DE69634084T2 - Herstellung von lipid-nukleinsäure partikeln duch ein hydrophobische lipid-nukleinsäuree komplexe zwischenprodukt und zur verwendung in der gentransfer - Google Patents

Herstellung von lipid-nukleinsäure partikeln duch ein hydrophobische lipid-nukleinsäuree komplexe zwischenprodukt und zur verwendung in der gentransfer Download PDF

Info

Publication number
DE69634084T2
DE69634084T2 DE69634084T DE69634084T DE69634084T2 DE 69634084 T2 DE69634084 T2 DE 69634084T2 DE 69634084 T DE69634084 T DE 69634084T DE 69634084 T DE69634084 T DE 69634084T DE 69634084 T2 DE69634084 T2 DE 69634084T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
lipid
nucleic acid
plasmid
particle
particles
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69634084T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69634084D1 (de
Inventor
J. Jeffery WHEELER
B. Marcel BALLY
Yuan-Peng Zhang
L. Dorothy REIMER
Michael Hope
R. Pieter CULLIS
Peter Scherrer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA, VANCOUVER, BRI, CA
Arbutus Biopharma Corp
Original Assignee
Inex Pharmaceuticals Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/485,458 external-priority patent/US5705385A/en
Priority claimed from US08/484,282 external-priority patent/US5981501A/en
Application filed by Inex Pharmaceuticals Corp filed Critical Inex Pharmaceuticals Corp
Publication of DE69634084D1 publication Critical patent/DE69634084D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69634084T2 publication Critical patent/DE69634084T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft Lipid-Nucleinsäure-Teilchen, die für die Einführung von Nucleinsäuren in Zellen brauchbar sind, und Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung. Die Erfindung schafft ein im Blutkreislauf stabiles, charakterisierbares Abgabevehikel für die Einführung von Plasmiden oder Antisens-Verbindungen in Zellen. Diese Vehikel sind sicher, stabil und praktisch für eine klinische Verwendung.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Ein Gentransfer in genetisch geschädigte Wirtszellen, um die genetischen Schäden zu korrigieren, hat ein gewaltiges Potenzial für das erfolgreiche Behandeln einer Reihe von bislang nicht behandelbaren medizinischen Zuständen. Es gibt derzeit sechs nicht-virale Hauptverfahren, durch die Gene in Wirtszellen eingeführt werden: (i) direkte Mikroinjektion, (ii) Calciumphosphatfällung, (iii) DEAE-Dextran-Komplexe, (iv) Elektroporation, (v) Komplexe kationischer Lipide und (vi) rekonstituierte Viren und Virosomen (siehe Chang et al., Focus, 10: 88 (1988)).
  • Die meisten berichteten Beispiele für einen Gentransfer wurden in vitro durchgeführt. Der In-vivo-Gentransfer wird durch Serum-Wechselwirkungen, Immun-Clearance, enzymatischen Abbau der Gene, Toxizität und biologische Verteilung verkompliziert. Bei einer In-vivo-Verabreichung ist eine Selektion nicht möglich, und es ist eine angemessen hohe Transformationshäufigkeit erforderlich, um eine ausreichende Expression zu erreichen, um ein defektes endogenes Gen zu ersetzen.
  • Die In-vivo-Gentransferverfahren, die sich in der klinischen Prüfung befinden, bestehen fast vollständig aus viralen Vektoren. Obgleich virale Vektoren die ihnen eigene Fähigkeit haben, Nucleinsäuren durch Zellmembranen zu transportieren, und einige exogene DNA in die Chromosomen integrieren können, können sie nur begrenzte Mengen an DNA tragen. Zudem wirft ihre Verwendung erhebliche Risiken auf. Ein solches Risiko besteht darin, dass sich der virale Vektor entweder durch Mutation oder genetischen Austausch mit einem Wildtyp-Virus in einen pathogenen Genotyp zurückverwandeln kann.
  • In Anbetracht dieser Grenzen und Risiken wurden alternative Gentransferverfahren auf nicht-viraler Basis entwickelt. Bei diesen Verfahren werden oft Plasmid-Vektoren, die kleine kreisförmige DNA-Sequenzen sind, als Vektoren zur DNA-Abgabe verwendet. Jedoch besitzen die meisten Plasmide die für eine intrazelluläre Abgabe erforderlichen Eigenschaften nicht, und daher werden anspruchsvolle Abgabesysteme benötigt.
  • Komplexe kationischer Lipide sind derzeit das am besten wirksame, allgemein verwendete Mittel zum Einführen nicht-viraler Nucleinsäuren in Zellen. Eine Anzahl verschiedener, kationische Lipide enthaltender Formulierungen sind handelsüblich erhältlich. Diese umfassen: (i) LIPOFECTIN® (in dem 1,2-Dioleyloxy-3-(N,N,N-trimethylamino)propanchlorid oder DOTMA verwendet wird, siehe Eppstein et al., US-Patent Nr. 4.897.355) und LIPOFECTAMIN® (in dem DOSPA verwendet wird, siehe Hawley-Nelson et al., Focus 15(3): 73 (1993)) und LIPOFECTACE® (in dem N,N-Distearyl-N,N-dimethylammoniumbromid oder DDAB verwendet wird, siehe Rose, US-Patent Nr. 5.279.833). Andere haben über alternative kationische Lipide berichtet, die im Wesentlichen in gleicher Weise arbeiten, aber mit unterschiedlichen Wirksamkeiten, beispielsweise 1,2-Dioleoyloxy-3- Dioleoyloxy-3-(N,N,N-trimethylamino)propanchlorid oder DOTAP (siehe Stromatatos et al., Biochemistry 27: 3917–3925 (1988)), Lipide auf Glycerinbasis (siehe Leventis et al., Biochem. Biophys. Acta 1023: 124 (1990)), Lipopolyamine (siehe Behr et al., US-Patent Nr. 5.171.678) und Lipide auf Cholesterinbasis (siehe Epand et al., WO 93/05162 und US-Patent Nr. 5.283.185). Es wurde berichtet, dass DOTMA und verwandte Verbindungen in Gentransferassays erheblich aktiver als ihre gesättigten Analoga sind (siehe Felgner et al., WO 91/16024). Jedoch sind Formulierungen auf Basis sowohl von DOTMA als auch von DOSPA trotz ihrer Wirksamkeit bei der Ausführung des Gentransfers untragbar teuer. DDAB ist andererseits nicht teuer und von Chemikalienlieferanten leicht erhältlich, aber es ist in den meisten Zelllinien weniger wirksam als DOTMA. Ein anderer Nachteil der derzeitigen Lipidsysteme besteht darin, dass sie für eine intravenöse Injektion nicht geeignet sind.
  • Beim Gentransfer verwendete Vektoren auf Lipidbasis wurden im Allgemeinen auf eine von zwei Arten formuliert. Bei einem Verfahren wird die Nucleinsäure in vorab gebildete Liposomen eingeführt, die aus einem Gemisch kanonischer Lipide und neutraler Lipide hergestellt sind. Die so geformten Komplexe haben undefinierte und komplizierte Strukturen und die Lipofektionswirksamkeit wird durch die Gegenwart von Serum stark reduziert. Ein zweites Verfahren umfasst die Bildung von DNA-Komplexen mit mono- oder polykationischen Lipiden ohne die Gegenwart eines neutralen Lipids. Diese Komplexe werden oft in der Gegenwart von Ethanol hergestellt und sind in Wasser nicht stabil. Zusätzlich werden diese Komplexe durch Serum ungünstig beeinflusst (siehe Behr, Acc. Chem. Res. 26: 274–78 (1993)).
  • Eine Untersuchung der Beziehung zwischen der chemischen Struktur des Trägervehikels und seiner Gentransfer-Wirksamkeit hat gezeigt, dass die Eigenschaften, die für einen wirksamen Gentransfer sorgen, einen Träger im Blutkreislauf instabil machen würden (siehe Ballas et al., Biochem. Biophys. Acta 939: 8–18 (1988)). Zusätzlich bleibt der Abbau entweder außerhalb oder innerhalb der Zielzelle ein Problem (siehe Duzghines, Subcellular Biochemistry 11: 195–286 (1985)). Andere, die versucht haben, DNA in Formulierungen auf Lipidbasis einzuschließen, haben diese Probleme nicht gelöst (siehe Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980); Deamer, US-Patent Nr. 4.515.736 und Legendere, Pharm. Res. 9: 1235–1242 (1992)).
  • Die WO-A-93/12756 offenbart die Herstellung von Komplexen aus kationischem Lipidträger und Nucleinsäure durch Zugabe des Nucleinsäurematerials zu einer Suspension aus vorab gebildeten, mehrschichtigen oder einschichtigen Vesikeln gerade nachdem die Lipidträger hergestellt wurden.
  • Die WO-A-95/02698 offenbart Zusammensetzungen aus kationischen Lipiden und viralen Komponenten. Es wird erwähnt, dass die Nucleinsäure einem vorab gebildeten kationischen Lipidaggregat zugegeben werden kann oder dass die Nucleinsäure vor einer Aggregatbildung mit dem Lipid zusammengegeben werden kann. Es wird behauptet, dass die Nucleinsäure mit der äußeren Oberfläche der kationischen Liposomen oder Vesikel einen Komplex bilden kann, oder dass alternativ die Nucleinsäure in die Liposomen oder Vesikel eingeschlossen werden kann.
  • Die US-A-5.279.833 beschreibt ein neutrales Lipid und ein kationisches Lipid aufweisende Liposomen zum Einführen einer Nucleinsäure in eine Zelle. Die Nucleinsäure-Liposomen werden durch Kontaktieren der Nucleinsäure mit den das neutrale und das kationionische Lipid aufweisenden Liposomen hergestellt. Dieses Verfahren ergibt Liposomen, bei denen die Nucleinsäure an die positiv geladene Oberfläche der Liposomen gebunden ist.
  • Das Journal of Biological Chemistry, Band 269, Nr. 4, S. 2550–2561, 1994 offenbart die Herstellung von Formulierungen kationischer Liposomen und den Transfektionsassay. In diesem Zusammenhang wird beschrieben, dass eine DNA-Lösung einer Formulierung eines kationischen Lipids zugegeben und gemischt wird, um Lipid-DNA-Komplexe zu bilden.
  • Die WO 91/16024 beschreibt Nucleinsäure-Lipid-Teilchen, bei denen eine Aggregatbildung durch das Lysophosphatid verhindert wird.
  • Idealerweise wird ein Abgabevehikel für eine Nucleinsäure oder ein Plasmid die folgenden Eigenschaften aufweisen: a) einfache Herstellung, b) Fähigkeit zum Tragen einer großen Menge DNA pro Teilchen, um einen Gentransfer aller Größen von Genen zu ermöglichen und das Injektionsvolumen zu reduzieren, c) homogen, d) reproduzierbar, e) serumbeständig mit minimalen Serumwechselwirkungen und schützt DNA vor extrazellulärem Abbau, und f) kann Zielzellen auf so eine Weise transfizieren, dass die DNA intrazellulär nicht verdaut wird.
  • Die vorliegende Erfindung schafft solche Zusammensetzungen und Verfahren für ihre Herstellung und Verwendung.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung umfasst neue Lipid-Nucleinsäure-Teilchen und Plasmid-Lipid-Teilchen. Die Erfindung umfasst auch Verfahren zur Herstellung und Verwendung dieser Teilchen.
  • In einigen Ausführungsformen werden die Teilchen durch Bildung hydrophober Zwischenkomplexe in Systemen auf Basis von entweder Detergens oder organischem Lösemittel und anschließendem Entfernen des Detergens oder organischen Lösemittels hergestellt. Bevorzugte Ausführungsformen sind ladungsneutralisiert.
  • In einer Ausführungsform wird ein Plasmid mit kationischen Lipiden in einer Detergenslösung zusammengebracht, um einen beschichteten Plasmid-Lipid-Komplex zu schaffen. Der Komplex wird dann mit nicht-kationischen Lipiden kontaktiert, um eine Lösung von Detergens, einem Plasmid-Lipid-Komplex, nicht kationischen Lipiden und einem Polyethylenglycol-Lipid-Konjugat zu schaffen, und das Detergens wird dann entfernt, um eine Lösung von serumbeständigen Plasmid-Lipid-Teilchen zu schaffen, in denen das Plasmid in einer Lipid-Doppelschicht eingeschlossen und vor Abbau geschützt ist. Die so gebildeten Teilchen haben eine Größe von etwa 50–150 nm.
  • Bei einer anderen Ausführungsform werden serumbeständige Plasmid-Lipid-Teilchen gebildet durch Herstellen einer Mischung aus kationischen Lipiden und nicht-kationischen Lipiden und eines Polyethylenglycol-Lipid-Konjugats in einem organischen Lösemittel; Kontaktieren einer wässrigen Plasmid-Lösung mit der Mischung aus kationischen und nicht-kationischen Lipiden, um eine klare Einphasenlösung zu schaffen; und Entfernen des organischen Lösemittels, um eine Suspension von Plasimd-Lipid-Teilchen zu schaffen, in denen das Plasmid in einer Lipid-Doppelschicht eingeschlossen und vor Abbau geschützt ist, und die Teilchen serumbeständig sind und eine Größe von etwa 50–150 nm haben.
  • Eine anderes Verfahren zum Bilden von Lipid-Nucleinsäure-Teilchen umfasst:
    • (a) Kontaktieren von Nucleinsäuren mit einer Lösung von nicht-kationischen Lipiden, eines Polyethylenglycol-Lipid-Konjugats und eines Detergens, um eine Nucleinsäure-Lipid-Mischung zu bilden;
    • (b) Kontaktieren von kationischen Lipiden mit der Nucleinsäure-Lipid-Mischung, um die negative Ladung der Nucleinsäuren zu neutralisieren und eine ladungsneutralisierte Mischung aus Nucleinsäuren und Lipiden zu bilden; und
    • (c) Entfernen des Detergens aus der ladungsneutralisierten Mischung, um die Lipid-Nucleinsäure-Teilchen zu schaffen, in denen die Nucleinsäuren in dem Lipid eingeschlossen und vor Abbau geschützt sind.
  • Ein anderes Verfahren zum Bilden von Lipid-Nucleinsäure-Teilchen umfasst:
    • (a) Kontaktieren einer Menge von kationischen Lipiden mit Nucleinsäuren in einer Lösung, wobei die Lösung etwa 15–35% Wasser und etwa 65–85% organisches Lösemittel enthält und die Menge an kationischen Lipiden ausreicht, um ein +/– Ladungsverhältnis von etwa 0,85 bis etwa 2,0 herzustellen, um einen hydrophoben, ladungsneutralisierten Lipid-Nucleinsäure-Komplex zu bilden;
    • (b) Kontaktieren des hydrophoben, ladungsneutralisierten Lipid-Nucleinsäure-Komplexes in Lösung mit nicht-kationischen Lipiden und einem Polyethylenglycol-Lipid-Konjugat, um eine Lipid-Nucleinsäure-Mischung zu schaffen, und
    • (c) Entfernen der organischen Lösemittel aus der Lipid-Nucleinsäure-Mischung, um Lipid-Nucleinsäure-Teilchen zu schaffen, in denen die Nucleinsäuren in dem Lipid eingeschlossen und vor Abbau geschützt sind
  • Die Lipid-Nucleinsäure-Teilchen der vorliegenden Erfindung sind für die therapeutische Abgabe von Nucleinsäuren brauchbar. Bei einer Ausführungsform werden die Teilchen über ein hydrophobes Lipid-Nucleinsäure- Zwischenprodukt (oder -Komplex) aufgebaut. Nach Entfernung einer solubilisierenden Komponente (d. h. eines Detergens oder eines organischen Lösemittels) wird die Nucleinsäure vor Abbau geschützt. Die somit gebildeten Teilchen sind für eine Verwendung beim intravenösen Nucleinsäuretransfer geeignet, da sie im Blutkreislauf beständig sind und eine Größe aufweisen, die für ein pharmakodynamisches Verhalten erforderlich ist, das zu einem Zugang zu Stellen außerhalb der Blutgefäße und zu Zielzellpopulationen führt.
  • Insbesondere besteht eine Aufgabe dieser Erfindung darin, therapeutische Zusammensetzungen zu schaffen, die in vitro und in vivo für die Behandlung von Erkrankungen verwendet werden können, die die Überproduktion oder Unterproduktion bestimmter Proteine umfassen. Bei diesen Verfahren wird eine Nucleinsäure, die ein gewünschtes Protein kodiert oder die Produktion eines ungewünschten Proteins blockiert, in ein Lipid-Nucleinsäure-Teilchen formuliert, und die Teilchen werden Patienten verabreicht, die eine solche Behandlung benötigen. Alternativ werden Zellen von einem Patienten entfernt, mit den hier beschriebenen Lipid-Nucleinsäure-Teilchen transfiziert und dem Patienten wieder injiziert.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 veranschaulicht einen durch Nucleinsäure-Lipid-Teilchen vermittelten Gentransfer unter Verwendung von „Sandwich"-DNA-Komplexen.
  • 2 veranschaulicht eine Aggregation und Präzipitation, die üblicherweise während des Einfangens großer Nucleinsäuren in Lipid-Komplexen auftritt.
  • 3 stellt eine schematische Darstellung der Herstellung von Plasmid-Lipid-Teilchen gemäß bestimmter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zur Verfügung.
  • 4 veranschaulicht die Wiederfindung von 3H-DNA aus eingeschlossenen Teilchen nach der Phasenumkehr-Herstellung der Teilchen und Extrusion durch einen 400-nm-Filter und einen 200-nm-Filter. Die Lipid-Zusammensetzung ist POPC : DODAC : PEG-Cer-C20. PEG-Cer-C20 wurde konstant bei 10 Mol-% gehalten und POPC und DODAC wurden relativ zueinander verändert. 20 mg Lipid, 50 μg Plasmid (7,5 kbp).
  • 5 veranschaulicht die Wiederfindung von 3H-DNA aus Teilchen, die unter Verwendung eines Phasenumkehr-Verfahrens hergestellt wurden. Die Teilchen wurden durch einen 200-nm-Filter extrudiert und auf einer DEAE-Sepharose-CL-6B-Anionenaustauschsäule eluiert. Die angegebenen Prozent Wiederfindung basieren auf der nach Filtration gewonnenen Menge. Die Lipid-Zusammensetzung ist wie in 4.
  • 6 veranschaulicht die Wiederfindung von 14C-Lipid aus eingeschlossenen Teilchen nach der Phasenumkehr-Herstellung der Teilchen und Extrusion durch einen 400-nm-Filter und einen 200-nm-Filter. Die Lipid-Zusammensetzung ist wie in 4.
  • 7 veranschaulicht die Wiederfindung von 14C-Lipid aus Teilchen, die unter Verwendung eines Phasenumkehr-Verfahrens hergestellt wurden. Die Teilchen wurden durch einen 200-nm-Filter extrudiert und auf einer DEAE-Sepharose-CL-6B-Anionenaustauschsäule eluiert. Die angegebenen Prozent Wiederfindung basieren auf der nach Filtration gewonnenen Menge. Die Lipid-Zusammensetzung ist wie in 4.
  • 8 veranschaulicht die Wirkung der DODAC-Konzentration auf den Einschluss von Plasmid-DNA. Die Einschlusswirksamkeit wurde durch Anionenaustauschchromatographie gemessen. Die Vesikel bestanden aus DOPE, DODAC und 10 Mol-% PEG-Cer-C20 (Symbol) oder EPC, DODAC und 10 Mol-% PEG-Cer-C20 (Symbol). Die Gesamt-Lipid- und -DNA-Konzentrationen betrugen 10 mmol/ml bzw. 50 μg/ml.
  • Die 9A und 9B veranschaulichen die Wirkung von Serumnucleasen auf freie pCMVCAT-DNA, wie durch Säulenchromatographie vor (A) und nach (B) Inkubation in 80% Mäuseserum bestimmt wurde. Freie 3H-DNA (pCMVCAT) wurde auf einer Sepharose-CL-4B-Säule in HBS, pH 7,4 eluiert.
  • 10 veranschaulicht die Wirkung von Serumnucleasen auf eingeschlossene pCMVCAT-DNA (hergestellt mit Phasenumkehr), wie durch Säulenchromatographie bestimmt wurde. Profil einer Sepharose-CL-4B-Säule von eingeschlossenem pCMV-Plasmid, das 30 min in 80% Mäuseserum inkubiert wurde. (A) Externe DNA wurde durch Ionenaustauschchromatographie vor Inkubation in Serum entfernt. (B) Externe DNA wurde vor Inkubation in Serum nicht entfernt. Die Lipid-Zusammensetzung war POPC : DODAC : PEG-Cer-C20. Die Gesamt-Lipid- und -Plasmid-Konzentrationen betrugen 20 μmol/ml und 50 μg/ml vor der Anionenaustauschchromatographie.
  • Die 11A und 11B veranschaulichen die Wirkung von Serumnucleasen auf eingeschlossene pCMVCAT-DNA (hergestellt mittels Detergens-Dialyse), wie durch Säulenchromatographie bestimmt wurde. Profil einer Sepharose-CL-4B-Säule von eingeschlossenem pCMV-Plasmid, das 30 min in 80% Mäuseserum inkubiert wurde. (A) Externe DNA wurde durch Ionenaustauschchromatographie vor Inkubation in Serum entfernt. (B) Externe DNA wurde vor Inkubation in Serum nicht entfernt. Die Lipid-Zusammensetzung war DOPE : DODAC : PEG-Cer-C20 (84 : 6 : 10). Die Gesamt-Lipid- und -Plasmid-Konzentrationen betrugen 10 μmol/ml und 400 μg/ml vor der Anionenaustauschchromatographie.
  • Die 12A und 12B veranschaulichen die Beständigkeit von Plasmid, das mit vorab gebildeten, aus DOPE : DODAC (50 : 50) zusammengesetzten Liposomen komplexiert ist (A) und Plasmid, das in DOPE : DODAC : PEG-Cer-C14-Teilchen eingeschlossen ist (B), gegenüber dem Verdau durch DNase 1. Plasmid-DNA wurde extrahiert und einer PCR (Polymerasekettenreaktion) unterworfen, um sie für eine Sichtbarmachung auf einem Gel zu amplifizieren. Freies Plasmid wurde als Kontrolle verwendet. Spur 1: 1 kb DNA-Marker; Spur 2: negative PCR-Kontrolle (keine DNA); Spur 3: freies Plasmid alleine; Spur 4: freies Plasmid in 0,05% Detergens (Triton X-100); Spur 5: freies Plasmid inkubiert mit DNase 1 in Abwesenheit von Detergens; Spur 6: freies Plasmid inkubiert mit DNase 1 in der Gegenwert von Detergens; Spur 7: komplexiertes (A) oder eingeschlossenes (B) Plasmid alleine; Spur 8: komplexiertes (A) oder eingeschlossenes (B) Plasmid in 0,05% Detergens; Spur 9: komplexiertes (A) oder eingeschlossenes (B) Plasmid inkubiert mit DNase 1 in Abwesenheit von Detergens; Spur 10: komplexiertes (A) oder eingeschlossenes (B) Plasmid inkubiert mit DNase 1 in der Gegenwart von Detergens.
  • 13 veranschaulicht die Wirkung der Plasmid-DNA-Konzentration auf die Einschlusswirksamkeit (Detergens-Dialyse). Die Vesikel waren aus DOPE : DODAC : PEG-Cer (84 : 6 : 10) zusammengesetzt bei einer Lipid-Konzentration von 10 μmol/ml.
  • 14 veranschaulicht die Wirkung der NaCl-Konzentration auf die optimale DODAC-Konzentration für einen Plasmideinfang. Die Lipid- Zusammensetzung war DOPE : DODAC : PEG-Cer-C14 (oder PEG-Cer-C20). PEG-Cer wurde konstant bei 10 Mol-% gehalten. Die Lipid-Gesamtkonzentration war 10 μmol/ml. Die Plasmid-Konzentration war 50 μg/ml.
  • 15 veranschaulicht die Größenverteilung von Plasmid-Lipid-Teilchen, die durch das Detergenz-Dialyse-Verfahren hergestellt wurden (Analyse mit Gewichtung nach Volumen). Die Lipid-Zusammensetzung war DOPE : DODAC : PEG-Cer-C20 (84 : 6 : 10).
  • 16 veranschaulicht die Größenverteilung von Plasmid-Lipid-Teilchen, die durch das Detergenz-Dialyse-Verfahren hergestellt wurden (Analyse mit Gewichtung nach Anzahl). Die Lipid-Zusammensetzung war DOPE : DODAC : PEG-Cer-C20 (84 : 6 : 10).
  • Die 17A und 17B stellen elektronenmikroskopische Aufnahmen von aus DOPE : DODAC : PEG-Cer-C20 zusammengesetzten Liposomen ohne eingeschlossenes Plasmid (A) und den Plasmid-Lipid-Teilchen (B) zur Verfügung. Die kleinen Pfeile kennzeichnen leere Liposomen mit ungefähr 100 nm Durchmesser. Diese werden verglichen mit elektronendichten Teilchen, die von einer Membrandoppelschicht umgeben sind (große Pfeile). Maßbalken = 100 nm.
  • 18 zeigt die Clearance von 3H-DNA und 14C-Lipid aus Teilchen (hergestellt mittels Phasenumkehr-Verfahren) nach Injektion in ICR-Mäuse. Die Figur umfasst als Vergleich freie 3H-DNA nach Injektion. Die Lipid-Zusammensetzung ist POPC : DODAC : PEG-Cer-C20.
  • Die 19A und 19B zeigen die Clearance von 3H-DNA und 14C-Lipid aus Teilchen (hergestellt mittels Detergens-Dialyse-Verfahren) nach Injek tion in ICR-Mäuse. Die Lipid-Zusammensetzungen waren (A) DOPE : DODAC : PEG-Cer-C20 (84 : 6 : 10) und (B) DOPE : DODAC : PEG-Cer-C14 (84 : 6 : 10).
  • 20 zeigt die Ergebnisse eines In-vivo-Gentransfers, der in den Lungen von Mäusen auftritt. Die Lipid-Zusammensetzung ist DOPE : DODAC : PEG-Cer-C20 oder DOPE : DODAC : PEG-Cer-C14 (84 : 6 : 10).
  • 21 zeigt die Ergebnisse eines In-vivo-Gentransfers, der in der Leber von Mäusen auftritt. Die Lipid-Zusammensetzung ist DOPE : DODAC : PEG-Cer-C20 oder DOPE : DODAC : PEG-Cer-C14 (84 : 6 : 10).
  • 22 zeigt die Ergebnisse eines In-vivo-Gentransfers, der in der Milz von Mäusen auftritt. Die Lipid-Zusammensetzung ist DOPE : DODAC : PEG-Cer-C20 oder DOPE : DODAC : PEG-Cer-C14 (84 : 6 : 10).
  • 23 zeigt die Wirkung steigender Mengen von LIPOFECTIN® (DOTMA/DOPE; Molverhältnis 50 : 50) auf die Wiederfindung von β-Gal-Plasmid-DNA in der wässrigen Phase nach Bligh-und-Dyer-Extraktion der Lipid-Nucleinsäure-Komplexe.
  • Die 24A und 24B zeigen die Wirkung von steigenden Mengen von kationischem Lipid auf die Wiederfindung von Plasmid-DNA in der wässrigen (A) und organischen (B) Phase nach Bligh-und-Dyer-Extraktion der Lipid-Nucleinsäure-Komplexe.
  • Die 25A, 25B, 25C und 25D zeigen die Wiederfindung von Plasmid-DNA aus wässrigen (A und C) und organischen (B und D) Fraktionen nach Bligh-und-Dyer-Extraktion und ausgedrückt als Funktion des Ladungsverhältnisses (+/–).
  • Die 26A und 26B veranschaulichen die DNA-Verdichtung durch Poly-L-Lysin und DODAC untersucht durch TO-PRO-1-Farbstoffinterkalation. Der Verdichtungszustand wurde in einer Monophase nach Bligh und Dyer (A) und in 100 mM OGP (B) untersucht.
  • 27 veranschaulicht die Wirkung steigender Mengen von OGP auf die Wiederfindung von Plasmid-DNA aus wässrigen und organischen Phasen nach Bligh-und-Dyer-Extraktion von Lipid-Nucleinsäure-Komplexen (Plasmid/DODAC).
  • 28 zeigt die Wirkungen steigender Mengen von NaCl auf die Wiederfindung von Plasmid-DNA aus der wässrigen Phase nach Bligh-und-Dyer-Extraktion von Lipid-Nucleinsäure-Komplexen.
  • Die 29A und 29B zeigen die Wirkung von Poly-L-Lysin und DODAC auf die elektrophoretische Beweglichkeit von Plasmid-DNA.
  • 30 veranschaulicht einen Ablauf zur Herstellung von Lipid-Nucleinsäure-Teilchen unter Verwendung der Detergens-Dialyse.
  • Die 31A und B sind Balkendiagramme, welche die QELS-Ergebnisse einer typischen aus β-Gal-Plasmid/DODAC/ESM hergestellten Lipid-Nucleinsäure-Komplex-Mischung veranschaulichen.
  • 32 ist ein Balkendiagramm, das die fluoreszenzspektroskopische Bewertung der DNA-Verdichtung in den Lipid-Nucleinsäure-Komplexen unter Verwendung von TO-PRO-1-Farbstoffinterkalation veranschaulicht. Die Ergebnisse zeigen, dass β-Gal-Plasmid in DODAC/ESM verdichtet ist und durch das Lipid vor einer Farbstoffinterkalation geschützt ist, und dass OGP die Verdichtung des Teilchens aufheben kann.
  • 33 zeigt die Ergebnisse der Elektrophorese von DNA, die aus Lipid-Nucleinsäure-Komplexen nach Verdau mit DNase 1 extrahiert wurde. DNA innerhalb des Komplexes ist vor DNase-1-Abbau geschützt während nicht komplexierte DNA nicht geschützt ist.
  • 34 stellt die Ergebnisse der CHO-Zelllipofektion unter Verwendung von β-Gal-Plasmid/DODAC/ESM zur Verfügung, wie durch β-Gal-Enzymaktivität untersucht wurde.
  • Die 35A und B zeigen Änderungen der Probentrübung gemessen durch 90° Lichtstreuung bei 600 nm während der Herstellung von Nucleinsäure-Lipid-Teilchen in der Gegenwart von 100 mM (A) oder 20 mM (B) n-Octyl-β-D-glucopyranose (OGP).
  • 36 zeigt die Solubilisierung von vorab gebildeten DODAC- (
    Figure 00150001
    ) und SM- (
    Figure 00150002
    ) Vesikeln in OGP, wie durch 90° Lichtstreuung gemessen wurde. Die Konzentrationen der verwendeten Lipide waren 200 μM (durchgezogene Linien) und 800 μM (unterbrochene Linien).
  • Die 37A, 37B und 37C zeigen die Teilchengrößenverteilung mit Gewichtung nach Volumen bestimmt durch QELS, das im Modus für die Analyse von Feststoffteilchen betrieben wurde, für eine Nucleinsäure-Lipid-Teilchen-Formulierung, die aus pCMVβ/DODAC/SM (Ladungsverhältnis 2 : 1, Molverhältnis von DODAC/SM 1 : 1) zusammengesetzt und unter Verwendung von 20 mM OGP hergestellt war, vor (
    Figure 00150003
    ) und nach (
    Figure 00150004
    ) Dialyse (A). Dieselbe Nucleinsäure-Lipid-Teilchen-Formulierung nach Dialyse wurde auch durch Elektronenmikroskopie (B, negative Färbung und C, Gefrierbruch) untersucht. Maßbalken = 100 nm:
  • Die 38A und 38B stellen die Agarose-Gelelektrophorese von DNA dar, die aus in 100 mM und 20 mM OGP (Ladungsverhältnis 2 : 1 und SM/DODAC-Verhältnis 1 : 1) hergestellten Formulierungen isoliert wurde, und in der Abwesenheit (A) oder Gegenwart (B) von OGP auf Empfindlichkeit gegenüber DNase 1 geprüft wurde. A: Molekulargewichtsstandards (Spur 1), pCMBβ in der Abwesenheit von zugegebenem Lipid oder DNase 1 (Spur 2), pCMVβ nach Inkubation mit DNase 1 (Spur 3), DNA isoliert aus einer dialysierten Nucleinsäure-Lipid-Teilchen-Formulierung, die unter Verwendung von 100 mM OGP hergestellt wurde, und anschließenden Inkubationen in der Abwesenheit (Spur 4) oder Gegenwart (Spur 5) von DNase 1, und DNA isoliert aus Teilchen, die unter Verwendung von 20 mM OGP hergestellt und dialysiert wurden und anschließenden Inkubationen in der Abwesenheit (Spur 6) und Gegenwart (Spur 7) von DNase 1. Die ersten 3 Spuren in B sind identisch mit denen in A mit der Ausnahme, dass pCMVβ in 20 mM OGP in der Abwesenheit (Spur 2) und Gegenwart (Spur 3) von DNase 1 inkubiert wurde. DNA, die aus einer in 20 mM OGP (vor der Entfernung des Detergens) hergestellten Formulierung isoliert wurde, wurde in der Abwesenheit (Spur 4) und in der Gegenwart (Spur 5) von DNase 1 in 20 mM OGP inkubiert. Der Pfeil zeigt abgebaute DNA an.
  • Die 39A, 39B und 39C zeigen eine In-vitro-Lipofektion von Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO) unter Verwendung von Nucleinsäure-Lipid-Teilchen-Formulierungen, die aus pCMVβ/SM/DODAC (Molverhältnis SM/DODAC 1 : 1 und Ladungsverhältnis von 1 : 1 bis 8 : 1) zusammengesetzt sind und unter Verwendung von 100 mM OGP und anschließender Dialyse hergestellt wurden. (A) Einfluss des Ladungsver hältnisses auf die β-Galactosidase-Lipofektion. (B) Durch Teilchen induzierte Toxizität gemessen durch verminderte β-Galactosidase-Aktivität pro Vertiefung für Formulierungen, die unter Verwendung eines Ladungsverhältnisses von 4: 1 hergestellt wurden. (C) β-Galactosidase-Lipofektion, die mit Nucleinsäure-Lipid-Teilchen erreicht wurde, die unter Verwendung von SM (gefüllter Balken) oder DOPE (schraffierter Balken) als das neutrale Lipid (Ladungsverhältnis 4 : 1 und Molverhältnis von DODAC zu neutralem Lipid 1 : 1) hergestellt wurden.
  • 40 ist ein Modell, das die Zwischenprodukte beschreibt, die an der Entstehung eines neuen Lipid-DNA-Teilchens beteiligt sein können.
  • Die 41A, 41B und 41C veranschaulichen den Einschluss von Plasmid-DNA in ein Lipid-Vesikel durch das Detergens-Dialyse-Verfahren unter Verwendung verschiedener kationischer Lipide.
  • Die 42A, 42B und 42C stellen die Stabilität von Plasmid enthaltenden Vesikeln dar, die mit verschiedenen kanonischen Lipiden hergestellt wurden.
  • 43 stellt den Einschluss von Plasmid-DNA mit dem ionisierbaren Lipid AL-1 (pKa = 6,6) durch das Dialyse-Verfahren dar.
  • Die 44 und 45 zeigen die Stabilität der Plasmid enthaltenden Vesikel, die mit AL-1 bei pH 4,8 hergestellt wurden, und den Schutz der eingefangenen DNA vor Abbau durch Serumnucleasen bei pH 7,5.
  • 46 stellt die Wirkung der PEG-Ceramid-Konzentration auf die Einschlusswirksamkeit durch das Dialyse-Verfahren mit 7,5% DODAC und DOPE dar.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • INHALT
    • I. Glossar
    • II. Allgemeines
    • III. Ausführungsformen der Erfindung
    • A. Lipid-Nucleinsäure-Teilchen und ihre Eigenschaften
    • B. Formulierungsverfahren für Lipid-Nucleinsäure-Teilchen
    • C. Pharmazeutische Zubereitungen
    • D. Verabreichung von Lipid-Nucleinsäure-Teilchen für einen Gentransfer
    • IV. Beispiele
    • V. Schlussfolgerungen
  • I. Glossar
  • Die folgenden Abkürzungen werden hier verwendet: CHO, Ovarialzelllinie des chinesischen Hamsters; B 16, Melanom-Zelllinie der Maus; DC-Chol, 3β-(N-(N',N'-Dimethylaminoethan)carbamoyl)cholesterol (siehe Gao et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 179: 280–285 (1991)); DDAB, N,N-Distearyl-N,N-dimethylammoniumbromid; DMRIE, N-(1,2-Dimyristyloxyprop-3-yl)-N,N-dimethyl-N-hydroxyethylammoniumbromid; DODAC, N,N-Dioleyl-N,N-dimethylammoniumchlorid; DOGS, Diheptadecylamidoglycylspermidin; DOPE, 1,2-sn- cylamidoglycylspermidin; DOPE, 1,2-sn-Dioleoylphosphatidylethanolamin; DOSPA, N-(1-(2,3-Dioleyloxy)propyl)-N-(2-(spermincarboxamido)ethyl)-N,N-dimethylammoniumtrifluoracetat; DOTAP, N-(1-(2,3-dioleoyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammoniumchlorid; DOTMA, N-(1-(2,3-dioleyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammoniumchlorid; EPC, Eier-Phosphatidylcholin; ESM, Eier-Sphingomyelin; RT, Raumtemperatur; TBE, Tris-Borat-EDTA (89 mM in Tris-Borat und 2 mM in EDTA); HEPES, 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure; HBS, mit HEPES gepufferte Salzlösung (150 mM NaCl und 20 mM HEPES); PEG-Cer-C20, 1-O-(2'-(ω-Methoxypolyethylenglycol)succinoyl)-2-N-arachidoylsphingosin; PEG-Cer-C14, 1-O-(2'-(ω-Methoxypolyethylenglycol)succinoyl)-2-N-myristoylsphingosin; PBS, phosphatgepufferte Salzlösung; EGTA, Ethylenbis(oxyethylennitrilo)tetraessigsäure; OGP, n-Octyl-β-D-glycopyranosid (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); POPC, Palmitoyloleoylphosphatidylcholin (Northern Lipids, Vancouver, BC); QELS, quasielastische Lichtstreuung; TBE, 89 mM Tris-Borat mit 2 mM EDTA; und EDTA, Ethylendiamintetraessigsäure (Fisher Sientific, Fair Lawn, NJ).
  • Der Begriff „Acyl" bezieht sich auf ein Radikal, das aus einer organischen Säure durch Entfernen der Hydroxylgruppe hergestellt wurde. Beispiele für Acylradikale umfassen Acetyl, Pentanoyl, Palmitoyl, Stearoyl, Myristoyl, Caproyl und Oleoyl.
  • Wie hier verwendet bezieht sich der Begriff „pharmazeutisch akzeptables Anion" auf Anionen organischer und anorganischer Säuren, die in pharmazeutischen Zubereitungen nicht-toxische Salze bereitstellen. Beispiele solcher Anionen umfassen Chlorid, Bromid, Sulfat, Phosphat, Acetat, Benzoat, Citrat, Glutamat und Lactat. Die Herstellung pharmazeutisch akzeptabler Salze ist in Berge et al., J. Pharm. Sci. 66: 1–19 (1977), das hier durch Bezugnahme eingefügt ist, beschrieben.
  • Der Begriff „Lipid" bezieht sich auf jedes beliebige Fettsäurederivat, das eine solche Doppelschicht bilden kann, dass sich ein hydrophober Teil des Lipidmaterials zur Doppelschicht hin orientiert, während sich ein hydrophiler Teil zur wässrigen Phase hin orientiert. Amphipathische Lipide sind als primäres Strukturelement des Lipidvesikels notwendig. Hydrophile Eigenschaften leiten sich von der Gegenwart von Phosphat-, Carboxyl-, Sulfat-, Amino-, Sulfhydryl-, Nitro- und anderen ähnlichen Gruppen ab. Die Hydrophobizität könnte sich durch den Einbau von Gruppen ergeben, die langkettige gesättigte und ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppen und solche Gruppen einschließen, die durch einen oder mehrere aromatische, cycloaliphatische oder heterocyclische Gruppe(n) substituiert sind, aber nicht darauf eingeschränkt sind. Bevorzugte Lipide sind Phosphoglyceride und Sphingolipide, von denen repräsentative Beispiele Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol, Phosphatidsäure, Palmitoyloleoylphosphatidylcholin, Lysophosphatidylcholin, Lysophosphatidylethanolamin, Dipalmitoylphosphatidylcholin, Dioleoylphosphatidylcholin, Distearoylphosphatidylcholin oder Dilinoleoylphosphatidylcholin einschließen, die verwendet werden können. Andere Verbindungen, die keinen Schwefel aufweisen, wie z. B. die Familien der Sphingolipide und Glycosphingolipide, gehören auch zu der als Lipid bezeichneten Gruppe. Zusätzlich können die vorstehend beschriebenen amphipatischen Lipide mit anderen Lipiden, einschließlich Triglyceriden und Sterolen, gemischt sein.
  • Der Begriff „neutral" bezieht sich auf eine beliebige Anzahl von Lipidspezies, die entweder in einer ungeladenen Form oder einer neutralen zwitterionischen Form vorliegen. Solche Lipide umfassen beispielsweise Diacylphosphatidylcholin, Diacylphosphatidylethanolamin, Ceramid, Sphingomyelin, Cephalin und Cerebroside.
  • Der Begriff "nicht-kationisches Lipid" bezieht sich auf ein beliebiges neutrales Lipid, wie es vorstehend beschrieben ist, sowie auf anionische Lipide. Beispiele für anionische Lipide umfassen Cardiolipin, Diacylphosphatidylserin und Diacylphosphatidsäure.
  • Der Begriff „kationisches Lipid" bezieht sich auf ein beliebiges aus einer Anzahl von Lipidspezies, die eine positive Nettoladung bei physiologischem pH-Wert tragen. Solche Lipide umfassen DODAC, DOTMA, DDAB, DOTAP, DC-Chol und DMRIE, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Zusätzlich sind eine Anzahl handelsüblicher Zubereitungen kationischer Lipide erhältlich, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Diese umfassen beispielsweise LIPOFECTIN® (handelsüblich erhältliche kationische Liposomen, die DOTMA und DOPE aufweisen, von GIBCO/BRL, Grand Island, New York, USA); LIPOFECTAMIN® (handelsüblich erhältliche kanonische Liposomen, die DOSPA und DOPE aufweisen, von GIBCO/BRL); und TRANSFECTAM®(handelsüblich erhältliche kanonische Lipide, die DOGS aufweisen, von Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA).
  • Der Begriff „Nucleinsäure" bezieht sich auf ein Desoxyribonucleotid- oder Ribonucleotidpolymer in entweder einfach- oder doppelsträngiger Form. Soweit nichts anderes definiert ist, wird der Begriff austauschbar mit Gen, DNA, cDNA, RNA und mRNA verwendet. Der Begriff umfasst im Einzelnen Ribozyme, Nucleinsäure-Klonierungs- und/oder Expressionsvektoren, wie z. B. Plasmide, gentechnisch hergestellte Virusgenome, Expressionskassetten und Chromosomen von Säugtierquellen (insbesondere Menschen).
  • Die Begriffe „Gentransfer", „Transfektion" und „Transformation" werden hier austauschbar verwendet und beziehen sich auf die Einführung poly anionischer Materialien, insbesondere von Nucleinsäuren, in Zellen. Der Begriff „Lipofektion" bezieht sich auf die Einführung solcher Materialien unter Verwendung von Komplexen auf Lipidbasis. Die polyanionischen Materialien können in der Form von DNA oder RNA vorliegen, die an Expressionsvektoren gebunden ist, um nach dem Eintritt in die Zelle eine Genexpression zu erleichtern. Somit soll das in der vorliegenden Erfindung verwendete polyanionische Material DNA einschließen, die für Strukturproteine, Rezeptoren und Hormone kodierende Sequenzen sowie Regulatorelemente für die Transkription und Translation (d. h. Promotoren, Verstärker bzw. Enhancer, Terminatoren und Signalsequenzen) und Vektoren aufweist. Verfahren zum Einbau bestimmter Nucleinsäuren in Expressionsvektoren sind Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt, sind aber im Einzelnen beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage), Band 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989) oder Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg. Greene Publishing und Wiley-Interscience, New York (1987), beschrieben, die hier beide durch Bezugnahme eingefügt sind.
  • „Expressionsvektoren", „Klonierungsvektoren" oder „Vektoren" sind Nucleinsäuremoleküle (wie z. B. Plasmide), die sich in einer gewählten Wirtszelle replizieren können. Expressionsvektoren können sich autonom replizieren oder sie können sich replizieren, indem sie in das Genom der Wirtszelle mittels in dem Fachgebiet wohlbekannter Verfahren eingebaut werden. Vektoren, die sich autonom replizieren, werden einen Replikationsursprung oder eine autonom replizierende Sequenz (ARS) haben, die in der (den) gewählten Wirtszelle(n) funktionsfähig ist. Oft ist es wünschenswert, dass ein Vektor in mehr als einer Wirtszelle verwendbar ist, z. B. zum Klonieren und für den Aufbau in E. coli und in einer Säugetierzelle für die Expression.
  • Der Begriff „hydrophob" bezieht sich bei Anwendung auf DNA und DNA-Komplexe auf Komplexe, die im Wesentlichen löslicher in organischen Lösemitteln als in wässrigen Lösungen sind. Im Einzelnen sind hydrophobe DNA und DNA-Komplexe solche, die zumindest zu 50% in organischen Lösemitteln, wie z. B. Chloroform/Methanol-Mischungen löslich sind, bevorzugt zu mehr als 70% löslich sind und bevorzugter zu mehr als 90 % in solchen organischen Lösemitteln löslich sind.
  • II. Allgemeines
  • Gentransfer-Techniken, die die Verwendung von Liposomen umfassen, wurden bereits zuvor in dem Fachgebiet beschrieben (US-Patente 5.049.386; 4.946.787 und 4.897.355). Allgemeine Lipofektionsabläufe sind auch in den folgenden Literaturstellen beschrieben: Behr et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 6982; Demeneix et al. (1991) Int. J. Dev. Biol. 35: 481; Loeffler et al. (1990) J. Neurochem. 54; 1812; Bennett et al. (1992) Mol. Pharmacol. 41: 1023; Bertling et al. (1991) Biotechnol. Appl. Biochem. 13: 390; Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 84: 7413; Felgner und Ringold (1989) Nature 337: 387; Gareis et al. (1991) Cell. Mol. Biol. 37: 191; Jarnagin et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 4205; Jiao et al. (1992) Exp. Neurol. 115: 400; Lim et al. (1991) Circulation 83: 2007; Malone et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 6077; Powell et al. (1992) Eur. J. Vasc. Surg. 6: 130; Strauss und Jaenisch (1992) EMBO J. 11: 417; und Leventis und Silvius (1990) Biochim. Biophys. Acta 1023: 124. Lipofektionsreagenzien werden handelsüblich verkauft (z. B. „Transfectam" und „Lipofectin"). Von kationischen und neutralen Lipiden wird berichtet, dass sie für eine wirksame Lipofektion von Nucleinsäuren einschließlich denen von Felgner (WO 91/17424; WO 91/16024) geeignet sind. Zusätzlich wurde gezeigt, dass eine Kombination neutraler und kationischer Lipide hochwirksam bei der Lipofektion tierischer Zellen ist und ein breites Wirksamkeitsspektrum in einer Reihe von Zelllinien zeigte (Rose et al. (1991) BioTechniques 10: 520). Die vorstehenden Lipofektionsabläufe können für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung angepasst werden.
  • III. Ausführungsformen der Erfindung
  • A. Lipid-Nucleinsäure-Teilchen und ihre Eigenschaften
  • In einem Aspekt schafft die vorliegende Erfindung neue, im Wesentlichen aus kationischen Lipiden, nicht-kationischen Lipiden und Nucleinsäuren bestehende Lipid-Nucleinsäure-Komplexe.
  • 1. Lipid-Komponenten
  • Ein Reihe geeigneter kanonischer Lipide kann in der vorliegenden Erfindung entweder alleine oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen kationischen Lipidspezies oder neutralen Lipidspezies verwendet werden.
  • Kanonische Lipide, die in der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, können beliebige aus einer Anzahl von Lipidspezies sein, die bei physiologischem pH-Wert eine positive Nettoladung tragen, beispielsweise DODAC, DOTMA, DDAB, DOTAP, DOSPA, DOGS, DC-Chol und DMRIE oder deren Kombinationen. Eine Anzahl dieser Lipide und verwandter Analoga, die in der vorliegenden Erfindung auch brauchbar sind, wurden in der ebenfalls anhängigen USSN 08/316.399; den US-Patenten Nr. 5.208.036, 5.264.618, 5.279.833 und 5.283.185 beschrieben, deren Offenbarungen hier durch Bezugnahme eingefügt sind. Zusätzlich ist eine Anzahl handelsüblicher Zubereitungen kanonischer Lipide erhältlich und kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese umfassen beispielsweise LIPOFECTIN® (handelsüblich erhältliche kationische Liposomen, die DOTMA und DOPE aufweisen, von GIBCO/BRL, Grand Island, New York, USA); LIPOFECTAMIN® (handelsüblich erhältliche kationische Liposomen, die DOSPA und DOPE aufweisen, von GIBCO/BRL); und TRANSFECTAM® (handelsüblich erhältliche kationische Liposomen, die DOGS aufweisen, von Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA).
  • Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten, nicht-kationischen Lipide können beliebige aus einer Reihe neutraler, ungeladener, zwitterionischer oder anionischer Lipide sein, die einen stabilen Komplex erzeugen können. Sie sind bevorzugt neutral, obgleich sie alternativ positiv oder negativ geladen sein können. Beispiele für in der vorliegenden Erfindung brauchbare, nicht-kationische Lipide umfassen mit Phospholipiden verwandte Materialien, wie z. B. Lecithin, Phosphatidylethanolamin, Lysolecithin, Lysophosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinosit, Sphingomyelin, Cephalin, Cardiolipin, Phosphatidsäure, Cerebroside, Dicetylphosphat, Dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), Dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), Dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG), Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), Palmitoyloleoylphosphatidylcholin (POPC), Palmitoyloleoylphosphatidylethanolamin (POPE) und Dioleoylphosphatidylethanolamin-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat (DOPE-mal). Zusätzliche, keinen Phosphor enthaltende Lipide sind z. B. Stearylamin, Dodecylamin, Hexadecylamin, Acetylpalmitat, Glycerolricinoleat, Hexadecylstearat, Isopropylmyristat, amphotere Acryl-Polymere, Triethanolaminlaurylsulfat, polyethyloxylierte Alkylarylsulfat-Fettsäureamide, Dioctadecyldimethylammoniumbromid und dergleichen, Diacylphosphatidylcholin, Diacylphosphatidylethanolamin, Ceramid, Sphingomyelin, Cephalin und Cerebroside. Andere Lipide, wie z. B. Lysophosphatidylcholin und Ly sophosphatidylethanolamin können vorliegen. Nicht-kationische Lipide umfassen auch Polymere auf Basis von Polyethylenglycol, wie z. B. PEG 2000, PEG 5000 und Polyethylenglycol, das an Phospholipide oder Ceramide konjugiert ist (bezeichnet als PEG-Cer), wie sie in der ebenfalls anhängigen USSN 08/316.429 beschrieben sind.
  • In bevorzugten Ausführungsformen sind die nicht-kationischen Lipide Diacylphosphatidylcholin (z. B. Dioleoylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin und Dilinoleoylphosphatidylcholin), Diacylphosphatidylethanolamin (z. B. Dioleoylphosphatidylethanolamin und Palmitoyloleoylphosphatidylethanolamin), Ceramid oder Sphingomyelin. Die Acylgruppen in diesen Lipiden sind bevorzugt von Fettsäuren mit C10–C24-Kohlenstoffketten abgeleitete Acylgruppen. Bevorzugter sind die Acylgruppen Lauroyl, Myristoyl, Palmitoyl, Stearoyl oder Oleoyl. In besonders bevorzugten Ausführungsformen wird das nicht-kationische Lipid 1,2-sn-Dioleoylphosphatidylethanolamin oder Eier-Sphingomyelin (ESM) sein.
  • 2. Nucleinsäure-Komponenten
  • Obgleich die Erfindung in den Beispielen unter Bezugnahme auf die Verwendung von Plasmiden beschrieben ist, wird ein Fachmann auf dem Gebiet verstehen, dass die hier beschriebenen Verfahren gleichermaßen auf andere größere Nucleinsäuren oder Oligonucleotide anwendbar ist.
  • Die Nucleinsäuren, die in der vorliegenden Erfindung brauchbar sind (einschließlich sowohl der Komplexe als auch der Teilchen) sind typischerweise Nucleotid-Polymere mit 10 bis 100.000 Nucleotid-Komponenten. Typischerweise sollen die Nucleinsäuren einem Individuum zum Zwecke der Reparatur oder der Verstärkung der Expression eines Zellproteins verabreicht werden. Zusätzlich kann die Nucleinsäure eine Markierung (z. B. eine radioaktive Markierung, eine Fluoreszenz-Markierung oder eine kolorimetrische Markierung) zum Zwecke der Schaffung einer klinischen Diagnose tragen, die sich auf die Gegenwart oder Abwesenheit komplementärer Nucleinsäuren bezieht. Dementsprechend können Nucleinsäuren oder Nucleotidpolymere Polymere von Nucleinsäuren, einschließlich genomischer DNA, cDNA, mRNA oder Oligonucleotiden, die Nucleinsäure-Analoga enthalten, z. B. die in einem Übersichtsartikel von Stein et al., Science 261: 1004–1011 (1993) und in den US-Patenten Nr. 5.264.423 und 5.276.019 beschriebenen Antisens-Derivate sein. Darüber hinaus können die Nucleinsäuren Transkriptions- und Translations-Regulatorsequenzen einschließlich Promotor-Sequenzen und Enhancer-Sequenzen kodieren.
  • Die Nucleotid-Polymere können Einzelstrang-DNA oder -RNA oder Doppelstrang-DNA oder DNA-RNA-Hybride sein. Beispiele für Doppelstrang-DNA umfassen Strukturgene, Gene, die Kontroll- und Terminationsregionen enthalten, und selbstreplizierende Systeme, wie z. B. Plasmid-DNA.
  • Einzelstrang-Nucleinsäuren umfassen Antisens-Oligonucleotide (komplementär zu DNA und RNA), Ribozyme und Triplex-bildende Oligonucleotide. Um die Stabilität zu erhöhen, werden bei einigen Einfachstrang-Nucleinsäuren bevorzugt einige oder alle Nucleotid-Bindungen durch stabile Bindungen substituiert sein, die keine Phosphodiester-Bindungen sind, einschließlich beispielsweise Phosphorthioat-, Phosphordithioat-, Phosphorselenat- oder O-Alkylphosphotriester-Bindungen.
  • Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Nucleinsäuren werden auch solche Nucleinsäuren einschließen, in denen Modifikationen in einer oder mehreren Zuckerkomponenten und/oder in einer oder mehreren der Pyrimidin- oder Purinbasen gemacht wurden. Beispiele für Zuckermodifi kationen umfassen die Ersetzung von einer oder mehreren Hydroxylgruppen durch Halogene, Alkylgruppen, Aminen, Azidogruppen oder funktionalisiert als Ether oder Ester. Zusätzlich kann der gesamte Zucker mit sterisch und elektronisch ähnlichen Strukturen ersetzt werden, einschließlich Aza-Zucker und carbocyclischen Zuckeranaloga. Modifikationen in der Purin- oder Pyrimidinbasen-Komponente umfassen beispielsweise alkylierte Purine und Pyrimidine, acylierte Purine und Pyrimidine oder andere heterocyclische Ersatzstoffe, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind.
  • In den vorliegenden Verfahren können auch mehrere Gensequenzen verwendet werden. Somit können die Sequenzen für unterschiedliche Proteine auf einem Strang oder Plasmid vorliegen. Nicht kodierende Sequenzen können auch in dem Umfang vorliegen, wie sie notwendig sind, um eine geeignete Expression zu erreichen.
  • Die in dem vorliegenden Verfahren verwendeten Nucleinsäuren können aus natürlichen Quellen isoliert sein, von solchen Quellen wie ATCC oder GenBank-Bibliotheken erhalten sein oder durch synthetische Verfahren hergestellt sein. Synthetische Nucleinsäuren können durch eine Reihe von Lösungs- oder Festphasen-Verfahren hergestellt werden. Allgemein ist eine Festphasen-Synthese bevorzugt. Ausführliche Beschreibungen der Vorgehensweisen für eine Festphasen-Synthese von Nucleinsäuren durch Phosphittriester-, Phosphotriester- und H-Phosphonat-Chemie sind in großem Umfang verfügbar. Siehe beispielsweise Itakura, US-Pat. Nr. 4.401.796; Caruthers et al., US-Pat. Nr. 4.458.066 und 4.500.707; Beaucage et al., Tetrahedron Lett., 22: 1859–1862 (1981); Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc., 103: 3185–3191 (1981); Caruthers et al., Genetic Engineering, 4: 1–17 (1982); Iones, Kapitel 2, Atkinson et al., Kapitel 3, und Sproat et al., Kapitel 4, in Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Gait (Hrsg.), IRL Press, Washington D. C. (1984); Froehler et al., Tetrahedron Lett., 27: 469–472 (1986); Froehler et al., Nucleic Acids Res. 14: 5399–5407 (1986); Sinha et al., Tetrahedron Lett. 24: 5843–5846 (1983); und Sinha et al., Nucl. Acids Res. 12: 4539–4557 (1984).
  • a. Vektoren zum Einführen und Exprimieren von Genen in Zellen
  • Ein wichtiger Aspekt dieser Erfindung ist die Verwendung der hier geschaffenen Lipid-Nucleinsäure-Teilchen zum Einführen ausgewählter Gene in Zellen in vitro und anschließender Expression des ausgewählten Gens in der Wirtszelle. Somit umfassen die Nucleinsäuren in den Teilchen konkret Vektoren, die in einer Wirtszelle exprimiert werden können. Promotor, Enhancer, durch Stress oder chemisch regulierte Promotoren, gegen Antibiotika empfindliche oder nahrungsempfindliche Regionen sowie Sequenzen, die therapeutische Proteine kodieren, können, falls erforderlich, enthalten sein.
  • Kurz zusammengefasst wird die Expression natürlicher oder synthetischer Nucleinsäuren typischerweise durch wirkungsschlüssiges Verbinden einer interessierenden Nucleinsäure mit einem Promotor (der entweder konstitutiv oder induzierbar ist), Einbauen des Konstrukts in einen Expressionsvektor und Einführen des Vektors in eine geeignete Wirtszelle erreicht. Typische Vektoren enthalten Transkriptions- und Translations-Terminatoren, Transkriptions- und Translations-Initiationssequenzen und Promotoren, die für die Regulation der Expression der einzelnen Nucleinsäure brauchbar sind. Die Vektoren weisen wahlweise generische Expressionskassetten auf, die mindestens eine unabhängige Terminatorsequenz, Sequenzen, die eine Replikation der Kassette in Eukaryonten oder Prokaryonten oder beiden (z. B. Shuttle-Vektoren bzw. Pendel-Vektoren) erlauben, und Selektionsmarker sowohl für prokaryontische als auch für euka ryontische Systeme enthalten. Die Vektoren sind für eine Replikation und Integration in Prokaryonten, Eukaryonten oder bevorzugt in beiden geeignet. Siehe Giliman und Smith (1979), Gene 8: 81–97; Roberts et al. (1987), Nature 328: 731–734; Berger und Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Band 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al. (1989), MOLECULAR CLONING – A LABORATORY MANUAL (2. Auflage) Band 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, N. Y., (Sambrook); und F. M. Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Hrsg., Current Protocols, ein Gemeinschaftsunternehmen von Greene Publishing Associates, Inc. und John Wiley & Sons, Inc., (1994 Beilage) (Ausubel). Die Produktinformation von Herstellern biologischer Reagenzien und der Versuchsausrüstung stellen auch Informationen zur Verfügung, die bei bekannten biologischen Verfahren nützlich sind. Solche Hersteller umfassen SIGMA chemical company (Saint Louis, MO), R & D Systems (Minneapolis, MN), Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersberg, MD), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Schweiz), und Applied Biosystems (Foster City, CA) sowie viele andere gewerbliche Quellen, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind.
  • Vektoren, an die fremde Nucleinsäuren wirkungsschlüssig gebunden sind, können verwendet werden, um diese Nucleinsäuren in Wirtszellen einzuführen und ihre Replikation und/oder Expression zu vermitteln. „Klonierungsvektoren" sind zum Replizieren und Amplifizieren der fremden Nucleinsäuren und zum Erhalten von Klonen bestimmter fremde Nucleinsäuren enthaltender Vektoren brauchbar. „Expressionsvektoren" vermitteln die Expression der fremden Nucleinsäure. Einige Vektoren sind sowohl Klonierungs- als auch Expressionsvektoren.
  • Im Allgemeinen ist der bestimmte zum Transportieren eines Fremdgens in die Zelle verwendete Vektor nicht besonders kritisch. Ein beliebiger der üblichen für eine Expression in der gewählten Wirtszelle verwendeter Vektor kann verwendet werden.
  • Ein Expressionsvektor weist typischerweise eine eukaryontische Transkriptionseinheit oder „Expressionskassette" auf, die alle die Elemente enthält, die für die Expression exogener Gene in eukaryontischen Zellen erforderlich sind. Eine typische Expressionskassette enthält einen Promotor, der wirkungsschlüssig mit der DNA-Sequenz verbunden ist, die ein gewünschtes Protein und Signale, die für eine wirksame Polyadenylierung des Transkripts erforderlich sind, kodiert.
  • Eukaryontische Promotoren enthalten typischerweise zwei Arten von Erkennungssequenzen, die TATA-Box und stromaufwärts liegende Promotor-Elemente. Die TATA-Box, die 25–30 Basenpaare stromaufwärts von der Initiationsstelle der Transkription liegt, soll an der Steuerung der RNA-Polymerase zum Beginnen der RNA-Synthese beteiligt sein. Die anderen stromaufwärts liegenden Promotorelemente bestimmen die Geschwindigkeit, mit der die Transkription eingeleitet wird.
  • Enhancer-Elemente können die Transkription von gebundenen homologen oder heterologen Promotoren bis zu 1.000fach anregen. Enhancer sind aktiv, wenn sie stromabwärts oder stromaufwärts der Transkriptionsinitiationsstelle eingebaut sind. Manche von Viren abgeleitete Enhancer-Elemente haben einen breiten Wirtebereich und sind in einer Reihe von Geweben aktiv. Beispielsweise ist der frühes-SV40-Gen-Enhancer für viele Zelltypen geeignet. Andere für die vorliegende Erfindung geeignete Enhancer/Promotor-Kombinationen umfassen solche, die sich von Polyoma- Virus, humanem oder Maus-Cytomegalovirus, der langfristigen Wiederholung verschiedener Retroviren, wie z. B. Maus-Leukämievirus, Maus- oder Rous-Sarcomvirus und HIV ableiten. Siehe Enhancers and Eucaryotic Expression, Cold Spring Harbour Press, Cold Spring Harbour, N. Y. 1983.
  • Zusätzlich zu einer Promotor-Sequenz sollte die Expressionskassette auch eine Transkriptions-Terminationssequenz stromabwärts des Strukturgens enthalten, um eine wirksame Termination zu schaffen. Die Terminationsregion kann aus derselben Quelle wie die Promotor-Sequenz oder aus einer anderen Quelle erhalten werden.
  • Wenn die durch das gewählte Strukturgen kodierte mRNA wirksam translatiert werden soll, werden üblicherweise dem Vektorkonstrukt auch Polyadenylierungssequenzen zugefügt. Zwei getrennte Sequenzelements sind für eine genaue und wirksame Polyadenylierung erforderlich: GU- oder U-reiche Sequenzen, die stromabwärts von der Polyadenylierungsstelle angeordnet ist, und eine hochkonservierte Sequenz mit sechs Nucleotiden AAUAAA, die 11–30 Nucleotide stromaufwärts angeordnet sind. Terminations- und Polyadenylierungssignale, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, umfassen die von SV40 abgeleiteten oder eine genomische Teilkopie eines Gens, das bereits auf dem Expressionsvektor vorliegt.
  • Zusätzlich zu den bereits beschriebenen Elementen kann der Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung typischerweise andere spezialisierte Element enthalten, die das Expressionsniveau klonierter Nucleinsäuren erhöhen oder die Identifikation von die transduzierte DNA tragenden Zellen erleichtern sollen. Beispielsweise enthalten eine Anzahl tierischer Viren DNA-Sequenzen, die die extrachromosomale Replikation des Virusgenoms in permissiven Zelltypen fördern. Plasmide, die diese viralen Replikons tragen, werden episomal repliziert, solange die geeigneten Faktoren durch Gene zur Verfügung gestellt werden, die entweder auf dem Plasmid oder in dem Genom der Wirtszelle vorliegen.
  • Die Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung werden typischerweise sowohl prokaryontische Sequenzen enthalten, die das Klonieren des Vektors in Bakterien erleichtern, als auch eine oder mehrere eukaryontische Transkriptionseinheiten, die nur in eukaryontischen Zellen, wie z. B. Säugetierzellen, exprimiert werden. Die prokaryontischen Sequenzen werden bevorzugt so ausgewählt, dass sie die Replikation der DNA in eukaryontischen Zellen nicht stören.
  • Ausgewählte Gene werden normalerweise exprimiert, wenn die DNA-Sequenz funktionstüchtig in einen Vektor eingefügt ist. „Funktionstüchtig bzw. funktionell eingeführt" bedeutet, dass sie in ein zweckmäßiges Leseraster und in einer zweckmäßigen Leseorientierung eingefügt ist und funktionstüchtig mit zweckmäßigen regulatorischen Elementen verbunden ist. Typischerweise wird ein Gen stromabwärts von einem Promotor eingefügt werden und von einem Stoppcodon gefolgt werden, obgleich, falls erwünscht, eine Produktion als Hybridprotein und anschließender Spaltung eingesetzt werden kann.
  • Expressionsvektoren, die regulatorische Elemente aus eukaryontischen Viren, wie z. B. Retroviren enthalten, werden typischerweise verwendet. SV40-Viren umfassen pSVT7 und pMT2. Vom Rinderpapillomvirus abgeleitete Vektoren umfassen pBV-1MTHA und von Epstein-Bar-Virus abgeleitete Vektoren umfassen pHEBO und p2O5. Andere beispielhafte Vektoren umfassen pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, Baculovirus pDSVE, und jeden beliebigen anderen Virus, der eine Expression von Proteinen unter der Leitung des frühen SV-40-Promotors, späten SV-40- Promotors, Metallothionein-Promotors, Brustdrüsentumorvirus-Promotors der Maus, Rous-Sarcomvirus-Promotors, Polyhedrin-Promotors oder anderen Promotoren ermöglicht, die sich für eine Expression in eukaryontischen Zellen wirksam erwiesen haben.
  • Während eine Reihe von Vektoren verwendet werden kann, sollte angemerkt werden, dass virale Vektoren, wie z. B. Retrovirus-Vektoren, zum Modifizieren eukaryontischer Zellen aufgrund der hohen Wirksamkeit, mit der die retroviralen Vektoren Zielzellen transfizieren und sich in das Genom der Zeilzelle integrieren, brauchbar sind. Zusätzlich können die den retroviralen Vektor beherbergenden Retroviren Zellen aus einer großen Vielfalt von Geweben infizieren.
  • Zusätzlich zu den vorstehend erwähnten retroviralen Vektoren können Zellen mit adenoassoziierten viralen Vektoren lipofiziert werden. Siehe z. B. Methods in Enzymology, Band 185, Academic Press, Inc., San Diego, CA (D. V. Goeddel, Hrsg.) (1990) oder M. Krieger (1990), Gene Transfer and Expression – A Laboratory Manual, Stockton Press, New York, NY, und die dort zitierten Literaturstellen. Adenoassoziierte Viren (AAV) benötigen Helferviren, wie z. B. Adenovirus oder Herpesvirus, um eine produktive Infektion zu erreichen. In Abwesenheit von Helfervirusfunktionen integriert sich AAV (ortsspezifisch) in das Genom einer Wirtszelle, aber das integrierte AAV-Genom hat keine pathogene Wirkung. Der Integrationsschritt ermöglicht es dem AAV-Genom, genetisch intakt zu bleiben bis der Wirt den geeigneten Umweltbedingungen (z. B. einem lytischen Helfervirus) ausgesetzt ist, wonach es wieder in den lytischen Lebenszyklus eintritt. Samulski (1993), Current Opinion in Genetic and Development, 3: 74–80 und die darin zitierten Literaturstellen stellen einen Überblick über den AAV-Lebenszyklus zur Verfügung. Siehe auch West et al. (1987), Virology, 160: 38–47; Carter et al. (1989), US-Patent Nr. 4.797.68; Carter et al. (1993), WO 93/24641; Kotin (1994), Human Gene Therapy, 5: 793–801; Muzyczka (1994), J. Clin. Invest., 94: 1351 und Samulski, supra, für einen Überblick über AAV-Vektoren.
  • Plasmide, die für eine Herstellung von rekombinaten Vakziniaviren wie z. B. pGS62 entwickelt wurden (Langford, C. L. et al. (1986), Mol. Cell. Biol., 6: 3191–3199), können auch verwendet werden. Dieses Plasmid besteht aus einer Klonierungsstelle für den Einbau fremder Nucleinsäuren, dem P7.5-Promotor von Vakzinia, um die Synthese der eingefügten Nucleinsäure zu steuern, und dem Vakzinia-TK-Gen, das beide Enden der fremden Nucleinsäure flankiert.
  • Welcher Vektor auch immer verwendet wird, so ist der Vektor im Allgemeinen gentechnisch verändert, sodass er ein interessierendes Gen in exprimierbarer Form enthält. Das bestimmte ausgewählte Gen wird von der beabsichtigten Behandlung abhängen. Beispiele für solche interessierende Gene sind nachstehend im Abschnitt D.3 „Insertion einer funktionellen Genkopie" und in der gesamten Beschreibung beschrieben.
  • Die Vektoren weisen weiterhin üblicherweise auswählbare Marker auf, die zu einer Nucleinsäureamplifikation führen, wie z. B. die Natrium-Kalium-ATPase, Thymidinkinase, Aminoglycosid-Phosphotransferase, Hygromycin-B-Phosphotransferase, Xanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase, CAD (Carbamylphosphat-Synthetase, Aspartat-Transcarbamylase und Dihydroorotase), Adenosin-Deaminase, Dihydrofolat-Reduktase und Asparagin-Synthetase und Ouabain-Selektion. Alternativ sind auch Systeme mit einer Hochleistungsexpression geeignet, die keine Nucleinsäureamplifikation unfassen, wie z. B. die Verwendung eines Bacculovirus-Vektors in Insektenzellen mit der codierenden Sequenz unter der Leitung des Polyhedrin-Promotors oder anderen starken Bacculovirus-Promotoren.
  • Werden andere Nucleinsäuren als Plasmide verwendet, können die Nucleinsäuren Nucleinsäure-Analoga enthalten, beispielsweise die in einem Überblick von Stein et al.. Science 261: 1004–1011 (1993) und in den US-Patenten Nr. 5.264.423 und 5.276.019 beschriebenen Antisens-Derivate.
  • B. Verfahren zur Herstellung der Teilchen
  • In einer Ausführungsform schafft die vorliegende Erfindung Lipid-Nucleinsäure-Teilchen, die über neue hydrophobe Nucleinsäure-Lipid-Zwischenkomplexe hergestellt werden. Die Komplexe sind bevorzugt ladungsneutralisiert. Eine Manipulation dieser Komplexe in Lösemittelsystemen auf Basis entweder von Detergens oder organischem Lösemittel kann zu einer Teilchenbildung führen, bei der die Nucleinsäure geschützt ist.
  • Lipid-Nucleinsäure-Formulierungen können durch Zusammengeben der Nucleinsäure mit einem vorab gebildeten kationischen Liposom (siehe US-Patente Nr. 4.897.355, 5.264.618, 5.279.833 und 5.283.185) gebildet werden. Bei solchen Verfahren wird die Nucleinsäure von der kationischen Oberflächenladung des Liposoms angezogen und von den resultierenden Komplexen wird angenommen, dass sie dem mit Liposomen bedeckten „Sandwich-Typ" angehören. Als Ergebnis bleibt ein Teil der Nucleinsäure oder des Plasmids dem Serum ausgesetzt und kann durch Enzyme, wie z. B. DNase 1 abgebaut werden. Andere haben versucht, die Nucleinsäure oder das Plasmid während der Bildung in das Innere eines Liposoms einzufügen. Diese Verfahren führen in Lösung typischerweise zur Aggregation der kationischen Lipid-Nucleinsäure-Komplexe (siehe 2). Eine passive Aufnahme eines Plasmids in ein vorab gebildetes Liposom hat sich auch nicht als erfolgreich erwiesen. Schließlich haben die Liposom- Plasmid-Komplexe, die gebildet wurden, typischerweise eine Größe von 200 bis 400 nm und werden daher schneller aus dem Blutkreislauf ausgeschieden als Komplexe oder Partikel mit kleinerer Größe.
  • Die vorliegende Erfindung schafft ein Verfahren zur Herstellung serumbeständiger Plasmid-Lipid-Teilchen, in denen das Plasmid in einer Lipiddoppelschicht eingeschlossen und vor Abbau geschützt ist. Zudem sind die in der vorliegenden Erfindung gebildeten Teilchen bevorzugt bei phsiologischem pH-Wert neutral oder negativ geladen. Für In-vivo-Anwendungen sind neutrale Teilchen vorteilhaft während die Teilchen für In-vitro-Anwendungen bevorzugter negativ geladen sind. Dies sorgt für den weiteren Vorteil einer reduzierten Aggregation gegenüber den positiv geladenen Liposom-Formulierungen, in denen eine Nucleinsäure in kationischen Lipiden eingeschlossen sein kann.
  • Die durch die erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Teilchen haben eine Größe von etwa 50 bis etwa 150 nm, wobei eine Mehrheit der Teilchen etwa 65 bis 85 nm groß ist. Die Teilchen können entweder durch ein Detergens-Dialyse-Verfahren oder durch eine Abwandlung eines Phasenumkehr-Verfahrens gebildet werden, bei dem organische Lösemittel verwendet werden, um während dem Mischen der Komponenten eine Einphasenlösung zu schaffen. Ohne durch irgend einen bestimmten Bildungsmechanismus gebunden sein zu wollen, stellt 3 einen Detergens-Dialyse-Weg zur Bildung der Plasmid-Lipid-Teilchen dar. Unter Bezugnahme auf 3 wird ein Plasmid oder eine andere große Nucleinsäure mit einer Detergenslösung kationischer Lipide kontaktiert, um einen beschichteten Plasmid-Komplex zu bilden. Diese beschichteten Plasmide können aggregieren und ausfallen. Jedoch reduziert die Gegenwart eines Detergens diese Aggregation und ermöglicht es den beschichteten Plasmiden, mit überschüssigen Lipiden (typischerweise nicht-kationischen Lipi den) zu reagieren, um Teilchen zu bilden, in denen das Plasmid in einer Lipid-Doppelschicht eingeschlossen ist. Wie vorstehend angemerkt ist, unterscheiden sich diese Teilchen von den klassischeren Liposomen sowohl in der Größe (Liposome sind typischerweise 200–400 nm groß) als auch darin, dass wenig oder kein wässriges Medium in der Lipid-Doppelschicht des Teilchens eingeschlossen ist. Diese vorstehend für die Bildung von Plasmid-Lipid-Teilchen beschriebenen Verfahren unter Verwendung organischer Lösemittel folgen einem ähnlichen Schema.
  • In einigen Ausführungsformen werden die Teilchen unter Verwendung der Detergens-Dialyse gebildet. Somit schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung serumbeständiger Plasmid-Lipid-Teilchen mit folgenden Schritten:
    • (a) Zusammenbringen eines Plasmids mit kationischen Lipiden in einer Detergenslösung, um einen beschichteten Plasmid-Lipid-Komplex zu bilden;
    • (b) Kontaktieren von nicht-kationischen Lipiden mit dem beschichteten Plasmid-Lipid-Komplex, um eine Detergenslösung zu bilden, die einen Plasmid-Lipid-Komplex, nicht-kationische Lipide und ein Polyethylenglycol-Lipid-Konjugat aufweist; und
    • (c) Dialysieren der Detergenslösung von Schritt (b), um eine Lösung serumbeständiger Plasmid-Lipid-Teilchen zu schaffen, in denen das Plasmid in einer Lipid-Doppelschicht eingeschlossen und vor Abbau geschützt ist und die Teilchen serumbeständig sind und eine Größe von etwa 50 bis etwa 150 nm haben.
  • Eine Ausgangslösung beschichteter Plasmid-Lipid-Komplexe wird durch Zusammengeben des Plasmids mit den kationischen Lipiden in einer Detergenslösung gebildet.
  • In diesen Ausführungsformen ist die Detergenslösung bevorzugt eine wässrige Lösung eines neutralen Detergens, das eine kritische Mizellenbildungskonzentration von 15–300 mM, bevorzugter 20–50 mM aufweist. Beispiele für solche geeignete Detergenzien umfassen beispielsweise N,N'-((Octanoylimino)-bis-(trimethylen))-bis-(D-gluconamid) (BIGCHAP); BRIJ 35; Deoxy-BIGCHAP; Dodecylpoly(ethylenglycol)ether; Tween 20; Tween 40; Tween 60; Tween 80; Tween 85; Mega 8; Mega 9; Zwittergent® 3-08; Zwittergent® 3-10; Triton X-405; Hexyl-, Heptyl-, Octyl- und Nonyl-β-D-glucopyranosid und Heptylthioglucopyranosid; wobei Octyl-β-D-glucopyranosid und Tween-20 die am meisten bevorzugten sind. Die Detergenskonzentration in der Detergenslösung beträgt typischerweise etwa 100 mM bis etwa 2 M, bevorzugt etwa 200 mM bis etwa 1,5 M.
  • Die kationischen Lipide und das Plasmid werden typischerweise zusammengegeben, um ein Ladungsverhältnis (+/–) von etwa 1 : 1 bis etwa 20 : 1 herzustellen, bevorzugt in einem Verhältnis von etwa 1 : 1 bis etwa 12 : 1 und bevorzugter in einem Verhältnis von etwa 2 : 1 bis etwa 6 : 1. Zusätzlich wird die Gesamtkonzentration von Plasmid in Lösung typischerweise etwa 25 μg/mL bis etwa 1 mg/mL, bevorzugt etwa 25 μg/mL bis etwa 200 μg/mL und bevorzugter etwa 50 μg/mL bis etwa 100 μg/mL sein. Die Kombination von Plasmiden und kationischen Lipiden in Detergenslösung wird typischerweise bei Raumtemperatur für eine Zeitspanne gehalten, die zum Bilden der beschichteten Komplexe ausreicht. Alternativ können die Plasmide und kationischen Lipide in der Detergenslösung zusammengegeben werden und auf Temperaturen von bis zu etwa 37°C erwärmt werden. Bei Plasmiden, die besonders temperaturempfindlich sind, können die beschichteten Komplexe bei niedrigeren Temperaturen gebildet werden, typischerweise bis hinab zu etwa 4°C.
  • Die Detergenslösung der beschichteten Plasmid-Lipid-Komplexe wird dann mit nicht-kationischen Lipiden kontaktiert, um eine Detergenslösung von Plasmid-Lipid-Komplexen und nicht-kationischen Lipiden zu schaffen. Die nicht-kationischen Lipide, die in diesem Schritt brauchbar sind, umfassen Diacylphosphatidylcholin, Diacylphosphatidylethanolamin, Ceramid, Sphingomyelin, Cephalin, Cardiolipin und Cerebroside. In bevorzugten Ausführungsformen sind die nicht-kationischen Lipide Diacylphosphatidylcholin, Diacylphosphatidylethanolamin, Ceramid oder Sphingomyelin. Die Acylgruppen in diesen Lipiden sind bevorzugt Acylgruppen, die sich von C10-C24-Kohlenstoffketten aufweisenden Fettsäuren ableiten. Bevorzugter sind die Acylgruppen Lauroyl-, Myristoyl-, Palmitoyl-, Stearoyl- oder Oleoylgruppen. In besonders bevorzugten Ausführungsformen wird das nicht-kationische Lipid 1,2-sn-Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE); Palmitoyloleoylphosphatidylcholin (POPC) oder Eier-Phosphatidylcholin (EPC) sein. In den am meisten bevorzugten Ausführungsformen werden die Plasmid-Lipid-Teilchen fusogene Teilchen mit verstärkten Eigenschaften in vivo sein und das nicht-kationische Lipid wird DOPE sein. Das nicht-kationische Lipid wird weiterhin Polymere auf Polyethylenglycol-Basis aufweisen wie z. B. PEG 2000, PEG 5000 und mit Ceramiden konjugiertes Polyethylenglycol, wie in der ebenfalls anhängigen USSN 08/316.429 beschrieben ist.
  • Die in den vorliegenden Verfahren verwendete Menge an nicht-kationischem Lipid beträgt typischerweise etwa 2 bis etwa 20 mg Gesamtlipide auf 50 μg Plasmid. Bevorzugt beträgt die Menge an Gesamtlipid etwa 5 bis etwa 10 mg pro 50 μg Plasmid.
  • Nach Bildung der Detergenslösung von Plasmid-Lipid-Komplexen, einem Polyethylenglycol-Lipid-Konjugat und nicht-kationischen Lipiden wird das Detergens entfernt, bevorzugt durch Dialyse. Die Entfernung des Deter gens führt zur Bildung einer Lipid-Doppelschicht, die das Plasmid umgibt, sodass serumbeständige Plasmid-Lipid-Teilchen geschaffen werden, die eine Größe von etwa 50 nm bis etwa 150 nm aufweisen. Die somit gebildeten Teilchen aggregieren nicht und haben eine optimale Größe, um eine gleichmäßige Teilchengröße zu erreichen.
  • Die serumbeständigen Plasmid-Lipid-Teilchen können durch ein beliebiges der zum Klassieren von Liposomen verfügbaren Verfahren klassiert werden. Das Klassieren kann durchgeführt werden, um einen gewünschten Größenbereich und eine relativ enge Teilchengrößenverteilung zu erreichen.
  • Es sind mehrere Techniken zum Klassieren der Teilchen in eine gewünschte Größe verfügbar. Ein Klassierungsverfahren, das für Liposomen verwendet wird und gleichermaßen für die vorliegenden Teilchen anwendbar ist, ist im US-Patent Nr. 4.737.323 beschrieben. Das Ultraschallbehandeln einer Teilchensuspension entweder durch Behandeln im Ultraschallbad oder mit Sondenultraschall erzeugt eine fortlaufende Größenreduzierung bis hinab zu Partikeln mit einer Größe von weniger als etwa 50 nm. Homogenisierung ist ein anderes Verfahren, das auf Scherenergie beruht, um größere Teilchen zu kleineren zu zerteilen. Bei einem typischen Homogenisierungsvorgang werden Teilchen durch einen Standardemulsionshomogenisator im Kreis geführt, bis ausgewählte Teilchengrößen, typischerweise zwischen etwa 60 und 80 nm beobachtet werden. Bei beiden Verfahren kann die Teilchengrößenverteilung durch herkömmliche Laserstrahl-Teilchengrößendiskriminierung oder QELS überwacht werden.
  • Eine Extrusion der Teilchen durch eine kleinporige Polycarbonatmembran oder eine unsymmetrische Keramikmembran ist auch ein wirksames Verfahren zum Reduzieren der Teilchengröße auf eine relativ gut definierte Größenverteilung. Typischerweise wird die Suspension zyklisch ein oder mehrere Male durch die Membran geführt, bis die gewünschte Teilchengrößenverteilung erreicht ist. Die Teilchen können nacheinander durch Membranen mit immer kleineren Poren extrudiert werden, um eine schrittweise Größenreduzierung zu erreichen.
  • In einer anderen Gruppe von Ausführungsformen schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung von serumbeständigen Plasmid-Lipid-Teilchen, das folgende Schritte umfasst:
    • (a) Herstellen einer Mischung, die kationische Lipide, nicht-kationische Lipide und ein Polyethylenglycol-Lipid-Konjugat in einem organischen Lösemittel enhält;
    • (b) Kontaktieren einer wässrigen Plasmid-Lösung mit der Mischung in Schritt (a), um eine klare Einphasenlösung zu erhalten; und
    • (c) Entfernen des organischen Lösemittels, um eine Suspension von Plasmid-Lipid-Teilchen zu schaffen, in der das Plasmid in einer Lipid-Doppelschicht eingeschlossen und vor Abbau geschützt ist, und die Teilchen serumbeständig sind und eine Größe von etwa 50 bis etwa 150 nm haben.
  • Die Plasmide (oder Nucleinsäuren), kationischen Lipide, nicht-kationischen Lipide und Polyethylenglycol-Lipid-Konjugate, die in dieser Gruppe von Ausführungsformen brauchbar sind, sind die bei den Detergens-Dialyse-Verfahren vorstehend beschriebenen.
  • Die Auswahl eines organischen Lösemittels beinhaltet typischerweise die Berücksichtigung der Lösemittelpolarität und der Leichtigkeit, mit der das Lösemittel in den späteren Stadien der Teilchenbildung entfernt werden kann. Das organische Lösemittel, das auch als Solubilisierungsmittel verwendet wird, liegt in einer Menge vor, die ausreicht, um eine klare Einphasenmischung von Plasmid und Lipiden zu schaffen. Geeignete Lösemittel umfassen Chloroform, Dichlormethan, Diethylether, Cyclohexan, Cyclopentan, Benzol, Toluol, Methanol oder andere aliphatische Alkohole wie z. B. Propanol, Isopropanol, Butanol, tert.-Butanol, iso-Butanol, Pentanol und Hexanol. Kombinationen aus zwei oder mehreren Lösemitteln können in der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden.
  • Das Kontaktieren des Plasmids mit der organischen Lösung kationischer und nicht-kationischer Lipide wird durch Zusammenmischen einer ersten Plasmidlösung, die typischerweise eine wässrige Lösung ist, und einer zweiten organischen Lösung der Lipide erreicht. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird verstehen, dass dieses Mischen durch eine beliebige Anzahl von Verfahren stattfinden kann, beispielsweise durch mechanische Mittel, wie z. B. durch Verwenden von Vortex-Mischern.
  • Nachdem das Plasmid mit der organischen Lösung von Lipiden kontaktiert wurde, wird das organische Lösemittel entfernt, sodass eine wässrige Suspension serumbeständiger Plasmid-Lipid-Teilchen gebildet wird. Die zum Entfernen des organischen Lösemittels verwendeten Verfahren umfassen typischerweise eine Verdampfung bei reduzierten Drücken oder Blasen eines Inertgasstroms (z. B. Stickstoff oder Argon) über die Mischung.
  • Die somit gebildeten serumbeständigen Plasmid-Lipid-Teilchen werden typischerweise eine Größe von etwa 50 nm bis 150 nm haben. Um eine weitere Größenreduzierung oder Größenhomogenität bei den Teilchen zu erreichen, kann wie vorstehend beschrieben eine Klassierung durchgeführt werden.
  • In anderen Ausführungsformen werden die Verfahren weiterhin das Zugeben von Nichtlipid-Polykationen umfassen, die brauchbar sind, um die Transformation von Zellen unter Verwendung der vorliegenden Zusammensetzungen zu bewirken. Beispiele geeigneter Nichtlipid-Polykationen umfassen Hexadimethrinbromid (verkauft unter der Marke POLYBRENE®, von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin, USA) oder andere Salze von Hexadimethrin. Andere geeignete Polykationen umfassen beispielsweise Salze von Poly-L-ornithin, Poly-L-arginin, Poly-L-lysin, Poly-D-lysin, Polyallylamin und Polyethylenimin.
  • In anderen Ausführungsformen können die Polyoxyethylen-Konjugate, die in den Plasmid-Lipid-Teilchen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, durch Kombinieren der konjugierenden Gruppe (d. h. Phosphatidsäure oder Phosphatidylethanolamin) mit einem geeignet funktionalisierten Polyoxyethylen-Derivat hergestellt werden. Beispielsweise kann Phosphatidylethanolamin mit Polyoxyethylen-bis-(p-toluolsulfonat) kombiniert werden, um ein Phosphatidylethanolamnin-Polyoxyethylen-Konjugat zu schaffen. Siehe, Woodle, et al., Biochim. Biophys. Acta 1105: 193–200 (1992).
  • In bestimmten Ausführungsformen kann die Bildung der Lipid-Nucleinsäure-Komplexe entweder in einem Monophasensystem (z. B. einer Monophase nach Bligh und Dyer oder einer ähnlichen Mischung wässriger und organischer Lösemittel) oder in einem Zweiphasensystem mit geeignetem Mischen durchgeführt werden.
  • Wird die Bildung der Komplexe in einem Monophasensystem durchgeführt, sind die kationischen Lipide und die Nucleinsäuren jeweils in einem Volumen der Monophasenmischung gelöst. Das Zusammengeben der beiden Lösungen schafft eine einzige Mischung, in der sich die Komplexe bilden. Alternativ können sich die Komplexe in Zweiphasenmischungen bilden, in denen sich die kationischen Lipide an die Nucleinsäure (die in der wässrigen Phase vorliegt) binden und sie in die organische Phase „ziehen".
  • Ohne an irgendeine bestimmte Bildungstheorie gebunden sein zu wollen stellt 1 ein Modell für die Bindung monokationischer Lipide an DNA zur Verfügung, die zur Bildung eines hydrophoben (organisch löslichen) Lipid-Nucleinsäure-Komplexes führt. In dieser Figur binden sich zuerst kationische Lipide an die DNA, um einen Komplex zu bilden, in dem die DNA nicht verdichtet ist. Dieser Komplex ist in der organischen Phase oder in einer Monophase löslich und die DNA bleibt unverdichtet. Nach Zugabe anderer Lipide und Enfernung von Lösemittel und Hydratisierung bilden die Komplexe Teilchen (nachstehend ausführlicher beschrieben).
  • In einer anderen Ausführungsform schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung von Lipid-Nucleinsäure-Teilchen, das folgende Schritte umfasst:
    • (a) Kontaktieren von Nucleinsäuren mit einer Lösung, die nicht-kationische Lipide, ein Polyethylenglycol-Lipid-Konjugat und ein Detergens enthält, um eine Nucleinsäure-Lipid-Mischung zu bilden.
    • (b) Kontaktieren von kationischen Lipiden mit der Nucleinsäure-Lipid-Mischung, um einen Teil der negativen Ladung der Nucleinsäuren zu neutralisieren und eine ladungsneutralisierte Mischung aus Nucleinsäuren und Lipiden zu bilden; und
    • (c) Entfernen des Detergens aus der ladungsneutralisierten Mischung, um die Lipid-Nucleinsäure-Teilchen zu schaffen, in denen die Nucleinsäuren in dem Lipid eingeschlossen und vor Abbau geschützt sind.
  • Ohne durch einen bestimmten Aspekt der Darstellung; eingeschränkt sein zu wollen, stellt 30 eine Darstellung eines Verfahrens zur Bildung der Teilchen unter Verwendung der Detergens-Dialyse dar. In dieser Figur werden DNA in einer wässrigen Detergens-Lösung (OGP) und nicht-kationische Lipide (ESM) in einer wässrigen Detergens-Lösung zusammengegeben und etwa 30 min reassoziieren gelassen. Eine vorher ultraschallbehandelte Mischung kationischer Lipide (DODAC) in Detergens wird zugegeben und die resultierende Mischung wird 3 Tage dialysiert, um Detergens zu entfernen und dadurch Lipid-Nucleinsäure-Teilchen zu bilden. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird verstehen, dass für die kinetische Bildung solcher Teilchen die Reihenfolge der Zugabe von kationischen Lipiden und nicht-kationischen Lipiden umgekehrt werden kann oder die Lipide gleichzeitig zugegeben werden können. Zusätzlich ist es möglich, die Nucleinsäure mit multivalenten Kationen zu bedecken, sodass sie nun Anionen bindet.
  • In einer Gruppe von Ausführungsformen ist die Lösung von nicht-kationischen Lipiden und Detergens eine wässrige Lösung. Das Kontaktieren der Nucleinsäuren mit der Lösung von nicht-kationischen Lipiden und Detergens wird typischerweise durch Zusammenmischen einer ersten Lösung von Nucleinsäuren und einer zweiten Lösung der Lipide und des Detergens erreicht. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird verstehen, dass dieses Mischen durch eine beliebige Anzahl von Verfahren stattfinden kann, beispielsweise durch mechanische Mittel, wie z. B. durch Verwenden eines Vortex-Mischers. Bevorzugt ist die Nucleinsäure-Lösung auch eine Detergens-Lösung. Die Menge von nicht-kationischem Lipid, die bei dem vorliegenden Verfahren verwendet wird, wird typischerweise auf Basis der verwendeten Menge kationischer Lipide bestimmt und beträgt typischerweise etwa 0,2 bis 5 Mal die Menge an kationischem Lipid, bevorzugt etwa 0,5 bis 2 Mal die Menge an verwendetem kationischem Lipid.
  • Die somit gebildete Nucleinsäure-Lipid-Mischung wird mit kationischen Lipiden kontaktiert, um einen Teil der negativen Ladung zu neutralisieren, die mit den vorliegenden Nucleinsäuren (oder anderen polyanionischen Materialien) verbunden ist. Die verwendete Menge kationischer Lipide wird typischerweise ausreichen, um mindestens 50% der negativen Ladung der Nucleinsäure zu neutralisieren. Bevorzugt wird die negative Ladung zu mindestens 70%, bevorzugter zu mindestens 90% neutralisiert. Kationische Lipide, die in der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, umfassen beispielsweise DODAC, DOTMA, DDAB, DOTAP, DC-Chol und DMRIE. Diese Lipide und verwandte Analoga wurden in der ebenfalls anhängigen USSN 08/316.399, den US-Patenten Nr. 5.208.036, 5.264.618, 5.279.833 und 5.283.185 beschrieben. Zusätzlich sind eine Anzahl handelsüblicher Zubereitungen kationischer Lipide erhältlich und können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese umfassen beispielsweise LIPOFECTIN® (handelsüblich erhältliche kationische Liposomen, die DOTMA und DOPE aufweisen, von GIBCO/BRL, Grand Island, New York, USA); LIPOFECTAMIN® (handelsüblich erhältliche kationische Liposomen, die DOSPA und DOPE aufweisen, von GIBCO/BRL); und TRANSFECTAM® (handelsüblich erhältliche kationische Lipide, die DOGS in Ethanol aufweisen, von Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA).
  • Das Kontaktieren der kationischen Lipide mit der Nucleinsäure-Lipid-Mischung kann durch eine beliebige Anzahl von Techniken erreicht werden, bevorzugt durch Zusammenmischen einer Lösung des kationischen Lipids und einer die Nucleinsäure-Lipid-Mischung enthaltenden Lösung. Beim Mischen der beiden Lösungen (oder Kontaktieren auf eine beliebige andere Weise) wird ein Teil der mit der Nucleinsäure verbundenen negativen Ladung neutralisiert. Nichtsdestotrotz bleibt die Nucleinsäure in einem unverdichteten Zustand und erhält hydrophile Eigenschaften.
  • Nachdem die kationischen Lipide mit der Nucleinsäure-Lipid-Mischung in Kontakt gebracht wurden, wird das Detergens (oder die Kombination aus Detergens und organischem Lösemittel) entfernt, sodass sich die Lipid-Nucleinsäure-Teilchen bilden. Die zur Entfernung des Detergens verwendeten Verfahren werden typischerweise eine Dialyse umfassen. Liegen organische Lösemittel vor, wird die Entfernung typischerweise durch Verdampfen bei reduzierten Drücken oder durch Blasen eines Inertgasstroms (z. B. Stickstoff oder Argon) über das Gemisch erreicht.
  • Die somit gebildeten Teilchen haben typischerweise eine Größe von etwa 100 nm bis mehrere Mikron. Um eine weitere Größenverminderung oder Größenhomogenität der Teilchen zu erreichen, können die Lipid-Nucleinsäure-Teilchen ultraschallbehandelt, filtriert oder anderen Klassierungstechniken unterzogen werden, die bei Liposomen-Formulierungen verwendet werden und Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind.
  • In anderen Ausführungsformen umfassen die Verfahren weiterhin die Zugabe von Nichtlipid-Polykationen, die nützlich sind, um die Lipofektion von Zellen unter Verwendung der vorliegenden Zusammensetzungen zu bewirken. Beispiele geeigneter Nichtlipid-Polykationen umfassen Hexadimethrinbromid (verkauft unter der Marke POLYBRENE® von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin, USA) oder andere Salze von Hexadimethrin. Andere geeignete Polykationen umfassen beispielsweise Salze von Poly-L-ornithin, Poly-L-arginin, Poly-L-lysin, Poly-D-lysin, Polyallylamin und Polyethylenimin. Die Zugabe dieser Salze erfolgt bevorzugt nachdem sich die Teilchen gebildet haben.
  • In einem anderen Aspekt schafft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von Lipid-Nucleinsäure-Teilchen mit folgenden Schritten:
    • (a) Kontaktieren einer Menge von kationischen Lipiden mit Nucleinsäuren in einer Lösung, wobei die Lösung etwa 15–35% Wasser und etwa 65–85% organisches Lösemittel enthält und die Menge an kationischen Lipiden ausreicht, um ein +/– Ladungsverhältnis von etwa 0,85 bis etwa 2,0 herzustellen, um einen hydrophoben, ladungsneutralisierten Lipid-Nucleinsäure-Komplex zu bilden;
    • (b) Kontaktieren des hydrophoben Lipid-Nucleinsäure-Komplexes in Lösung mit nicht-kationischen Lipiden und einem Polyethylenglycol-Lipid-Konjugat, um eine Lipid-Nucleinsäure-Mischung zu schaffen, und
    • (c) Entfernen der organischen Lösemittel aus der Lipid-Nucleinsäure-Mischung, um Lipid-Nucleinsäure-Teilchen zu schaffen, in denen die Nucleinsäuren in dem Lipid eingeschlossen und vor Abbau geschützt sind.
  • Die Nucleinsäuren, nicht-kationischen Lipide, kationischen Lipide, Polyethylenglycol-Lipid-Konjugate und organischen Lösemittel, die bei diesem erfindungsgemäßen Aspekt brauchbar sind, sind die gleichen wie die, die vorstehend für die Verfahren beschrieben sind, bei denen Detergenzien verwendet werden. Bei einer Gruppe von Ausführungsformen ist die Lösung in Schritt (a) eine Monophase. Bei einer anderen Gruppe von Ausführungsformen ist die Lösung in Schritt (a) zweiphasig.
  • In bevorzugten Ausführungsformen sind die kationischen Lipide DODAC, DDAB, DOTMA, DOSPA, DMRIE, DOGS oder deren Kombinationen. In anderen bevorzugten Ausführungsformen sind die nicht-kationischen Lipide ESM, DOPE, Polymere auf Basis von Polyethylenglycol (z. B. PEG 2000, PEG 5000, mit PEG modifizierte Phospholipide oder mit PEG modifizierte Ceramide) oder deren Kombinationen. Bei noch anderen bevorzugten Ausführungsformen sind die organischen Lösemittel Methanol, Chloroform, Methylenchlorid, Ethanol, Diethylether oder deren Kombinationen.
  • Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Nucleinsäure ein Plasmid, das kationische Lipid ist DODAC, DDAB, DOTMA, DOSPA, DMRIE, DOGS oder deren Kombinationen, das nicht-kationische Lipid ist ESM, DOPE, Polymere auf Basis von Polyethylenglycol oder deren Kombinationen und das organische Lösemittel ist Methanol, Chloroform, Methylenchlorid, Ethanol, Diethylether oder deren Kombinationen.
  • Wie vorstehend wird das Kontaktieren der Nucleinsäuren mit den kationischen Lipiden durch Zusammenmischen einer ersten Lösung von Nucleinsäuren und einer zweiten Lösung der Lipide erreicht, bevorzugt durch mechanische Mittel wie z. B. durch Verwendung von Vortex-Mischern. Die resultierende Mischung enthält Komplexe, wie sie vorstehend für einen Aspekt der Erfindung beschrieben sind. Diese Komplexe werden dann durch die Zugabe nicht-kationischer Lipide und die Entfernung des organischen Lösemittels zu Teilchen umgewandelt. Die Zugabe der nicht-kationischen Lipide wird typischerweise einfach durch Zugeben einer Lösung der nicht-kationischen Lipide zu der die Komplexe enthaltenden Mischung erreicht. Eine umgekehrte Zugabe kann auch eingesetzt werden. Die anschließende Entfernung organischer Lösemittel kann durch Verfahren erreicht werden; die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind und ebenfalls vorstehend beschrieben sind.
  • Die Menge nicht-kationischer Lipide, die in diesem erfindungsgemäßen Aspekt verwendet wird, ist typischerweise eine Menge von etwa 0,2 bis etwa 5 Mal die Menge (auf molarer Basis) kationischer Lipide, die verwendet wurde, um den ladungsneutralisierten Lipid-Nucleinsäure-Komplex zu schaffen. Bevorzugt ist die Menge 0,5 bis 2 Mal die Menge verwendeter kationischer Lipide.
  • Bei noch einem anderen Aspekt schafft die vorliegende Erfindung Lipid-Nucleinsäure-Teilchen, die durch die vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt wurden. In diesen Ausführungsformen sind die Lipid-Nucleinsäure-Teilchen entweder in der Nettoladung neutral oder tragen eine Gesamtladung, welche die Teilchen mit einer größeren Genlipofektionsaktivität ausstattet. Bevorzugt ist die Nucleinsäurekomponente der Teilchen eine Nucleinsäure, die ein gewünschtes Protein kodiert oder die Herstellung eines ungewünschten Proteins blockiert. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist die Nucleinsäure ein Plasmid, das nicht-kationische Lipid Eier-Sphingomyelin und das kationische Lipid DODAC.
  • Wie vorstehend angemerkt ist, sind die Lipid-Nucleinsäure-Teilchen für die Lipofektion von Zellen in vitro brauchbar. Dementsprechend schafft die vorliegende Erfindung in noch einem anderen Aspekt ein Verfahren zum Einführen einer Nucleinsäure in eine Zelle mit folgenden Schritten:
    • (a) Herstellen eines Lipid-Nucleinsäure-Teilchens nach den vorstehenden Verfahren; und
    • (b) Kontaktieren der Zelle in vitro mit dem Lipid-Nucleinsäure-Teilchen während einer Zeitspanne, die ausreicht, um die Nucleinsäure in die Zelle einzuführen.
  • Obgleich dies nachstehend ausführlicher erläutert ist, sind bevorzugte Ausführungsformen solche, bei denen das Lipid-Nucleinsäure-Teilchen ein Plasmid, DODAC und ESM aufweist.
  • Anders als Gentherapievektoren auf Basis von Viren, die aufgrund von Größenbeschränkungen für das Verpacken von Virion-Teilchen nur eine relativ kleine nicht-virale Nucleinsäuresequenz in das Virusgenom einbauen können, können die Lipid-Nucleinsäure-Komplexe der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um große (z. B. 50–5.000 Kilobasen) exogene Nucleinsäuren in Zellen zu transferieren. Dieser Aspekt der Lipofektion ist besonders vorteilhaft, da viele Gene, die Ziele für eine Gentherapie sein können, über 100 Kilobasen (z. B. das Gen für das Amyloid-Vorläuferprotein (APP), Chorea-Huntington-Gen) überspannen und für eine Therapie große homologe Zielkonstrukte oder Transgene erforderlich sein können.
  • Zellen können mit einer exogenen Nucleinsäure mit hoher Wirksamkeit und mit einer Zelltyp-Spezifität lipofiziert werden, indem die Zellen mit einem Rezeptor-Erkennungs-Transfektions-Komplex kontaktiert werden, der folgendes umfasst: (1) eine exogene Nucleinsäure, (2) ein Rezeptor-Ligand-Protein („rlp"), das kovalent an ein Polykation gebunden ist, und (3) ein kationisches oder neutrales Lipid. Es wurde herausgefunden, dass eine Kombination eines an ein Polykation gebundenen Rezeptor-Erkennungs-Proteins und eines geeigneten kationischen (oder neutralen) Lipids zum Transfizieren von Nucleinsäuren verwendet werden kann, und dass die Kombination die Zelltyp-Zielspezifität behält, die durch das Rezeptor-Erkennungs-Protein verliehen wird, und auch eine hocheffiziente Transfektion zeigt, die zum Teil durch den Einschluss eines kationischen Lipids, neutralen Lipids oder Lipopolyamins verliehen wird.
  • Die exogene Nucleinsäure ist typischerweise dsDNA, ssDNA, ssRNA, dsRNA; am meisten typischerweise ist die exogene Nucleinsäure dsDNA, wie z. B. eine klonierte DNA-Sequenz in einem Klonierungsvektor, wie z. B. einem Plasmid oder Virusgenom. Mehrere Spezies exogener Nucleinsäuren können in einem Transfektionskomplex kombiniert werden, wie z. B. für eine Cotransfektion unverbundener Nucleinsäure-Sequenzen oder um eine homologe Verschiebung durch Rekombination zu erreichen. Oft kann (können) exogene Nucleinsäure(n) keine autonome Replikation in Zellen durchführen, die den Transfektionskomplex einbauen, und werden ent weder vorübergehend exprimiert oder werden durch homologe Rekombination oder nichthomologe Integration stabil in ein Wirtszellenchromosom integriert. Oft wird mindestens ein wählbarer Marker (z. B. eine neo®-Expressionskassette) in die exogene(n) Nucleinsäure(n) eingeschlossen, um eine Auswahl von Zellen zu erleichtern, welche die exogene(n) Nucleinsäure(n) eingebaut haben. Typischerweise umfasst eine exogene Nucleinsäure ein Strukturgen, das ein Polypeptid kodiert, das in einer Zielzelle exprimiert werden soll, die die exogene Nucleinsäure eingebaut hat, und das Strukturgen ist üblicherweise wirkungsschlüssig mit geeigneten cis-wirkenden regulatorischen Elementen (z. B. Promotor, Enhancer, Polyadenylierungsstelle) verbunden. Wenn auch eine Gentherapie auf einer Reihe von Wegen durchgeführt werden kann, umfasst ein typischer Rezeptor-Erkennungs-Lipofektions-Komplex eine Nucleinsäure, die mindestens eine Transkriptionseinheit umfasst.
  • Die erfindungsgemäßen Lipid-Nucleinsäure-Teilchen können so gestaltet sein, dass sie zusätzlich zu der Nucleinsäurespezies ein Rezeptor-Erkennungsmolekül (rrm), wie z. B. ein Protein, enthalten. Das rrm kann kovalent an das Nucleinsäure-Lipid-Teilchen aufweisende Lipide gebunden sein. Sein Vorhandensein auf dem Teilchen erhöht die Wirksamkeit und Spezifität, mit der das Teilchen mit Zielzellen in Kontakt tritt und in diese eintritt. Beispielsweise ist ein geeignetes rrm ein Nicht-Immunglobulinprotein, dass an einen Rezeptor der Zelloberfläche einer Zielzelle bindet, der die Internalisation eines Transfektionskomplexes vermittelt, der das rrm-Polykation-Konjugat aufweist, beispielsweise durch den Prozess der Endocytose oder Membranfusion. Zusätzliche geeignete rrm-Spezies sind typischerweise natürlich auftretende physiologische Liganden, die einen Polypeptid-Abschnitt aufweisen (z. B. Adhäsionsmoleküle, wie z. B. ICAM-1, ICAM-2, ELAM-1, VCAM-1). Virale Proteine (z. B. Spike-Glycoproteine), die an virale Rezeptoren an eukaryontischen Zellen binden und eine Virus-Internalisation vermitteln, können auch als rrm-Spezies zur Bildung von rrm-Polykation-Konjugaten verwendet werden. Beispiele umfassen auch virale Glycoproteine, die an Rezeptoren der Zelloberfläche binden und zur Internalisierung und/oder Membranfusion führen, und umfassen die gB-, gC-, gD-, gE-, gH- und gI-Virion-Glycoproteine von HSV-1 und gp120 von HIV-1.
  • Fragmente und Analoga natürlich auftretender Proteine können ebenso wie zu voller Länge gereifte Proteine als rrm-Spezies beim Bilden erfindungsgemäßer Transfektionskomplexe verwendet werden. Beispielsweise können Fragmente, Analoga und Fusionsproteine, die einen Teil eines Adhäsionsmoleküls oder Virion-Bindungsproteins aufweisen, das die Bindung an eine Zielzelle vermittelt, als rrm-Spezies verwendet werden ohne andere Teile des natürlich auftretenden Proteins in voller Länge, die für die Zellanbindung und/oder Membranfusion nicht wesentlich sind. Somit kann beispielsweise ein cytoplasmatischer Schwanzpeptidteil eines Virion-Glycoproteins üblicherweise weggelassen werden und das resultierende Protein kann immer noch als geeignetes rrm dienen.
  • Das ausgewählte rrm wird mit dem einzelnen Zielzelltyp variieren. Zum spezifischen Zielen auf Hepatocyten sind Asialoglycoproteine (Galactose-Terminus) als rrm bevorzugt. Beispiele für Asialoglycoproteine umfassen Asialoorosomucoid, Asialofetuin und desialylierte Virionproteine des Bläschenstomatitisvirus. Diese können durch chemische oder enzymatische Desialylierung solcher Glycoproteine gebildet werden, die terminate Sialinsäure-Komponenten und penultimative Galaktose-Komponenten besitzen. Alternativ können rrm-Spezies, die zum Bilden von selektiv auf Hepatocyten zielenden Lipofektionskomplexen geeignet sind, durch Koppeln von Lactose oder anderen Kohlenhydraten mit Galactose-Ende (z. B. Arabinogalactan) an keine Galactose tragende Proteine durch reduktive Lactosa minierung erzeugt werden. Andere nützliche Kohlenhydrate mit Galactose-Ende zum Zielen auf Hepatocyten umfassen Kohlenhydratbäume, die von natürlichen Glycoproteinen erhalten wurden, insbesondere tri- und tetra-Antennenstrukturen, die entweder terminale Galactose-Komponenten enthalten oder die so enzymatisch behandelt werden können, dass sie terminale Glucose-Komponenten freilegen können. Zum Zielen auf Makrophagen, Endothelzellen oder Lymphozyten können rrm-Spezies, die Mannose oder Mannose-6-phosphat aufweisen, oder komplexe Kohlenhydrate, die diese terminalen Kohlenhydratstrukturen aufweisen, verwendet werden.
  • Da auf den Oberflächen von Säugerzellen eine Reihe verschiedener Zelloberflächenrezeptoren existieren, kann ein zellspezifisches Zielen von Nucleinsäuren auf nichthepatische Zellen Lipofektionskomplexe einbeziehen, die verschiedene rrm-Spezies aufweisen. Beispielsweise kann Transferrin als geeigentes rrm zum Bilden von Rezeptor-Erkennungs-Transfektions-Komplexen an Zellen verwendet werden, die Transferrin-Rezeptoren exprimieren. Andere Rezeptor-Liganden, wie z. B. Polypeptid-Hormone (z. B. Wachstumshormone, PDGF, FGF, EGF, Insulin, IL-2, IL-4 usw.) können verwendet werden, um Rezeptor-Erkennungs-Transfektions-Komplexe an Zellen, die den erkennenden Rezeptor exprimieren, zu lokalisieren.
  • Die Nucleinsäure-Lipid-Teilchen können mehrere rrm-Spezies aufweisen. Häufig wird ein Mittel, das Membranfusionsaktivität aufweist (z. B. Influenzavirus-Hämagglutinin, HSV-1, gB und gD), entweder alleine oder in Kombination mit anderen rrm-Spezies, typischerweise mit solchen, die keine Membranfusionsaktivität aufweisen, als rrm zum Bilden von rrm-Polykation-Komplexen verwendet.
  • Diese Transfektionsverfahren umfassen im Allgemeinen folgende Schritte: (1) Bilden eines Nucleinsäure-Lipid-rrm-Teilchens, das im Wesentlichen aus einer exogenen Nucleinsäure, einem Polykation-Konjugat, das im Wesentlichen aus einem Polykation, das an ein Rezeptor-Erkennungs-Molekül gebunden ist, das kein Immunglobulin ist und das ein einen vorbestimmten Zelloberflächenrezeptor bindet, und einer Lipid-Komponente besteht, die im Wesentlichen aus einem neutralen oder kationischen Lipid besteht (das wahlweise ein quartäres Ammonium-Detergens und/oder ein Lipopolyamin umfasst), und (2) Kontaktieren von Zellen, die den vorbestimmten Zelloberflächenrezeptor exprimieren, mit einer Zusammensetzung, die den Rezeptor-Erkennungs-Transfektions-Komplex aufweist, unter physiologischen Transfektionsbedingungen, die eine Aufnahme der exogenen Nucleinsäure in die Zellen erlauben. Bei alternativen Ausführungsformen ist das rrm durch kovalente Bindung an das Polykation gebunden, häufig durch kovalente Bindung durch ein Vernetzungsmittel oder durch Peptidbindung.
  • Die Teilchen-Gesamtladung ist eine wichtige Eigenschaft der Teilchen, da sie die Teilchen-Clearence aus dem Blut beeinflussen kann. Teilchen mit langen Blutkreislauf-Halbwertszeiten sind typischerweise für therapeutische und diagnostische Verwendungen wünschenswert. Beispielsweise sind Teilchen besonders bevorzugt, die 8, 12 oder bis zu 24 Stunden im Blutstrom gehalten werden können. Negativ geladene Liposomen und Teilchen werden typischerweise schneller von dem retikuloendothelialen System aufgenommen (Juliano, Biochem. Biophys. Res. Commun. 63: 651 (1975)) und haben somit kürzere Halbwertszeiten im Blutstrom.
  • C. Pharmazeutische Zubereitungen
  • Die Nucleinsäure-Lipid-Teilchen der vorliegenden Erfindung können entweder alleine oder als Mischung mit einem physiologisch akzeptablen Träger (wie z.B, physiologischer Salzlösung oder Phosphatpuffer) verabreicht werden, der gemäß dem Verabreichungsweg und pharmazeutischer Standardpraxis ausgewählt ist. Im Allgemeinen wird normale Salzlösung als pharmazeutisch akzeptabler Träger ausgewählt. Andere geeignete Träger umfassen z. B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4%ige Salzlösung, 0,3% Glycin und dergleichen einschließlich Glycoproteinen für eine erhöhte Stabilität, wie z. B. Albumin, Lipoprotein, Globulin usw.
  • Der pharmazeutische Träger wird im Allgemeinen nach der Teilchenbildung zugegeben. Somit kann das Teilchen, nachdem das Teilchen gebildet ist, in pharmazeutisch akzeptablen Trägern verdünnt werden, wie z. B. in normaler Salzlösung.
  • Die Teilchenkonzentration in den pharmazeutischen Formulierungen kann breit variieren, d. h. von weniger als etwa 0,05 Gew.-%, üblicherweise bei oder mindestens etwa 2–5 Gew.-% bis hin zu 10 bis 30 Gew.-% und wird hauptsächlich im Hinblick auf Fluidvolumina, Viskositäten usw. gemäß dem einzelnen gewählten Verabreichungsmodus ausgewählt. Beispielweise kann die Konzentration erhöht werden, um die mit der Behandlung verbundene Fluidbelastung zu senken. Dies kann insbesondere bei Patienten wünschenswert sein, die mit Atherosklerose verbundenes kongestives Herzversagen oder starken Bluthochdruck haben. Alternativ können Teilchen, die aus reizenden Lipiden zusammengesetzt sind, auf niedrige Konzentrationen verdünnt werden, um eine Entzündung an der Verabreichungsstelle zu vermindern. Die Zugabe von Polyethylenglycol (PEG), PEG-Ceramid oder modifizierten (z. B. mit Gangliosid GMI modifizierten) Lipiden zu den Teilchen verhindert eine Teilchenaggregation und stellt ein Mittel zur Erhöhung der Blutkreislauf-Lebensdauer und zur Erhöhung der Abgabe der Lipid-Nucleinsäure-Teilchen an die Zielgewebe zur Verfügung. Typischerweise wird die Konzentration des PEG, PEG-Ceramids oder der mit GMI modifizierten Lipide in dem Teilchen etwa 1–15% betragen.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können durch übliche, gut bekannte Sterilisationstechniken sterilisiert werden. Wässrige Lösungen können für eine Verwendung verpackt oder unter aseptischen Bedingungen filtriert und lyophilisiert werden, wobei die lyophilisierte Zubereitung vor der Verabreichung mit einer sterilen wässrigen Lösung zusammengegeben wird. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch akzeptable Hilfssubstanzen enthalten, wie sie erforderlich sind, um sich physiologischen Bedingungen anzunähern, wie z. B. den pH-Wert einstellende und puffernde Mittel, die Tonizität einstellende Mittel und dergleichen, z. B. Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid und Calciumchlorid. Zusätzlich kann die Teilchensuspension Lipid schützende Mittel enthalten, die Lipide bei der Lagerung gegen Schäden durch freie Radikale und Lipid-Peroxidation schützen. Lipophile Quencher für freie Radikale, wie z. B. Alphatocopherol und wasserlösliche, eisenspezifische Komplexbildner, wie z. B. Ferrioxamin, sind geeignet.
  • Bei einem anderen Beispiel ihrer Verwendung können Lipid-Nucleinsäure-Teilchen in einen breiten Bereich topischer Dosierungsformen eingefügt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Gele, Öle, Emulsionen und dergleichen. Beispielsweise kann die die Nucleinsäure-Lipid-Teilchen enthaltende Suspension als topische Cremes, Pasten, Salben, Gele, Lotionen und dergleichen formuliert und verabreicht werden.
  • Die vorliegende Erfindung schafft auch Lipid-Nucleinsäure-Teilchen in Form von Kits. Das Kit wird typischerweise einen Behälter aufweisen, der aufgeteilt ist, um die verschiedenen Elemente des Kits zu halten. Das Kit wird die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten, bevorzugt in dehydratisierter Form, mit Anweisungen für ihre Rehydratisierung und Verabreichung. Bei noch anderen Ausführungsformen werden die Teichen und/oder die die Teilchen aufweisenden Zusammensetzungen eine Zielkomponente aufweisen, die an die Oberfläche des Teilchens gebunden ist. Verfahren zum Anbinden von auf Lipide zielenden Komponenten (z. B. Antikörper, Protein) (wie die in den vorliegenden Teilchen verwendeten) sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt.
  • D. Verabreichung von Lipid-Nucleinsäure-Teilchen-Formulierungen
  • Die serumbeständigen Lipid-Nucleinsäure-Teilchen der vorliegenden Erfindung sind für die Einführung von Nucleinsäuren in Zellen brauchbar. Demgemäß schafft die vorliegende Erfindung auch Verfahren zum Einführen von Nucleinsäuren (z. B. eines Plasmids) in eine Zelle. Die Verfahren werden in vitro ausgeführt, indem zuerst die Teilchen wie vorstehend beschrieben gebildet werden, dann die Teilchen mit den Zellen während einer Zeitspanne kontaktiert werden, die ausreicht, dass eine Transfektion auftritt.
  • Die Nucleinsäure-Lipid-Teilchen der vorliegenden Erfindung können an benahe jeden beliebigen Zelltyp adsorbiert werden, mit dem sie gemischt oder kontaktiert werden. Sobald sie adsorbiert sind, können die Teilchen entweder durch einen Teil der Zellen aufgenommen bzw. endozytosiert werden, mit Zellmembranen Lipide austauschen oder mit den Zellen fusionieren. Ein Transfer oder ein Einbau des Nucleinsäureanteils des Teilchens kann über einen beliebigen dieser Wege stattfinden. Im Einzelnen wird, wenn eine Fusion stattfindet, die Teilchenmembran in die Zell membran integriert und die Inhalte des Teilchens vereinigen sich mit der intrazellulären Flüssigkeit.
  • 1. In-vitro-Gentransfer
  • Für In-vitro-Anwendungen kann die Abgabe von Nucleinsäuren an jede beliebige in Kultur gezüchtete Zelle erfolgen, ob aus pflanzlichem oder tierischem Ursprung, Wirbeltier oder Wirbellosen und von jedem beliebigen Gewebe oder Typ. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Zellen tierische Zellen sein, bevorzugter Säugetierzellen und am meisten bevorzugt menschliche Zellen.
  • Der Kontakt zwischen den Zellen und den Lipid-Nucleinsäure-Teilchen findet, wenn er in vitro durchgeführt wird, in einem biologisch verträglichen Medium statt. Die Konzentration der Teilchen variiert breit in Abhängigkeit von der einzelnen Anwendung, liegt aber im Allgemeinen zwischen etwa 1 μmol und etwa 10 mmol. Eine Behandlung der Zellen mit den Nucleinsäure-Lipid-Teilchen wird im Allgemeinen bei physiologischen Temperaturen (etwa 37°C) für Zeitspannen zwischen etwa 1 bis 48 Stunden, bevorzugt etwa 2 bis 4 Stunden durchgeführt.
  • Bei einer Gruppe bevorzugter Ausführungsformen wird eine Lipid-Nucleinsäure-Teilchen-Suspension 60–80% zusammenfließenden plattierten Zellen zugegeben, die eine Zelldichte von 103 bis etwa 105 Zellen/mL, bevorzugter etwa 2 × 104 Zellen/mL aufweisen. Die Konzentration der den Zellen zugegebenen Suspension beträgt bevorzugt von etwa 0,01 bis 0,2 μg/mL, bevorzugter etwa 0,1 μg/mL.
  • 2. In-vivo-Gentransfer
  • Alternativ können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung auch zum Herstellen einer therapeutischen Zusammensetzung für den In-vivo-Gentransfer verwendet werden, wobei Verfahren verwendet werden, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind. Im Einzelnen ist in Zhou et al., Science 261: 209–211 (1993), das hier durch Bezugnahme eingefügt ist, die intravenöse Abgabe des Cytomegalovirus-(CMV-)Chloramphenicol-Acetyltransferase-(CAT-)Expressionsplasmids unter Verwendung von DOTMA-DOPE-Komplexen beschrieben. In Hyde et al., Nature 362: 250–256 (1993) ist die Abgabe des Gens für das CTFR-Protein (cystc fibrosis transmembrane conductance regulator) an Epithel der Luftwege und an Alveolen der Lunge von Mäusen unter Verwendung von Liposomen beschrieben. In Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 298: 278–281 (1989) ist die In-vivo-Transfektion von Mäuselungen mit einem aktiven prokaryontischen Gen, das das intrazelluläre Enzym Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) kodiert, beschrieben.
  • Für eine In-vivo Verabreichung werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen bevorzugt parenteral, d. h. intraartikulär, intravenös, intraperitoneal, subkutan oder intramuskulär verabreicht. Bevorzugter werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen intravenös oder intraperitoneal durch eine Bolus-Injektion verabreicht. Siehe beispielsweise Stadler et al., US-Patent Nr. 5.286.634. Die intrazelluläre Abgabe von Nucleinsäuren wurde auch in Straubringer et al., METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, New York 101: 512–527 (1983); Mannino et al., Biotechniques 6: 682–690 (1988); Nicolau et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 6: 239–271 (1989) und Behr, Acc. Chem. Res. 26: 274–278 (1993) erläutert. Noch andere Verfahren der Verabreichung von Therapeutika auf Lipidbasis sind beispielsweise in Rahman et al., US-Patent Nr. 3.993.754; Sears, US-Patent Nr. 4.145.410; Papahadjopoulos et al., US-Patent Nr. 4.235.871; Schneider, US-Patent Nr. 4.224.179; Lenk et al., US-Patent Nr. 4.522.803 und Fountain et al., US-Patent Nr. 4.588.578 beschrieben.
  • In bestimmten Ausführungsformen können die pharmazeutischen Zubereitungen mit dem Zielgewebe durch direktes Auftragen der Zubereitung auf das Gewebe kontaktiert werden. Die Auftragung kann durch topische „offene" oder „geschlossene" Vorgehensweisen durchgeführt werden. Mit „topisch" ist die direkte Auftragung der pharmazeutischen Zubereitung auf ein Gewebe gemeint, das der Umgebung ausgesetzt ist, wie z. B. die Haut, der Mundrachenraum, der äußere Gehörgang und dergleichen. „Offene" Vorgehensweisen sind solche Vorgehensweisen, die das Einschneiden der Haut eines Patienten und die direkte Sichtbarmachung des darunter liegenden Gewebes umfassen, auf das die pharmazeutischen Zubereitungen aufgetragen werden. Dies wird im Allgemeinen durch eine chirurgische Vorgehensweise erreicht, wie z. B. Thorakotomie, um zu der Lunge zu gelangen, abdominale Laparotomie, um an die Baucheingeweide zu gelangen, oder ein anderer direkter chirurgischer Zugang zu dem Zielgewebe. „Geschlossene" Vorgehensweisen sind invasive Vorgehensweisen, bei denen die inneren Zielgewebe nicht direkt sichtbar gemacht werden, sondern über Einführungsinstrumente durch kleine Wunden in der Haut Zugang geschaffen wird. Beispielweise können die Zubereitungen durch Nadelspülung in das Bauchfell verabreicht werden. Ebenso können die pharmazeutischen Zubereitungen in die Hirnhäute oder das Rückenmark durch Infusion während einer Lumbalpunktion und anschließender geeigneter Positionierung des Patienten an die Hirnhäute oder das Rückenmark verabreicht werden, wie es üblicherweise für eine Spinalanästhesie oder Metrazamid-Abbildung des Rückenmarks ausgeführt wird. Alternativ können die Zubereitungen durch endoskopische Vorrichtungen verabreicht werden.
  • Die Lipid-Nucleinsäure-Teilchen können auch in einem Aerosol verabreicht werden, das in die Lungen inhaliert wird (siehe Brigham et al., Am. J. Sci. 298(4): 278–281 (1989)) oder durch direkte Injektion an der Erkrankungsstelle (Culver, HUMAN GENE THERAPY, MaryAnn Liebert, Inc., Publishers, New York. S. 70–71 (1994)).
  • Die therapeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können einer Reihe von Wirten verabreicht werden. Bevorzugte Wirte umfassen Säugetierspezies, wie z. B. Menschen, nicht-humane Primaten, Hunde, Katzen, Rindvieh, Pferde, Schafe und dergleichen.
  • Die verabreichte Menge der Teilchen wird von dem Verhältnis von Nucleinsäure zu Lipid, der verwendeten einzelnen Nucleinsäure, dem diagnostizierten Erkrankungszustand, dem Alter, Gewicht und Zustand des Patienten und der Beurteilung des Klinikarztes abhängen, wird aber im Allgemeinen zwischen etwa 0,01 und etwa 50 mg pro Kilogramm Körpergewicht, bevorzugt zwischen etwa 0,1 und etwa 5 mg pro Kilogramm Körpergewicht oder etwa 108–1010 Teilchen pro Injektion liegen.
  • 3. Insertion einer funktionellen Genkopie
  • Einige Gentherapieverfahren dienen der Kompensation eines Defekts in einem endogenen Gen, indem eine funktionelle Kopie des Gens in das Wirtschromosom integriert wird. Das inserierte Gen repliziert sich mit der Wirts-DNA und wird in einer Menge exprimiert, um das defekte Gen auszugleichen. Erkrankungen, die einer Behandlung durch diesen Weg zugänglich sind, sind oft durch rezessive Mutationen gekennzeichnet. Das heißt, dass beide Kopien eines endogenen Gens defekt sein müssen, damit Symptome auftreten. Solche Erkrankungen umfassen Mukoviszidose, Sichelzellenanämie, β-Thalassämie, Phenylketonurie, Galaktosämie, Wil son-Syndrom, Hämochromatose, schwere kombinierte Immundefekt-Erkrankung, alpha-1-Antitrypsin-Mangel, Albinismus, Alkaptonurie, lysosomale Speicherkrankheit, Ehlers-Danlos-Syndrom, Hämophilie, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase-Mangel, Agammaglobulimenie, Diabetes insipidus, Lesch-Nyhan-Syndrom, Muskeldystrophie, Wiskott-Aldrich-Syndrom, Fabry-Syndrom, Fragiles-X-Syndrom und dergleichen. Andere rezessive Mutationen sind in dem Fachgebiet bekannt, und die Verwendung der therapeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zu ihrer Behandlung wird hier in Betracht gezogen.
  • Es gibt mehrere Verfahren zum Einführen eines exogenen funktionellen Gens, um die vorstehenden genetischen Defekte auszugleichen. Bei einem Weg werden Zellen aus einem an der Krankheit leidenden Patienten entfernt und in vitro mit einem Lipid-Vektor-Komplex kontaktiert. Die Zellen sollten aus einem Gewebetyp entfernt werden, in dem sich Krankheitssymptome zeigen. Können sich die Zellen replizieren und enthält der verwendete Vektor einen selektiven Marker, können Zellen selektiert werden, die den Marker aufgenommen und exprimiert haben. Insbesondere wenn keine Selektion durchgeführt wird, ist es wichtig, dass die Häufigkeit des Gentransfers in die Zellen hoch ist, beispielweise mindestens etwa 1, 5, 10, 25 oder 50% der Zellen.
  • Nach Integration des Vektors in das zelluläre Genom und wahlweise Selektion werden die Zellen wieder in den Patienten eingeführt. Bei dieser Anwendung und anderen nachstehend erläuterten (mit Ausnahme stellenspezifischer Rekombination zur Korrektur dominanter Mutationen) ist es nicht notwendig, dass das durch das Lipid-Nucleinsäure-Teilchen gelieferte Gen an die gleiche Stelle abgegeben wird, die von dem defekten Gen besetzt wird, das es ausgleicht.
  • Alternativ kann der Lipid-Vektor-Komplex als pharmazeutische Zusammensetzung direkt in einen Patienten eingeführt werden. Der Komplex wird an das (die) von der genetischen Störung betroffene(n) Gewebe abgegeben, die in einer therapeutisch wirksamen Dosis behandelt werden. Bei diesem und anderen Verfahren ist eine therapeutisch wirksame Dosis eine Menge, die ausreicht, um die Symptome der Erkrankung und ihre Komplikationen zu heilen oder zumindest teilweise aufzuhalten. Wirksame Dosierungen der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung für die Behandlung der vorstehend beschriebenen Zustände werden in Abhängigkeit von vielen verschiedenen Faktoren variieren, einschließlich dem Verabreichungsmittel, der Zielstelle, dem physiologischen Zustand des Patienten und anderen verabreichten Medikamenten. Somit werden Behandlungsdosierungen titriert werden müssen, um die Sicherheit und Wirksamkeit zu optimieren. Dosierungen im Bereich von etwa 10 ng bis 1 g, 100 ng bis 100 mg, 1 μg bis 10 mg oder 30–300 μg DNA pro Pateint sind typisch. Verabreichungswege umfassen den oralen, nasalen, gastrischen, intravenösen, intradermalen und intramuskulären Weg.
  • Die Nucleinsäure-Lipid-Komplexe können auch verwendet werden, um embryonale Stammzellen oder Zygoten zu transfizieren, um Keimbahnveränderungen zu erreichen. Siehe Jaenisch, Science, 240, 1468–1474 (1988); Gordon et al. (1984) Methods Enzymol. 101, 414; Hogan et al., Manipulation of the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, C. S. H. L. N. Y. (1986); und Hammer et al. (1985) Nature 315, 680; Gandolfi et al. (1987) J. Reprod. Fert. 81, 23–28; Rexroad et al. (1988) J. Anim. Sci. 66, 947–953 und Eyestone et al. (1989) J. Reprod. Fert. 85, 715–720; Camous et al. (1984) J. Reprod. Fert. 72, 779–785; Heyman et al. (1987) Theriogenology 27, 5968. Jedoch sind diese Verfahren derzeit aufgrund ethischer und rechtlicher Beschränkungen für die Veränderung menschlicher Embryo nen geeigneter für Anwendungen in der Tiermedizin als für die Behandlung von Menschen.
  • Beispielsweise ist Mukoviszidose (CF) eine üblicherweise tödliche rezessive genetische Krankheit, die ein großes Vorkommen bei kaukasischen Völkern aufweist. Das Gen, das für diese Krankheit verantwortlich ist, wurde von Riordan et al., Science 245, 1059–1065 (1989) isoliert. Es kodiert ein Protein, das CFTR-Protein (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) genannt wird, das an der Übertragung von Chloridionen (Cl–) durch Epithelzellmembranen beteiligt ist. Mutationen in dem Gen verursachen Defekte der Cl–-Ausscheidung in Epithelzellen, die zu den verschiedenen klinischen Symptomen führen. Obgleich CF eine Anzahl von Symptomen aufweist, einschließlich verdickter Sekretion der exokrinen Drüsen, Pankreas-Schwäche, Darmverschluss und Malabsorption von Fett, ist der bedeutendste, die Sterblichkeit beeinflussende Faktor eine chronische Lungenerkrankung. Dementsprechend kann, um einen CF-Patienten zu behandeln, ein Vektor, der eine kodierende Sequenz für ein funktionelles CFTR-Genprodukt enthält, mit Lipid und wahlweise einem pharmazeutischen Grundstoff komplexiert werden und über eine nasale Verabreichung in den Patienten eingeführt werden, sodass die Vektor-Lipid-Zusammensetzung die Lunge erreicht. Die Dosis des Vektor-Lipid-Komplexes beträgt bevorzugt etwa 108–1010 Teilchen.
  • Als anderes Beispiel können Defekte in den α- oder γ-Globin-Genen (siehe McDonagh & Nienhuis in Hematology of Infancy and Childhood (Hrsg. Nathan & Oski, Saunders, PA, 1992) auf S. 783–879) durch Ex-vivo-Behandlung von hämopoietischen Stammzellen mit einem Nucleinsäure-Lipid-Komplex ausgeglichen werden, der eine funktionelle Kopie des Gens enthält. Das Gen integriert sich in die Stammzellen, die dann wieder in den Patienten eingeführt werden. Defekte in dem Gen, die für Fanconi- Anämie Komplement Gruppe C verantwortlich sind, können mit einer analogen Strategie behandelt werden (siehe Walsh et al., J. Clin. Invest. 94, 1440–1448 (1994)).
  • Andere Anwendungen umfassen die Einführung einer funktionellen Kopie eines Tumor-Suppressor-Gens in Krebszellen oder in Zellen, für die ein Risiko eines Krebsbefalls besteht. Bei Personen, die Defekte in einer oder beiden Kopien eines endogenen Tumor-Suppressor-Gens haben, besteht ein besonderes Risiko, Krebserkrankungen zu entwickeln. Beispielsweise ist das Li-Fraumeni-Syndrom ein erblicher Zustand, bei dem Personen mutierte p53-Allele erhalten, was zu einer frühen Entstehung verschiedener Krebserkrankungen führt (Harris, Science 262, 1980–1981 (1993) Frebourg et al., PNAS 89, 6413–6417 (1992); Malkin et al., Science 250, 1233 (1990)). Die Expression eines Tumor-Suppressor-Gens in einer Krebszelle oder einer Zelle, für die ein Risiko eines Krebsbefalls besteht, wirkt so, dass eine zelluläre Proliferation und andere Anzeichen des Krebszustands verhindert, aufgehalten und/oder umgekehrt werden. Geeignete Tumor-Suppressor-Gene zur Verwendung in der Erfindung umfassen p53 (Buchman et al., Gene 70, 245–252 (1988)), APC, DCC, Rb, WT1 und NF1 (Marx, Science 260, 751–752 (1993); Marshall, Cell 64, 313–326 (1991)). Lipid-Nucleinsäure-Komplexe, die eine funktionelle Kopie eines Tumor-Suppressor-Gens tragen, werden üblicherweise in vivo über den Weg verabreicht, der der beabsichtigten Wirkungsstelle am nächsten ist. Beispielsweise können Hautkrebsarten durch topische Verabreichung und Leukämie durch intravenöse Verabreichung behandelt werden.
  • 4. Unterdrückung bzw. Suppression der Genexpression
  • Gentherapieverfahren, bei denen die erfindungsgemäßen Nucleinsäure-Lipid-Teilchen verwendet werden, können auch zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Patienten oder Zellen verwendet werden, die mit einem pathogenen Mikroorganismus wie z. B. HIV infiziert sind oder für die ein Risiko besteht, dass sie damit infiziert werden. Die Wirksamkeit von Antisens-Molekülen beim Blockieren von Zielgenfunktionen einer behindernden Virus-Replikation wurde in einer Anzahl verschiedener Systeme gezeigt (Friedman et al., Nature 335: 452–54 (1988), Malim et al., Cell 58: 205–14 (1989) & Trono et al., Cell 59: 113–20 (1989)). Der verwendete Vektor enthält ein DNA-Segment, das ein Antisens-Transkript kodiert, das zu einem Segment des Genoms aus dem pathogenen Organismus komplementär ist. Das Segment sollte bevorzugt eine wesentliche Rolle im Lebenszyklus des Mikroorganismus spielen und sollte auch für den Mikroorganismus einzigartig sein (oder zumindest im Genom des natürlichen Genoms eines die Therapie durchlaufenden Patienten nicht vorkommen.) Beispielsweise umfassen geeignete Stellen zur Hemmung des HIV-Virus TAR, REV oder nef (Chatterjee et al., Science 258: 1485–1488 (1992)). Rev ist ein regulatorisches RNA bindendes Protein, das den Export ungespleißter HIV-pre-mRNA aus dem Nucleus erleichtert. Malim et al., Nature 338: 254 (1989). Von Tat wird angenommen, dass es ein Transkriptionsaktivator ist, der durch Binden einer Erkennungssequenz in 5'-flankierender mRNA funktioniert. Karn & Graeble, Trends Genet. 8: 365 (1992). Der Nucleinsäure-Lipid-Komplex wird in einer therapeutisch wirksamen Dosis in Leukozyten oder hämopoietische Stammzellen entweder ex vivo oder durch intravenöse Injektion eingeführt. Die Behandlung kann prophylaktisch an HIV-Personen oder an Personen verabreicht werden, die bereits mit HIV infiziert sind.
  • Analoge Verfahren werden zum Unterdrücken der Expression endogener Empfängerzellgene verwendet, die Adhäsionsproteine kodieren. Eine Unterdrückung der Expression von Adhäsionsproteinen ist nützlich beim Abbrechen unerwünschter Entzündungsreaktionen. Adhäsionsproteine können durch Antisens-Segmente unterdrückt werden, die in ausgewählten Vektoren vorliegen, einschließlich der Mitglieder der Überfamilien der Integrine, Selektine und Immunglobuline (Ig) (siehe Springer, Nature 346, 425–433 (1990); Osborn, Cell 62, 3 (1990); Hynes, Cell 69, 11 (1992)). Integrine sind heterodimere Transmembran-Glycoproteine, die aus einer α-Kette (120–180 kDa) und einer β-Kette (90–110 kDa) bestehen und im Allgemeinen kurze cytoplasmatische Domänen aufweisen. Die drei bekannten Integrine LFA-1, Mac-1 und P150,95 haben unterschiedliche Alpha-Untereinheiten, die als CD11a, CD11b und CD11c bezeichnet werden, und eine gemeinsame Beta-Untereinheit, die als CD18 bezeichnet wird. LFA-1 (α1β2) wird auf Lymphozyten, Granulozyten und Monozyten exprimiert und bindet überwiegend einen Gegenrezeptor, der ein Ig-Familienmitglied ist und als ICAM-1 bezeichnet wird, (und vielleicht in einem geringer Umfang ICAM-2). ICAM-1 wird auf vielen Zellen exprimiert, einschließlich Leukozyten und Endothelzellen, und wird durch Cytokine, wie z. B. TNF und IL-2 auf vaskulärem Endothel hochreguliert. Mac-1 (αMβ2) ist auf Neutrophilen und Monozyten verteilt und bindet auch an ICAM-1 (und möglicherweise ICAM-2). Das dritte β2-Integrin P150,95 (αxβ2) findet sich auch auf Neutrophilen und Monozyten. Die Selektine bestehen aus L-Selektin, E-Selektin und P-Selektin.
  • 5. Zu transformierende Zellen
  • Die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung werden verwendet, um eine große Vielfalt von Zelltypen in vivo zu behandeln. Unter den am häufigsten für eine Gentherapie angezielten Zellen befinden sich hämatopoietische Vorläufer-(Stamm-)Zellen. Andere Zellen umfassen solche, von denen ein Anteil der angezielten Zellen sich nicht teilen oder langsam teilen. Diese umfassen beispielsweise Fibroblasten, Keratinozyten, Endothelzellen, Skelettzellen und Zellen der glatten Muskulatur, Osteoblasten, Neuronen, ruhende Lymphozyten, kulatur, Osteoblasten, Neuronen, ruhende Lymphozyten, ausdifferenzierte Zellen, langsam oder nicht zirkulierende Primärzellen, Parenchymzellen, Lymphoidzellen, Epithelzellen, Knochenzellen usw. Die Verfahren und Zusammensetzungen können mit Zellen einer breiten Vielfalt an Wirbeltieren eingesetzt werden, einschließlich Säugetieren und insbesondere solchen mit tiermedizinischer Bedeutung, z. B. hundeartige, katzenartige, pferdeartige, rinderartige, schafartige, ziegenartige, nagetierartige, hasenartige, schweineartige usw. zusätzlich zu humanen Zellpopulationen.
  • Soweit Gewebekulturen von Zellen erforderlich sein können, ist dies auf dem Fachgebiet gut bekannt. Freshney (1994) (Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, dritte Auflage, Wiley-Liss, New York), Kuchler et al. (1977) Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Kuchler, R. J., Dowden, Hutchinson und Ross, Inc., und die darin zitierten Literaturstellen stellen einen allgemeinen Leitfaden über die Zellkultur zur Verfügung. Kultivierte Zellsysteme werden oft in der Form von Monoschichten von Zellen vorliegen, obgleich auch Zellsuspensionen verwendet werden.
  • Eine Gentherapie beruht auf der wirksamen Abgabe therapeutischer Gene an Zielzellen. Die meisten somatischen Zellen, die für eine Gentherapie angezielt wurden, z. B. hämatopoietische Zellen, Fibroblasten und Keratinozyten der Haut, Hepatozyten, Endothelzellen, Muskelzellen und Lymphozyten teilen sich normalerweise nicht. Retrovirus-Vektoren, die die am breitesten eingesetzten Vektoren für eine Gentherapie sind, benötigen unglücklicherweise eine Zellteilung für eine wirksame Transduktion (Miller et al., Mol. Cell. Biol. 10: 4239–4242 (1990)). Dies trifft auch auf andere Vektoren für die Gentherapie zu, wie z. B. die adenoassoziieren Vektoren (Russell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8915–8919 (1994); Alexander et al., J. Virol. 68: 8282–8287 (1994); Srivastrava, Blood Cells 20: 531–538 (1994)). Kürzlich wurde berichtet, dass Vektoren auf HIV-Basis sich nicht teilende Zellen (CITE) transfizieren. Nichtsdestotrotz vermehren sich die meisten Stammzellen, die ein bevorzugtes Ziel für viele Gentherapiebehandlungen sind, normalerweise nicht. Somit ist die Wirksamkeit der Transduktion oft relativ gering und das Genprodukt kann nicht in therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Mengen exprimiert werden. Dies hat Forscher dazu geführt, solche Techniken, wie das Stimulieren der Stammzellen zur Vermehrung vor oder während des Gentransfers (z. B. durch Behandlung mit Wachstumsfaktoren), Behandlung mit 5-Fluoruracil, Infektion in der Gegenwart von Cytokinen und Verlängern des Vektor-Infektionszeitraums zu entwickeln, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass sich Stammzellen während der Infektion teilen, aber diese haben begrenzten Erfolg gehabt.
  • 6. Detektion fremder Nucleinsäuren
  • Nachdem eine vorgegebene Zelle mit einem Nucleinsäurekonstrukt tranduziert wurde, das ein interessierendes Gen kodiert, ist es wichtig, zu detektieren, welche Zellen oder Zellinien das Genprodukt exprimieren und das Niveau der Expression des Genprodukts in gentechnisch veränderten Zellen zu ermitteln. Dies erfordert die Detektion von Nucleinsäuren, welche die Genprodukte kodieren.
  • Nucleinsäuren und Proteine werden hier durch eine beliebige Anzahl von Mitteln detektiert und quantifiziert, die Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt sind. Diese umfassen analytische biochemische Verfahren, wie z. B. Spektrophotometrie, Radiographie, Elektrophorese, Kapillarelektrophorese, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), Dünnschichtchromatographie (DC), Hyperdiffusionschromatographie und dergleichen sowie verschiedene immunologische Verfahren, wie z. B. Fluid- oder Gel-Präzipitationsreaktionen, Immundiffusion (einfache oder zweifache), Immunelektrophorese, Radioimmunelektrophorese (RIA), enzymgebundene Immunadsorptions-Assays (ELISA), Immunfluoreszenz-Assays und dergleichen. Die Detektion von Nucleinsäuren wird mit gut bekannten Verfahren, wie z. B. Southern-Analyse, Northern-Analyse, Gelelektrophorese, PCR, Radiomarkierung, Szintillationszählung und Affinitätschromatographie durchgeführt.
  • Die Auswahl eines Nucleinsäure-Hybridisierungsformats ist nicht kritisch. Eine Reihe von Nucleinsäure-Hybridisierungsformaten ist Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Beispielsweise umfassen übliche Formate Sandwich-Assays und Konkurrenz- oder Verdrängungs-Assays. Hybridisierungstechniken sind allgemein in "Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach", Hrsg. Hames, B. D. und Higgins, S. J., IRL Press, 1985 beschrieben.
  • Die Empfindlichkeit der Hybridisierungsassays kann durch Verwendung eines Amplifizierungssystems für Nucleinsäuren erhöht werden, das die zu detektierende Zielnucleinsäure vermehrt. In-vitro-Amplifikationstechniken, die zum Amplifizieren von Sequenzen zur Verwendung als molekulare Sonden oder zum Erzeugen von Nucleinsäurefragmenten zum anschließenden Subklonieren geeignet sind, sind bekannt. Beispiele für Techniken, die ausreichen, um Fachleute durch solche In-vitro-Amplifikationsverfahren zu leiten, einschließlich der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), der Ligase-Kettenreaktion (LCR), Qβ-Replikase-Amplifikation und anderer durch RNA-Polymerase vermittelte Techniken (z. B. NASBA) sind zu finden in Berger, Sambrook und Ausubel, sowie in Mullis et al. (1987), US-Patent Nr. 4.683.202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al. Hrsg.) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (1. Oktober 1990), C & EN 36–47; The Journal Of NIH Research (1991), 3: 81–94; Kwoh et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1173; Guatelli et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1874; Lomell et al. (1989), J. Clin. Chem., 35: 1826; Landegren et al. (1988), Science, 241: 1077–1080; Van Brunt (1990), Biotechnology 8: 291–294; Wu und Wallace (1989), Gene 4: 560; Barringer et al. (1990), Gene, 89: 117, und Sooknanan und Malek (1995), Biotechnology 13: 563–564. Verbesserte Verfahren zum Klonieren von in vitro amplifizierten Nucleinsäuren sind in Wallace et al., US-Patent Nr. 5.426.039 beschrieben. Andere kürzlich auf dem Fachgebiet beschriebene Verfahren sind die Amplifikation auf Basis der Nucleinsäuresequenz (NASBATM, Cangene, Mississauga, Ontario) und Q-Beta-Replikase-Systeme. Diese Systeme können verwendet werden, um Mutanten direkt zu identifizieren, wohingegen die PCR- oder LCR-Primer so gestaltet sind, dass sie nur wenn. eine Auswahlsequenz vorliegt verlängert oder ligiert werden. Alternativ können die Auswahlsequenzen allgemein unter Verwendung von beispielsweise unspezifischen PCR-Primern amplifiziert werden und die amplifizierte Zielregion kann später mit einer Sonde auf eine spezifische Sequenz geprüft werden, die eine Mutation anzeigt.
  • Oligonucleotide zur Verwendung als Sonden z. B. bei In-vitro-Amplifikationsverfahren zur Verwendung als Gensonden oder als Inhibitorkomponenten werden typischerweise chemisch nach dem Phosphoramidittriester-Festphasenverfahren synthetisiert, das von Beaucage and Caruthers (1981), Tetrahedron Letts., 22(20): 1859–1862 beschrieben ist, z. B. unter Verwendung eines automatischen Synthesegeräts, wie es bei Needham-VanDevanter et al. (1984), Nucleic Acids Res., 12: 6159–6168 beschrieben ist. Die Aufreinigung von Oligonucleotiden wird, wo erforderlich, typischerweise entweder durch native Acrylamid-Gelelektrophorese oder durch Anionenaustausch-HPLC durchgeführt, wie bei Pearson und Regnier (1983), J. Chrom. 255: 137–149 beschrieben ist. Die Sequenz der synthetischen Oligonucleotide kann unter Verwendung des chemischen Abbauverfahrens von Maxam und Gilbert (1980) in Grossman und Moldave (Hrsg.), Academic Press, New York, Methods in Enzymology, 65: 499–560 überprüft werden.
  • Ein alternatives Mittel zum Bestimmen des Expressionsniveaus des Gens ist die In-situ-Hybridisierung. In-situ-Hybridisierungs-Assays sind gut bekannt und allgemein in Angerer et al. (1987), Methods Enzymol. 152: 649–660 beschrieben. Bei einem In-situ-Hybridisierungs-Assay werden Zellen auf einem festen Träger fixiert, typischerweise auf einem Glas-Objektträger. Soll DNA sondiert werden, werden die Zellen mit Hitze oder Alkali denaturiert. Die Zellen werden dann mit einer Hybridisierungslösung bei einer moderaten Temperatur kontaktiert, um die Doppelstrangbildung spezifischer markierter Sonden zu erlauben. Die Sonden sind bevorzugt mit Radioisotopen oder fluoreszierenden Reportern markiert.
  • 7. Detektion fremder Genprodukte
  • Die Expression des interessierenden Gens zur Herstellung eines Produkts kann durch eine Reihe von Verfahren detektiert oder quantifiziert werden. Bevorzugte Verfahren umfassen die Verwendung spezifischer Antikörper.
  • Verfahren zur Herstellung polyklonaler und monoklonaler Antikörper sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Siehe z. B. Coligan (1991), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY; und Harlow und Lane (1989), ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Press, NY; Stites et al. (Hrsg.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (4. Aufl.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, und darin zitierte Literaturstellen; Goding (1986), MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2. Aufl.) Academic Press, New York, NY; und Kohler und Milstein (1975), Nature, 256: 495–497. Solche Techniken umfassen die Antikörperherstellung durch Selektion von Antikörpern aus Bibliotheken rekombinanter Antikörper in Phagen oder ähnlichen Vektoren. Siehe Huse et al. (1989), Science 246: 1275–1281; und Ward et al. (1989), Nature 341: 544–546. Spezifische monoklonale und polyklonale Antikörper und Antiseren werden üblicherweise mit einem KD von mindestens etwa 0,1 mM, üblichererweise mindestens etwa 1 μM, bevorzugt mindestens etwa 0,1 μM oder besser und am meisten typischerweise und bevorzugt 0,01 μM oder besser binden.
  • Die Gegenwart eines gewünschten Polypeptids (einschließlich Peptid, Transkript oder enzymatisches Abbauprodukt) in einer Probe kann unter Verwendung einer Western-Blot-Analyse detektiert und quantifiziert werden. Die Technik umfasst im Allgemeinen das Trennen von Probenprodukten durch Gelelektrophorese auf Basis des Molekulargewichts, das Überführen der getrennten Proteine auf einen geeigneten festen Träger (wie z. B. einen Nitrocellulosefilter, einen Nylonfilter oder derivatisierten Nylonfilter) und das Inkubieren der Probe mit markierenden Antikörpern, die sich spezifisch an das Analyt-Protein binden. Die markierenden Antikörper binden sich spezifisch an den Analyten auf dem festen Träger. Diese Antikörper sind direkt markiert oder werden alternativ anschließend unter Verwendung von Markierungsmitteln detektiert, wie z. B. Antikörpern (z. B. markierte Anti-Maus-Antikörper aus Schafen, wobei der Antikörper für einen Analyten ein Mausantikörper ist), die sich spezifisch an den markierenden Antikörper binden.
  • VII. Beispiele
  • Die folgenden Beispiele werden lediglich zu Zwecken der Erläuterung angeboten und sollen die Erfindung weder einschränken noch definieren. In jedem dieser Beispiele bezieht sich der Begriff „DNA" oder „Plasmid" auf das Plasmid pCMV (pCMV4-CAT).
  • A. Materialien
  • Die transfizierenden Mittel Lipofectin und Lipofectamin wurden von Gibco/BRL (Grand Island, New York, USA) bezogen. Das Transfectam-Reagenz wurde von Promega Corp. (Madison, Wisconsin, USA) bezogen. Das monokationische Lipid DDAB, Calciumchlorid, L-Lysin (freie Base), Poly-L-Lysinhydrobromid (Mittl. MW 52.000), n-Octyl-D-glucopyranosid (OGP) und DNase 1 wurden von Sigma Chemical Company (St. Louis, Missouri, USA) erhalten. TO-PRO-1 (Thiazol-Orange-Monomer) wurde von Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA erhalten. Das Plasmid pCMV (GenBank Eingangsnr. U02451), das E.-coli-Galactosidase (β-gal) kodiert, ein Plasmid-DNA-Reportergen mit 7,2 kb, wurde von Clontech Laboratories, Palo Alto, California, USA erhalten. β-gal-DNA wurde unter Verwendung von Standardtechniken (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor, New York (1989)) vermehrt und aufgereinigt. Eier-Sphingomyelin (SM) und 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DOPE) wurden von Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL) bezogen. N,N-Dioleoyl-N,N-dimethylammoniumchlorid (DODAC) wurde von Steven Ansell von INEX Pharmaceuticals Corp. (Vancouver, B. C.) synthetisiert und geliefert. TO-PRO-1 wurde von Molecular Probes Inc. (Eugene, OR) bezogen. Die Dialysemembran (SPECTRA/POR, mwco: 12.000–14.000) wurde von Fisher Scientific (Ottawa, ON) bezogen. Alle anderen verwendeten Chemikalien waren analysenrein und alle verwendeten Lösemittel hatten HPLC-Reinheit. Radiomarkierte DNA wurde als Indikatorsubstanz verwendet und wurde durch Einbau von 3H-dUTP in das Plasmid während des Bakterienwachstums erzeugt, was zu spezifischen Aktivitäten von 50.000 dpm/g DNA führte. Alle anderen in diesen Beispielen verwendeten Chemikalien waren analysenrein und alle verwendeten Lösungsmittel hatten HPLC-Reinheit. Steril destilliertes Wasser wurde bei allen Versuchen verwendet. Alle Materialien wurden ohne weitere Aufreinigung verwendet.
  • B. Verfahren
  • Extraktionsverfahren nach Bligh und Dyer
  • Nicht-kationische Lipide, kationische Lipide und DNA wurden in Chloroform : Methanol : Wasser (1 : 2,1 : 1) vor dem Mischen solubilisiert. Diese Mischung aus Lösemitteln und Wasser entspricht der bei der Herstellung einer Monophase nach Bligh und Dyer verwendeten (Bligh und Dyer, Can. J. Biochem. Physiol. 37: 91–97 (1959)). Typischerweise wurde DNA zugegeben, um eine Endkonzentration von 10 g/mL in Lösung zu erreichen, während Lipid in verschiedenen Konzentrationen zugegeben wurde. Spurenmengen von 3H-Plasmid-DNA wurden zugegeben, sodass 2000 bis 4000 dpm pro 10 g unmarkierter DNA vorlagen. Die Reaktionsmischungen wurden bei Raumtemperatur 30 min in einem Gesamtvolumen von 1 mL inkubiert. Anschließend wurde die Monophase nach Bligh und Dyer durch Zugabe von Wasser und Chloroform (jeweils 250 L) in einem Zweiphasensystem getrennt. Die Proben wurden durch Verwirbeln gemischt und die Trennung der unteren organischen und der oberen wässrigen Phase wurde durch Zentrifugation bei 2000 upm für 5 min bei Raumtemperatur erleichtert. Die wässrige Phase wurde entfernt und für eine Szintillationszählung aufbewahrt. Die Lösemittelphase wurde unter Verwendung eines Stickstoffgasstromes getrocknet und der resultierende Film wurde in dem Solubilisierungsmittel SOLVABLE (Dupont NEN, Boston, Massachusetts, USA) resuspendiert und bei 50°C 1 Stunde inkubiert. Dieser letzte Schritt war notwendig, um den getrockneten DNA/Lipid-Komplex zu solubilisieren, da die Zugabe des Szintillationscocktails alleine nicht ausreichte, um den Komplex zu dissoziieren. Das Szintillationsmittel PICOFLUOR (Can berra Packard, Meriden, Conneticut, USA) wurde allen Proben zugegeben und die Radioaktivität (3H-DNA) wurde unter Verwendung eines Szintillationszählers TR 1900 von Packard (Canberra Packard) gemessen.
  • Assays, die die Stabilität ladungsneutralisierter Lipid-Nucleinsäure-Komplexe bewerten, wurden in der Gegenwart von variierenden Konzentrationen von NaCl und OGP durchgeführt. Kurz gesagt wurden kationische Lipid-Nucleinsäure-Komplexe unter Bedingungen hergestellt, bei denen erwartet wurde, dass 100% des Plasmids in der organischen Phase wiedergefunden werden. NaCl oder OGP wurden dann dem Monophasensystem zugegeben und es wurden bei Raumtemperatur 15 min lang Inkubationen durchgeführt. Extraktionen nach Bligh und Dyer wurden wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Die Bindung von Calcium, L-Lysin und Poly-L-Lysin an das Plasmid wurde unter Verwendung einer Abwandlung der vorstehenden Vorgehensweise bewertet. Diese kationischen Nichtlipid-Materialien wurden in verschiedenen Konzentrationen in sterilem destillierten Wasser gelöst und bei Raumtemperatur 30 min in einem Endvolumen von 250 L mit dem Plasmid (10 g/mL Endkonzentration in Wasser) inkubiert. Reaktionsvolumina wurden auf 1 mL mit Chloroform : Methanol (1 : 2,1) eingestellt, um eine Monophase erzeugen. Dann wurden Extraktionen nach Bligh und Dyer wie beschrieben durchgeführt.
  • Farbstoff-Interkalations-Assay
  • Der Fluoreszenzfarbstoff TO-PRO-1 wurde verwendet, um den Verdichtungszustand des Plasmids in dem ladungsneutralisierten Lipid-Nucleinsäure-Komplex zu bewerten. TO-PRO-1 wurde in dieser Untersuchung aufgrund seiner stabilen Einschiebung in das Plasmid sowie der hohen Empfindlichkeit bei der Detektion der Fluoreszenz im Vergleich mit dem üblicheren Interkalationsfarbstoff Ethidiumbromid (siehe Hirons et al., Cytometry 15: 129–140 (1994)) verwendet. Plasmid wurde entweder in der Monophase nach Bligh und Dyer oder in 100 mM OGP gelöst. Poly-L-Lysin oder DODAC wurden jeweils zu 10 g Plasmid in einem Ladungsverhältnis von 1 : 1 gegeben.
  • Agarose-Gelelektrophorese
  • Komplexe, die Plasmid und Poly-L-Lysin umfassen, wurden bei einer Nucleinsäure-Konzentration von 10 g/mL und einem Ladungsverhältnis von 1 : 1 in der Gegenwart von 100 mM OGP gebildet. Komplexe, die das kationische Lipid DODAC und Plasmid umfassen, wurden bei einer Plasmid-Konzentration von 10 g/mL und steigenden DODAC-Konzentrationen (10 bis 320 nmol/mL) gebildet. Die Mischungen wurden vor Ladung auf ein 0,8%iges Agarosegel 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Elektrophorese wurde in TBE-Puffer gemäß Standard-Techniken durchgeführt (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor, New York (1989)). Die Nucleinsäuren wurden nach Färben des Gels mit Ethidiumbromid (0,5 g/mL, 20 min) durch Fotografie mit UV-Transillumination sichtbar gemacht.
  • DNase-1-Assay
  • Um die Schutzwirkung kationischer Lipide auf DNA zu bewerten, wurden die in der Gegenwart von OGP gebildeten Komplexe mit DNase 1 inkubiert. Vorab gebildete ladungsneutralisierte Lipid-Nucleinsäure-Komplexe (Ladungsverhältnis Plasmid : DODAC 1 : 1) wurden mit DNase 1 bei einer Konzentration gemischt, bei der Plasmid alleine anfällig für einen Abbau bei 37°C für 10 min war. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von 25 mM EDTA beendet und die Proben wurden unter Verwendung der Vorgehensweise nach Bligh und Dyer in der Gegenwart von 150 mM NaCl extrahiert. Unter diesen Bedingungen dissoziieren die ladungsneutralisierten Lipid-Nucleinsäure-Komplexe, und Plasmid kann wirksam in der wässrigen Fraktion wiedergefunden werden. Diese DNA wurde mit 1/10tel des Volumens an 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 2,5 Volumina 95%igem EtOH ausgefällt und durch Zentrifugation bei 14.000 g für 30 min bei 4°C gewonnen. Das DNA-Pellet wurde in sterilem destillierten Wasser resuspendiert und einer Elektrophorese auf einem 0,8%igen Agarosegel unterzogen.
  • BEISPIEL 1 (Vergleichsbeipiel)
  • Dieses Beispiel erläutert den Einschluss eines Plasmids in ein Lipid-Teilchen unter Verwendung entweder eines Phasenumkehr-Verfahrens oder eines Detergens-Dialyse-Verfahrens.
  • Phasenumkehr-Verfahren
  • Das Plasmid pCMV4-CAT wurde in ein Lipid-Teilchen eingeschlossen, das unter Verwendung von etwa 10 mg oder 20 mg Lipid aufgebaut wurde. Das Einschlussverfahren umfasste eine Abwandlung des klassischen Phasenumkehr-Verfahrens für den Einfang. Im Allgemeinen wurden 1,050 ml Chloroform : Methanol in einem prozentualen Molverhältnis von 1 : 2–1 einem Lipidfilm zugegeben, der 2 μl 14C-Cholesterylhexadecylether (6,66 μl/μCi) enthielt. Anschließend folgte die Zugabe von 220 μl H2O und 33 μl 3H-pCMVCAT-Plasmid (158.000 dpm/μl; 1,5 mg/ml). Diese Kombination erzeugte eine klare Einphasenlösung. Das Chloroform und das meiste Methanol wurden unter einem Stickstoffstrom unter Verwirbeln entfernt. In manchen Fällen wurde die resultierende 250-μl-Suspension von eingeschlossenem Plasmid mit 1 ml H2O verdünnt und 5 Mal durch einen 400-nm-Filter und anschließend 5 Mal durch einen 200-nm-Filter extrudiert.
  • Die resultierende Vesikelgröße betrug ungefähr 150 bis 200 nm im Durchmesser. Die Liposomengrößen vor der Extrusion variierten breit in Abhängigkeit von der Lipidzusammensetzung.
  • Detergens-Dialyse-Verfahren
  • pCMVCAT wurde mit DODAC bei verschiedenen DODAC-Konzentrationen in 100 μl 1 M n-Octyl-β-D-glucopyranosid und 400 μl H2O 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die resultierende Plasmid : DODAC-Mischung wurde einer Suspension von ungefähr 10 mg Lipid, das 1 μl 14C-Cholesterylhexadecylether, 6,66 μl/μCi, in 100 μl 1 M n-Octyl-β-D-glucopyranosid enthielt, zugegeben. Die Suspension wurde gegen HBS bei pH 7,4 über Nacht dialysiert. Das resultierende eingeschlossene Plasmid wurde ohne weitere Größensortierung verwendet.
  • BEISPIEL 2
  • Dieses Beispiel erläutert das Ausmaß des „Schutzes" des Plasmids vor dem äußeren Medium unter Verwendung von Anionenaustauschchromatographie.
  • Das Ausmaß des Einschlusses oder des Schutzes des Plasmids vor dem äußeren Medium wurde durch Anionenaustauschchromatographie wie folgt untersucht: Ein 50-μl-Aliquot jeder Probe wurde auf einer DEAE-Sepharose-CL-6B-Säule eluiert und die Fraktionen wurden durch Szintillationszählung sowohl auf 3H-Plasmid als auch auf 14C-Lipid untersucht. Jede exponierte negative Ladung, wie solche, die auf DNA-Molekülen vorliegen, werden an die Anionenaustauschsäule binden und werden nicht mit dem 14C-Lipid eluieren. DNA, deren negative Ladung „geschützt" oder nicht exponiert ist, wird nicht an das Anionenaustauschharz binden und wird mit dem 14C-Lipid eluieren. Alternativ wurde Plasmid-DNA unter Verwendung des Indikatorfarbstoffs PicoGreen® gemessen.
  • Phasenumkehr-Verfahren
  • 4 stellt die Ergebnisse dar, welche die Beziehung zwischen der in der Formulierung vorliegenden Menge an DODAC und der Einschlusswirksamkeit für POPC : DODAC : PEG-Cer-C20-Zusammensetzungen (20 mg Gesamtlipid) nach Extrusion durch einen 400-nm-Filter und einen 200-nm-Filter beschreiben, wie durch Anionenaustauschchromatographie gemessen wurde. Das Lipid bestand aus 10% PEG-Cer-C20 und der verbleibende Prozentanteil konnte POPC und DODAC zugeordnet werden. Eine Erhöhung der prozentualen Wiederfindung von Plasmid wurde entsprechend einer Erhöhung der DODAC-Konzentration beobachtet. Kein Plasmid wurde in Abwesenheit von DODAC wiedergefunden, während bei einer DODAC-Konzentration von 1,5 Mol-% 90% des Plasmids nach Extrusion durch einen 200-nm-Filter wiedergefunden wurden. Fast 100% des nach Extrusion durch einen 200-nm-Filter wiedergefundenen Plasmids wurde durch Anionenaustauschchromatographie (5) wiedergefunden, was nahe legt, dass sämtliches wiedergefundenes Plasmid eingeschlossen war. Dies entsprach einer gesamten Einschlusswirksamkeit von etwa 70%. Die Lipid-Wiederfindungen nach Extrusion und Anionenaustauschchromatographie betrugen 90% nach Extrusion durch einen 400-nm-Filter und 70% nach Extrusion durch einen 200-nm-Filter (siehe 6). Von den 70% Lipid, die nach Extrusion durch einen 200-nm-Filter wiedergefunden wurden, wurden beinahe 100% nach Anionenaustauschchromatographie wiedergefunden (7). Die Lipid- und Plasmid-Wiederfindung nach Extrusion und Anionenaustauschchromatographie waren beinahe identisch. Tabelle 1 erläutert die Einschlusswirksamkeiten unter Verwendung einiger verschiedener Lipid- Zusammensetzungen. Es ist ziemlich offensichtlich, dass ein breiter Bereich von Lipid-Zusammensetzungen verwendet werden kann. Es ist auch interessant anzumerken, dass PEG-Cer in vielen dieser Lipid-Zusammensetzungen nicht notwendig zu sein scheint. Tabelle 1. Einige Beispiele für Plasmid-DNA-Einschluss durch das abgewandelte Phasenumkehr-Verfahren. Daten werden nur gezeigt, wenn mindestens 70% des Lipids nach der Anionenaustauschchromatographie wiedergefunden wurden Phasenumkehr
    Lipid-Zusammensetzung % Einschluss
    EPC-DODAC (98,9 : 1,1) 98%
    DOPE : EPC : DODAC (10 : 88,9 : 1,1) 24%
    DOPE : EPC : DODAC (20 : 78,9 : 1,1) 13%
    DOPE : EPC : DODAC (40 : 58,9 : 1,1) 16%
    DOPE : EPC : DODAC (10 : 85,5 : 4,5) 78%
    DOPE : EPC : DODAC (15 : 80,5 : 4,5) 67%
    DOPE : SM : EPC : DODAC (15 : 40 : 40 : 5) 53%
    DOPE : SM : EPC : DODAC (20 : 37,5 : 37,5 : 5) 37%
    DOPE : EPC : DODAC : PEG-Cer-C8 (25 : 64 : 1 : 10) 83%
    DOPE : EPC : DODAC : PEG-Cer-C8 (50 : 39 : 1 : 10) 90%
  • Dialyse-Verfahren
  • 8 stellt die Ergebnisse dar, die das Verhältnis zwischen der in der Formulierung vorliegenden Menge an DODAC und der Einschlusswirksamkeit für DOPE : DODAC : PEG-Cer-C20 (84 : 6 : 10) beschreibt, wie es durch Anionenaustauschchromatographie gemessen wurde. Tabelle 2 erläutert die Einschlusswirksamkeiten unter Verwendung einiger verschiedener Lipid-Zusammensetzungen. Es ist ziemlich offensichtlich, dass ein breiter Bereich von Lipid-Zusammensetzungen verwendet werden kann. Es ist interessant anzumerken, dass in diesen Lipid-Zusammensetzungen PEG-Cer notwendig zu sein scheint.
  • Tabelle 2. Einige Beispiele für Plasmid-DNA-Einschluss durch das Detergens-Dialyse-Verfahren. Daten werden nur gezeigt, wenn mindestens 70% des Lipids nach der Anionenaustauschchromatographie wiedergefunden wurden
    Figure 00850001
  • BEISPIEL 4 (Vergleichsbeispiel)
  • Dieses Beispiel erläutert die Serumbeständigkeit, die bei Verwendung von Plasmid-Lipid-Teilchen erreicht wird, die nach den Verfahren aus Beispiel 1 hergestellt wurden.
  • Um die Serumbeständigkeit der Plasmid-Lipid-Teilchen zu bestimmen, wurden Aliquote der Teilchenmischungen, die sowohl nach dem Phasenumkehr-Verfahren als auch nach dem Dialyseverfahren aus Beispiel 1 hergestellt wurden, in 80% Mäuseserum (Cedar Lane) 30 min bei 37°C inkubiert. Vor der Inkubation wurde das an Lipid gebundene Plasmid auf einer DEAE-Sepharose-CL-6B-Säule eluiert, um nicht eingeschlossenes Plasmid zu entfernen. Nach der Inkubation wurde ein Aliquot der Inkubationsmischung in HBS auf einer Sepharose-CL-4B-Säule eluiert.
  • Als Kontrolle wurden 1,5 mg freies 3H-pCMVCAT in HBS, pH 7,4 auf einer Sepharose-CL-4B-Säule eluiert (siehe 9A). Zum Vergleich wurden 1,5 mg freies 3H-pCMVCAT in 500 μl Mäuseserum bei 37°C 30 min inkubiert und auf die gleiche Weise eluiert (9B). Es wird angemerkt, dass in 9A das freie Plasmid im Zwischenkornvolumen der Säule eluierte, während in 9B das in Serum inkubierte Plasmid in dem eingeschlossenen Volumen eluierte, was nahe legte, dass das Plasmid durch Serumenzyme verdaut wurde.
  • Serumbeständigkeit von durch Phasenumkehr hergestellten Plasmid-Lipid-Teilchen
  • Die Stabilität von Plasmid-Lipid-Teilchen wurde durch Inkubation eines 50-μl-Aliquots in 500 μl Mäuseserum (Cedar Lane) für 15 min bei 37°C untersucht. Ein 500-μl-Aliquot der Inkubationsmischung wurde in HBS auf einer Sepharose-CL-4B-Säule eluiert (10). Die gemeinsame Migration des Plasmids und des Lipids im Zwischenkornvolumen legt stark nahe, das kein Plasmidabbau auftrat. Jegliches von Serum abgebaute Plasmid oder Lipid sollte als Peak etwa bei Fraktion 35 detektiert worden sein (siehe Kontrollergebnisse in 9B).
  • Serumbeständigkeit von durch Dialyse hergestellten Plasmid-Lipid-Teilchen
  • Ein 50-μl-Aliquot einer Teilchensuspension wurde in 500 μl Mäuseserum für 30 min bei 37°C inkubiert und wie vorstehend beschrieben auf einer Sepharose-CL-4B-Säule eluiert. 11 zeigt das Elutionsprofil der Probe nach Inkubation in Serum. Wie man in 11A sehen kann, wurden 94% des Plasmids im Zwischenkornvolumen wiedergefunden, was nahe legt, dass im wesentlichen das gesamte aus der Anionenaustauschchromatographie gewonnene Plasmid eingeschlossen war.
  • Um zu zeigen, dass dieser Versuch einen Einschluss und keine Hemmung von Serumnucleasen durch Lipide in der Formulierung wiedergibt, wurde eine eingeschlossene Plasmid-DNA-Formulierung, die nicht durch Anionenaustauschchromatographie behandelt wurde, 30 min in Mäuseserum inkubiert (11B). 47% der eingeschlossenen Plasmid-DNA wurde in dem eingeschlossenen Volumen eluiert während 53% in dem Zwischenkornvolumen der Säule eluiert wurden. Die Einfangwirksamkeit gemessen durch Anionenaustauschchromatographie betrug 55%.
  • BEISPIEL 4
  • Dieses Beispiel erläutert die In-vitro-Resistenz von Plasmid-Lipid-Teilchen gegen einen Verdau durch DNase 1. Komplexe, die durch die Zugabe von Vesikeln aus DOPE : DODAC (50 : 50) zu Plasmid-DNA gebildet wurden, wurden mit der eingeschlossenen Formulierung (DOPE : DODAC : PEG-Cer-C14; 84 : 6 : 10) verglichen. Die Proben wurden in DNase 1 inkubiert, durch PCR (Polymerase-Kettenreaktion) amplifiziert und auf einem Agarosegel laufen gelassen. Die DNA-Banden wurden mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Die Komplexe waren in DNase 1 in der Abwesenheit von Detergens (Spur 9) nicht stabil (12A), wohingegen das eingeschlossene Plasmid (12B) stabil war (Spur 9).
  • BEISPIEL 5 (Vergleichsbeispiel)
  • Dieses Beispiel erläutert die Abhängigkeit der Einschlusswirksamkeit von der Plasmidkonzentration.
  • Plasmid pCMVCAT wurde durch Detergens-Dialyse wie in Beispiel 1 beschrieben in die Lipid-Teilchen eingeschlossen. Der Einschluss betrug ungefähr 50%–60% bei allen geprüften Konzentrationen (13). Die Einschlusswirksamkeit war in dem untersuchten Bereich nicht von der Plasmid-Konzentration abhängig.
  • BEISPIEL 6 (Vergleichsbeispiel)
  • Dieses Beispiel erläutert die Abhängigkeit der optimalen DODAC-Konzentration für einen Einfang von der NaCl-Konzentration.
  • Wir haben herausgefunden, dass die optimale DODAC-Konzentration für einen Einfang nicht nur von der Lipid-Zusammensetzung sondern auch von der NaCl-Konzentration des Dialysepuffers abhängig war. Das Plasmid pCMVCAT wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durch Detergens-Dialyse in die Lipid-Teilchen eingeschlossen. 14 zeigt die optimale DODAC-Konzentration für einen Einschluss von Plasmid pCMVCAT bei verschiedenen NaCl-Konzentrationen. Es wird angemerkt, dass die in der Membran benötigte Menge an DODAC einfach durch Ändern der NaCl-Konzentration während der Dialyse in einer vorhersehbaren Weise gesteuert werden kann.
  • BEISPIEL 7
  • Dieses Beispiel erläutert die Größenverteilung von Plasmid-Lipid-Teilchen gemessen durch quasielastische Lichtstreuung unter Verwendung eines Submikron-Teilchenklassiergeräts von Nicomp (Modell 370).
  • Detergens-Dialyse
  • Plasmid-Lipid-Teilchen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durch Detergens-Dialyse hergestellt. Die Lipid-Zusammensetzung war DOPE : DODAC : PEG-Cer-C20. Die Teilchen wurden unter Verwendung eines Submikron-Teilchenklassiergeräts von Nicomp klassiert. 15 zeigt die Messung mit Gewichtung nach Volumen während 16 die Messung mit Gewichtung nach Anzahl zeigt.
  • BEISPIEL 8
  • Dieses Beispiel erläutert die Größenverteilung und Struktur der Plasmid-Lipid-Teilchen gemessen durch Kryoelektronenmikroskopie.
  • Kryoelektronenmikroskopie ist eine relativ wenig störende Technik, die routinemäßig zum Untersuchen der Liposomenform verwendet wurde.
  • Liposomen sind in der glasartigen Eisschicht aufgrund ihrer relativ elektronendichten Phosphat-Kopfgruppen sichtbar. Das Gleiche würde für DNA gelten, da sie aus vielen Phosphatgruppen besteht.
  • Die Kryoelektronenmikroskopie wurde wie zuvor beschrieben (Chakrabarti et al., 1992, Wheeler et al., 1994) durchgeführt. Plasmid-DNA enthaltende Vesikel wurden aus der Formulierung durch Dichtegradienten-Zentrifugation angereichert. Ein 500-μl-Aliquot der Formulierung wurde in einer Mikroultrazentrifuge 90 min bei 60.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet wurde in 100 ml HBS resuspendiert. Ein Tropfen der Suspension wurde in einen Probenträger aus Gold mit 700 Mesh gegeben, von hinten mit Filterpapier Nr. 50 von Whatman geblottet, um einen dünnen Film zu bilden, und durch Tauchen in flüssiges Ethan, das mit flüssigem Stickstoff gekühlt wurde, in einem Reichart Jung Universal Kryofixierungssystem (Reichart Corp.) verglast. Der Probenträger wurde in ein 10C STEM Elektronenmikroskop von Zeiss, das mit einem Gatan-126-Kälteobjekttisch ausgerüstet war, überführt. Der Objekttisch und der Antikontaminator wurden mit flüssigem Stickstoff bei 120 K bzw. 115 K gehalten. Regionen aus dünnem, glasartigen Eis wurden mit einer Beschleunigungsspannung von 60 kV beobachtet.
  • 17A ist ein kryoelektronenmikroskopisches Bild einer eingeschlossenen Plasmid-DNA-Formulierung. Für diese Zubereitung wurden 400 μg Plasmid-DNA verwendet. Die Lipid-Zusammensetzung war DOPE : DODAC : PEG-Cer-C14 (84 : 6 : 10). Die kleinen Pfeile kennzeichnen leere Liposomen mit ungefähr 100 nm Durchmesser. Diese liegen im Vergleich zu elektronendichte Zentren enthaltenden Lipid-Teilchen vor (große Pfeile). Diese elektronendichten Zentren entsprechen wahrscheinlich Plasmid-DNA. Diese Strukturen wurden in Formulierungen, die in Abwesenheit von DNA hergestellt wurden, nicht gesehen (17B).
  • BEISPIEL 9
  • Dieses Beispiel erläutert die Blut-Clearance der Plasmid-Lipid-Teilchen in Mäusen.
  • Phasenumkehr
  • Die Blut-Clearance von eingeschlossenem Plasmid wurde in drei ICR-Mäusen als Funktion der über die Zeit prozentual wiedergefundenen Dosis geprüft. Die prozentuale Wiederfindung von freiem 3H-Plasmid wurde über einen ähnlichen Zeitverlauf aufgezeichnet wie bei einer Kontrolle (siehe 18). Das eingeschlossene Plasmid zeigt eine Clearance-Geschwindigkeit, die viel langsamer ist als die von 3H-Plasmid. Zudem ändert sich das Plasmid-Lipid-Verhältnis über den Zeitverlauf des Versuchs nicht erheblich, was bestätigt, dass die Plasmid-Clearance-Geschwindigkeit mit der Clearance-Geschwindigkeit des Lipidträgers selbst verknüpft ist.
  • Detergens-Dialyse
  • Fusogene Teilchen von pCMVCAT eingeschlossen in DOPE : DODAC : PEG-Cer-C14 oder DOPE : DODAC : PEG-Cer-C20 (84 : 6 : 10 Mol-%) wurden wie folgt hergestellt:
    pCMVCAT (50 μg) (42 μl 3H-pCMVCAT; 108 dpm/μl, 1,19 mg/ml) wurden mit DODAC in 100 μl 1 M OGP und 400 μl Wasser 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Diese DNA : DODAC-Komplex-Mischung wurde einer Suspension von DOPE : PEG-Cer-C14 oder DOPE : PEG-Cer-C20 zugegeben und die Teilchen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben (Detergens-Dailyse) aufgebaut. Die Plasmid-Lipid-Teilchen für die Untersuchungen der Blut-Clearance enthielten 0,75 μl 14C-Cholesterylhexadecylether (CHE) (6,66 μl/μCi) in 100 μl 1 M OGP und 400 μl Wasser.
  • Clearance von pCMVCAT eingeschlossen in DOPE : DODAC : PEG-Cer-C14 und DOPE : DODAC : PEG-Cer-C20 (84 : 6 : 10)
  • Externe „eingeschlossene" DNA wurde durch Anionenaustauschchromatographie unter Verwendung von DEAE-Sepharose CL-6B vor einer Injektion in Mäuse entfernt. Die Einschlusswirksamkeiten betrugen ungefähr 42% für die PEG-Cer-C20 enthaltenden Systeme und 60% für die PEG-Cer-C14 enthaltenden Systeme.
  • Drei Gruppen von drei weiblichen ICR-Mäusen (20–25 g) wurden 200 μl in dem Plasmid-Lipid-Teilchen eingeschlossene DNA injiziert. Eine Gruppe von Mäusen wurde getötet und es wurde an jedem von drei Zeitpunkten (1, 2 und 5 Stunden) Blut entnommen. Das Plasma wurde durch Zentrifugation in mit 0,5 ml EDTA beschichteten Tainer-Röhrchen von dem Gesamtblut getrennt. Ein 200-μl-Aliquot des Plasmas von jeder Maus wurde durch Szintillationszählung auf 3H-DNA und 14C-Lipid untersucht.
  • 19A zeigt die Clearance von DNA, die in einem aus DOPE : DODAC : PEG-Cer-C20 (84 : 6 : 10) zusammengesetzten Teilchen eingeschlossen ist. Die DNA und das Lipid wurden viel weniger schnell aus dem Blutkreislauf eliminiert als wenn die Zusammensetzung DOPE : DODAC : PEG-Cer-C14 verwendet wurde. Beinahe 50% des Lipids und der DNA liegen nach 2 Stunden vor. Eine signifikante Menge von DNA und Lipid lagen noch nach 5 Stunden vor. Die injizierten Mengen von DNA und Lipid betrugen 1,8 μg bzw. 853 μg.
  • 19B zeigt die Clearance von DNA, die in einem aus DOPE : DODAC : PEG-Cer-C14 (84 : 6 : 10 Mol-%) zusammengesetzten Teilchen eingeschlossen ist. Sowohl DNA als auch Lipid wurden schnell aus dem Blutkreislauf eliminiert, wobei nur etwa 20% des Lipids und 10% der DNA nach 1 Stunde im Plasma vorlagen. Die injizierten Mengen von DNA und Lipid betrugen 2,7 μg bzw. 912 μg.
  • BEISPIEL 10
  • Dieses Beispiel erläutert die In-vitro-Transfektion von in Gewebekultur gezüchteten BHK-Zellen.
  • BEISPIEL 11
  • Dieses Beispiel erläutert die In-vivo-Transfektion von Geweben in Mäusen.
  • In-vivo-Transfektion in Lunge, Leber und Milz
  • Drei Gruppen von vier ICR-Mäusen wurden über die Schwanzvene pCMVCAT eingeschlossen in Lipid-Teilchen injiziert, die aus DOPE : DODAC : PEG-Cer-C14 (84 : 6 : 10) oder DOPE : DODAC : PEG-Cer-C20 zusammengesetzt waren und wie in Beispiel 7 beschrieben hergestellt wurden. Die Mäuse wurden nach 2, 4 und 8 Tagen getötet und die Lunge, Leber und Milz wurden auf CAT-Aktivität gemäß einer Abwandlung von Deigh, Anal. Biochem., 156: 251–256 (1986) untersucht. Die Menge an injiziertem Plasmid betrug bei den PEG-Cer-C14 enthaltenden Teilchen 2,6 μg und bei den PEG-Cer-C20 enthaltenden Teilchen 1,5 μg.
  • 20 zeigt die Ergebnisse der in der Lunge erreichten In-vivo-Transfektion. Wie aus dieser Figur ersichtlich ist, führte die Behandlung mit DOPE : DODAC : PEG-Cer-C14 zu einer Transfektion (auf Grundlage der CAT-Aktivität) bis zu 4 Tagen. DOPE : DODAC : PEG-Cer-C20 schaffte, obwohl es zu insgesamt geringeren CAT-Aktivitätsniveaus führte, realtiv konstante Enzymaktivitätsniveaus über 8 Tage.
  • 21 zeigt die Ergebnisse der in der Leber erreichten Transfektion. Bei beiden Formulierungen erreichte die Transfektion (und CAT-Aktivität) ein Maximum bei 4 Tagen.
  • 22 zeigt die Ergebnisse der in der Milz erreichten Transfektion, wobei herausgefunden wurde, dass die maximale Transfektion bei beiden Formulierungen nach 2 Tagen auftrat.
  • Die Beispiele 12–18 erläutern die Bildung und Charakterisierung von ladungsneutralisierten Lipid-Nucleinsäure-Zwischenkomplexen, in denen die Nucleinsäure einen hydrophoben Charakter annimmt. In jedem dieser Beispiele bezieht sich der Begriff „DNA" oder „Plasmid" auf das Plasmid pCMVβ. Die Beispiele 19 und 20 erläutern die Herstellung und Charakterisierung von Lipid-Nucleinsäure-Teilchen, die für eine Transfektion von Zellen geeignet sind. Die Beispiele 21–23 erläutern die Serumbeständigkeit und Transfektionsfähigkeit dieser Lipid-Nucleinsäure-Teilchen.
  • BEISPIEL 12 (Vergleichsbeispiel)
  • Dieses Beispiel stellt einen Vergleich kationischer Lipide und nicht-kationischer Lipide beim Bewirken der Bildung hydrophober ladungsneutralisierter Lipid-Nucleinsäure-Komplexe zur Verfügung.
  • LIPOFECTIN® besteht aus ultraschallbehandelten einschichtigen Vesikeln, die aus DOTMA und DOPE (Molverhältnis 50 : 50, siehe Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413–7417 (1987)) zusammengesetzt sind. Die Liposomen sind in Wasser hergestellt und werden mit einer Gesamtlipid-Konzentration von 1 mg/ml zur Verfügung gestellt. DNA (10 μg) wurde mit den Liposomen in Wasser gemischt, wie vorstehend in Beispiel 2 beschrieben ist, um von 0 bis 160 nmol Gesamtlipid bereitzustellen. Jede der Mischungen wurde unter Verwendung der Vorgehensweise nach Bligh und Dyer extrahiert. Überraschenderweise gab es in der Gegenwart von LIPOFECTIN® eine konzentrationsabhängige Verringerung der aus der wässrigen Phase wiedergefundenen DNA (siehe 23). Die Zugabe von 80 nmol Gesamtlipid zu 10 μg DNA ergab einen mehr als 95%igen Verlust von DNA aus der wässrigen Phase. Dieser Effekt konnte nicht erreicht werden, wenn Liposomen verwendet wurden, die aus Eier-Phosphatidylcholin/DOPE (Molverhältnis 50 : 50) hergestellt wurden. Somit ist der hydrophobe Komplex, der sich bildet und in die organische Phase gezogen wird, ein Ergebnis des kationischen Lipids, das in dem Komplex vorliegt.
  • BEISPIEL 13 (Vergleichsbeispiel)
  • Dieses Beispiel stellt einen Vergleich mehrerer kationischer Lipide beim Bilden hydrophober ladungsneutralisierter Lipid-Nucleinsäure-Komplexe, die sich in organische Lösungsmittel verteilen, zur Verfügung.
  • Aufgereinigte, monovalente kationische Lipide (DOTMA, DDAB und DODAC) wurden jeweils zu DNA in einem Monophasen-Lösemittelsystem nach Bligh und Dyer gegeben. Die resultierenden Mischungen wurden jeweils durch die Zugabe von Wasser und Chloroform in zwei Phasen getrennt. Die Plasmid-DNA-Gehalte wurden wie vorstehend beschrieben in den wässrigen und organischen Phasen bestimmt. Die Ergebnisse sind in 24 dargestellt und stehen im Einklang mit den in 23 darge stellten Ergebnissen. Im Einzelnen wurde ermittelt, dass ein vom kationischen Lipid abhängiger Verlust an DNA aus der wässrigen Phase vorliegt (24A). Es gab keinen sichtbaren Nachweis für ausgefallenes Material an der wässrig-organischen Grenzfläche und eine Quantifizierung der DNA in den gesammelten Proben, die die Grenzfläche enthalten sollen, erklärten keine nennenswerte DNA-Mengen (Ergebnisse nicht dargestellt). Es wurde herausgefunden, dass die DNA quantitativ in die organische Phase überführt wurde (24B). Zudem konnten mehr als 95% der DNA in der Monophase in der organischen Phase wiedergefunden werden, wenn 40 nmol monovalentes kationisches Lipid zugegeben wurden. Dieser Wert ist identisch mit den Ergebnissen, die in 23 dargestellt werden, in denen 80 nmol LIPOFECTIN® (50 Mol-% DOTMA) zum vollständigen Verlust von DNA aus der wässrigen Phase führten. Die in 24 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass sich die drei verschiedenen monovalenten kationischen Lipide unter den verwendeten Bedingungen in einer ähnlichen Weise verhalten.
  • BEISPIEL 14 (Vergleichsbeispiel)
  • Dieses Beispiel erläutert den Einfluss monovalenter kationischer Lipide und kationischer Nichtlipid-Spezies auf DNA, die sich in organische Lösemittel verteilt.
  • LIPOFECTAMIN® (DOSPA : DOPE, Molverhältnis 75: 25) und TRANSFECTAM® (100% DOGS) wurden DNA (10 μg) als vorab gebildete Liposomen wie in Beispiel 13 beschrieben zugegeben. Die Liposomen enthalten sich von Spermin ableitende Kopfgruppen und weisen positive Ladungen von 5 bzw. 4 bei pH < 7 auf. Wie erwartet werden erheblich kleinere Mengen dieser Lipide (berechnet auf Molbasis) benötigt, um die Abtrennung der DNA in die organische Phase zu vermitteln (siehe Figur 24). Eine vollständige Abtrennung der DNA in die organische Phase wurde nach Zugabe von ungefähr 10 nmol DOSPA und DOGS erreicht.
  • Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass sich DNA zu kleinen ringförmigen oder stabförmigen Strukturen verdichtet, wenn die Phosphatladung der DNA zu mindestens 90% neutralisiert ist (siehe Wilson et al., Biochemistry 18: 2192–2196 (1979). Die in 24 dargestellten Daten wurden daher als Funktion des Kationen/Phosphat-Ladungsverhältnisses (25A und 25B) ausgedrückt. Zum Vergleich sind Ergebnisse, die nach der Zugabe der monovalenten (Lysin), divalenten (Calcium) und multivalenten (Poly-L-Lysin) Kationen auf Nichtlipid-Basis erhalten wurden, eingefügt (25C und 25D). Die in 25 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass sich bei monovalenten kationischen Lipiden mehr als 99% der DNA in die organische Phase abtrennten, wenn ein +/– Ladungsverhältnis von > 1 erreicht wurde. Ähnliche Ergebnisse wurden beobachtet, wenn die polyvalenten Lipide DOSPA und DOGS verwendet wurden, wenn auch ein etwas größeres Ladungsverhältnis erforderlich war, um einen wirksamen DNA-Übergang zu vermitteln. Jedoch trat eine Abtrennung von DNA in die organische Phase nicht als Ergebnis einer einfachen Ladungsneutralisierung auf. Wurde die DNA mit Nichtlipid-Kationen gemischt, wurde der Hauptteil der DNA bei Ladungsverhältnissen von bis zu und über 4 stets in der wässrigen Phase wiedergefunden.
  • BEISPIEL 15 (Vergleichsbeispiel)
  • Dieses Beispiel erläutert, dass die wie in den Beispielen 12–14 beschrieben gebildeten, hydrophoben, ladungsneutralisierten Lipid-Nucleinsäure-Komplexe die Nucleinsäure in einer unverdichteten (ungeschützten) Konfiguration bereitstellen.
  • Die Bewertung der hydrophoben ladungsneutralisierten Lipid-Nucleinsäure-Komplexe wurde durchgeführt, indem die Fähigkeit einer kleinen fluoreszierenden Sonde untersucht wurde, an die Nucleinsäure in dem Komplex zu binden. Diese Bewertung ist einem Ansatz ähnlich, bei dem Ethidiumbromid verwendet wird (siehe Gershon et al. Biochemistry 32: 7143–7151 (1993)). TO-PRO-1 ist ein empfindlicherer, Membranundurchlässiger Nucleinsäure-Interkalationsfarbstoff und stellt daher eine überzeugendere Prüfung der DNA-Bindung zur Verfügung. DNA wurde entweder mit einem monovalenten kationischen Lipid oder Poly-L-Lysin in der Monophase nach Bligh und Dyer gemischt (26A). Dann wurde TO-PRO-1 bis zu einer Endkonzentration von 1 μM zugegeben, und bei 533 nm wurde die Fluoreszenz gemessen (Anregung der Sonde bei 509 nm). In Abwesenheit von DNA wurde keine Fluoreszenz beobachtet. Wurde jedoch Plasmid-DNA zugegeben (10 μg/mL), gab es einen > 600fachen Anstieg der Fluoreszenz bei 533 nm. Wurde TO-PRO-1 der DNA/Poly-L-Lysin-Mischung zugegeben, wurde keine Fluoreszenz beobachtet. Dies steht im Einklang mit der Existenz der DNA in einem verdichteten Zustand aufgrund einer Ladungsneutralisierung. Im drastischen Gegensatz dazu war eine Bindung von TO-PRO-1 bei Zugabe von TO-PRO-1 zu einem hydrophoben ladungsneutralisierten Lipid-Nucleinsäure-Komplex (Plasmid/DODAC-Komplex) nicht ausgeschossen. Dieses Ergebnis steht mit dem Konzept im Einklang, dass DNA innerhalb des hydrophoben Komplexes nicht als verdichtete Struktur existiert. 26B zeigt, dass ähnliche Ergebnisse erhalten wurden, wenn TO-PRO-1 zu Plasmid-DNA gegeben wurde, die entweder mit Poly-L-Lysin oder dem kationischen Lipid DODAC in der Gegenwart von 100 mM OGP, einem nicht-ionischen Detergens gemischt war.
  • BEISPIEL 16 (Vergleichsbeispiel)
  • Dieses Beispiel erläutert die Stabilität des hydrophopen ladungsneutralisierten Lipid-Nucleinsäure-Komplexes in Detergens-Lösungen (27) und die Instabilität in der Gegenwart zugegebener Salze (28).
  • Plasmid-DNA (10 μg) wurde mit 40 nmol DODAC in einer Monophase nach Bligh und Dyer wie in Beispiel 12 beschrieben gemischt. OGP wurde zugegeben, um eine Konzentration von bis zu 20 mM (20 μmol in 1 mL) zu erreichen, bevor die Probe in zwei Phasen getrennt wurde. Diese Konzentration war die maximale Menge, die aus einer Stammlösung mit 2 M OGP zugegeben werden konnte, ohne das Monophasensystem zu zerstören. Ungeachtet der OGP-Konzentration trennten sich mehr als 99% der DNA in die organische Phase ab, was die Stabilität der hydrophopen ladungsneutralisierten Komplexe zeigte.
  • Die Wirkung der Erhöhung der Konzentrationen von NaCl auf die Stabilität des hydrophopen ladungsneutralisierten Lipid-Nucleinsäure-Komplexes wurde auch bewertet. Wie in 28 dargestellt ist, war in der Gegenwart von 1 μmol NaCl die Bindung von monavalentem kationischem Lipid an DNA vollständig gehemmt. Bei dieser Konzentration liegt Na+ in einem 25-molaren Überschuss bezogen auf die Menge an zugegebenem kationischem Lipid vor. Wie erwartet war der Komplex zwischen DNA und dem polyvalenten Lipid DOSPA in der Gegenwart von NaCl stabiler. Tatsächlich verursachte die Zugabe von Na+ in einem 300fachen molaren Überschuss bezogen auf DOSPA keine Abtrennung des ladungsneutralisierten Lipid-Nucleinsäure-Komplexes in die wässrige Phase.
  • BEISPIEL 17 (Vergleichsbeispiel)
  • Dieses Beispiel erläutert den Einfluss der Bindung kationischer Lipide auf die DNA-Migration durch Agarose-Gelelektrophorese.
  • 29A zeigt die Beweglichkeitseigenschaften in Gel der in der Gegenwart von OGP hergestellten ladungsneutralisierten Lipid-Nucleinsäure-Komplexe im Vergleich zu der von mit Poly-L-Lysin verdichteter DNA als Kontrolle. Spur 2 zeigt, dass die DNA/Poly-L-Lysin-Komplexe auf Nichtlipid-Basis eine erheblich verminderte Beweglichkeit in einem Agarosegel zeigen. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit Untersuchungen, die gezeigt haben, dass mit kationischen Liposomen verdichtete DNA eine makromolekulare Struktur annimmt, die sich in einem angelegten elektrischen Feld nicht bewegt (siehe Bertling et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 13: 390–405 (1991)). Diese Wirkung kann eine Folge der Ladungsneutralisierung und/oder Erhöhungen der Molekülgröße sein. Im Gegensatz dazu gibt es, wenn DNA mit kationischen Lipiden unter den Bedingungen von Beispiel 12 gemischt wird, kein Anzeichen, dass sich die Migration von DNA geändert hat (siehe 29A, Spuren 3–5). Diese Untersuchungen schaffen weitere Beweise, die nahe legen, dass an DNA bindendes kationisches Lipid unter Verwendung der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung nicht zur Verdichtung von DNA führt. Veränderungen der DNA-Beweglichkeit wurden jedoch beobachtet, wenn die Konzentration des kationischen Lipids über Ladungsverhältnisse von kationischem Lipid zu DNA-Phosphat von 2 hinaus erhöht wurde (siehe Spuren 6 bis 8). Beispielsweise führte die Zugabe von 320 nmol DODAC zu einer Abnahme der in das Gel migrierenden DNA und einem kleinen DNA-Anteil, der nahe des oberen Endes des Gels migrierte. Dies zeigt, dass eine Verdichtung von DNA mit überschüssigen kationischen Lipiden erreicht werden kann.
  • BEISPIEL 18 (Vergleichsbeispiel)
  • Dieses Beispiel erläutert die Fähigkeit kationischer Lipide, Plasmid-DNA vor enzymatischem Verdau zu schützen.
  • Um die Fähigkeit kationischer Lipide, Plasmid-DNA vor enzymatischem Verdau zu schützen, zu bestimmen, wurde auch der durch DNase 1 vermittelte Abbau des Lipid-Nucleinsäure-Komplexes (wie vorstehend beschrieben hergestellter Plasmid/DODAC-Komplex) unter Verwendung von Agarose-Gelelektrophorese bewertet (siehe 29B). In diesen Versuchen wurde eine Lösung von Plasmid in OGP mit einer ausreichenden Menge DNase 1 gemischt, um nach 10minütiger Inkubation bei 37°C kleine DNA-Fragmente zu erzeugen (Spur 2). Spur 1 zeigt unverdautes Plasmid als Kontrolle. Unter identischen Bedingungen waren die Komplexe (mit dem monokationischen Lipid DODAC komplexiertes Plasmid) nicht gegen die enzymatische Aktivität von DNase 1 geschützt (Spur 4). Aus dem Komplex in Abwesenheit von DNase 1 extrahierte DNA zeigt intakte DNA (Spur 3). Dies schafft einen weiteren Nachweis, dass die Nucleinsäuren in den Lipid-Nucleinsäure-Komplexen in einem unverdichteten Zustand vorliegen und für einen Abbau anfällig sind.
  • BEISPIEL 19 (Vergleichsbeispiel)
  • Dieses Beispiel erläutert die Herstellung von Lipid-Nucleinsäure-Teilchen aus β-Gal, DODAC und ESM.
  • Das kationische Lipid DODAC, das nicht-kationische Lipid ESM und die Nucleinsäure β-Gal-Plasmid wurden unter Verwendung eines Detergens-Dialyse-Verfahren gemäß der „Strategie der Phasenumkehr" (siehe 30) wie folgt formuliert:
  • Einzelne Lösungen von DNA (10 μg in 200 μL von 200 mM wässrigem OGP), DODAC (160 nmol in 400 μL OGP) und ESM (160 nmol in 400 μL OGP) wurden hergestellt. Die ESM- und DODAC-Lösungen wurden jeweils bei geringer Leistung bei 10–20 Impulsen ultraschallbehandelt. Die DNA-Lösung wurde dann zu der ESM-Lösung gegeben und man ließ die Mischung 0,5 Std. bei Raumtemperatur inkubieren. Die DODAC-Lösung wurde langsam der DNA/ESM-Mischung zugegeben während die Mischung bei niedriger Geschwindigkeit verwirbelt wurde. Die resultierende Mischung (1 mL) wurde in ein SPECTRA/POR-Dialyserohr, mwco: 12.000–14.000 (Fisher Scientific) gegeben und gegen jeweils 2 L sechs mal ausgetauschtem destilliertem sterilem Wasser über 36 Stunden dialysiert. Die Größenverteilung der gebildeten Komplexe wurde unter Verwendung der quasielastischen Lichtstreuungs-(QELS-)Technik (Teilchenklassiergerät Nicomp 370, das bei einer Wellenlänge von 632,8 nm betrieben wurde) bestimmt. 31 zeigt, dass zwei Populationen von Teilchen beobachtet wurden, wobei eine Gruppe 50 bis 150 nm und die zweite 500 bis 1000 nm groß war. Die relativen Anzahlen von jeder hing von der Art des (der) verwendeten nicht-kationischen Lipids (Lipide), der Menge und der Konzentration der zwei Lipid-Komponenten und dem DNA/Lipid-Verhältnis ab. Etwa 20–40% des relativen Volumens der Mischung waren die kleineren Komplexe, die über 90% der gesamten Teilchenanzahl ausmachten.
  • BEISPIEL 20 (Vergleichsbeispiel)
  • Dieses Beispiel erläutert den Verdichtungszustand der DNA in dem Lipid-Nucleinsäure-Teilchen.
  • Der fluoreszierende Farbstoff (TO-PRO-1) wurde verwendet, um den Verdichtungszustand der DNA in dem Lipid-Nucleinsäure-Teilchen zu bewerten. Ein Aliquot von 200 μL der Lipid-Nucleinsäure-Teilchen (der 2 μg mit dem in Beispiel 19 angegebenen Ablauf vorbereitete Plasmid-DNA enthielt) wurde mit 100 mM OGP auf 1 mL verdünnt. TO-PRO-1 wurde zugegeben, sodass sich eine Endkonzentration von 1 μM ergab. Um die Fluoreszenz zu messen, wurden spektrofluorometrische Messungen unter Verwendung eines Lumineszenz-Spektrometers 50B (Perkin Elmer Ltd., Buckinghamshire, England) mit einer Anregungswellenlänge von 509 nm und einer Emissionswellenlänge von 533 nm durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 32 dargestellt, in der die Werte als willkürliche Fluoreszenzeinheiten ausgedrückt sind. Wie 32 darstellt, ist Plasmid-DNA in Lipid-Nucleinsäure-Komplexen, die DODAC/ESM enthalten, verdichtet oder durch die Lipid-Komponente geschützt. Darüber hinaus kann das Detergens (OGP) den Komplex lösen, um die Verdichtung der DNA aufzuheben (siehe 32).
  • DNA ist in DODAC/DOPE enthaltenden Lipid-Nucleinsäure-Teilchen für TO-PRO-1 bei einem Ladungsverhältnis (+/–) von 4 : 1 teilweise zugänglich, jedoch ist bei 8 : 1 die DNA vollständig durch die Lipid-Komponente geschützt. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Nucleinsäure (DNA) bei dem niedrigeren Ladungsverhältnis teilweise und bei dem höheren Verhältnis vollständig verdichtet ist (32).
  • BEISPIEL 21 (Vergleichsbeispiel)
  • Dieses Beispiel zeigt die Stabilität von Lipid-Nucleinsäure-Teilchen in Phosphat-gepufferter Salzlösung und in serumhaltigen Medien.
  • Eine Lipid-Nucleinsäure-Teilchen-Formulierung wurde gemäß der in Beispiel 19 beschriebenen Vorgehensweise hergestellt. Teile der Formulierung (unter Verwendung von entweder ESM oder DOPE als das neutrale Lipid) wurden mit PBS (140 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4) oder serumhaltigem Medium zusammengegeben und zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Die resultierenden Komplexe wurden isoliert und auf irgendwelche Veränderungen in den Ergebnissen für die QELS-Größe oder die Transfektions wirksamkeit untersucht. Für keine der Formulierungen wurde ein Unterschied ermittelt, was anzeigt, dass die Komplexe weder durch Natrium noch durch Serumkomponenten zerstört wurden. Ein Teil, der 10 Tage mit PBS inkubiert wurde, zeigte immer noch eine sehr gute Transfektionswirksamkeit.
  • BEISPIEL 22 (Vergleichsbeispiel)
  • Dieses Beispiel erläutert den Schutz von DNA gegen DNase 1, der durch die Lipid-Nucleinsäure-Teilchen gewährt wird.
  • Eine Lipid-Nucleinsäure-Teilchen-Formulierung aus 10 μg DNA, 160 nmol DODAC und 160 nmol ESM in einem Gesamtvolumen von 1 mL wurde gemäß dem in Beispiel 19 beschriebenen Verfahren hergestellt. Die Empfindlichkeit der DNA in dieser Formulierung gegenüber einem Abbau durch DNase 1 wurde durch Mischen der Formulierung mit DNase 1 in der Gegenwart von OGP (Ladungsverhältnis 1 : 1) bewertet. Die Menge von DNase 1 entsprach der, die nicht komplexierte DNA bei 37°C innerhalb von 10 Minuten abbaut. Die Reaktionen wurden nach 10 min durch die Zugabe von 25 mM EDTA beendet. DNA wurde unter Verwendung des Extraktionsverfahrens nach Bligh und Dyer in der Gegenwart von 150 mM NaCl extrahiert. Unter diesen Bedingungen dissoziiert der Komplex aus kanonischem Lipid und DNA und die resultierende DNA kann wirksam aus der wässrigen Fraktion gewonnen werden. Diese DNA wurde mit 1/10 des Volumens an 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 2,5 Volumina 95%igem Ethanol gefällt und durch Zentrifugation bei 14.000 g bei 4°C für 30 min gewonnen. Das DNA-Pellet wurde in sterilem destilliertem Wasser resuspendiert und einer Elektrophorese auf einem 0,8%igen Agarosegel (Gibco, BRL) unterzogen. Die Ergebnisse sind in 33 dargestellt. Wie
  • 33 zeigt, stellen ESM enthaltende Komplexe einen Schutz von DNA vor einem Abbau durch DNase 1 zur Verfügung.
  • BEISPIEL 23 (Vergleichsbeispiel)
  • Dieses Beispiel erläutert die In-vitro-Transfektion von CHO- oder B16-Zelllinien unter Verwendung von durch das Verfahren aus Beispiel 19 hergestellten Lipid-Nucleinsäure-Teilchen.
  • Eine In-vitro-Transfektion wurde unter Verwendung einer Zellkultur-Platte mit 96 Vertiefungen (Costar, Cambridge, Massachusetts, USA) durchgeführt, die 50% zusammenfließendes Wachstum von entweder Ovarialzelllinien des chinesischen Hamsters (CHO) oder Melanomzelllinien der Maus (B16) enthielten. Angemessene Mengen (etwa 6–50 μL) der Lipid-Nucleinsäure-Teilchen-Formulierung (10 μg DNA/mL) wurden mit 10% Serum enthaltendem Medium zu einem Endvolumen von 150 μL vorgemischt. Das die Zellen umgebende Medium wurde unter Verwendung einer Nadelspritze entfernt und durch das Lipid-Nucleinsäure-Teilchen in 10% Serum enthaltende Medium ersetzt. Die Zellen und Komplexe wurden weitere 48 Std. bei 37°C inkubiert. Die Transfektionswirksamkeit wurde unter Verwendung einer β-Gal-Färbung oder eines Enzymaktivitätsassays untersucht. Die Ergebnisse sind in 34 dargestellt.
  • Die Transfektionsuntersuchung zeigte eine hervorragende Transfektionswirksamkeit mit ESM enthaltenden Komplexen und mit DOPE enthaltenden Komplexen (nicht dargestellt). Ein Ladungsverhältnis von kationischem Lipid zu DNA von 3 : 1 bis 4 : 1 ergab die besten In-vitro Transfektionsergebnisse.
  • BEISPIEL 24 (Vergleichsbeispiel)
  • Dieses Beispiel erläutert die Eigenschaften von Nucleinsäure-Lipid-Teilchen, die wie vorstehend beschrieben in der Gegenwart von 100 mM (A) oder 20 mM (B) n-Octyl-β-D-glucopyranosid (OGP) hergestellt wurden.
  • Der Ablauf umfasst die Herstellung von Lösungen von pCMVβ-DNA in OGP und gemischten Lipid-Detergens-Mizellen. DODAC und das neutrale Lipid wurden in der gleichen Konzentration von OGP gelöst, die zum Verdünnen der DNA-Lösung verwendet wurde. Um sicherzustellen, dass die Lipide vollständig gelöst waren, wurden die Mischungen 5 min auf 50 °C erwärmt und kräftig verwirbelt. Es wurden einzelne Lösungen mit oder ohne neutralem Lipid hergestellt. War kein neutrales Lipid einbezogen, wurde die DNA der DODAC-Lösung zugegeben und anschließend leicht verwirbelt und dann 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Lag das neutrale Lipid vor, wurde die DNA enthaltende Detergenslösung mit der das neutrale Lipid enthaltenden Detergenslösung gemischt. Diese Mischung wurde 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und dann einer das kationische Lipid DODAC enthaltenden Detergenslösung zugegeben. Um das Detergens zu entfernen, wurden die Mischungen in Dialyse-Beutel überführt und gegen sechsmal ausgewechseltes steriles Wasser über 72 Std. dialysiert. Das Volumen jeder Probe betrug weniger als 1 mL.
  • Die Bildung von Nucleinsäure-Lipid-Teilchen wurde durch Messen von Veränderungen der 90°-Lichtstreuungsintensität bei 600 nm (Spaltbreite 2,5 nm) beurteilt. Diese Wellenlänge wurde verwendet, weil die Lichtstreuung von Detergens-Mizellen alleine vernachlässigbar war, daher konnte die Bildung von Nucleinsäure-Lipid-Teilchen überwacht werden. Diese Technik wurde auch verwendet, um die Fähigkeit von OGP zu untersuchen, vorab gebildete Liposomen aus DODAC oder SM zu solubilisieren. Mehrschichtige Liposomen wurden bei einer Lipid-Endkonzentration von 1,0 mM durch Hydratisieren von pulverförmigem Lipid in destilliertem Wasser bei 60°C hergestellt. Die Lipid-Suspensionen wurden unter Verwendung einer Ultraschallsonde (Sonilier Cell Disrupter 350, Branson Sonic Power Co. Danbury, CN) 5 min ultraschallbehandelt (100 Watt, 90% Arbeitszyklus, bei 20 kHz), um eine homogene Suspension zu erzeugen. Für die Messung der Lipidauflösung wurde ein Aliquot der Lipid-Suspension mit destilliertem Wasser auf eine Lipid-Endkonzentration von 0,2–1,0 mM verdünnt. Diese Lipid-Suspension wurde mit 200 mM OGP titriert und durch Pipettieren gut gemischt. Die Lichtstreuungsintensität wurde bei Raumtemperatur unter Verwendung eines Lumineszenz-Spektrometers 50B (Perkin Elmer) gemessen.
  • In 100 mM OGP gab es keine erheblichen Veränderungen der beobachteten Lösungstrübung, wenn DNA zu der gemischten DODAC/OGP-Mizellenlösung in der Gegenwart und Abwesenheit von SM gegeben wurde. Nach 3 Stunden Dialyse wurden die Lösungen trübe und die Lichtstreuung erhöhte sich, eine Wiedergabe einer erhöhten Teilchengröße und/oder Aggregation. Nach 4,5 Std. wurde bei Systemen, die in der Abwesenheit von SM hergestellt wurden, eine Abnahme der Lichtstreuung beobachtet, ein Ergebnis der Bildung größerer sichtbarer Aggregate. Wurden die Proben in 20 mM OGP hergestellt (35B), einer Konzentration, die nahe der kritischen Mizellenbildungskonzentration von OGP in der Abwesenheit zugegebener Lipide war, erhöhte sich die Lichtstreuung zu dem Zeitpunkt, an dem DNA den DODAC/OGP-Mizellen zugegeben wurde. Diese Zunahme der Trübung zeigt eine spontane Teilchenbildung runder gemischter Mizellen an. Es ist daher unwahrscheinlich, dass sich Lipidvesikel unter Bedingungen bilden, bei denen die Detergens-Konzentration gleich oder größer als 20 mM ist. Die Bildung von Nucleinsäure-Lipid-Teilchen in der Gegenwart von 20 mM OGP beruht wahrscheinlich nicht auf einer durch DNA vermittelten Aggregation kationischer Liposomen.
  • Wir nehmen an, dass die Bildung von Nucleinsäure-Lipid-Teilchen das Ergebnis des hydrophoben Lipid-DNA-Komplexes ist, der eine Struktur annimmt, die einen Kontakt der Lipid-Acylkette mit Wasser minimiert.
  • Die physikalischen Eigenschaften der Nucleinsäure-Lipid-Teilchen, die sich entweder spontan oder nach Entfernung von Detergens geformt hatten, sind in Tabelle 3 und 37 zusammengefasst. Die bewerteten Parameter umfassen (i) Teilchengröße gemäß Abschätzung durch QELS und Elektronenmikroskopie, (ü) der beobachtete Grad der Aggregation/Ausflockung und (iii) eine Untersuchung der TO-PRO-1-Bindung, ein Interkalationsmittel, das fluoresziert, wenn es an DNA gebunden ist.
  • Da angenommen wird, dass die Bildung von Nucleinsäure-Lipid-Teilchen von der Bindung von kationischem Lipid an DNA abhängig ist, wurden Teilcheneigenschaften unter Bedingungen untersucht, bei denen das Ladungsverhältnis von kationischem Lipid zu anionischem Phosphat von 1 : 1 bis 8 : 1 variiert wurde. Unter Bedingungen, bei denen eine Teilchenbildung nach Entfernung von Detergens (d. h. Lipid- und DNA-Mischungen hergestellt in 100 mM OGP) auftrat, waren die resultierenden Teilchen groß (> 2000 nm) und aggregiert (Tabelle 3). Diese Tendenz zum Aggregieren hing vom Ladungsverhältnis ab.
  • Nach Bildung der Nucleinsäure-Lipid-Teilchen nahm die DNA eine Struktur an, die einer Interkalation von TO-PRO-1 nicht zugänglich war, was nahe legt, dass die DNA verdichtet war. Es sollte angemerkt werden, das ein Verdichtungsindex von 1,0 dem entspricht, der erhalten wird, wenn DNA durch die Zugabe von Polylysin verdichtet wird (Reimer et al., 1995).
  • Wenn niedrige Detergens-Konzentrationen (20 mM OGP) verwendet wurden, um eine spontane Bildung von Nucleinsäure-Lipid-Teilchen zu för dern, gab es keine erhebliche Änderung der Teilchengröße oder des Aggregationszustands als Funktion der Entfernung von Detergens mit Ausnahme bei Ladungsverhältnissen von 1 : 1 und 1,5 : 1 (Tabelle 3), bei denen erhebliche Erhöhungen der Teilchengröße beobachtet wurden.
  • Wie in 37A dargestellt ist, zeigten die QELS-Daten, dass bei Proben, die mit einem Ladungsverhältnis von 2 : 1 hergestellt wurden, die Teilchen homogen waren und einer Gauss'schen Verteilung folgten mit einem mittleren Durchmesser von 59 ± 38 nm.
  • Dieses Ergebnis ist vergleichbar mit Beobachtungen, die mit Negativfärbung-Elektronenmikroskopie gemacht wurden (37B). Nucleinsäure-Lipid-Teilchen wurden unter Verwendung von zwei Verfahren durch Elektronenmikroskopie (EM) bewertet. Zuerst wurden die Proben für die Negativfärbung-EM durch Aufgeben eines Tropfens einer konzentrierten Nucleinsäure-Lipid-Teilchen-Formulierung (3 mM Lipid) auf einen beschichteten FORMVAR-Nickelträger vorbereitet. Nach 1 min wurde die Probe vorsichtig unter Verwendung von Filterpapier abgezogen und mit einer 2,5%igen Ammoniummolybdat-Lösung gefärbt. Die gefärbten Proben wurden sofort untersucht und unter Verwendung eines bei 80 Kv betriebenen Elektronenmikroskops EM10CR von Carl Zeiss fotografiert. Zweitens wurden Nucleinsäure-Lipid-Teilchen für eine Gefrierbruch-EM hergestellt, wobei eine Probe konzentrierter Nucleinsäure-Lipid-Teilchen-Formulierung (15 mM Lipid) mit Glycerin (25% Vol./Vol.) gemischt wurde, in einem Freonbrei gefroren wurde und unter Einsatz eines BAF 400D-Geräts von Balzers einem Gefrierbruch unterzogen wurde. Mikrofotografien wurden unter Verwendung eines Elektronenmikroskops Modell JEM-1200EX von JEOL erhalten.
  • Die aus der elektronenmikroskopischen Gefrierbruch-Analyse der Teilchen erhaltenen Daten (37C) zeigten, dass es ungeachtet der Probenkonzentration (bis zu 15 mM Gesamtlipid) nur wenige Zonen in der Gefrierbruch-Kopie gab, die Bruchoberflächen aufwiesen, die für zweischichtige Membranstrukturen typisch sind. Stattdessen wurden viele Erhebungen auf der Kopie detektiert. Dies steht im Einklang mit der Annahme, dass unter den hier beschriebenen Abläufen eher Teilchen als Liposomen gebildet wurden.
  • Die DNA war nach spontaner Teilchenbildung für TO-PRO-1 zugänglich, und es wurden typischerweise Verdichtungsindizes von weniger als 0,05 vor der Entfernung des Detergens gemessen. Dieses Ergebnis war unerwartet und legt nahe, dass eine Teilchenbildung kein Indikator dafür ist, ob DNA verdichtet ist. Nach der Entfernung des Detergens wurde keine TO-PRO-1-Interkalation beobachtet, und die resultierenden DNA-Verdichtungsindizes waren hoch (= 1,0) (Tabelle 3).
  • Tabelle 3. Eigenschaften von Lipid-DNA-Teilchen, die mit pCMVβ/DODAC/SM gebildet sind und unter Verwendung von 20 mM und 100 mM OGP hergestellt sind, vor und nach der Dialyse Mittlerer Durchmesser ± SD (nm)b
    Figure 01110001
  • DNA-Stabilitätstest
  • Um die Schutzwirkung von Lipiden auf DNA zu bewerten, wurden 100 μl der 1 μg pCMVβ-DNA enthaltenden Formulierungen mit 0,67 Einheiten DNase 1 bei 37°C 20 min in der Gegenwart von Puffer (0,05 M Tris-HCl pH 8,0, 0,01 M MgSO4, 0,1 mM Dithiothreitol) oder 20 mM OGP inkubiert. Die enzymatischen Reaktionen wurden durch die Zugabe von 5 μl 0,5 M EDTA und 3 μl 5 M NaCl beendet. DNA wurde unter Verwendung eines abgewandelten Extraktionsvorgangs nach Bligh und Dyer (Reimer et al., 1995) extrahiert. Unter diesen Bedingungen dissoziierten Lipid und DNA und die resultierende DNA wurde wirksam in der wässrigen Phase wiedergefunden. Die DNA wurde mit 1/10 Volumen Natriumacetat (pH 5,2) und 2,5 Volumina 95%igem Ethanol bei –20°C für 30 min ausgefällt und durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 30 min bei 4°C in einer Mikrozentrifuge (Eppendorf) gewonnen. Das DNA-Pellet wurde in 10 μl sterilem destilliertem Wasser resuspendiert und einer Elektrophorese auf einem 0,8%igem Agarosegel in TBE-Puffer (89 mM Tris-Borat, 2 mM EDTA, pH 8,0) unterzogen.
  • Um die Eigenschaften der Nucleinsäure-Lipid-Teilchen, die als Folge der Komplexbildung aus DNA und kationischem Lipid gebildet wurden, weiter festzulegen, untersuchten wir, ob die DNA in den Nucleinsäure-Lipid-Teilchen gegen die Endonuclease-Aktivität von DNase 1 geschützt war. Dies ist eine wichtige Eigenschaft, da wir diese Systeme für einen In-vitro- und In-vivo-DNA-Transfer entwickeln. Die in 38A dargestellten Ergebnisse zeigen, dass nach Entfernung des Detergens die DNA innerhalb des Teilchens in der Gegenwart von DNase 1 intakt blieb (Spuren 5 und 7). Interessanterweise blieb DNA innerhalb von Teilchen, die sich spontan in der Gegenwart 20 mM OGP gebildet hatten, sogar ohne Detergens-Entfernung in der Gegenwart von DNase 1 intakt (38B, Spur 5).
  • BEISPIEL 25 (Vergleichsbeispiel)
  • Dieses Beispiel erläutert, dass die wie in Beispiel 24 beschrieben hergestellten Nucleinsäure-Lipid-Teilchen als Plasmid-Abgabesystem in vitro brauchbar sind.
  • CHO-Zellen (American Type Tissue Culture, Rockville, MD) wurden mit 2 × 104 Zellen pro Vertiefung auf eine Kulturplatte mit 96 Vertiefungen (Costar, Cambridge, MA) in mit 5% fetalem Rinderserum (FBS) angereichertem αMEM plattiert. Die Zellen wurden 24 Std. in einem Inkubator mit 37°C und 5% CO2 gezüchtet und waren zum Zeitpunkt der Transfektion zu 40–50% zusammengewachsen. Die Medien wurden von den Zellen vor der Zugabe von 100 μl verdünnter Nucleinsäure-Lipid-Teilchen-Formulierungen entfernt, die aus 25 μl Nucleinsäure-Lipid-Teilchen-Formulierung hergestellt wurden, die 0,3–1,2 μg DNA und 75 μl mit 10% FBS angereichertes αMEM enthielt. Die Zellen wurden 4 Std. bei 37°C inkubiert vor der Zugabe von 100 μl αMEM (10% FBS), das 100 μg/ml Gentamicinsulfat enthielt. Die Zellen wurden weiter zwei Tage bei 37°C inkubiert und dann auf β-Galactosidase-Aktivität geprüft. Die Medien wurden aus jeder Vertiefung entfernt und 30 μl eines Zelllysepuffers (0,1% Triton X-100, 250 mM Na2HPO4, pH 8,0) wurde zugegeben. Anschließend wurden 50 μl Rinderserumalbumin (0,5% in Phosphatpuffer, pH 8,0) jeder Vertiefung zugegeben und anschließend wurden 150 μl Chlorphenolrot-Galactopyranosid (CPRG, 1 mg/mL in 60 mM Na2HPO4, 1 mM MgSO4, 10 mM KCl, 50 mM β-Mercaptoethanol) zugegeben. Die Absorption bei 590 nm wurde auf einem Mikrotiterplatten-Lesegerät Titertek Multiscan 310C (Flow Laboratories, Mississauga, ONT) an verschiedenen Zeitpunkten abgelesen und die resultierenden optischen Dichten wurden in mU β-Galactosidase unter Verwendung einer Standardkurve, die für jede Platte erhalten wurde, umgewandelt. Alle Assays wurden in mindestens 3 Vertiefungen pro Platte beurteilt und die Werte sind als Mittelwerte ± Standardabweichungen angegeben.
  • Transfektions-Untersuchungen an Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO) unter Verwendung von Nucleinsäure-Lipid-Teilchen, die unter Verwendung von 100 mM OGP hergestellt wurden, sind in 39 dargestellt und werden durch Enzymproduktion (β-Galactosidase-Aktivität) als das Endprodukt des Gentransfers bewertet. Nur solche Systeme, die > 2000 nm groß waren, waren bei der Transfektion von Zellen wirksam. Die Transfektionswirksamkeit für diese Systeme erhöhte sich mit steigendem (Ladungs-)Verhältnis von kationischem Lipid zu DNA-Nucleotidphosphat von 1 : 1 bis 4 : 1 (39A). Anders als bei Ergebnissen mit vorab gebildeten Liposom-DNA-Aggregaten (siehe z. B. Jarnagin et al., 1992) wurde jedoch die Transfektion nicht durch die Gegenwart von Serum beeinträchtigt.
  • Daten für die durch Teilchen induzierte Zelltoxizität sind in 39B als Verminderung der Enzymaktivität/Vertiefung mit steigenden Mengen der Nucleinsäure-Lipid-Teilchen-Formulierung gezeigt.
  • Ein erheblicher Unterschied zwischen vorab gebildeten Liposom-DNA-Aggregaten und den Nucleinsäure-Lipid-Teilchen betrifft die Verwendung von DOPE als Helferlipid, das für eine optimale Transfektion erforderlich ist (Felgner & Ringold, 1989; Smith et al., 1993, Farhood et al., 1995). Wie in 39C gezeigt ist, waren große Teilchen, die unter Verwendung des Detergens-Dialyse-Verfahrens mit DODAC und SM hergestellt wurden, effektiver bei der Transfektion von CHO-Zellen in vitro als unter Verwendung von DODAC und DOPE hergestellte Teilchen.
  • BEISPIEL 26 (Vergleichsbeispiel)
  • Dieses Beispiel erläutert den Einschluss von Plasmid-DNA in ein Lipid-Vesikel durch das Detergens-Dialyse-Verfahren unter Verwendung verschiedener kationischer Lipide. Das Dialyse-Verfahren ist wie vorstehend für DODAC beschrieben (BEISPIEL 1). Die Menge von eingefangenem Plasmid mit unterschiedlichen Mol-% der verschiedenen kationischen Lipide wurde durch DEAE-Sepharose-Chromatographie (in BEISPIEL 2 beschrieben) bestimmt. Die Einfangwirksamkeit war für alle mit ungefähr 50 bis 60% Plasmid-DNA geprüften kationischen Lipide ähnlich. Die in der Formulierung für einen optimalen Plasmideinschluss erforderliche Konzentration kationischer Lipide betrug 6,5% für DOTMA, DSDAC und DODMA-AN in 41(a); 8% DODAC und DMRIE in 41(b); DCchol in 41(c).
  • BEISPIEL 27 (Vergleichsbeispiel)
  • Dieses Beispiel zeigt die Stabilität von Plasmid enthaltenden Vesikeln, die mit unterschiedlichen kationischen Lipiden hergestellt wurden. Die Serumbeständigkeit und der Schutz des Plasmids vor Serumnucleasen wurden durch das in BEISPIEL 3 beschriebene Verfahren bestimmt. Stabilität und Schutz waren bei allen mit den unterschiedlichen kationischen Lipiden erhaltenen Zubereitungen ähnlich. Als Beispiele sind die Elutionsprofile für Zubereitungen, die DODAC, 42(a), DOTMA, 42(b) und DSDAC, 42(c) enthalten, nach Inkubation in Mäuseserum für 30 min bei 37°C angegeben.
  • BEISPIEL 28 (Vergleichsbeispiel)
  • Dieses Beispiel erläutert den Einschluss von Plasmid-DNA mit dem ionisierbaren Lipid AL-1 (pKa = 6,6) durch das Dialyse-Verfahren (wie in BEISPIEL 1 beschrieben). AL-1 ist bei saurem pH-Wert positiv geladen und neutral bei pH > 7. Unterschiedliche Konzentrationen von AL-1 wurden in den Lipid-Formulierungen bei pH 4,8 bzw. pH 7,5 verwendet. Die Menge an eingeschlossener DNA wurde unter Verwendung des PicoGreen-Assays bestimmt. Zuerst wurde nicht eingeschlossene DNA durch Anionenaustauschchromatographie entfernt und die eingefangene DNA nach Solubilisierung der Lipid-Vesikel in Detergens mit PicoGreen bestimmt. Der Einschluss von Plasmid-DNA unter Verwendung von DODAC ist als Vergleich dargestellt. Bei pH 4,8 wurde ein maximaler Einschluss von ungefähr 75% Plasmid-DNA mit 8% AL-1 ähnlich wie bei der DODAC-Formulierung bei pH 7,5 erreicht. Jedoch wurde mit AL-1 bei pH 7,5 kein DNA-Einfang erhalten. 43. Dies zeigt deutlich das Erfordernis positiv geladener Lipide für einen DNA-Einfang.
  • BEISPIEL 29 (Vergleichsbeispiel)
  • Dieses Beispiel zeigt die Stabilität der mit AL-1 bei pH 4,8 gebildeten, Plasmid enthaltenden Vesikel und den Schutz der eingefangenen DNA vor Abbau durch Serumnucleasen bei pH 7,5. 3H-DNA und 14C-CHE (Cholesterylhexadecylether) wurden verwendet, um die DNA bzw. das Lipid zu verfolgen. Die mit AL-1 bei pH 4,8 gebildeten Vesikel wurden in Mäuseserum für 1,5 Std. bei 37°C und pH 7,5 inkubiert. Die nicht eingeschlossene DNA wurde in den für die Seruminkubation verwendeten Zubereitungen nicht entfernt. Nach Inkubation in Serum wurden die Vesikel auf einer Sepharose-CL6B-Säule getrennt. Lipid und DNA wurden in den verschiedenen Fraktionen durch Radioaktivität detektiert. 44. Ungefähr 60% der DNA war vor Serumnucleasen geschützt. Wurden mit AL-1 bei pH 7,5 gebildete Vesikel in Serum inkubiert, wurde praktisch die gesamte DNA abgebaut und als von Lipiden getrennte Fragmente eluiert. 45.
  • BEISPIEL 30
  • Beispiel 30 zeigt die Wirkung der PEG-Ceramid-Konzentration auf die Einschlusswirksamkeit durch das Dialyse-Verfahren mit 7,5% DODAC und DOPE. Die nicht eingeschlossene DNA in den verschiedenen Formulierungen mit verschiedenen PEG-C14-Konzentrationen wurde durch DEAE-Sepharose-CL6B-Chromatographie abgetrennt. Wiedergefundene DNA und Lipid sind als Funktion von % PEG-C14 dargestellt. Der beste Einfang wurde mit 10 Mol-% PEG-C14 erhalten. 46. Jedoch zeigt ein neuerer Versuch einen optimalen Einfang im Bereich von 10 bis 15 Mol-% (Daten nicht dargestellt).
  • VII. Schlussfolgerung
  • Wie vorstehend erläutert, umfasst die vorliegende Erfindung neue Lipid-Nucleinsäure-Komplexe und Verfahren zu ihrer Herstellung. Bei einer Anzahl von Ausführungsformen können hydrophobe DNA-Zwischenprodukte isoliert werden, und die DNA liegt in einer unverdichteten Form vor, wie durch Farbstoffbindung und DNase-1-Empfindlichkeit gemessen wurde. Diese Komplexe können bei der Herstellung anderer Lipid-Nucleinsäure-Teilchen verwendet werden.
  • In weiteren Ausführungsformen schafft die Erfindung Verfahren zur Herstellung serumbeständiger Nucleinsäure-Lipid-Teilchen, die für die Transfektion von Zellen sowohl in vitro als auch in vivo brauchbar sind.
  • Die für die Herstellung und Verwendungen der verschiedenen Nucleinsäure-Teilchen beschriebenen Verfahren können mit im Wesentlichen jeder Nucleinsäure verwendet werden, die in einem lipophilen Zustand existiert, wenn sie mit einem geeigneten kanonischen Lipid komplexiert wurde. Beispiele für einige Konstrukte umfassen solche, die Adenonsin-Deaminase, den Rezeptor für Lipoproteine niedriger Dichte bei familiärer Hypercholesterinämie, das CTFR-Gen bei Mukoviszidose, Galactocerebrosidase bei Gaucher's Syndrom und Dystrophin oder Utrophin in Muskelzellen bei Duchenne's Muskeldystrophie kodieren.

Claims (50)

  1. Verfahren zur Herstellung von Lipid-Nucleinsäure-Teilchen mit folgenden Schritten: (a) Kontaktieren von Nucleinsäuren mit einer Lösung, die nicht-kationische Lipide, ein Polyethylenglycol-Lipid-Konjugat und ein Detergens enthält, um eine Nucleinsäure-Lipid-Mischung zu bilden, (b) Kontaktieren von kationischen Lipiden mit der Nucleinsäure-Lipid-Mischung, um die negative Ladung der Nucleinsäure zu neutralisieren und eine ladungsneutralisierte Mischung zu bilden, die Detergens, Nucleinsäuren und Lipide enthält, und (c) Entfernen des Detergens aus der ladungsneutralisierten Mischung, um die Lipid-Nucleinsäure-Teilchen zu schaffen, in denen die Nucleinsäuren in dem Lipid eingeschlossen und vor Abbau geschützt sind.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Lösung von Schritt (a) außerdem ein organisches Lösemittel enthält.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Detergens Octyl-β-D-glucopyranosid ist, das kationische Lipid DODAC ist, die nicht-kationischen Lipide Kombinationen von ESM und Polyethylenglycol-Ceramid sind und das Detergens durch Dialyse entfernt wird.
  4. Verfahren zum Einführen einer Nucleinsäure in eine Zelle mit folgenden Schritten: (a) Herstellen eines Lipid-Nucleinsäure-Teilchens nach dem Verfahren von Anspruch 1 und (b) Kontaktieren der Zelle in vitro mit dem Lipid- Nucleinsäure-Teilchen während einer Zeitspanne, die ausreicht, um die Nucleinsäure in die Zelle einzuführen.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem das Lipid-Nucleinsäure-Teilchen ein Plasmid, DODAC und ESM enthält.
  6. Verfahren zur Herstellung von Lipid-Nucleinsäure-Teilchen mit folgenden Schritten: (a) Kontaktieren einer Menge von kationischen Lipiden mit Nucleinsäuren in einer Lösung, wobei die Lösung etwa 15–35% Wasser und etwa 65–85% organisches Lösemittel enthält und die Menge an kationischen Lipiden ausreicht, um ein +/– Ladungsverhältnis von etwa 0,85 bis etwa 2,0 herzustellen, um einen hydrophoben, ladungsneutralisierten Lipid-Nucleinsäure-Komplex zu bilden, (b) Kontaktieren des hydrophoben Lipid-Nucleinsäure-Komplexes in Lösung mit nicht-kationischen Lipiden und einem Polyethylenglycol-Lipid-Konjugat, um eine Lipid-Nucleinsäure-Mischung zu schaffen, und (c) Entfernen der organischen Lösemittel aus der Mischung, um die Lipid-Nucleinsäure-Teilchen zu schaffen, in denen die Nucleinsäuren in dem Lipid eingeschlossen und vor Abbau geschützt sind.
  7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 6, bei dem die kationischen Lipide Glieder sind, ausgewählt aus der aus DODAC, DDAB, DOTMA, DOSPA, DMRIE, DOGS und deren Kombinationen bestehenden Gruppe.
  8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 6, bei dem die nicht-kationischen Lipide Glieder sind, ausgewählt aus der aus ESM, DOPE, auf Polyethylenglycol basierenden Polymeren und deren Kombinationen bestehenden Gruppe.
  9. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die organischen Lösemittel Glieder sind, ausgewählt aus der aus Methanol, Chloroform, Methylenchlorid, Ethanol, Diethylether und deren Kombinationen bestehenden Gruppe.
  10. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Nucleinsäure ein Plasmid ist, das kationische Lipid ein Glied ist, ausgewählt aus der aus DODAC, DDAB, DOTMA, DOSPA, DMRIE, DOGS und deren Kombinationen bestehenden Gruppe, das nicht-kationische Lipid ein Glied ist, ausgewählt aus der aus ESM, DOPE und deren Kombinationen bestehenden Gruppe, und das organische Lösemittel ein Glied ist, ausgewählt aus der aus Methanol, Chloroform, Methylenchlorid, Ethanol, Diethylether und deren Kombinationen bestehenden Gruppe.
  11. Verfahren zum Einführen einer Nucleinsäure in eine Zelle mit folgenden Schritten: (a) Herstellen eines Lipid-Nucleinsäure-Teilchens nach dem Verfahren von Anspruch 7 und (b) Kontaktieren der Zelle in vitro mit dem Lipid-Nucleinsäure-Teilchen während einer Zeitspanne, die ausreicht, um die Nucleinsäure in die Zelle einzuführen.
  12. Lipid-Nucleinsäure-Teilchen, das nach Anspruch 1 oder 6 hergestellt ist.
  13. Verfahren zur Herstellung von serumbeständigen Plasmid-Lipid-Teilchen mit folgenden Schritten: (a) Zusammenbringen eines Plasmids mit kationischen Lipiden in einer Detergenslösung, um einen beschichteten Plasmid-Lipid-Komplex zu schaffen, (b) Kontaktieren von nicht-kationischen Lipiden mit dem beschichteten Plasmid-Lipid-Komplex, um eine Lösung zu schaffen, die ein Detergens, einen Plasmid-Lipid-Komplex, nicht-kationische Lipide und ein Polyethylenglycol-Lipid-Konjugat enthält, und (c) Entfernen des Detergens aus der Lösung von Schritt (b), um eine Lösung von serumbeständigen Plasmid-Lipid-Teil chen zu schaffen, in denen das Plasmid in einer Lipid-Doppelschicht eingeschlossen und vor Abbau geschützt ist, und die Teilchen serumbeständig sind und eine Größe von etwa 50 bis etwa 150 nm haben.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem das Entfernen durch Dialyse erfolgt.
  15. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem außerdem (d) die Teilchen auf eine Größe gebracht werden, um eine einheitliche Teilchengröße zu erreichen.
  16. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die Detergenslösung ein Detergens mit einer kritischen Micellenbildungskonzentration zwischen etwa 20 mM und 50 mM enthält.
  17. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem das Detergens n-Octyl-β-D-glucopyranosid ist.
  18. Verfahren zur Herstellung von serumbeständigen Plasmid-Lipid-Teilchen mit folgenden Schritten: (a) Herstellen einer Mischung, die kationische Lipide, nicht-kationische Lipide und ein Polyethylenglycol-Lipid-Konjugat in einem organischen Lösemittel enthält, (b) Kontaktieren einer wäßrigen Plasmidlösung mit der in Schritt (a) hergestellten Lösung, um eine klare Einphasenlösung zu schaffen, und (c) Entfernen des organischen Lösemittels, um eine Suspension von Plasmid-Lipid-Teilchen zu schaffen, in denen das Plasmid in einer Lipid-Doppelschicht eingeschlossen und vor Abbau geschützt ist, und die Teilchen serumbeständig sind und eine Größe von etwa 50 bis etwa 150 nm haben.
  19. Verfahren nach Anspruch 13 oder 18, bei dem das Polyethylenglycol-Lipid-Konjugat ein PEG-Ceramid-Konjugat ist.
  20. Verfahren nach Anspruch 13 oder 18, bei dem die kationischen Lipide aus der aus DODAC, DDAB, DOTAP, DOTMA, DOSPA, DOGS, DC-Chol und deren Kombinationen bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
  21. Verfahren nach Anspruch 13 oder 18, bei dem die nicht-kationischen Lipide aus der aus DOPE, POPC, EPC und deren Kombinationen bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
  22. Plasmid-Lipid-Teilchen, das nach Anspruch 13 hergestellt ist.
  23. Verfahren zum Einführen eines Plasmids in eine Zelle mit folgenden Schritten: (a) Herstellen eines Plasmid-Lipid-Teilchens nach dem Verfahren von Anspruch 13 und (b) Kontaktieren der Zelle in vitro mit dem Plasmid-Lipid-Teilchen während einer Zeitspanne, die ausreicht, um ein Plasmid in die Zelle einzuführen.
  24. Plasmid-Lipid-Teilchen, das nach Anspruch 18 hergestellt ist.
  25. Verfahren zum Einführen eines Plasmids in eine Zelle mit folgenden Schritten: (a) Herstellen eines Plasmid-Lipid-Teilchens nach dem Verfahren von Anspruch 18 und (b) Kontaktieren der Zelle in vitro mit dem Plasmid-Lipid-Teilchen während einer Zeitspanne, die ausreicht, um das Plasmid in die Zelle einzuführen.
  26. Verfahren nach Anspruch 23 oder 25, bei dem das Plasmid-Lipid-Teilchen ein Plasmid, DODAC, POPC und ein PEG-Ceramid, ausgewählt aus der aus PEG-Cer-C20 und PEG-Cer-C14 bestehenden Gruppe, enthält.
  27. Verfahren nach Anspruch 23 oder 25, bei dem das Plasmid-Lipid-Teilchen ein Plasmid, DODAC, DOPE und ein PEG-Ceramid, ausgewählt aus der aus PEG-Cer-C20 und PEG-Cer-C14 bestehenden Gruppe, enthält.
  28. Nucleinsäure-Lipid-Teilchen zum Einführen einer Nucleinsäure in eine Zelle, wobei das Teilchen ein kationisches Lipid, ein Polyethylenglycol-Lipid-Konjugat, das die Aggregation der Teilchen verhindert, und eine Nucleinsäure enthält, wobei die Nucleinsäurekomponente des Teilchens in dem Lipid eingeschlossen und vor Abbau geschützt ist.
  29. Nucleinsäure-Lipid-Teilchen nach Anspruch 28, wobei das Teilchen im wesentlichen nicht toxisch ist.
  30. Nucleinsäure-Lipid-Teilchen nach Anspruch 28 oder 29, wobei das Teilchen einen mittleren Durchmesser von weniger als 150 nm hat.
  31. Nucleinsäure-Lipid-Teilchen nach einem der Ansprüche 28 bis 30, in dem das kationische Lipid ein Glied ist, ausgewählt aus der Gruppe, die aus N,N-Dioleyl-N,N-dimethylammoniumchlorid (DODAC), N,N-Distearyl-N,N-dimethylammoniumbromid (DDAB), N-(1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTAP), N-(1-(2,3-Dioleyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA) und N,N-Dimethyl-(2,3-dioleyloxy)propylamin (DODMA) und einer Mischung von zwei oder mehreren der obigen besteht.
  32. Nucleinsäure-Lipid-Teilchen nach einem der Ansprüche 28 bis 31, wobei das Teilchen außerdem ein zusätzliches nicht-kationisches Lipid enthält.
  33. Nucleinsäure-Lipid-Teilchen nach Anspruch 32, bei dem das nicht-kationische Lipid aus der aus DOPE, POPC und EPC bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  34. Nucleinsäure-Lipid-Teilchen nach Anspruch 28, bei dem das Polyethylenglycol-Lipid 1% bis etwa 15% des in dem Teilchen vorliegenden Lipids enthält.
  35. Nucleinsäure-Lipid-Teilchen nach Anspruch 28 oder 34, bei dem das Polyethylenglycol-Lipid PEG-Ceramid ist.
  36. Nucleinsäure-Lipid-Teilchen nach Anspruch 35, bei dem das Ceramid des PEG-Ceramids eine Fettsäuregruppe mit 8, 14 oder 20 Kohlenstoffatomen aufweist.
  37. Nucleinsäure-Lipid-Teilchen nach Anspruch 28, bei dem das Polyethylenglycol-Lipid ein PEG-Phosphatidylethanolamin ist.
  38. Nucleinsäure-Lipid-Teilchen nach einem der Ansprüche 28 bis 37, bei dem das Nucleinsäure/Lipid Verhältnis innerhalb des Teilchens wenigstens 5 mg Nucleinsäure pro mmol Lipid beträgt.
  39. Nucleinsäure-Lipid-Teilchen nach einem der Ansprüche 28 bis 38, bei dem die Nucleinsäure DNA ist.
  40. Nucleinsäure-Lipid-Teilchen nach einem der Ansprüche 28 bis 38, bei dem die Nucleinsäure ein Plasmid, ein Antisens-Oligonucleotid oder ein Ribozym ist.
  41. Nucleinsäure-Lipid-Teilchen nach einem der Ansprüche 28 bis 40, bei dem die Nucleinsäurekomponente des Teilchens nach der Inkubation des Teilchens im Serum bei 37°C während 30 Minuten im wesentlichen nicht abgebaut wird.
  42. Nucleinsäure-Lipid-Teilchen nach einem der Ansprüche 28 bis 41, wobei die Transformation der Zellen durch das Teilchen an einer zur Verabreichungsstelle entfernten Stelle während wenigstens vier Tagen nach der intravenösen Injektion nachweisbar ist.
  43. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Nucleinsäure-Lipid-Teilchen und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist, wobei das Nucleinsäure-Lipid-Teilchen ein kationisches Lipid, ein Polyethylenglycol-Lipid-Konjugat, das die Aggregation der Teilchen verhindert, und eine Nucleinsäure enthält, wobei die Nucleinsäurekomponente des Teilchens in dem Lipid eingeschlossen und vor Abbau geschützt ist.
  44. Verfahren zum Einführen einer Nucleinsäure in eine Zelle, bei dem die Zelle in vitro mit einem Nucleinsäure-Lipid-Teilchen kontaktiert wird, das ein kationisches Lipid, ein Polyethylenglycol-Lipid-Konjugat, das die Aggregation der Teilchen verhindert, und eine Nucleinsäure enthält, wobei die Nucleinsäurekomponente des Teilchens in dem Lipid eingeschlossen und vor Abbau geschützt ist.
  45. Verwendung eines Nucleinsäure-Lipid-Teilchens nach einem der Ansprüche 28 bis 42 bei der Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung zum Einführen einer Nucleinsäure in eine Zelle.
  46. Verwendung eines Nucleinsäure-Lipid-Teilchens nach einem der Ansprüche 28 bis 42 bei der Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung für einen in vitro Gentransfer oder einen in vivo Gentransfer.
  47. Verwendung eines Nucleinsäure-Lipid-Teilchens nach einem der Ansprüche 28 bis 42 bei der Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung für die Insertion einer funktionellen Genkopie oder für die Suppression von Genexpression.
  48. Verwendung eines Nucleinsäure-Lipid-Teilchens, das nach dem Verfahren von Anspruch 1 oder 6 erhalten wird, bei der Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung zum Einführen einer Nucleinsäure in eine Zelle.
  49. Verwendung eines Plasmid-Lipid-Teilchens, das nach dem Verfahren von Anspruch 13 oder 18 erhalten wird, bei der Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung zum Einführen eines Plasmids in eine Zelle.
  50. Verwendung eines Nucleinsäure-Lipid-Teilchens bei der Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung zum Einführen einer Nucleinsäure in die Zelle, wobei das Nucleinsäure-Lipid-Teilchen durch ein Verfahren erhalten wird, bei dem eine Zelle mit einem Nucleinsäure-Lipid-Teilchen kontaktiert wird, das ein kationisches Lipid, ein Polyethylenglycol-Lipid-Konjugat, das die Aggregation der Teilchen verhindert, und eine Nucleinsäure enthält, wobei die Nucleinsäurekomponente des Teilchens in dem Lipid eingeschlossen und vor Abbau geschützt ist.
DE69634084T 1995-06-07 1996-06-06 Herstellung von lipid-nukleinsäure partikeln duch ein hydrophobische lipid-nukleinsäuree komplexe zwischenprodukt und zur verwendung in der gentransfer Expired - Lifetime DE69634084T2 (de)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/485,458 US5705385A (en) 1995-06-07 1995-06-07 Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US484282 1995-06-07
US08/484,282 US5981501A (en) 1995-06-07 1995-06-07 Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US485458 1995-06-07
PCT/US1996/009949 WO1996040964A2 (en) 1995-06-07 1996-06-06 Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69634084D1 DE69634084D1 (de) 2005-01-27
DE69634084T2 true DE69634084T2 (de) 2005-12-08

Family

ID=27047938

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69634084T Expired - Lifetime DE69634084T2 (de) 1995-06-07 1996-06-06 Herstellung von lipid-nukleinsäure partikeln duch ein hydrophobische lipid-nukleinsäuree komplexe zwischenprodukt und zur verwendung in der gentransfer

Country Status (10)

Country Link
US (1) US5976567A (de)
EP (2) EP0832271B8 (de)
JP (2) JP4335310B2 (de)
AT (1) ATE285477T1 (de)
AU (1) AU723163B2 (de)
CA (1) CA2222328C (de)
DE (1) DE69634084T2 (de)
ES (1) ES2231819T3 (de)
IL (2) IL122290A0 (de)
WO (1) WO1996040964A2 (de)

Families Citing this family (466)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6727230B1 (en) 1994-03-25 2004-04-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US20030026782A1 (en) * 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6630455B1 (en) 1995-01-13 2003-10-07 Vanderbilt University Methods for inducing mucosal immune responses
US6008202A (en) 1995-01-23 1999-12-28 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US5795587A (en) 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US20030069173A1 (en) * 1998-03-16 2003-04-10 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced transfections
US7422902B1 (en) * 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5981501A (en) * 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
WO1997004748A2 (en) * 1995-08-01 1997-02-13 Advanced Therapies, Inc. Enhanced artificial viral envelopes for cellular delivery of therapeutic substances
US5855911A (en) * 1995-08-29 1999-01-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal phosphodiester, phosphorothioate, and P-ethoxy oligonucleotides
EP0855919B1 (de) * 1995-10-18 2003-07-23 Vanderbilt University Induktion von immunantworten der schleimhäute durch verabreichung von vitamine d3 und dns, die für ein antigen kodiert und die mit mit einem kationischen lipid ein complex bildet.
US10011247B2 (en) 1996-03-27 2018-07-03 Gtj Ventures, Llc Control, monitoring and/or security apparatus and method
US7253731B2 (en) 2001-01-23 2007-08-07 Raymond Anthony Joao Apparatus and method for providing shipment information
US10152876B2 (en) 1996-03-27 2018-12-11 Gtj Ventures, Llc Control, monitoring, and/or security apparatus and method
US6093816A (en) * 1996-06-27 2000-07-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Cationic lipids
US7309692B1 (en) * 1996-07-08 2007-12-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of chronic myelogenous leukemic cell growth by liposomal-antisense oligodeoxy-nucleotides targeting to GRB2 or CRK1
PT941066E (pt) * 1996-08-26 2004-03-31 Transgene Sa Complexos de lipido cationico - acido nucleico
ES2305157T3 (es) * 1996-09-13 2008-11-01 Lipoxen Technologies Limited Liposomas.
US6977244B2 (en) 1996-10-04 2005-12-20 Board Of Regents, The University Of Texas Systems Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
US6884430B1 (en) 1997-02-10 2005-04-26 Aventis Pharma S.A. Formulation of stabilized cationic transfection agent(s) /nucleic acid particles
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
US20030104044A1 (en) * 1997-05-14 2003-06-05 Semple Sean C. Compositions for stimulating cytokine secretion and inducing an immune response
US6835395B1 (en) 1997-05-14 2004-12-28 The University Of British Columbia Composition containing small multilamellar oligodeoxynucleotide-containing lipid vesicles
EP2113247A3 (de) 1997-05-14 2010-05-05 The University Of British Columbia Hochwirksame Verkapselung von Nukleinsäuren in Lipidvesikeln
CA2289702C (en) 1997-05-14 2008-02-19 Inex Pharmaceuticals Corp. High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles
WO1998058630A1 (en) * 1997-06-23 1998-12-30 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Liposome-entrapped polynucleotide composition and method
WO1999004819A1 (en) * 1997-07-24 1999-02-04 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for the delivery of nucleic acid catalysts
WO1999005303A1 (en) * 1997-07-24 1999-02-04 Inex Pharmaceuticals Corporation Preparation of lipid-nucleic acid particles using a solvent extraction and direct hydration method
US7285288B1 (en) 1997-10-03 2007-10-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
US7704962B1 (en) * 1997-10-03 2010-04-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Small oligonucleotides with anti-tumor activity
US6734171B1 (en) * 1997-10-10 2004-05-11 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating nucleic acids in lipid bilayers
DE69837274T2 (de) * 1997-10-10 2007-11-08 Inex Pharmaceuticals Corp., Burnaby Verfahren zur verkapselung von nukleinsäuren in lipiddoppelschichten
US6387695B1 (en) * 1997-12-23 2002-05-14 Merck & Co., Inc. DNA pharmaceutical formulations comprising citrate or triethanolamine and combinations thereof
ATE366121T1 (de) * 1998-02-03 2007-07-15 Protiva Biotherapeutics Inc Systemische verabreichung von serum-stabilen plasmid-lipid partikeln zur krebstherapie
US6410328B1 (en) 1998-02-03 2002-06-25 Protiva Biotherapeutics Inc. Sensitizing cells to compounds using lipid-mediated gene and compound delivery
US9075136B1 (en) 1998-03-04 2015-07-07 Gtj Ventures, Llc Vehicle operator and/or occupant information apparatus and method
US6841537B1 (en) 1998-04-22 2005-01-11 Protiva Biotherapeutics Inc. Combination therapy using nucleic acids and conventional drugs
US6841538B1 (en) 1998-04-22 2005-01-11 Inex Pharmaceuticals Corporation Combination therapy using nucleic acids and radio therapy
US7244714B1 (en) * 1998-06-12 2007-07-17 Aradigm Corporation Methods of delivering aerosolized polynucleotides to the respiratory tract
JP2002518313A (ja) * 1998-06-19 2002-06-25 ジエンザイム コーポレイション カチオン性両親媒性ミセル複合体
US20040247662A1 (en) * 1998-06-25 2004-12-09 Dow Steven W. Systemic immune activation method using nucleic acid-lipid complexes
US20030022854A1 (en) 1998-06-25 2003-01-30 Dow Steven W. Vaccines using nucleic acid-lipid complexes
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
WO2000027795A1 (en) 1998-11-12 2000-05-18 Invitrogen Corporation Transfection reagents
US6903077B1 (en) * 1999-01-04 2005-06-07 University Of Vermont And State Agricultural College Methods and products for delivering nucleic acids
ATE272410T1 (de) * 1999-03-26 2004-08-15 Vical Inc Adjuvanszusammensetzungen zur erhöhung der immunantwort auf polynukleotid-basierende impfstoffe
US7311924B2 (en) * 1999-04-01 2007-12-25 Hana Biosciences, Inc. Compositions and methods for treating cancer
US6852334B1 (en) * 1999-04-20 2005-02-08 The University Of British Columbia Cationic peg-lipids and methods of use
US7094423B1 (en) * 1999-07-15 2006-08-22 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for preparation of lipid-encapsulated therapeutic agents
WO2001013723A1 (en) * 1999-08-20 2001-03-01 Mirus Corporation Charge reversal of polyion complexes
US20050249794A1 (en) * 1999-08-27 2005-11-10 Semple Sean C Compositions for stimulating cytokine secretion and inducing an immune response
DE19944262A1 (de) * 1999-09-15 2001-03-29 Cardiogene Gentherapeutische S Pharmazeutische Zusammensetzung in Form eines Nukleinsäure-Lipid-Komplexes, ihre Herstellung und Verwendung in der Gentherapie
CA2386270A1 (en) * 1999-10-15 2001-04-26 University Of Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
US6458382B1 (en) * 1999-11-12 2002-10-01 Mirus Corporation Nucleic acid transfer complexes
WO2001060414A2 (en) * 2000-02-17 2001-08-23 Genzyme Corporation Genetic modification of the lung as a portal for gene delivery
JP2003523377A (ja) * 2000-02-25 2003-08-05 ヘルス リサーチ インコーポレイテッド 分子の経皮的又は皮内送達のための方法
US20060127466A1 (en) * 2000-02-25 2006-06-15 Arindam Sen Method for transdermal or intradermal delivery of molecules
EP1133994A1 (de) * 2000-03-11 2001-09-19 Biognostik Gesellschaft für biomolekulare Diagnostik mbH Verfahren zür Umwandlung des immunosuppresive effekts von MIA (Melanoma Inhibitory Activity)
ES2336887T5 (es) 2000-03-30 2019-03-06 Whitehead Inst Biomedical Res Mediadores de interferencia por ARN específicos de secuencias de ARN
JP2004508012A (ja) * 2000-04-20 2004-03-18 ザ　ユニバーシティ　オブ　ブリティッシュ　コロンビア エンドソーム膜不安定剤を用いたｓｐｌｐ媒介性トランスフェクションの強化方法
US7189705B2 (en) 2000-04-20 2007-03-13 The University Of British Columbia Methods of enhancing SPLP-mediated transfection using endosomal membrane destabilizers
IL153676A0 (en) * 2000-06-30 2003-07-06 Inex Pharmaceuticals Corp Liposomal pharmaceutical compositions
US7452550B2 (en) * 2000-06-30 2008-11-18 Hana Biosciences, Inc. Liposomal antineoplastic drugs and uses thereof
EP2241308A3 (de) 2000-10-04 2010-11-17 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Methode zur Beschichtung feiner Teilchen mit einem Lipidfil
NZ525440A (en) * 2000-10-27 2005-03-24 Invitrogen Corp Method for introducing antisense oligonucleotides into eucaryotic cells using cationic lipids
DK2813582T3 (en) 2000-12-01 2017-07-31 Max-Planck-Gesellschaft Zur Förderung Der Wss E V Small RNA molecules that mediate RNA interference
US20110301569A1 (en) 2001-01-20 2011-12-08 Gordon Wayne Dyer Methods and apparatus for the CVCS
CA2445947A1 (en) * 2001-04-30 2002-11-07 Targeted Genetics Corporation Lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
WO2002087541A1 (en) * 2001-04-30 2002-11-07 Protiva Biotherapeutics Inc. Lipid-based formulations for gene transfer
US20030059899A1 (en) * 2001-09-26 2003-03-27 Murali Sastry Method for the hydrophobisation of DNA molecules
WO2003039595A2 (en) * 2001-11-07 2003-05-15 Inex Pharmaceuticals Corporation Mucosal adjuvants comprising an oligonucleotide and a cationic lipid
US7223887B2 (en) * 2001-12-18 2007-05-29 The University Of British Columbia Multivalent cationic lipids and methods of using same in the production of lipid particles
EP1460898A4 (de) * 2002-01-03 2006-05-24 Univ Texas Wt1-antisense-oligos für die hemmung von brustkrebs
EP1479985B1 (de) 2002-01-17 2017-06-14 Alfa Laval Corporate AB Getauchter Verdampfer umfassend einen Plattenwärmetauscher und ein zylindrisches Gehäuse in dem der Plattenwärmetauscher angeordnet ist
US10562492B2 (en) 2002-05-01 2020-02-18 Gtj Ventures, Llc Control, monitoring and/or security apparatus and method
US20040009944A1 (en) * 2002-05-10 2004-01-15 Inex Pharmaceuticals Corporation Methylated immunostimulatory oligonucleotides and methods of using the same
US20040013649A1 (en) * 2002-05-10 2004-01-22 Inex Pharmaceuticals Corporation Cancer vaccines and methods of using the same
US8496961B2 (en) 2002-05-15 2013-07-30 Sutter West Bay Hospital Delivery of nucleic acid-like compounds
JP2005529959A (ja) * 2002-06-14 2005-10-06 マイラス コーポレイション 細胞へのポリヌクレオチドの伝達をするための新規な方法
JP4722481B2 (ja) * 2002-06-28 2011-07-13 プロティバ バイオセラピューティクス リミテッド リポソーム製造方法および装置
US20040151729A1 (en) * 2002-10-28 2004-08-05 George Michalopoulos Novel long-term three-dimensional culture system
BR0316402A (pt) * 2002-11-21 2006-02-21 Pevion Biotech Ltd vesìcula fusogênica, métodos para preparar uma vesìcula fusogênica encapsulante, e para encapsular pelo menos uma substáncia terapêutica ou imunologicamente ativa em uma vesìcula fusogênica, uso de uma vesìcula fusogênica, e, formulação farmacêutica
US20040191803A1 (en) * 2002-11-22 2004-09-30 Michela Gallagher Target for therapy of cognitive impairment
WO2004053104A2 (en) 2002-12-11 2004-06-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5’ cpg nucleic acids and methods of use
ATE513471T1 (de) 2003-04-21 2011-07-15 Epeius Biotechnologies Corp Verfahren und zusammensetzungen zur behandlung von erkrankungen
US20070178066A1 (en) * 2003-04-21 2007-08-02 Hall Frederick L Pathotropic targeted gene delivery system for cancer and other disorders
US7771711B2 (en) * 2003-06-18 2010-08-10 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Sphingolipids' polyalkylamines conjugates
WO2005007196A2 (en) 2003-07-16 2005-01-27 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering rna
CA2536333C (en) * 2003-08-28 2013-01-08 Jan Weiler Interfering rna duplex having blunt-ends and 3'-modifications
KR101164256B1 (ko) * 2003-09-15 2012-07-10 프로티바 바이오쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 폴리에틸렌글리콜 개질된 지질 화합물 및 그의 용도
AU2004280143A1 (en) * 2003-10-11 2005-04-21 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Methods and compositions for enhancing innate immunity and antibody dependent cellular cytotoxicity
US20050181035A1 (en) * 2004-02-17 2005-08-18 Dow Steven W. Systemic immune activation method using non CpG nucleic acids
ES2423060T3 (es) 2004-03-12 2013-09-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Agentes iRNA que tienen como diana al VEGF
AU2005321469B2 (en) 2004-05-05 2012-04-05 Silence Therapeutics Gmbh Lipid complexes coated with peg and their use
CN102940891B (zh) 2004-05-05 2016-02-24 赛伦斯治疗有限公司 脂质、脂质复合物及其应用
EP1750673B1 (de) * 2004-05-17 2009-12-02 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Liposomale formulierungen mit dihydrosphingomyelin und verfahren zu ihrer verwendung
CA2572450A1 (en) 2004-05-28 2005-12-15 Ambion, Inc. Methods and compositions involving microrna
EP1766035B1 (de) * 2004-06-07 2011-12-07 Protiva Biotherapeutics Inc. Lipidverkapselte interferenz-rna
WO2005120152A2 (en) 2004-06-07 2005-12-22 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods of use
JP2008504827A (ja) * 2004-07-02 2008-02-21 プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド 免疫賦活性ｓｉＲＮＡ分子およびその使用方法
WO2006007712A1 (en) * 2004-07-19 2006-01-26 Protiva Biotherapeutics, Inc. Methods comprising polyethylene glycol-lipid conjugates for delivery of therapeutic agents
WO2006017476A2 (en) * 2004-08-02 2006-02-16 The Research Foundation Of State University Of New York Amino functionalized ormosil nanoparticles as delivery vehicles
US20060045872A1 (en) 2004-08-25 2006-03-02 Universidad Autonoma De Madrid Ciudad Universitaria de Cantoblanco Use of adipose tissue-derived stromal stem cells in treating fistula
WO2006052767A2 (en) * 2004-11-05 2006-05-18 Inex Pharmaceuticals Corporation Compositions and methods for stabilizing liposomal camptothecin formulations
EP2302055B1 (de) 2004-11-12 2014-08-27 Asuragen, Inc. Verfahren und Zusammensetzungen, die miRNAs und miRNAa-inhibitorischen Molekülen verbunden sind
AU2005306533B2 (en) * 2004-11-17 2012-05-31 Arbutus Biopharma Corporation siRNA silencing of apolipoprotein B
CN101589137B (zh) 2005-03-31 2013-06-05 斯丹姆涅恩有限公司 羊膜来源的细胞组合物及其制备方法和用途
EP1736552A1 (de) * 2005-06-22 2006-12-27 Universität Osnabrück Nukleolipide und deren Verwendung, sowie Vorrichtungen zur Nukleinsäureanalytik
CN101267805A (zh) 2005-07-27 2008-09-17 普洛体维生物治疗公司 制造脂质体的系统和方法
US20070054873A1 (en) * 2005-08-26 2007-03-08 Protiva Biotherapeutics, Inc. Glucocorticoid modulation of nucleic acid-mediated immune stimulation
WO2007048046A2 (en) * 2005-10-20 2007-04-26 Protiva Biotherapeutics, Inc. Sirna silencing of filovirus gene expression
US8101741B2 (en) 2005-11-02 2012-01-24 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified siRNA molecules and uses thereof
RU2448703C2 (ru) 2005-11-23 2012-04-27 Дзе Борд Оф Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Техас Систем Онкогенное ras-специфичное цитотоксическое соединение и способы его применения
WO2007119892A1 (en) * 2006-04-17 2007-10-25 Chabiotech Co., Ltd. Methods for vitrification of human oocytes
AU2013257401B2 (en) * 2006-04-20 2016-03-17 Silence Therapeutics Gmbh Lipoplex formulations for specific delivery to vascular endothelium
ES2549728T3 (es) * 2006-04-20 2015-11-02 Silence Therapeutics Gmbh Formulaciones de lipoplexo para la administración específica al endotelio vascular
GB0608838D0 (en) 2006-05-04 2006-06-14 Novartis Ag Organic compounds
EA015676B1 (ru) 2006-05-11 2011-10-31 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. Композиции и способы ингибирования экспрессии гена pcsk9
US8598333B2 (en) * 2006-05-26 2013-12-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. SiRNA silencing of genes expressed in cancer
US7915399B2 (en) 2006-06-09 2011-03-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified siRNA molecules and uses thereof
US20080213349A1 (en) * 2006-09-11 2008-09-04 Deepak Ramesh Thakker Liposome Complexes Containing Pharmaceutical Agents and Methods
CA2663878A1 (en) * 2006-09-19 2008-03-27 Asuragen, Inc. Mir-200 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
WO2008036933A2 (en) 2006-09-21 2008-03-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the hamp gene
ES2623141T3 (es) 2007-01-17 2017-07-10 Noveome Biotherapeutics, Inc. Nuevos métodos para modular respuestas inflamatorias y/o inmunitarias
PE20090064A1 (es) 2007-03-26 2009-03-02 Novartis Ag Acido ribonucleico de doble cadena para inhibir la expresion del gen e6ap humano y composicion farmaceutica que lo comprende
US20100184823A1 (en) 2007-07-05 2010-07-22 Mark Aron Labow dsRNA For Treating Viral Infection
US8716255B2 (en) 2007-08-10 2014-05-06 British Columbia Cancer Agency Branch Microrna compositions and methods for the treatment of myelogenous leukemia
US8361714B2 (en) 2007-09-14 2013-01-29 Asuragen, Inc. Micrornas differentially expressed in cervical cancer and uses thereof
CN101939027B (zh) * 2007-10-02 2014-07-30 玛瑞纳生物技术有限公司 用于递送核酸的脂肽
US8097712B2 (en) 2007-11-07 2012-01-17 Beelogics Inc. Compositions for conferring tolerance to viral disease in social insects, and the use thereof
AU2008325122A1 (en) * 2007-11-09 2009-05-14 Northeastern University Self-assembling micelle-like nanoparticles for systemic gene delivery
WO2009070805A2 (en) 2007-12-01 2009-06-04 Asuragen, Inc. Mir-124 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
AU2008333811B2 (en) 2007-12-04 2014-05-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides
EP2617828B1 (de) 2007-12-10 2014-09-24 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Zusammensetzungen und Verfahren zur Hemmung der Faktor VII-Genexpression
AU2008342535B2 (en) 2007-12-27 2015-02-05 Arbutus Biopharma Corporation Silencing of polo-like kinase expression using interfering RNA
EP3100718B1 (de) 2008-01-02 2019-11-27 Arbutus Biopharma Corporation Verbesserte zusammensetzungen und verfahren zur freisetzung von nukleinsäuren
WO2009102427A2 (en) 2008-02-11 2009-08-20 Rxi Pharmaceuticals Corp. Modified rnai polynucleotides and uses thereof
EP2712926A2 (de) * 2008-03-05 2014-04-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Zusammensetzungen und Verfahren zur Hemmung der Expression des Eg5- und des VEGF-Gens
EP2770057A1 (de) 2008-04-15 2014-08-27 Protiva Biotherapeutics Inc. Stilllegung von CSN5-Genexpression mittels interferierender RNA
NZ588583A (en) 2008-04-15 2012-08-31 Protiva Biotherapeutics Inc Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
EP2990487A1 (de) 2008-05-08 2016-03-02 Asuragen, INC. Zusammensetzungen und verfahren in zusammenhang mit der mirna-modulation von neovaskularisation oder angiogenese
US8815818B2 (en) 2008-07-18 2014-08-26 Rxi Pharmaceuticals Corporation Phagocytic cell delivery of RNAI
EP2690175B1 (de) 2008-09-02 2016-12-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Zusammensetzungen und Verfahren zur kombinierten Hemmung der Expression eines mutierenden EGFR-Gens und IL-6
US10138485B2 (en) 2008-09-22 2018-11-27 Rxi Pharmaceuticals Corporation Neutral nanotransporters
JP5529142B2 (ja) 2008-09-25 2014-06-25 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 血清アミロイドａ遺伝子の発現を阻害するための脂質製剤組成物および方法
ES2475065T3 (es) 2008-10-09 2014-07-10 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Aminol�pidos mejorados y métodos para la administración de ácidos nucleicos
KR20110071017A (ko) * 2008-10-16 2011-06-27 마리나 바이오테크, 인크. 유전자 침묵 치료제의 리포좀에 의한 효율적인 전달을 위한 프로세스 및 조성물
SI2937418T1 (en) 2008-10-20 2018-02-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compounds and procedures for inhibiting the expression of transthyretin
CA2741373A1 (en) 2008-10-30 2010-06-03 Peixuan Guo Membrane-integrated viral dna-packaging motor protein connector biosensor for dna sequencing and other uses
KR20220150995A (ko) 2008-11-10 2022-11-11 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 치료제 운반용 신규 지질 및 조성물
US9074211B2 (en) 2008-11-19 2015-07-07 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of MAP4K4 through RNAI
JP5855462B2 (ja) 2008-12-10 2016-02-09 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ＧＮＡＱを標的としたｄｓＲＮＡ組成物および発現を阻害するための方法
US9493774B2 (en) 2009-01-05 2016-11-15 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of PCSK9 through RNAi
EP3243504A1 (de) 2009-01-29 2017-11-15 Arbutus Biopharma Corporation Verbesserte lipidformulierung
US9745574B2 (en) 2009-02-04 2017-08-29 Rxi Pharmaceuticals Corporation RNA duplexes with single stranded phosphorothioate nucleotide regions for additional functionality
US20120041051A1 (en) 2009-02-26 2012-02-16 Kevin Fitzgerald Compositions And Methods For Inhibiting Expression Of MIG-12 Gene
WO2010105209A1 (en) 2009-03-12 2010-09-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. LIPID FORMULATED COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING EXPRESSION OF Eg5 AND VEGF GENES
MX2011009724A (es) 2009-03-19 2011-10-14 Merck Sharp & Dohme Inhibicion mediada por interferencia de acido ribonucleico de la expresion del gen del factor de transcripcion basico de cierre de leucina 1 de homologia de btb y cnc 1, usando el listado de secuencias de acido nucleico corto de interferencia.
WO2010107958A1 (en) 2009-03-19 2010-09-23 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF SIGNAL TRANSDUCER AND ACTIVATOR OF TRANSCRIPTION 6 (STAT6) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
WO2010107952A2 (en) 2009-03-19 2010-09-23 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF CONNECTIVE TISSUE GROWTH FACTOR (CTGF) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
WO2010107957A2 (en) 2009-03-19 2010-09-23 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GATA BINDING PROTEIN 3 (GATA3) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20120022143A1 (en) 2009-03-27 2012-01-26 Merck Sharp & Dohme Corp RNA Interference Mediated Inhibition of the Thymic Stromal Lymphopoietin (TSLP) Gene Expression Using Short Interfering Nucliec Acid (siNA)
US20120004281A1 (en) 2009-03-27 2012-01-05 Merck Sharp & Dohme Corp RNA Interference Mediated Inhibition of the Nerve Growth Factor Beta Chain (NGFB) Gene Expression Using Short Interfering Nucleic Acid (siNA)
US20120022142A1 (en) 2009-03-27 2012-01-26 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA Interference Mediated Inhibition of Signal Transducer and Activator of Transcription 1 (STAT1) Gene Expression Using Short Interfering Nucleic Acid (siNA)
WO2010111464A1 (en) 2009-03-27 2010-09-30 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF APOPTOSIS SIGNAL-REGULATING KINASE 1 (ASK1) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
KR20110138223A (ko) 2009-03-27 2011-12-26 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 짧은 간섭 핵산 (ｓｉＮＡ)을 사용한 세포간 부착 분자 1 (ＩＣＡＭ-1) 유전자 발현의 ＲＮＡ 간섭 매개 억제
CA3042927C (en) 2009-05-05 2022-05-17 Arbutus Biopharma Corporation Lipid compositions for the delivery of therapeutic agents
KR102205886B1 (ko) 2009-06-10 2021-01-21 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 향상된 지질 조성물
US9051567B2 (en) 2009-06-15 2015-06-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Methods for increasing efficacy of lipid formulated siRNA
KR20120050429A (ko) 2009-06-15 2012-05-18 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 Ｐｃｓｋ9 유전자를 표적으로 하는 지질 제형된 ｄｓｒｎａ
WO2011000106A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Improved cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
WO2011000107A1 (en) * 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for delivery of therapeutic agents to solid tumors
US9018187B2 (en) 2009-07-01 2015-04-28 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
WO2011011447A1 (en) 2009-07-20 2011-01-27 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing ebola virus gene expression
US9029338B2 (en) 2009-08-14 2015-05-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of a gene from the ebola virus
WO2011038160A2 (en) 2009-09-23 2011-03-31 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing genes expressed in cancer
JP2013507365A (ja) 2009-10-07 2013-03-04 サンフォード−バーナム メディカル リサーチ インスティテュート 血餅結合脂質化合物に関する方法および組成物
US8962584B2 (en) 2009-10-14 2015-02-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. Compositions for controlling Varroa mites in bees
WO2011056682A1 (en) 2009-10-27 2011-05-12 The University Of British Columbia Reverse head group lipids, lipid particle compositions comprising reverse headgroup lipids, and methods for the delivery of nucleic acids
ES2713852T3 (es) 2009-12-01 2019-05-24 Translate Bio Inc Derivado de esteroides para la administración de ARNm en enfermedades genéticas humanas
WO2011071860A2 (en) 2009-12-07 2011-06-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions for nucleic acid delivery
WO2011075656A1 (en) 2009-12-18 2011-06-23 The University Of British Columbia Methods and compositions for delivery of nucleic acids
HUE033056T2 (hu) 2010-03-08 2017-11-28 Monsanto Technology Llc Polinukleotid molekulák génszabályozáshoz növényekben
EP2550002B1 (de) 2010-03-24 2019-05-08 Phio Pharmaceuticals Corp. Rna-interferenz bei dermalen und fibrotischen erkrankungen
EP2550000A4 (de) 2010-03-24 2014-03-26 Advirna Inc Selbstfreisetzende rnai-verbindungen von reduzierter grösse
US9095504B2 (en) 2010-03-24 2015-08-04 Rxi Pharmaceuticals Corporation RNA interference in ocular indications
ES2893199T3 (es) 2010-03-29 2022-02-08 Alnylam Pharmaceuticals Inc Terapia de ARNbc para amiloidosis ocular relacionada con transtiretina (TTR)
EP2382994A1 (de) 2010-04-26 2011-11-02 Maurizio Victor Cattaneo Durch Liganden gezielrichtete Nanokapseln zur Verabreichung von RNAi und anderen Wirkstoffen
US20130156845A1 (en) 2010-04-29 2013-06-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated single stranded rna
WO2011141705A1 (en) 2010-05-12 2011-11-17 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel cationic lipids and methods of use thereof
US10077232B2 (en) 2010-05-12 2018-09-18 Arbutus Biopharma Corporation Cyclic cationic lipids and methods of use
JP6081910B2 (ja) 2010-06-02 2017-02-15 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 肝線維症治療用組成物および肝線維症の治療法
CN103096875B (zh) 2010-06-03 2016-08-17 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于递送活性剂的生物可降解脂质
CA2802994A1 (en) 2010-06-17 2011-12-22 The United States Of America As Represented By The Secretary, National I Nstitutes Of Health Compositions and methods for treating inflammatory conditions
WO2012000104A1 (en) 2010-06-30 2012-01-05 Protiva Biotherapeutics, Inc. Non-liposomal systems for nucleic acid delivery
WO2012016188A2 (en) 2010-07-30 2012-02-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for delivery of active agents
WO2012016184A2 (en) 2010-07-30 2012-02-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for delivery of active agents
JP6043285B2 (ja) 2010-08-02 2016-12-14 サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッドＳｉｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いたカテニン（カドヘリン結合型タンパク質）β１（ＣＴＮＮＢ１）遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害
EP2606134B1 (de) 2010-08-17 2019-04-10 Sirna Therapeutics, Inc. Rna-interferenz-vermittelte hemmung der hepatitis b-virus (hbv)-genexpression mittels kurzer interferierender nukleinsäure (sina)
KR20130137160A (ko) 2010-08-24 2013-12-16 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 내부의 비－핵산 스페이서를 함유하는 단일－가닥 ＲＮＡｉ 작용제
WO2012027467A1 (en) 2010-08-26 2012-03-01 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF PROLYL HYDROXYLASE DOMAIN 2 (PHD2) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
EP3327125B1 (de) 2010-10-29 2020-08-05 Sirna Therapeutics, Inc. Rna-interferenz-vermittelte inhibition von genexpression unter verwendung kurzer interferierender nukleinsäure (sina)
WO2012058715A1 (en) 2010-11-01 2012-05-10 University Of Technology, Sydney Immune-modulating agents and uses therefor
WO2012064824A1 (en) 2010-11-09 2012-05-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of eg5 and vegf genes
US8853377B2 (en) 2010-11-30 2014-10-07 Shire Human Genetic Therapies, Inc. mRNA for use in treatment of human genetic diseases
EP2648763A4 (de) 2010-12-10 2014-05-14 Alnylam Pharmaceuticals Inc Zusammensetzungen und verfahren zur expressionshemmung der gene klf-1 und bcl11a
WO2012078967A2 (en) 2010-12-10 2012-06-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for increasing erythropoietin (epo) production
AU2012207606B2 (en) 2011-01-11 2017-02-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Pegylated lipids and their use for drug delivery
WO2012106490A1 (en) 2011-02-03 2012-08-09 The Government Of The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Multivalent vaccines for rabies virus and filoviruses
KR102104401B1 (ko) 2011-03-29 2020-04-27 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 Tmprss6 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법
KR20200084048A (ko) 2011-06-08 2020-07-09 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. Mrna 전달을 위한 지질 나노입자 조성물 및 방법
EP3388068A1 (de) 2011-06-21 2018-10-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Zusammensetzung und verfahren zur hemmung der expression von protein-c (proc)-genen
RU2631805C2 (ru) 2011-06-21 2017-09-26 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. Композиции и способы ингибирования экспрессии генов аполипопротеина с-iii (арос3)
AU2012272970A1 (en) 2011-06-21 2014-02-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Angiopoietin-like 3 (ANGPTL3) iRNA compositions and methods of use thereof
AU2012272908A1 (en) 2011-06-21 2013-12-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Assays and methods for determining activity of a therapeutic agent in a subject
WO2012178033A2 (en) 2011-06-23 2012-12-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serpina1 sirnas: compositions of matter and methods of treatment
JP2014526887A (ja) 2011-08-01 2014-10-09 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 造血幹細胞移植の成功率を改善する方法
US10829828B2 (en) 2011-09-13 2020-11-10 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US10806146B2 (en) 2011-09-13 2020-10-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
BR112014005975A8 (pt) 2011-09-13 2017-09-12 Monsanto Technology Llc Método de controle de planta, método de redução de expressão de um gene pds em uma planta, cassete de expressão microbiana, método de fazer um polinucleotídeo, método de identificação de polinucleotídeos, e composições para controle de erva daninha
MX343071B (es) 2011-09-13 2016-10-21 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para el control de malezas.
MX361938B (es) 2011-09-13 2018-12-19 Monsanto Technology Llc Métodos y composiciones para el control de malezas.
UY34333A (es) 2011-09-13 2013-04-30 Monsanto Technology Llc ?métodos y composiciones para el control de malezas, y métodos para reducir la expresión de enzima dhps?
EP2756086B1 (de) 2011-09-13 2018-02-21 Monsanto Technology LLC Verfahren und zusammensetzungen zur unkrautbekämpfung
US9840715B1 (en) 2011-09-13 2017-12-12 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delaying senescence and improving disease tolerance and yield in plants
US10760086B2 (en) 2011-09-13 2020-09-01 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US9644241B2 (en) 2011-09-13 2017-05-09 Interpace Diagnostics, Llc Methods and compositions involving miR-135B for distinguishing pancreatic cancer from benign pancreatic disease
US9920326B1 (en) 2011-09-14 2018-03-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for increasing invertase activity in plants
JP6250543B2 (ja) 2011-09-27 2017-12-20 アルニラム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド ジ脂肪族置換ｐｅｇ化脂質
LT2773326T (lt) 2011-11-04 2019-04-25 Nitto Denko Corporation Lipidų-nukleorūgščių dalelių sterilios gamybos būdas
DK3988537T1 (da) 2011-12-07 2022-05-23 Alnylam Pharmaceuticals Inc Bionedbrydelige lipider til afgivelse af aktive midler
US9372831B2 (en) 2011-12-09 2016-06-21 Fujitsu Ten Limited Remote starter
US9035039B2 (en) 2011-12-22 2015-05-19 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing SMAD4
RU2020111326A (ru) 2012-02-24 2020-04-29 Протива Байотерапьютикс Инк. Триалкил катионные липиды и способы их использования
US9133461B2 (en) 2012-04-10 2015-09-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the ALAS1 gene
US9127274B2 (en) 2012-04-26 2015-09-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serpinc1 iRNA compositions and methods of use thereof
WO2013175480A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 A.B. Seeds Ltd. Compositions and methods for silencing gene expression
EP2859102A4 (de) 2012-06-08 2016-05-11 Shire Human Genetic Therapies Nukleaseresistente polynukleotide und verwendungen davon
EP3884949A1 (de) 2012-06-08 2021-09-29 Translate Bio, Inc. Pulmonale verabreichung von mrns an nicht pulmonale zielzellen
JP6067315B2 (ja) 2012-10-12 2017-01-25 富士通テン株式会社 車両制御装置、及び、車両制御方法
EP2908620A4 (de) 2012-10-18 2016-07-27 Monsanto Technology Llc Verfahren und zusammensetzungen zur schädlingsbekämpfung bei pflanzen
KR102310697B1 (ko) 2012-11-20 2021-10-12 스펙트럼 파마슈티컬즈 인크 치료적 사용을 위한 리포솜 캡슐화 빈크리스틴을 제조하기 위한 개선된 방법
CN104854242B (zh) 2012-12-05 2018-03-16 阿尔尼拉姆医药品有限公司 PCSK9 iRNA组合物及其使用方法
US10683505B2 (en) 2013-01-01 2020-06-16 Monsanto Technology Llc Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression
EA032406B1 (ru) 2013-01-01 2019-05-31 Эй.Би. СИДЗ ЛТД. СПОСОБЫ ВВЕДЕНИЯ дсРНК В СЕМЕНА РАСТЕНИЙ ДЛЯ МОДУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ
US10000767B2 (en) 2013-01-28 2018-06-19 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for plant pest control
US10612019B2 (en) 2013-03-13 2020-04-07 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
UA123082C2 (uk) 2013-03-13 2021-02-17 Монсанто Текнолоджи Ллс Спосіб та гербіцидна композиція для боротьби з видами рослин роду sorghum
KR20210122917A (ko) 2013-03-14 2021-10-12 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. Cftr mrna 조성물 및 관련 방법 및 사용
CN114015692A (zh) 2013-03-14 2022-02-08 阿尔尼拉姆医药品有限公司 补体组分C5 iRNA组合物及其使用方法
US9925276B2 (en) 2013-03-14 2018-03-27 Epeius Biotechnologies Corporation Thymidine kinase gene
US20140283211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Monsanto Technology Llc Methods and Compositions for Plant Pest Control
KR20150128687A (ko) 2013-03-14 2015-11-18 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. 메신저 rna의 정제 방법
LT2970456T (lt) 2013-03-14 2021-08-10 Translate Bio, Inc. Būdai ir kompozicijos, skirti mrnr koduojamų antikūnų pristatymui
US10568328B2 (en) 2013-03-15 2020-02-25 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
RS57316B1 (sr) 2013-03-15 2018-08-31 Translate Bio Inc Sinergističko poboljšanje isporuke nukleinskih kiselina pomoću mešavina formulacija
US9937231B2 (en) 2013-03-27 2018-04-10 The General Hospital Corporation Methods and agents for treating Alzheimer's disease
KR102049568B1 (ko) 2013-04-01 2019-11-27 삼성전자주식회사 히알루론산을 포함하는 핵산전달용 조성물
WO2014182661A2 (en) 2013-05-06 2014-11-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc Dosages and methods for delivering lipid formulated nucleic acid molecules
HUE038146T2 (hu) 2013-05-22 2018-09-28 Alnylam Pharmaceuticals Inc Serpina1 IRNS készítmények és eljárások alkalmazásukra
EP2999786A1 (de) 2013-05-22 2016-03-30 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Tmprss6-irna-zusammensetzungen und verfahren zur verwendung davon
US10546441B2 (en) 2013-06-04 2020-01-28 Raymond Anthony Joao Control, monitoring, and/or security, apparatus and method for premises, vehicles, and/or articles
EP3013958B1 (de) 2013-06-25 2019-12-25 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Glucan-gekapselte sirna zur behandlung von diabetes mellitus vom typ 2
WO2014207679A1 (en) 2013-06-25 2014-12-31 Tigenix S.A.U. Cell populations having immunoregulatory activity, methods for the preparation and uses thereof
TW201534578A (zh) 2013-07-08 2015-09-16 Daiichi Sankyo Co Ltd 新穎脂質
JP6668236B2 (ja) 2013-07-19 2020-03-18 モンサント テクノロジー エルエルシー Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ防除用組成物及びその方法
US9850496B2 (en) 2013-07-19 2017-12-26 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling Leptinotarsa
WO2015011633A1 (en) 2013-07-23 2015-01-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for delivering messenger rna
CN105793423A (zh) 2013-10-02 2016-07-20 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于抑制lect2基因表达的组合物和方法
NZ757749A (en) 2013-10-04 2022-07-01 Icahn School Med Mount Sinai Compositions and methods for inhibiting expression of the alas1 gene
EA201992208A1 (ru) 2013-10-22 2020-07-31 Транслейт Био, Инк. ЛЕЧЕНИЕ ФЕНИЛКЕТОНУРИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ мРНК
JP6893785B2 (ja) 2013-10-22 2021-06-23 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド ｍＲＮＡのＣＮＳ送達及びその使用方法
EA201690576A1 (ru) 2013-10-22 2016-10-31 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. Липидные композиции для доставки матричной рнк
MX2016005237A (es) 2013-10-22 2016-08-12 Shire Human Genetic Therapies Terapia de acido ribonucleico mensajero para la deficiencia de argininosuccinato sintetasa.
AU2014341879B2 (en) 2013-11-04 2020-07-23 Beeologics, Inc. Compositions and methods for controlling arthropod parasite and pest infestations
CN106061488B (zh) 2013-12-02 2021-04-09 菲奥医药公司 癌症的免疫治疗
UA119253C2 (uk) 2013-12-10 2019-05-27 Біолоджикс, Інк. Спосіб боротьби із вірусом у кліща varroa та у бджіл
CA3107872A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component irna compositions and methods of use thereof
KR101713886B1 (ko) 2013-12-19 2017-03-10 연세대학교 산학협력단 ＰＲＫ２를 표적으로 하는 Ｃ형 간염 바이러스 치료제 ｓｉＲＮＡ
CN105979770B (zh) 2014-01-15 2019-07-05 孟山都技术公司 用于使用epsps多核苷酸的杂草控制的方法和组合物
EA201691587A1 (ru) 2014-02-11 2017-01-30 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ iRNA ДЛЯ КЕТОГЕКСОКИНАЗЫ (KHK) И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
JP6606088B2 (ja) 2014-02-24 2019-11-13 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド ヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みのための方法および組成物
US11091770B2 (en) 2014-04-01 2021-08-17 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling insect pests
WO2015164773A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Methods for purification of messenger rna
US11279934B2 (en) 2014-04-28 2022-03-22 Phio Pharmaceuticals Corp. Methods for treating cancer using nucleic acids targeting MDM2 or MYCN
SG11201609376SA (en) 2014-05-22 2016-12-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc Angiotensinogen (agt) irna compositions and methods of use thereof
CA2949106C (en) 2014-05-30 2023-10-24 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Biodegradable lipids for delivery of nucleic acids
CN106795515B (zh) 2014-06-23 2021-06-08 孟山都技术公司 用于经由rna干扰调控基因表达的组合物和方法
CN106795142B (zh) 2014-06-24 2022-11-04 川斯勒佰尔公司 用于递送核酸的立体化学富集组合物
EP3161138A4 (de) 2014-06-25 2017-12-06 Monsanto Technology LLC Verfahren und zusammensetzungen zur zuführung von nukleinsäuren an pflanzenzellen und regulierung der genexpression
PT3766916T (pt) 2014-06-25 2022-11-28 Acuitas Therapeutics Inc Novos lípidos e formulações de nanopartículas lipídicas para distribuição de ácidos nucleicos
WO2016001845A1 (en) 2014-06-30 2016-01-07 Tigenix S.A.U. Mesenchymal stromal cells for treating rheumatoid arthritis
MX2017000142A (es) 2014-06-30 2017-07-28 Tigenix S A U Celulas estromales mesenquimatosas para tratar el sindrome de respuesta inflamatoria sistemica.
US9821738B2 (en) 2014-06-30 2017-11-21 Raymond Anthony Joao Battery power management apparatus and method
JP6782171B2 (ja) 2014-07-02 2020-11-11 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド メッセンジャーｒｎａのカプセル化
WO2016011203A1 (en) 2014-07-15 2016-01-21 Life Technologies Corporation Compositions with lipid aggregates and methods for efficient delivery of molecules to cells
EP3174982A4 (de) 2014-07-29 2018-06-20 Monsanto Technology LLC Zusammensetzungen und verfahren zur bekämpfung von insektenbefall
KR20230037676A (ko) 2014-09-05 2023-03-16 피오 파마슈티칼스 코프. Tyr 또는 mmp1을 표적화하는 핵산을 사용한 노화 및 피부 장애의 치료 방법
EP3191591A1 (de) 2014-09-12 2017-07-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Gegen komplementkomponente c5 gerichtete polynukleotidwirkstoffe und verfahren zur verwendung davon
US10415037B2 (en) 2014-10-02 2019-09-17 Arbutus Biopharma Corporation Compositions and methods for silencing hepatitis B virus gene expression
JOP20200115A1 (ar) 2014-10-10 2017-06-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc تركيبات وطرق لتثبيط التعبير الجيني عن hao1 (حمض أوكسيداز هيدروكسيلي 1 (أوكسيداز جليكولات))
EP3207138B1 (de) 2014-10-17 2020-07-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Gegen aminolävulinsäuresynthase-1 (alas1) gerichtete polynukleotidmittel und verwendungen davon
EP3212794B1 (de) 2014-10-30 2021-04-07 Genzyme Corporation Polynukleotidwirkstoffe mit abzielung auf serpinc1 (at3) und verfahren zur verwendung davon
JOP20200092A1 (ar) 2014-11-10 2017-06-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc تركيبات iRNA لفيروس الكبد B (HBV) وطرق لاستخدامها
WO2016081444A1 (en) 2014-11-17 2016-05-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Apolipoprotein c3 (apoc3) irna compositions and methods of use thereof
US9943595B2 (en) 2014-12-05 2018-04-17 Translate Bio, Inc. Messenger RNA therapy for treatment of articular disease
AU2015364508A1 (en) 2014-12-18 2017-07-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. ReversirTM compounds
US10968449B2 (en) 2015-01-22 2021-04-06 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling Leptinotarsa
CA2976445A1 (en) 2015-02-13 2016-08-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Patatin-like phospholipase domain containing 3 (pnpla3) irna compositions and methods of use thereof
AU2016233135B2 (en) 2015-03-19 2021-07-08 Translate Bio, Inc. mRNA therapy for pompe disease
WO2016153012A1 (ja) 2015-03-24 2016-09-29 協和発酵キリン株式会社 核酸含有脂質ナノ粒子
US10745702B2 (en) 2015-04-08 2020-08-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the LECT2 gene
CN108271386B (zh) 2015-05-06 2022-07-15 阿尔尼拉姆医药品有限公司 因子XII(哈格曼因子)(F12)、激肽释放酶B、血浆(夫列契因子)1(KLKB1)和激肽原1(KNG1)iRNA组合物及其使用方法
CN107750125A (zh) 2015-06-02 2018-03-02 孟山都技术有限公司 用于将多核苷酸递送至植物中的组合物和方法
EP3302030A4 (de) 2015-06-03 2019-04-24 Monsanto Technology LLC Verfahren und zusammensetzungen zum einführen von nukleinsäuren in pflanzen
WO2016197132A1 (en) 2015-06-04 2016-12-08 Protiva Biotherapeutics Inc. Treating hepatitis b virus infection using crispr
EP3307316A1 (de) 2015-06-12 2018-04-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Gegen komplementkomponente c5 gerichtete irna-zusammensetzungen und verfahren zur verwendung davon
WO2016205323A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotde agents targeting hydroxyacid oxidase (glycolate oxidase, hao1) and methods of use thereof
WO2016209862A1 (en) 2015-06-23 2016-12-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Glucokinase (gck) irna compositions and methods of use thereof
US10221127B2 (en) 2015-06-29 2019-03-05 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
US10808247B2 (en) 2015-07-06 2020-10-20 Phio Pharmaceuticals Corp. Methods for treating neurological disorders using a synergistic small molecule and nucleic acids therapeutic approach
KR20180026739A (ko) 2015-07-06 2018-03-13 알엑스아이 파마슈티칼스 코포레이션 슈퍼옥시드 디스뮤타제 1 (sod1)을 표적화하는 핵산 분자
US10494632B2 (en) 2015-07-10 2019-12-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Insulin-like growth factor binding protein, acid labile subunit (IGFALS) compositions and methods of use thereof
TWI678213B (zh) 2015-07-22 2019-12-01 美商史倍壯製藥公司 用於長春新鹼硫酸鹽脂質體注射之即可使用的調配物
CN108350455A (zh) 2015-07-29 2018-07-31 阿布特斯生物制药公司 用于使b型肝炎病毒基因表达沉默的组合物和方法
WO2017035278A1 (en) 2015-08-24 2017-03-02 Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. Polynucleotide nanoparticles for the modulation of gene expression and uses thereof
EP3344769B1 (de) 2015-09-02 2024-04-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Programmed cell death 1 ligand 1 (pd-l1) irna-kompositionen und methoden zu deren verwendung
TW201718857A (zh) 2015-09-14 2017-06-01 艾爾妮蘭製藥公司 用於抑制alas1基因表現之組合物及方法
WO2017048620A1 (en) 2015-09-14 2017-03-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide agents targeting patatin-like phospholipase domain containing 3 (pnpla3) and methods of use thereof
EP3362555B1 (de) 2015-10-14 2021-01-13 Translate Bio, Inc. Modifizierung von rna-zugehörigen enzyme zur erhöhten produktion
CN109563509B (zh) 2015-10-19 2022-08-09 菲奥医药公司 靶向长非编码rna的减小尺寸的自递送核酸化合物
IL286515B2 (en) 2015-10-28 2024-02-01 Acuitas Therapeutics Inc Novel lipids and nanoparticle formulations of lipids for delivery of nucleic acids
EP3387129A1 (de) 2015-12-10 2018-10-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Zusammensetzungen aus sterolregulatorischem element-bindendem protein (srep) chaperone (scap) irna und verfahren zur verwendung davon
AU2017214761B2 (en) 2016-02-01 2024-02-01 Epiaxis Therapeutics Pty Ltd Proteinaceous compounds and uses therefor
WO2017144552A1 (en) 2016-02-22 2017-08-31 Centauri Biotech. S.L. Pharmaceutical or veterinary cell compositions comprising mesenchymal stromal cells (mscs) and dimethyl sulfoxide (dmso)
GB201604304D0 (en) 2016-03-14 2016-04-27 Tigenix S A U Adipose tissue-derived stromal stem cells for use in treating refractory complex perianal fistulas in crohn's disease
EP4104854A3 (de) 2016-04-04 2023-03-08 The United States of America as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Multivalente impfstoffe gegen tollwutvirus und coronaviren
WO2017177169A1 (en) 2016-04-08 2017-10-12 Rana Therapeutics, Inc. Multimeric coding nucleic acid and uses thereof
MA45295A (fr) 2016-04-19 2019-02-27 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composition d'arni de protéine de liaison de lipoprotéines haute densité (hdlbp/vigiline) et procédés pour les utiliser
US20190256845A1 (en) 2016-06-10 2019-08-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. COMPLEMENT COMPONENT C5 iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF FOR TREATING PAROXYSMAL NOCTURNAL HEMOGLOBINURIA (PNH)
JP2019522047A (ja) 2016-06-13 2019-08-08 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症治療のためのメッセンジャーｒｎａ療法
JP7086870B2 (ja) 2016-06-30 2022-06-20 アルブータス・バイオファーマー・コーポレイション メッセンジャーｒｎａを送達するための組成物及び方法
UY37376A (es) 2016-08-26 2018-03-23 Amgen Inc Construcciones de arni para inhibir expresión de asgr1 y métodos para su uso
TWI788312B (zh) 2016-11-23 2023-01-01 美商阿尼拉製藥公司 絲胺酸蛋白酶抑制因子Ａ１ ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
WO2018112320A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating or preventing ttr-associated diseases using transthyretin (ttr) irna compositions
EP3585417B1 (de) 2017-02-27 2023-02-22 Translate Bio, Inc. Methode der herstellung von codon-optimierter cftr-mrna
WO2018191657A1 (en) 2017-04-13 2018-10-18 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for delivery of active agents
BR112019021852A2 (pt) 2017-04-18 2020-06-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Agente de rnai e uma vacina contra hbv, uso ou método e kit para tratamento
WO2018200943A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Acuitas Therapeutics, Inc. Novel carbonyl lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
WO2018213476A1 (en) 2017-05-16 2018-11-22 Translate Bio, Inc. Treatment of cystic fibrosis by delivery of codon-optimized mrna encoding cftr
EP3662913A4 (de) 2017-08-04 2021-06-30 Kyowa Kirin Co., Ltd. Nukleinsäurehaltige lipidnanopartikel
WO2019036008A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICULAR FORMULATIONS
WO2019036030A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS
US11542225B2 (en) 2017-08-17 2023-01-03 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
WO2019053295A1 (en) 2017-09-18 2019-03-21 Fundació Institut D'investigació Sanitària Pere Virgili METHODS FOR IMPROVING THE EFFICACY OF CELL THERAPY WITH MESENCHYMAL STEM CELL POPULATIONS
CA3078971A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c3 irna compositions and methods of use thereof
EP3714054A1 (de) 2017-11-20 2020-09-30 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serum-amyloid p-komponente (apcs) irna zusammensetzungen und verfahren zu deren verwendung
AR113490A1 (es) 2017-12-12 2020-05-06 Amgen Inc CONSTRUCCIONES DE ARNi PARA INHIBIR LA EXPRESIÓN DE PNPLA3 Y MÉTODOS DE USO DE LAS MISMAS
WO2019126222A1 (en) * 2017-12-18 2019-06-27 Spark Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus (aav) vector lipid nanoparticle compositions and methods of use
US11167043B2 (en) 2017-12-20 2021-11-09 Translate Bio, Inc. Composition and methods for treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
JP7417529B2 (ja) 2018-03-07 2024-01-18 サノフイ ヌクレオチド前駆体、ヌクレオチド類似体およびこれを含むオリゴマー化合物
EP3837367A1 (de) 2018-08-16 2021-06-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur hemmung der lect2-genexpression
CN112930396A (zh) 2018-08-24 2021-06-08 川斯勒佰尔公司 用于纯化信使rna的方法
US20210332367A1 (en) 2018-09-18 2021-10-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. KETOHEXOKINASE (KHK) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
US10913951B2 (en) 2018-10-31 2021-02-09 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Silencing of HNF4A-P2 isoforms with siRNA to improve hepatocyte function in liver failure
WO2020104649A2 (en) 2018-11-23 2020-05-28 Sanofi Novel rna compositions and methods for inhibiting angptl8
JP2022513159A (ja) 2018-11-29 2022-02-07 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ， インコーポレイテッド Ｒｎａを調節する方法
BR112021011061A2 (pt) 2018-12-10 2021-08-31 Amgen Inc. Construtos de rnai para inibir a expressão de pnpla3
AU2019395341A1 (en) 2018-12-10 2021-06-17 Amgen Inc. Chemically-modified RNAi constructs and uses thereof
EP4285929A3 (de) 2018-12-20 2024-03-06 Humabs Biomed SA Kombinierte hbv-therapie
JP2022515744A (ja) 2018-12-20 2022-02-22 プラクシス プレシジョン メディシンズ， インコーポレイテッド Ｋｃｎｔ１関連障害の治療のための組成物及び方法
TW202043256A (zh) 2019-01-10 2020-12-01 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
US11453639B2 (en) 2019-01-11 2022-09-27 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents
TW202111124A (zh) 2019-05-30 2021-03-16 美商安進公司 用於抑制ｓｃａｐ表現之ｒｎａｉ構建體及其使用方法
GB201910299D0 (en) 2019-07-18 2019-09-04 Aouadi Myriam Medical uses, methods and uses
WO2021030522A1 (en) 2019-08-13 2021-02-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. SMALL RIBOSOMAL PROTEIN SUBUNIT 25 (RPS25) iRNA AGENT COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
EP4013871A1 (de) 2019-08-13 2022-06-22 Amgen Inc. Rnai-konstrukte zur hemmung der slc30a8-expression und verfahren zur verwendung davon
US20220290156A1 (en) 2019-08-27 2022-09-15 Sanofi Compositions and methods for inhibiting pcsk9
EP4025694A1 (de) 2019-09-03 2022-07-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zum hemmen der lect2-genexpression
US20220372063A1 (en) 2019-09-05 2022-11-24 Sanofi Oligonucleotides containing nucleotide analogs
WO2021067747A1 (en) 2019-10-04 2021-04-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for silencing ugt1a1 gene expression
AR120341A1 (es) 2019-11-01 2022-02-09 Alnylam Pharmaceuticals Inc COMPOSICIONES DE AGENTES DE ARNi CONTRA LA HUNTINGTINA (HTT) Y SUS MÉTODOS DE USO
WO2021087325A1 (en) 2019-11-01 2021-05-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for silencing dnajb1-prkaca fusion gene expression
IL293051A (en) 2019-11-18 2022-07-01 Janssen Biotech Inc calr and jak2 mutant-based vaccines and their uses
CA3159021A1 (en) * 2019-11-22 2021-05-27 So Jin Lee Kit for preparing nanoparticle composition for drug delivery
EP4061945A1 (de) 2019-11-22 2022-09-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Ataxin3 (atxn3)-rnai-wirkstoffzusammensetzungen und verfahren zu deren verwendung
MX2022007005A (es) 2019-12-09 2022-08-25 Amgen Inc Construcciones de iarn y metodos para inhibir la expresion de lpa.
WO2021119226A1 (en) 2019-12-13 2021-06-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Human chromosome 9 open reading frame 72 (c9orf72) irna agent compositions and methods of use thereof
WO2021154941A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions for use in the treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
WO2021163066A1 (en) 2020-02-10 2021-08-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for silencing vegf-a expression
TW202144389A (zh) 2020-02-14 2021-12-01 美商健生生物科技公司 在多發性骨髓瘤中表現之新抗原及其用途
TW202144388A (zh) 2020-02-14 2021-12-01 美商健生生物科技公司 在卵巢癌中表現之新抗原及其用途
WO2021178607A1 (en) 2020-03-05 2021-09-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c3 irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing complement component c3-associated diseases
TW202204615A (zh) 2020-03-26 2022-02-01 美商阿尼拉製藥公司 冠狀病毒ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
WO2021202443A2 (en) 2020-03-30 2021-10-07 Alnylam Pharmaceucticals, Inc. Compositions and methods for silencing dnajc15 gene expression
EP4133078A1 (de) 2020-04-06 2023-02-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur ausschaltung der myoc-expression
TW202204617A (zh) 2020-04-07 2022-02-01 美商艾爾妮蘭製藥公司 用於靜默scn9a表現之組合物及方法
EP4133076A1 (de) 2020-04-07 2023-02-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna-zusammensetzungen aus angiotensin-konvertierendem enzym 2 (ace2) und verfahren zur verwendung davon
WO2021206922A1 (en) 2020-04-07 2021-10-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transmembrane serine protease 2 (tmprss2) irna compositions and methods of use thereof
EP4143319A1 (de) 2020-04-27 2023-03-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Apolipoprotein e (apoe) irna-wirkstoffzusammensetzungen und verfahren zur verwendung davon
WO2021231698A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of argininosuccinate lyase (asl)
EP4150076A1 (de) 2020-05-15 2023-03-22 Korro Bio, Inc. Verfahren und zusammensetzungen zur adar-vermittelten bearbeitung von methyl-cpg-bindendem protein 2 (mecp2)
WO2021231673A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of leucine rich repeat kinase 2 (lrrk2)
WO2021231685A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of transmembrane channel-like protein 1 (tmc1)
WO2021231691A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of retinoschisin 1 (rsi)
WO2021231679A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of gap junction protein beta 2 (gjb2)
WO2021231675A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of argininosuccinate synthetase (ass1)
WO2021231692A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of otoferlin (otof)
KR20230022415A (ko) 2020-05-18 2023-02-15 맥스 바이올로지 컴퍼니 리미티드 지질-중합체 조성물 및 사용 방법
WO2021237097A1 (en) 2020-05-21 2021-11-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting marc1 gene expression
IL298697A (en) 2020-06-01 2023-02-01 Amgen Inc RNA interference constructs to inhibit hsd17b13 expression and methods for using them
US11408000B2 (en) 2020-06-03 2022-08-09 Triplet Therapeutics, Inc. Oligonucleotides for the treatment of nucleotide repeat expansion disorders associated with MSH3 activity
EP4162050A1 (de) 2020-06-09 2023-04-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Rnai-zusammensetzungen und verfahren zur verwendung davon zur verabreichung durch inhalation
KR20230042023A (ko) 2020-06-24 2023-03-27 비르 바이오테크놀로지, 인코포레이티드 조작된 b형 간염 바이러스 중화 항체 및 이의 용도
US20230024133A1 (en) 2020-07-06 2023-01-26 Janssen Biotech, Inc. Prostate Neoantigens And Their Uses
WO2022009052A2 (en) 2020-07-06 2022-01-13 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses
US20230035403A1 (en) 2020-07-06 2023-02-02 Janssen Biotech, Inc. Method For Determining Responsiveness To Prostate Cancer Treatment
EP4179091A1 (de) 2020-07-10 2023-05-17 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale - Inserm Verfahren und zusammensetzungen zur behandlung von epilepsie
AU2021326521A1 (en) 2020-08-13 2023-03-09 Amgen Inc. RNAi constructs and methods for inhibiting MARC1 expression
EP4217489A1 (de) 2020-09-24 2023-08-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Dipeptidylpeptidase 4 (dpp4)-irna-zusammensetzungen und verfahren zur verwendung davon
AU2021358490A1 (en) 2020-10-05 2023-06-01 Max Biology Co. Ltd. Cannabinoid-containing compositions and use for treating and preventing diseases
JP2023544413A (ja) 2020-10-05 2023-10-23 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｇタンパク質共役受容体７５（ＧＰＲ７５）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
US20230372397A1 (en) 2020-10-06 2023-11-23 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
WO2022076606A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
US20240035029A1 (en) 2020-10-16 2024-02-01 Sanofi Rna compositions and methods for inhibiting lipoprotein(a)
CN116887842A (zh) 2020-10-16 2023-10-13 赛诺菲 用于抑制angptl3的新型rna组合物和方法
US20240092819A1 (en) 2020-10-20 2024-03-21 Sanofi Novel ligands for asialoglycoprotein receptor
EP4232581A1 (de) 2020-10-21 2023-08-30 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Verfahren und zusammensetzungen zur behandlung von primärer hyperoxalurie
EP4232582A1 (de) 2020-10-23 2023-08-30 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Mucin-5b (muc5b)-irna-zusammensetzungen und verfahren zur verwendung davon
CA3199678A1 (en) 2020-11-05 2022-05-12 Amgen Inc. Methods for treating atherosclerotic cardiovascular disease with lpa-targeted rnai constructs
MX2023006056A (es) 2020-11-25 2023-06-06 Akagera Medicines Inc Nanoparticulas lipidicas para suministro de acidos nucleicos y metodos de uso de las mismas.
EP4256053A1 (de) 2020-12-01 2023-10-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Verfahren und zusammensetzungen zur hemmung der hao1 (hydroxysäureoxidase 1 (glycolatoxidase))-genexpression
JP2023554395A (ja) 2020-12-17 2023-12-27 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド Ｃｔｌａ－４及びｐｄ－１阻害剤と併用した腫瘍浸潤リンパ球療法による治療
WO2022133149A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancers with tumor infiltrating lymphocytes
CA3210763A1 (en) 2021-02-12 2022-08-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Superoxide dismutase 1 (sod1) irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing superoxide dismutase 1- (sod1-) associated neurodegenerative diseases
US11760227B2 (en) 2021-02-15 2023-09-19 Raymond Anthony Joao Battery power management apparatus and method
EP4298220A1 (de) 2021-02-25 2024-01-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Prionprotein (prnp)-irna-zusammensetzungen und verfahren zur verwendung davon
EP4305169A1 (de) 2021-03-12 2024-01-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Glykogensynthasekinase-3-alpha (gsk3a)-irna-zusammensetzungen und verfahren zur verwendung davon
KR20230162024A (ko) 2021-03-29 2023-11-28 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 헌팅틴(HTT) iRNA 제제 조성물 및 이의 사용 방법
EP4326287A2 (de) 2021-04-19 2024-02-28 Iovance Biotherapeutics, Inc. Chimäre kostimulatorische rezeptoren, chemokinrezeptoren und deren verwendung in zellulären immuntherapien
WO2022232343A1 (en) 2021-04-29 2022-11-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Signal transducer and activator of transcription factor 6 (stat6) irna compositions and methods of use thereof
WO2022245583A1 (en) 2021-05-18 2022-11-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Sodium-glucose cotransporter-2 (sglt2) irna compositions and methods of use thereof
EP4341405A1 (de) 2021-05-20 2024-03-27 Korro Bio, Inc. Verfahren und zusammensetzungen für adar-vermittelte bearbeitung
WO2022256283A2 (en) 2021-06-01 2022-12-08 Korro Bio, Inc. Methods for restoring protein function using adar
AR126000A1 (es) 2021-06-04 2023-08-30 Alnylam Pharmaceuticals Inc Agentes de arni del marco de lectura abierto 72 del cromosoma 9 humano (c9orf72), composiciones y métodos de uso de los mismos
WO2022269097A1 (en) 2021-06-25 2022-12-29 Alpine Antiviral Gmbh Sirna combinations targeting sars-cov-2 and/or host factor transcripts
WO2023278410A1 (en) 2021-06-29 2023-01-05 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for adar-mediated editing
US20230194709A9 (en) 2021-06-29 2023-06-22 Seagate Technology Llc Range information detection using coherent pulse sets with selected waveform characteristics
KR20240037293A (ko) 2021-07-23 2024-03-21 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 베타-카테닌(CTNNB1) iRNA 조성물 및 이의 사용 방법
WO2023009716A1 (en) 2021-07-28 2023-02-02 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with kras inhibitors
CA3234369A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Amagen, Inc. Compositions and methods for enhancing gene silencing activity of oligonucleotide compounds
WO2023069979A1 (en) 2021-10-20 2023-04-27 University Of Rochester Isolated glial progenitor cells for use in the competition treatment of age-related white matter loss
CA3234835A1 (en) 2021-10-22 2023-04-27 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for disrupting nrf2-keap1 protein interaction by adar mediated rna editing
WO2023069754A2 (en) 2021-10-22 2023-04-27 Amgen Inc. Rnai constructs for inhibiting gpam expression and methods of use thereof
AR127482A1 (es) 2021-10-27 2024-01-31 Iovance Biotherapeutics Inc Sistemas y métodos para coordinar la fabricación de células para inmunoterapia específica de paciente
WO2023076450A2 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. HUNTINGTIN (HTT) iRNA AGENT COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
WO2023086803A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expansion treatment utilizing cd8 tumor infiltrating lymphocytes
WO2023122762A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Camp4 Therapeutics Corporation Modulation of gene transcription using antisense oligonucleotides targeting regulatory rnas
WO2023141314A2 (en) 2022-01-24 2023-07-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Heparin sulfate biosynthesis pathway enzyme irna agent compositions and methods of use thereof
WO2023144163A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg A glun2d inhibitor for use in the treatment or relapse prevention of a depressive episode
WO2023144798A1 (en) 2022-01-31 2023-08-03 Genevant Sciences Gmbh Ionizable cationic lipids for lipid nanoparticles
WO2023240277A2 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Camp4 Therapeutics Corporation Methods of modulating progranulin expression using antisense oligonucleotides targeting regulatory rnas
US20240084301A1 (en) 2022-07-25 2024-03-14 Amgen Inc. Rnai constructs and methods for inhibiting fam13a expression
WO2024059165A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 17b-hydroxysteroid dehydrogenase type 13 (hsd17b13) irna compositions and methods of use thereof
CN115624539A (zh) * 2022-12-16 2023-01-20 首都医科大学附属北京朝阳医院 一种脂质纳米颗粒及其制备方法和应用

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4394448A (en) * 1978-02-24 1983-07-19 Szoka Jr Francis C Method of inserting DNA into living cells
ATE8584T1 (de) * 1980-01-16 1984-08-15 Hans Georg Prof. Dr. Weder Verfahren und dialysiereinrichtung zur herstellung von bilayer-vesikeln und verwendung der bilayer-vesikel.
US4598051A (en) * 1980-03-12 1986-07-01 The Regents Of The University Of California Liposome conjugates and diagnostic methods therewith
US4515736A (en) * 1983-05-12 1985-05-07 The Regents Of The University Of California Method for encapsulating materials into liposomes
US5545412A (en) * 1985-01-07 1996-08-13 Syntex (U.S.A.) Inc. N-[1, (1-1)-dialkyloxy]-and N-[1, (1-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-n,n,n-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4897355A (en) * 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5208036A (en) * 1985-01-07 1993-05-04 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω, (ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω, (ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5320906A (en) * 1986-12-15 1994-06-14 Vestar, Inc. Delivery vehicles with amphiphile-associated active ingredient
US5703055A (en) * 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
FR2645866B1 (fr) * 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
US5225212A (en) * 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
US5013556A (en) * 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5279833A (en) * 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5264618A (en) * 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US5283185A (en) * 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
US6001644A (en) * 1991-12-17 1999-12-14 The Regents Of The University Of California Mammalian transformation complex comprising a lipid carrier and DNA encoding CFTR
US5858784A (en) * 1991-12-17 1999-01-12 The Regents Of The University Of California Expression of cloned genes in the lung by aerosol- and liposome-based delivery
EP0672178A4 (de) * 1992-02-19 1996-03-20 Baylor College Medicine Zellwachstumsmodulation mit oligonukleotiden.
WO1993024640A2 (en) * 1992-06-04 1993-12-09 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for in vivo gene therapy
WO1995002698A1 (en) * 1993-07-12 1995-01-26 Life Technologies, Inc. Composition and methods for transfecting eukaryotic cells
FR2714830B1 (fr) * 1994-01-10 1996-03-22 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations.
AU696881B2 (en) * 1994-06-22 1998-09-24 Megabios Corporation Cationic amphiphiles
FR2722506B1 (fr) * 1994-07-13 1996-08-14 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations
US5753613A (en) * 1994-09-30 1998-05-19 Inex Pharmaceuticals Corporation Compositions for the introduction of polyanionic materials into cells
US5705385A (en) * 1995-06-07 1998-01-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer

Also Published As

Publication number Publication date
JP2009028046A (ja) 2009-02-12
WO1996040964A3 (en) 1997-04-24
EP0832271B8 (de) 2005-03-02
AU723163B2 (en) 2000-08-17
EP0832271B1 (de) 2004-12-22
JP4335310B2 (ja) 2009-09-30
ATE285477T1 (de) 2005-01-15
US5976567A (en) 1999-11-02
DE69634084D1 (de) 2005-01-27
AU6330796A (en) 1996-12-30
IL122290A (en) 2006-12-31
CA2222328A1 (en) 1996-12-19
ES2231819T3 (es) 2005-05-16
IL122290A0 (en) 1998-04-05
CA2222328C (en) 2012-01-10
EP1489184A1 (de) 2004-12-22
EP0832271A2 (de) 1998-04-01
JPH11507537A (ja) 1999-07-06
WO1996040964A2 (en) 1996-12-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69634084T2 (de) Herstellung von lipid-nukleinsäure partikeln duch ein hydrophobische lipid-nukleinsäuree komplexe zwischenprodukt und zur verwendung in der gentransfer
US7422902B1 (en) Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
DE69906977T2 (de) In liposomen verkapselte nukleinsäurekomplexe
DE69837274T2 (de) Verfahren zur verkapselung von nukleinsäuren in lipiddoppelschichten
DE69631149T2 (de) Formulierungen in form von emulsionen zur verabreichung von nukleinsäuren an zellen
Thierry et al. Characterization of liposome-mediated gene delivery: expression, stability and pharmacokinetics of plasmid DNA
US5705385A (en) Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
DE69433519T2 (de) Sich selbst zusammensetzendes polynukleotid-abgabesystem, das dendrimer-polykationen enthält
US6815432B2 (en) Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
DE69937450T2 (de) Methoden zur gestaltung von proteingebundenen lipidischen mikropartikeln und verbindungen damit
DE60126801T2 (de) Lipidformulierungen zur zielgerichteten abgabe
EP1838286B1 (de) Herstellung von lipidbasierten nanopartikeln unter einsatz einer dualen asymmetrischen zentrifuge
US7189705B2 (en) Methods of enhancing SPLP-mediated transfection using endosomal membrane destabilizers
EP1363601B1 (de) Amphotere liposomen und verwendung dieser
DE69725877T2 (de) Kationische lipid-nukleinsäure komplexe
DE69820465T2 (de) Liposomen-umschlossene polynukleotidzusammensetzung sowie verfahren
DE69837819T2 (de) Kondensierte plasmid-liposome komplex zur transfektion
Fenske et al. [3] Stabilized plasmid-lipid particles: A systemic gene therapy vector
US20030077829A1 (en) Lipid-based formulations
DE60019134T2 (de) Verfahren und zusammensetzungen für die abgabe von pharmazeutischen wirkstoffen
Palmer et al. Transfection properties of stabilized plasmid–lipid particles containing cationic PEG lipids
JP2004508012A (ja) エンドソーム膜不安定剤を用いたｓｐｌｐ媒介性トランスフェクションの強化方法
AU771241B2 (en) Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
Thierry Optimization of lipoplex formulations for intravenous gene delivery
Barron Systemic cationic lipid-DNA complex-mediated gene delivery: A mechanistic study

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA, VANCOUVER, BRI, CA

8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: INEX PHARMACEUTICALS CORP., VANCOUVER, CA

Owner name: UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA, VANCOUVER, BRI, CA

8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: INEX PHARMACEUTICALS CORP., BURNABY, BRITISH C, CA

Owner name: UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA, VANCOUVER, BRI, CA

8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: TEKMIRA PHARMACEUTICALS CORP., BURNABY, BRITIS, CA

Owner name: UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA, VANCOUVER, BRI, CA