 R.T.或rt：室溫 sat：飽和 SEMCl：氯甲基-2-三甲基矽基乙基醚 SFC：超臨界流體層析術 SOCl2 ：二氯化硫 tBuOK：第三丁醇鉀 TBAB：四丁基溴化銨 TBAF：四丁基氟化銨 TBAI：四丁基碘化銨 TEA：三乙胺 Tf：三氟甲磺酸酯 TfAA、TFMSA或Tf2 O：三氟甲磺酸酐 TFA：三氟乙酸 TIBSCl：2,4,6-三異丙基苯磺醯氯 TIPS：三異丙基矽基 THF：四氫呋喃 THP：四氫哌喃 TLC：薄層層析術 TMEDA：四甲基乙二胺 pTSA：對甲苯磺酸 UPLC：超高效液相層析術 wt：重量 Xantphos：4,5-雙(二苯基膦基)-9,9-二甲基呫噸 一般合成方法
下列實例意欲闡述本發明且不應視為限制本發明。溫度以攝氏度給定。若未另外提及，則所有蒸發均在減壓下，較佳在約15 mm Hg至100 mm Hg (= 20至133 mbar)之間進行。最終產物、中間物及起始材料之結構藉由標準分析方法例如微量分析及光譜特性(例如，MS、IR、NMR)證實。使用之縮寫為彼等此項技術中習知的。
用於合成本發明之核酸或其類似物之所有起始材料、建構組元、試劑、酸、鹼、脫水劑、溶劑及觸媒可購買獲得或可藉由一般技術者已知的有機合成方法產生(Houben-Weyl第4版，1952, Methods of Organic Synthesis, Thieme，第21卷)。另外，本發明之核酸或其類似物可藉由一般技術者已知如下列實例中顯示之有機合成方法產生。
除非另有說明，否則所有反應在氮或氬下進行。
質子NMR (1 H NMR)係在氘化溶劑中進行。在本文揭示之某些核酸或其類似物中，一或多個1 H位移與殘餘之蛋白溶劑信號重疊；此等信號已報導於下文提供之實驗中。
如下文實例中繪示，在某些例示性實施例中，核酸或其類似物根據下列一般程序製備。應知曉，儘管該等一般方法繪示本發明之某些核酸或其類似物之合成，但下列一般方法及一般技術者已知的其他方法可應用於如本文描述，所有核酸或其類似物及此等核酸或其類似物中之各者之子類及種類。實例 1 ： (2R,3S,4R,5R)-2-(((((2R,3S,5R)-2-(( 雙 (4- 甲氧基苯基 )( 苯基 ) 甲氧基 ) 甲基 )-5-(5- 甲基 -2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 ) 四氫呋喃 -3- 基 ) 氧基 )( 甲氧基 ) 磷醯基 ) 甲氧基 )-5-(2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 )-4- 甲氧基四氫呋喃 -3- 基 (2- 氰乙基 ) 二異丙基胺基亞磷酸酯 (I-3) 之合成
Figure 02_image303
步驟 1 ： ((((2R,3S,4R,5R)-3-(( 第三丁基二甲基矽基 ) 氧基 )-5-(2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 )-4- 甲氧基四氫呋喃 -2- 基 ) 氧基 ) 甲基 ) 膦酸二甲酯。 (1.2)
將1.10 g1.1 溶解於10 mL無水DMF中。然後將1.22 g咪唑添加至該溶液。添加1.36 g TBSCl後，在室溫下將該反應混合物保持攪拌10小時。如藉由UPLC證實反應完成後，在減壓下移除DMF。然後將淡黃色殘餘物重新溶解於200 mL EA中並用75 mL水洗兩次及用鹽水洗一次。所得溶液經無水硫酸鈉乾燥並藉由旋轉蒸發移除揮發物。然後粗產物藉由驟沸塔(0至10% MeOH於DCM中)純化以提供呈白色泡沫之1.2 (1.21 g，83%產率)。1 H-NMR (400MHz, CDCl3 ) δ (ppm): 8.42 (s, 1H), 7.59 (d, J=8Hz, 1H), 7.58 (d, J=4Hz, 1H), 6.33 (dd, J1=8Hz, J2=1.6Hz, 1H), 4.89 (s, 1H), 4.25 (d, J=4Hz, 1H), 4.03 (m, 1H), 3.76-3.91 (m, 2H), 3.85 (d, J=4Hz, 3H), 3.82 (d, J=4Hz, 3H), 3.37 (s, 3H), 0.91 (s, 9H), 0.13 (s, 3H), 0.11 (s, 3H)。針對C18 H33 N2 NaO9 PSi- 計算之MS (ESI) m/z：503.5150，實測值：503.55。
步驟 2 ：氫 ((((2R,3S,4R,5R)-3-(( 第三丁基二甲基矽基 ) 氧基 )-5-(2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 )-4- 甲氧基四氫呋喃 -2- 基 ) 氧基 ) 甲基 ) 膦酸甲酯。 (1.3)
將3.30 g1.2 溶解於120 mL水性吡啶(吡啶:水3:2)中。將該反應混合物加熱至50℃並保持攪拌16小時。如藉由UPLC證實反應完成後，在減壓下移除揮發物。粗產物1.3 (3.74 g，定量)無需進一步純化即可用於下一步驟中。1 H-NMR (400MHz, DMSO-d6 ) δ (ppm): 11.16 (br, 1H), 7.75 (d, J=1Hz, 1H), 6.09 (d, J=8Hz, 1H), 5.67 (d, J1=8Hz, 1H), 4.94 (s, 1H), 4.24 (d, J=4Hz, 1H), 3.95 (m, 1H), 3.45-3.61 (m, 2H), 3.43 (d, J=4Hz, 3H), 3.26 (s, 3H), 0.87 (s, 9H), 0.11 (s, 3H), 0.10 (s, 3H)。31 P-NMR (200MHz, DMSO-d6 ): 19.96。針對C17 H30 N2 O9 PSi- 計算之MS (ESI) m/z：465.4913，實測值：465.23。
步驟 3 ： ((((2R,3S,4R,5R)-3-(( 第三丁基二甲基矽基 ) 氧基 )-5-(2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 )-4- 甲氧基四氫呋喃 -2- 基 ) 氧基 ) 甲基 ) 膦酸 (2R,3S,5R)-2-(( 雙 (4- 甲氧基苯基 )( 苯基 ) 甲氧基 ) 甲基 )-5-(5- 甲基 -2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 ) 四氫呋喃 -3- 基酯甲酯 (I-1) 。
將4.65 g1.3 溶解於100 mL無水吡啶中。將該混合物冷卻至0℃並添加7.72 g TIBSCl (3當量)及攪拌5 min，接著升溫至室溫並再攪拌15 min。然後將4.63 g 1-((2R,4R,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮添加至所得溶液，接著添加4.1 mL 1-甲基咪唑。在室溫下將該反應混合物攪拌2小時。UPLC證實反應完成並添加25 mL飽和碳酸氫鈉以淬滅該反應。在減壓下移除揮發物及所得黃色/棕色油藉由急速層析術(0至10% MeOH於DCM中，具有0.1% TEA)純化以提供呈白色粉末之I-1 (3.67 g，44%產率)。針對C48 H61 N4 NaO15 PSi+ 計算之MS (ESI) m/z：1016.0770，實測值：1016.01。
步驟 4 ： ((((2R,3S,4R,5R)-5-(2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 )-3- 羥基 -4- 甲氧基四氫呋喃 -2- 基 ) 氧基 ) 甲基 ) 膦酸 (2R,3S,5R)-2-(( 雙 (4- 甲氧基苯基 )( 苯基 ) 甲氧基 ) 甲基 )-5-(5- 甲基 -2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 ) 四氫呋喃 -3- 基酯甲酯 (I-2) 。
將2.50 gI-1 溶解於50 mL無水THF中。然後在室溫下歷時3 min向該溶液攪拌滴加7.5 mL TBAF (1M)。在室溫下將所得溶液保持攪拌30 min。當UPLC指示消耗＞85%起始材料時，停止該反應。在減壓下移除揮發物以產生黃色油，其藉由急速層析術(0至10% MeOH於DCM中，具有0.1% TEA)純化以提供呈白色粉末之I-2 (1.07 g，49%產率)。31 P-NMR (200MHz, CDCl3 ): 21.93, 21.91。針對C42 H46 N4 O15 P- 計算之MS (ESI) m/z：877.8173，實測值：877.91。
步驟 5 ： (2R,3S,4R,5R)-2-(((((2R,3S,5R)-2-(( 雙 (4- 甲氧基苯基 )( 苯基 ) 甲氧基 ) 甲基 )-5-(5- 甲基 -2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 ) 四氫呋喃 -3- 基 ) 氧基 )( 甲氧基 ) 磷醯基 ) 甲氧基 )-5-(2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 )-4- 甲氧基四氫呋喃 -3- 基 (2- 氰乙基 ) 二異丙基胺基亞磷酸酯 (I-3) 。
將440 mg化合物I-2 溶解於6 mL無水DCM中。在室溫下攪拌10 min後，將262 µL 2-氰乙基N’,N’,N’,N’-四異丙基亞磷二醯胺酸酯添加至該反應混合物，接著添加100 mg 4,5-二氰基咪唑。在室溫下將所得澄清溶液保持攪拌4小時。UPLC監測證實起始材料之完全轉化。然後該反應混合物用5 mL飽和碳酸氫鈉及5 mL鹽水洗。在經無水硫酸鈉乾燥後，在減壓下移除揮發物。然後白色油殘餘物藉由急速層析術(0至8% MeOH於DCM中，具有0.1% TEA)純化以提供呈白色粉末之I-3 (346 mg，64%產率)。31 P-NMR (200MHz, CDCl3 ): 152.80, 152.75, 151.53, 151.38, 22.65, 22.47, 22.19, 22.16。針對C51 H64 N6 NaO16 P2 + 計算之MS (ESI) m/z：1102.0357，實測值：1102.08。實例 2 ： (2R,3S,4R,5R)-2-(1-((((2R,3S,5R)-2-(( 雙 (4- 甲氧基苯基 )( 苯基 ) 甲氧基 ) 甲基 )-5-(5- 甲基 -2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 ) 四氫呋喃 -3- 基 ) 氧基 )( 甲氧基 ) 磷醯基 ) 乙氧基 )-5-(2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 )-4- 甲氧基四氫呋喃 -3- 基 (2- 氰乙基 ) 二異丙基胺基亞磷酸酯 (I-6) 之合成
Figure 02_image305
步驟 1 ：苯甲酸 (2R,3S,4R,5R)-5-(3-(( 苯甲氧基 ) 甲基 )-2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 )-2-(( 二甲氧基磷醯基 ) 甲氧基 )-4- 甲氧基四氫呋喃 -3- 基酯 (2.2) 。
將3.06 g2.1 溶解於20 mL無水DCM中。將該溶液冷卻至0℃並添加3.77 mL BF3 •Et2 O，接著添加3 mL (1-羥基乙基)膦酸二甲酯。在室溫下將該反應混合物攪拌24小時，然後將另一1.9 mL BF3 •Et2 O及1.5 mL (1-羥基乙基)膦酸二甲酯添加至該反應。將所得溶液再保持攪拌84小時。如藉由UPLC證實反應完成後，該反應用15 mL水淬滅並用40 mL DCM稀釋。將層分離，及有機層用30 mL飽和碳酸氫鈉及30 mL鹽水洗。在經無水硫酸鈉乾燥後，將該混合物濃縮並藉由急速層析術(30至100% EA於己烷中，接著0至5% MeOH於DCM中)純化以提供呈白色粉末之2.2 (2.04 g，56%產率)。針對C28 H32 N2 NaO11 P+ 計算之MS (ESI) m/z：627.5380，實測值：627.21。
步驟2：苯甲酸(2R,3S,4R,5R)-2-(1-(二甲氧基磷醯基)乙氧基)-5-(2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基四氫呋喃-3-基酯(2.3)。
將1.80 g2.2 溶解於0.9 mL無水甲苯中並將7.2 mL TFA添加至該溶液。然後將反應混合物加熱至45℃並攪拌3小時。如藉由UPLC證實反應完成後，該混合物用70 mL甲苯稀釋並在減壓下移除揮發物。然後將紫色/棕色殘餘物溶解於100 mL EA中並用50 mL碳酸氫鈉及50 mL鹽水洗。在經無水硫酸鈉乾燥後，在減壓下移除揮發物。然後所得棕色油藉由急速層析術純化以提供呈白色粉末之2.3 (1.11 g，77%產率)。針對C20 H25 N2 NaO10 P+ 計算之MS (ESI) m/z：507.3870，實測值：507.43。
步驟3：苯甲酸(2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-2-(1-(羥基(甲氧基)磷醯基)乙氧基)-4-甲氧基四氫呋喃-3-基酯(2.4)。
將1.11 g化合物2.3 溶解於40 mL 3:2吡啶及水混合物中。將該反應混合物加熱至50℃並攪拌16小時。如藉由UPLC證實反應完成後，在減壓下移除揮發物且粗2.4 (1.26 g，定量)無需進一步純化即可用於下一步驟中。
步驟4：苯甲酸(2R,3S,4R,5R)-2-(1-((((2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基)氧基)(甲氧基)磷醯基)乙氧基)-5-(2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基四氫呋喃-3-基酯(I-4)。
將1.04 g2.4 溶解於24 mL無水吡啶中並冷卻至0℃。添加1.81 g TIBSCl並將該混合物升溫至室溫且在室溫下攪拌10 min。將2.16 g 1-((2R,4R,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮添加至所得溶液，接著添加1.0 mL 1-甲基咪唑。然後在室溫下將該反應混合物攪拌3小時。如藉由UPLC證實反應完成後，添加10 mL飽和碳酸氫鈉以淬滅該反應。在減壓下移除揮發物及所得黃色油藉由急速層析術(0至10% MeOH於DCM中，具有0.1% TEA)純化以提供呈白色粉末之I-4 (0.89 g，47%產率)。針對C50 H53 N4 NaO16 P+ 計算之MS (ESI) m/z：1019.9490，實測值：1019.78。
步驟5：(1-(((2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-3-羥基-4-甲氧基四氫呋喃-2-基)氧基)乙基)膦酸(2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基酯甲酯(I-5)。
將1.38 g碳酸鉀添加至20 mL MeOH並將所得漿體攪拌12小時。將0.89 gI-4 溶解於5 mL無水MeOH中並添加5 mL預先製得之碳酸鉀漿體。在室溫下將該反應混合物攪拌2.5小時。如藉由UPLC證實反應完成後，將該反應混合物過濾，及濾液用2 mL 1M乙酸淬滅。在減壓下移除揮發物。然後粗產物藉由急速層析術(30至100% EA於己烷中，接著0至5% MeOH於DCM中，具有0.1% TEA)純化以提供呈白色泡沫之I-5 (0.42 g，53%產率)。針對C43 H49 N4 NaO15 P+ 計算之MS (ESI) m/z：915.8410，實測值：915.48。
步驟6：(2R,3S,4R,5R)-2-(1-((((2R,3S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)四氫呋喃-3-基)氧基)(甲氧基)磷醯基)乙氧基)-5-(2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-4-甲氧基四氫呋喃-3-基(2-氰乙基)二異丙基胺基亞磷酸酯(I-6)。
將550 mgI-5 溶解於7.5 mL無水DCM中。在室溫下攪拌10 min後，將320 µL 2-氰乙基N’,N’,N’,N’-四異丙基亞磷二醯胺酸酯添加至該反應混合物，接著添加90 mg 4,5-二氰基咪唑。在室溫下將所得澄清溶液攪拌3小時。如藉由UPLC證實反應完成後，該反應混合物用5 mL飽和碳酸氫鈉及5 mL鹽水洗。在經無水硫酸鈉乾燥後，在減壓下移除揮發物。然後白色油殘餘物藉由急速層析術(0至10% MeOH於DCM中，具有0.1% TEA)純化以提供呈白色粉末之I-6 (451 mg，67%產率)。31 P-NMR (200MHz, CDCl3 ): 152.48, 152.46, 151.32, 151.29, 24.74, 24.50, 24.13, 23.96。針對C52 H66 N6 NaO16 P2 + 計算之MS (ESI) m/z：1116.0627，實測值：1116.12。實例 3 ： (2R,3R,4S,5R)-2-(((((2R,4S,5R)-5-(6- 苯甲醯胺基 -9H- 嘌呤 -9- 基 )-2-(( 雙 (4- 甲氧基苯基 )( 苯基 ) 甲氧基 ) 甲基 )-4- 甲氧基四氫呋喃 -3- 基 ) 氧基 )( 甲氧基 ) 磷醯基 ) 甲氧基 )-5-(2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 )-4- 甲氧基四氫呋喃 -3- 基 (2- 氰乙基 ) 二異丙基胺基亞磷酸酯 (I-9) 之合成
Figure 02_image307
步驟 3 ： ((((2R,3S,4R,5R)-3-(( 第三丁基二甲基矽基 ) 氧基 )-5-(2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 )-4- 甲氧基四氫呋喃 -2- 基 ) 氧基 ) 甲基 ) 膦酸 (2R,3S,5R)-2-(( 雙 (4- 甲氧基苯基 )( 苯基 ) 甲氧基 ) 甲基 )-5-(5- 甲基 -2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 ) 四氫呋喃 -3- 基酯甲酯 (I-7) 。
將2.60 g1.3 溶解於55 mL無水吡啶中並冷卻至0℃。添加TIBSCl (3當量)並在0℃下保持攪拌15 min。升溫至室溫後，添加2.48 g N-(9-((2R,3S,4S,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基-3-甲氧基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲醯胺，接著添加2.3 mL 1-甲基咪唑。然後在室溫下將該反應混合物攪拌3小時。藉由UPLC證實反應完成後，添加10 mL飽和碳酸氫鈉以淬滅該反應。在減壓下移除揮發物及所得黃色油藉由急速層析術(0至10% MeOH於DCM中，具有0.1% TEA)純化以提供呈白色粉末之I-7 (2.26 g，55%產率)。針對C56 H67 N7 O15 PSi+ 計算之MS (ESI) m/z：1137.2442，實測值：1137.45。
步驟 4 ： ((((2R,3S,4R,5R)-5-(2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 )-3- 羥基 -4- 甲氧基四氫呋喃 -2- 基 ) 氧基 ) 甲基 ) 膦酸 (2R,3S,5R)-2-(( 雙 (4- 甲氧基苯基 )( 苯基 ) 甲氧基 ) 甲基 )-5-(5- 甲基 -2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 ) 四氫呋喃 -3- 基酯甲酯 (I-8) 。
將1.30 gI-7 溶解於40 mL無水THF中並在室溫下歷時3 min攪拌滴加3.0 mL TBAF (1M)，且在室溫下將所得溶液攪拌1小時。當藉由UPLC證實消耗＞90%起始材料時，在減壓下移除揮發物以產生黃色油，其藉由急速層析術(0至10% MeOH於DCM中，具有0.1% TEA)純化以提供呈灰白色粉末之I-8 (0.53 g，45%產率)。針對C50 H51 N7 O15 P- 計算之MS (ESI) m/z：1021.9663，實測值：1020.84。
步驟 5 ： (2R,3S,4R,5R)-2-(((((2R,3S,5R)-2-(( 雙 (4- 甲氧基苯基 )( 苯基 ) 甲氧基 ) 甲基 )-5-(5- 甲基 -2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 ) 四氫呋喃 -3- 基 ) 氧基 )( 甲氧基 ) 磷醯基 ) 甲氧基 )-5-(2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 )-4- 甲氧基四氫呋喃 -3- 基 (2- 氰乙基 ) 二異丙基胺基亞磷酸酯 (I-9) 。 將416 mgI-8 溶解於5 mL無水DCM中。在室溫下攪拌10 min後，將224 µL 2-氰乙基N’,N’,N’,N’-四異丙基亞磷二醯胺酸酯添加至該反應混合物，接著添加63 mg 4,5-二氰基咪唑。在室溫下將所得澄清溶液攪拌3小時。如藉由UPLC證實反應完成後，該反應混合物用5 mL飽和碳酸氫鈉，5 mL鹽水洗，經無水硫酸鈉乾燥，並在減壓下濃縮。然後所得白色油殘餘物藉由急速層析術(0至10% MeOH於DCM中，具有0.1% TEA)純化以提供呈白色泡沫之I-9 (305 mg，61%產率)。31 P-NMR (200MHz, CDCl3 ): 152.89, 152.71, 151.60, 151.51, 23.19, 22.81, 22.16, 21.75。針對C59 H70 N9 O16 P2 + 計算之MS (ESI) m/z：1223.2023，實測值：1222.91。實例 4 ： (2R,3R,5R)-2-(((((2R,3R,5R)-5-(6- 苯甲醯胺基 -9H- 嘌呤 -9- 基 )-2-(( 雙 (4- 甲氧基苯基 )( 苯基 ) 甲氧基 ) 甲基 ) 四氫呋喃 -3- 基 ) 氧基 )( 甲氧基 ) 磷醯基 ) 甲氧基 )-5-(5- 甲基 -2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 ) 四氫呋喃 -3- 基 (2- 氰乙基 ) 二異丙基胺基亞磷酸酯 (I-12) 之合成
Figure 02_image309
步驟 1 ：苯甲酸 (2R,3S,5R)-5-(3-(( 苯甲氧基 ) 甲基 )-5- 甲基 -2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 )-2-(1-( 二甲氧基磷醯基 ) 乙氧基 ) 四氫呋喃 -3- 基酯 (3.2)
將4.10 g3.1 溶解於24 mL無水DCM中。然後將該溶液冷卻至0℃並添加5.40 mL BF3 •Et2 O，接著添加3.60 mL (羥基甲基)膦酸二甲酯。在0℃下將該反應混合物攪拌15 min並容許逐漸升溫至室溫。在室溫下將所得溶液攪拌18小時。如藉由UPLC證實反應完成後，該反應用20 mL水淬滅並用60 mL DCM稀釋。將層分離，及有機層用30 mL飽和碳酸氫鈉及30 mL鹽水洗。在經無水硫酸鈉乾燥後，將該混合物濃縮並藉由急速層析術(30至100% EA於己烷中，接著0至10% MeOH於DCM中)純化以提供呈白色粉末之3.2 (2.15 g，45%產率)。1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ (ppm): 8.04 (dd, J1=12Hz, J2=4Hz, 2H), 7.24-7.64 (m, 9H), 6.86 (t, J=8Hz, 1H), 5.53 (s, 1H), 5.52 (s, 2H), 5.21 (s, 1H), 4.72 (s, 2H), 4.06 (dd, J1=14Hz, J2=8Hz, 1H), 3.82-3.90 (m, 7H), 2.58-2.63 (m, 1H), 2.32-2.39 (m, 1H), 2.02 (s, 3H)。針對C27 H31 N2 NaO10 P+ 計算之MS (ESI) m/z：597.1614，實測值：597.1783。
步驟 2 ：苯甲酸 (2R,3S,5R)-2-(( 二甲氧基磷醯基 ) 甲氧基 )-5-(5- 甲基 -2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 ) 四氫呋喃 -3- 基酯。 (3.3)
將2.12g化合物3.2 溶解於2.0mL無水甲苯中並將16.0 mL TFA添加至該溶液。然後將反應混合物加熱至45℃並攪拌5小時。如藉由UPLC證實反應完成後，該混合物用70 mL甲苯稀釋並在減壓下移除揮發物。然後將紫色/棕色殘餘物溶解於100 mL EA中並用100 mL碳酸氫鈉及100 mL鹽水洗。在經無水硫酸鈉乾燥後，在減壓下移除揮發物。然後所得棕色油藉由急速層析術純化以提供呈白色粉末之3.3 (1.21 g，75%產率)。1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ (ppm): 8.46 (s, 1H), 7.40-8.05 (m, 6H), 6.82 (t, J=8Hz, 1H), 5.53 (s, 1H), 5.22 (s, 1H), 4.07 (dd, J1=14Hz, J2=8Hz, 1H), 3.83-3.91 (m, 7H), 2.59-2.64 (m, 1H), 2.38-2.44 (m, 1H), 1.98 (s, 3H)。針對C19 H23 N2 NaO9 P+ 計算之MS (ESI) m/z：477.3615，實測值：477.4387。
步驟 3 ：苯甲酸 (2R,3S,5R)-2-(( 羥基 ( 甲氧基 ) 磷醯基 ) 甲氧基 )-5-(5- 甲基 -2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 ) 四氫呋喃 -3- 基酯 (3.4)
將1.2 g化合物3.4 溶解於40 mL 3:2吡啶及水混合物中。將該反應混合物加熱至50℃並攪拌16小時。如藉由UPLC證實反應完成後，在減壓下移除揮發物且粗產物3.4 (1.37 g，定量)無需進一步純化即可用於下一步驟中。
步驟 4 ：苯甲酸 (2R,3R,5R)-2-(((((2R,3R,5R)-5-(6- 苯甲醯胺基 -9H- 嘌呤 -9- 基 )-2-(( 雙 (4- 甲氧基苯基 )( 苯基 ) 甲氧基 ) 甲基 ) 四氫呋喃 -3- 基 ) 氧基 )( 甲氧基 ) 磷醯基 ) 甲氧基 )-5-(5- 甲基 -2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 ) 四氫呋喃 -3- 基酯 (I-10) 。
將2.56 g3.4 及2.98 g 1-((2R,4R,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮溶解於64 mL無水吡啶中並冷卻至0℃。添加3.44 g TIBSCl。然後在0℃下將該混合物攪拌15 min。升溫至室溫後，向反應混合物添加2.5 mL 1-甲基咪唑。然後在室溫下將該反應混合物攪拌3.5小時。如藉由UPLC證實反應完成後，添加30 mL飽和碳酸氫鈉以淬滅該反應。在減壓下移除揮發物及所得黃色油藉由急速層析術(0至10% MeOH於EA中，具有0.1% TEA)純化以提供呈白色粉末之I-10 (2.42 g，46%產率)。針對C56 H55 N7 O14 P+ 計算之MS (ESI) m/z：1080.3545，實測值：1080.3895。
步驟 5 ： ((((2R,3R,5R)-3- 羥基 -5-(5- 甲基 -2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 ) 四氫呋喃 -2- 基 ) 氧基 ) 甲基 ) 膦酸 (2R,3R,5R)-5-(6- 苯甲醯胺基 -9H- 嘌呤 -9- 基 )-2-(( 雙 (4- 甲氧基苯基 ) ( 苯基 ) 甲氧基 ) 甲基 ) 四氫呋喃 -3- 基酯甲酯 (I-11) 。
將1.38 g碳酸鉀添加至20 mL MeOH並將所得漿體攪拌12小時。然後過濾該漿體以產生作為碳酸鉀溶液之澄清濾液。將1.0 gI-10 溶解於45 mL無水MeOH中並添加5 mL預先製得之碳酸鉀溶液。在室溫下將該反應混合物攪拌1小時。如藉由UPLC證實反應完成後，將該反應混合物過濾，及濾液用1.5 mL 1M乙酸淬滅。在減壓下移除揮發物。然後粗產物藉由急速層析術(30至100% EA於己烷中，具有0.1% TEA，接著0至10% MeOH於DCM中)純化以提供呈白色泡沫之I-11 (0.52 g，58%產率)。針對C49 H51 N7 O13 P+ 計算之MS (ESI) m/z：976.3283，實測值：976.6138。
步驟 6 ： (2R,3R,5R)-2-(((((2R,3R,5R)-5-(6- 苯甲醯胺基 -9H- 嘌呤 -9- 基 )-2-(( 雙 (4- 甲氧基苯基 )( 苯基 ) 甲氧基 ) 甲基 ) 四氫呋喃 -3- 基 ) 氧基 )( 甲氧基 ) 磷醯基 ) 甲氧基 )-5-(5- 甲基 -2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 ) 四氫呋喃 -3- 基 (2- 氰乙基 ) 二異丙基胺基亞磷酸酯 (I-12) 。
將291 mgI-11 溶解於4.0 mL無水DCM中。在室溫下攪拌10 min後，將143 μL 2-氰乙基N’,N’,N’,N’-四異丙基亞磷二醯胺酸酯添加至該反應混合物，接著添加39 mg 4,5-二氰基咪唑。在室溫下將所得澄清溶液攪拌3小時。如藉由UPLC證實反應完成後，該反應混合物用5 mL飽和碳酸氫鈉及5 mL鹽水洗。在經無水硫酸鈉乾燥後，在減壓下移除揮發物。然後白色油殘餘物藉由急速層析術(0至10% MeOH於DCM中，具有0.1% TEA)純化以提供呈白色粉末之I-12 (220 mg，62%產率)。31P-NMR (200MHz, DMSO-d6): 149.64, 149.51, 149.49, 149.37, 23.67, 23.65, 23.38, 23.33。針對C58 H68 N9 O14 P2 + 計算之MS (ESI) m/z：1176.4361，實測值：1176.7185。實例 5 ： (2R,3R,5R)-2-(1-((((2R,3R,5R)-5-(6- 苯甲醯胺基 -9H- 嘌呤 -9- 基 )-2-(( 雙 (4- 甲氧基苯基 )( 苯基 ) 甲氧基 ) 甲基 ) 四氫呋喃 -3- 基 ) 氧基 )( 甲氧基 ) 磷醯基 ) 乙氧基 )-5-(5- 甲基 -2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 ) 四氫呋喃 -3- 基 (2- 氰乙基 ) 二異丙基胺基亞磷酸酯 (I-15) 之合成
Figure 02_image311
步驟 1 ：苯甲酸 (2R,3S,5R)-5-(3-(( 苯甲氧基 ) 甲基 )-5- 甲基 -2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 )-2-(1-( 二甲氧基磷醯基 ) 乙氧基 ) 四氫呋喃 -3- 基酯 (4.1)
將4.50 g3.1 溶解於27 mL無水DCM中。然後將該溶液冷卻至0℃並添加5.90 mL BF3 •Et2 O，接著添加4.50 mL (1-羥基乙基)膦酸二甲酯。在0℃下將該反應混合物攪拌15 min並容許逐漸升溫至室溫。在室溫下將所得溶液攪拌24小時。如藉由UPLC證實反應完成後，該反應用40 mL水淬滅並用100 mL DCM稀釋。將層分離，及有機層用30 mL飽和碳酸氫鈉及30 mL鹽水洗。在經無水硫酸鈉乾燥後，將該混合物濃縮並藉由急速層析術(30至100% EA於己烷中，接著0至10% MeOH於DCM中)純化以提供呈白色粉末之4.1 (2.15 g，45%產率)。針對C28 H33 N2 NaO10 P+ 計算之MS (ESI) m/z：611.1771，實測值：611.3412。
步驟 2 ：苯甲酸 (2R,3S,5R)-2-(1-( 二甲氧基磷醯基 ) 乙氧基 )-5-(5- 甲基 -2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 ) 四氫呋喃 -3- 基酯。 (4.2)
將1.90 g化合物4.1 溶解於2.0 mL無水甲苯中並將16.0 mL TFA添加至該溶液。然後將反應混合物加熱至45℃並攪拌5小時。如藉由UPLC證實反應完成後，該混合物用70 mL甲苯稀釋並在減壓下移除揮發物。然後將紫色/棕色殘餘物溶解於100 mL EA中並用100 mL碳酸氫鈉及100 mL鹽水洗。在經無水硫酸鈉乾燥後，在減壓下移除揮發物。然後所得棕色油藉由急速層析術純化以提供呈白色粉末之4.2 (1.15 g，76%產率)。針對C20 H25 N2 NaO9 P+ 計算之MS (ESI) m/z：491.1195，實測值：491.2625。
步驟 3 ：苯甲酸 (2R,3S,5R)-2-(1-( 羥基 ( 甲氧基 ) 磷醯基 ) 乙氧基 )-5-(5- 甲基 -2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 ) 四氫呋喃 -3- 基酯 (4.3)
將1.0 g化合物4.2 溶解於40 mL 3:2吡啶及水混合物中。將該反應混合物加熱至50℃並攪拌16小時。如藉由UPLC證實反應完成後，在減壓下移除揮發物且粗產物4.3 (1.14 g，定量)無需進一步純化即可用於下一步驟中。
步驟 4 ：苯甲酸 (2R,3R,5R)-2-(1-((((2R,3R,5R)-5-(6- 苯甲醯胺基 -9H- 嘌呤 -9- 基 )-2-(( 雙 (4- 甲氧基苯基 )( 苯基 ) 甲氧基 ) 甲基 ) 四氫呋喃 -3- 基 ) 氧基 )( 甲氧基 ) 磷醯基 ) 乙氧基 )-5-(5- 甲基 -2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 ) 四氫呋喃 -3- 基酯 (I-13) 。
將1.35 g4.3 及1.50 g 1-((2R,4R,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮溶解於27 mL無水吡啶中並冷卻至0℃。添加2.35 g均三甲苯-2-磺醯氯。然後在0℃下將混合物攪拌15 min。升溫至室溫後，向反應混合物添加1.20 mL 1-甲基咪唑。然後在室溫下將該反應混合物攪拌4小時。如藉由UPLC證實反應完成後，添加30 mL飽和碳酸氫鈉以淬滅該反應。在減壓下移除揮發物及所得黃色油藉由急速層析術(0至10% MeOH於EA中，具有0.1% TEA)純化以提供呈白色粉末之I-13 (1.03 g，46%產率)。針對C57 H57 N7 O14 P+ 計算之MS (ESI) m/z：1094.3701，實測值：1094.3352。
步驟 5 ： (1-(((2R,3R,5R)-3- 羥基 -5-(5- 甲基 -2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 ) 四氫呋喃 -2- 基 ) 氧基 ) 乙基 ) 膦酸 (2R,3R,5R)-5-(6- 苯甲醯胺基 -9H- 嘌呤 -9- 基 )-2-(( 雙 (4- 甲氧基苯基 )( 苯基 ) 甲氧基 ) 甲基 ) 四氫呋喃 -3- 基酯甲酯 (I-14) 。
將1.38 g碳酸鉀添加至20 mL MeOH並將所得漿體攪拌12小時。然後過濾該漿體以產生作為碳酸鉀溶液之澄清濾液。將680 mgI-13 溶解於45 mL無水MeOH中並添加5 mL預先製得之碳酸鉀溶液。在室溫下將該反應混合物攪拌1.5小時。如藉由UPLC證實反應完成後，將該反應混合物過濾，及濾液用1.5 mL 1M乙酸淬滅。在減壓下移除揮發物。然後粗產物藉由急速層析術(30至100% EA於己烷中，具有0.1% TEA，接著0至10% MeOH於DCM中)純化以提供呈白色泡沫之I-14 (310 mg，51%產率)。針對C50 H53 N7 O13 P+ 計算之MS (ESI) m/z：990.3439，實測值：990.5858。
步驟 6 ： (2R,3R,5R)-2-(1-((((2R,3R,5R)-5-(6- 苯甲醯胺基 -9H- 嘌呤 -9- 基 )-2-(( 雙 (4- 甲氧基苯基 )( 苯基 ) 甲氧基 ) 甲基 ) 四氫呋喃 -3- 基 ) 氧基 )( 甲氧基 ) 磷醯基 ) 乙氧基 )-5-(5- 甲基 -2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 ) 四氫呋喃 -3- 基 (2- 氰乙基 ) 二異丙基胺基亞磷酸酯 (I-15) 。 將300 mgI-14 溶解於4.0 mL無水DCM中。在室溫下攪拌10 min後，將150 μL 2-氰乙基N’,N’,N’,N’-四異丙基亞磷二醯胺酸酯添加至該反應混合物，接著添加42 mg 4,5-二氰基咪唑。在室溫下將所得澄清溶液攪拌3小時。如藉由UPLC證實反應完成後，該反應混合物用5 mL飽和碳酸氫鈉及5 mL鹽水洗。在經無水硫酸鈉乾燥後，在減壓下移除揮發物。然後白色油殘餘物藉由急速層析術(0至10% MeOH於DCM中，具有0.1% TEA)純化以提供呈白色粉末之I-15 (225 mg，74%產率)。31P-NMR (200MHz, DMSO-d6): 149.41, 148.96, 148.84, 148.74, 148.73, 148.66, 148.61, 148.53, 24.61, 24.58, 24.55, 24.52, 24.48, 24.46, 24.42, 24.37。針對C59 H70 N9 O14 P2 + 計算之MS (ESI) m/z：1190.4518，實測值：1190.4528。實例 6 ： (2R,3S,5R)-2-(((((2R,3R,5R)-5-(4- 苯甲醯胺基 -5- 甲基 -2- 側氧基嘧啶 -1(2H)- 基 )-2-(( 雙 (4- 甲氧基苯基 )( 苯基 ) 甲氧基 ) 甲基 ) 四氫呋喃 -3- 基 ) 氧基 )( 甲氧基 ) 磷醯基 ) 甲氧基 )-5-(6- 苯甲醯胺基 -9H- 嘌呤 -9- 基 ) 四氫呋喃 -3- 基 (2- 氰乙基 ) 二異丙基胺基亞磷酸酯 (I-18) 之合成
Figure 02_image313
步驟 1 ：乙酸 (2R,3S,5R)-5-(6- 苯甲醯胺基 -9H- 嘌呤 -9- 基 )-2-(( 羥基 ( 甲氧基 ) 磷醯基 ) 甲氧基 ) 四氫呋喃 -3- 基酯 (5.2)
將2.0 g化合物5.1 (乙酸(2R,3S,5R)-5-(6-苯甲醯胺基-9H-嘌呤-9-基)-2-((二甲氧基磷醯基)甲氧基)四氫呋喃-3-基酯)溶解於72 mL 5:4吡啶及水混合物中。將該反應混合物加熱至50℃並攪拌16小時。如藉由UPLC證實反應完成後，在減壓下移除揮發物且粗產物5.2 (2.26 g，定量)無需進一步純化即可用於下一步驟中。
步驟 2 ：苯甲酸 (2R,3R,5R)-2-(((((2R,3R,5R)-5-(6- 苯甲醯胺基 -9H- 嘌呤 -9- 基 )-2-(( 雙 (4- 甲氧基苯基 )( 苯基 ) 甲氧基 ) 甲基 ) 四氫呋喃 -3- 基 ) 氧基 )( 甲氧基 ) 磷醯基 ) 甲氧基 )-5-(5- 甲基 -2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 ) 四氫呋喃 -3- 基酯 (I-16) 。
將1.87 g5.2 及2.02 g N-(1-((2R,4R,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羥基四氫呋喃-2-基)-5-甲基-2-側氧基-1,2-二氫嘧啶-4-基)苯甲醯胺溶解於47.5 mL無水吡啶中並冷卻至0℃。添加3.44 g均三甲苯-2-磺醯氯。然後在0℃下將該混合物攪拌15 min。升溫至室溫後，向反應混合物添加1.6 mL 1-甲基咪唑。在室溫下將該反應混合物攪拌3小時。如藉由UPLC證實反應完成後，添加30 mL飽和碳酸氫鈉以淬滅該反應。在減壓下移除揮發物及所得黃色油藉由急速層析術(0至10% MeOH於EA中，具有0.1% TEA)純化以提供呈白色粉末之I-16 (1.72 g，46%產率)。針對C58 H58 N8 O14 P+ 計算之MS (ESI) m/z：1121.3810，實測值：1121.4519。
步驟 5 ： ((((2R,3S,5R)-5-(6- 苯甲醯胺基 -9H- 嘌呤 -9- 基 )-3- 羥基四氫呋喃 -2- 基 ) 氧基 ) 甲基 ) 膦酸 (2R,3R,5R)-5-(4- 苯甲醯胺基 -5- 甲基 -2- 側氧基嘧啶 -1(2H)- 基 )-2-(( 雙 (4- 甲氧基苯基 )( 苯基 ) 甲氧基 ) 甲基 ) 四氫呋喃 -3- 基酯甲酯 (I-17) 。
將1.38 g碳酸鉀添加至20 mL MeOH並將所得漿體攪拌12小時。然後過濾該漿體以產生作為碳酸鉀溶液之澄清濾液。將1.4 gI-16 溶解於100 mL無水MeOH中並添加4 mL預先製得之碳酸鉀溶液。在室溫下將該反應混合物攪拌20分鐘。如藉由UPLC證實反應完成後，將該反應混合物過濾，及濾液用1.5 mL 1M乙酸猝滅。在減壓下移除揮發物。然後粗產物藉由急速層析術(30至100% EA於己烷中，具有0.1% TEA，接著0至10% MeOH於DCM中)純化以提供呈白色泡沫之I-17 (0.85 g，63%產率)。針對C56 H56 N8 O13 P+ 計算之MS (ESI) m/z：1079.3705，實測值：1079.6301。
步驟 6 ： (2R,3S,5R)-2-(((((2R,3R,5R)-5-(4- 苯甲醯胺基 -5- 甲基 -2- 側氧基嘧啶 -1(2H)- 基 )-2-(( 雙 (4- 甲氧基苯基 )( 苯基 ) 甲氧基 ) 甲基 ) 四氫呋喃 -3- 基 ) 氧基 )( 甲氧基 ) 磷醯基 ) 甲氧基 )-5-(6- 苯甲醯胺基 -9H- 嘌呤 -9- 基 ) 四氫呋喃 -3- 基 (2- 氰乙基 ) 二異丙基胺基亞磷酸酯 (I-18) 。
將640 mgI-17 溶解於10.0 mL無水DCM中。在室溫下攪拌10 min後，將285 μL 2-氰乙基N’,N’,N’,N’-四異丙基亞磷二醯胺酸酯添加至該反應混合物，接著添加99 mg 4,5-二氰基咪唑。在室溫下將所得澄清溶液攪拌3小時。如藉由UPLC證實反應完成後，該反應混合物用5 mL飽和碳酸氫鈉及5 mL鹽水洗。在經無水硫酸鈉乾燥後，在減壓下移除揮發物。然後白色油殘餘物藉由急速層析術(0至10% MeOH於DCM中，具有0.1% TEA)純化以提供呈白色粉末之I-18 (420 mg，55%產率)。31P-NMR (200MHz, DMSO-d6): 149.59, 149.56, 149.47, 149.46, 23.83, 23.82, 23.38, 23.36。針對C65 H73 N10 O15 P2 + 計算之MS (ESI) m/z：1279.4783，實測值：1279.7819。實例 7 ：在 SGLT2 ASO 主鏈中用磷酸二酯鍵聯置換硫磷酸酯鍵聯之效應。
在圖1中，ASO係SGLT2基準ASO。ASO1、ASO2、ASO3、ASO4、ASO5、ASO6、ASO7、ASO8、ASO9、ASO10及ASO11表示基於基準ASO分別在核苷酸1與2、2與3、3與4、4與5、5與6、6與7、7與8、8與9、9與10、10與11、11與12 (自5’端至3’端計數)之間用核苷酸間磷酸二酯(PO)鍵聯置換核苷酸間硫磷酸酯(PS)鍵聯。
使用上文寡核苷酸以0.2 ml劑量體積皮下治療雌性CD-1 IGS小鼠(6至8週齡)。基於RNA重量，投與之劑量係1.3 mg/kg並調配於磷酸鹽緩衝鹽水中。5天後，藉由CO2 將動物安樂死，並藉由心臟穿刺放血。使用4 mm直徑一次性穿刺活檢收集腎樣本並使用RNAlater™溶液固定24 h。使用5 mm鋼珠將組織樣本均質於Trizol™試劑中，並使用MagMAX™系統根據製造商之推薦分離總RNA。自總RNA，利用標準工業方法來產生cDNA (單股合成)，且該cDNA用作TaqMan™定量即時PCR (qRT-PCR)之受質以定量偵測SGLT2 mRNA。使用標準ddCt方法計算相對SGLT2 mRNA，並將其標準化為Ppib mRNA作為參考基因。
圖1中之SGLT2 mRNA減弱結果證實，除核苷酸2與3 (ASO2)之間的位置外，在SGLT2 ASO分子中用PO鍵聯置換單一PS核苷酸間鍵聯在主鏈上之所有位置處均顯著減小效價。當在核苷酸1與2 (ASO1)、3與4 (ASO3)，及11與12 (ASO11)之間用PO置換PS時，活性降低係局部的。於任何其他位置，用PO置換PS消除活性。實例 8 ：在 SGLT2 ASO 主鏈中用 iMOP 置換硫磷酸酯鍵聯之效應。
在圖2中，ASO係SGLT2基準ASO。ASO12係實驗對照，其與該基準之唯一差異在於核苷酸11 (自5’端計數)之2’-修飾係2’-OMe而非2’-MOE。ASO13係測試物品，其中核苷酸10與11之間的鍵聯係iMOP (顯示於核酸I-3中)而非PS。ASO13之剩餘部分與ASO12相同。
使用上文寡核苷酸以0.2 ml劑量體積皮下治療雌性CD-1 IGS小鼠(6至8週齡)。基於RNA重量，投與之劑量係0.5或3 mg/kg，並調配於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中。5天後，藉由CO2 將動物安樂死，並藉由心臟穿刺放血。使用4 mm直徑一次性穿刺活檢收集腎樣本並使用RNAlater™溶液固定24 h。使用5 mm鋼珠將組織樣本均質於Trizol™試劑中，並使用MagMAX™系統根據製造商之推薦分離總RNA。自總RNA，利用標準工業方法來產生cDNA (單股合成)，且該cDNA用作TaqMan™定量即時PCR (qRT-PCR)之受質以定量偵測SGLT2 mRNA。使用標準ddCt方法計算相對SGLT2 mRNA，並將其標準化為Ppib mRNA作為為參考基因。
圖2證實相比於圖1中顯示之磷酸二酯置換，在SGLT2 ASO中用iMOP鍵聯置換PS鍵聯大體上維持活體內mRNA KD活性且ED50 為~0.5 mpk。2’-OMe實驗對照(ASO12)顯示與基準(ASO)相等之效價。所有三種寡核苷酸ASO、ASO12及ASO13均顯示劑量依賴性活性。實例 9 ：在 SGLT2 ASO 主鏈中用 iMOP 及 iMeMOP 置換硫磷酸酯鍵聯之效應。
在圖3中，ASO係SGLT2基準ASO。ASO14係PO對照，其中核苷酸10與11之間的鍵聯係磷酸二酯鍵聯且核苷酸11係2’-OMe。ASO12係PS對照，其中所有鍵聯均為PS且核苷酸11係2’-OMe。ASO13係iMOP測試物品，其中核苷酸10與11之間的鍵聯係iMOP (顯示於核酸I-3中)而非PS。ASO15係iMeMOP測試物品，其中核苷酸10與11之間的鍵聯係iMeMOP (顯示於核酸I-6中)而非PS。
將上文描述之測試物品溶解於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中並以0.5 mg/kg皮下注射至雌性CD-1小鼠內。在注射PBS或測試物品後7天獲得組織樣本。然後使用TissueLyser II (Qiagen, Valencia, CA)將組織樣本均質於QIAzol Lysis試劑中。然後使用MagMAX Technology根據製造商說明書(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)純化RNA。使用高容量cDNA逆轉錄套組(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)製備cDNA。使用小鼠特異性SGLT2引子(Integrated DNA Technology, Coralville, IA)在CFX384即時PCR偵測系統(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA)上進行PCR。
圖3中之結果證實如相較於完全PS基準ASO之活性，在SGLT2 ASO中用iMeMOP置換PS核苷酸間鍵聯完全維持mRNA KD活性。該基準ASO (ASO)及PS對照(ASO12)顯示相似減弱活性且ED50 為＜0.5 mpk。PO對照(ASO14)失去大部分減弱活性(ED50 ＞0.5 mpk)。iMOP (ASO13)維持一些減弱活性(ED50 ~0.5 mpk)，其類似於圖2中顯示之結果。實例 10 ：於 GalXC 分子中之反義股之 5’ 端之 iMOP 鍵聯之效應。
在圖4中，GalXC1係於反義股之5’端之核苷酸1與2之間具有PS鍵聯中之一者之對照GalXC分子。GalXC2係用iMOP鍵聯置換反義股之5’端PS鍵聯之GalXC分子。該分子之剩餘部分與對照相同。
將測試核酸溶解於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中並以0.5 mg/kg皮下注射至雌性CD-1小鼠內。在注射PBS或測試核酸後7天獲得組織樣本。然後使用TissueLyser II (Qiagen, Valencia, CA)將組織樣本均質於QIAzol Lysis試劑中。然後使用MagMAX Technology根據製造商說明書(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)純化RNA。使用高容量cDNA逆轉錄套組(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)以製備cDNA。使用小鼠特異性ALDH2引子(Integrated DNA Technology, Coralville, IA)在CFX384即時PCR偵測系統(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA)上進行PCR。
圖4中之結果證實用衍生自於GalXC分子中之反義股之5’端之核酸I-9之GalXC2中之4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯置換GalXC1中之PS核苷酸間鍵聯維持活體內mRNA KD活性。實例 11 ：在 SGLT2 ASO 主鏈之 GAP 2 位置上用 iMOP 置換硫磷酸酯鍵聯。
在圖5中，ASO係SGLT2基準ASO。ASO4係實驗PO對照，其與該基準之唯一差異在於核苷酸4與5 (自5’端計數)之間的鍵聯係核苷酸間磷酸二酯(PO)而非硫磷酸酯(PS)鍵聯。ASO18係測試物品，其中核苷酸4與5之間的鍵聯係iMOP (顯示於核酸I-12中)而非PS。ASO19係iMeMOP測試物品，其中核苷酸4與5之間的鍵聯係iMeMOP (顯示於核酸I-15中)而非PS。
將上文描述之測試物品溶解於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中並以0.5 mg/kg皮下注射至雌性CD-1小鼠內。在注射PBS或測試物品後5天獲得組織樣本。(除測試物品ASO*組外，其等樣本在另一實驗中在注射後7天獲得)。然後使用TissueLyser II (Qiagen, Valencia, CA)將組織樣本均質於QIAzol Lysis試劑中。然後使用MagMAX Technology根據製造商說明書(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)純化RNA。使用高容量cDNA逆轉錄套組(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)以製備cDNA。使用小鼠特異性SGLT2引子(Integrated DNA Technology, Coralville, IA)在CFX384即時PCR偵測系統(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA)上進行PCR。
圖5中之結果證實如相較於完全PS基準ASO之活性，在SGLT2 ASO中用iMOP (ASO18)或iMeMOP (ASO19)置換PS核苷酸間鍵聯大體上維持活體內mRNA KD活性。兩種ASO之ED50 均為~0.5 mpk。該基準ASO (ASO)顯示減弱活性且ED50 為＜0.5 mpk。PO對照(ASO4)失去大部分減弱活性(ED50 ＞0.5 mpk)。實例 12 ：去汙溶酶體穩定性
為評定具有活體外核苷酸間修飾之化合物之代謝穩定性，在大鼠肝去汙溶酶體(酸性磷酸酶活性) (Sekisui Xenotech, Kansas City, KS)中在38℃下培養~ 4 µM測試化合物及其等相應之對照化合物。該等大鼠肝去汙溶酶體係來自已用Triton WR 1339 (亦稱為泰洛沙泊(Tyloxapol))處理之大鼠肝細胞之溶酶體。培養之測試化合物及其等個別對照化合物係在不同預定時間點下自培養去汙溶酶體收集並接著使用96孔/100 mg CLARITY® OTX™匣SPE盤(Phenomenex, Torrance, CA)及96孔盤真空歧管根據製造商之說明書自溶酶體基質提取。溶析液使用TURBOVAP® (Biotage, Charlotte, NC)溶劑蒸發裝置蒸發並重溶於水中及經由LC-MS分析。
使用ACQUITY UPLC®儀器(Waters公司，Milford, MA)以0.4 mL/min遞送含有緩衝添加劑之流動相，及層析分離使用ACQUITY UPLC®寡核苷酸BEH C18管柱1.7 µm粒度逆相超高效液相層析術(2.1 x 50 mm)管柱(Waters公司，Milford, MA)進行。將管柱溫度維持在70℃且樣本注射體積為8 µL。使用在負離子模式及電噴霧電離(ESI)條件下操作之SYNAPT® G2S高解析度飛行時間質譜儀(HRMS, Waters公司，Milford, MA)以偵測對照、測試化合物，及其代謝物。零電荷狀態分子離子質量經由電荷狀態反捲積使用PROMASS DECONVOLUTION™軟體(Novatia, Newtown, PA)獲得。藉由比較實驗測定之質量及預期之理論分子量識別對照、測試化合物，及其代謝物。
為評定iMOP鍵聯在GalXC分子情境下之代謝穩定性，在上文描述之去汙溶酶體分析中測試圖4中顯示之兩種化合物。GalXC1係於反義股之5’端之核苷酸1與2之間具有PS鍵聯之GalXC分子。GalXC2係用iMOP鍵聯置換該反義股之5’端PS鍵聯之GalXC分子。
在24小時培養週期內，在測試核酸之iMOP鍵聯上未觀測到裂解產物。表2中之資料表明如相較於具有PS鍵聯之對照反義股，含有iMOP核苷酸間鍵聯之反義股顯示經改善之整體代謝穩定性。自該等反義股之3’端觀測到主要代謝物(資料未顯示)。 表2：用大鼠去汙溶酶體培養後殘餘之全長反義股百分比
測試物品 0 h 1 h 2 h 4 h 8 h 24 h
GalXC1 100 102 104 85 56 25
GalXC2 100 88 86 82 73 49
為評定iMOP及iMeMOP鍵聯在ASO平臺情境下之代謝穩定性，在上文描述之去汙溶酶體分析中測試圖3中顯示之測試物品。如表3中顯示，如相較於親代對照及2’OMe PS對照，具有iMOP或iMeMOP鍵聯之測試物品顯示相似之代謝穩定性。核苷酸10與11之間的鍵聯係磷酸二酯鍵聯(ASO14)之PO對照顯示最低穩定性。圖6以圖表形式顯示表3之結果。 表3：用大鼠去汙溶酶體培養後殘餘之全長反義股百分比
測試物品 0 h 1 h 2 h 4 h 8 h 24 h 48 h
ASO 100 94 88 78 72 59 23
ASO12 100 80 83 76 68 44 25
ASO13 100 86 79 71 55 33 41
ASO14 100 77 70 56 33 25 6
ASO15 100 90 85 79 69 28 20
實例 13 ： iMOP 及 iMeMOP 修飾對雙螺旋穩定性之效應
SGLT2 ASO及RNA1 (經設計以完全沃森-克裡克互補性結合至SGLT2 ASO之12mer RNA)之雙螺旋形成及融化係藉由紫外線(UV)光譜並在配備帕耳帖溫度控制器之Agilent Cary 3500 UV-VIS 分光光度計上監測。雙螺旋濃度為2 μM (4 μM總濃度之股)於PBS (磷酸鹽緩衝鹽水) (1X, pH 7.4)中。加熱至90℃後，將樣本緩慢冷卻至室溫並冷藏整夜。然後將樣本轉移至分光光度計之冷光析管內且一經以0.5℃/min之速率自5℃加熱至90℃，即監測260 nm下之吸光度之變化。當低於20℃時，將樣本保持在流動氮下，且每隔30秒記錄吸光度值。使用基線法計算Tm值並顯示於圖7中。
ASO係完全硫磷酸化SGLT2基準ASO。ASO14係該基準之PO對照且在核苷酸10與11之間具有磷酸二酯鍵聯。ASO13係iMOP測試物品，其中核苷酸10與11之間的鍵聯係iMOP而非PS。ASO15係iMeMOP測試物品，其中核苷酸10與11之間的鍵聯係iMeMOP而非PS。結果指示當結合至互補RNA1時，ASO14顯示最高熱穩定性。結果亦指示用新穎iMeMOP或iMOP修飾置換PS核苷酸間鍵聯維持ASO:RNA雙螺旋熱穩定性，而併入iMeMOP在-1℃下輕微失穩(參見圖6中之ASO15:RNA1)，併入iMOP在+1.5℃下穩定(參見圖7中之ASO13:RNA1)。實例 14 ： iMOP 及 iMeMOP 修飾對 RNase H 活性之效應
已知RNase H酶消化ASO:RNA雜合體之RNA部分，而ASO股仍未受影響。當合併至ASO時，為監測核苷酸間鍵聯修飾在誘發RNase H活性中之效用，使經iMOP及iMeMOP修飾之ASO與互補RNA雜合並測試其等對由人類RNase H裂解之敏感性。裂解反應係使用高解析度LC-MS方法而非經典電泳方法監測。分析產生之RNA片段之質量峰可確定RNA上之精確裂解位點，而在LC光譜上定量對應於RNA片段及/或殘餘之全長RNA之峰面積容許比較由不同ASO誘導之裂解反應動力學(圖8)。
設計長32個核苷酸之RNA股(RNA2)，其含有與SGLT2 12mer ASO完全互補之12個核苷酸片段。將各ASO退火至互補體RNA提供雙螺旋受質(ASO15:RNA2、ASO13:RNA2及ASO:RNA2)。ASO係SGLT2基準ASO，其中所有鍵聯均為PS。ASO13係iMOP測試物品，其中核苷酸10與11之間的鍵聯係iMOP而非PS。ASO15係iMeMOP測試物品，其中核苷酸10與11之間的鍵聯係iMeMOP而非PS。
一般而言，將2 nmol各反義寡核苷酸與1 nmol RNA混合於1X RNase H反應緩衝劑(50 mM Tris-HCl、75 mM KCl、3 mM MgCl2 及10 mM DTT，在pH 8.3下)中。在90℃下將樣本加熱5分鐘並緩慢冷卻至室溫以容許形成雙螺旋受質。各退火溶液均由相對於RNA 2倍過量之AON製成，以確保所有RNA與ASO雜合且游離RNA不存在於溶液中。接著，將100 µL等分試樣轉移至玻璃總回收MS小瓶內並在LC-MS樣本保持器中在20℃ (分析溫度)下保持1分鐘。選擇之分析溫度遠低於ASO:RNA雜合體之熱熔化溫度以進一步確保所有RNA均與ASO雜合。培養1分鐘後，在Waters Synapt高解析度LC-MS上分析ASO:RNA雙螺旋受質，針對0時間點產生光譜。
然後藉由在1X RNase H緩衝劑中添加2 µL 0.25 U新鮮稀釋之大腸桿菌RNase H酶引發RNA裂解反應。在冰上處理酶以避免任何活性損失。藉由移液輕輕混合該混合物並在LC-MS上在添加酶後30 sec、15 min、30 min及45 min時間點下監測RNA裂解。用於此等分析之0.25 U最佳RNase H濃度選自一系列初步酶稀釋物(10 U、5 U、1 U、0.5 U及0.25 U)。在0.25 U下，RNA之消化係緩慢的，如圖8中顯示，容許計算及比較裂解速率。在各時間點下，通過在該時間點下定量對應於殘餘之全長RNA之LC峰面積，計算轉化為裂解產物之RNA之分數。如圖8中顯示，結果指示在SGLT2 ASO序列中用iMeMOP或iMOP置換PS核苷酸間鍵聯以堪比SGLT2基準之裂解速率之裂解速率完全維持RNase H活性。
儘管本文已描述本發明之許多實施例，但顯而易見可改變本文提供之基本實例以提供利用本發明之核酸或其類似物及方法之其他實施例。因此，應知曉本發明之範圍由本說明書及隨附申請專利範圍定義，而非由已藉助於實例表示之特定實施例定義。
圖1包括於基準SGLT2 ASO用核苷酸間磷酸二酯(PO)鍵聯置換核苷酸間硫磷酸酯(PS)鍵聯之結果，該結果顯示相較於PBS剩餘之%SGLT2 (y軸)及PBS、基準SGLT2 ASO (ASO)，及分別自5’端至3’端計數，在核苷酸1與2 (ASO1)之間、2與3 (ASO2)之間、3與4 (ASO3)之間、4與5 (ASO4)之間、5與6 (ASO5)之間、6與7 (ASO6)之間、7與8 (ASO7)之間、8與9 (ASO8)之間、9與10 (ASO9)之間、10與11 (ASO10)，及11與12 (ASO11)之間置換的寡核苷酸(x軸)。
圖2包括如藉由在0.5及3.0毫克每公斤體重(mpk)之單劑量後5天，小鼠腎中之SGLT2 mRNA減弱(KD)量測，PBS、SGLT2基準ASO (ASO)、ASO12及ASO13 (x軸)之在活體內ASO主鏈上用核苷酸間4’-O-亞甲基膦酸酯(iMOP)鍵聯置換核苷酸間硫磷酸酯(PS)鍵聯之結果(%表現[Slc5a2/Ppib] + SEM))(y軸)。ASO12係與基準之不同僅在於核苷酸11 (自5’端計數)之2’-修飾為2’-OMe而非2’-MOE之實驗對照。ASO13係測試物品，其中核苷酸10與11之間的鍵聯為iMOP (顯示於核酸I-3中)而非PS。ASO12之剩餘部分與ASO13相同。
圖3包括如藉由在0.5毫克每公斤體重(mpk)之單劑量後7天，小鼠腎中之SGLT2 mRNA減弱(KD)量測，在活體內ASO主鏈上用核苷酸間4’-O-亞甲基膦酸酯(iMOP)鍵聯或核苷酸間4’-O-甲基亞甲基膦酸酯(iMeMOP)鍵聯置換PS鍵聯之效應之結果，該等結果顯示(相對於PBS剩餘之% SGLT2 mRNA)(y軸)，及ASO14、SGLT2基準ASO (ASO)、ASO12、ASO13及ASO15 (x軸)。ASO14係PO對照，其中核苷酸10與11之間的鍵聯係磷酸二酯鍵聯且核苷酸11係2’-OMe。ASO12係PS對照，其中所有鍵聯均為PS且核苷酸11係2’-OMe。ASO13係iMOP測試物品，其中核苷酸10與11之間的鍵聯係iMOP而非PS。ASO15係iMeMOP測試物品，其中核苷酸10與11之間的鍵聯係iMeMOP (顯示於核酸I-6中)而非PS。
圖4包括如藉由在1.0 mpk之單劑量後4天，小鼠肝中之靶基因mRNA減弱量測，於GalXC分子中之反義股之5’端之iMOP鍵聯之結果，該等結果顯示(相對於PBS剩餘之% Aldh2 mRNA)(y軸)及PBS、GalXC1及GalXC2 (x軸)。GalXC1係於該反義股之5’端之核苷酸1與2之間具有PS鍵聯之對照GalXC分子。GalXC2係用iMOP鍵聯置換該反義股之5’端PS鍵聯之GalXC分子。該等GalXC分子之剩餘部分與該對照相同。
圖5揭示在活體內ASO主鏈之GAP2位置上用iMOP鍵聯或iMeMOP鍵聯置換PS鍵聯之效應。
圖6繪示如實例8之表3中描述，基準ASO (A)、ASO12(b)、ASO13 (C)、ASO14 (D)及ASO15 (E)之基於HRMS之活體外去汙溶酶體(tritosomal)穩定性分析之結果，該等結果顯示剩餘百分比(%)(y軸)相對於去汙溶酶體培養時間(小時)(x軸)。
圖7包括針對基準ASO:RNA1、ASO12:RNA1、ASO13:RNA1、ASO15:RNA1及ASO14:RNA1，將iMeMOP及iMOP併入ASO:RNA雙螺旋之ASO股內之熱穩定性結果，該等結果顯示標準化吸光度(y軸)相對於溫度(℃)(x軸)。
圖8包括針對基準ASO:RNA2、ASO15:RNA2及ASO13:RNA2，將iMeMOP及iMOP併入ASO:RNA雜合體之ASO股內之RNase H活性結果，該等結果顯示剩餘RNA之百分比(%)(y軸)相對於時間(min)(x軸)。
Figure 110101591-A0101-11-0001-1

Claims (34)

  1. 一種核酸或其類似物，其包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I表示：
    Figure 03_image315
    I 或其醫藥上可接受之鹽，其中： B係核鹼基或氫； R1 及R2 獨立地係氫、鹵素、R5 、-CN、-S(O)R、-S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ，或： 相同碳上之R1 及R2 連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之3至7員飽和或部分不飽和環； 各R獨立地係氫、合適之保護基，或視需要經取代之選自以下之基團：C1-6 脂族、苯基，具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環，或： 相同原子上之兩個R基團連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧、矽及硫之雜原子之4至7員飽和、部分不飽和或雜芳基環； R3 係氫、合適之保護基、合適之前藥，或視需要經取代之選自以下之基團：C1-6 脂族、苯基，具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環； 各R4 獨立地係氫、合適之前藥、R5 、鹵素、-CN、-NO2 、-OR、-SR、-NR2 、-S(O)2 R、-S(O)2 NR2 、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2 、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2 、-OP(O)R2 、-OP(O)(OR)2 、-OP(O)(OR)NR2 、-OP(O)(NR2 )2 -、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2 、-N(R)S(O)2 R、-N(R)P(O)R2 、-N(R)P(O)(OR)2 、-N(R)P(O)(OR)NR2 、-N(R)P(O)(NR2 )2 、-N(R)S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ； 各R5 獨立地係視需要經取代之選自以下之基團：C1-6 脂族、苯基，具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環； X1 係O、S或NR； X2 係-O-、-S-、-B(H)2 -或共價鍵； X3 係-O-、-S-、-Se-或-N(R)-； Y1 係結合至核苷、核苷酸或寡核苷酸之2′或3′端之連接基； Y2 係氫、保護基、胺基亞磷酸酯(phosphoramidite)類似物，連結至核苷、核苷酸或寡核苷酸之4′或5′端之核苷酸間連接基，或連結至撐體之連接基； Z係-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2 -；及 n係0、1、2、3、4或5。
  2. 如請求項1之核酸或其類似物，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯係選自代表式中之任一者：
    Figure 03_image317
    、
    Figure 03_image319
    、
    Figure 03_image321
    、         I-a-1 I-b-1 I-g-1
    Figure 03_image323
    、
    Figure 03_image325
    、
    Figure 03_image327
    、         I-h-1 I-i-1 I-n-1
    Figure 03_image329
    、
    Figure 03_image331
    、
    Figure 03_image333
    、         I-o-1 I-p-1 I-q-1
    或其醫藥上可接受之鹽，其中： Y3 係連結至核苷、核苷酸或寡核苷酸之2′或3′端之連接基；及 Y4 係氫、保護基、胺基亞磷酸酯類似物、連結至核苷、核苷酸或寡核苷酸之4′-或5′端之核苷酸間連接基，或連結至撐體之連接基。
  3. 如請求項1或請求項2之核酸或其類似物，其中該核酸或其類似物係選自下式中之任一者：
    Figure 03_image335
    、
    Figure 03_image337
    、
    Figure 03_image339
    、         I-a-2 I-a-3 I-a-4
    Figure 03_image341
    、
    Figure 03_image343
    、
    Figure 03_image345
    、         I-a-5 I-c-1 I-d-1
    Figure 03_image347
    、
    Figure 03_image349
    、
    Figure 03_image351
    、         I-e-1 I-f-1 I-j-1
    Figure 03_image353
    、
    Figure 03_image355
    、
    Figure 03_image357
    、         I-k-1 I-l-1 I-m-1
    或其醫藥上可接受之鹽。
  4. 如請求項1至3中任一項之核酸或其類似物，其中R1 係氫及R2 係氫或甲基。
  5. 如請求項1至4中任一項之核酸或其類似物，其中各R4 獨立地係氫、羥基、氟、甲氧基或
    Figure 03_image359
    。
  6. 如請求項1至5中任一項之核酸或其類似物，其中各B係選自
    Figure 03_image361
    、
    Figure 03_image363
    、
    Figure 03_image365
    、
    Figure 03_image367
    、
    Figure 03_image369
    及
    Figure 03_image371
    。
  7. 如請求項1至6中任一項之核酸或其類似物，其中該核酸或其類似物係選自表1中繪示之任一者，或其醫藥上可接受之鹽。
  8. 如請求項1之核酸或其類似物，其中該核酸或其類似物係包含第一股及第二股之雙股RNAi抑制劑分子，其中該第一股係正義股及該第二股係反義股。
  9. 如請求項8之核酸或其類似物，其中該雙股RNAi抑制劑分子包含在該正義股與該反義股之間具有15至45個核苷酸之互補區。
  10. 如請求項9之核酸或其類似物，其中在該正義股與該反義股之間的互補區係20至30個核苷酸。
  11. 如請求項10之核酸或其類似物，其中在該正義股與該反義股之間的互補區係21至26個核苷酸。
  12. 如請求項9之核酸或其類似物，其中在該正義股與該反義股之間的互補區係19至24個核苷酸。
  13. 如請求項12之核酸或其類似物，其中在該正義股與該反義股之間的互補區係19至21個核苷酸。
  14. 如請求項8之核酸或其類似物，其中該雙股RNAi抑制劑分子含有四環。
  15. 如請求項1之核酸或其類似物，其中該核酸或其類似物係單股核酸。
  16. 如請求項15之核酸或其類似物，其中該單股核酸係單股RNAi抑制劑分子。
  17. 如請求項15之核酸或其類似物，其中該單股核酸係習知反義核酸、核糖核酸酵素或適體。
  18. 如請求項16或請求項17之核酸或其類似物，其中該單股RNAi抑制劑分子長度係14至50個核苷酸。
  19. 如請求項18之核酸或其類似物，其中該單股RNAi抑制劑分子係約16至30、18至22、或20至22個核苷酸長度。
  20. 如請求項1之核酸或其類似物，其中該核酸或其類似物係裸核酸。
  21. 如請求項1之核酸或其類似物，其進一步包含至少一種遞送劑，其中該至少一種遞送劑係結合至該核酸或其類似物以促進該核酸或其類似物運輸跨越細胞之外膜。
  22. 如請求項1之核酸或其類似物，其中該遞送劑係選自由醣、肽、脂質、維生素及抗體組成之群。
  23. 如請求項1之核酸或其類似物，其中該遞送劑係選自N-乙醯半乳胺糖(GalNAc)、甘露糖-6-磷酸酯、半乳糖、寡醣、多醣、膽固醇、聚乙二醇、葉酸鹽、維生素A、維生素E、石膽酸及陽離子脂質。
  24. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1之核酸或其類似物，及醫藥上可接受之載劑、佐劑或媒劑。
  25. 一種減少靶基因在有需要個體中表現之方法，其包括向該個體投與足以減少該靶基因表現之量之如請求項24之醫藥組合物。
  26. 一種治療有需要個體之癌症、病毒感染或遺傳疾患之方法，其包括向該個體投與足以治療該癌症、病毒感染或遺傳疾患之量之如請求項24之醫藥組合物。
  27. 如請求項24或請求項25之方法，其中該投與包含全身投與。
  28. 一種製備包含4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯之核酸或其類似物之方法，其中該4′-O-亞甲基膦酸酯核苷酸間鍵聯由式I-c表示：
    Figure 03_image373
    I-c 或其醫藥上可接受之鹽，該方法包括以下步驟： (a)    提供式A4之核酸或其類似物：
    Figure 03_image375
    A4 或其醫藥上可接受之鹽，及 (b)    縮合式A4之核酸或其類似物與式A5之核苷或其類似物：
    Figure 03_image377
    A5 以形成包含式I-b之核酸或其類似物，其中： 各B係核鹼基或氫； PG係合適之羥基保護基； R1 及R2 獨立地係氫、鹵素、R5 、-CN、-S(O)R、-S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ，或： 相同碳上之R1 及R2 連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之3至7員飽和或部分不飽和環； 各R獨立地係氫、合適之保護基，或視需要經取代之選自以下之基團：C1-6 脂族、苯基，具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環，或： 相同原子上之兩個R基團連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧、矽及硫之雜原子之4至7員飽和、部分不飽和或雜芳基環； R3 係氫、合適之保護基、合適之前藥，或視需要經取代之選自以下之基團：C1-6 脂族、苯基，具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環； 各R4 獨立地係氫、合適之前藥、R5 、鹵素、-CN、-NO2 、-OR、-SR、-NR2 、-S(O)2 R、-S(O)2 NR2 、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2 、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2 、-OP(O)R2 、-OP(O)(OR)2 、-OP(O)(OR)NR2 、-OP(O)(NR2 )2 -、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2 、-N(R)S(O)2 R、-N(R)P(O)R2 、-N(R)P(O)(OR)2 、-N(R)P(O)(OR)NR2 、-N(R)P(O)(NR2 )2 、-N(R)S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ； 各R5 獨立地係視需要經取代之選自以下之基團：C1-6 脂族、苯基，具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環； X1 係O、S或NR； 各X2 獨立地係-O-、-S-、-B(H)2 -或共價鍵； X3 係-O-、-S-、-Se-或-N(R)-； Y2 係氫、保護基、亞磷醯胺類似物，連結至核苷、核苷酸或寡核苷酸之4′或5′端之核苷酸間連接基，或連結至撐體之連接基； 各Z獨立地係-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2 -；及 各n獨立地係0、1、2、3、4或5。
  29. 如請求項27之方法，其中Y2 係保護基。
  30. 如請求項29之方法，其進一步包括製備式I-d之核酸之步驟：
    Figure 03_image379
    I-d 或其醫藥上可接受之鹽，該方法包括以下步驟： (a)    提供包含式I-c之核酸或其類似物：
    Figure 03_image381
    I-c 或其醫藥上可接受之鹽，及 (b)    將包含式I-c之核酸或其類似物去保護以形成包含式I-d之核酸或其類似物，其中： 各B係核鹼基或氫； PG係合適之羥基保護基； PG1 係保護基； R1 及R2 獨立地係氫、鹵素、R5 、-CN、-S(O)R、-S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ，或： 相同碳上之R1 及R2 連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之3至7員飽和或部分不飽和環； 各R獨立地係氫、合適之保護基，或視需要經取代之選自以下之基團：C1-6 脂族、苯基，具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環，或： 相同原子上之兩個R基團連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧、矽及硫之雜原子之4至7員飽和、部分不飽和或雜芳基環； R3 係氫、合適之保護基、合適之前藥，或視需要經取代之選自以下之基團：C1-6 脂族、苯基，具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環； 各R4 獨立地係氫、合適之前藥、R5 、鹵素、-CN、-NO2 、-OR、-SR、-NR2 、-S(O)2 R、-S(O)2 NR2 、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2 、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2 、-OP(O)R2 、-OP(O)(OR)2 、-OP(O)(OR)NR2 、-OP(O)(NR2 )2 -、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2 、-N(R)S(O)2 R、-N(R)P(O)R2 、-N(R)P(O)(OR)2 、-N(R)P(O)(OR)NR2 、-N(R)P(O)(NR2 )2 、-N(R)S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ； 各R5 獨立地係視需要經取代之選自以下之基團：C1-6 脂族、苯基，具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環； X1 係O、S或NR； 各X2 獨立地係-O-、-S-、-B(H)2 -或共價鍵； X3 係-O-、-S-、-Se-或-N(R)-； 各Z獨立地係-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2 -；及 各n獨立地係0、1、2、3、4或5。
  31. 如請求項30之方法，其進一步包括製備式I-e之核酸或其類似物之步驟：
    Figure 03_image383
    I-e 或其醫藥上可接受之鹽，該方法包括以下步驟： (a)    提供式I-d之核酸或其類似物：
    Figure 03_image385
    I-d (b)    使式I-d之核酸或其類似物與P(III)形成試劑反應以形成式I-e之核酸或其類似物，其中： 各B係核鹼基或氫； PG係合適之羥基保護基； R1 及R2 獨立地係氫、鹵素、R5 、-CN、-S(O)R、-S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ，或： 相同碳上之R1 及R2 連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之3至7員飽和或部分不飽和環； 各R獨立地係氫、合適之保護基，或視需要經取代之選自以下之基團：C1-6 脂族、苯基，具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環，或： 相同原子上之兩個R基團連同其等中間原子一起形成具有0至3個獨立地選自氮、氧、矽及硫之雜原子之4至7員飽和、部分不飽和或雜芳基環； R3 係氫、合適之保護基、合適之前藥，或視需要經取代之選自以下之基團：C1-6 脂族、苯基，具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環； 各R4 獨立地係氫、合適之前藥、R5 、鹵素、-CN、-NO2 、-OR、-SR、-NR2 、-S(O)2 R、-S(O)2 NR2 、-S(O)R、-C(O)R、-C(O)OR、-C(O)NR2 、-C(O)N(R)OR、-OC(O)R、-OC(O)NR2 、-OP(O)R2 、-OP(O)(OR)2 、-OP(O)(OR)NR2 、-OP(O)(NR2 )2 -、-N(R)C(O)OR、-N(R)C(O)R、-N(R)C(O)NR2 、-N(R)S(O)2 R、-N(R)P(O)R2 、-N(R)P(O)(OR)2 、-N(R)P(O)(OR)NR2 、-N(R)P(O)(NR2 )2 、-N(R)S(O)2 R、-Si(OR)2 R、-Si(OR)R2 或-SiR3 ； 各R5 獨立地係視需要經取代之選自以下之基團：C1-6 脂族、苯基，具有1至2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之4至7員飽和或部分不飽和雜環，及具有1至4個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5至6員雜芳基環； E係鹵素或-NR2 ； X1 係O、S或NR； 各X2 獨立地係-O-、-S-、-B(H)2 -或共價鍵； X3 係-O-、-S-、-Se-或-N(R)-； 各Z獨立地係-O-、-S-、-N(R)-或-C(R)2 -；及 各n獨立地係0、1、2、3、4或5。
  32. 如請求項28至31中任一項之方法，其中各R1 係氫及R2 係氫或甲基。
  33. 如請求項28至32中任一項之方法，其中各R4 獨立地係氫、羥基、氟、甲氧基或
    Figure 03_image387
    。
  34. 如請求項28至33中任一項之方法，其中各B係選自
    Figure 03_image388
    、
    Figure 03_image390
    、
    Figure 03_image392
    、
    Figure 03_image394
    、
    Figure 03_image396
    及
    Figure 03_image398
    。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4201947A1 (en) * 2021-12-22 2023-06-28 F. Hoffmann-La Roche AG Process for the backbone deprotection of oligonucleotides containing a terminal alkyl phosphonate group
CN116003494A (zh) * 2022-01-05 2023-04-25 大睿生物医药科技(上海)有限公司 具有核苷酸类似物的双链rna
AU2023254798A1 (en) * 2022-04-15 2024-09-19 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating scap activity

Family Cites Families (82)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
EP0406309A4 (en) 1988-03-25 1992-08-19 The University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5194599A (en) 1988-09-23 1993-03-16 Gilead Sciences, Inc. Hydrogen phosphonodithioate compositions
US5721218A (en) 1989-10-23 1998-02-24 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides with inverted polarity
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
PT98562B (pt) 1990-08-03 1999-01-29 Sanofi Sa Processo para a preparacao de composicoes que compreendem sequencias de nucleo-sidos com cerca de 6 a cerca de 200 bases resistentes a nucleases
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
EP0549686A4 (en) 1990-09-20 1995-01-18 Gilead Sciences Inc Modified internucleoside linkages
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
US5672697A (en) 1991-02-08 1997-09-30 Gilead Sciences, Inc. Nucleoside 5'-methylene phosphonates
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
US5792608A (en) 1991-12-12 1998-08-11 Gilead Sciences, Inc. Nuclease stable and binding competent oligomers and methods for their use
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
CA2159629A1 (en) 1993-03-31 1994-10-13 Sanofi Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5646269A (en) 1994-04-28 1997-07-08 Gilead Sciences, Inc. Method for oligonucleotide analog synthesis
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US6218108B1 (en) 1997-05-16 2001-04-17 Research Corporation Technologies, Inc. Nucleoside analogs with polycyclic aromatic groups attached, methods of synthesis and uses therefor
JP4656675B2 (ja) 1997-05-14 2011-03-23 ユニバーシティー オブ ブリティッシュ コロンビア 脂質小胞への荷電した治療剤の高率封入
US6242591B1 (en) 1997-10-15 2001-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of sulfurized 2'-substituted oligonucleotides
JP2002500201A (ja) 1998-01-05 2002-01-08 ユニバーシティ オブ ワシントン 膜破壊剤を使用する増強された輸送
WO2001051092A2 (en) 2000-01-07 2001-07-19 University Of Washington Enhanced transport of agents using membrane disruptive agents
ES2253398T3 (es) 2000-06-30 2006-06-01 Inex Pharmaceuticals Corp. Camptotecinas liposomales mejoradas y sus usos.
WO2003040395A2 (en) 2001-11-07 2003-05-15 Applera Corporation Universal nucleotides for nucleic acid analysis
JP4731324B2 (ja) 2003-08-28 2011-07-20 武 今西 Ｎ−ｏ結合性架橋構造型新規人工核酸
DE602005018043D1 (de) 2004-05-17 2010-01-14 Tekmira Pharmaceuticals Corp Liposomale formulierungen mit dihydrosphingomyelin und verfahren zu ihrer verwendung
US20080213891A1 (en) 2004-07-21 2008-09-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. RNAi Agents Comprising Universal Nucleobases
US20090018097A1 (en) 2005-09-02 2009-01-15 Mdrna, Inc Modification of double-stranded ribonucleic acid molecules
WO2007109584A1 (en) 2006-03-16 2007-09-27 University Of Washington Temperature-and ph-responsive polymer compositions
JP5274461B2 (ja) 2006-08-18 2013-08-28 アローヘッド リサーチ コーポレイション ポリヌクレオチドのインビボ送達のためのポリ結合体
WO2009140423A2 (en) 2008-05-13 2009-11-19 University Of Washington Targeted polymer bioconjugates
CN102066444A (zh) 2008-05-13 2011-05-18 华盛顿大学 胶束装配体
AU2009246321A1 (en) 2008-05-13 2009-11-19 Phaserx, Inc. Polymeric carrier
WO2009140427A2 (en) 2008-05-13 2009-11-19 University Of Washington Diblock copolymers and polynucleotide complexes thereof for delivery into cells
WO2009140432A2 (en) 2008-05-13 2009-11-19 University Of Washington Micelles for intracellular delivery of therapeutic agents
CA2734917A1 (en) 2008-08-22 2010-02-25 University Of Washington Heterogeneous polymeric micelles for intracellular delivery
ES2708944T3 (es) 2008-09-22 2019-04-12 Dicerna Pharmaceuticals Inc Composiciones y métodos para la inhibición específica de la expresión de genes por DSRNA que tenga modificaciones
KR20110095292A (ko) 2008-11-06 2011-08-24 유니버시티 오브 워싱톤 다중블록 공중합체
US20110281934A1 (en) 2008-11-06 2011-11-17 Phaserx, Inc. Micelles of hydrophilically shielded membrane-destabilizing copolymers
US8513207B2 (en) 2008-12-18 2013-08-20 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Extended dicer substrate agents and methods for the specific inhibition of gene expression
WO2010093788A2 (en) 2009-02-11 2010-08-19 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Multiplex dicer substrate rna interference molecules having joining sequences
KR20230098713A (ko) 2009-06-10 2023-07-04 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 향상된 지질 조성물
MX342609B (es) 2010-12-29 2016-10-06 Hoffmann La Roche Conjugados de molecula pequeña para suministro intracelular de acidos nucleicos.
KR20150055037A (ko) 2012-09-14 2015-05-20 다이서나 파마수이티컬, 인크. 이중쇄 rna에 의한 myc의 특이적 저해를 위한 방법 및 조성물
AU2014236250B2 (en) 2013-03-14 2019-01-03 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Process for formulating an anionic agent
CA2970801C (en) 2014-12-15 2024-02-13 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Ligand-modified double-stranded nucleic acids
CN111511754B (zh) * 2017-12-20 2023-09-12 捷克共和国有机化学与生物化学研究所 活化sting转接蛋白的具有膦酸酯键的2’3’环状二核苷酸

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