ES2253398T3

ES2253398T3 - Camptotecinas liposomales mejoradas y sus usos.

Info

Publication number: ES2253398T3
Application number: ES01949169T
Authority: ES
Inventors: Thomas D. Madden; Sean C. Semple
Original assignee: Inex Pharmaceuticals Corp
Current assignee: Inex Pharmaceuticals Corp
Priority date: 2000-06-30
Filing date: 2001-06-29
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2021-06-29
Also published as: MXPA02012817A; DE60115045D1; US20060269594A1; US7060828B2; AU2001270413A1; JP2014088444A; CA2412795C; CA2412790A1; JP2012092148A; ATE309787T1; IL153676A; US20020110586A1; EP1299084B1; WO2002002078A3; AU7038501A; DE60115044D1; DE60115044T2; US20130136787A1; JP2004501955A; EP1299084A2

Abstract

Una forma de dosificación unitaria de topotecan liposomal, comprendiendo dicha forma de dosificación unitaria: un lípido; y un topotecan adecuado para la administración en una dosificación entre 0, 01 mg/M2/dosis y 7, 5 mg/M2/dosis, en la que dicha forma de dosificación unitaria de topotecan liposomal tiene una relación fármaco:lípido en peso de 0, 05 a 0, 2, y en la que dicho lípido comprende una mezcla de esfingomielina y colesterol.

Description

Camptotecinas liposomales mejoradas y sus usos.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere a composiciones de topotecan liposomal mejoradas y métodos de producción y uso de tales composiciones para tratar la neoplasia y para inhibir la angiogénesis.

Las camptotecinas terapéuticas, tales como el Topotecan (9-dimetilaminometil-10-hidroxi-camptotecina;
Hycamtin^{TM}) y el Irinotecan, son un derivado soluble en agua y semisintético de camptotecina, un alcaloide extraído de la madera del tronco del árbol chino Camptotheca acuminata (Wall, et al., J. Am. Chem. Soc. 88:3.889-3.890 (1966)). Las camptotecinas pertenecen a la clase de inhibidor de topoisomerasa de agentes antineoplásicos, inhibiendo específicamente la acción de la enzima nuclear topoisomerasa I la cual está implicada en la replicación de ADN (Hsiang, et al., Cancer Res. 48:1.722-1.726 (1988)). Así, el topotecan presenta un mecanismo de acción específico de ciclo celular, que actúa durante la fase S (replicación de ADN) para causar rupturas irreversibles de la doble cadena en el ADN que a la larga conduce a la detención del ciclo celular en G2 y apoptosis. En la forma libre, el fármaco tiene un amplio espectro de actividad contra una variedad de líneas celulares tumorales y modelos tumorales de xenoinjertos humanos y aloinjertos murinos (McCabe, F.L. et al., Cancer Invest. 12:308-313 (1994); Emerson, et al., Cancer Res. 55:603-609 (1995); Thompson, Biochim. Biophys. Acta 1.400:301-319 (1998); Ormrod, et al., Drugs 58:533-551 (1999); Hardman, et al., Anticancer Res. 19:2.269-2.274 (1999)). Más recientemente, la evidencia que se ha sacado es que el topotecan tiene fuertes propiedades antiangiogénicas que pueden contribuir a su mecanismo de acción antitumor (O’Leary, et al., Clin. Cancer Res. 5:181-187 (1999); Clements et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 44:411-416 (1999)). Todos estos tratamientos están asociados con la toxicidad limitativa de dosis tal como la mielosupresión no acumulativa que conduce a anemia, neutropenia y trombocitopenia, y la toxicidad relacionada con lo gastrointestinal, incluyendo mucositis y diarrea. Clínicamente, se ha aprobado el topotecan para terapia de segunda línea en cáncer de pulmón de célula pequeña (SCLC, del Inglés "Small Cell Lung Cancer") y de ovario y actualmente es el foco de una exhaustiva evaluación clínica.

Se han propuesto formulaciones lipídicas de camptotecinas como agentes terapéuticos (véase, el documento de Patente U.S Nº 5.552.156 y la Publicación PCT Nº WO 95/08986). Sin embargo, no todas las formulaciones lipídicas son iguales para los propósitos de reparto de fármaco y la exhaustiva investigación continúa en formulaciones que demuestran características preferidas para cargar y almacenar el fármaco, la administración del fármaco, las farmacocinéticas, la biodistribución, los índices de filtración, la acumulación de tumor, el perfil de toxicidad y similares. Con las camptotecinas, el campo se complica más debido a que las toxicidades limitativas de dosis en seres humanos pueden ser 10 veces inferiores que en ratones (Erickson-Miller, et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 39:467-472 (1997)).

El documento WO 00/23052 describe formulaciones liposomales de camptotecina y derivados de camptotecina tales como topotecan y su uso en terapia antitumor. El uso de liposomas que comprenden una mezcla de esfingomielina y colesterol no está descrito.

En resumen, las camptotecinas son una clase prometedora de agentes antineoplásicos, y las formulaciones lipídicas de estos fármacos podrían demostrar ser muy útiles. Sin embargo, hasta la fecha, las formulaciones lipídicas no han proporcionado actividad suficientemente notable para garantizar el progreso clínico. Es un objetivo de la presente invención proporcionar novedosas camptotecinas formuladas en lípido que tengan una novedosa utilidad clínica.

Compendio de la invención

La presente invención proporciona composiciones de topotecan liposomal mejoradas que tienen una eficacia clínica sorprendentemente incrementada y una toxicidad colateral disminuida. Además, la presente invención proporciona métodos de uso de tales composiciones de topotecan liposomal para tratar la neoplasia y para inhibir la angiogénesis.

En un aspecto, la presente invención proporciona una forma de dosificación unitaria de topotecan liposomal que comprende un topotecan adecuado para la administración en una dosificación entre 0,01 mg/M^{2}/dosis y 7,5 mg/M^{2}/dosis y un lípido, en el cual la forma de dosificación unitaria de topotecan liposomal tiene una relación fármaco:lípido (en peso) de 0,05 a 0,2. En una realización preferida, la forma de dosificación unitaria comprende un topotecan adecuado para la administración en una dosificación entre 0,15 mg/M^{2}/dosis y 0,5 mg/M^{2}/dosis.

En una realización, la relación fármaco:lípido (en peso) es de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,15. En otro aspecto, la forma de dosificación unitaria de topotecan liposomal es adecuada para la administración en una dosificación entre 1 mg/M^{2}/dosis y 4 mg/M^{2}/dosis de topotecan.

En la presente invención el lípido comprende una mezcla de esfingomielina y colesterol, preferiblemente en una relación esfingomielina:colesterol (en peso) de 30:70 a 60:40.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una formulación de topotecan liposomal, en la cual la formulación retiene más del 50% del topotecan como especie de lactona activa después de 12 horas en la circulación sanguínea. En una realización preferida, la formulación retiene más del 80% del topotecan como especie de lactona activa después de 12 horas en la circulación sanguínea. En otro aspecto, la presente invención proporciona una formulación lipídica de topotecan, que comprende topotecan, esfingomielina, colesterol y un ionóforo divalente, tal como un ionóforo de catión divalente. En una realización preferida, el ionóforo divalente está presente en trazas. En otra realización preferida, el ionóforo está presente en más que en trazas.

En aún otro aspecto, la presente invención proporciona un método de tratamiento de un tumor sólido en un ser humano que sufre de eso, comprendiendo el método la administración al ser humano de una cantidad eficaz de una forma de dosificación unitaria de topotecan liposomal en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los expertos en la técnica advertirán de inmediato que cualquiera de una diversidad de tumores sólidos pueden ser tratados usando las composiciones de la presente invención. En una realización preferida, el tumor sólido a tratar se selecciona entre el grupo que consiste en tumores sólidos de pulmón, mama, colon y próstata. En otra realización preferida, el método comprende además la administración conjunta de un tratamiento o agente activo adecuado para tratar neutropenia o deficiencia de plaquetas. En una realización preferida, la dosificación de topotecan en la forma de dosificación unitaria de topotecan liposomal es adecuada para la administración en una dosificación entre 0,015 mg/M^{2}/dosis y 1 mg/M^{2}/dosis. En otra realización preferida, la forma de dosificación unitaria de topotecan liposomal tiene una relación fármaco:lípido (en peso) de 0,05 a 0,15. En una realización preferida, la forma de dosificación unitaria comprende un topotecan adecuado para la administración en una dosificación entre 0,15 mg/M^{2}/dosis y 0,5 mg/M^{2}/dosis. En la presente invención, la forma unitaria liposomal comprende una mezcla de esfingomielina y colesterol, preferiblemente a una relación esfingomielina:colesterol (en peso) de 30:70 a 60:40.

Otras características, objetivos y ventajas de la invención y sus realizaciones preferidas llegarán a hacerse patentes a partir de la descripción detallada que sigue.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1

Farmacocinéticas y filtración de fármaco de topotecan encapsulado en vesículas de EM/CO

Topotecan en Plasma (\mug/ml)(A); Lípido en Plasma (\mug/ml)(B); y Recuperación Relativa (Topotecan/Lípido)(C). Se encapsuló topotecan en vesículas de EM/CO de 100 nm (55/45 mol/mol) usando el método del ionóforo A23187 de Mg tal como se describe en la sección Ejemplo. Se ensayó el topotecan mediante un ensayo de fluorescencia (véase, la sección Ejemplo) y se determinó el lípido por la incorporación de un marcador de lípido, [^{3}H]-CHE. Los puntos de datos representan la media\pmSD de 4 ratones. La formulación de EM/CO preparada mediante el método del ionóforo A23187 de Mn está incluida en la tabla inferior para comparar (de Tardi, et al., Cancer Res., presentado en
2000).

Figura 2

Influencia de la raza de ratón, el programa de dosis y la encapsulación en liposoma sobre la tolerabilidad de topotecan en ratones

Ratones Balb/c (CT-26); Dosis Única(A); ratones tipo "nude" NCr (LX-1); Dosis Única(B); ratones tipo "nude" NCr (MX-1); q3dx4(C); y ratones tipo "nude2" NCr (MX-1); q7dx3(D). Se hizo un seguimiento de los pesos corporales al menos 3 veces por semana seguido a la administración de fármaco. Los puntos de datos representan el % medio (\pmSD) de cambio en el peso corporal para cada grupo de tratamiento (n=6-8 ratones). Los datos son de los estudios NCTEF-002, NCTEF-003, NCTEF-006 y NCTEF-007.

Figura 3

Eficacia de topotecan libre (A) y encapsulado (B) en un modelo de leucemia murina L1210 intravenosa-dosis única

Se inyectaron intravenosamente células L1210 (10^{5} células en 200 \mul) en la vena del rabo de ratones BDF-1 el día 0. Se encapsuló topotecan en vesículas de EM:CO (55:45) en una relación entre fármaco y lípido de 0,10 (p/p) usando el método del A23187 de Mg tal como se describe en Experimental. Todas las diluciones se realizaron en disolución salina al 0,9% estéril inmediatamente antes de la inyección. La administración del fármaco se realizó por la vena del rabo lateral 1 día después de la inyección de célula tumoral. Cada grupo consistía en 8 animales. Los datos son de NCTEF-005.

Figura 4

Eficacia de topotecan libre (A) y encapsulado (B) en un modelo de metástasis de colon murina CT-26 intraesplénica-dosis única

Se inyectaron células CT-26 (10^{4} células en 50 \mul) en el bazo de ratones Balb/c el día 0. Se encapsuló topotecan en vesículas de EM:CO (55:45) en una relación entre fármaco y lípido de 0,10 (p/p) usando el método del A23187 de Mg tal como se describe en Experimental. Todas las diluciones se realizaron en disolución salina al 0,9% estéril inmediatamente antes de la inyección. La administración del fármaco se realizó por la vena del rabo lateral 1 día después de la inyección de célula tumoral. Cada grupo consistía en 8 animales. Los datos son de NCTEF-002.

Figura 5

Eficacia de topotecan libre y encapsulado en xenoinjertos de mama humanos MX-1 subcutáneos-dosis única

Se encapsuló topotecan en vesículas de EM:CO (55:45) en una relación entre fármaco y lípido de 0,10 (p/p) usando el método del A23187 de Mg tal como se describe en Experimental. Todas las diluciones se realizaron en disolución salina al 0,9% estéril inmediatamente antes de la inyección. La administración del fármaco se realizó por la vena del rabo lateral a los 11 días después de la implantación de célula tumoral cuando los tumores eran de 100-300 mm^{3}. Los puntos de datos representan la media\pmEEM (n=6). Los datos son de NCTEF-004.

Figura 6

Eficacia de topotecan libre y encapsulado en xenoinjertos de SCLC humanos LX-1 subcutáneos-dosis única

Se encapsuló topotecan en vesículas de EM:CO (55:45) en una relación entre fármaco y lípido de 0,10 (p/p) usando el método del A23187 de Mg tal como se describe en Experimental. Todas las diluciones se realizaron en disolución salina al 0,9% estéril inmediatamente antes de la inyección. La administración del fármaco se realizó por la vena del rabo lateral a los 10 días después de la implantación de célula tumoral cuando los tumores eran de 100-300 mm^{3}. Los puntos de datos representan la media\pmEEM (n=6). Los datos son de NCTEF-003.

Figura 7

Eficacia de topotecan libre y encapsulado en xenoinjertos MX-1 subcutáneos-programa q3dx4

Se encapsuló topotecan en vesículas de EM:CO (55:45) en una relación entre fármaco y lípido de 0,10 (p/p) usando el método del A23187 de Mg tal como se describe en Experimental. Todas las diluciones se realizaron en disolución salina al 0,9% estéril inmediatamente antes de la inyección. La administración del fármaco se realizó por la vena del rabo lateral comenzando el día 10 (los días de dosificación están indicados con un asterisco) después de la implantación de célula tumoral. La dosis (en mg/kg/dosis) está indicada entre paréntesis en la figura. Los puntos de datos representan la media\pmEEM (n=6). Los datos son de NCTEF-006.

Figura 8

Eficacia de topotecan libre y encapsulado en xenoinjertos MX-1 subcutáneos-programa q7dx3

Se encapsuló topotecan en vesículas de EM:CO (55:45) en una relación entre fármaco y lípido de 0,10 (p/p) usando el método del A23187 de Mg tal como se describe en Experimental. Todas las diluciones se realizaron en disolución salina al 0,9% estéril inmediatamente antes de la inyección. La administración del fármaco se realizó por la vena del rabo lateral el día 12, 17 y 24 después de la implantación de célula tumoral. La dosis (en mg/kg/dosis) está indicada entre paréntesis en la figura. Los puntos de datos representan la media\pmEEM (n=6). Los datos son de NCTEF-009.

Figura 9

Eficacia de topotecan libre y encapsulado en xenoinjertos LX-1 subcutáneos-programa q7dx3

Se encapsuló topotecan en vesículas de EM:CO (55:45) en una relación entre fármaco y lípido de 0,10 (p/p) usando el método del A23187 de Mg tal como se describe en Experimental. Todas las diluciones se realizaron en disolución salina al 0,9% estéril inmediatamente antes de la inyección. La administración del fármaco se realizó por la vena del rabo lateral el día 14, 21 y 28 después de la implantación de célula tumoral. La dosis (en mg/kg/dosis) está indicada en la figura. Los puntos de datos representan la media\pmEEM (n=6). Los datos son de NCTEF-007.

Descripción detallada de la invención y realizaciones preferidas

En la actualidad se ha descubierto que la actividad antitumor del hidrocloruro de topotecan (Hycamtim^{TM}, Smith-
Kline Beecham) encapsulado en liposomas de esfingomielina/colesterol, tales como liposomas de esfingomielina/co-
lesterol (55:45), mediante un método de carga en gradiente proporciona una eficacia clínica sorprendente a dosis inferiores, y con una toxicidad colateral inferior, que el topotecan libre. Los datos demuestran un incremento drástico en el índice terapéutico del topotecan encapsulado en liposoma en relación con el fármaco libre. La presente invención también proporciona un novedosa variedad de dosificaciones diferentes y programas de dosificación, y una diversidad de formulaciones de relación fármaco:lípido de topotecan liposomal, que son útiles para tratar tumores sólidos.

I. Composiciones y métodos de preparación de camptotecinas liposomales

Liposoma, vesícula y vesícula de liposoma se entenderán para indicar las estructuras que tienen membranas contenedoras de lípido que encierran un interior acuoso. Las estructuras pueden tener una o más membranas lipídicas si no se indica lo contrario, aunque generalmente los liposomas tendrán solamente una membrana. En la presente memoria a tales liposomas de capa única se denominan "unilamelar". En la presente memoria a los liposomas de capa múltiple se denominan "multilamelar".

Los liposomas que se usan en la presente invención preferiblemente están formados de lípidos que si se combinan forman vesículas relativamente estables. Se conoce una enorme diversidad de lípidos en la técnica que se pueden usar para generar tales liposomas. Los lípidos preferidos incluyen, pero no se limitan a, fosfolípidos o esfingolípidos cargados negativamente o neutros y esteroles, tales como el colesterol. Generalmente la selección de lípidos está guiada mediante la consideración de, por ejemplo, el tamaño de liposoma y la estabilidad de los liposomas en la corriente sanguínea.

Las composiciones de liposoma para usar en la presente invención son aquellas que comprenden esfingomielina y colesterol. La relación entre esfingomielina y colesterol en la composición de liposoma puede variar, pero generalmente está en el intervalo entre esfingomielina/colesterol al 75/25% mol/% mol y esfingomielina/colesterol al 30/50% mol/% mol, más preferiblemente entre esfingomielina/colesterol al 70/30% mol/% mol y esfingomielina/colesterol al 40/45% mol/% mol, e incluso más preferiblemente esfingomielina/colesterol al 55/45% mol/% mol. Otros lípidos pueden estar incluidos en las composiciones de liposoma de la presente invención ya que pueden ser necesarios, así como para prevenir la oxidación de lípido o para unir ligandos sobre la superficie del liposoma. Generalmente, si se incluyen los lípidos, la otra inclusión de tales lípidos dará como resultado un descenso en la relación de esfingomielina/colesterol. Se conocen liposomas de este tipo como los esfingosomas y están descritos más completamente en el documento de Patente U.S. Nº 5.814.335.

Una diversidad de métodos están disponibles para preparar liposomas tal como se describe en, por ejemplo, Szoka, et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980); documentos de Patente U.S. N^{os} 4.235.871, 4.501.728, 4.837.028, el texto Liposomes, Marc J. Ostro, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1983, Capítulo 1; y Hope, et al., Chem. Phys. Lip. 40:89 (1986). El protocolo para generar liposomas generalmente incluye: mezclar componentes lipídicos en un disolvente orgánico; secar y reconstituir los liposomas en disolvente acuoso; y clasificar según el tamaño los liposomas (tal como mediante extrusión), todo lo cual es conocido en la técnica.

También están disponibles métodos alternativos de preparación de liposomas. Por ejemplo, un método que implica el autoesamblaje basado en diálisis con detergente de partículas de lípido está descrito y reivindicado en el documento de Patente U.S. Nº 5.976.567 expedido por Wheeler, et al., el cual evita el consumo de tiempo y las difíciles etapas de reconstitución y secado a escala. Los métodos adicionales de preparación de liposomas que usan hidratación por flujo continuo están bajo desarrollo y pueden con frecuencia proporcionar el proceso de producción a gran escala más eficaz.

La preparación de camptotecinas liposomales requiere cargar el fármaco dentro de los liposomas. La carga puede ser o bien pasiva o activa. La carga pasiva generalmente requiere la adición del fármaco al tampón a la vez que la etapa de reconstitución. Esto permite retener el fármaco dentro del interior del liposoma, donde seguirá si no es liposoluble, y si la vesícula sigue intacta (tales métodos se emplean, por ejemplo, en la Publicación PCT Nº WO 95/08986).

En muchos sentidos es preferible la carga activa, y se pueden cargar una amplia diversidad de agentes terapéuticos en los liposomas con eficacias de encapsulación próximas al 100% usando un pH de transmembrana o un gradiente iónico (véase, Mayer, et al., Biochim. Biophys. Acta 1.025:143-151 (1990) y Madden, et al., Chem. Phys. Lipids 53:37-46 (1990)). Se conocen numerosos modos de carga activa por los expertos en la técnica. Todos estos métodos implican el establecimiento de alguna forma de gradiente que atrae los compuestos lipofílicos al interior de los liposomas donde pueden resistir durante tanto tiempo como se mantenga el gradiente. Se pueden obtener cantidades muy altas del fármaco deseado en el interior, tantas que el fármaco puede precipitar fuera del interior y generar un gradiente de consumo continuo.

Particularmente preferido para usar con la presente invención es la carga mediada por ionóforo tal como se describe y se reivindica en el documento de Patente U.S. Nº 5.837.282. Básicamente, este método emplea un ionóforo en la membrana del liposoma para conducir la generación de un gradiente de pH a partir de un gradiente de iones monovalentes o divalentes existente previamente.

Una característica importante de las camptotecinas liposomales con propósitos farmacéuticos es la relación entre fármaco y lípido de la formulación final. Las relaciones fármaco:lípido se pueden establecer de dos modos: 1) usando liposomas homogéneos que contienen cada uno la misma relación fármaco:lípido; o 2) mezclando liposomas vacíos con liposomas que tienen una alta relación fármaco:lípido para proporcionar una relación fármaco:lípido promedio adecuada. Para diferentes aplicaciones, se pueden desear diferentes relaciones fármaco:lípido. En la técnica son muy conocidas técnicas para generar relaciones fármaco:lípido específicas. Las relaciones fármaco:lípido se pueden medir sobre una base de peso a peso, una base de mol a mol o cualquier otra base designada. Las relaciones fármaco:lípido preferidas oscilan entre fármaco:lípido de 0,005 (en peso) y fármaco:lípido de 2 (en peso) y, más preferiblemente, entre fármaco:lípido de 0,01 (en peso) y fármaco:lípido de 0,02 (en peso).

Una característica importante adicional es el tamaño de las partículas de liposoma. Para usar en las presentes invenciones, se prefieren liposomas que tengan un tamaño de entre 0,05 micrómetros y 0,15 micrómetros.

La presente invención también proporciona composiciones de topotecan liposomal en forma de kit. El kit puede comprender una formulación preparada, o una formulación que requiere mezclar el medicamento antes de la administración. El kit generalmente comprenderá un envase que está compartimentado para llevar los diversos elementos del kit. El kit contendrá las composiciones liposomales de la presente invención o sus componentes, posiblemente en forma deshidratada, con instrucciones para su rehidratación y administración.

Las composiciones de liposoma preparadas, por ejemplo, mediante los métodos descritos en la presente memoria se pueden administrar o bien solas o en una mezcla con un vehículo fisiológicamente aceptable (tal como disolución salina fisiológica o tampón fosfato) seleccionado de acuerdo con la vía de administración y la práctica farmacéutica estándar. Generalmente, se empleará disolución salina normal como vehículo farmacéuticamente aceptable. Otros vehículos adecuados incluyen, por ejemplo, agua, agua tamponada, disolución salina al 0,4%, glicina al 0,3% y similares, incluyendo glicoproteínas para una estabilidad aumentada, tal como albúmina, lipoproteína, globulina, etc. Estas composiciones se pueden esterilizar mediante técnicas de esterilización bien conocidas y convencionales. Las disoluciones acuosas resultantes se pueden envasar para usar o filtrar bajo condiciones asépticas y liofilizar, siendo la preparación liofilizada combinada con una disolución acuosa estéril antes de la administración. Las composiciones también pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables tal como las requeridas para aproximar las condiciones fisiológicas, tal como agentes ajustadores de pH y tamponadores, agentes ajustadores de la tonicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, etc. Además, la composición puede incluir agentes protectores de lípido que protegen los lípidos frente a los daños de radicales libres y peroxidativos de lípido en el almacenaje. Son adecuados los amortiguadores ("quencher") de radical libre lipofílicos, tales como el \alpha-tocoferol y quelantes específicos de hierro solubles en agua, tales como la ferrioxamina.

En los siguientes ejemplos se exponen métodos ilustrativos de preparación de formulaciones específicas de camptotecinas liposomales y, en particular, de topotecan liposomal.

II. Métodos de uso de topotecan liposomal

Se usa topotecan liposomal, de acuerdo con esta invención, en el tratamiento de tumores sólidos en un animal, tal como un ser humano. Los siguientes ejemplos exponen los parámetros llave de las relaciones fármaco:lípido, las dosificaciones de topotecan y lípido a administrar, y la programación de la dosis preferida para tratar diferentes tipos de tumor.

Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas se administran parenteralmente, es decir, intraarticularmente, intravenosamente, intraperitonealmente, subcutáneamente o intramuscularmente. Más preferiblemente, las composiciones farmacéuticas se administran mediante goteo intravenoso o intraperitonealmente mediante una inyección continua ("en bolus"). La concentración de liposomas en las formulaciones farmacéuticas puede variar mucho, es decir, desde menos del aproximadamente 0,05%, normalmente o al menos aproximadamente 2-5% hasta tanto como 10 a 30% en peso y se seleccionará principalmente por volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo concreto de administración seleccionado. Por ejemplo, se puede incrementar la concentración hasta por debajo de la carga de fluido asociado con el tratamiento. Si no, se pueden diluir liposomas compuestos de lípidos irritantes a concentraciones bajas para rebajar la inflamación en el sitio de administración. La cantidad de liposomas administrados dependerá de: el estado de la enfermedad a tratar y la opinión del médico, pero generalmente, en un ser humano, estará entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 50 mg por kilogramo de peso corporal, preferiblemente entre aproximadamente 5 y aproximadamente 40 mg/kg de peso corporal. Las dosis de lípidos superiores son adecuadas para ratones, por ejemplo, 50-120 mg/kg.

La dosificación para el topotecan dependerá de la opinión de los doctores que administran basada en la edad, el peso y la condición del paciente, y el programa de tratamiento. Una dosis recomendada para topotecan libre en Cáncer de Pulmón de Célula Pequeña es de 1,5 mg/M^{2} por dosis, cada día durante 5 días, repetida cada tres semanas. Debido a las mejoras en el tratamiento demostrados ahora en los ejemplos, a continuación, las dosis de topotecan en topotecan liposomal en seres humanos será eficaz a intervalos tan bajos como desde 0,015 mg/M^{2}/dosis y aún se tolerará a dosis tan altas como de 15 a 75 mg/M^{2}/dosis, dependiendo de la programación de dosis. Las dosis pueden ser dosis únicas o se pueden administrar de manera repetida cada 4h, 6h, ó 12h o cada 1d, 2d, 3d, 4d, 5d, 6d, 7d, 8d, 9d, 10d ó combinación de los mismos. La programación preferida puede emplear un ciclo de tratamiento que se repite cada semana, 2 semanas, tres semanas, cuatro semanas, cinco semanas o seis semanas o combinación de los mismos. En una realización preferida, el tratamiento se administra una vez a la semana, generalmente siendo la dosis menor que 1,5 mg/M^{2}. En otra realización, el régimen de intervalo es al menos una vez a la semana. En otra realización, el régimen de intervalo es al menos una cada dos semanas, o si no, al menos una cada tres semanas.

Particularmente las dosificaciones preferidas de topotecan y la programación son como los siguientes

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Dosificación (mg/M^{2}/dosis)	Periodo	Repetir Ciclo cada:
0,15	1dx5d	3 semanas
0,5	1d	1 semana
1,5	1d	1 semana
15	1d	3 semanas
50	1d	3 semanas

La invención se describirá a más detalle mediante ejemplos específicos.

III. Ejemplos A. Materiales y Métodos

1. Materiales. El topotecan (Hycamtin^{TM}, SmithKline Beecham) se adquirió de la farmacia del "British Columbia Cancer Agency". La esfingomielina (EM) se adquirió de "Avanti Polar Lipids". La esfingomielina de "Northern Lipids" se usó en un primer estudio, pero era menos soluble en etanol que la versión de Avanti. El colesterol (CO) y el ionóforo A23187 de catión divalente se adquirió de Sigma. El [^{3}H]-colesterilhexadeciléter (Dupont) se usó como marcador de lípido.

2. Ratones. Se adquirieron hembras, ICR, BDF-1 o nu/nu atímicos (6-8 semanas) de "Harlan-Sprague Dawley" (Indianápolis, IN). Todos los animales fueron puestos en cuarentena durante una semana antes de usar. Todos los estudios se condujeron de acuerdo con la directrices establecidas por el "Canadian Council on Animal Care" (CCAC) y el "Institutional Animal Care and User Committee" (IACUC).

3. Formulación de topotecan mediante el método del A23187 de Mg. Se encapsuló topotecan en liposomas de EM:CO (55:45, mol/mol) usando el método del ionóforo A23187 de Mg de acuerdo con el documento de Patente U.S. Nº 5.837.282. La relación entre fármaco y lípido inicial era de 0,10 (p/p) y la carga de fármaco era generalmente de 95-100%. El tampón externo consistía en PBS 10 mM, pH 7,5 y sacarosa 300 mM. Se analizaron todas las formulaciones con respecto al tamaño de partícula, la eficacia de carga de fármaco, pH y la concentración de fármaco y lípido.

4. Preparación del fármaco y dosificación. Se hidrató cada vial de topotecan (Hycamtin^{TM}) en 1,0 ml de agua estéril, administrando una concentración de topotecan de 4,0 mg/ml. Las disoluciones posteriores se realizaron en \mul en disolución salina estéril al 0,9% para mantener el pH bajo requerido para la especie de lactona del fármaco. El fármaco no usado en la disolución de reserva en agua (4,0 mg/ml) se almacenó a 4ºC en ausencia de luz. Se diluyó el topotecan encapsulado en liposoma en disolución salina al 0,9% hasta la concentración requerida para la administración. Todas las administraciones del fármaco eran de 10 ml/kg (200 \mul/20 g ratón) por la vena de rabo lateral.

5. Estudios de farmacocinética y de filtración in vivo . Se evaluaron las farmacocinéticas y la filtración de fármaco del topotecan libre y encapsulado en liposomas en ratones ICR durante las 24h siguientes a la administración intravenosa por la vena de rabo lateral. Se usaron dos relaciones entre fármaco y lípido diferentes, es decir, 0,10 (p/p) y 0,02 (p/p), para examinar la influencia de la relación entre fármaco y lípido y la dosis de lípido sobre el comportamiento de la filtración de fármaco y la farmacocinética. Se administró topotecan encapsulado a 1 mg/kg (lípido a 10 ó 50 mg/kg) y topotecan a 5 mg/kg (lípido a 50 mg/kg). En la misma medida, se evaluó el comportamiento de farmacocinética de topotecan libre a 1 y 5 mg/kg. Se determinó el topotecan total en sangre mediante un ensayo de fluorescencia precedido por precipitación de proteínas en plasma. Se cuantificó el topotecan mediante espectrofluorimetría en una longitud de onda de excitación (ancho de rendija de 2,5 nm) y emisión (ancho de rendija de 2,5 nm) de 380 y 518 nm, respectivamente. Se determinaron los niveles de lípidos en plasma mediante recuento de centelleo líquido del marcador [^{3}H]-CHE.

6. Estudios de MTD. Los estudios de MTD se realizaron en la raza de ratón hospedante que correspondía a cada modelo de tumor. Se determinaron la MTD de dosis única y de dosis múltiple mediante el seguimiento de la pérdida de peso a lo largo del tiempo. Se definió la MTD como la dosis que da como resultado pérdida de peso al 20%.

7. Estudios de mielosupresión y neutropenia. Se valoró la alteración en los niveles celulares en sangre periférica como consecuencia de la administración de topotecan durante 4-6 semanas en ratones ICR. Se recogió la sangre en tubos microtainer con EDTA el día 1, 3, 5, 7, 14 y 21 siguientes a la administración intravenosa de topotecan libre o encapsulado en liposoma a 10 mg/kg. Se administraron vesículas vacías como control. Se realizaron análisis RSC y diferenciales en "Central Labs of Veterinarians" (Langley, BC) para cuantificar los niveles celulares, las relaciones y la morfología.

8. Modelos de Tumor. Se emplearon el modelo de leucemia murina L1210 y el modelo de metástasis de colon murino CT-26 como protocolos estándar. Se obtuvieron líneas celulares MX-1 y LX-1 humanas del almacén de tumor de DCTD en Frederick, MD. Se recibieron estas líneas celulares como fragmentos de tumor y se propagaron en ratones tipo "nude" NCr mediante transplante en serie de fragmentos de 3x3 mm. Los experimentos no se iniciaron hasta que las líneas celulares hubieran estado por 3 conductos en los ratones tipo "nude" y se reanudaron las líneas tumorales cuando el número de conducto alcanzó 10.

9. Estudios de eficacia. Se administró toda la dosificación de topotecan libre y liposomal mediante la vía intravenosa a 10 ml/kg por la vena de rabo lateral. En los modelos L1210 y CT-26, la dosificación se dio el día 1 (inyección de célula tumoral=día 0). Para los modelos de tumor MX-1 y LX-1, se determinó el volumen de tumor mediante mediciones perpendiculares repetidas de las dimensiones de tumor y usando la fórmula:

Volumen \ (mm^{3}) \ = \ (LxP^{2})/2

Se inició la dosificación en los modelos MX-1 y LX-1 cuando los tumores habían demostrado claramente crecimiento y estaban en el intervalo de 100-300 mm^{3}.

Puesto que la mayoría de los fármacos presentan un balance entre un efecto biológico y la toxicidad, es útil examinar un parámetro que incorpore ambos atributos. El parámetro frecuentemente más empleado es el índice terapéutico (TI). Tradicionalmente, el índice terapéutico se define como:

TI \ = \ LD_{50}/ED_{50}

Sin embargo, ya que no está muy permitido realizar estudios de LD_{50}, se ha definido el índice terapéutico para estos estudios tal como sigue:

TI=MTD/MED

En la fórmula anterior, MTD es la máxima dosis tolerada, definida como la dosis que causa una pérdida de peso media del 20% en un grupo de animales; y MED es la mínima dosis eficaz, definida como la dosis que produce un valor de %T/C de \leq40 en los modelos de tumor sólido o un %ILS de 50\pm10% en los modelos de supervivencia.

B. Resultados

1. Farmacocinéticas y filtración de fármaco. Se examinó la influencia de la encapsulación en liposoma y la relación entre fármaco y lípido sobre las farmacocinéticas en plasma y la filtración de fármaco del topotecan durante 24h en ratones ICR. La encapsulación en liposoma de topotecan (relación entre fármaco y lípido, 0,11, p/p) tenía una influencia drástica sobre los parámetros de farmacocinéticas del fármaco (véase, Figura 1, superior; y Tabla 1). A una dosis de 5 mg/kg de topotecan, se observaron un incremento de 164 veces en el AUC (del Inglés "Area Under Curve") en plasma, un incremento de 24 veces en C_{max} y un incremento de 24 veces en la semivida \alpha en plasma para el fármaco liposomal en relación con el fármaco libre (véase, Tabla 1). Históricamente, grandes mejoras en el AUC y en las semividas en plasma de fármacos liposomales han dado como resultado el reparto aumentado del fármaco en los sitios de enfermedad (tales como tumores), un proceso conocido como "fijación de objetivo en el sitio de la enfermedad".

Se prepararon las formulaciones usadas en este estudio mediante el método del ionóforo A23187 de Mg. Había una rápida liberación inicial del fármaco en los primeros 10-30 minutos después de la administración intravenosa (véase, Figura 1, inferior), seguido por una fase de liberación más gradual. El t_{1/2liberación} para las formulaciones de A23187 de Mn y A23187 de Mg eran de aproximadamente 3 h y aproximadamente 5-7 h, respectivamente; sin embargo, muy poco fármaco estaba presente en cada formulación a 24 h.

Para la mayoría de las formulaciones de fármaco liposomales, las propiedades farmacocinéticas del fármaco encapsulado se controlan mediante la composición de lípido y la dosis. Se ha mostrado que el topotecan liposomal presenta actividad antitumor excepcional, incluso a dosis muy bajas de fármaco (0,5 mg/kg; relación entre fármaco y lípido, 0,10, p/p). A estas dosis de fármaco y relación entre fármaco y lípido, se espera que la eliminación del liposoma del plasma sea rápida. Por lo tanto, para determinar si se podrían mejorar las farmacocinéticas de topotecan a dosis baja, se investigó una formulación de relación entre fármaco y lípido baja (0,02, p/p) de topotecan. Curiosamente, en este estudio, la formulación de relación entre fármaco y lípido baja liberó el fármaco más rápido que la formulación de más alta relación entre fármaco y lípido (0,11, p/p). Este resultado fue inesperado.

TABLA 1 Parámetros de farmacocinética de topotecan libre y liposomal

Formulación	Dosis (mg/kg)	AUC (h*\mug/ml)	Cmax (\mug/ml)	CI (ml/h)	\alpha_{1/2} (h)	\beta_{1/2} (h)
libre	1	1,97	0,75	13,9	0,14	11,8
	5	2,77	2,17	49,6	0,26	11,4
TCS	1	65,7	16,3	0,417	2,79
	5	453	51,0	0,302	6,16

Todos los parámetros eran obtenidos de modelos de uno o dos compartimientos usando el programa de realización de modelo de farmacocinética WINNONLIN.

2. Máxima dosis tolerada. Se realizaron estudios de MTD de dosis única y múltiple en ratones Balb/c, BDF-1 y NCr nu/nu porteadores de tumor. Se hizo un seguimiento de los pesos corporales de los ratones individuales a lo largo de cada estudio para evaluar la tolerabilidad general de topotecan libre y liposomal, si es posible, para establecer una MTD (véase, Figura 2). La máxima dosis tolerada de topotecan liposomal era de 10 mg/kg en una administración única, 7,5 mg/kg en un programa q7dx3 y 5 mg/kg en un programa q3dx4. La LD_{10} indicada de topotecan libre tras una infusión intravenosa única en ratones es de 75 mg/M^{2} (aproximadamente 25 mg/kg) [monográfico de producto Hycamtin^{TM}]; sin embargo, se observó una muy pequeña pérdida de peso a dosis hasta 40 mg/kg, aunque esto se considerara la MTD debido a fuertes respuestas. Se limitaron las cantidades de fármaco por tanto no se siguió con las dosis superiores a 40 mg/kg (administradas durante 5-10 minutos). Previamente se había indicado que la LD_{10} del topotecan libre en un programa qdx5 es de 14 mg/M^{2}/dosis (aproximadamente 4,7 mg/kg/dosis)(Grochow, et al., Drug Metab. Dispos. 20:706-713 (1992)).

3. Toxicidad. La mayor toxicidad limitativa de dosis de topotecan libre administrado diariamente en seres humanos durante 5 días consecutivos (dx5) a 1,5 mg/M^{2}/dosis, la MTD, es la mielosupresión no acumulativa. Tal como se mencionó al principio, los seres humanos son más sensibles que los ratones a la mielosupresión y solamente pueden tolerar 11% de la MTD en ratones (1,5 frente a 14 mg/M^{2}). A este respecto, los perros han mostrado ser mucho mejores indicadores de mielosupresión de topotecan en seres humanos (Burris, et al., J. Natl. Cancer Inst. 84:1.816-1.820 (1992)). Sin embargo, los ratones deberían ser adecuados para comparar los efectos de la mielosupresión relativa de topotecan libre y encapsulado en liposoma.

En un estudio, la reducción máxima en recuentos de glóbulos blancos (GB) periféricos se da el día 3 después de la inyección siguiente a la administración de topotecan liposomal. A continuación, se realizó una comparación de los niveles celulares en sangre periférica y la morfología el día 3 siguiente a la administración de topotecan libre o encapsulado en liposoma o vesículas vacías (véase, Tabla 2). La dosis usada para esta comparación era la MTD de topotecan encapsulado en liposoma (10 mg/kg). Se observó una significativa reducción en los neutrófilos en circulación para topotecan liposomal en relación con topotecan libre (aproximadamente 10 veces), vesículas vacías (aproximadamente 10 veces) o animales control (aproximadamente 20 veces). Se redujeron los niveles totales de glóbulos blancos (GB) y la subpoblación de linfocitos aproximadamente 2 veces para el topotecan liposomal relativo a animales control. No se observaron diferencias significativas en estos parámetros para topotecan libre a la misma dosis. El día 21 después de la inyección los niveles totales de glóbulos blancos (GB) para topotecan liposomal seguían aproximadamente 2-5 veces inferiores a los animales normales; sin embargo, se habían registrado los niveles de neutrófilos desde un descenso de 20 veces a un descenso de 3 veces en relación con los ratones normales. Los niveles de linfocitos seguían aproximadamente 2 veces inferiores a los ratones normales. No se observaron otras diferencias significativas.

Los análisis de los parámetros químicos en suero el día 3 después de la inyección revelaron muy pocos cambios en relativos a los animales no tratados (véase, Tabla 3). El único cambio destacado era un incremento estadísticamente significativo (aproximadamente 2 veces) en los niveles de globulina y un descenso concomitante en la relación albúmina/globulina para los animales tratados con topotecan liposomal. No se observaron otros cambios significativos.

1

2

C. Estudios de Eficacia en Modelos de Tumor Murino y Humano: Estudios de Dosis única

1. Leucemia Murina L1210. Se ha usado mucho el modelo de leucemia murina L1210 intravenosa para evaluar la actividad diferencial entre agentes quimioterapéuticos libres y encapsulados en liposoma y era uno de los modelos originales (1955-1975) en la investigación del NCI in vivo de novedosos agentes terapéuticos (Plowman, et al., Human tumor xenograft models in NCI drug development. In "Anticancer Drug Development Guide: Preclinical Screening, Clinical Trials, and Approval" (B. Teicher, Ed.), Humana Press Inc., Totowa (1997); Waud, Murine L1210 y P388 leukemias. In "Anticancer Drug Development Guide: Preclinical Screening, Clinical Trials, and Approval" (B. Teicher, Ed.), Humana Press Inc., Totowa (1997)). El modelo es rápido-la supervivencia media de los animales no tratados es generalmente de aproximadamente 7-8 días y las células tumorales administradas crecen en el hígado y en la médula ósea.

La administración de topotecan libre como dosis intravenosa única tuvo un efecto mínimo sobre la supervivencia en el modelo de L1210 (véase, Figura 3A). A la dosis más alta de topotecan libre, se observó una supervivencia media de 13 días (ILS al 44%). Hubo un superviviente a largo plazo (día 60) en este grupo. Por lo contrario, una administración intravenosa única de topotecan liposomal a o bien 5 ó 10 mg/kg dio como resultado una supervivencia del 100% el día 60 (véase, Figura 3B). La supervivencia media para una dosis de 1 mg/kg era de 13 días (ILS al 44%) y la curva de supervivencia era casi idéntica a la del topotecan libre administrado a 30 mg/kg aproximadamente una mejora de 30 veces en fuerza. A dosis superiores (30 mg/kg) del topotecan liposomal, se observaron muertes tóxicas. La MTD para topotecan liposomal era de 20 mg/kg en ratones BDF-1 después de una administración intravenosa única.

2. Carcinoma de Colon Murino CT-26. La línea celular de colon CT-26 murina es útil para la investigación de fármaco puesto que crece rápidamente como tumores sólidos subcutáneos o se puede administrar intravenosamente y usar como modelo de supervivencia. Además, cuando se administran las células tumorales mediante inyección intraesplénica, seguido por esplenectomía, las células crecen en el hígado y dan origen a un modelo de metástasis experimental que se parece mucho más al desarrollo clínico del cáncer colorectal. El modelo se ha usado mucho y se describe, por ejemplo, en detalle en otra parte.

En el modelo CT-26, la administración de una dosis única de topotecan tenía un impacto modesto sobre la supervivencia resultante en %ILS del 23-60% en el intervalo de dosis de 5-40 mg/kg.

En el modelo CT-26, la administración de una dosis única de topotecan tenía un impacto modesto sobre la supervivencia resultante en %ILS del 23-60% en el intervalo de dosis de 5-40 mg/kg (véase, Figura 4). Sin embargo, el topotecan encapsulado en liposoma era altamente activo a dosis mayores de 5 mg/kg, dando como resultado supervivencia del 100% (8/8) el día 90. A 10 mg/kg, se observó una supervivencia del 87,5% (7/8) el día 90; sin embargo, la carga del tumor en animal muerto era muy baja sugiriendo que este animal podía haber muerto debido a otros factores, tales como una infección relacionada con mielosupresión. Se observó una respuesta a dosis para topotecan liposomal, con la dosis de 2 mg/kg dando un %ILS del 54%. Esto se decidió que fuese la MED y era comparable al %ILS (58%) alcanzado usando topotecan libre a 40 mg/kg un incremento de 20 veces en fuerza.

3. Carcinoma de Mama Humano MX-1. MX-1 es un modelo experimental de cáncer de mama humano y tiene un tiempo de duplicación registrado de 3,9 días (NCI); en este estudio, el tiempo de duplicación medio era sistemáticamente de 3,6-3,7 días. Se obtuvo la línea celular tumoral del tumor primario de una mujer de 29 años de edad sin historia previa de quimioterapia y fue proporcionado por el almacén de tumor de DCTD (NCI) como un fragmento de tumor que se pasa en serie en los ratones tipo "nude". Histológicamente, el MX-1 es un carcinoma mamario escasamente diferenciado sin evidencia de formación de glándula o producción de mucina. El MX-1 era uno de los 3 modelos de xenoinjerto (MX-1, LX-1, CX-1) que comprendía la lista de tumor in vivo del NCI y la preinvestigación (1976-1986) para evaluar novedosos agentes quimioterapéuticos (Plowman, et al., Human tumor xenograft models in NCI drug development. In "Anticancer Drug Development Guide: Preclinical Screening, Clinical Trials, and Approval" (B. Teicher, Ed.), Humana Press Inc., Totowa (1997)). Desde entonces, se ha incorporado el MX-1 en una lista mayor de modelos de tumor de mama (12 en total) para reflejar un cambio en la estrategia del NCI desde el descubrimiento "orientado a compuesto" al descubrimiento "orientado a enfermedad".

En los tumores MX-1 preparados (100-300 mm^{3}), el topotecan libre presentó inhibición dependiente de la dosis del crecimiento tumoral (véase, Figura 5; Tabla I). A las dosis más altas (40 mg/kg), se obtuvo un %T/C óptimo de 24%; mientras que los valores del %T/C óptimo para 10 y 5 mg/kg eran de 66% y 78%, respectivamente. No se observaron muertes relacionadas con el fármaco y todos los animales ganaron peso a lo largo del estudio. La encapsulación en liposoma de topotecan tenía un impacto marcado sobre el %T/C, con valores de %T/C óptimo, de 8%, -49% y –62% siguientes a una administración única del fármaco a 2, 5 ó 10 mg/kg, respectivamente. Un valor negativo de %T/C es indicativo de regresión del volumen del tumor desde el tamaño del tumor preparado original (100-300 mm^{3}). De acuerdo con las directrices del NCI, un %T/C óptimo <10% se considera actividad significativa, mientras que valores <42% son los límites mínimos aceptables para proseguir un fármaco más en desarrollo (Corbett, T. et al., In vivo methods for screening and preclinical testing. In "Anticancer Drug Development Guide: Preclinical Screening, Clinical Trials, and Approval" (B. Teicher, Ed.), Humana Press Inc., Totowa (1997)). La encapsulación en liposoma incrementó la toxicidad de topotecan, reduciendo la MTD a 10 mg/kg desde >40 mg/kg para topotecan libre.

4. Carcinoma de Pulmón Humano LX-1. LX-1 es un modelo experimental de cáncer de pulmón de célula pequeña (SCLC). Se obtuvo la línea celular de tumor del explante quirúrgico de una lesión metastática encontrada en un varón de 48 años de edad y fue proporcionado por el almacén de tumor de DCTD (NCI) como un fragmento de tumor que se pasa en serie en ratones tipo "nude". El modelo LX-1 era parte de la lista de tumor in vivo del NCI de 1976-1986 (Plowman, J. et al., Human tumor xenograft models in NCI drug development. In "Anticancer Drug Development Guide: Preclinical Screening, Clinical Trials, and Approval" (B. Teicher, Ed.), Humana Press Inc., Totowa (1997)) y, aunque en la actualidad usado menos frecuentemente, sigue siendo un modelo de xenoinjerto útil para estudios de actividad comparativos entre fármacos libres y liposomales debido a su rápido índice de crecimiento.

En general, el modelo LX-1 era menos sensible a los efectos del topotecan que el modelo MX-1, tanto para fármaco libre como encapsulado en liposoma (véase, Figura 6; Tabla I). Los valores de %T/C óptimo para topotecan libre eran 43%, 55% y 67% para dosis de 30, 10 ó 5 mg/kg, respectivamente. La actividad antitumor se mejoró a través de la encapsulación, dando como resultado valores de %T/C de 8%, 11% y 13% para dosis de 30, 10 ó 5 mg/kg, respectivamente. Curiosamente, todas las dosis de topotecan liposomal presentaron actividad similar. Esto era un primer estudio y los estudios posteriores en otros modelos (véase, Figuras 4-6) indican respuesta a la dosis comenzando a dosis <5 mg/kg. Esto es consistente con la observación de que los compuestos de la clase de camptotecina (y se supone que otros agentes antineoplásicos) pueden presentar eficacia "auto limitativa" por lo cual, a dosis por encima de una dosis de umbral crítica, no se observan beneficios adicionales de la actividad (Thompson, Biochim. Biophys. Acta 1.400:301-319 (1998)). Es posible que esta situación pudiera darse si el fármaco tiene acceso celular tumoral limitado o si el fármaco está actuando sobre, y destruyendo, la vascularización del tumor (es decir, tiene actividad antiangiogénica). En ambos casos, se esperaría una dosis superior de fármaco que tuviera insignificante beneficio.

Tal como se observa en el estudio de L1210, la encapsulación de topotecan aumentó la toxicidad del fármaco y redujo la MTD. La MTD en ratones tipo "nude" porteadores de tumor era de 10 mg/kg (aproximadamente pérdida de peso del 16%). A 30 mg/kg, se observaron 4/6 muertes tóxicas relacionadas con el fármaco y se alcanzó la máxima pérdida de peso -29% (intervalo de 27-34%).

D. Estudios de Eficacia en Modelos de Tumor Humano y Murino: Estudios de Dosis Múltiple

1. Carcinoma de Mama Humano MX-1. Para localizar la eficacia de la administración múltiple y la exposición prolongada de los tumores a fármaco, se examinaron dos protocolos de dosis múltiple en xenoinjertos MX-1, programas q3dx4 y q7dx3. En el programa q4dx3, el topotecan libre presentó actividad moderada a 2,5 y 10 mg/kg/dosis y actividad mínima a 1,25 mg/kg/dosis (véase, Figura 7; Tabla II). Los valores de %T/C óptimo para topotecan libre en este programa de dosificación eran de 55%, 30% y 27% para 1,25, 2,5 y 10 mg/kg/dosis, respectivamente. Para el topotecan encapsulado administrado en el mismo programa de dosificación, los valores de %T/C óptimo eran de -15%, -100%, -100% y -100% para 0,5, 1,25, 2,5 y 5 mg/kg/dosis respectivamente. Se hizo un seguimiento de todos los tumores retrocedidos durante 60 días. Al final de este periodo, todos los animales tratados con \geq1,25 mg/kg/dosis de topotecan liposomal se consideraron libre de tumor.

En un programa de dosificación q7dx3, se observó una pequeña actividad con el topotecan libre, o bien 5 ó 10 mg/kg/dosis (véase, Figura 8; Tabla II). A las mismas dosis, el topotecan liposomal indujo la regresión completa de los tumores preparados. Sin embargo, en este programa de dosificación, 10 mg/kg/dosis era demasiado tóxico y esta parte del estudio se detuvo ya que se observaron 6/6 muertes tóxicas (o por eutanasia) el día 24.

2. Carcinoma de Pulmón Humano LX-1. Estudios iniciales (dosis única) en el modelo LX-1 indicaron que el topotecan libre estaba inactivo a dosis evaluadas <30 mg/kg y el topotecan liposomal inhibía el crecimiento tumoral, pero no inducía la regresión. Para mejorar esta actividad, se examinó un programa múltiple (q7dx3) tanto para topotecan libre como liposomal. En este caso, se observó una actividad considerablemente mayor para topotecan libre en comparación con el estudio de dosis única y se obtuvieron valores de %T/C óptimo de 5 y 40 para 30 y 10 mg/kg/dosis, respectivamente. El topotecan liposomal también presentó actividad significativamente mejorada, dando como resultado la regresión completa (con posterior recrecimiento) a 5 mg/kg/dosis. Los valores de %T/C óptimo para topotecan liposomal en este modelo y programa de dosificación eran -55,3 y 16 para 5, 2,5, 1,25 mg/kg/día, respectivamente.

3. Comparaciones del Índice Terapéutico (TI). Se valoró el índice terapéutico de topotecan libre y liposomal en 4 modelos diferentes de tumor en varios programas de dosificación diferentes (véase, Tabla 4). Las suposiciones y definiciones usadas para generar estos números se encuentran en la Tabla III. En algunos casos, no se observó una verdadera MED o MTD y, por lo tanto, se estimaron matemáticamente en base a las tendencias de respuesta a dosis. Por ejemplo, se observó una fuerte MTD de 40 mg/kg para topotecan libre administrado como una inyección continua ("en bolus") única, pero la verdadera MTD (en base al peso perdido) probablemente sería más próxima a 60 mg/kg si el fármaco se administrara por infusión durante 5-10 minutos. También, algo que complicaba el análisis era el nivel de fuerza de la formulación liposomal. Se alcanzó una actividad antitumor significativa a dosis bajas de fármaco y la MED tuvo que ser estimada en ciertos estudios. En estos casos, se hizo una notación en la Tabla 4.

En general, el incremento en el índice terapéutico para topotecan liposomal era relativamente grande para la administración de dosis única (5, 10, 15 y 18 veces, dependiendo del modelo) y descendía con el incremento de la frecuencia de dosificación. Esto se ilustra en la Tabla 4, donde la relación TI_{TCS}/TI_{Libre} era de 4,7-7,5 y 3,3 para programas q7dx3 y q3dx4, respectivamente. El descenso en la relación TI_{TCS}/TI_{Libre} con la dosificación más frecuente concuerdan con los estudios preclínicos y clínicos que indican que la eficacia y la toxicidad del topotecan libre es dependiente del programa.

TABLA 4 Índices Terapéuticos Relativos de Topotecan Libre y Liposomal en Modelos de Tumor Humano y Murino.^{a}

Modelo de Tumor	Vía de	Programa de	TI_{Libre}	TI_{TCS}	TI_{TCS}/TI_{Libre}
	Inoculación	Dosificación
L1210 (leucemia	Intra-venosa	Única	1,3 (2,0)^{b}	20	15,4(10)^{b}
murina)
CT-26 (colon	Intra-esplénica	Única	1,0 (1,5)^{b}	5,0	5(3,3)^{b}
murino)
MX-1 (mama	Subcutánea	Única	1,4 (2,1)^{b}	25	17,9(11,9)^{b}
humana)
		q3dx4	15	50^{c}	3,3
		q7dx3	2,0	15,0^{c}	7,5
LX-1 (pulmón	subcutánea	Sencilla	1,3 (2,0)^{b}	13,3	10,2(6,7)^{b}
humano)		q7dx3	4,0	18,8	4,7
^{a} basado en los datos de Tabla II y III; fórmulas y definiciones en Tabla IV.
^{b} \begin{minipage}[t]{155mm} obtenido usando una MTD fuerte de 40 mg/kg; el segundo valor está basado en una MTD estimada (peso corporal).\end{minipage}
^{c} \begin{minipage}[t]{155mm} una estimación prudente que puede ser aproximadamente 2 veces mayor; difícil de valorar la MED debido a la alta actividad a dosis bajas.\end{minipage}

E. Discusión

El topotecan es un excelente candidato para la encapsulación en liposoma. En pocas palabras, el topotecan es específico del ciclo celular (fase S) y la actividad se aumenta enormemente con una exposición prolongada, el topotecan presenta farmacocinéticas rápidas en plasma y el fármaco necesita mantenerse por debajo de pH 6,0 para retener la actividad biológica. Esto es un escenario ideal para usar una formulación de liposoma relativamente sin fugas (tal como EM:CO, 55:45) que tiene un núcleo acuoso ácido. El interior ácido requerido se puede producir, por ejemplo, mediante metodología de carga de ionóforo o de carga de pH. En la presente memoria, se ha demostrado que la encapsulación de topotecan en liposomas EM/CO mediante el método del A23187 de Mg da como resultado aumentos drásticos en la eficacia antitumor. También se observó un modesto aumento de la toxicidad para topotecan liposomal, pero esto mayormente se compensaba mediante reducciones substanciales de dosis que alcanzaba una eficacia comparable y, en la mayoría de los casos, superior relativa al fármaco libre.

El índice terapéutico (TI) es un parámetro útil de la actividad de fármaco, ya que es la media de la relación entre toxicidad (MTD) y la actividad biológica (punto final definido por usuario, es decir, MED, ED_{50}, o ED_{80}). En general, a menor TI, mayor riesgo de toxicidad puesto que la dosis de fármaco requerida para provocar un efecto biológico se acerca a la MTD. El índice terapéutico es particularmente útil para la evaluación de fármacos liposomales puesto que el cambio relativo en TI se puede usar para definir el beneficio (o su carencia) de encapsulación. Tal como se ha demostrado en la presente invención, el TI mejoró desde 3-18 veces dependiendo del modelo y el programa de dosis usado. Por lo tanto, el aumento en la actividad biológica observado tras la encapsulación en liposoma de topotecan más que compensa cualquier incremento en la toxicidad.

Sin intención de estar obligado por la teoría, se cree que los aumentos significativos en la actividad antitumor y la toxicidad incrementada de la forma liposomal del fármaco resulta de las farmacocinéticas mejoradas y el mantenimiento del fármaco en forma de lactona activa. En estos estudios, se presentó el 84% de topotecan en plasma como especie de lactona después de 24 h en comparación con lactona al 48% para topotecan libre después de solamente 5 minutos. Además, cuando se administró intravenosamente la misma dosis (10 mg/kg) de topotecan libre y liposomal en ratones, la concentración de lactona era aproximadamente 40 veces superior a tiempos <1 h. A 24 h, la concentración de lactona en plasma para fármaco liposomal era de 5,4 \mug/ml en comparación con 1,5 \mug/ml en 5 minutos para fármaco libre aproximadamente aún 3,5 veces mayor que la concentración de lactona máxima para topotecan libre.

TABLA I Compendio de los Parámetros de Actividad Antitumor y Toxicidad de Dosis única

			Actividad Antitumor	Toxicidad
Modelo		Dosis	%T/C^{a}	T-C^{b}	%ILS^{c}	LCK^{d}	LT^{e}	DRD^{f}	MWL^{g}
L1210	Libre	5			11		0/8	0/8	+
(i.v.)	Libre	10			22		0/8	0/8	+
NCTEF-	Libre	20			33		0/8	0/8	+
005
	Libre	30			44		0/8	0/8	+
	Libre	40			55		0/8	0/8	+
	TCS	1			44		0/8	0/8	+
	TCS	5			**		8/8	0/8	+
	TCS	10			**		8/8	0/8	-9,7
	TCS	20			**		7/7	1/8	-14,8
	TCS	30			**		3/3	5/8	-23,4
CT-26	Libre	5			31		0/8	0/8	+
(i.s.)	Libre	10			23		0/8	0/8	+
NCTEF-	Libre	40			58		1/8	0/8	-0,4
005
	TCS	2			54		0/8	0/8	+
	TCS	5			**		8/8	0/8	-6,8
	TCS	10			**		7/8	0/8	-19,1
MX-1	Libre	5	78	0,2	0	0,02	0/6	0/6	+
(s.c.)	Libre	10	66	1,4	13	0,12	0/6	0/6	+
NCTEF-	Libre	40	24	4,2	35	0,35	0/6	0/6	+
004
	TCS	2	8	7,4	65	0,62	0/6	0/6	+
	TCS	5	-49	10,2	74	0,85	0/6	0/6	-0,4
	TCS	10	-62	14,2	83	1,19	1/6	0/6	-18,3
LX-1	Libre	5	67	1,4	0	0,13	0/6	0/6	+
(s.c.)	Libre	10	55	1,9	0	0,18	0/6	0/6	+
NCTEF-	Libre	30	43	2,9	7	0,27	0/6	0/6	-1,3
003
	TCS	5	13	7,9	30	0,74	0/6	0/6	-1,7
	TCS	10	11	8,7	22	0,82	0/6	0/6	-15,6
	TCS	30	8	9,9	22	0,93	0/6	4/6	-29,0
^{a} %T/C óptimo siguiente al tratamiento final. Valor negativo indica regresión del tumor.
^{b} retraso del crecimiento tumoral (diferencia en tiempo entre tumores tratados y control para alcanzar 500 mm^{3}).
^{c} incremento en la esperanza de vida relativa a animales tratados (expresado como %).
^{d} logaritmo de muerte celular (en bruto).
^{e} animales libres de tumor al final del estudio (es decir, tumores no visibles o supervivientes a largo plazo).
^{f} muertes relacionados con el fármaco.
^{g} máxima pérdida de peso medio por grupo tratado.
^{h} cambio de peso positivo (es decir, en ningún momento el peso disminuyó por debajo del peso de pretratamiento).
** supervivientes a largo plazo.

TABLA II Compendio de los Parámetros de Actividad Antitumor y Toxicidad de Dosis Múltiple

			Actividad Antitumor	Toxicidad
Modelo		Dosis	%T/C^{a}	T-C^{b}	%ILS^{c}	LCK^{d}	LT^{e}	DRD^{f}	MWL^{g}
MX-1	Libre	1,25	55	2,0	20	0,17	0/6	0/6	+^{h}
(q3dx4)	Libre	2,5	30	5,0	55	0,42	0/6	0/6	+
NCTEF-	Libre	10	27	2,5	52	0,21	1/6	0/6	+
006
	TCS	0,5	-15	23,5	157	1,96	1,6	0/6	-0,3
	TCS	1,25	-100	**	**		6/6	0/6	-1,0
	TCS	2,5	-100	**	**		6/6	0/6	-11,5
	TCS	5	-100	**	**		6/6	0/6	-20,0
MX-1	Libre	5	58	1,8	27	0,15	0/6	0/6	+
(q7dx3)	Libre	10	61	2,0	ND^{i}		0/6	0/6	-0,8
NCTEF-	TCS	5	-100	**	**		6/6	0/6	-7,6
009
	TCS	10	-100	ND^{i}	ND^{i}		6/6	6/6	-29,0
LX-1	Libre	10	40	2,0	21	0,14	0/6	0/6	-6,2
(q7dx3)	Libre	30	5	20,9	58	1,53	0/6	0/6	-8,8
NCTEF-	TCS	1,25	16	10,8	54	0,79	0/6	0/6	-7,70
007
	TCS	2,5	3	23,2	79	1,70	0/6	0/6	-7,3
	TCS	5	-55	30,2	100	2,22	0/6	0/6	-10,5
LX-1	Libre	10	28	4,4	41		0/6	0/6	-3,6
(q7dx3)	Libre	30	9	25	72		0/6	2/6	-16,4
NCTEF-	TCS	7,5	ND^{i}	ND^{i}	ND^{i}		0/6	6/6	>-30
011
	TCS	0,75	27	11,2	50		0/6	0/6	-1,3
^{a} %T/C óptimo siguiente al tratamiento final. Valor negativo indica regresión del tumor.
^{b} retraso del crecimiento tumoral (diferencia en tiempo entre tumores tratados y control para alcanzar 500 mm^{3}).
^{c} incremento en la esperanza de vida relativa a animales tratados (expresado como %).
^{d} logaritmo de muerte celular (en bruto).
^{e} animales libres de tumor al final del estudio (es decir, tumores no visibles o supervivientes a largo plazo).
^{f} muertes relacionados con el fármaco.
^{g} máxima pérdida de peso medio por grupo tratado.
^{h} cambio de peso positivo (es decir, en ningún momento el peso disminuyó por debajo del peso de pretratamiento).
^{i} no determinado; muertes tóxicas en el grupo de encapsulado en liposoma.
** "curaciones"; tumores no visibles el día 60.

Tabla III

Definiciones y Fórmulas para los Parámetros de Toxicidad y Actividad Antitumor

DRD: (del Inglés, "Drug-Related Death"). Muerte relacionada con fármaco. Se consideró una muerte relacionada con fármaco si el animal moría o se sometía a eutanasia en los 15 días siguientes al tratamiento final con fármaco y su peso de tumor era menor que la carga letal en los ratones control, o su pérdida de peso era mayor del 20% de los animales control.

GI_{50}: (del Inglés "Growth inhibition"). La concentración de fármaco que causa una inhibición del crecimiento del 50% en una población de células in vitro. El NCI renombró el parámetro IC_{50} para enfatizar la corrección para el recuento celular a tiempo cero. Por lo tanto, la fórmula es:

GI_{50} \ = \ (T - T_{0})/(C-T_{0}) \ x \ 100 \ = \ 50

\quad: T y T_{o} son las densidades ópticas a 48 y 0 h, respectivamente; C es la densidad óptica control (recuento celular) a 0 h.

%ILS: (del Inglés "Increase Lifespan"). Incremento en la esperanza de vida (en porcentaje). Para modelos de supervivencia esto se calcula usando los tiempos de supervivencia media para los animales tratados (T_{trat}) y control (T_{cont}), de acuerdo con:

(T_{trat} \ - \ T_{cont})/T_{cont} \ x \ 100

\quad: Para los modelos de tumor sólido, se usó el tiempo para que los tumores alcanzasen 2.000 mm^{3} (aproximadamente 10% del peso corporal) como límite ético en lugar de supervivencia media.

LCK: (del Inglés "Log Cell Kill"). Logaritmo de muerte celular (en bruto). Este parámetro estima el número de log_{10} de unidades de células destruidas al final del tratamiento, de acuerdo con la fórmula:

(T-C) x 0,301/tiempo duplicación medio

\quad: Se puede calcular el logaritmo de muerte celular neto restando la duración del tratamiento al parámetro de retraso del crecimiento tumoral (T-C) tal como sigue:

[(T-C)-duración tratamiento]x0,301/tiempo duplicación medio

\quad: Un logaritmo de muerte celular de 0 indica que la población celular al final del tratamiento es el mismo que era al inicio del tratamiento. Sin embargo, un logaritmo de muerte celular de 4, por ejemplo, indica una reducción del 99,99% en la población celular inicial.

MBWL: (del Inglés "Maximum Body Weight Loss"). Máxima pérdida de peso corporal (en porcentaje). Se pesan los animales antes de la primera administración del fármaco (Pi) y en diversos días durante el estudio (Pd). El cambio en porcentaje en el peso corporal se calcula mediante:

MBWL=(P_{d}-P_{i})/P_{i}x100

MED: (del Inglés "Minimum Effective Dose"). Mínima dosis eficaz. Este es un parámetro algo arbitrario. Para estos estudios hemos definido la MED como la dosis más baja que alcanza un %T/C óptimo\leq40 (para modelos de tumor sólido) o un %ILS de 40-60% (para modelos de supervivencia).

MTD: (del Inglés "Maximum Tolerated Dose"). Máxima dosis tolerada. Dosis de fármaco que da como resultado una MBWL de \leq20%.

%T/C: Relación óptima de tumores tratados frente a control obtenida tras el primer tratamiento. Estos valores se obtienen restando el peso de tumor medio en el primer día de los tratamientos (T_{i} o C_{i}) a los pesos de tumor en cada día de observación de acuerdo con la siguiente fórmula:

%T/C=(\Delta T/ \Delta C)x100,

\hskip0.5cm

donde \ \Delta T>0, \ ó

%T/C=(\Delta T/T_{i})x100,

\hskip0.5cm

donde \ \Delta T<0,

\quad: De acuerdo con los criterios de actividad del NCI, el siguiente sistema de anotación aplica (Plowman, et al., Human tumor xenograft models in NCI drug development. In "Anticancer Drug Development Guide: Preclinical Screening, Clinical Trials, and Approval" (B. Teicher, Ed.), Humana Press Inc., Totowa (1997)) [22]:

\quad: 0= inactivo, %T/C>40

\quad: 1= inhibición del tumor, intervalo de %T/C 1-40

\quad: 2= estasis del tumor, intervalo de %T/C 0 a –40

\quad: 3= regresión del tumor, intervalo de %T/C –50 a –100

\quad: 4= intervalo de %T/C –50 a –100 y >30% de ratones libres de tumor

\newpage

TGD: (del Inglés "Tumor Growth Delay"). Retraso del crecimiento tumoral (también representado como T-C). Este parámetro expresa la diferencia en el tiempo (en días) entre tumores tratados y control para lograr un tamaño arbitrario (generalmente 500 ó 1.000 mm^{3}).

TI: (del Inglés "Therapeutic Index"). Índice terapéutico. El índice terapéutico es la relación entre un parámetro de toxicidad (es decir, LD_{50}, LD_{10}, MTD) y un parámetro de actividad biológica (es decir, ED_{50}, la dosis que causa una respuesta biológica definida en el 50% del grupo de tratamiento). En general, TI describe el margen de seguridad para un fármaco. Para estudios de modelo animal tradicionalmente esto se describe por la fórmula:

TI=LD_{50}/ED_{50}

\quad: Sin embargo, puesto que éticamente no se permite realizar estudios de LD_{50}, hemos definido el índice terapéutico para estos estudios como:

TI=MTD/MED

Claims

1. Una forma de dosificación unitaria de topotecan liposomal, comprendiendo dicha forma de dosificación unitaria:

: un lípido; y

: un topotecan adecuado para la administración en una dosificación entre 0,01 mg/M^{2}/dosis y 7,5 mg/ M^{2}/dosis,

en la que dicha forma de dosificación unitaria de topotecan liposomal tiene una relación fármaco:lípido en peso de 0,05 a 0,2, y en la que dicho lípido comprende una mezcla de esfingomielina y colesterol.

2. La forma de dosificación unitaria de topotecan liposomal de la reivindicación 1, en la que dicha relación fármaco:lípido en peso es de 0,05 a 0,15.

3. La forma de dosificación unitaria de topotecan liposomal de la reivindicación 1 ó 2, en la que dicho lípido comprende esfingomielina y colesterol en una relación en peso de 30:70 a 60:40.

4. La forma de dosificación unitaria de topotecan liposomal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, adecuada para la administración en una dosificación entre 0,015 mg/M^{2}/dosis y 1 mg/M^{2}/dosis de topotecan.

5. La forma de dosificación unitaria de topotecan liposomal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, adecuada para la administración en una dosificación entre 1 mg/M^{2}/dosis y 4 mg/M^{2}/dosis de topotecan

6. La forma de dosificación unitaria de topotecan liposomal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha forma de dosificación de topotecan liposomal retiene más del 50% de especie de lactona activa después de 12 horas en la circulación sanguínea.

7. La forma de dosificación unitaria de topotecan liposomal de la reivindicación 6, en la que dicha forma de dosificación de topotecan liposomal retiene más del 80% de especie de lactona activa después de 12 horas en la circulación sanguínea.

8. La forma de dosificación unitaria de topotecan liposomal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, comprendiendo además un ionóforo de catión divalente.

9. La forma de dosificación unitaria de topotecan liposomal de la reivindicación 8, en la que dicho ionóforo divalente está presente en trazas.

10. El uso de una formulación de topotecan liposomal que comprende topotecan, esfingomielina y colesterol para la producción de un medicamento para tratar un tumor sólido en un mamífero.

11. El uso de la reivindicación 10, en el que dicho tumor sólido se selecciona entre el grupo que consiste en tumores sólidos de pulmón, mama, colon y próstata.

12. El uso de la reivindicación 10 ó 11, en el que la formulación de topotecan liposomal comprende la forma de dosificación unitaria de topotecan de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

13. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que el medicamento es adecuado para la administración conjunta con un agente activo adecuado para el tratamiento de la neutropenia o la deficiencia de plaqueta.

14. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que el medicamento es adecuado para la administración en un régimen de intervalo.

15. El uso de la reivindicación 14, en el que dicho régimen de intervalo es una vez al día durante al menos dos días consecutivos.

16. El uso de la reivindicación 14, en el que dicho régimen de intervalo es una vez cada tres días.

17. El uso de la reivindicación 14, en el que dicho régimen de intervalo es al menos una vez a la semana, al menos una vez cada dos semanas, o al menos una vez cada tres semanas.