CN1245977C - 脂质体抗肿瘤药物及其使用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及脂质体的抗肿瘤药物(如，喜树碱)组合物，以及使用这种组合物治疗肿瘤和抑制血管生成的方法。这些组合物和方法可有效调节活性药物的血浆循环半衰期。

Description

脂质体抗肿瘤药物及其使用
                     相关申请的互相参照
本申请涉及提交于2000年6月30日的题为“脂质体的喜树碱及其使用”的美国临时申请第60/215,556号，以及提交于2001年1月26日的题为“脂质体的抗肿瘤药物及其使用”的美国临时申请第60/264,616号，出于所有目的，在此将这两者全文并入以供参考。出于所有目的，在此全文并入提交于2001年6月29日的题为“脂质体的喜树碱及其使用”、代理人文件第016303-008020号的美国专利申请第＿号，以供参考。
                            发明背景
本发明涉及脂质体的组合物以及使用此类组合物治疗肿瘤和抑制血管生成的方法。
许多抗癌或抗肿瘤药物被包裹在脂质体中。这包括烷化剂、亚硝基脲、顺氯氨铂、代谢拮抗剂和蒽环类抗生素。对这些含有蒽环类抗生素的脂质体的研究清楚显示了心脏毒性和皮肤毒性的降低，同时，与接受游离药物的对照动物相比，它延长了带瘤动物的存活时间。
与对应的游离药物相比，脂质体的抗癌药物改变了药物的药代动力学。对脂质体的药物制剂来说，药物的药代动力学很大程度上由载体从血液中清除的速度以及药物从载体释放的速度所决定。为鉴定从血液中缓慢清除的脂质体载体组合物已经作出了重大的努力，并且在许多科学出版物和专利中已经描述了长时间循环的载体。在控制药物从脂质体载体中释放方面(例如，用跨膜电位控制释放)也作出了努力。
治疗用的喜树碱，比如Topotecan(托泊替康，9-二甲基氨基甲基-10-羟基-喜树碱；HycamtinTM)，以及Irinotecan(伊立替康)，是半合成的、喜树碱(一种提取自中国树Camptotheca acuminata树干的生物碱)的水溶性衍生物(Wall等，J.Am.Chem.Soc.88：3888-3890(1966))。喜树碱属于拓扑异构酶抑制剂类的抗肿瘤剂，特异性抑制参与DNA复制的核酶拓扑异构酶I的活性(Hsiang等，CancerRes.48：1722-1726(1988))。如此，托泊替康显示细胞周期特异性的作用机制，作用于S期(DNA复制期)使DNA的双链造成不可逆的断裂，这最终导致G2细胞周期停滞和凋亡。在游离形式时，这种药物对一系列抗肿瘤细胞系以及鼠同种异体移植物和人异种移植物肿瘤模型有广谱的活性(McCabe，F.L等，Cancer Invest12：308-313(1994)；Emerson等，Cancer Res.55：603-609(1995)；Thompson，Biochim.Biophys.Acta 1400：301-319(1998)；Ormrod等，Drugs58：533-551(1999)；Hardman等，Anticancer Res.19：2269-2274(1999))。最近，有证据显示，托泊替康有很强的抗血管生成的特性，这可能有助于其抗肿瘤的作用机制(O’Leary等，Clin.Cancer Res.5：181-187(1999)；Clements等，CancerChemother.Pharmacol.44：411-416(1999))。所有这些治疗都与剂量限制性毒性(比如导致贫血、中性粒细胞减少和血小板减少的非累积性骨髓抑制，以及与肠胃相关的毒性包括粘膜炎和腹泻)有关。临床上，托泊替康被批准在卵巢和小细胞肺癌(SCLC)中用于二线治疗，且最近成为广泛的临床评价的焦点。
喜树碱的脂类制剂已被提出作为治疗剂(参见美国专利5,552,156号和PCT公布号WO 95/08986)。然而，不是所有的脂类制剂对于药物输递目的都是等效的，对制剂进行广泛的研究证实了关于药物荷载和储藏、药物施用、药代动力学、体内分布、释放速度、肿瘤中累积、毒性等的优选特性。对喜树碱而言，这一领域更加复杂，因为人类中的剂量限制毒性可能比小鼠要低10倍(Erickson-Miller等，Caner Chemother.Pharmacol.39：467-472(1997))。
改进的抗肿瘤剂的脂质体制剂被证明非常有效。本发明的一个目的是提供有新的临床用途的脂类制剂的抗肿瘤剂。
                            发明概要
本发明提供了可有效调节活性药物(如，托泊替康)血浆循环半衰期的组合物和方法。脂质体制剂改进了临床疗效且降低了毒副反应。此外，本发明提供了治疗瘤形成和抑制血管生成的方法和脂质体组合物。如此，在一个实施方案中，本发明提供了一种调节活性药物血浆循环半衰期的方法，包括：(a)提供一种其中包裹游离活性药物和沉淀的活性药物的脂质体；以及(b)改变沉淀在脂质体中的活性药物的量。奇怪的是，通过改变脂质体中沉淀的活性药物的量，有可能修饰活性药物释放入血浆的释放动力学。优选的活性药物是抗肿瘤药物，比如喜树碱(如，托泊替康)。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种脂质体的制剂，包括：a)抗肿瘤药物；以及b)含有游离抗肿瘤药物和沉淀的抗肿瘤药物的脂质体，其中，脂质体中沉淀的抗肿瘤药物至少占抗肿瘤药物总量的50％。通过改变脂质体中沉淀的抗肿瘤药物的量，有可能控制药物在体外和体内的释放。在某些优选的实施方案中，脂质体内活性药物(如，托泊替康)的含量较高将导致沉淀型的量较高。此时，随后药物在体内的释放速度较慢。在某些方面，较慢的释放速度较好，且与快的释放速度相比更加有效。
再一个实施方案中，本发明提供了一种脂质体的制剂，包括：a)活性药物；b)其中包裹游离活性药物和沉淀的活性药物的脂质体；以及c)空的脂质体。
在这一方面，由于在制剂中含有空的脂质体，脂质体的血清半衰期延长了。精通这一技术的技术人员应该了解，任何脂质都可以用来形成本发明的脂质体组合物。在目前一个优选的实施方案中，脂类包括鞘磷脂和胆固醇的混合物，较好的是鞘磷脂和胆固醇的比例(摩尔比例)约为30∶70至约60∶40。在一个优选的实施方案中，脂质体中所含的鞘磷脂和胆固醇的比例为55∶45。
在还有一个方面，本发明提供了一种在患有实体瘤的人中治疗实体瘤的方法，此方法包括向患者施用有效量的在药学上可接受的载体中的本发明的脂质体制剂。用本发明的组合物还可以治疗各种实体瘤。在优选的实施方案中，被治疗的实体瘤选自肺部、乳房、结肠和前列腺的实体瘤。在另一个优选的实施方案中，此方法进一步包括同时施用适合治疗中性粒细胞减少或血小板减少的一种疗法或是活性药物。
在优选的实施方案中，脂质体的托泊替康被用来治疗实体瘤。此外，那些精通这一技术的技术人员应很容易理解，任何种类的脂类都可用来形成本发明的脂质体组合物。
此外，通过下面的详细描述，将进一步展现本发明的目的和优点及其优选的实施方案。
                            附图简述
图1A C显示长春瑞宾脂质体制剂的药代动力学行为。图A显示了三种不同药物∶脂类比例(0.1∶1，0.2∶1，0.3∶1)的制剂的药物从循环的载体中释放的速度。药物释放依赖于药物∶脂类的比例，比例最高(0.3∶1)则释放速度最慢。图B显示了脂类在血液中的回收。图C显示，药物自载体的释放速度的调节可导致长春瑞宾血液清除半衰期的改变。
图2A-C显示了当使用血浆药物水平了解药代动力学时的相应行为。图A显示了药物随时间的滞留情况。图B显示了脂类随时间的回收情况。图C显示了药物随时间的回收情况。
图3A-C显示了作为药物∶脂类比例的函数的脂质体长春花碱制剂的药代动力学行为(血液PK)。药物从脂质体载体中的释放由最初的药物∶脂类的比例决定，药物比例较高则制剂的释放较慢。图A显示了药物随时间的滞留情况。图B显示了脂类随时间的回收。图C显示了药物释放速度与药物从血液中清除的半衰期的改变相关。
图4A-C显示了作为药物∶脂类比例的函数的脂质体长春花碱制剂的药代动力学行为(血浆PK)。图A显示了药物随时间的滞留情况。图B显示了脂类随时间的回收。图C显示了药物释放速度与药物从血浆中清除的半衰期的改变相关。
图5A-C显示了脂类剂量对PK行为的影响(血液PK)。像这里所列举的，药物∶脂类比例为0.3∶1、脂类剂量在16.6mg/kg和50mg/kg之间的脂质体长春花碱制剂，观察到了类似的药物释放(A)、脂类清除(B)和药物清除(C)速度。
图6A-C显示了脂类剂量对PK行为的影响(血浆PK)。像这里所列举的，药物∶脂类比例为0.3∶1、脂类剂量在16.6mg/kg和50mg/kg之间的脂质体长春花碱制剂，观察到了类似的药物释放(A)、脂类清除(B)和药物清除(C)速度。
图7A-C显示了两种有着不同药物∶脂类比例的脂质体托泊替康制剂的药代动力学行为。图A显示，当托泊替康中药物∶脂类比例为0.11∶1时，药物的释放速度会很慢，与图B(其中制剂的药物∶脂类比例较低，为0.02∶1)相比，这会导致很慢的血浆清除速度。
                      发明详述及优选的实施方案
许多抗癌药物的活性依赖于它们的药代动力学行为。药代动力学行为决定了药物的浓度和癌细胞暴露于药物的时间。对许多抗癌药物而言，较长的暴露时间是优选的，且这样会杀死更多的癌细胞。通常，几个参数被用来描述药物的药代动力学。例如血浆清除半衰期和曲线下面积(AUC)。血浆清除半衰期是从血浆中除去一半所施用药物的时间。AUC是一段时间中血浆药物水平的量度，它指出了药物暴露的总量。通常，增加抗癌药物的血浆清除半衰期和血浆AUC可以增加治疗效果。
I.调节活性药物的释放
本发明描述了调节药物从脂质体中释放的方法和制剂。一个实施方案中，本发明提供了一种调节活性药物血浆循环半衰期的方法，包括；(a)提供一种包裹游离活性药物和沉淀的活性药物的脂质体；以及(b)改变脂质体中沉淀的活性药物的量。较好的是，“游离的活性药物”和“沉淀的活性药物”是同一活性药物，虽然本发明没有对此进行限制。这里所使用的“调节”一词可以指增加或降低活性药物从脂质体载体中释放的速度。对抗肿瘤活性药物而言，调节较好的是降低或减慢活性药物的释放速度。
在优选的方面，本发明的脂质体同时含有被包裹的游离活性药物和沉淀的活性药物。沉淀在脂质体中的活性药物的量可用各种机制加以改变。例如，通过改变活性药物与脂类的比例，则沉淀的活性药物的量可以增加或减少。低药物∶脂类比例的药物会导致活性药物(如，托泊替康)在脂质体内部的浓度较低，因此，许多(如果不是全部的话)药物是溶液形式而不会沉淀或游离。低沉淀量会导致药物从脂质体中快速释放。相反，高的药物：脂类比例会导致高的脂质体内浓度和高的沉淀量。当药物为沉淀型时，随后在体内或体外的释放速度较慢。对抗肿瘤药物(如，托泊替康)而言，较慢的释放速度是优选的。
不拘泥于任何特殊的理论，据信本发明的脂质体经历了“沉淀-溶出机制”(PDM)，这决定了药物的释放。在本发明的PDM机制中，与活性药物释放到脂质体外部的速度相比，脂质体内沉淀的活性药物(如，托泊替康)溶出到脂质体内部溶液的速度较慢，因此由后者决定速度。即，沉淀的药物溶出而成为脂质体内部的游离药物的速度决定了药物将以多快的速度释放进血浆。
某些实施方案中，可以加入空的脂质体改变活性药物与脂类的比例。通常，无论是空的脂质体或是其中含有活性药物的脂质体都可以被网状内皮系统(RES)的细胞清除。典型地，RES在一小时内可以除去一次注射的脂质体剂量的80-95％，将选定的靶位点有效清出以便接受脂质体。已经报道了许多影响RES摄取脂质体速度的因素，包括脂质体尺寸、电荷、脂类的饱和程度以及表面的片段。将空的脂质体囊泡包括在内可能保护含有活性药物的脂质体免遭RES除去。因此，空的脂质体囊泡实际上通过作为“诱饵”增加了脂质体的血液循环寿命。脂质体通常需要增加循环时间以从注射位点到达靶区域、细胞或位点。空的脂质体囊泡使RES保持繁忙，因此其中含有活性药物的脂质体的血清半衰期增加了。
在某些其它的方面，在脂质体中加入一种组分会提高活性药物的沉淀。在此方面，许多带电离子可被用来增加囊泡内部沉淀的活性药物的量。在较好的方面，可以使用二价、三价或多价的阴离子。合适的阴离子包括(但不限于)羧酸盐(-CO2 -)、磺酸盐(SO3 -)、硫酸盐(SO4 -2)、氢氧化物(-OH)、醇盐、磷酸盐(-PO4 -2)以及膦酸盐(-PO3 -2)。那些精通这一技术的技术人员应知道，其它的组分也可以提高脂质体内沉淀的活性药物的量。
此外，药物：脂类的比例可用脂质体的尺寸来调节。较大的脂质体囊泡需要较小的药物∶脂类比例。某些方面，活性药物与脂类的比例以及脂质体的尺寸都可以被调节以使活性药物的疗效最为理想。
沉淀在囊泡中的被包裹的活性药物的量可以改变，且它在一定程度上依赖于活性药物本身。某些实施方式中，沉淀的活性药物的量至少是活性药物总量的约25％-约95％(比如约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％和95％)。对托泊替康而言，包裹在脂质体内的沉淀的活性药物的量至少是活性药物总量的50％。
在较优的方面，当活性药物是抗肿瘤药物时，用较高的药物∶脂类比例会使被包裹的沉淀药物的量较多。如此，体内药物从脂质体的释放就比用低药物∶脂类比例制得的类似的组合物要慢。这些高药物∶脂类比例的脂质体能延长血浆半衰期并增加血浆AUC值。有利的是，这些制剂可以促进抗肿瘤的疗效。
某些实施方案中，活性药物∶脂类的比例约为0.005-1∶1(w/w)。
较好的是，活性药物∶脂类的比例约为0.05-0.9∶1(w/w)，更好的是，活性药物∶脂类的比例约为0.1-0.5∶1(w/w)。通过调节活性药物的血浆循环半衰期，有可能使活性药物的疗效最大或最为理想。
II.组合物以及制造脂质体制剂的方法
脂质体、囊泡和脂质体囊泡应理解为是指由含有脂类的膜包裹含水的内部的这种结构。除非另有说明，这种结构可以有一层或多层脂类的膜，尽管脂质体通常只含有一层膜。这种单层膜的脂质体在这里被称为“单层的”。多层脂质体在这里被称为“多层的”。
用在本发明中的脂质体最好是由脂类形成，当结合时可以形成相对稳定的囊泡。这一领域中已知有许多种脂类可用来形成此类脂质体。优选的脂类包括(但不限于)中性和带负电荷的磷脂类或神经鞘脂类和甾醇类，比如胆固醇。对脂类的选择通常要考虑(例如)脂质体的尺寸和脂质体在血流中的稳定性。
用在本发明中的优选的脂质体组合物包括鞘磷脂和胆固醇。脂质体组合物中鞘磷脂和胆固醇的比例可以改变，但通常约为75/25mol％/mol％鞘磷脂/胆固醇至约30/50mol％/mol％鞘磷脂/胆固醇，更好的是约为70/30mol％/mol％鞘磷脂/胆固醇至约40/45mol％/mol％鞘磷脂/胆固醇，最好是约为55/45mol％/mol％鞘磷脂/胆固醇。如果必要的话，本发明的脂质体组合物中还可以包括其它的脂类，比如为防止脂类氧化或在脂质体表面附着配体。通常，如果包括了脂类，则再加入此类脂类会导致鞘磷脂/胆固醇比例降低。这种类型的脂质体被认为是鞘脂质体(sphingosomes)，它在美国专利5,814,335中有详细的描述，在此并入对它的说明以供参考。
已经存在许多制备脂质体的方法，如Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467(1980)；美国专利4,235,871号；4,501,728号，标题Liposomes，Marc J.Ostro编，Marcel Dekker公司，纽约，1983，第一章；以及Hope等，Chem.Phys.Lip.40：89(1986)，在此将它们全文并入以供参考。制造脂质体的步骤通常包括：将脂类组分混合在有机溶剂中；干燥并在含水溶剂中重建脂质体；以及确定脂质体的尺寸(如通过挤出)，所有这些都是这一技术中已知的。
还存在其它的制造脂质体的方法。例如，Wheeler等人发表的美国专利5,976,567中解释并要求了一种基于脂类颗粒自组装包括去污剂透析的方法，这种方法避免了耗时和难于放大的干燥以及重建的步骤。其它采用连续流动水合制造脂质体的方法还在发展中，这些方法通常可以提供最有效的大规模的工业生产工艺。
制造含有活性药物(如，喜树碱)的脂质体制剂需要在脂质体中引入药物。引入可以是被动或主动的。被动的引入通常需要在重建步骤时在缓冲液中添加药物。这使得药物被截留在脂质体内部，如果药物不溶于脂类并且囊泡保持完整的话它将保留在这里(此类方法已在，例如，PCT公布WO 95/08986号中被应用，在此将其并入以供参考)。
主动引入可以有多种方法，且可以在脂质体中引入许多治疗药物，通过使用跨膜pH或离子梯度可以使包裹效率达到100％(参见Mayer等，Biochim.Biophys.Acta1025：143-151(1990)以及Madden等，Chem.Phys.Lipids 53：37-46(1990))。那些精通这一技术的技术人员已经知道很多主动引入的方法。所有这些方法都包括建立某些形式的梯度，这些梯度可以将亲脂组分送进脂质体内部，只要梯度保持，它们就可以保留在那里。在内部可以获得很高数量的所需药物，这样药物就可以在内部沉淀出来并形成连续的摄取梯度。
特别优选用在本发明中的是离子载体介导的引入，如美国专利5,837,282中描述和要求的那样，在此将其方法并入以供参考。离子载体介导的引入是一种电中性的过程且不会导致跨膜电位的形成。氢离子被输送进囊泡中，相应地，镁离子以2∶1的比例被运出囊泡(即，没有净电荷转移)。若为托泊替康，据信该药物以中性状态(无电荷)穿过膜。进入囊泡后，托泊替康带上正电荷。由于离子载体介导的引入是电中性的过程，故没有跨膜电位产生。
用作药物的脂质体喜树碱的一个重要特征是最终制剂中药物与脂类的比例。像前面所讨论的那样，可以通过两种途径建立药物：脂类的比例：1)用含有同样药物∶脂类比例的相同的脂质体；或是2)将空的脂质体与高药物∶脂类比例的脂质体混合以提供合适的平均药物∶脂类比例。对于不同的应用，需要不同的药物∶脂类比例。产生特定药物∶脂类比例的方法在此领域中已被人熟知。药物∶脂类比例可以重量比重量为单位，以摩尔比摩尔为单位或采用任何其它指定的单位。优选的药物∶脂类比例范围是约.005∶1药物∶脂类(重量)至约0.2∶1药物∶脂类(重量)，更好的是从约0.1∶1药物∶脂类(重量)至约0.3∶1药物∶脂类(重量)。
另一个重要的特征是脂质体颗粒的尺寸。出于本发明的目的，脂质体的尺寸在约0.05微米至约0.15微米是优选的。
本发明还提供了药物盒形式的脂质体组合物(如，喜树碱)。这种试剂盒可以提供预制的制剂或是在用药之前需要将药物混合的制剂。这种药物盒通常包括一种经过分隔以盛装药物盒各组件的容器。这种药物盒含有本发明的脂质体组合物或是其成分，可能是脱水形式的，以及关于它们再水化和施用的使用说明。
例如，用这里所描述的方法制备的脂质体组合物可以单独施用或与根据用药途径和标准用药惯例选择的生理上可接受的载体(如生理盐水或磷酸盐缓冲液)混合后施用。通常，生理盐水可被用作药学上可接受的载体。其它合适的载体包括，例如，水、缓冲的水、0.4％的盐水、0.3％的甘氨酸以及类似的载体，包括糖蛋白以提高稳定性，例如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。可通过常规的、熟知的灭菌技术将这些组合物灭菌。所得水溶液可被包装以供使用，或在无菌条件下过滤并冻干，在使用之前将冻干的制品与无菌的水溶液混合。组合物中还可以含有药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂以及类似的物质，例如，醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。此外，组合物中还可以包括脂类保护剂，它可以保护脂类在储存中避免自由基和脂类过氧化的危害。亲脂性的自由基淬灭剂(如α-生育酚)和水溶性铁特异性螯合剂(如铁草铵)是合适的。
有很多活性药物都适用于这种脂质体组合物和本发明的方法。在优选的方面，这种活性药物是抗肿瘤药物。目前大约有20个经过批准的抗肿瘤药物类别。分类通常是基于特定药物的共同结构，或是基于药物作用的共同机制。以下按照分类列出了某些常规的已被商业认可(或正在积极开发)的抗肿瘤药物中的一部分：
基于结构的类别：
1.氟嘧啶类-5-FU、氟脱氧尿苷、呋氟尿嘧啶、5’-脱氧氟尿苷、UFT、S-1卡比他宾(Capecitabine)；
2.嘧啶核苷类-脱氧胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、5-氮杂胞嘧啶、吉西他宾(Gemcitabine)、5-氮杂胞嘧啶-阿拉伯糖苷；
3.嘌呤类-6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤、别嘌呤醇、克拉利宾(Cladribine)、氟达拉宾(Fludarabine)、喷司他丁苷、2-氯腺苷
4.铂类似物—顺氯氨铂、卡铂、奥沙利铂、四铂(Tetraplatin)、铂-DACH、奥马铂(Ormaplatin)、CI-973、JM-216；
5.蒽环类抗生素/蒽二酮类—阿霉素、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌；
6.表鬼臼毒素在—依托泊甙、替尼伯甙；
7.喜树碱类—伊立替康、托泊替康、9-氨基喜树碱、10，11-亚甲二氧基喜树碱、9-硝基喜树碱、TAS 103(即二盐酸6-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-3-羟基-7H-茚并[2，1-c]喹啉-7-酮，可购自Taiho Pharmaceutical Co.，Ltd.，Tokyo，Japan，另可见Mizutani，H等，J.Biol.Chem.，Vol.277，第34期，pp.30684-30689，23 August 2002)、7-(4-甲基-哌嗪基-亚甲基)-10，11-亚乙二氧基-20(S)-喜树碱、7-(2-N-异丙胺基)乙基-20(S)-喜树碱：
8.激素和激素类似物—己烯雌酚、他莫昔芬、托瑞米芬、托目得斯(Tolmudex)、塞米太克(Thymitaq)、氟他胺、比卡鲁胺(Bicalutamide)、普罗斯佳、雌二醇、曲沃昔芬、屈洛昔芬、醋酸甲孕酮、醋酸甲地孕酮、氨鲁米特、睾丸内酯等；
9.酶类、蛋白质类和抗体类—天冬酰胺酶、白细胞介素、干扰素、亮丙瑞林、培帕格斯(Pegaspargase)等；
10.长春花属生物碱—长春新碱、长春花碱、长春瑞宾、长春地辛；
11.紫杉烷类—帕利泰斯(Paclitaxel)、多西泰斯(Docetaxel)。
基于机制的类别：
1.抗激素类—见关于激素和激素类似物，阿纳曲唑(Anastrozole)；
2.抗叶酸类—氨甲蝶呤、氨蝶呤、三甲曲沙(Trimetrexate)、甲氧苄啶、吡利曲星(Pyritrexim)、乙胺嘧啶、伊达曲沙(Edatrexate)、MDAM；
3.抗微管类药—紫杉烷类和长春花属生物碱；
4.烷化物(经典的和非经典的)—氮芥类(氮芥、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、尿嘧啶氮芥)、奥沙磷(Oxazaphosphorine)类(异环磷酰胺、环磷酰胺、帕氟酰胺(Perfosfamide)、氯乙环磷磷胺、烷基磺酸酯(白消安)、亚硝基脲类(卡氮芥、环己亚硝脲、链佐星)、噻替派、达卡巴嗪等；
5.代谢拮抗剂—上面所列出的嘌呤类、嘧啶类和核苷类；
6.抗生素—蒽环类抗生素/蒽二酮类、博莱霉素、放线菌素D、丝裂霉素、普卡霉素、喷司他丁、链佐星；
7.拓扑异构酶抑制剂—喜树碱(拓扑I)、表鬼臼毒素、m-AMSA、玫瑰树碱(拓扑II)：
8.抗病毒药类-AZT、扎西他宾(Zalcitabine)、吉西他宾(Gemcitabine)、双脱氧胞苷等；
9.各种细胞毒剂—羟基脲、米托坦、融合毒素、PZA、布来他汀(Bryostatin)、类维生素A、丁酸及其衍生物、戊聚糖、夫马洁林等。
所有抗肿瘤药物的目的都是消除(治愈)癌细胞或是阻碍癌细胞的生长和扩散(缓解症状)。上面所列抗肿瘤药物中的大部分都是通过细胞毒活性对癌细胞直接杀伤而实现这一目的的。其它的抗肿瘤药物刺激机体的天然免疫以杀死癌细胞。文献中对上述药物以及许多其它药物的活性和机制有大量的讨论。
关于制造脂质体喜树碱，尤其是脂质体托泊替康特定制剂的方法的例子被列在以下的实施例中。
III.使用脂质体喜树碱的方法
本发明的脂质体组合物(如，喜树碱)被用于治疗动物，如人类，的实体瘤。以下的实施例列出了关于药物∶脂类比例、被施用的活性药物和脂类的剂量以及治疗不同肿瘤类型优选的剂量方案的关键参数。
药物组合物最好以不经肠道的方式，即在关节内、静脉内、腹膜内、皮下或是肌肉内施用。更好的是通过静脉滴注或腹膜内推注施用这种药物组合物。药物制剂中脂质体的浓度可以有很大的变化，即，重量可以从小于约0.05％，通常是或至少约2-5％至多达10-30％，这主要根据所选的特殊施用方式从液体的体积、粘度等方面进行选择。例如，可以增加浓度以减小与治疗有关的流体负荷。或者，由刺激性脂类构成的脂质体可被稀释成低浓度以减少用药位点的炎症。所施用脂质体的量依赖于所用的特定喜树碱、被治疗的疾病的状态以及临床医师的判断，但对于人，这通常约在每千克体重0.01和50mg之间，较好的是约在5-40mg/千克体重之间。较高的脂类剂量对于小鼠是合适的，例如，在50-120mg/kg之间。
活性药物(如，喜树碱)的剂量决定于治疗医师的意见，这将基于年龄、体重和患者的状况以及治疗方案。对小细胞肺癌，游离托泊替康的推荐剂量是每剂1.5mg/M2，连续5天，每三周重复一次。由于对治疗的改进现在已被以下的实施例证实，在人类中，根据用药方案，活性药物(如，托泊替康)低至每剂0.015mg/M2时都是有效的，并可耐受高至每剂15-75mg/M2的剂量。剂量可以是单剂，或是每4h、6h或12h，或是每ld、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d重复施用一次，或将这两种方法结合使用。优选的方案是采用一个治疗周期，即每周、每两周、每三周、每四周、每五周或是每六周重复一次，或结合使用这些方法。在一个目前优选的实施方案中，每周进行一次治疗，剂量通常是少于1.5mg/M2。
特别优选的托泊替康剂量和方案如下所示：
  剂量(mg/M2/每剂)   周期   周期间隔
  0.15   1dx5d   3周
  0.5   1d   1周
  1.5   1d   1周
  15   1d   3周
  50   1d   3周
通过特定的实施例将更加详细地描述本发明。提供以下实施例只是为了阐述而不能以任何方式理解为是限制本发明。那些精通这一技术的技术人员可以很容易的认识到，许多非关键性的参数可以改变或修改，而得到实质上一样的效果。
IV. 实施例
A.材料和方法
1.材料。托泊替康(HycamtinTM，SmithKline Beecham)是从British ColumbiaCancer Agency的药房购得的。鞘磷脂(SM)是从Avanti Polar Lipids购得的。在早期的研究中使用了来自Northern Lipids的鞘磷脂，但与Avanti的产品相比，它在乙醇中的溶解性不佳。胆固醇(CH)和二价阳离子离子载体A23187购自Sigma。[3H]-胆固醇十六烷基醚(Dupont)被用作脂类标记物。
2.小鼠。雌性、ICR、BDF-1或是无胸腺nu/nu(6-8周)，购自Harlan-SpragueDawley(印第安纳波利斯，印第安纳州)。所有的动物在使用之前都检疫一周。所有的研究都是根据加拿大动物管理委员会(CCAC)和公共机构动物管理和使用委员会(IACUC)确定的方针处理的。
3.用Mg-A23187法制造的托泊替康制剂。用美国专利5,837,282所述的Mg-A23187离子载体法将托泊替康包裹在SM∶CH(55∶45，mol/mol)的脂质体中。最初药物∶脂类的比例为0.10(w/w)，药物包裹通常为95-100％。外部缓冲液中含有10mMPBS，pH7.5和300mM蔗糖。对所有的制剂都进行了粒度、药物包裹率、pH以及药物和脂类的浓度分析。
4.药物制备和剂量。将每瓶托泊替康(HycamtinTM)以1.0ml的无菌水水合，使托泊替康的浓度为4.0mg/ml。随后用0.9％的无菌盐水进行稀释以维持持药物的内酯所需的低pH。未用完的水储备液(4.0mg/ml)中的药物被保存在4℃无光的环境下。包有脂质体的托泊替康被稀释在0.9％的盐水中至用药所需要的浓度。所有的药物施用都以10ml/kg(200μl/20g小鼠)通过侧尾静脉进行。
5.药代动力学和体内释放研究。用ICR小鼠，在通过侧尾静脉i.v.用药后24小时内，评价了游离和包有脂质体的托泊替康的药代动力学和药物释放。采用了两种不同的药物∶脂类比例，即0.10(w/w)和0.02(w/w)，来考查药物∶脂类比例和脂类剂量对药物释放和PK行为的影响。以1mg/kg(10或50mg/kg脂类)和5mg/kg托泊替康(50mg/kg脂类)的剂量施用被包裹的托泊替康。相应的，以1和5mg/kg评价了游离托泊替康的PK行为。将血浆蛋白质沉淀，再通过荧光测定法确定血液中总的托泊替康。用分光荧光法在激发(狭缝宽度2.5nm)和发射波长(狭缝宽度2.5nm)分别为380和518nm时对托泊替康进行定量。对[3H]-CHE标记进行液体闪烁计数以确定血浆中脂类的水平。
6.MTD研究。在与各个肿瘤模型相对应的宿主小鼠品系中进行MTD研究。通过监控一段时间的体重减少确定单剂量和多剂量MTD。MTD被定义为导致20％体重减轻的剂量。
7.骨髓抑制和中性粒细胞减少的研究。在ICR小鼠中对作为施用托泊替康后果的外周血细胞水平的改变进行了4-6周的评估。在以10mg/kg的剂量i.v.施用游离或包裹有脂质体的托泊替康后，在第1、3、5、7、14和21天将血液收集在EDTA微量试管中施用空的囊泡作为对照。在兽医中心实验室(Central Labs forVeterinarian)(兰利，BC)进行了全血细胞计数(CBC)和差示分析以对细胞水平、比例和形态进行定量。
8.肿瘤模型。在标准方案中使用了L1210鼠白血病模型和CT-26鼠结肠转移模型。从马里兰州弗雷德里克的DCTD肿瘤贮库获得人MX-1和LX-1细胞系。这些细胞系以肿瘤碎片获得并通过连续移植3×3mm的碎片使其在NCr裸小鼠中增殖。直至细胞系在裸小鼠中传3代开始实验，当传代数达到10时肿瘤系应从贮库取新的细胞系碎片移植。
9.疗效研究。所有的游离和脂质体托泊替康药量都是通过静脉途径以10ml/kg经过侧尾静脉施用的。在L1210和CT-26模型中，给药在第1天进行(以注射肿瘤细胞作为第0天)。对于MX-1和LX-1肿瘤模型，通过重复垂直测量肿瘤直径并用以下公式计算肿瘤的体积：
                        体积(mm3)＝(L×W2)/2
当肿瘤已明显生长并在100-300mm3范围时才在MX-1和LX-1模型中开始给药。
由于大多数药物在生物效应和毒性之间显示出平衡，检测包括这两类属性在内的参数是有用的。最常使用的参数是治疗指数(TI)。通常，治疗指数是这样定义的：
                        TI＝LD50/ED50
然而，由于不能长期进行LD50的研究，这些研究的治疗指数可以这样定义：
                      TI＝MTD/MED
上述公式中，MTD是最大耐受剂量，定义为在一组动物中导致平均体重减少20％的剂量；MED是最小有效剂量，定义为在实体瘤模型中使最佳％T/C值≤40或在存活模型中使％ILS达到50±10％的剂量。
B.结果
1.药代动力学和药物释放。在ICR小鼠中对脂质体包裹和药物∶脂类比例对托泊替康的血浆药代动力学和药物释放的影响进行了24小时的检测。托泊替康的脂质体包裹(药物∶脂类比例，0.11，wt/wt)对药物的药代动力学参数有惊人的影响(见，图1，顶部；以及表1)。当托泊替康剂量为5mg/kg时，相对于游离药物(见表1)，脂质体药物观察到血浆AUC有164倍的增长，Cmax有24倍的增长，血浆α半衰期有24倍的增长。历史上，AUC和脂质体药物血浆半衰期的大幅度提高已经导致了药物向疾病部位(如肿瘤)输递的增加，这样过程被称为“靶向疾病部位”。
这一研究中所用的制剂是用Mg-A23187离子载体法制备的。在iv用药后最初的10-30分钟内，出现了药物最初的快速释放(见图1，底部)，然后是逐步释放阶段。Mn-A23187和Mg-A23187制剂的t1/2释放分别约为3小时和5-7小时；然而，两种制剂中都有很小一部分药物在24小时时仍存在。
对于大多数的脂质体药物制剂，被包裹的药物的的药代动力学性质是由脂类组成和剂量控制的。已经显示脂质体托泊替康具有异常的抗肿瘤活性，即便是在很低的药物剂量下(0.5mg/kg；药物∶脂类比例，0.10，wt/wt)。在这种药物剂量和药物∶脂类比例下，从血浆中消除脂质体是很迅速的。因此，为确定低剂量时托泊替康的药代动力学是否得到了改进，研究了低药物∶脂类比例(0.02，wt/wt)的托泊替康制剂。有趣的是，在这一研究中，低药物∶脂类比例的制剂释放药物要比高药物∶脂类比例(0.11，wt/wt)的制剂快得多。这一结果是没有预料到的。
                      表1.游离和脂质体托泊替康的药代动力学参数
  制剂   剂量(mg/kg)   AUC(h·μg/ml)   Cmax(μg/ml)   Cl(ml/h)   α1/2(h)   β1/2(h)
  游离   1   1.97   0.75   13.9   0.14   11.8
  5   2.77   2.17   49.6   0.26   11.4
  TCS   1   65.7   16.3   0.417   2.79
  5   453   51.0   0.302   6.16
所有的参数都来自使用用WINNONLIN PK模型软件的一室或两室模型。
2.最大耐受剂量。在带有肿瘤的Balb/c、BDF-1和NCr nu/nu小鼠上进行了单剂量和多剂量XTD研究。在各个研究中对每只小鼠的体重都进行了监控，以对游离和脂质体托泊替康的总的耐受性进行估价，以及，可能的话，确定MTD(见图2)。脂质体托泊替康的最大耐受剂量在单独用药时是10mg/kg，用q7dx3方案时是7.5mg/kg，用q3dx4方案时是5mg/kg。据报道，对小鼠进行单剂量静脉输注后，游离托泊替康的LD10为75mg/M2(约为25mg/kg)[HycamtinTM产品专论]；然而，当剂量达到40mg/kg时，观察到非常小的体重减少，尽管这被认为是由于急性反应造成的MTD。对药量进行了限制，所以没有试用高于40mg/kg(在5-10分钟内施用)的剂量。以前已经证明，在qdx5方案中，游离托泊替康的LD10是14mg/M2/每剂(约4.7mg/kg/每剂)(Grochow等，Drug Metab.Dispos.20：706-713(1992))。
3.毒性。连续5天(dx5)每天一次以1.5mg/M2/每剂的MTD用于人体的游离托泊替康的主要剂量限制性毒性是非累积性的骨髓抑制。像前面所提到的，人类对骨髓抑制比小鼠更加敏感，且仅可耐受小鼠MTD的11％(1.5比14mg/M2)。在这方面，狗类是人托泊替康骨髓抑制的很好的预测者(Burris等，J.Natl.CancerInst.84：1816-1820(1992))。然而，小鼠可能适合于比较游离和脂质体包裹的托泊替康的相对骨髓抑制效应。
在一项研究中，外周WBC计数的最大减少发生在注射脂质体托泊替康三天后。在用药后的第三天对游离或脂质体包裹的托泊替康或空囊泡的外周血细胞水平和形态进行了比较(见表2)。这一比较中试用的剂量是脂质体包裹的托泊替康的MTD(10mg/kg)。相对于游离托泊替康(约10倍)、空囊泡(约10倍)或对照动物(约20倍)，脂质体托泊替康观察到明显的循环中性粒细胞的减少。相对于对照动物，脂质体托泊替康的总WBC水平和淋巴细胞亚群降低了约2倍。在同等剂量的游离托泊替康时，这些参数没有明显的变化。注射21天后，脂质体托泊替康的WBC水平仍比正常动物低大约2.5倍；然而，相对于正常小鼠，中性粒细胞的水平已经从减少20倍恢复到减少3倍。淋巴细胞的水平仍比正常小鼠低大约2倍。没有观察到其它显著的差异。
注射三天后对血清化学参数的分析显示了相对于未处理动物的非常小的变化(见表3)。唯一值得注意的一点变化是，经脂质体托泊替康处理的动物的球蛋白水平在统计学上的明显增加(约2倍)，且白蛋白/球蛋白比例也相应降低。未见其他显著变化
                                                                       表2
                                  经静脉给予10mg/kg剂量的游离或脂质体包裹的托泊替康处理的ICR小鼠的血液CBC和分类
  处理方法   注射后天数   WBC(×109/L)   中性粒细胞(×109/L)   淋巴细胞(×109/L)   单核细胞(×109/L)   嗜酸粒细胞(×109/L)   嗜碱粒细胞(×109/L)   RBC(×1012/L)   Hb(g/L)   Hb(L/L)  PLT(×109/L)
  对照游离TCS空泡囊 321321321   6.47±1.626.70±1.955.16±1.182.82±1.052.54±1.434.68±1.135.05±0.64   0.937±0.2010.520±0.2000.480±0.1220.048±0.0180.282±0.1670.598±0.2380.898±0.575   5.23±1.455.90±1.704.33±0.932.63±0.872.06±1.363.66±0.933.78±0.88   0.180±0.0420.177±0.0720.247±0.1800.109±0.1260.133±0.1420.248±0.1680.263±0.163   0.059±0.0390.031±0.0210.034±0.160.001±0.0010.019±0.0110.081±0.0440.038±0.036   0.056±0.0530.057±0.0400.088±0.0710.034±0.0290.064±0.0600.064±0.0550.072±0.057   8.67±0.938.47±0.399.81±0.378.93±0.769.41±0.837.77±0.309.36±0.67   142±12136±05154±04141±10154±12130±05152±08   0.438±0.0450.444±0.0120.493±0.0140.463±0.0330.486±0.0350.416±0.0140.483±0.033  717±317879±145907±059564±0981009±161863±1431366±144
                                                                 表3
                       经静脉给予10mg/kg剂量的游离或脂质体包裹的托泊替康处理的ICR小鼠在注射三天后的血清化学参数
  处理   BUN(mmol/L)   肌酐（μmol/L)   TP(g/L)   白蛋白(g/L)   球蛋白(g/L)   白蛋白/球蛋白比例   胆红素(μmol/L)   Alk Phos(IU/L)   ALT(IU/L)   AST(IU/L)   CPK(IU/L)
  对照游离TCS空泡囊   11.3±3.09.4±3.210.0±3.9ND   83±682±1896±2868±13   46.7±2.148.0±2.155.8±11.849.3±1.2   31.3±1.532.8±1.328.8±2.533.0±1.7   15.3±1.215.2±1.127.0±10.116.3±0.6   2.07±0.152.16±0.151.18±0.332.00±0.17   4.7±0.63.8±0.82.5±0.64.3±0.6   86±1267±3573±2170±10   27±3113±2323±1717±15   59±2255±1077±2953±6   87±10756±38155±5456±26
C.鼠和人类肿瘤模型的疗效研究：单剂量研究
1.L1210鼠白血病。静脉内L1210鼠白血病模型被广泛用来评价游离和脂质体包裹的化学治疗剂间活性的差异，并且它还是NCI对新的化学治疗剂体内筛选的初筛模型(1955-1975)(Plowman等，Human tumor xenograft models in NCI drugdevelopment.见“Anticancer Drug Development Guide：PreclinicalScreening，Clinical Trials，and Approval”(B.Teicher编)，Humana出版公司，Totowa(1997)；Waud，Murine L1210 and P388 leukemias。见“Anticancer DrugDevelopment Guide：Preclinical Screening，Clinical Trials，and Approval”(B.Teicher编)，Humana出版公司，Totowa(1997))。这种模型是快速的—未处理动物平均存活期通常约7-8天—并且所给予的肿瘤细胞被接种到肝脏和骨髓。
以一次静脉给予游离托泊替康对L1210模型的存活期的影响极小(见图3A)。当游离托泊替康剂量极大时，观察到的存活期中位值为13天(44％ILS)。在这一组中有一只长期存活者(60天)。相反，以5或10mg/kg单剂量静脉施用脂质体托泊替康到第60天的存活率为100％(见图3B)。1mg/kg剂量的存活期中位值为13天(44％ILS)，且存活期曲线与施用30mg/kg(效力提高了30倍)的游离托泊替康的曲线类似。在高剂量(30mg/kg)的脂质体托泊替康时，观察到了中毒死亡。在单剂量静脉施用后，BDF-1小鼠中脂质体托泊替康的MTD是20mg/kg。
2.CT-26鼠结肠癌。鼠CT-26结肠细胞系对于药物筛选是有效的，因为它很容易作为皮下实体瘤生长或通过静脉接种，并可被用作存活期模型。此外，当通过脾内注射接种肿瘤细胞，然后通过脾切除，细胞便接种到肝脏并产生与直肠结肠癌的临床发展非常类似的实验性转移模型。这种模型被广泛应用并且还将在别处(对实例)详细描述。
在CT-26模型中，单剂量托泊替康的施用对存活期的影响极小，在5-40mg/kg的剂量范围时所得％ILS为23-60％(见图4)。然而，脂质体包裹的托泊替康在剂量超过5mg/kg时就要有效得多，90时存活率为100％(8/8)。在10mg/kg时，90天观察到的存活率为87.5％(7/8)；然而，死亡动物中的肿瘤负荷很低，这说明这个动物可能死其于它因素，比如与骨髓抑制有关的感染。脂质体托泊替康观察到了剂量反应，2mg/kg的剂量得到的％ILS为54％。这被确定是MED，并且与用40mg/kg(效力提高了20倍)的游离托泊替康所得的％ILS(58％)相当。
3.MX-1人乳房癌。MX-1是人乳房癌的实验模型，据报道倍增时间为3.9天(NCI)；这一研究中，倍增时间中位值始终为3.6-3.7天。肿瘤细胞系是从以前无化疗史的29岁女性的原发瘤中分离的，并由DCTD(NCI)肿瘤贮库提供，它作为肿瘤碎片在裸小鼠上连续传代。组织学上，MX-1是分化差的乳房癌，没有明显的腺组织或粘蛋白产物。MX-1是三种异种移植模型(MX-1、LX-1、CX-1)中的一种，它构成NCI的体内肿瘤名单和评价新化学治疗剂的初筛模型(1976-1986)(Plowman等，Humantumor xenograft models in NCI drug development.见“Anticancer DrugDevelopment Guide：Preclinical Screening，Clinical Trials，and Approval”(B.Teicher编)，Humana出版公司，Totowa(1997))。因此，MX-1已经被列入较大的一组乳房癌模型(总共12种)，反映出NCI从“化合物定向”的发现到“疾病定向”的发现策略的变化。
适用的(100-300mm3)MX-1肿瘤，游离托泊替康显示了对肿瘤生长的剂量依赖性抑制(见图5；表1)。在最高剂量时(40mg/kg)观察到了24％的最佳％T/C；而10和5mg/kg时最佳％T/C分别为66％和78％。没有观察到药物相关的死亡，且所有的动物在研究过程中体重都增加了。托泊替康的脂质体包裹对％T/C有显著的影响，以2、5或10mg/kg单剂量施用后，最佳％T/C分别为8％、-49％和-62％。负的％T/C值说明肿瘤的体积比开始阶段的肿瘤尺寸(100-300mm3)减小了。按照NCI的方针，最佳％T/C小于10％被认为具有显著的活性，而小于42％则是药物进一步发展的可接受的下限(Corbett，T等，In vivo methods for screening andpreclinical testing.见“Anticancer Drug Development Guide：PreclinicalScreening，Clinical Trials，and Approval”(B.Teicher编)，Humana出版公司，Totowa(1997))。脂质体包裹增加了托泊替康的毒性，使MTD从游离托泊替康的大于40mg/kg减小到10mg/kg。
4.LX-1人肺癌。LX-1是人小细胞肺癌(SCLC)的实验模型。肿瘤细胞系是从48岁男性中发现的转移性损伤的手术移出物中分离的，并由DCTD(NCI)肿瘤贮库提供，作为在裸小鼠上连续传代的肿瘤碎片。LX-1是NCI从1976-1986的体内肿瘤模型名单中的一部分(Plowman，J.等，Human tumor xenograft models in NCI drugdevelopment.见“Anticancer Drug Development Guide：PreclinicalScreening，Clinical Trials and Approval”(B.Teicher编)，Humana出版公司，Totowa(1997))，并且，尽管现在不经常使用，但因为它的快速生长速率，它仍是在游离和脂质体药物间进行比较活性研究的有用的异种移植模型。
通常，对于游离和脂质体包裹的药物，LX-1模型对于托泊替康的作用的敏感性要小于MX-1模型(见图6；表I)。当剂量为30、10或5mg/kg时，游离托泊替康的最佳％T/C值分别是43％、55％和67％。通过包裹抗肿瘤活性得到了改进，其结果为，当剂量为30、10或5mg/kg时，％T/C值分别是8％、11％和13％。有趣的是，所有的脂质体托泊替康剂量显示了类似的活性。这是一个早期研究，在其它模型上进行的，随后的研究(见图4-6)指出了从剂量小于5mg/kg开始具有剂量反应。这与下列观察结果是一致的，即喜树碱类化合物(可能还有其它的抗肿瘤药物)有“自限性”疗效，因此，当剂量超过临界阈剂量时就无法观察到进一步的活性作用了(Thompson，Biochim.Biophys.Acta 1400：301-319(1998))。如果药物已经限制了肿瘤细胞增加(access)，或者如果药物已经在肿瘤的脉管系统上发挥作用并将其破坏(即，有抗血管生成的活性)，这种情况是可能发生的。在这两种情况，更大剂量的药物的好处可能可以忽略。
如在L1210研究中所观察到的，托泊替康的包裹提高了药物的毒性并降低了MTD。在带有肿瘤的裸小鼠中，MTD是10mg/kg(体重减轻约16％)。在30mg/kg时，观察到了4/6的因药物相关的毒性而死亡，且最大体重损失达到了约29％(27-34％之间)。
D.在鼠和人类肿瘤模型中进行的疗效研究：多剂量研究
1.MX-1人乳房癌。为确定多剂量用药和延长肿瘤暴露于药物的时间的疗效，在MX-1异种移植物上考察了两个多剂量方案-q3dx4和q7dx3方案。在q4dx3方案中，游离托泊替康在2.5和10mg/kg/每剂时显示了中等活性，在1.25mg/kg/每剂时活性极小(见图7；表II)。在这种剂量方案中，游离托泊替康在1.25、2.5和10mg/kg/每剂时的最佳％T/C值分别为55％、30％和27％。而以同样的剂量方案施用的被包裹的托泊替康在0.5、1.25、2.5和5mg/kg/每剂时，最佳％T/C值分别为-15％、-100％、-100％和-100％。对所有消退的肿瘤监控了60天。在这一时期结束时，所有用≥1.25mg/kg/每剂的脂质体托泊替康处理的动物都没有肿瘤了。
在q7dx3剂量方案中，在5或10mg/kg/每剂的游离托泊替康中观察到了较小的活性(见图8；表II)。同等剂量时，脂质体托泊替康使该阶段肿瘤完全消退。然而，在这一剂量方案中，10mg/kg/每剂毒性太大，在24天时这部分研究停止了，因观察到有6/6中毒死亡(或是安乐死的)。
2.LX-1人肺癌。初次以LX-1模型进行的研究(单剂量)表明，游离托泊替康在剂量小于30mg/kg时没有活性，而脂质体托泊替康抑制了肿瘤的生长，但没有导致消退。为提高这种活性，对游离和脂质体托泊替康实施了多剂量(q7dx3)方案。在这一研究中，相对于单剂量研究，对游离托泊替康观察到了明显较大的活性，在30和10mg/kg/每剂时得到的最佳％T/C值为5和40。脂质体托泊替康也显示了显著提高的活性，结果是在5mg/kg/每剂时完全消退(其后又再生长)。在这个模型和剂量方案中，用5、2.5、1.25mg/kg/天的剂量脂质体托泊替康的最佳％T/C值分别为-55、3和16。
3.治疗指数(TI)的比较。在4种不同肿瘤模型中获得了游离和脂质体托泊替康几种不同剂量方案的治疗指数(见表4)。用来产生这些数据的前提和限制列在表III中。在这些情况中，没有观察到真实的MED或MTD，因此是基于剂量反应趋势作出的数学预测。例如，对以单次推注方式给予的游离观察到了40mg/kg的急性MTD，但是，如果输注时间为5-10分钟的话，真实的MTD(基于体重减少)可能要接近60mg/kg。同样，使分析复杂化的可能还有脂质体制剂效价的水平。在低药物剂量时获得了显著的抗肿瘤活性且在某些研究中必须估计MED。这些情况下，在表4中作了注释。
通常，单剂量用药的脂质体托泊替康治疗指数的增加相对较大(根据模型分别为5、10、15和18倍)，并且它随着给药频率的增加而减少。这种情况列在表4中，其中，q7dx3和q3dx4方案的TITCS/TIFree比例分别为4.7-7.5和3.3。较频繁给药时TITCS/TIFree比例的降低与证实游离托泊替康的疗效和毒性具方案依赖性的临床前和临床研究是一致的。
            表4.鼠和人类肿瘤模型中游离和脂质体托泊替康的相对治疗指数a
  肿瘤模型 接种途径 用量方案   TIFree   TITCS   TITCS/TIFree
  L1210(鼠白血病)CT-26(鼠结肠）MX-1(人类乳房)LX-1(人类肺) 静脉内脾内皮下皮下   单剂量单剂量单剂量q3dx4qTdx3单剂量q7dx3   1.3(2.0)b1.0(1.5)b1.4(2.1)b152.01.3(2.0)b4.0   205.02550c15.0c13.318.8   15.4(10)b5(3.3)b17.9(11.9)b3.37.510.2(6.7)b4.7
a基于表II和III的数据；表IV中的公式和定义。
b用40mg/kg的急性MTD获得；第二个值是基于估计的MTD(体重)
c保守的估计，可能增加约2倍；由于低剂量时的高活性难以获得MED。
E.讨论
托泊替康是脂质体包裹的优秀候选者。简而言之，托泊替康是细胞周期特异性的(S-期)且暴露延长时活性大大提高，托泊替康显示了快速的血浆药代动力学，同时这种药物需要保持在低于pH6.0的条件下以保持生物学活性。为了使用有酸性的含水的核心的相对释放少的脂质体制剂(如SM∶CH为55∶45)，这是一种理想的情况。所需的酸性核心是可以制造的，例如，通过pH包裹或离子载体包裹的方法。这里已经证实，用Mg-A23187法在SM/CH脂质体中对托泊替康进行包裹使抗肿瘤疗效有了显著的提高。脂质体托泊替康也观察到了毒性的有限提高，但是，通过实质性的减少剂量可以大大得到补偿，这相对于游离药物量获得了同等的疗效，且在大多数情况下是最大的疗效。
治疗指数(TI)是药物活性的有用参数，因为它是毒性(MTD)与生物学活性(使用者定义的终点，即MED，ED50或ED80)比例的量度。通常，TI越低中毒的风险就越大，因为要得到生物学效果所需的药物剂量接近于MTD。治疗指数对于评价脂质体药物特别有用，因为TI的相对改变可被用来确定包裹的益处(或没有好处)。如这里所证实的，依赖于模型和所用的剂量方案TI可提高3倍到18倍。因此，对脂质体包裹的托泊替康观察到的生物学活性的提高要大于对任何毒性提高的补偿。
不受任何理论的限制，我们认为，药物的脂质体形式抗肿瘤活性的显著提高以及毒性的增加是由于药代动力学的改进以及使药物维持活性内酯形式造成的。这些研究中，24小时后有84％的托泊替康作为内酯出现在血浆中，而游离托泊替康仅仅在5分钟后有48％的内酯。此外，当在小鼠中通过静脉施用同样剂量(10mg/kg)的游离托泊替康和脂质体托泊替康时，当时间小于1小时时，内酯的浓度提高了约40倍。在24小时时，脂质体药物的内酯血浆浓度为5.4μg/ml，而游离药物在5分钟时仅为1.5μg/ml-这仍然比游离托泊替康的内酯浓度峰值高出3.5倍。
                                          表I
                          单剂量抗肿瘤活性和毒性参数的总结
  模型   剂量   ％T/Ca    抗肿瘤活性   LCKd   TFe           毒性
 T-Cb   ％ILSc   DRDf   MWLg
  L1210(静脉内)NCTEF-005CT-26(脾内)NCTEF-005MX-1(皮下)NCTEF-004LX-1(皮下)NCTEF-003  游离游离游离游离游离TCSTCSTCSTCSTCS游离游离游离TCSTCSTCS游离游离游离TCSTCSTCS游离游离游离TCSTCSTCS   510203040151020305104025105104025105103051030 7866248-49-6267554313118 0.21.44.27.410.214.21.41.92.97.98.79.9   112233445544********31235854****01335657483007302222 0.020.120.350.620.851.190.130.180.270.740.820.93   0/80/80/80/80/80/88/88/87/73/30/80/81/80/88/87/80/60/60/60/60/61/60/60/60/60/60/60/6   0/80/80/80/80/80/80/80/81/85/80/80/80/80/80/80/80/60/60/60/60/60/60/60/60/60/60/64/6   +h+++++++-9.7-14.8-23.4++-0.4+-6.8-19.1++++-0.4-18.3++-1.3-1.7-15.6-29.0
a末次治疗后的最佳T/C。负值说明肿瘤消退
b肿瘤生长延迟(治疗和对照肿瘤长至500mm3所需时间的差值)
c与未处理动物相比存活时间的增加(以％表示)
d细胞杀伤的对数(总体)
e研究结束时无肿瘤的动物(即没有可见的肿瘤或长期存活)
f与药物相关的死亡
g每个治疗组中最大的平均体重减轻
h正的体重改变(即体重从未低于治疗前的重)
**长时间存活
                                             表II
                             多剂量抗肿瘤活性和毒性参数的总结
  模型   剂量   ％T/Ca       抗肿瘤活性   LCKd   TFe          毒性
  T-Cb   ％ILSc   DRDf   MWLg
  MX-1(q3dx4)NCTEF-006MX-1(q7dx3)NCTEF-009LX-1(q7dx3)NCTEF-007LX-1(q7dx3)NCTEF-011   游离游离游离TCSTCSTCSTCS游离游离TCSTCS游离游离TCSTCSTCS游离游离TCSTCS   1.252.5100.51.252.5551051010301.252.5510307.50.75   553027-15-100-100-1005861-100-100405163-55289NDi27   2.05.02.523.5******1.82.0**NDi2.020.910.823.230.24.425NDi11.2   205552157******27NDi**NDi215854791004172NDi50   0.170.420.211.960.150.141.530.791.702.22   0/60/61/61/66/66/66/60/60/66/66/60/60/60/60/60/60/60/60/60/6   0/60/60/60/60/60/60/60/60/60/66/60/60/60/60/60/60/62/66/60/6   +h++-0.3-1.0-11.5-20.0+-0.8-7.6-29.0-6.2-8.8-7.7-7.3-10.5-3.6-16.4＞-30-1.3
a末次治疗后的最佳T/C。负值说明肿瘤消退
b肿瘤生长延迟(治疗和对照肿瘤长至500mm3所需时间的差值)
c与未处理动物相比存活时间的增加(以％表示)
d细胞杀伤的对数(总体)
e研究结束时无肿瘤的动物(即没有可见的肿瘤或长期存活)
f与药物相关的死亡
g每个治疗组中最大的平均体重减轻
h正的体重改变(即体重从未低于治疗前的体重)
i未测确定；脂质体包裹组中毒死亡
**“治愈”；60天后没有可见的肿瘤
                                    表III
                  关于毒性和抗肿瘤活性参数的定义和公式
DRD与药物相关的死亡。如果动物在末次用药物治疗后的15天内死亡或安乐死并且其肿瘤的重量小于对照小鼠的致死负荷，或者其体重减少超过对照动物20％，则其死亡被认为是与药物有关的。
GI50造成体内细胞群50％生长抑制的药物浓度。NCI重新定义了GI50参数以强调对零时间细胞数的校正。因此，公式是：
                GI50＝(T-T0)/(C-T0)×100＝50
T和T0分别是48小时和0小时时的光密度；C是0小时时对照(细胞数)的光密度。
％ILS存活时间的增加(以百分比表示)。对于存活期模型，这是用治疗(T治疗)和对照(T对照)动物的存活时间中位值根据以下公式计算的：
              (T治疗-T对照)/T对照×100
对实体瘤模型，肿瘤达到2000mm3(约占体重的10％)的时间被用作伦理上的终止点，而不用存活时间中位值。
LCK细胞杀伤对数(总体)。这个参数根据以下公式估算了以log10为单位的治疗终点被杀死的细胞的数目：
              (T-C)×0.301/倍增时间的中位值
净细胞杀伤对数可以按照以下公式，从肿瘤生长延迟(T-C)参数中减去治疗时间来计算：
           [(T-C)-治疗时间]×0.301/倍增时间的中位值
细胞杀伤对数为0说明治疗终点时的细胞群与治疗开始时是一样的。然而，细胞杀伤对数为4，例如，说明最初的细胞群减少了99.99％。
MBWL最大体重减少(以百分数表示)。在第一次施用药物之前称量动物的体重(Wi)，并在研究过程中每天称重(Wd)。体重变化的百分数是用以下公式计算的：
                 MBWL＝(Wd-Wi)/Wi×100
MED最小有效剂量。这是一个有些随意的参数。对于这些研究，我们将MED定义为使最佳％T/C≤40(对于实体瘤模型)或使％ILS在40-60％(对于存活期模型)的最小剂量。
MTD最大耐受剂量。使MBWL≤20％的药物剂量。
％T/C第一疗程后得到的治疗肿瘤和对照肿瘤的最佳比值。这些值是从各个观察日的肿瘤重量中减去治疗第一天肿瘤重量的中位值(Ti或Ci)得到的，公式如下：
         ％T/C＝(ΔT/ΔC)×100，其中ΔT＞0，或是
         ％T/C＝(ΔT/Ti)×100，其中ΔT＜0
根据NCI的活性标准，采用了以下评分系统(Plowman等，Human tumorxenograft models in NCI drug development.见“Anticancer DrugDevelopment Guide：Preclinical Screening，Clinical Trials，andApproval”(B.Teicher编)，Humana出版公司，Totowa(1997)[22]：
0＝无活性，％T/C＞40
          1＝肿瘤抑制，％T/C从1至40
          2＝肿瘤停滞，％T/C从0至-40
          3＝肿瘤消退，％T/C从-50至-100
          4＝％T/C从-50至-100并有＞30％的小鼠无肿瘤
TGI肿瘤生长延迟(也以T-C表示)。这个参数表示了治疗肿瘤和对照肿瘤达到任意大小(通常是500或1000mm3)所需时间的差(以天表示)。
TI治疗指数。治疗指数是毒性参数(即LD50、LD10、MTD)与生物学活性参数(即D50-在50％的治疗组中造成所定义的生物反应的剂量)的比例。通常，TI描述了药物的安全界限。对动物模型研究，它通常是用以下公式描述的：
                       TI＝LD50/ED50
然而，由于在伦理学上从未允许进行LD50研究，我们用以下公式定义这些研究的治疗指数：
                       TI＝MTD/MED
应该理解的是，上述描述是为了阐述而不是限制。对那些精通这一技术领域的技术人员而言，通过阅读上述描述，有许多实施方案都是显而易见的。因此，本发明的范围不能参考上述描述确定，而应该由所附的权利要求，以及与此权利要求所要求的范围等价的全部范围来确定。所提到的所有的文献和参考资料，包括专利申请和公开，出于所有目的，在此全文并入以供参考。

Claims (12)

1.一种脂质体制剂，所述脂质体制剂含有：
a)一种抗肿瘤药物；以及
b)一种含有游离抗肿瘤药物和沉淀的抗肿瘤药物的脂质体，其中，所述脂质体中沉淀的抗肿瘤药物至少占全部抗肿瘤药物的50％；其中所述的脂质体包含鞘磷脂和胆固醇，所述抗肿瘤药物与脂类的比例为0.005-1∶1(w/w)，所述抗肿瘤药物是喜树碱，选自：伊立替康、托泊替康、9-氨基喜树碱、10，11-亚甲二氧基喜树碱、9-硝基喜树碱、二盐酸6-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-3-羟基-7H-茚并[2，1-c]喹啉-7-酮、7-(4-甲基-哌嗪基-亚甲基)-10，11-亚乙二氧基-20(S)-喜树碱和7-(2-N-异丙胺基)乙基-20(S)-喜树碱。
2.如权利要求1所述的脂质体制剂，其中所述的喜树碱是托泊替康。
3.一种脂质体制剂，含有：
a)一种抗肿瘤药物；以及
b)一种含有游离抗肿瘤药物和沉淀的抗肿瘤药物的脂质体，其中，所述脂质体中沉淀的抗肿瘤药物至少占全部抗肿瘤药物的50％；其中所述的脂质体包含鞘磷脂和胆固醇，所述抗肿瘤药物与脂类的比例为0.005-1∶1(w/w)，所述的抗肿瘤药物是长春瑞宾。
4.如权利要求1或3所述的脂质体制剂，其中，所述药物与所述脂类的比例为0.05-0.9∶1(w/w)。
5.如权利要求4所述的脂质体制剂，其中，所述抗肿瘤药物与所述脂类的比例为0.1-0.5∶1(w/w)。
6.如权利要求1或3所述的脂质体制剂，其中所述的脂质体所含鞘磷脂和胆固醇的比例为55∶45。
7.如权利要求1或3所述的脂质体制剂，它进一步含有没有包裹抗肿瘤药物的脂质体。
8.如权利要求7所述的脂质体制剂，其中，含有药物抗肿瘤的脂质体与没有包裹药物的脂质体的比例从1∶0.5至1∶1000。
9.如权利要求8所述的脂质体制剂，其中，含有抗肿瘤药物的脂质体与没有包裹药物的脂质体的比例从1∶1至1∶100。
10.如权利要求9所述的脂质体制剂，其中，含有抗肿瘤药物的脂质体与没有包裹药物的脂质体的比例从1∶2至1∶10。
11.如权利要求10所述的脂质体制剂，其中，含有抗肿瘤药物的脂质体与没有包裹药物的脂质体的比例从1∶3至1∶5。
12.权利要求1或3所述制剂用于制造抗癌药物的用途。
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