CN107750125A - 用于将多核苷酸递送至植物中的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供用于将多核苷酸从植物或植物部分的外表面递送至植物细胞的内部中的组合物和方法。更具体来说，本公开涉及包含至少一种多核苷酸和至少一种能够破坏植物或植物部分的至少一个屏障的试剂的组合物。

Description

用于将多核苷酸递送至植物中的组合物和方法
领域
本公开提供用于将多核苷酸从植物或植物部分的外表面递送至植物细胞的内部中的组合物和方法。
背景
由RNA干扰介导的基因抑制已作为一种用于使广泛范围的生物体中的基因沉默的强力工具被开发。然而，存在对用以将用于植物局部施加的干扰RNA尤其是穿过多个保护屏障而有效递送至植物细胞的内部中的组合物和方法的需要。
发明概述
若干实施方案涉及一种用于将多核苷酸从植物或植物部分的外表面递送至植物细胞的内部中的组合物，其包含至少一种多核苷酸和至少一种能够破坏所述植物或植物部分的至少一个屏障的试剂。在一些实施方案中，试剂包括酶和磨蚀剂中的一者或多者。在一些实施方案中，酶是水解酶。在一些实施方案中，试剂包括超过一种酶。在一些实施方案中，酶选自由纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、角质酶和脂酶组成的组。在一些实施方案中，组合物还包含渗透调节物质(osmolyte)和表面活性剂中的一者或多者。在一些实施方案中，组合物包含多核苷酸和酶。在一些实施方案中，组合物包含多核苷酸、酶和渗透调节物质。在一些实施方案中，组合物包含多核苷酸、酶和表面活性剂。在一些实施方案中，组合物包含多核苷酸、酶、渗透调节物质和表面活性剂。在一些实施方案中，组合物包含多核苷酸和磨蚀剂。在一些实施方案中，组合物包含多核苷酸、磨蚀剂和渗透调节物质。在一些实施方案中，组合物包含多核苷酸、磨蚀剂和表面活性剂。在一些实施方案中，组合物包含多核苷酸、磨蚀剂、渗透调节物质和表面活性剂。在一些实施方案中，组合物包含多核苷酸、磨蚀剂和酶。在一些实施方案中，组合物包含多核苷酸、酶、磨蚀剂和渗透调节物质。在一些实施方案中，组合物包含多核苷酸、酶、磨蚀剂和表面活性剂。在一些实施方案中，组合物包含多核苷酸、酶、磨蚀剂、渗透调节物质和表面活性剂。在一些实施方案中，多核苷酸是非可转录的。在一些实施方案中，非可转录多核苷酸是触发多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸选自由单链DNA、单链RNA、双链DNA、双链RNA和RNA/DNA杂交体组成的组。在一些实施方案中，多核苷酸是干扰RNA。在一些实施方案中，多核苷酸是miRNA。在一些实施方案中，多核苷酸是mRNA。在一些实施方案中，多核苷酸是可转录的。在一些实施方案中，多核苷酸编码CRISPR酶。在一些实施方案中，多核苷酸包含CRISPR系统的RNA组分。在一些实施方案中，多核苷酸包含能够与靶标序列杂交的引导序列、tracr配偶序列和tracr序列中的一者或多者。在一些实施方案中，植物细胞表达CRISPR酶。在一些实施方案中，CRISPR酶选自由Cas9、Cpf1、Csc1和Csc2组成的组。
若干实施方案涉及一种用于将多核苷酸从植物或植物部分的外表面递送至植物细胞的内部中的组合物，其包含至少一种多核苷酸和至少一种能够破坏所述植物或植物部分的至少一个屏障的酶。在一些实施方案中，酶是水解酶。在一些实施方案中，至少一种酶独立地选自由纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、角质酶和脂酶组成的组。在一些实施方案中，组合物还包含渗透调节物质(osmolyte)和表面活性剂中的一者或多者。在一些实施方案中，组合物包含多核苷酸、酶和渗透调节物质。在一些实施方案中，组合物包含多核苷酸、酶和表面活性剂。在一些实施方案中，组合物包含多核苷酸、酶、渗透调节物质和表面活性剂。在一些实施方案中，在施加组合物之前对植物或植物部分的外表面进行磨蚀。在一些实施方案中，在施加组合物之后对植物或植物部分的外表面进行磨蚀。在一些实施方案中，多核苷酸是非可转录的。在一些实施方案中，非可转录多核苷酸是触发多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸选自由单链DNA、单链RNA、双链DNA、双链RNA和RNA/DNA杂交体组成的组。在一些实施方案中，多核苷酸是干扰RNA。在一些实施方案中，多核苷酸是miRNA。在一些实施方案中，多核苷酸是mRNA。在一些实施方案中，多核苷酸是可转录的。在一些实施方案中，多核苷酸编码CRISPR酶。在一些实施方案中，多核苷酸包含CRISPR系统的RNA组分。在一些实施方案中，多核苷酸包含能够与靶标序列杂交的引导序列、tracr配偶序列和tracr序列中的一者或多者。在一些实施方案中，植物细胞表达CRISPR酶。在一些实施方案中，CRISPR酶选自由Cas9、Cpf1、Csc1和Csc2组成的组。
若干实施方案涉及一种用于将多核苷酸从植物或植物部分的外表面递送至植物细胞的内部中的组合物，其包含至少一种多核苷酸、渗透调节物质和至少一种表面活性剂。在一些实施方案中，在施加组合物之前对植物或植物部分的外表面进行磨蚀。在一些实施方案中，在施加组合物之后对植物或植物部分的外表面进行磨蚀。在一些实施方案中，多核苷酸是非可转录的。在一些实施方案中，非可转录多核苷酸是触发多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸选自由单链DNA、单链RNA、双链DNA、双链RNA和RNA/DNA杂交体组成的组。在一些实施方案中，多核苷酸是干扰RNA。在一些实施方案中，多核苷酸是miRNA。在一些实施方案中，多核苷酸是mRNA。在一些实施方案中，多核苷酸是可转录的。在一些实施方案中，多核苷酸编码CRISPR酶。在一些实施方案中，多核苷酸包含CRISPR系统的RNA组分。在一些实施方案中，多核苷酸包含能够与靶标序列杂交的引导序列、tracr配偶序列和tracr序列中的一者或多者。在一些实施方案中，植物细胞表达CRISPR酶。在一些实施方案中，CRISPR酶选自由Cas9、Cpf1、Csc1和Csc2组成的组。
若干实施方案涉及一种用于将多核苷酸从植物或植物部分的外表面递送至植物细胞的内部中的方法，其包括向所述植物或植物部分的所述外表面施加至少一种多核苷酸和至少一种能够破坏所述植物或植物部分的至少一个屏障的试剂。在一些实施方案中，通过喷洒来施加多核苷酸和试剂。在一些实施方案中，试剂包括酶和磨蚀剂中的一者或多者。在一些实施方案中，酶是水解酶。在一些实施方案中，试剂包括超过一种酶。在一些实施方案中，酶选自由纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、角质酶和脂酶组成的组。在一些实施方案中，方法还包括向所述植物或植物部分的外表面施加渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者。在一些实施方案中，方法包括以单一组合物施加试剂和多核苷酸。在一些实施方案中，方法包括分开施加试剂和多核苷酸。在一些实施方案中，方法包括将渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者与多核苷酸一起施加。在一些实施方案中，方法包括将渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者与试剂一起施加。在一些实施方案中，方法包括以单一组合物施加多核苷酸、试剂以及渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者。在一些实施方案中，多核苷酸是非可转录的。在一些实施方案中，非可转录多核苷酸是触发多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸选自由单链DNA、单链RNA、双链DNA、双链RNA和RNA/DNA杂交体组成的组。在一些实施方案中，多核苷酸是干扰RNA。在一些实施方案中，多核苷酸是miRNA。在一些实施方案中，多核苷酸是mRNA。在一些实施方案中，多核苷酸是可转录的。在一些实施方案中，多核苷酸编码CRISPR酶。在一些实施方案中，多核苷酸包含CRISPR系统的RNA组分。在一些实施方案中，多核苷酸包含能够与靶标序列杂交的引导序列、tracr配偶序列和tracr序列中的一者或多者。在一些实施方案中，植物细胞表达CRISPR酶。在一些实施方案中，CRISPR酶选自由Cas9、Cpf1、Csc1和Csc2组成的组。
若干实施方案涉及一种用于将多核苷酸从植物或植物部分的外表面递送至植物细胞的内部中的方法，其包括向所述植物或植物部分的所述外表面施加至少一种多核苷酸和至少一种能够破坏所述植物或植物部分的至少一个屏障的酶。在一些实施方案中，通过喷洒来施加多核苷酸和酶。在一些实施方案中，在施加多核苷酸和酶之前对植物或植物部分的外表面进行磨蚀。在一些实施方案中，在施加多核苷酸和酶之后对植物或植物部分的外表面进行磨蚀。在一些实施方案中，酶是水解酶。在一些实施方案中，至少一种酶独立地选自由纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、角质酶和脂酶组成的组。在一些实施方案中，方法还包括向所述植物或植物部分的外表面施加渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者。在一些实施方案中，方法包括以单一组合物施加酶和多核苷酸。在一些实施方案中，方法包括分开施加酶和多核苷酸。在一些实施方案中，方法包括将渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者与多核苷酸一起施加。在一些实施方案中，方法包括将渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者与酶一起施加。在一些实施方案中，方法包括以单一组合物施加多核苷酸、酶以及渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者。在一些实施方案中，多核苷酸是非可转录的。在一些实施方案中，非可转录多核苷酸是触发多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸选自由单链DNA、单链RNA、双链DNA、双链RNA和RNA/DNA杂交体组成的组。在一些实施方案中，多核苷酸是干扰RNA。在一些实施方案中，多核苷酸是miRNA。在一些实施方案中，多核苷酸是mRNA。在一些实施方案中，多核苷酸是可转录的。在一些实施方案中，多核苷酸编码CRISPR酶。在一些实施方案中，多核苷酸包含CRISPR系统的RNA组分。在一些实施方案中，多核苷酸包含能够与靶标序列杂交的引导序列、tracr配偶序列和tracr序列中的一者或多者。在一些实施方案中，植物细胞表达CRISPR酶。在一些实施方案中，CRISPR酶选自由Cas9、Cpf1、Csc1和Csc2组成的组。
若干实施方案涉及一种用于将多核苷酸从植物或植物部分的外表面递送至植物细胞的内部中的方法，其包括向所述植物或植物部分的所述外表面施加至少一种多核苷酸、渗透调节物质和至少一种表面活性剂。在一些实施方案中，通过喷洒来施加多核苷酸、渗透调节物质和表面活性剂。在一些实施方案中，方法还包括在施加多核苷酸、渗透调节物质和表面活性剂之前对植物或植物部分的外表面进行磨蚀。在一些实施方案中，方法还包括在施加多核苷酸、渗透调节物质和表面活性剂之后对植物或植物部分的外表面进行磨蚀。在一些实施方案中，方法包括将渗透调节物质和表面活性剂与多核苷酸一起施加。在一些实施方案中，多核苷酸是非可转录的。在一些实施方案中，非可转录多核苷酸是触发多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸选自由单链DNA、单链RNA、双链DNA、双链RNA和RNA/DNA杂交体组成的组。在一些实施方案中，多核苷酸是干扰RNA。在一些实施方案中，多核苷酸是miRNA。在一些实施方案中，多核苷酸是mRNA。在一些实施方案中，多核苷酸是可转录的。在一些实施方案中，多核苷酸编码CRISPR酶。在一些实施方案中，多核苷酸包含CRISPR系统的一个或多个RNA组分。在一些实施方案中，多核苷酸包含能够与靶标序列杂交的引导序列、tracr配偶序列和tracr序列中的一者或多者。在一些实施方案中，植物细胞表达CRISPR酶。在一些实施方案中，CRISPR酶选自由Cas9、Cpf1、Csc1和Csc2组成的组。
若干实施方案涉及一种用于将多核苷酸从植物或植物部分的外表面递送至植物细胞的内部中的方法，其包括对所述植物或植物部分的表面进行磨蚀，以及将至少一种多核苷酸局部施加于所述表面上。在一些实施方案中，通过喷洒来施加至少一种多核苷酸。在一些实施方案中，方法还包括向所述植物或植物部分的外表面施加渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者。在一些实施方案中，通过喷洒来施加至少一种多核苷酸以及渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者。在一些实施方案中，多核苷酸是非可转录的。在一些实施方案中，非可转录多核苷酸是触发多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸选自由单链DNA、单链RNA、双链DNA、双链RNA和RNA/DNA杂交体组成的组。在一些实施方案中，多核苷酸是干扰RNA。在一些实施方案中，多核苷酸是miRNA。在一些实施方案中，多核苷酸是mRNA。在一些实施方案中，多核苷酸是可转录的。在一些实施方案中，多核苷酸编码CRISPR酶。在一些实施方案中，多核苷酸包含CRISPR系统的一个或多个RNA组分。在一些实施方案中，多核苷酸包含能够与靶标序列杂交的引导序列、tracr配偶序列和tracr序列中的一者或多者。在一些实施方案中，植物细胞表达CRISPR酶。在一些实施方案中，CRISPR酶选自由Cas9、Cpf1、Csc1和Csc2组成的组。
若干实施方案涉及一种适合于局部施加于杂草或自生植物的外表面上的除草组合物，所述组合物包含：至少一种非可转录多核苷酸和至少一种能够破坏所述杂草或自生植物的至少一个屏障的试剂，其中所述至少一种非可转录多核苷酸包含与所述杂草或自生植物的内源性基因的编码或非编码序列或从所述杂草或自生植物的内源性基因转录的信使RNA基本上同一或基本上互补的序列；并且其中所述内源性基因：(i)是用于维持所述杂草或自生植物的生长或生命的必需基因，(ii)编码对所述杂草或自生植物提供除草剂抗性的蛋白质，或(iii)转录成RNA调控剂。在一些实施方案中，通过于杂草或自生植物的外表面上喷洒除草组合物来施加除草组合物。在一些实施方案中，试剂包括酶和磨蚀剂中的一者或多者。在一些实施方案中，试剂包括超过一种酶。在一些实施方案中，酶选自由纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、角质酶和脂酶组成的组。在一些实施方案中，酶是水解酶。在一些实施方案中，除草组合物还包含渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者。在一些实施方案中，除草组合物包含至少一种非可转录多核苷酸和酶。在一些实施方案中，除草组合物包含至少一种非可转录多核苷酸、酶和渗透调节物质。在一些实施方案中，除草组合物包含至少一种非可转录多核苷酸、酶和表面活性剂。在一些实施方案中，除草组合物包含至少一种非可转录多核苷酸、酶、渗透调节物质和表面活性剂。在一些实施方案中，除草组合物包含至少一种非可转录多核苷酸和磨蚀剂。在一些实施方案中，除草组合物包含至少一种非可转录多核苷酸、磨蚀剂和渗透调节物质。在一些实施方案中，除草组合物包含至少一种非可转录多核苷酸、磨蚀剂和表面活性剂。在一些实施方案中，除草组合物包含至少一种非可转录多核苷酸、磨蚀剂、渗透调节物质和表面活性剂。在一些实施方案中，除草组合物包含至少一种非可转录多核苷酸、磨蚀剂和酶。在一些实施方案中，除草组合物包含至少一种非可转录多核苷酸、酶、磨蚀剂和渗透调节物质。在一些实施方案中，除草组合物包含至少一种非可转录多核苷酸、酶、磨蚀剂和表面活性剂。在一些实施方案中，除草组合物包含至少一种非可转录多核苷酸、酶、磨蚀剂、渗透调节物质和表面活性剂。在一些实施方案中，非可转录多核苷酸是触发多核苷酸。一些实施方案中，非可转录多核苷酸选自由单链DNA、单链RNA、双链DNA、双链RNA和RNA/DNA杂交体组成的组。在一些实施方案中，多核苷酸是干扰RNA。在一些实施方案中，多核苷酸是miRNA。
若干实施方案涉及一种适合于局部施加于杂草或自生植物的外表面上的除草组合物，所述组合物包含至少一种非可转录多核苷酸和至少一种能够破坏所述杂草或自生植物的至少一个屏障的酶，其中所述至少一种非可转录多核苷酸包含与所述杂草或自生植物的内源性基因的编码或非编码序列或从所述杂草或自生植物的内源性基因转录的信使RNA基本上同一或基本上互补的序列；并且其中所述内源性基因：(i)是用于维持所述杂草或自生植物的生长或生命的必需基因，(ii)编码对所述杂草或自生植物提供除草剂抗性的蛋白质，或(iii)转录成RNA调控剂。在一些实施方案中，通过于杂草或自生植物的外表面上喷洒除草组合物来施加除草组合物。在一些实施方案中，酶是水解酶。在一些实施方案中，至少一种酶独立地选自由纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、角质酶和脂酶组成的组。在一些实施方案中，除草组合物还包含渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者。在一些实施方案中，除草组合物包含非可转录多核苷酸、酶和渗透调节物质。在一些实施方案中，除草组合物包含多核苷酸、酶和表面活性剂。在一些实施方案中，除草组合物包含非可转录多核苷酸、酶、渗透调节物质和表面活性剂。在一些实施方案中，在施加组合物之前对杂草或自生植物的外表面进行磨蚀。在一些实施方案中，在施加组合物之后对杂草或自生部分的外表面进行磨蚀。在一些实施方案中，非可转录多核苷酸是触发多核苷酸。一些实施方案中，非可转录多核苷酸选自由单链DNA、单链RNA、双链DNA、双链RNA和RNA/DNA杂交体组成的组。在一些实施方案中，非可转录多核苷酸是干扰RNA。在一些实施方案中，非可转录多核苷酸是miRNA。
若干实施方案涉及一种适合于局部施加于杂草或自生植物的外表面上的除草组合物，所述组合物包含：至少一种非可转录多核苷酸、渗透调节物质和至少一种表面活性剂，其中所述至少一种非可转录多核苷酸包含与所述杂草或自生植物的内源性基因的编码或非编码序列或从所述杂草或自生植物的内源性基因转录的信使RNA基本上同一或基本上互补的序列；并且其中所述内源性基因：(i)是用于维持所述杂草或自生植物的生长或生命的必需基因，(ii)编码对所述杂草或自生植物提供除草剂抗性的蛋白质，或(iii)转录成RNA调控剂。在一些实施方案中，通过于杂草或自生植物的外表面上喷洒除草组合物来施加除草组合物。在一些实施方案中，在施加除草组合物之前对植物或植物部分的外表面进行磨蚀。在一些实施方案中，在施加除草组合物之后对植物或植物部分的外表面进行磨蚀。在一些实施方案中，非可转录多核苷酸是触发多核苷酸。一些实施方案中，非可转录多核苷酸选自由单链DNA、单链RNA、双链DNA、双链RNA和RNA/DNA杂交体组成的组。在一些实施方案中，非可转录多核苷酸是干扰RNA。在一些实施方案中，非可转录多核苷酸是miRNA。
若干实施方案涉及一种用于选择性控制靶向的除草剂抗性杂草或自生植物的方法，其包括将至少一种非可转录多核苷酸和至少一种能够破坏所述杂草或自生植物的至少一个屏障的试剂局部施加于所述杂草或自生植物的表面上；其中所述至少一种非可转录多核苷酸包含与所述杂草或自生植物的内源性基因的编码或非编码序列或从所述杂草或自生植物的内源性基因转录的信使RNA基本上同一或基本上互补的序列；并且其中所述内源性基因：(i)是用于维持所述杂草或自生植物的生长或生命的必需基因，(ii)编码对所述杂草或自生植物提供除草剂抗性的蛋白质，或(iii)转录成RNA调控剂。在一些实施方案中，通过喷洒来施加非可转录多核苷酸和试剂。在一些实施方案中，试剂包括酶和磨蚀剂中的一者或多者。在一些实施方案中，试剂包括超过一种酶。在一些实施方案中，酶选自由纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、角质酶和脂酶组成的组。在一些实施方案中，酶是水解酶。在一些实施方案中，方法还包括向所述植物或植物部分的外表面施加渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者。在一些实施方案中，方法包括以单一组合物施加试剂和至少一种非可转录多核苷酸。在一些实施方案中，方法包括分开施加试剂和至少一种非可转录多核苷酸。在一些实施方案中，方法包括将渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者与至少一种非可转录多核苷酸一起施加。在一些实施方案中，方法包括将渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者与试剂一起施加。在一些实施方案中，方法包括以单一组合物施加非可转录多核苷酸、试剂以及渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者。在一些实施方案中，非可转录多核苷酸是触发多核苷酸。
若干实施方案涉及一种用于选择性控制靶向的除草剂抗性杂草或自生植物的方法，其包括将至少一种非可转录多核苷酸和至少一种能够破坏所述杂草或自生植物的至少一个屏障的酶局部施加于所述杂草或自生植物的表面上；其中所述至少一种非可转录多核苷酸包含与所述杂草或自生植物的内源性基因的编码或非编码序列或从所述杂草或自生植物的内源性基因转录的信使RNA基本上同一或基本上互补的序列；并且其中所述内源性基因：(i)是用于维持所述杂草或自生植物的生长或生命的必需基因，(ii)编码对所述杂草或自生植物提供除草剂抗性的蛋白质，或(iii)转录成RNA调控剂。在一些实施方案中，通过喷洒来施加非可转录多核苷酸和酶。在一些实施方案中，在施加至少一种非可转录多核苷酸和酶之前对杂草或自生植物的外表面进行磨蚀。在一些实施方案中，在施加至少一种非可转录多核苷酸和酶之后对杂草或自生植物的外表面进行磨蚀。在一些实施方案中，酶是水解酶。在一些实施方案中，至少一种酶独立地选自由纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、角质酶和脂酶组成的组。在一些实施方案中，方法还包括向所述杂草或自生植物的外表面施加渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者。在一些实施方案中，方法包括以单一组合物施加酶和至少一种非可转录多核苷酸。在一些实施方案中，方法包括分开施加酶和至少一种非可转录多核苷酸。在一些实施方案中，方法包括将渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者与至少一种非可转录多核苷酸一起施加。在一些实施方案中，方法包括将渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者与酶一起施加。在一些实施方案中，方法包括以单一组合物施加至少一种非可转录多核苷酸、酶以及渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者。在一些实施方案中，非可转录多核苷酸是触发多核苷酸。
若干实施方案涉及一种用于选择性控制靶向的除草剂抗性杂草或自生植物的方法，其包括将至少一种非可转录多核苷酸、渗透调节物质和表面活性剂局部施加于所述杂草或自生植物的表面上；其中所述至少一种非可转录多核苷酸包含与所述杂草或自生植物的内源性基因的编码或非编码序列或从所述杂草或自生植物的内源性基因转录的信使RNA基本上同一或基本上互补的序列；并且其中所述内源性基因：(i)是用于维持所述杂草或自生植物的生长或生命的必需基因，(ii)编码对所述杂草或自生植物提供除草剂抗性的蛋白质，或(iii)转录成RNA调控剂。在一些实施方案中，通过喷洒来施加非可转录多核苷酸、渗透调节物质和表面活性剂。在一些实施方案中，在施加至少一种非可转录多核苷酸、渗透调节物质和表面活性剂之前对杂草或自生植物的外表面进行磨蚀。在一些实施方案中，在施加至少一种非可转录多核苷酸、渗透调节物质和表面活性剂之后对杂草或自生植物的外表面进行磨蚀。在一些实施方案中，方法包括以单一组合物施加渗透调节物质、表面活性剂和至少一种非可转录多核苷酸。在一些实施方案中，方法包括分开施加表面活性剂和至少一种非可转录多核苷酸。在一些实施方案中，非可转录多核苷酸是触发多核苷酸。
若干实施方案涉及一种用于选择性控制靶向的除草剂抗性杂草或自生植物的方法，其包括对所述杂草或自生植物的表面进行磨蚀，以及将至少一种非可转录多核苷酸局部施加于所述表面上；其中所述至少一种非可转录多核苷酸包含与所述杂草或自生植物的内源性基因的编码或非编码序列或从所述杂草或自生植物的内源性基因转录的信使RNA基本上同一或基本上互补的序列；并且其中所述内源性基因：(i)是用于维持所述杂草或自生植物的生长或生命的必需基因，(ii)编码对所述杂草或自生植物提供除草剂抗性的蛋白质，或(iii)转录成RNA调控剂。在一些实施方案中，方法还包括向所述杂草或自生植物的外表面施加渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者。在一些实施方案中，通过喷洒来施加多核苷酸、渗透调节物质和表面活性剂。在一些实施方案中，非可转录多核苷酸是触发多核苷酸。
若干实施方案涉及一种用于将CRISPR系统的一个或多个元件从植物或植物部分的外表面递送至植物细胞的内部中的方法，其包括向所述植物或植物部分的所述外表面施加至少一种编码所述CRISPR系统的一个或多个元件的多核苷酸和至少一种能够破坏所述植物或植物部分的至少一个屏障的试剂。在一些实施方案中，植物细胞表达Cas酶，并且至少一种多核苷酸编码CRISPR系统的一个或多个RNA组分。在一些实施方案中，通过喷洒来施加多核苷酸和试剂。在一些实施方案中，试剂包括酶和磨蚀剂中的一者或多者。在一些实施方案中，试剂包括超过一种酶。在一些实施方案中，酶选自由纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、角质酶和脂酶组成的组。在一些实施方案中，酶是水解酶。在一些实施方案中，方法还包括向所述植物或植物部分的外表面施加渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者。在一些实施方案中，方法包括以单一组合物施加试剂和至少一种编码CRISPR系统的一个或多个元件的多核苷酸。在一些实施方案中，方法包括分开施加试剂和至少一种编码CRISPR系统的一个或多个元件的多核苷酸。在一些实施方案中，方法包括将渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者与至少一种编码CRISPR系统的一个或多个元件的多核苷酸一起施加。在一些实施方案中，方法包括将渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者与试剂一起施加。在一些实施方案中，方法包括以单一组合物施加编码CRISPR系统的一个或多个元件的多核苷酸、试剂以及渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者。在一些实施方案中，多核苷酸编码Cas酶、引导序列、tracr配偶序列和tracr序列中的一者或多者。在一些实施方案中，多核苷酸编码连接于tracr配偶序列的引导序列。在一些实施方案中，Cas酶选自由Cas9、Cpf1、Csc1和Csc2组成的组。
若干实施方案涉及一种用于将CRISPR系统的一个或多个元件从植物或植物部分的外表面递送至植物细胞的内部中的方法，其包括向所述植物或植物部分的所述外表面施加至少一种编码CRISPR系统的一个或多个元件的多核苷酸和至少一种能够破坏所述植物或植物部分的至少一个屏障的酶。在一些实施方案中，植物细胞表达Cas酶，并且至少一种多核苷酸编码CRISPR系统的一个或多个RNA组分。在一些实施方案中，通过喷洒来施加多核苷酸和试剂。在一些实施方案中，在施加编码CRISPR系统的一个或多个元件的多核苷酸和酶之前对植物或植物部分的外表面进行磨蚀。在一些实施方案中，在施加编码CRISPR系统的一个或多个元件的多核苷酸和酶之后对植物或植物部分的外表面进行磨蚀。在一些实施方案中，酶是水解酶。在一些实施方案中，至少一种酶独立地选自由纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、角质酶和脂酶组成的组。在一些实施方案中，方法还包括向所述植物或植物部分的外表面施加渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者。在一些实施方案中，方法包括以单一组合物施加酶和至少一种编码CRISPR系统的一个或多个元件的多核苷酸。在一些实施方案中，方法包括分开施加酶和至少一种编码CRISPR系统的一个或多个元件的多核苷酸。在一些实施方案中，方法包括将渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者与至少一种编码CRISPR系统的一个或多个元件的多核苷酸一起施加。在一些实施方案中，方法包括将渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者与酶一起施加。在一些实施方案中，方法包括以单一组合物施加编码CRISPR系统的一个或多个元件的多核苷酸、酶以及渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者。在一些实施方案中，多核苷酸编码Cas酶、引导序列、tracr配偶序列和tracr序列中的一者或多者。在一些实施方案中，多核苷酸编码连接于tracr配偶序列的引导序列。在一些实施方案中，Cas酶选自由Cas9、Cpf1、Csc1和Csc2组成的组。
若干实施方案涉及一种用于将CRISPR系统的一个或多个元件从植物或植物部分的外表面递送至植物细胞的内部中的方法，其包括向所述植物或植物部分的所述外表面施加至少一种编码所述CRISPR系统的一个或多个元件的多核苷酸、渗透调节物质和表面活性剂。在一些实施方案中，植物细胞表达Cas酶，并且至少一种多核苷酸编码CRISPR系统的一个或多个RNA组分。在一些实施方案中，通过喷洒来施加非可转录多核苷酸、渗透调节物质和表面活性剂。在一些实施方案中，在施加多核苷酸、渗透调节物质和表面活性剂之前对植物或植物部分的外表面进行磨蚀。在一些实施方案中，在施加多核苷酸、渗透调节物质和表面活性剂之后对杂草或自生植物的外表面进行磨蚀。在一些实施方案中，方法包括以单一组合物施加渗透调节物质、表面活性剂和多核苷酸。在一些实施方案中，方法包括分开施加表面活性剂和多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸编码Cas酶、引导序列、tracr配偶序列和tracr序列中的一者或多者。在一些实施方案中，多核苷酸编码连接于tracr配偶序列的引导序列。在一些实施方案中，Cas酶选自由Cas9、Cpf1、Csc1和Csc2组成的组。
若干实施方案涉及一种用于将CRISPR系统的一个或多个元件从植物或植物部分的外表面递送至植物细胞的内部中的方法，其包括对所述植物或植物部分的表面进行磨蚀，以及将至少一种编码CRISPR系统的一个或多个元件的多核苷酸局部施加于所述表面上。在一些实施方案中，植物细胞表达Cas酶，并且至少一种多核苷酸编码CRISPR系统的一个或多个RNA组分。在一些实施方案中，通过喷洒来施加至少一种多核苷酸。在一些实施方案中，方法还包括向所述植物或植物部分的外表面施加渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者。在一些实施方案中，通过喷洒来施加至少一种多核苷酸以及渗透调节物质和表面活性剂中的一者或多者。在一些实施方案中，多核苷酸编码Cas酶、引导序列、tracr配偶序列和tracr序列中的一者或多者。在一些实施方案中，多核苷酸编码连接于tracr配偶序列的引导序列。在一些实施方案中，Cas酶选自由Cas9、Cpf1、Csc1和Csc2组成的组。
附图简述
图1描绘与目视表型相关联的GFP mRNA的相对丰度的qPCR测量结果(参见实施例28)。
图2描绘测试的不同颗粒的目视沉默功效，如实施例31中所述。“AlO”＝氧化铝(根据筛目尺寸列出)，“DE”＝硅藻土(以Celite等级列出)，“SiC”＝碳化硅(根据筛目尺寸列出)，“SLG”＝钠钙玻璃(根据以微米计的珠粒直径范围列出)。
详述
除非另外定义，否则使用的所有技术和科学术语都具有与由本公开所属领域中的普通技术人员通常理解相同的含义。当以单数形式提供术语时，本发明者也预期通过那个术语的复数形式来描述各个方面。当以引用的方式并入本文的参考文献中使用的术语和定义存在分歧时，本申请中使用的术语应具有本文给出的定义。使用的其它技术术语具有它们的在它们所用于的领域中的普通含义，如由各种领域特异性词典所例示，所述词典例如“The AmericanScience Dictionary”(American Heritage Dictionaries的编者,2011,Houghton Mifflin Harcourt,Boston and New York)、“McGraw-HillDictionary of Scientific and Technical Terms”(第6版,2002,McGraw-Hill,NewYork)或“Oxford Dictionary of Biology”(第6版,2008,Oxford University Press,Oxford and New York)。本发明者不意图限于某一作用机理或模式。对其的提及仅出于说明目的而提供。
本文引用的任何参考文献都以引用的方式整体并入本文。
如本文所用，除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述/该(the)”包括复数个指示物。举例来说，术语“一个(种)化合物”或“至少一个(种)化合物”可包括复数个(种)化合物，包括其混合物。
如本文所用，术语“约”指示数值包括用于测定数值的方法的固有误差偏差或存在于实验之间的偏差。
用于破坏植物细胞的至少一个屏障的的酶
如本文所用，术语“酶”是指能够催化特异性生物化学反应的蛋白质。如本文所用，术语植物细胞的“至少一个屏障”是指围绕植物原生质体的细胞质的保护层，包括植物角质层/蜡屏障、植物细胞壁、植物质膜或其任何组合。因此，术语“破坏至少一个屏障”意指分解植物角质层/蜡屏障、植物细胞壁或植物质膜中的至少一种组成分子。
在一个实施方案中，酶是帮助分解植物角质层/蜡屏障、植物细胞壁或植物质膜中的至少一种组成分子的蛋白质。植物角质层/蜡屏障、植物细胞壁或植物质膜中的组成分子的实例包括但不限于多糖(诸如纤维素、半纤维素和果胶)、脂质(诸如磷脂和角质)和糖多肽。酶可通过它的底物或它催化的化学反应来分类。酶学委员会编号(EC编号)是基于酶催化的化学反应的酶数值分类流程。酶单位(U)是特定酶的量的单位。一个U定义为产生某一酶活性量的酶量，即每分钟催化1微摩尔底物转化的量。
酶可源于天然生物来源或在宿主细胞中重组产生。在一个方面，酶由微生物天然或重组产生。在一些实施方案中，微生物进一步产生在靶标植物中诱导RNA干扰(RNAi)响应的多核苷酸。在另一方面，酶由动物或植物天然或重组产生。在一些实施方案中，动物或植物进一步产生在靶标植物中诱导RNA干扰(RNAi)响应的多核苷酸。在一些实施方案中，微生物是真菌。在一些实施方案中，微生物是细菌。可表达适用于本公开中的酶的微生物的实例包括但不限于灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、芸苔生链格孢(Alternaria brassicola)、豌豆茄镰孢菌(Fusarium solani pisi)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、绿色木霉(Trichoderma viride)、疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)、苋生拟点霉(Phomopsis amaranthicola)、隐地疫霉(Phytophtora cryptogea)、绿色木霉、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、脐孢木霉(Trichoderma bervicompactum)。
酶可在采用或不采用本领域中已知的任何分离或纯化步骤下使用。在一些实施方案中，酶在复原以进行施加之前呈冻干形式。在一些实施方案中，酶以液体溶液形式提供。在一些实施方案中，酶以冻干形式提供。在一些实施方案中，酶作为细胞溶解产物的一部分被提供。在一些实施方案中，酶作为细胞培养液的一部分被提供。在一些实施方案中，酶作为细菌或真菌溶解产物的一部分被提供。
如本文所用，术语“纤维素酶”广泛指代帮助分解纤维素分子的任何酶，包括所述酶的混合物或其任何组合。基于催化的反应的类型的不同纤维素酶的实例包括但不限于内切纤维素酶(EC 3.2.1.4)、外切纤维素酶或纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)、纤维二糖酶(EC 3.2.1.21)或β-葡萄糖苷酶、氧化纤维素酶和纤维素磷酸化酶。可商购获得的纤维素酶包括例如来自真菌，如黑曲霉(Aspergillus niger)和其它曲霉属物种、绿色木霉和其它木霉属物种(如里氏木霉(Trichoderma reesei)ATCC 26921、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)和哈茨木霉)的那些，或来自细菌的那些，如来自热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)或膨胀网球菌(Dyctioglomus turgid)的那些。
类似地，如本文所用，术语“半纤维素酶”广泛指代帮助分解半纤维素分子的任何酶，包括所述酶的混合物或其任何组合。半纤维素的非限制性实例包括木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、葡甘露聚糖和木葡聚糖。因此，半纤维素酶的非限制性实例包括木聚糖酶、葡糖醛酸木聚糖酶、阿拉伯糖基木聚糖酶、葡甘露聚糖酶和木葡聚糖酶。可商购获得的半纤维素酶包括例如来自真菌，如黑曲霉和其它曲霉属物种、疏绵状嗜热丝孢菌、木霉属物种(如长枝木霉和绿色木霉)的那些。
如本文所用，术语“果胶酶”广泛指代帮助分解果胶分子的任何酶，包括所述酶的混合物或其任何组合。果胶酶(pectinase)也可被称为果胶酶(pectic enzyme)。不同果胶酶的实例包括但不限于果胶裂解酶(pectolyase)(或果胶裂解酶(pectin lyase)，EC4.2.2.10)和聚半乳糖醛酸酶(或果胶解聚酶、PG、果胶酶(pectolase)、果胶水解酶，EC3.2.1.15)。可商购获得的果胶酶包括例如来自真菌，如根霉属物种(Rhizopus sp.)、黑曲霉和棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的那些。
如本文所用，术语“角质酶”广泛指代帮助分解角质分子的任何酶，包括所述酶的混合物或其任何组合。角质酶是丝氨酸酯酶。在一个方面，角质酶催化角质的水解，并且也可被称为角质水解酶(EC 3.1.1.74)。可商购获得的角质酶包括例如豌豆茄镰孢菌角质酶。
如本文所用，术语“脂酶”广泛指代帮助分解脂质分子的任何酶或所述酶的混合物或其任何组合。脂酶是酯酶的一个子类。可商购获得的脂酶包括例如来自真菌，如米根霉(Rhizopus oryzae)、黑曲霉、爪哇毛霉(Mucor javanicus)、沙门柏干酪青霉(Penicilliumcamemberti)、雪白根霉(Rhizopus niveous)、米赫毛霉(Mucor miehei)、棘孢曲霉、里氏木霉、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)、疏绵状嗜热丝孢菌、酵母(如皱褶念珠菌(Candidarugosa)和其它念珠菌属物种)；或细菌，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的那些。在一些实施方案中，使用的脂酶包括可商购获得的(C-PAL)、脂酶G(AL-G)、疏绵状嗜热丝孢菌磷酸脂酶A1(Tl-PLA1)和硅藻土固定化的脂酶PS(iAL-PS，来自洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia))。
用于将核酸递送至植物中的颗粒磨蚀剂
如本文所用，术语“颗粒”、“磨蚀剂”和“颗粒磨蚀剂”可互换使用，并且是指可物理破坏植物或植物部分的至少一个屏障的试剂。
在一些实施方案中，本公开提供使用对植物的表面的机械破坏来有助于将核酸递送至植物中的方法，例如通过使植物的表面与磨蚀剂诸如松散颗粒或负载在基体上的颗粒接触，或通过使植物的表面与非颗粒微结构接触。通常，方法中使用的磨蚀在表面上破坏植物的角质层或表皮或角质层与表皮两者中的细胞，但不损害植物的更深组织中的细胞。
适用于本文公开的方法中的颗粒包括选自由矿物质磨蚀剂、金属磨蚀剂、合成磨蚀剂和有机磨蚀剂组成的组的颗粒磨蚀剂。实施方案包括选自由以下组成的组的颗粒磨蚀剂：氧化铝、碳化硅(“金刚砂”)、二氧化硅、钠钙玻璃、硅藻土(diatomaceous silica)(“硅藻土(diatomaceous earth)”)、燧石、石英、石榴石、二氧化硅、浮石、砂、长石、方解石、钢、钨、陶瓷、碳化硼、碳化钨、有机或可生物降解磨蚀剂或这些的组合。在各实施方案中，颗粒由有机或可生物降解材料诸如但不限于木材粒子、玉米芯粒子、谷物或种子粒子或坚果壳粒子组成。
根据诸如与给定制剂的相容性、在给定装置(诸如喷嘴)中使用的适合性、在递送RNA方面的效率、或使对处理的植物的损害最小化的因素选择颗粒尺寸。在各实施方案中，颗粒具有约2.5微米至约50微米的平均尺寸范围。在各种实施方案中，颗粒具有2.5–50、2.5–40、2.5–30、2.5–20、5–50、5–40、5–30、5–20、7–50、7–40、7–30、7–20、8–50、8–40、8–30、8–20、10–50、10–40、10–30、或10–25微米的平均尺寸范围。工作实施例进一步说明适用颗粒尺寸范围的实施方案。
本文也描述适用于将核酸递送至植物中的组合物和装置以及通过如本文所述的方法或组合物处理的植物。在各实施方案中，使用加压气体将DNA或RNA涂布的氧化铝或碳化硅粒子递送至植物中。举例来说，将RNA分子(例如合成dsRNA或在细菌系统中产生的dsRNA)或DNA分子(例如VIGS载体或质粒)涂布于氧化铝(Al2O3)或碳化硅(SiC，“金刚砂”)粒子上，并且使其干燥；使用加压空气或其它气体将这些核酸涂布的粒子喷洒于植物的叶上，并且导致由核酸靶向的基因的沉默。使用压缩空气的气刷(例如如本文所述的实验中所用的Master Airbrush G78型单动重力馈料空气磨蚀剂浸蚀气刷枪)是一种向植物施加颗粒的适宜工具。加压气体可由任何适宜工具诸如空气压缩机或压缩气瓶提供；当与干燥粉末组合物一起使用时，优选使用低湿度加压气体。
这些方法中使用的磨蚀优选对植物产生最小损害。在各实施方案中，颗粒仅破坏植物的角质层中或角质层和表皮中的细胞。在各实施方案中，比表皮更深的细胞基本上不由颗粒磨蚀剂损害。在各实施方案中，沉默是系统性的，并且在植物的至少一个并非磨蚀位置的位置中的靶标基因被沉默。
与使用基因枪的植物转化技术相比，本文所述的颗粒辅助的递送方法和组合物使用由比金或钨廉价的材料制得且尺寸范围大于基因枪转化中使用的粒子的尺寸范围的颗粒，通常使用较低压力，不需要在真空中处理植物，并且可在完整植物或多个植物中进行。方法和组合物可扩展以便适用于一次处理多个植物。
多核苷酸
如本文所用，“多核苷酸”是指含有多个核苷酸的核酸分子，并且通常是指“寡核苷酸”(长度是18-25个核苷酸的多核苷酸分子)与具有26个或更多个核苷酸的多核苷酸两者。多核苷酸也包括含有包括如本领域中通常实施的非典型核苷酸或经化学修饰核苷酸的多个核苷酸的分子；参见例如技术手册“RNA Interference(RNAi)and DsiRNAs”,2011(Integrated DNA Technologies Coralville,IA)中公开的化学修饰。通常，如本文所述的多核苷酸(无论是DNA还是RNA或两者以及无论是单链还是双链)都包括至少一个具有18个或更多个连续核苷酸(或在双链多核苷酸的情况下，具有至少18个连续碱基对)的区段，其与靶标基因的DNA或所述靶标基因的RNA转录物的具有等效尺寸的片段基本上同一或基本上互补。在整篇本公开中，“至少18个连续”意指“18至约10,000个，包括介于之间的每个整数点”。本公开的各个方面包括组合物，其包括具有16-25个核苷酸的长度的寡核苷酸(例如16聚体、17聚体、18聚体、19聚体、20聚体、21聚体、22聚体、23聚体、24聚体或25聚体)、或具有26个或更多个核苷酸的长度的中等长度多核苷酸(例如具有26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约210、约220、约230、约240、约250、约260、约270、约280、约290或约300个核苷酸的多核苷酸)、或具有至少约300个核苷酸的长度的长多核苷酸(例如长度是约300至约400个核苷酸、约400至约500个核苷酸、约500至约600个核苷酸、约600至约700个核苷酸、约700至约800个核苷酸、约800至约900个核苷酸、约900至约1000个核苷酸、约300至约500个核苷酸、约300至约600个核苷酸、约300至约700个核苷酸、约300至约800个核苷酸、约300至约900个核苷酸或约1000个核苷酸，或长度甚至大于约1000个核苷酸，例如长度多达2000个核苷酸、3000个核苷酸、4000个核苷酸、5000个核苷酸，或多达靶标基因(包括所述靶标基因的编码部分或非编码部分或编码部分与非编码部分两者)的整个长度的多核苷酸)。当多核苷酸是双链时，它的长度可类似地用碱基对来描述。
如本文所用，术语“非可转录多核苷酸”是指不包含完整聚合酶II转录单元的多核苷酸。在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法中的多核苷酸是非可转录多核苷酸。在其它实施方案中，本文公开的多核苷酸是可转录多核苷酸。在一些实施方案中，本文公开的多核苷酸是质粒或病毒载体。
如本文所用，术语“触发剂”、“触发多核苷酸”或“多核苷酸触发剂”是指与靶标基因的多核苷酸序列或从所述靶标基因表达的RNA或其片段大致上同源或互补，并且起抑制所述靶标基因的表达或产生敲低表型的作用的生物活性多核苷酸分子。触发多核苷酸能够抑制或“沉默”靶标基因的表达。触发多核苷酸通常相对于它们的“靶标序列”来描述。触发多核苷酸可为单链DNA(ssDNA)、单链RNA(ssRNA)、双链RNA(dsRNA)、双链DNA(dsDNA)或双链DNA/RNA杂交体。触发多核苷酸可包含天然存在的核苷酸、经修饰核苷酸、核苷酸类似物或其任何组合。在一些实施方案中，触发多核苷酸可被并入较大多核苷酸内。在一些实施方案中，触发多核苷酸可被加工成小干扰RNA(siRNA)。
如本文所用，术语“靶标基因”或“靶标序列”是指存在于触发多核苷酸所针对的基因或基因产物中的核苷酸序列。在这个情形下，术语“基因”意指基因组序列的对应于遗传单元的可定位区域，其包括调控区(诸如启动子、增强子)、5’非翻译区、内含子区域、3’非翻译区、转录区以及可以天然基因或转基因形式存在于植物基因组或病原体的基因组中的其它功能性序列区域。如本文所用，术语“病原体”是指病毒、类病毒、细菌、真菌、卵菌、原生动物、植原体和寄生植物。视情况而定，术语靶标序列或靶标基因可指被靶向以达成抑制的基因或基因产物的全长核苷酸序列，或被靶向以达成抑制的基因或基因产物的一部分的核苷酸序列。
如本文所用，“dsRNA”分子是指包含两个由氢键结合在一起的反向平行核糖核苷酸链的分子，其各链包含由在一个链中在5’-3’方向上以及在另一链中在3’-5’方向上行进的磷酸二酯键连接的核糖核苷酸。dsRNA的两个反向平行链可彼此完全互补，或在直至以下程度上包含一个或多个错配：其中任一额外错配都会导致两个反向平行链解离。dsRNA分子可以在整个dsRNA分子上具有完全互补性，或仅包含整个分子的一部分呈dsRNA构型。dsRNA的两个反向平行链也可来自一个由磷酸二酯键连接的连续核糖核苷酸的链，例如发夹样结构(也常称为茎-环结构)。
如本文所用，术语“同源性”和“同一性”在关于核酸使用时描述两个或更多个核苷酸序列之间的类似性程度。两个序列之间的“序列同一性”的百分比通过以下方式来确定：在比较窗上比较两个最优对准序列，以使所述比较窗中的序列的部分相较于参照序列(其不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(空位)以达成两个序列的最优比对。通过以下方式来计算百分比：确定同一核酸碱基或氨基酸残基存在于两个序列中所处的位置的数目以产生匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以比较窗中的位置总数，以及用100乘以结果以产生序列同一性百分比。相较于参照序列在每个位置都同一的序列被称为与所述参照序列同一，并且反之亦然。可使用任何适合计算机程序来对两个或更多个序列进行比对。举例来说，一种广泛使用和接受的用于进行序列比对的计算机程序是CLUSTALW v1.6(Thompson等Nucl.Acids Res.,22:4673-4680,1994)。
如本文所用，术语“基本上同一”或“基本上互补”意指生物活性多核苷酸触发剂(或双链多核苷酸的至少一个链或其部分或单链多核苷酸的一部分)在生理条件下与靶标基因、从其转录的RNA或其片段杂交以实现对靶标基因的调控或抑制。举例来说，在一些实施方案中，当相较于具有靶标基因或从靶标基因转录的RNA中的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60个或更多个连续核苷酸的序列时，生物活性多核苷酸触发剂具有100％序列同一性或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些实施方案中，当相较于具有靶标基因或从靶标基因转录的RNA中的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60个或更多个连续核苷酸的序列时，生物活性多核苷酸触发剂具有100％序列互补性或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列互补性。在一些实施方案中，生物活性多核苷酸触发剂与给定靶标基因的一个等位基因或一个家族成员(基因的编码或非编码序列)具有100％序列同一性或互补性。在一些实施方案中，生物活性多核苷酸触发剂与给定靶标基因的多个等位基因或家族成员具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性或互补性。在一些实施方案中，生物活性多核苷酸触发剂与给定靶标基因的多个等位基因或家族成员具有100％序列同一性或互补性。
本文所述的多核苷酸可为单链(ss)或双链(ds)。“双链”是指通常在生理相关条件下发生在充分互补的反向平行核酸链之间以形成双链核酸结构的碱基配对。实施方案包括其中多核苷酸选自由以下组成的组的那些：有义单链DNA(ssDNA)、有义单链RNA(ssRNA)、双链RNA(dsRNA)、双链DNA(dsDNA)、双链DNA/RNA杂交体、反义ssDNA或反义ssRNA；可使用任何这些类型的多核苷酸的混合物。在一些实施方案中，多核苷酸是微小RNA(miRNA)、miRNA诱饵(例如如以引用的方式并入本文的美国专利申请公布2009/0070898中所公开)、miRNA前体或反式作用性RNA(ta-siRNA)。在一些实施方案中，多核苷酸是长度大于为天然存在的调控小RNA(诸如内源性产生的siRNA和成熟miRNA)所特有的长度的双链RNA。在一些实施方案中，多核苷酸是长度是至少约30个连续碱基对的双链RNA。在一些实施方案中，多核苷酸是具有约50至约500个碱基对的长度的双链RNA。在一些实施方案中，多核苷酸可包括除标准核糖核苷酸以外的组分，例如一实施方案是包含末端脱氧核糖核苷酸的RNA。
在各种实施方案中，本文所述的多核苷酸包含天然存在的核苷酸，诸如存在于DNA和RNA中的那些。在某些实施方案中，多核苷酸是核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合，例如主要由核糖核苷酸组成，但具有一个或多个末端脱氧核糖核苷酸或一个或多个末端二脱氧核糖核苷酸的合成多核苷酸，或主要由脱氧核糖核苷酸组成，但具有一个或多个末端二脱氧核糖核苷酸的合成多核苷酸。在某些实施方案中，多核苷酸包含非典型核苷酸诸如肌苷、硫尿苷或假尿苷。在某些实施方案中，多核苷酸包含经化学修饰核苷酸。经化学修饰寡核苷酸或多核苷酸的实例在本领域中是熟知的；参见例如美国专利公布2011/0171287、美国专利公布2011/0171176、美国专利公布2011/0152353、美国专利公布2011/0152346和美国专利公布2011/0160082，其以引用的方式并入本文。说明性实例包括但不限于寡核苷酸或多核苷酸的天然存在的磷酸二酯骨架可用硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联修饰加以部分或完全修饰，经修饰核苷碱基或经修饰糖可用于寡核苷酸或多核苷酸合成中，以及寡核苷酸或多核苷酸可用荧光部分(例如荧光素或若丹明)或其它标记(例如生物素)加以标记。
若干实施方案涉及一种包含至少一个具有18个或更多个连续核苷酸的区段的多核苷酸，所述区段具有与靶标基因的DNA的等效长度的片段具有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％或约95％至约100％同一性的序列。在一些实施方案中，连续核苷酸数目是至少16，例如16至24、或16至25、或16至26、或16至27、或16至28。在一些实施方案中，连续核苷酸数目是至少18，例如18至24、或18至28、或20至30、或20至50、或20至100、或50至100、或50至500、或100至250、或100至500、或200至1000、或500至2000或甚至更大。在一些实施方案中，连续核苷酸数目超过16，例如是17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或大于30，例如约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约210、约220、约230、约240、约250、约260、约270、约280、约290、约300、约350、约400、约450、约500、约600、约700、约800、约900、约1000个或大于1000个连续核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸包含至少一个具有至少21个连续核苷酸的区段，其具有与靶标基因的DNA的等效长度的片段具有100％同一性的序列。在一些实施方案中，多核苷酸是双链核酸(例如dsRNA)，其中一个链包含至少一个具有至少21个连续核苷酸的与靶标基因的DNA的等效长度的片段具有100％同一性的区段；以碱基对加以表示，这种双链核酸包含至少一个具有对应于靶标基因的DNA的等效长度的片段或其DNA互补序列的至少21个连续完全匹配碱基对的区段。在一些实施方案中，多核苷酸中含有的各区段具有的长度大于为天然存在的调控小RNA所特有的长度，例如各区段的长度是至少约30个连续核苷酸(或碱基对)。在一些实施方案中，多核苷酸的总长度在约50至约5000个核苷酸(对于单链多核苷酸)或碱基对(对于双链多核苷酸)之间。在一些实施方案中，多核苷酸是在约50至约5000个碱基对之间的dsRNA。
制备多核苷酸的方法在本领域中是熟知的。化学合成、体内合成和体外合成方法和组合物在本领域中是已知的，并且包括各种病毒元件、微生物细胞、经修饰聚合酶和经修饰核苷酸。寡核苷酸的商业制备常在有义链的3’末端上提供两个脱氧核糖核苷酸。可由可商购获得的试剂盒合成长多核苷酸分子，例如来自Applied Biosystems/Ambion(Austin,TX)的试剂盒使DNA连接在包括细菌T7聚合酶启动子的微生物表达盒中的5’末端上，这制备可装配成dsRNA的RNA链，以及由各个制造商提供的试剂盒，其包括T7RiboMax Express(Promega,Madison,WI)、AmpliScribe T7-Flash(Epicentre,Madison,WI)和TranscriptAid T7High Yield(Fermentas,Glen Burnie,MD)。如本文所述的多核苷酸可在细菌细胞中从微生物表达盒产生(Ongvarrasopone等ScienceAsia 33:35-39；Yin,Appl.Microbiol.Biotechnol 84:323-333,2009；Liu等,BMC Biotechnology 10:85,2010)。在一些实施方案中，细菌细胞具有经调控的或缺陷性RNA酶III酶活性。在一些实施方案中，将靶标基因的片段插入微生物表达盒中的某一位置中，其中所述片段表达以产生在本文所述的方法中适用于调控靶标基因的表达的ssRNA或dsRNA。长多核苷酸分子也可从多个RNA或DNA片段装配。在一些实施方案中，设计参数诸如雷诺兹评分(Reynolds score)(Reynolds等Nature Biotechnology 22,326-330(2004))和图许尔法则(Tuschl rule)(Pei和Tuschl,Nature Methods 3(9):670-676,2006)在本领域中是已知的，并且用于选择在基因沉默方面有效的多核苷酸序列。在一些实施方案中，对多核苷酸序列的随机设计或经验选择用于选择在基因沉默方面有效的多核苷酸序列。在一些实施方案中，相对于预定植物的基因组DNA筛选多核苷酸的序列以使对其它基因的非故意沉默最小化。
靶标基因和触发多核苷酸
本公开中的方法和组合物可用于被设计以调节靶标基因的表达的任何触发多核苷酸。靶标基因可为内源性基因、病毒基因或转基因。靶标基因可为内源性植物基因、在植物细胞中表达的转基因、植物病原体的内源性基因或在植物病原体中表达的转基因。术语“病原体”是指病毒、类病毒、细菌、真菌、卵菌、原生动物、植原体和寄生植物。在一些实施方案中，靶标基因1)是用于维持植物的生长和生命的必需基因；2)编码对植物提供除草剂抗性的蛋白质；或3)转录成RNA调控剂。在一些实施方案中，靶标基因对于将引入触发多核苷酸的植物是外源性的，但对于植物病原体是内源性的。
靶标基因可为可翻译(编码)序列，或可为非编码序列(诸如非编码调控序列)，或两者。靶标基因的实例包括非可翻译(非编码)序列，诸如但不限于5’非翻译区、启动子、增强子或其它非编码转录区、3’非翻译区、终止子和内含子。靶标基因包括编码微小RNA、小干扰RNA和与沉默复合物(RISC)或Argonaute蛋白相关的其它小RNA；核糖体或核酶的RNA组分；小核仁RNA；和其它非编码RNA的基因。靶标基因也可包括编码转录因子的基因和编码参与目标分子(诸如但不限于氨基酸、脂肪酸和其它脂质、糖和其它碳水化合物、生物聚合物、以及次级代谢物，包括生物碱、类萜、聚酮、非核糖体肽和混合生物合成来源的次级代谢物)的生物合成或分解代谢的酶的基因。
靶标基因可包括被靶向以达成抑制的单一基因或单一基因的一部分，或可包括例如靶标基因的多个连续区段、靶标基因的多个非连续区段、靶标基因的多个等位基因、或来自一个或多个物种的多个靶标基因。
在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法适用于使生长植物细胞或完整植物中的一个或多个基因短暂沉默以响应于培养条件、环境或非生物或生物应激、或生长季节期间的市场需求变化或收获后环境变化实现所需表型。举例来说，如本文所述的组合物和方法适用于短暂抑制生物合成或分解代谢基因以产生具有所需表型诸如作物植物产品的所需营养组成的植物或植物产品，例如抑制FAD2基因以在大豆或加拿大油菜(canola)或其它油籽中实现所需脂肪酸概况，或抑制木质素生物合成基因诸如COMT和CCOMT以提供更可易于消化的草料植物。
靶标基因可包括编码除草剂耐受性蛋白质的基因、包括调控RNA的非编码序列、以及作为维持细胞生命或支持生物体的繁殖所必要的基因的必需基因。必需基因的实施方案包括DNA或RNA复制、基因转录、RNA介导的基因调控、蛋白质合成、能量产生和细胞分裂中涉及的基因。必需基因的概要的一个实例描述于Zhang等(2004)Nucleic Acids Res.,32:D271-D272中，并且可在tubic.tju.edu.cn/deg/处获得；DEG 5.4版列出拟南芥(Arabidopsis thaliana)的777个必需基因。必需基因的实例包括翻译起始因子(TIF)和核酮糖-1,5-二磷酸酯羧化酶加氧酶(RuBisCO)。靶标基因可包括编码转录因子的基因和编码参与植物中分子(诸如但不限于氨基酸、脂肪酸和其它脂质、糖和其它碳水化合物、生物聚合物、以及次级代谢物，包括生物碱、类萜、聚酮、非核糖体肽和混合生物合成来源的次级代谢物)的生物合成或分解代谢的酶的基因。
适合靶标基因的特定实例也包括参与氨基酸或脂肪酸合成、储存或分解代谢的基因，参与多步生物合成路径的基因，其中可为重要的是调控一种或多种中间体的水平；以及编码细胞周期控制蛋白质的基因。靶标基因可包括编码不合需要蛋白质(例如过敏原或毒素)或用于生物合成不合需要化合物(例如不合需要风味或气味组分)的酶的基因。
靶标基因也包括植物病原体的必需基因。必需基因包括当沉默或抑制时导致病原体的死亡或导致病原体不能成功繁殖的基因。在一些实施方案中，靶标基因是来自病原性病毒的序列。真菌植物病原体的实例包括例如导致白粉病、锈病、叶斑病和枯萎病、立枯病、根腐病、冠腐病、棉铃红腐病、茎干溃烂、小枝溃烂、维管枯萎、黑穗病或发霉的真菌，包括但不限于镰刀菌属物种(Fusarium spp.)、层锈菌属物种(Phakospora spp.)、丝核菌属物种(Rhizoctonia spp.)、曲霉属物种(Aspergillus spp.)、赤霉属物种(Gibberella spp.)、梨孢属物种(Pyricularia spp.)和链格孢属物种(Alternaria spp.)，以及以引用的方式整体明确并入本文的美国专利6,194,636的表4和5中提供的众多真菌物种。植物病原体的实例包括先前分类为真菌，但更新近分类为卵菌的病原体。特别关注的卵菌植物病原体的特定实例包括腐霉属(Pythium)的成员(例如瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum))和疫霉属(Phytophthora)的成员(例如致病疫霉(Phytophthora infestans)、大豆疫霉(Phytophthora sojae))以及导致霜霉病的生物体(例如粉霜霉(Peronosporafarinosa))。
在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法适用于使一个或多个必需番茄斑萎病毒基因沉默，由此治疗或预防番茄斑萎病毒感染。若干实施方案涉及使处理的植物对番茄斑萎病毒感染的抗性改进。若干实施方案涉及使植物中对番茄斑萎病毒感染的抗性改进的方法，其包括：向所述植物局部施加如本文所述的包含双链RNA多核苷酸的组合物，所述多核苷酸包含与必需番茄斑萎病毒基因的全部或一部分互补的序列。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法适用于使选自由以下组成的组的番茄斑萎病毒的一个或多个必需基因沉默：菜豆坏死花叶病毒、辣椒褪绿病毒、落花生芽坏死病毒、落花生环斑病毒、落花生黄斑病毒、风仙花坏死斑病毒、鸢尾黄斑病毒、甜瓜黄斑病毒、花生芽坏死病毒、花生黄斑病毒、大豆叶脉坏死相关病毒、番茄褪绿斑病毒、番茄坏死环斑病毒、番茄斑枯病毒、番茄环纹斑病毒、西瓜芽坏死病毒、西瓜银斑病毒和绿皮西葫芦致死褪绿病毒。在一些实施方案中，本文提供的多核苷酸触发剂靶向一个或多个选自由以下组成的组的必需番茄斑萎病毒基因：核衣壳基因(N)、外壳蛋白基因(CP)、毒性因子NSm和NSs、以及RNA依赖性RNA聚合酶L区段(RdRp/L区段)。
在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法适用于使一个或多个必需双生病毒基因沉默，由此治疗或预防双生病毒感染。若干实施方案涉及使处理的植物对双生病毒感染的抗性改进。若干实施方案涉及使植物中对双生病毒感染的抗性改进的方法，其包括：向所述植物局部施加如本文所述的包含双链RNA多核苷酸的组合物，所述多核苷酸包含与必需双生病毒基因的全部或一部分互补的序列。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法适用于使选自由以下组成的组的双生病毒的一个或多个必需基因沉默：大麦黄矮病毒、黄瓜花叶病毒、茄瓜花叶病毒、棉花卷叶病毒、番茄黄色卷叶病毒、番茄金色花叶病毒、马铃薯黄色花叶病毒、胡椒卷叶病毒、菜豆金色花叶病毒、菜豆金色花叶病毒、番茄斑驳病毒。在一些实施方案中，本文提供的多核苷酸触发剂靶向一个或多个选自由以下组成的组的必需双生病毒基因：核衣壳基因(N)、外壳蛋白基因(CP)、毒性因子NSm和NSs、以及RNA依赖性RNA聚合酶L区段(RdRp/L区段)、沉默抑制基因、移动蛋白(MP)、Nia、CP-N、三重基因区块、CP-P3、MP-P4、C2和AC2。
在一些实施方案中，触发多核苷酸是DNA、RNA或DNA/RNA杂交体。在一些实施方案中，触发多核苷酸是单链或双链。在一些实施方案中，触发多核苷酸的长度是10至约5000个核苷酸(nt)。在一些实施方案中，触发多核苷酸的长度是15至约5000个核苷酸(nt)。在一些实施方案中，触发多核苷酸的长度是10至约1500个核苷酸(nt)。在一些实施方案中，触发多核苷酸的长度是15至1500个核苷酸(nt)。在一些实施方案中，触发多核苷酸的长度是约20至约100、约75至约150、约100至约200、约150至约300、约200至约400、约300至约500、约400至约600、约500至约700、约600至约800、约700至1000、约900至约1200、约1000至约1500、约1200至约2000、约1500至约2500、约2000至约3000、约2500至约3500、约3000至约4000、约3500至约4500、或约4000至约5000nt。在一些实施方案中，触发多核苷酸的长度是约20、约30、约40、约50、约60、约80、约100、约120、约140、约150、约160、约180、约200、约220、约224、约260、约280、约300、约320、约340、约360、约380、约400、约420、约440、约460、约480、约500、约550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950、约1000、约1100、约1200、约1300、约1400、约1500、约2000、约2500、约3000、约3500、约4000、约4500或约5000nt。
在一个方面，触发多核苷酸包含至少一个具有18个或更多个连续核苷酸的区段，其具有与靶标基因的DNA的等效长度的片段具有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％或约95％至约100％同一性的序列。在一些实施方案中，连续核苷酸数目是至少16，例如16至24、或16至25、或16至26、或16至27、或16至28。在一些实施方案中，连续核苷酸数目是至少18，例如18至24、或18至28、或20至30、或20至50、或20至100、或50至100、或50至500、或100至250、或100至500、或200至1000、或500至2000或甚至更大。在一些实施方案中，连续核苷酸数目超过16，例如是17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或大于30，例如约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约210、约220、约230、约240、约250、约260、约270、约280、约290、约300、约350、约400、约450、约500、约600、约700、约800、约900、约1000个或大于1000个连续核苷酸。在一些实施方案中，触发多核苷酸包含至少一个具有至少21个连续核苷酸的区段，其具有与靶标基因的DNA的等效长度的片段具有100％同一性的序列。在一些实施方案中，触发多核苷酸是双链核酸(例如dsRNA)，其中一个链包含至少一个具有至少21个连续核苷酸的与靶标基因的DNA的等效长度的片段具有100％同一性的区段；以碱基对加以表示，这种双链核酸包含至少一个具有对应于靶标基因的DNA的等效长度的片段或其DNA互补序列的至少21个连续完全匹配碱基对的区段。在一些实施方案中，触发多核苷酸中含有的各区段具有的长度大于为天然存在的调控小RNA所特有的长度，例如各区段的长度是至少约30个连续核苷酸(或碱基对)。在一些实施方案中，触发多核苷酸的总长度在约50至约5000个核苷酸(对于单链多核苷酸)或碱基对(对于双链多核苷酸)之间。在一些实施方案中，触发多核苷酸是在约50至约5000个碱基对之间的dsRNA。在一些实施方案中，向植物的表面局部提供多核苷酸。
可在本文所述的各种方法和组合物中单独或组合使用任何尺寸的有效触发多核苷酸。在一些实施方案中，单一多核苷酸触发剂用于制备组合物(例如供局部施加的组合物或适用于制备转基因植物的重组DNA构建体)。在其它实施方案中，使用不同多核苷酸触发剂的混合物或汇合物；在所述情况下，多核苷酸触发剂可针对单个靶标基因或针对多个靶标基因。
应了解本公开的触发多核苷酸例如dsRNA无需限于仅含有天然核苷酸的那些分子，而是进一步涵盖经化学修饰核苷酸和非核苷酸。本公开的触发多核苷酸试剂也可包括碱基修饰或取代。如本文所用，“未修饰”或“天然”碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰碱基包括但不限于其它合成和天然碱基，诸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物；腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物；2-硫代尿嘧啶；2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶；5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶；6-偶氮基尿嘧啶；6-偶氮基胞嘧啶和6-偶氮基胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫代尿嘧啶；8-卤代基、8-氨基、8-硫醇、8-烷基硫基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤；5-卤代基(特别是5-溴基)、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤；8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤；7-去氮杂鸟嘌呤和7-去氮杂腺嘌呤以及3-去氮杂鸟嘌呤和3-去氮杂腺嘌呤。其它碱基包括美国专利号3,687,808中公开的那些、TheConcise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering,第858-859页,Kroschwitz,J.I.编John Wiley&Sons,1990中公开的那些、由Englisch等,AngewandteChemie,国际版,1991,613公开的那些以及由Sanghvi,Y.S.,第15章,Antisense Researchand Applications,第289-2页,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编,CRC Press,1993公开的那些。所述碱基特别适用于增加本公开的寡聚化合物的结合亲和力。这些碱基包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已显示使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2等(1993)Antisense Research and Applications,CRC Press,Boca Raton276-278)，并且是目前优选碱基取代，甚至更特定来说在与2’-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。
用于体外和体内表达RNA以达成大规模生产的方法在本领域中是已知的。举例来说，用于使dsRNA的产生得以改进的方法公开于WO 2014/151581中。
在合成或产生之后，可任选纯化触发多核苷酸。举例来说，可通过用溶剂或树脂提取、沉淀、电泳、色谱法或其组合来从混合物纯化多核苷酸。或者，触发多核苷酸可在不纯化或最小程度纯化下使用以避免归因于样品处理的损失。可使触发多核苷酸干燥以进行储存，或溶解于水溶液中。溶液可含有缓冲剂或盐以促进退火和/或双链体链的稳定化。
递送位点特异性酶
本公开中的方法和组合物可用于将编码位点特异性酶的多核苷酸从植物或植物部分的外表面递送至植物细胞的内部中。如本文所用，术语“位点特异性酶”是指可以位点特异性方式裂解核苷酸序列的任何酶。在一方面，本文提供的位点特异性酶选自由以下组成的组：核酸内切酶(在不加限制下，例如兆碱基大范围核酸酶(meganuclease)、锌指核酸酶(ZFN)、转录活化子样效应物核酸酶(TALEN)、RNA引导的核酸酶(在不加限制下，例如成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)Cas9核酸酶或Cpf1核酸酶)和DNA引导的核酸酶(在不加限制下，例如格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)Argonaute(NgAgo)，即结合单链引导DNA以产生位点特异性DNA双链断裂的原核Argonaute))；重组酶(在不加限制下，例如连接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶、连接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶)；转座酶(在不加限制下，例如连接于DNA结合结构域的DNA转座酶)；或其任何组合。在一些实施方案中，编码位点特异性酶的多核苷酸包含完整聚合酶II转录单元，并且是可转录的。在一些实施方案中，编码位点特异性酶的多核苷酸是mRNA。在一方面，本文提供的多核苷酸可包含编码锌指核酸酶的核酸序列。在一方面，本文提供的多核苷酸可包含编码转录活化子样效应物核酸酶(TALEN)的核酸序列。在一方面，本文提供的多核苷酸可包含编码兆碱基大范围核酸酶的核酸序列。在一方面，本文提供的多核苷酸可包含编码CRISPR系统的一个或多个元件的核酸序列。在一些实施方案中，CRISPR系统是1型CRISPR系统。在一些实施方案中，CRISPR系统是2型CRISPR系统。在一方面，本文提供的多核苷酸可包含编码RNA引导的Cas9核酸酶、RNA引导的Cpf1核酸酶、RNA引导的Csc1核酸酶或RNA引导的Csc2核酸酶以及为靶向相应核酸酶所必需的引导RNA的核酸序列。在一方面，本文提供的多核苷酸可包含编码Cascade(RNA引导的核酸酶)的一个或多个元件的核酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸编码RNA引导的核酸酶的一个或多个RNA组分。在一些实施方案中，多核苷酸编码引导序列、tracr配偶序列和tracr序列中的一者或多者。在一些实施方案中，多核苷酸编码连接于tracr配偶序列的引导序列。在一个方面，本文提供的多核苷酸包含编码NgAgo-gDNA系统的一个或多个元件的核酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸编码原核Argonaute。在一些实施方案中，原核Argonaute来自格氏嗜盐碱杆菌(NgAgo)、嗜热栖热菌(Thermus thermophiles)(TtAgo)或激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)(PfAgo)。参见例如Gao等,Nat.Biotechnol.,2016年5月2日,在线发表；Swarts等,Nature,2014,507(7491):258-61；以及Swarts等,Nucleic Acid Res.,2015,43(10):5120-5129。在一些实施方案中，原核Argonaute使用5'磷酸化引导DNA来对序列进行靶向，例如本领域中已知的NgAgo、TtAgo和PfAgo。在一些实施方案中，原核Argonaute使用5'羟基化引导RNA来对序列进行靶向，例如本领域中已知的嗜压海袍菌(Marinitoga piezophila)Argonaute(MpAgo)。例如Kaya等,Proc.Natl.Acad.Sci.,2016年3月30日,在线发表。在一些实施方案中，多核苷酸编码由原核Argonaute使用的引导序列。
一般来说，术语“CRISPR系统”总体指代表达CRISPR相关(“Cas”)基因或引导所述基因的活性中涉及的转录物和其它元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(转录活化CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr配偶序列(在内源性CRISPR系统的情形下涵盖“同向重复序列”和tracrRNA加工的部分同向重复序列)、引导序列(在内源性CRISPR系统的情形下也被称为“间隔体”)或如那个术语在本文中所用的“RNA”(例如用以引导Cas9的RNA，例如CRISPR RNA和转录活化(tracr)RNA或单一引导RNA(sgRNA)(嵌合RNA))或来自CRISPR基因座的其它序列和转录物。一般来说，CRISPR系统的特征在于具有促进在靶标序列的位点(在内源性CRISPR系统的情形下也被称为原间隔体)处形成CRISPR复合物的元件。在形成CRISPR复合物的情形下，“靶标序列”是指引导序列被设计以与其具有互补性的序列，其中在靶标序列与引导序列之间的杂交促进形成CRISPR复合物。CRISPR系统的实例以及它们的使用描述于WO 2014/093622(PCT/US2013/074667)、WO 2013/141680、WO2013/142578、WO 2013/098244和WO 2013/176772中。
与Cas9类似，来自Argonaute蛋白家族的核酸内切酶也使用寡核苷酸作为用以降解侵袭性基因组的向导。举例来说，发现格氏嗜盐碱杆菌Argonaute(NgAgo)是DNA引导的适于进行基因组编辑的核酸内切酶。NgAgo结合具有约24个核苷酸的5'磷酸化单链引导DNA(gDNA)，在装载有gDNA时高效产生位点特异性DNA双链断裂。NgAgo-gDNA系统不如同Cas9那样需要原间隔体邻近基序(PAM)，并且已表明它具有对向导-靶标错配的低耐受性以及在编辑富含(G+C)的基因组靶标方面的高效率。Gao等,Nat.Biotechnol.,2016年5月2日。
在一些实施方案中，CRISPR相关核酸酶(例如Cas9、Cpf1、Csc1、Csc2、Cascade)可组成性存在于植物部分中，并且本文所述的组合物和方法可用于将CRISPR系统的一个或多个RNA组分从植物或植物部分的外表面递送至植物细胞的内部中。在一些实施方案中，可在引导RNA、tracr配偶RNA、tracr RNA和连接于tracr配偶RNA的引导RNA中的一者或多者之前递送CRISPR酶mRNA以给与CRISPR酶进行表达的时间。在一些实施方案中，可在施用引导RNA、tracr配偶RNA、tracr RNA和连接于tracr配偶RNA的引导RNA中的一者或多者之前1-12小时(优选约2-6小时)施用CRISPR酶mRNA。或者，可将CRISPR酶mRNA与引导RNA、tracr配偶RNA、tracr RNA和连接于tracr配偶RNA的引导RNA中的一者或多者一起施用。在一些实施方案中，可在初始施用CRISPR酶mRNA+引导RNA、tracr配偶RNA、tracr RNA和连接于tracr配偶RNA的引导RNA中的一者或多者之后1-12小时(优选约2-6小时)施用第二加强剂量的引导RNA、tracr配偶RNA、tracr RNA和连接于tracr配偶RNA的引导RNA中的一者或多者。根据本文所述的组合物和方法来额外施用CRISPR酶mRNA和/或引导RNA、tracr配偶RNA、tracr RNA和连接于tracr配偶RNA的引导RNA中的一者或多者可适用于实现最高效水平的基因组修饰。
在一些实施方案中，本公开中的方法和组合物可用于将位点特异性酶从植物或植物部分的外表面递送至植物细胞的内部中。在一些实施方案中，本公开中的方法和组合物可用于将CRISPR酶从植物或植物部分的外表面递送至植物细胞的内部中。在一些实施方案中，使CRISPR酶与CRISPR系统的一个或多个RNA组分复合。在一些实施方案中，使CRISPR酶与引导RNA、tracr配偶RNA、tracr RNA和连接于tracr配偶RNA的引导RNA中的一者或多者复合。在一些实施方案中，CRISPR酶选自由Cas9、Cpf1、Csc1、Csc2和Cascade组成的组。在一些实施方案中，本公开中的方法和组合物可用于将原核Argonaute从植物或植物部分的外表面递送至植物细胞的内部中。在一些实施方案中，使原核Argonaute与引导DNA或引导RNA复合。在一些实施方案中，原核Argonaute是格氏嗜盐碱杆菌Argonaute(NgAgo)。
用于递送多核苷酸的组合物和方法
本公开提供一种用于将多核苷酸从植物或植物部分的外表面递送至植物细胞的内部中的组合物，其包含至少一种多核苷酸和至少一种能够破坏所述植物或植物部分的至少一个屏障的试剂。
本公开也提供一种用于将多核苷酸从植物或植物部分的外表面递送至植物细胞的内部中的方法，其包括向所述植物的所述外表面施加至少一种多核苷酸和至少一种能够破坏所述植物或植物部分的至少一个屏障的试剂。
在一些实施方案中，试剂选自一种或多种酶、一种或多种磨蚀剂及其任何组合。在一个实施方案中，试剂包括至少一种酶。在另一实施方案中，试剂包括至少一种磨蚀剂。在另一实施方案中，试剂包括至少一种酶和至少一种磨蚀剂。在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种渗透调节物质、一种或多种表面活性剂或其任何组合。在一些实施方案中，方法还包括施加一种或多种渗透调节物质、一种或多种表面活性剂或其任何组合。
本公开也提供一种用于将多核苷酸从植物或植物部分的外表面递送至植物细胞的内部中的组合物，其包含至少一种多核苷酸、一种或多种渗透调节物质和一种或多种表面活性剂。在一些实施方案中，组合物还包含至少一种能够破坏植物或植物部分的至少一个屏障的试剂。在一些实施方案中，至少一种试剂选自一种或多种酶、一种或多种磨蚀剂及其任何组合。
本公开也提供一种用于将多核苷酸从植物或植物部分的外表面递送至植物细胞的内部中的方法，其包括a)将至少一种能够破坏所述植物或植物部分的至少一个屏障的试剂施加于所述植物或植物部分的表面上，以及b)将一种或多种多核苷酸施加于所述植物或植物部分的表面上，其中步骤a)和b)同时或以任何顺序依序进行。在一些实施方案中，至少一种试剂选自一种或多种酶、一种或多种磨蚀剂及其任何组合。在一些实施方案中，方法还包括将一种或多种渗透调节物质、一种或多种表面活性剂或两者施加于植物或植物部分的表面上，其中多核苷酸、磨蚀剂、酶、渗透调节物质和表面活性剂同时或以任何顺序依序施加，并且以其任何组合加以分组。
本公开也提供一种用于将多核苷酸从植物或植物部分的外表面递送至植物细胞的内部中的方法，其包括将一种或多种多核苷酸、一种或多种渗透调节物质和一种或多种表面活性剂施加于所述植物或植物部分的表面上，其中所述多核苷酸、所述渗透调节物质和所述表面活性剂同时或以任何顺序依序施加，并且以其任何组合加以分组。
本公开进一步提供一种适合于局部施加于杂草或自生植物的外表面上的除草组合物，所述组合物包含：至少一种非可转录多核苷酸和至少一种能够破坏所述杂草或自生植物的至少一个屏障的试剂，其中所述至少一种非可转录多核苷酸包含与所述杂草或自生植物的内源性基因的编码或非编码序列或从所述杂草或自生植物的内源性基因转录的信使RNA基本上同一或基本上互补的序列；并且其中所述内源性基因：(i)是用于维持所述杂草或自生植物的生长或生命的必需基因，(ii)编码对所述杂草或自生植物提供除草剂抗性的蛋白质，或(iii)转录成RNA调控剂。在一些实施方案中，试剂选自至少一种酶、至少一种磨蚀剂及其任何组合。在一些实施方案中，组合物还包含至少一种渗透调节物质、至少一种表面活性剂或其任何组合。
本公开进一步提供一种用于选择性控制靶向的除草剂抗性杂草或自生植物的方法，其包括将至少一种非可转录多核苷酸和至少一种能够破坏所述杂草或自生植物的至少一个屏障的试剂局部施加于所述杂草或自生植物的表面上；其中所述至少一种非可转录多核苷酸包含与所述杂草或自生植物的内源性基因的编码或非编码序列或从所述杂草或自生植物的内源性基因转录的信使RNA基本上同一或基本上互补的序列；并且其中所述内源性基因：(i)是用于维持所述杂草或自生植物的生长或生命的必需基因，(ii)编码对所述杂草或自生植物提供除草剂抗性的蛋白质，或(iii)转录成RNA调控剂。在一些实施方案中，试剂选自至少一种酶、至少一种磨蚀剂及其任何组合。在一些实施方案中，方法还包括施加至少一种渗透调节物质、至少一种表面活性剂或其任何组合。
在一个方面，本公开也提供一种用于将多核苷酸从植物或植物部分的外表面递送至植物细胞的内部中的组合物，其包含至少一种非可转录多核苷酸和至少一种渗透调节物质或至少一种表面活性剂。在一些实施方案中，组合物还包含至少一种能够破坏植物或植物部分的至少一个屏障的试剂。在其它实施方案中，组合物不包含能够破坏植物或植物部分的至少一个屏障的试剂。在一些实施方案中，组合物包含至少一种渗透调节物质与至少一种表面活性剂两者，具有或不具有至少一种能够破坏植物或植物部分的至少一个屏障的试剂。在一些实施方案中，试剂选自至少一种酶、至少一种磨蚀剂及其任何组合。
在另一方面，本公开也提供一种用于将多核苷酸从植物或植物部分的外表面递送至植物细胞的内部中的方法，其包括向所述植物的所述外表面施加至少一种多核苷酸和至少一种渗透调节物质或至少一种表面活性剂。在一些实施方案中，将至少一种渗透调节物质或至少一种表面活性剂与至少一种多核苷酸于相同组合物中施加。在其它实施方案中，将至少一种渗透调节物质或至少一种表面活性剂与至少一种多核苷酸于不同组合物中施加。在一些实施方案中，将至少一种渗透调节物质和至少一种表面活性剂于相同组合物中施加。在其它实施方案中，将至少一种渗透调节物质和至少一种表面活性剂于不同组合物中施加。在一些实施方案中，组合物也包含至少一种能够破坏植物或植物部分的至少一个屏障的试剂。在其它实施方案中，组合物不包含能够破坏植物或植物部分的至少一个屏障的试剂。在一些实施方案中，试剂选自至少一种酶、至少一种磨蚀剂及其任何组合。
在一些实施方案中，多核苷酸是双链RNA、单链RNA、双链DNA、单链DNA或双链DNA/RNA杂交体。在一些实施方案中，多核苷酸是非可转录多核苷酸。在一些实施方案中，非可转录多核苷酸是dsRNA。在一些实施方案中，非可转录多核苷酸包含与靶标基因或其转录mRNA的至少18个连续核苷酸基本上同一或基本上互补的序列。在一些实施方案中，非可转录多核苷酸抑制靶标基因的表达。在一些实施方案中，非可转录多核苷酸是微小RNA(miRNA)、miRNA诱饵、miRNA前体或反式作用性RNA(ta-siRNA)。
靶标基因可为编码序列、非编码序列或两者。在一些实施方案中，靶标基因选自(a)内源性植物基因，(b)转基因植物的转基因，和(c)植物病原体的内源性基因。在一些实施方案中，靶标基因a)是用于维持植物的生长和生命的必需基因；b)编码对植物提供除草剂抗性的蛋白质；或c)转录成RNA调控剂。在一些实施方案中，靶标基因对于将引入触发多核苷酸的植物是外源性的，但对于植物病原体是内源性的。在一些实施方案中，靶标基因是植物病原体的必需基因。在一些实施方案中，靶标基因是病毒基因。
在某些实施方案中，植物选自：苜蓿、小茴香、苹果、杏、洋蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、黑莓、蓝莓、西兰花、抱子甘蓝(brussel sprout)、卷心菜、加拿大油菜、棱瓜(cantaloupe)、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、樱桃、芜荽、柑桔、克莱门氏小柑橘(clementine)、咖啡豆、玉米、棉花、黄瓜、花旗松(Douglas fir)、茄子、菊苣(endive)、苦苣(escarole)、桉树、茴香、无花果、葫芦、葡萄、葡萄柚、蜜瓜、豆薯、猕猴桃、莴苣、韭菜、柠檬、酸橙、火炬松(Loblolly pine)、芒果、甜瓜、蘑菇、坚果、燕麦、秋葵、洋葱、橙、观赏植物、番木瓜、欧芹、豌豆、桃子、花生、梨、胡椒、柿子、松树、菠萝、车前草、李子、石榴、白杨、马铃薯、南瓜、榅桲、辐射松、红菊苣、萝卜、树莓、稻、黑麦、高粱、南方松(Southern pine)、大豆、菠菜、南瓜小果、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、甜薯、枫香、红桔、茶树、烟草、番茄、草皮、藤、西瓜、小麦、山药和绿皮西葫芦植物。
在某些实施方案中，植物是杂草植物。杂草植物是与栽培植物竞争的植物，特别重要的那些包括但不限于作物生产中的重要侵袭性和有害性杂草以及除草剂抗性生物类型，诸如苋属物种(Amaranthus species)-白苋(A.albus)、北美苋(A.blitoides)、绿穗苋(A.hybridus)、长芒苋(A.palmeri)、鲍威氏苋(A.powellii)、反枝苋(A.retroflexus)、刺苋(A.spinosus)、糙果苋(A.tuberculatus)和皱果苋(A.viridis)；豚草属物种(Ambrosiaspecies)-三裂叶豚草(A.trifida)、美洲豚草(A.artemisifolia)；黑麦草属物种(Loliumspecies)-多花黑麦草(L.multiflorum)、硬直黑麦草(L.rigidium)、多年生黑麦草(Lperenne)；马唐属物种(Digitaria species)-两耳草(D.insularis)；大戟属物种(Euphorbia species)-白苞猩猩草(E.heterophylla)；地肤属物种(Kochia species)-扫帚草(K.scoparia)；高粱属物种(Sorghum species)-假高粱(S.halepense)；白酒草属物种(Conyza species)-香丝草(C.bonariensis)、加拿大蓬(C.canadensis)、苏门白酒草(C.sumatrensis)；虎尾草属物种(Chloris species)-截头虎尾草(C.truncate)；稗属物种(Echinochola species)-光头稗(E.colona)、大骨草(E.crus-galli)；穇属物种(Eleusinespecies)-牛筋草(E.indica)；早熟禾属物种(Poa species)-一年生早熟禾(P.annua)；车前属物种(Plantago species)-长叶车前草(P.lanceolata)；燕麦属物种(Avenaspecies)-野燕麦(A.fatua)；藜属物种(Chenopodium species)-灰藜(C.album)；狗尾草属物种(Setaria species)–狗尾草(S.viridis)；苘麻(A.theophrasti)；番薯属物种(Ipomoea species)；田菁属物种(Sesbania species)；山扁豆属物种(Cassia species)；黄花稔属物种(Sida species)；臂形草属物种(Brachiaria species)和茄属物种(Solanumspecies)。
见于栽培区域中的额外杂草植物物种包括大穗看麦娘(Alopecurusmyosuroides)、不实野燕麦(Avena sterilis)、长颖燕麦(Avena sterilis ludoviciana)、车前臂形草(Brachiaria plantaginea)、双雄雀麦(Bromus diandrus)、硬雀麦(Bromusrigidus)、洋狗尾草(Cynosurus echinatus)、升马唐(Digitaria ciliaris)、止血马唐(Digitaria ischaemum)、马唐(Digitaria sanguinalis)、稻稗(Echinochloaoryzicola)、水稗(Echinochloa phyllopogon)、路易斯安纳野黍(Eriochloa punctata)、大麦草(Hordeum glaucum)、墙大麦(Hordeum leporinum)、田间鸭嘴草(Ischaemumrugosum)、千金子(Leptochloa chinensis)、欧黑麦草(Lolium persicum)、小虉草(Phalaris minor)、变形虉草(Phalaris paradoxa)、筒轴茅(Rottboellia exalta)、大狗尾草(Setaria faberi)、巨狗尾草(Setaria viridis var,robusta-alba schreiber)、狗尾草变种(Setaria viridis var,robusta-purpurea)、Snowdenia polystachea、苏丹高粱(Sorghum sudanese)、泽泻(Alisma plantago-aquatica)、凹头苋(Amaranthus lividus)、青苋(Amaranthus quitensis)、耳基水苋(Ammania auriculata)、红花水苋(Ammaniacoccinea)、臭春黄菊(Anthemis cotula)、阿披拉草(Apera spica-venti)、圆叶虎耳(Bacopa rotundifolia)、三叶鬼针草(Bidens pilosa)、Bidens subaltemans、非洲芥末(Brassica tournefortii)、旱雀麦(Bromus tectorum)、小果亚麻荠(Camelinamicrocarpa)、茼蒿(Chrysanthemum coronarium)、田野菟丝子(Cuscuta campestris)、异型莎草(Cyperus difformis)、Damasonium minus、播娘嵩(Descurainia sophia)、细叶二行芥(Diplotaxis tenuifolia)、车前叶蓝蓟(Echium plantagineum)、三蕊沟繁缕(Elatine triandra var,pedicellata)、白苞猩猩草(Euphorbia heterophylla)、卷茎蓼(Fallopia convolvulus)、水虱草(Fimbristylis miliacea)、鼬瓣花(Galeopsistetrahit)、锯锯藤(Galium spurium)、向日葵(Helianthus annuus)、假苍耳(Ivaxanthifolia)、单刚毛狗尾草(Ixophorus unisetus)、变色牵牛(Ipomoea indica)、圆叶牵牛(Ipomoea purpurea)、毛茎薯(Ipomoea sepiaria)、蕹菜(Ipomoea aquatic)、三裂叶薯(Ipomoea triloba)、毒莴苣(Lactuca serriola)、黄花绒叶草(Limnocharis flava)、直立石龙尾(Limnophila erecta)、无柄花石龙尾(Limnophila sessiliflora)、美洲母草(Lindernia dubia)、美洲母草主变种(Lindernia dubia var,major)、狭叶母草(Lindernia micrantha)、陌上草(Lindernia procumbens)、冰叶日中花(Mesembryanthemum crystallinum)、雨久花(Monochoria korsakowii)、鸭舌草(Monochoria vaginalis)、球果芥(Neslia paniculata)、虞美人(Papaver rhoeas)、银胶菊(Parthenium hysterophorus)、Pentzia suffruticosa、小虉草、野萝卜(Raphanusraphanistrum)、秋冬萝卜(Raphanus sativus)、皱果荠(Rapistrum rugosum)、印度节节菜原变种(Rotala indica var,uliginosa)、冠果草(Sagittaria guyanensis)、蒙特登慈姑(Sagittaria montevidensis)、矮慈姑(Sagittaria pygmaea)、俄国大蓟(Salsolaiberica)、萤蔺欧万斯变种(Scirpus juncoides var,ohwianus)、北水毛花(Scirpusmucronatus)、金色狗尾草(Setaria lutescens)、刺金午时花(Sida spinosa)、野芥(Sinapis arvensis)、戟叶播娘蒿(Sisymbrium orientale)、大蒜芥(Sisymbriumthellungii)、东方龙葵(Solanum ptycanthum)、花叶滇苦菜(Sonchus asper)、苦苣菜(Sonchus oleraceus)、甜高粱(Sorghum bicolor)、繁缕(Stellaria media)、菥蓂(Thlaspi arvense)、苍耳(Xanthium strumarium)、南非金盏草(Arctotheca calendula)、苏门白酒草(Conyza sumatrensis)、革命菜(Crassocephalum crepidiodes)、萼距花(Cuphea carthagenenis)、Epilobium adenocaulon、费城飞莲(Erigeronphiladelphicus)、少根紫萍(Landoltia punctata)、北美独行菜(Lepidium virginicum)、雨久花、少花龙葵(Solanum americanum)、龙葵(Solanum nigrum)、欧洲福克斯泰尔羊茅(Vulpia bromoides)、黄鹤菜(Youngia japonica)、下轮叶黑藻(Hydrillaverticillata)、垂花飞廉(Carduus nutans)、意大利蓟(Carduus pycnocephalus)、黄星蓟(Centaurea solstitialis)、丝路蓟(Cirsium arvense)、节节草(Commelina diffusa)、田旋花(Convolvulus arvensis)、野胡萝卜(Daucus carota)、止血马唐、孔雀稗(Echinochloacrus-pavonis)、水虱草、鼬瓣花、锯锯藤、直立石龙尾、淡甘菊(Matricaria perforate)、虞美人、乌头叶毛茛(Ranunculus acris)、翅果假吐金菊(Soliva sessilis)、尖瓣花(Sphenoclea zeylanica)、繁缕、三叉针茅(Nassella trichotoma)、智利针草(Stipaneesiana)、匍匍翦股颖(Agrostis stolonifera)、萹蓄(Polygonum aviculare)、日本看麦娘(Alopecurus japonicus)、菵草(Beckmannia syzigachne)、旱雀麦、孟仁草(Chlorisinflate)、Echinochloa erecta、马齿苋(Portulaca oleracea)和欧洲千里光(Seneciovulgaris)。
在某些实施方案中，植物病原体是病毒、类病毒、细菌、真菌、卵菌、原生动物、植原体或寄生植物。
在某些实施方案中，植物部分是叶、茎干、花、根或果实。在某些实施方案中，植物细胞是表皮细胞。在其它实施方案中，植物细胞不是表皮细胞。在一些实施方案中，植物细胞是叶肉细胞、栅栏细胞、实质细胞、厚角细胞、厚壁组织细胞、分生细胞、维管组织中的细胞、基本组织中的细胞、木质组织中的细胞或储存器官中的细胞。
在一些实施方案中，植物细胞的屏障是植物或植物部分的角质层。在一些实施方案中，植物细胞的屏障是植物或植物部分的上表皮蜡层。在一些实施方案中，植物细胞的屏障是植物细胞的细胞壁。在一些实施方案中，植物细胞的屏障是植物细胞的质膜。
在一些实施方案中，酶是角质层或蜡水解酶。在一些实施方案中，酶使植物细胞壁的至少一种组成分子分解。在一些实施方案中，酶使植物质膜的至少一种组成分子分解。在一些实施方案中，植物细胞壁或植物质膜的组成分子是碳水化合物、脂质、蛋白质或其任何组合。在一些实施方案中，植物细胞壁的组成分子选自纤维素、半纤维素、果胶或其任何组合。在一些实施方案中，植物质膜的组成分子是磷脂。
在一些实施方案中，酶是水解酶。在一些实施方案中，酶是酯酶。在一些实施方案中，酶是脂酶、角质酶或其任何组合。在一些实施方案中，脂酶选自由以下组成的组：来自米根霉的脂酶、来自黑曲霉的Amano脂酶A、来自爪哇毛霉的Amano脂酶M、来自沙门柏干酪青霉的Amano脂酶G、来自皱褶念珠菌的脂酶、来自雪白根霉的脂酶、来自米赫毛霉的脂酶及其任何组合。在一些实施方案中，酶是纤维素、半纤维素、果胶酶或其任何组合。在一些实施方案中，酶是纤维素、半纤维素、果胶酶、角质酶、脂酶或其任何组合。在一个实施方案中，酶是还包含选自纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶或其任何组合的另一酶的组合物中的脂酶。在另一实施方案中，酶是还包含表面活性剂的组合物中的脂酶。在一些实施方案中，表面活性剂是生物表面活性剂。
在一些实施方案中，磨蚀剂是矿物质磨蚀剂、金属磨蚀剂、合成磨蚀剂和有机磨蚀剂。在一些实施方案中，磨蚀剂选自由以下组成的组：氧化铝、碳化硅、二氧化硅、钠钙玻璃、硅藻土(硅藻土(diatomaceous earth))、燧石、石英、石榴石、二氧化硅、浮石、砂、长石、方解石、钢、钨、陶瓷、碳化硼和碳化钨。
在一些实施方案中，本文公开的颗粒具有约2.5微米至约50微米的平均尺寸范围。在一些实施方案中，本文公开的颗粒具有约2.5至约10、约2.5至约20、约2.5至约30、约2.5至约40、约5至约10、约5至约20、约5至约30、约5至约40、约5至约50、约10至约20、约10至约30、约10至约40、约10至约50、约20至约30、约20至约40、约20至约50、约30至约40、约30至约50、或约40至约50微米的平均尺寸范围。在一些实施方案中，本文公开的颗粒具有约2.5、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45或约50微米的平均尺寸。
在一些实施方案中，本文公开的磨蚀剂包含离散粒子。在其它实施方案中，磨蚀剂由基体负载，附着于基体，或包埋在基体中。在一些实施方案中，基体包括纤维、多孔、非多孔或粘性载体。在一些实施方案中，使磨蚀剂和基体键合在一起。在其它实施方案中，不使磨蚀剂和基体结合。在一些实施方案中，负载磨蚀剂的基体是砂纸。
在一些实施方案中，本文公开的组合物是液体、固体、粉末、溶液、乳液或混悬液。在一些实施方案中，以喷雾剂施加组合物。在一些实施方案中，通过气刷来施加喷雾剂。在一些实施方案中，通过压缩气体喷雾器来施加喷雾剂。在其它实施方案中，通过罐式喷雾器、履带式喷雾器或喷管式喷雾器来施加喷雾剂。
在一些实施方案中，多核苷酸作为细胞溶解产物的一部分被提供。在一些实施方案中，细胞溶解产物是细菌溶解产物。
在一些实施方案中，酶作为细胞溶解产物或细胞培养液的一部分被提供。在一些实施方案中，细胞溶解产物是细菌溶解产物或真菌溶解产物。
在一些实施方案中，在以组合物形式提供之前对酶进行透析。
在一些实施方案中，多核苷酸呈液体组合物形式。在其它实施方案中，多核苷酸呈粉末组合物形式。在一些实施方案中，酶呈液体组合物形式。在其它实施方案中，酶呈粉末组合物形式。在一些实施方案中，磨蚀剂以液体组合物形式提供。在其它实施方案中，磨蚀剂以粉末组合物形式提供。在其它实施方案中，向植物或植物部分提供的磨蚀剂在固定基底上。在一些实施方案中，将至少一种多核苷酸和至少一种酶于相同组合物中施加于植物或植物部分的外表面。在其它实施方案中，将至少一种多核苷酸和至少一种酶于不同组合物中施加于植物或植物部分的外表面。在一些实施方案中，将至少一种多核苷酸和至少一种酶同时施加于植物或植物部分的外表面。在其它实施方案中，将至少一种多核苷酸和至少一种酶分开施加于植物或植物部分的外表面。
在一些实施方案中，多核苷酸在组合物中的浓度是约0.005μg/μl至约10μg/μl。在一些实施方案中，多核苷酸在组合物中的浓度是约0.01至约10μg/μl、约0.05至约10μg/μl、约0.1至约10μg/μl、约0.5至约10μg/μl、约1至约10μg/μl、约2至约10μg/μl、约3至约10μg/μl、约4至约10μg/μl、5至约10μg/μl、约0.1至约5μg/μl、约0.5至约5μg/μl、约1至约5μg/μl、或约2至约5μg/μl。在一些实施方案中，至少一种多核苷酸在组合物中的浓度是约0.005μg/μl、约0.01μg/μl、约0.02μg/μl、约0.03μg/μl、约0.04μg/μl、约0.05μg/μl、约0.1μg/μl、约0.2μg/μl、约0.3μg/μl、约0.4μg/μl、约0.5μg/μl、约1μg/μl、约2μg/μl、约3μg/μl、约4μg/μl、约5μg/μl、约6μg/μl、约7μg/μl、约8μg/μl、约9μg/μl或约10μg/μl。
在一些实施方案中，酶在组合物中的浓度是约10U/ml至约10,000U/ml。在一些实施方案中，酶在组合物中的浓度是约3,000U/ml至约5,000U/ml。在一些实施方案中，酶在组合物中的浓度是约1,000U/ml至约6,000U/ml。在一些实施方案中，浓度是约10U/ml、约20U/ml、约30U/ml、约40U/ml、约50U/ml、约100U/ml、约200U/ml、约300U/ml、约400U/ml、约500U/ml、约600U/ml、约700U/ml、约800U/ml、约900U/ml、约1,000U/ml、约1,500U/ml、约2,000U/ml、约2,500U/ml、约3,000U/ml、约3,500U/ml、约4,000U/ml、约4,500U/ml、约5,000U/ml、约5,500U/ml、约6,000U/ml、约6,500U/ml、约7,000U/ml、约7,500U/ml、约8,000U/ml、约8,500U/ml、约9,000U/ml、约9,500U/ml或约10,000U/ml。
在一些实施方案中，本公开的组合物还包含渗透调节物质。在一些实施方案中，渗透调节物质是天然存在的有机化合物。在一些实施方案中，渗透调节物质是氨基酸、甲胺或多元醇。使用的渗透调节物质包括但不限于糖醇诸如山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓醇；甘油；单糖诸如葡萄糖或二糖诸如蔗糖；氨基酸诸如脯氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、四氢甲基嘧啶甲酸(ectoine)或天冬氨酸；海藻糖、甘氨酸甜菜碱(甜菜碱)、肉碱、牛磺酸、肌氨酸、肌肉肌醇(肌醇)。在某些实施方案中，渗透调节物质选自由蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、甘油、聚乙二醇(PEG)、D-脯氨酸、L-脯氨酸、甜菜碱及其任何组合组成的组。在一些实施方案中，PEG具有不超过5,000g/mol的分子量。在一些实施方案中，渗透调节物质是PEG 300或PEG 400。在一些实施方案中，渗透调节物质处于约1mM至约500mM的浓度下。在其它实施方案中，渗透调节物质处于约10mM至约500mM的浓度下。在一些实施方案中，渗透调节物质处于约100mM至约500mM的浓度下。在一些实施方案中，渗透调节物质处于至少500mM的浓度下。在一些实施方案中，渗透调节物质处于约5mM至约500mM、约10mM至约500mM、约20mM至约500mM、约25mM至约500mM、约50mM至约500mM、约75mM至约500mM、约100mM至约500mM、约125mM至约500mM、约150mM至约500mM、约175mM至约500mM、约200mM至约500mM、约250mM至约500mM、约5mM至约250mM、约10mM至约250mM、约20mM至约250mM、约25mM至约250mM、约50mM至约250mM、约100mM至约250mM、约5mM至约150mM、约10mM至约150mM、约20mM至约150mM、约25mM至约150mM、约50mM至约150mM、约5mM至约100mM、约10mM至约100mM、约20mM至约100mM、约25mM至约100mM、以及约50mM至约100mM的浓度下。在一些实施方案中，渗透调节物质处于约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM、约100mM、约110mM、约120mM、约125mM、约150mM、约175mM、约200mM、约250mM、约300mM、约400mM、约500mM、约600mM、约700mM、约800mM、约900mM或约1000mM的浓度下。在一些实施方案中，本公开的组合物包含至少一种多核苷酸和至少一种渗透调节物质，具有或不具有酶或表面活性剂。在一些实施方案中，本公开的组合物包含至少两种、至少三种或至少四种不同的渗透调节物质。在一些实施方案中，组合物还包含至少一种表面活性剂、或至少两种、至少三种或至少四种不同表面活性剂的掺合物。在一些实施方案中，组合物还包含至少一种能够破坏植物或植物部分的至少一个屏障的酶。在一些实施方案中，组合物包含至少两种、至少三种或至少四种不同酶的混合物。
在一些实施方案中，本公开的组合物还包含缓冲剂。常见缓冲剂的实例包括但不限于乙酸盐、MES、柠檬酸盐、BIS-TRIS、MOPS、磷酸盐、碳酸盐、HEPES、三(羟甲基)甲基甘氨酸、Tris、N,N-二羟乙基甘氨酸(Bicine)、TAPS、牛磺酸、硼酸盐和CAPS。
在一些实施方案中，本公开的组合物不包含任何缓冲剂。在一个实施方案中，至少一种非可转录多核苷酸和/或至少一种酶呈水基制剂形式。
在一些实施方案中，本公开的组合物还包含杀害虫剂。杀害虫剂可为例如杀昆虫剂、杀真菌剂、除草剂或杀线虫剂。
杀昆虫剂和杀线虫剂的非限制性实例包括氨基甲酸酯、二酰胺、大环内酯、新烟碱(neonicotinoid)、有机磷酸酯、苯基吡唑、除虫菊酯(pyrethrin)、多杀菌素(spinosyn)、合成除虫菊酯、季酮酸(tetronic acid)和季胺酸(tetramic acid)。在特定实施方案中，杀昆虫剂和杀线虫剂包括阿维菌素(abamectin)、涕灭威(aldicarb)、氧涕灭威(aldoxycarb)、联苯菊酯(bifenthrin)、克百威(carbofuran)、氯虫酰胺(chlorantraniliporle)、噻虫胺(chlothianidin)、氟氯氰菊酯(cyfluthrin)、氯氟氰菊酯(cyhalothrin)、氯氰菊酯(cypermethrin)、溴氰菊酯(deltamethrin)、呋虫胺(dinotefuran)、埃玛菌素(emamectin)、乙虫腈(ethiprole)、克线磷(fenamiphos)、芬普尼(fipronil)、氟虫酰胺(flubendiamide)、噻唑膦(fosthiazate)、吡虫啉(imidacloprid)、伊维菌素(ivermectin)、λ-氯氟氰菊酯(lambda-cyhalothrin)、密灭汀(milbemectin)、烯啶虫胺(nitenpyram)、杀线威(oxamyl)、苄氯菊酯(permethrin)、乙基多杀菌素(spinetoram)、刺糖菌素(spinosad)、螺螨酯(spirodichlofen)、螺虫乙酯(spirotetramat)、七氟菊酯(tefluthrin)、噻虫啉(thiacloprid)、噻虫嗪(thiamethoxam)和硫双卡(thiodicarb)。
适用杀真菌剂的非限制性实例包括芳族烃、苯并咪唑、苯并噻二唑、羧酰胺、羧酸酰胺、吗啉、苯基酰胺、膦酸酯、醌外部抑制剂(例如嗜球果伞素(strobilurin))、噻唑烷、托布津(thiophanate)、噻吩羧酰胺和三唑。杀真菌剂的特定实例包括阿拉酸式苯-S-甲基(acibenzolar-S-methyl)、嘧菌酯(azoxystrobin)、苯霜灵(benalaxyl)、联苯吡菌胺(bixafen)、啶酰菌胺(boscalid)、多菌灵(carbendazim)、环丙唑醇(cyproconazole)、烯酰吗啉(dimethomorph)、氟环唑(epoxiconazole)、氟咯菌腈(fludioxonil)、氟吡菌酰胺(fluopyram)、氟嘧菌酯(fluoxastrobin)、氟噻菌净(flutianil)、氟酰胺(flutolanil)、氟苯吡菌胺(fluxapyroxad)、三乙膦酸铝(fosetyl-Al)、种菌唑(ipconazole)、吡唑萘菌胺(isopyrazam)、醚菌酯(kresoxim-methyl)、精甲霜灵(mefenoxam)、甲霜灵(metalaxyl)、叶菌唑(metconazole)、腈菌唑(myclobutanil)、肟醚菌胺(orysastrobin)、戊苯吡菌胺(penflufen)、吡噻菌胺(penthiopyrad)、啶氧菌酯(picoxystrobin)、丙环唑(propiconazole)、丙硫菌唑(prothioconazole)、吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)、氟唑环菌胺(sedaxane)、硅噻菌胺(silthiofam)、戊唑醇(tebuconazole)、噻苯咪唑(thiabendazole)、噻呋酰胺(thifluzamide)、托布津(thiophanate)、甲基立枯磷(tolclofos-methyl)、肟菌酯(trifloxystrobin)和灭菌唑(triticonazole)。
在一些实施方案中，本公开的组合物还包含一种或多种可添加至本公开的组合物中的除草剂，所述除草剂提供多物种杂草控制或对难以控制的杂草物种的替代性作用模式，例如包括但不限于以下的除草剂家族的成员：酰胺除草剂、芳族酸除草剂、砷除草剂、苯并噻唑除草剂、苯甲酰基环己二酮除草剂、苯并呋喃基烷基磺酸酯除草剂、氨基甲酸酯除草剂、环己烯肟除草剂、环丙基异噁唑除草剂、二甲酰亚胺除草剂、二硝基苯胺除草剂、二硝基酚除草剂、二苯基醚除草剂、二硫代氨基甲酸酯除草剂、卤化脂族除草剂、咪唑啉酮除草剂、无机除草剂、腈除草剂、有机磷除草剂、噁二唑酮除草剂、噁唑除草剂、苯氧基除草剂、苯二胺除草剂、吡唑除草剂、哒嗪除草剂、哒嗪酮除草剂、吡啶除草剂、嘧啶二胺除草剂、嘧啶基氧基苯甲基胺除草剂、季铵除草剂、硫代氨基甲酸酯除草剂、硫代碳酸酯除草剂、硫脲除草剂、三嗪除草剂、三嗪酮除草剂、三唑除草剂、三唑酮除草剂、三唑并嘧啶除草剂、尿嘧啶除草剂和脲除草剂。特定来说，在包含本公开的多核苷酸的组合物中，添加的除草剂的使用率可降低。额外所添加除草剂的使用率降低可为10-25％、26-50％、51-75％或更大，所述降低可在增强多核苷酸和除草剂组合物的活性下实现，并且作为本公开的一方面加以涵盖。
生长素(Auxin)样除草剂包括苯甲酸除草剂、苯氧基羧酸除草剂、吡啶羧酸除草剂、喹啉羧酸除草剂、嘧啶羧酸除草剂和草除灵乙酯(benazolin-ethyl)除草剂。
苯甲酸除草剂组(麦草畏(dicamba)(3,6-二氯-邻茴香酸)、草灭平(chloramben)(3-氨基-2,5-二氯苯甲酸)和TBA(2,3,6-三氯苯甲酸))是对于萌发前杂草管理与萌发后杂草管理两者均有效的除草剂。麦草畏是许多生长素样除草剂中的一者，其是一种廉价的环境友好除草剂，已作为萌发前和萌发后除草剂用于有效控制玉米、高粱、小谷物、牧草、干草、草场、甘蔗、芦笋、草皮和草籽作物中的一年生和多年生阔叶杂草以及若干禾本科杂草(Crop Protection Chemicals Reference,第1803-1821页,Chemical&PharmaceuticalPress,Inc.,New York,NY,第11版,1995)。麦草畏是指3,6-二氯-邻茴香酸或3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸以及它的酸和盐。它的盐包括异丙胺盐、二甘醇胺盐、二甲胺盐、钾盐和钠盐。麦草畏包括例如商业制剂(不限于)BanvelTM(呈DMA盐形式，BASF,Research TrianglePark,NC)、(DGA盐，BASF)、VEL-58-CS-11TM(BASF)和VanquishTM(DGA盐，BASF)。麦草畏是适用作桶混制剂的除草剂，与本公开的组合物同时，或在用本公开的组合物处理之前或之后使用。
生长素样除草剂也包括苯氧基羧酸化合物、吡啶羧酸化合物、喹啉羧酸化合物和草除灵乙酯化合物。苯氧基羧酸化合物的实例包括但不限于2,4-二氯苯氧乙酸、(4-氯-2-甲基苯氧基)乙酸、2,4-滴丙酸(2,4-DP)、2-甲-4-氯丙酸(MCPP)和稗草胺(clomeprop)。吡啶除草剂的实例包括但不限于二氯吡啶酸(clopryalid)、毒莠定(picloram)、氯氟吡氧乙酸(fluroxypyr)、氯丙嘧啶酸(aminocyclopyrachlor)和三氯吡氧乙酸(triclopyr)。这些生长素样除草剂适用于桶混制剂中，与本公开的组合物同时，或在用本公开的组合物处理之前或之后使用。生长素样除草剂包括可商购获得的制剂，例如包括但不限于2,4-D、2,4-DB(200、巴克(Bakker))、MCPA(2甲4氯(Rhomene))、甲氯丙酸(mecoprop)、2,4-滴丙酸(dichlorprop)、2,4,5-T、三氯吡氧乙酸(triclopyr)(Dow AgroSciences,Indianapolis,IN)、草灭平(chloramben)、麦草畏2,3,6-TBA、杀草畏(tricamba)、二氯吡啶酸(clopyralid)(Dow AgroSciences)、毒莠定Dow AgroSciences)、喹草酸(quinmerac)、二氯喹啉酸(quinclorac)、草除灵(benazolin)、伐草克(fenac)、IAA、NAA、苯腈素(orthonil)和氯氟吡氧乙酸(fluroxypyr)(DowAgroSciences)、氯氨吡啶酸(aminopyralid)(Dow AgroSciences)和氯丙嘧啶酸(aminocyclopyrachlor)(Dupont,Wilmington,DE)。
在一些实施方案中，除草剂是草甘膦(glyphosate)。“草甘膦”(N-膦酰基甲基甘氨酸)除草剂抑制莽草酸途径，其导致生物合成芳族化合物，包括氨基酸、植物激素和维生素。具体来说，草甘膦通过抑制酶5-烯醇丙酮酰基莽草酸-3-磷酸合成酶(在下文中称为EPSP合成酶或EPSPS)来限制磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和3-磷酸莽草酸转化成5-烯醇丙酮酰基-3-磷酸莽草酸。出于本公开的目的，术语“草甘膦”应被视为包括N-膦酰基甲基甘氨酸的任何除草有效形式(包括其任何盐)和导致在植物中产生草甘膦阴离子的其它形式。草甘膦是EPSPS抑制剂除草剂的一实例。除草剂是影响植物生长或发育或繁殖能力的分子。
草甘膦可以众多制剂形式商购获得。这些草甘膦制剂的实例包括不限于由Monsanto Company(St Louis,MO)以 ULTRA、ULTRAMAX、CT、EXTRA、BIACTIVE、BIOFORCE、和除草剂(其全都含有呈它的异丙铵盐形式的草甘膦)；WEATHERMAX(含有呈它的钾盐形式的草甘膦)；DRY和除草剂(其含有呈它的铵盐形式的草甘膦)；GEOFORCE(其含有呈它的钠盐形式的草甘膦)销售的那些，以及除草剂(Syngenta,Greensboro,NC)，其含有呈它的三甲基锍盐形式的草甘膦。草甘膦的各种其它盐是可用的，例如二甲胺盐、异丙胺盐、三甲基硫盐、钾盐、单铵盐和二铵盐。
在本公开的一个方面，多核苷酸抑制靶标基因的表达。在某些实施方案中，多核苷酸抑制表皮细胞中靶标基因的表达。在一些实施方案中，多核苷酸抑制叶肉细胞中靶标基因的表达。
在某些实施方案中，将本文公开的组合物施加于叶的表面上。在一些实施方案中，将液体组合物以每平方厘米(sq-cm)叶面积约1至约20μL制剂施加于叶的表面上。
在一些实施方案中，将多核苷酸在约0.005μg/μl至约10μg/μl的最终浓度下施加于植物或植物部分的表面上。在一些实施方案中，多核苷酸在组合物中的浓度是约0.01至约10μg/μl、0.05至约10μg/μl、约0.1至约10μg/μl、约0.5至约10μg/μl、约1至约10μg/μl、约2至约10μg/μl、约3至约10μg/μl、约4至约10μg/μl、5至约10μg/μl、约0.1至约5μg/μl、约0.5至约5μg/μl、约1至约5μg/μl、或约2至约5μg/μl。在一些实施方案中，多核苷酸在组合物中的浓度是约0.005μg/μl、约0.01μg/μl、约0.02μg/μl、约0.03μg/μl、约0.04μg/μl、约0.05μg/μl、约0.1μg/μl、约0.2μg/μl、约0.3μg/μl、约0.4μg/μl、约0.5μg/μl、约1μg/μl、约2μg/μl、约3μg/μl、约4μg/μl、约5μg/μl、约6μg/μl、约7μg/μl、约8μg/μl、约9μg/μl或约10μg/μl。
在一些实施方案中，将酶在约10U/ml至约10,000U/ml的最终浓度下施加于植物或植物部分的表面上。在一些实施方案中，供施加的酶的最终浓度是约3,000U/ml至约5,000U/ml。在一些实施方案中，供施加的酶的最终浓度是约1,000U/ml至约6,000U/ml。在一些实施方案中，浓度是约10U/ml、约20U/ml、约30U/ml、约40U/ml、约50U/ml、约100U/ml、约200U/ml、约300U/ml、约400U/ml、约500U/ml、约600U/ml、约700U/ml、约800U/ml、约900U/ml、约1,000U/ml、约1,500U/ml、约2,000U/ml、约2,500U/ml、约3,000U/ml、约3,500U/ml、约4,000U/ml、约4,500U/ml、约5,000U/ml、约5,500U/ml、约6,000U/ml、约6,500U/ml、约7,000U/ml、约7,500U/ml、约8,000U/ml、约8,500U/ml、约9,000U/ml、约9,500U/ml或约10,000U/ml。
在一些实施方案中，将至少一种多核苷酸和至少一种能够破坏至少一个植物屏障的试剂于相同组合物中施加于植物或植物部分的表面上。在其它实施方案中，将至少一种多核苷酸和至少一种能够破坏至少一个植物屏障的试剂于不同组合物中施加于植物或植物部分的表面上。在一些实施方案中，将不同组合物同时施加于植物或植物部分。在其它实施方案中，将不同组合物分开施加于植物或植物部分。
在一些实施方案中，将至少一种多核苷酸和至少一种能够破坏至少一个植物屏障的试剂分开施加于植物或植物部分的表面上。在一些实施方案中，一者紧接在另一者之后施加。在一些实施方案中，将至少一种多核苷酸和至少一种能够破坏至少一个植物屏障的试剂例如至少一种酶相隔至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少11小时、至少12小时、至少15小时、至少20小时、至少24小时、至少36小时或至少48小时施加于植物或植物部分的表面上。
在一些实施方案中，在施加至少一种能够破坏至少一个植物屏障的试剂之前将至少一种多核苷酸施加于植物或植物部分的表面上。在一些实施方案中，多核苷酸紧靠在施加酶之前施加。在一些实施方案中，在施加酶之前至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少11小时、至少12小时、至少15小时、至少18小时、至少20小时、至少24小时、至少30小时或至少36小时施加多核苷酸。
在一些实施方案中，在初始施加之后至少24小时的间隔下，将包含至少一种多核苷酸和/或至少一种能够破坏至少一个植物屏障的试剂的组合物再施加于植物或植物部分的表面上至少一次、至少两次或至少三次。在一些实施方案中，再施加混合物的间隔是约24小时至约14天。在一些实施方案中，再施加混合物的间隔是约24小时、约36小时、约48小时或约72小时。在其它实施方案中，再施加混合物的间隔是约1天至约14天、约2天至约10天或约2天至约5天。在其它实施方案中，再施加混合物的间隔是约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天或约14天。
在一些实施方案中，植物或植物部分的表面上的总面积的至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％与包含多核苷酸的组合物接触。
在一些实施方案中，在施加包含触发多核苷酸的组合物之后，观察到靶标基因表达由如本文提供的触发多核苷酸抑制至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少1周、至少2周或至少3周。
在一些实施方案中，将包含至少一种多核苷酸和/或至少一种能够破坏至少一个植物屏障的试剂的组合物溶解或混悬于水溶液中。在其它实施方案中，组合物是干燥粉末。在一些实施方案中，使用气雾剂或雾化器来施加组合物。在其它实施方案中，使用履带式喷雾器来施加水溶液。在一些实施方案中，使用喷雾器在约10至约50psi或约20至约30psi的气压下施加水溶液。在一些实施方案中，在每英亩约5至约40加仑的比率下施加水溶液。
在一些实施方案中，本公开的组合物还含有固体和液体载体以及表面活性剂(例如单独或呈组合形式的湿润剂、分散剂或乳化剂)。可存在于本公开的多核苷酸组合物中的表面活性剂可具有离子或非离子类型，例如磺基蓖麻油酸盐；季铵衍生物；基于氧化乙烯与壬基酚或辛基酚的缩合物、或已通过与氧化乙烯缩合来使游离羟基醚化而致使可溶的脱水山梨醇的羧酸酯的产品；硫酸酯和磺酸的碱金属和碱土金属盐诸如丁二酸二壬酯磺酸钠和丁二酸二辛酯磺酸钠；以及高分子量磺酸衍生物的碱金属和碱土金属盐诸如木质素磺酸钠和木质素磺酸钙。固体稀释剂或载体的实例包括但不限于硅酸铝、滑石、煅烧氧化镁、硅藻土、磷酸三钙、粉状软木、吸附炭黑和粘土诸如高岭土和膨润土。液体稀释剂的实例包括但不限于水、苯乙酮、环己酮、异佛尔酮(isophorone)、甲苯、二甲苯以及矿物油、动物油和植物油。这些稀释剂可单独或以其任何组合加以使用。在一些实施方案中，本申请的多核苷酸组合物或混合物也可含有常规佐剂诸如粘着剂、保护性胶体、增稠剂、渗透剂、稳定剂、螯合剂、防结块剂、着色剂和腐蚀抑制剂。这些佐剂也可充当载体或稀释剂。
在一些实施方案中，本公开的组合物是可湿润粉末或水可分散颗粒。在一些实施方案中，多核苷酸组合物或混合物是水性混悬浓缩物。在一些实施方案中，可湿润粉末(或供喷洒的粉末)可含有0％至约5％的湿润剂、约3％至约10％的分散剂和/或其它添加剂诸如渗透剂、粘着剂或防结块剂和着色剂。在一些实施方案中，以用以获得不沉淀析出的稳定流体产物(例如通过精磨)的方式制备可通过喷洒施加的水性混悬浓缩物。在一些实施方案中，水性混悬浓缩物含有0％至约10％的适合添加剂诸如消泡剂、腐蚀抑制剂和稳定剂。
本公开的多核苷酸组合物任选可还包含常规添加剂诸如表面活性剂、漂移降低剂、软化剂、溶解增强剂、增稠剂、流动增强剂、泡沫减少剂、冷冻保护剂、UV保护剂、防腐剂、抗微生物剂和/或为改进性能、作物安全性或处理组合物所必要或合乎需要的其它添加剂。
在一些实施方案中，多核苷酸组合物还包含表面活性剂。在一些实施方案中，表面活性剂是选自以下的非离子表面活性剂：有机硅酮表面活性剂、聚山梨醇酯、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡醇、油醇、硬脂醇、椰油酰胺DEA、椰油酰胺MEA、聚烷基葡糖苷、癸基葡糖苷、月桂基葡糖苷、辛基葡糖苷、甘油单月桂酸酯、泊洛沙姆、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、脱水山梨糖醇三硬脂酸酯或其任何组合。可商购获得的非离子表面活性剂的实例包括但不限于硅酮诸如来自Momentive的L-77；可根据Agnique PG品牌从BASF(先前是Cognis)获得的烷基聚葡糖苷；可从Lamberti、BASF、Croda、Akzo Nobel、Stepan和许多其它制造商获得的乙氧基化脂肪酸和醇；以及可根据商品名从Croda以及以TW从Oxiteno获得的乙氧基化脱水山梨糖醇酯。
在一些实施方案中，表面活性剂选自L-77、六乙二醇单十二基醚(HGME)、壬酸、TritonTM X-100、SP131、SP133、S210及其任何组合。在一些实施方案中，表面活性剂是脱水山梨糖醇脂肪酸酯或非离子聚山梨醇酯脂肪酸酯表面活性剂。在一些实施方案中，表面活性剂在组合物中处于约0.01％至约10％、约0.05％至约10％、约0.1％至约10％、约0.2％至约10％、约0.5％至约10％、约1％至约10％、约0.01％至约5％、约0.05％至约5％、约0.1％至约5％、约0.2％至约5％、约0.5％至约5％、约1％至约5％、约0.05％至约2％、约0.1％至约2％、或约0.5％至约2％的浓度下。在一些实施方案中，表面活性剂处于约0.01％、约0.02％、约0.05％、约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约1.2％、约1.5％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％的浓度下。
在一些实施方案中，多核苷酸组合物包含至少两种表面活性剂、至少三种表面活性剂或至少四种表面活性剂的掺合物。在一些实施方案中，多核苷酸组合物包含在约10:1至约1:10的比率下的至少两种表面活性剂。在一些实施方案中，多核苷酸组合物包含在约8:1至约1:8、约5:1至约1:5、约4:1至约1:4、约3:1至约1:3、约2:1至约1:2、约1.5:1至约1:1.5的比率下，或在约1:1的比率下的至少两种表面活性剂。在一个实施方案中，组合物包含在约3:1的比率下的和的掺合物。
在一些实施方案中，表面活性剂是生物表面活性剂。生物表面活性剂是由活细胞合成的表面活性物质。在一些实施方案中，生物表面活性剂由微生物产生。在某些实施方案中，生物表面活性剂由细菌或真菌产生。生物表面活性剂的实例包括但不限于脂肽(例如枯草芽孢杆菌表面活性素)、糖脂(例如来自绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)的二鼠李糖脂和单鼠李糖脂)、1’,4’-槐糖内酯6’,6’-二乙酸酯(例如来自念珠菌属物种)、海藻糖脂质(来自红球菌属物种)和甘露糖基赤藻糖醇脂质(南极念珠菌(Candida antartica))。在一些实施方案中，生物表面活性剂选自脂肽、糖脂、海藻糖脂质、甘露糖基赤藻糖醇脂质、1’,4’-槐糖内酯6’,6’-二乙酸酯及其任何组合。
在一些实施方案中，本文公开的组合物还包含至少一种渗透调节物质，或至少两种、至少三种或至少四种不同渗透调节物质的混合物。在一些实施方案中，一种或多种渗透调节物质选自蔗糖、甘露糖醇、甘油及其任何组合。
在一些实施方案中，多核苷酸混合物或多核苷酸组合物还包含光保护剂。在一些实施方案中，光保护剂是阴离子光保护剂。在一些实施方案中，光保护剂是水溶性光保护剂。光保护剂的实例包括但不限于：可以Maxgard 800从Lycus Ltd.(El Dorado,AK)以及以Helisorb-11DS从Norquay Technology(Chester,PA)获得的二苯甲酮-9(CAS号76656-36-5)。二苯甲酮-9是一种主要在紫外区中进行吸收的芳族磺酸盐。具有指示核准用于食物、药物和化妆品中的“FD&C”标号的可见光阴离子染料诸如FD&C蓝1号和FD&C绿3号也是光保护剂。在一个特定实施方案中，光保护剂是二苯甲酮9。在一些实施方案中，光保护剂处于约0.1％至约5％、约0.2％至约5％、约0.5％至约5％、约0.1％至约2％、或约0.5％至约1.5％的浓度下。在一些实施方案中，光保护剂处于约0.1％、约0.2％、约0.5％、约1％、约1.5％、约2％、约2.5％、约3％、约3.5％、约4％、约4.5％或约5％的浓度下。
在一些实施方案中，多核苷酸混合物或多核苷酸组合物还包含杀生物剂。在一些实施方案中，杀生物剂是杀害虫剂。在一些实施方案中，杀生物剂是除草剂。
在一些实施方案中，本文公开的组合物包含杀害虫剂，所述杀害虫剂选自由马铃薯块茎储藏蛋白(patatin)、植物凝集素、植物蜕皮类固醇、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)杀昆虫蛋白质、致病杆菌(Xenorhabdus)杀昆虫蛋白质、光杆状菌(Photorhabdus)杀昆虫蛋白质、侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporous)杀昆虫蛋白质和球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)杀昆虫蛋白质组成的组。
在某些实施方案中，本公开的组合物还包含螯合剂。实例包括但不限于：柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)的盐及其任何组合。在一些实施方案中，螯合剂处于约0.01％至约5％、约0.01％至约1％、约0.01％至约0.5％、0.01％至约0.25％、约0.02％至约1％、约0.02％至约0.5％、约0.05％至约1％、约0.05％至约0.5％、或约0.1％至约0.25％的浓度下。在一些实施方案中，螯合剂处于约0.01％、约0.02％、约0.03％、约0.04％、约0.05％、约0.06％、约0.07％、约0.08％、约0.09％、约0.1％、约0.125％、约0.15％、约0.175％、约0.2％、约0.225％、约0.25％、约0.3％、约0.35％、约0.4％、约0.45％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约1.5％、约2％、约2.5％、约3％、约3.5％、约4％、约4.5％或约5％的浓度下。
多核苷酸混合物或多核苷酸组合物也可还包含消泡剂诸如硅酮。一个实例是来自BASF的DFM 111S。
在某些实施方案中，本公开的组合物还包含核糖核酸酶抑制剂。实例包括但不限于硫酸锌、及其任何组合。
在某些实施方案中，本公开的组合物还包含植物中植物免疫应答的抑制剂或激发剂。植物免疫应答的抑制剂的实例包括但不限于草酸盐、DPI、2-脱氧-D-葡萄糖(DDG)及其任何组合。植物免疫应答的激发剂的实例包括但不限于：水杨酸、微生物源性肽(例如丙甲菌素(alamethicin))、蛋白质、多糖和脂质及其任何组合。
在某些实施方案中，本公开的组合物还包含细胞转染剂。实例包括但不限于：脂质纳米粒子、聚合物以及细胞渗透肽和胞吞效应物。
在各实施方案中，本文所述的方法、组合物和装置适用于在直接通过如本文所述的方法来处理的植物中获得表型(例如产率改进、对温度、水或营养物应激的抗性改进、对病原体的抗性改进、除草剂易感性改进、除草剂抗性改进以及营养物含量或外观改进)。在其它实施方案中，由本公开方法达成的处理效应被传递至后代，例如以表观遗传效应方式。在许多实施方案中，方法中采用的DNA或RNA被设计以使靶标基因沉默。在相关应用中，方法可用于递送任何目标核酸，包括被设计用于例如使用CRISPR或Cas9系统进行基因编辑的核酸。
本公开也提供一种用于喷洒多个植物或多排植物的喷洒装置，其包括推进剂来源、至少一个喷嘴和含有包含多核苷酸和至少一种磨蚀剂的组合物的储集器。本公开也提供一种用于将核酸引入完整植物中的装置，其包括a)负载磨蚀剂的基体，和b)核酸。本公开进一步提供一种用于将核酸引入完整植物中的方法，其包括呈任何顺序的以下步骤：a)用非颗粒微结构对完整植物的表面进行机械渗透，和b)使所述完整植物的所述表面与核酸接触。
以下实施例出于说明目的呈现，并且不应解释为限制。
实施例
实施例1：与脂酶一起使用液体制剂将dsRNA递送至本赛姆氏烟草(Nicotianabenthamiana)16C-GFP植物中。
在这个实施例中，用含有靶向GFP的dsRNA的制剂处理幼小本赛姆氏烟草植物(2-3周龄植物)，所述dsRNA仅处于水中或与由200mM甘油、4mM MES组成的缓冲溶液一起。额外组分是来自含有>3800U/ml(Sigma P2611)的储备物的1％果胶酶和来自含有>700U/g(1.1-1.3g/ml，Sigma C2730)的储备物的2％纤维素酶，具有或不具有脂酶，如下表1中所说明。使用的脂酶是20,000U/g(Sigma L4277；来自米赫根毛霉)，在300U/ml下；100,000U/g(Sigma L0777；来自疏绵状嗜热丝孢菌)，在300U/ml下；或AD L 6,000U/g(L3420；来自念珠菌属物种)，在300U/ml下。单独或以3-酶混合物(各脂酶在混合物制剂中在150U/ml下)形式组合使用脂酶。
使用1步法将制剂施加于植物叶，借此首先将所有组分混合在一起，接着温和吸移于3个叶上。将每平方厘米(sq-cm)叶面积平均14-17μL制剂施加于各处理叶。为得到用于达成适当制剂递送的表面积与体积比率的测量结果，从本赛姆氏烟草植物切除叶，并且使用FijiImage J免费软件(fiji.sc/How_to_cite_Fiji％3F)进行成像。跨越所成像叶的数目对表面积进行平均化。最幼小施加叶是长度测量为约2-4mm的顶端叶，这些叶具有0.18sq-cm/叶的平均表面积，并且通常用2-4μL制剂处理。第二类型的叶在尺寸方面略微更大，并且被称为中等尺寸叶，在尺寸方面测量为约0.51sq-cm/叶。这些叶用5-9μL制剂处理。处理的最大叶在表面积方面平均是约1.85sq-cm/叶，并且用每叶20μL制剂处理。
第二递送方法采用2步递送，其中首先使dsRNA与水或缓冲液预混合，并且通过温和吸移来施加于3个最幼小叶，随后在24小时后施加于水或缓冲液中的脂酶。在2步施加程序中，脂酶浓度是100U/ml(单一酶)或当三种酶被用作混合物时各自50U/ml。施加于植物叶的体积如上所述，约2-4μL于顶端叶上，约5-9μL于中等尺寸叶上，并且约18-20μL于较大叶上，其中目标是保持一致体积与表面积比率。用吸移器尖端的侧面在叶的顶部上温和散布制剂。使用的dsRNA靶向转基因本赛姆氏烟草16C株系中的GFP，并且由124bpdsRNA多核苷酸组成。表2说明施加于幼小处理植物的制剂。各处理由3个植物组成。
表1.将GFP dsRNA递送至幼小本赛姆氏烟草植物中时使用的脂酶。
表2.施加于本赛姆氏烟草16C-GFP植物的制剂的组成
在处理之后3、6、10和19天(DAT)观察植物的表型显现。早在3DAT就可见GFP表达的抑制，如由在蓝光(470nm激发)下的红色叶绿素荧光所证实。表3概述在处理的植物中观察到的局部化和系统性GFP抑制。
表3.具有局部化或系统性GFP抑制的植物总计
用1步或2步施加方法处理的植物显现早在3DAT就可见的局部化抑制症状。基于展现系统性GFP抑制的植物的数目，似乎1步施加方法倾向于更有效将多核苷酸递送至植物细胞中以引发抑制。
实施例2.通过与脂酶一起施加液体制剂中的dsRNA多核苷酸来抑制内源性基因的基因表达。
在这个实施例中，与或酶一起用靶向内源性镁螯合酶(MgChl)的dsRNA(长度是122bp)处理幼小本赛姆氏烟草16C-GFP植物(2-3周龄)，所述dsRNA处于与实施例1中所述相同基础制剂中。表4概述这个实施例中使用的制剂。
表4.用于MgChl实验的制剂。
每个植物用制剂处理3个叶。各处理组由3个植物组成。在这个实施例中，所有施加都使用1步方法递送。在处理之后，在含有MgChldsRNA的制剂的情况下，而非在含有GFP触发剂(脱靶对照)或不含有触发剂的对照制剂的情况下，早在3DAT就观察到如由在环境光线下可见的叶上褪绿斑所证实的MgChl沉默表型。
实施例3.当与脂酶一起使用于液体制剂中递送的dsRNA多核苷酸的混合物时共定位的GFP沉默和MgChl沉默表型。
在这个实施例中，与Palatase或Lipolase酶一起用靶向内源性镁螯合酶(MgChl)的dsRNA(长度是122bp)和靶向转基因GFP基因的dsRNA(长度是124bp)处理本赛姆氏烟草16C-GFP植物(2-3周龄)，所述dsRNA处于与实施例1中所述相同基础制剂中。表5概述这个实验中使用的制剂。
表5.用于将MgChl和GFP多核苷酸递送至本赛姆氏烟草植物中的制剂
在处理之后不同时间点在UV或环境光线下观察植物。早在5DAT就观察到基因表达抑制。在UV光下在所有处理植物(3/3)上的所有叶上都观察到暗棕色/微红斑点，从而指示GFP表达已被抑制，而在环境光线下，在与GFP抑制相同的位置中可见为MgChl抑制所特有的褪绿斑。
实施例4.通过与脂酶一起施加液体制剂中的dsRNA多核苷酸来抑制番茄中内源性基因的基因表达。
在这个实施例中，用靶向内源性镁螯合酶(MgChl；122bp dsRNA多核苷酸)的dsRNA或用作为脱靶对照的靶向GFP的dsRNA(124bpdsRNA多核苷酸)处理幼小番茄植物(番茄Celebrity栽培变种(Solanumlycopersicum cv.Celebrity)，2-3周阶段)。基础缓冲液制剂含有25mM甘露糖醇和4mM MES以及0.5％纤维素酶和0.25％果胶酶。和在如表6中所示的浓度下使用。番茄叶最接近类似于椭圆，因此通过首先将在两个方向上的叶直径相加，接着用π(π＝3.14)乘以所得值来测量叶的表面积。对番茄叶的平均施加体积是每sq-cm叶27μL。下表概述使用的制剂。
表6.番茄液体酶递送方案中使用的制剂的组成
通过以4DAT开始，在环境光线下在幼小处理叶中寻找褪绿斑来关于镁螯合酶基因表达抑制对番茄植物评分。实验结果的概述以下呈现在表7中。
表7.在用含dsRNA的水解酶制剂处理之后4天展现MgChl抑制的植物
用基础缓冲溶液、靶向MgChl的dsRNA和水解酶处理的番茄植物具有较高数目的症状性结果，由在环境光线下可见的幼小发育叶上褪绿斑所证实(4、5和6号处理)。在用228U/ml Palatase(4号处理)处理的5/5植物中观察到局部化MgChl抑制。也以(10-12号处理)观察到局部化MgChl抑制。纤维素酶和果胶酶的制剂(7号处理，510U/ml)显示5/5处理植物中的MgChl抑制。
实施例5.包含dsRNA、脂酶和表面活性剂的液体制剂足以达成递送和植物中基因表达抑制。
在以下于表8中概述的实施例中，用含有脂酶、表面活性剂和靶向转基因GFP基因的dsRNA的制剂处理本赛姆氏烟草16C幼苗。施加体积与以上实施例1中概述相同，并且供施加的处理叶的阶段如同实施例1和4中一样。
表8.在用靶向GFP的dsRNA、和Silwet L77处理的本赛姆氏烟草16C幼苗中使用的制剂和观察的结果。
以3DAT开始，所有3个处理植物都显示局部抑制表型，如由在蓝光(470nm激发)下的指示GFP表达抑制的红色叶绿素荧光所证实。
实施例6.使用喷洒方法施加用于基因抑制的局部制剂
在这个实施例中，使用喷雾器将含有与用于基因抑制的dsRNA混合的水解脂酶的局部制剂递送于烟草本赛姆氏烟草16C幼苗上。通过使用吸移器进行手动施加(对照)或通过喷洒来用在含有dsRNA的缓冲溶液中含有水解脂酶的制剂处理本赛姆氏烟草16C幼苗(2周龄)。与G233-SET型Master Airbrush一起使用MiniAir TC207型活塞式压缩机来用制剂喷洒八(8)个处于4叶(4L)出叶阶段的幼苗和四(4)个处于2叶(2L)出叶阶段的幼苗。气压设置在20-30psi下。通过远离幼苗约5cm固持喷雾器来跨越叶3、4和幼苗顶端对处于4L阶段的幼苗进行喷洒。跨越完整植物对处于2L阶段的幼苗进行喷洒。手动施加的制剂的组成包括处于基础制剂中的2500或5000U/ml的脂酶所述基础制剂含有50mM甘油、4mMMES(pH 5.7)和在4mg/ml下的靶向GFP的dsRNA(124bp dsRNA多核苷酸)或靶向内源性MgChl的dsRNA(122bp dsRNA多核苷酸)。制剂的组成和观察的结果概述于下表9中。
表9.使用喷洒方法的制剂和液体制剂递送结果
早在处理之后4天就在UV光下观察到GFP沉默斑点。在环境光线下观察到镁螯合酶褪绿斑。在除一个处理(3号处理)之外的所有处理中都观察到局部化症状显现，并且对于处理1和2中的每一个，在一个植物中观察到系统性沉默。在由最高浓度的测试Palatase(5000U/ml)与靶向GFP的dsRNA组合组成的2号处理中，观察到大多数植物展现局部沉默。
实施例7.来自被工程改造以产生靶向GFP的dsRNA发夹的大肠杆菌(E.coli)K12，并且掺入以脂酶的细菌溶解产物足以抑制转基因表达。
在这个实施例中，大肠杆菌K12菌株被修饰以表达靶向GFP的660bp dsRNA发夹。在存在或不存在酶下，用由大肠杆菌K12::GFP产生的液体溶解产物局部处理过表达GFP的幼小本赛姆氏烟草16C植物(2-3周龄)。表10概述这个实验中使用的微生物制剂的组成。
表10：本赛姆氏烟草16C局部施加中使用的基于微生物的制剂组成
各处理由3个植物组成。将制剂施加于植物，并且每日监测植物的GFP抑制症状显现。早在处理之后3天(3DAT)，在以1号和2号处理接种的植物中观察到局部化GFP沉默灶(由在暴露于UV光(470nm)后红色叶绿素荧光所证实)，其中对于用2号处理中的制剂处理的植物观察到更强烈症状。
实施例8.通过与可商购获得的表面活性剂和脂酶一起施加液体制剂中的dsRNA多核苷酸来增强对转基因的基因表达的抑制
在这个实施例中，与或酶一起用靶向转基因GFP转录物的dsRNA(长度是124bp)处理幼小2-3周龄和龄期更大的3-4周本赛姆氏烟草16C-GFP植物，所述dsRNA处于如下表11中所述的含有不同可商购获得的表面活性剂的基础制剂中。这个实施例中使用的可商购获得的表面活性剂是L-77、六乙二醇单十二基醚(HGME)、壬酸和TritonTM X-100。
表11.具有包括可商购获得的表面活性剂和脂酶的组成的用于评估GFP沉默功效的制剂。
每个植物用制剂处理3个叶和顶端分生组织区域。在这个实施例中，所有施加都使用1步方法递送。在处理之后，观察到GFP沉默表型，如由在蓝光(470nm)下以及使用绿色(11号绿，Tiffen)和黄色(12号黄，Tiffen)滤光片的组合在叶上观察到的暗红色斑点所证实。在14DAT获取用于表型表征的图像，并且将结果概述于表12中。
表12：来自测试包括可商购获得的表面活性剂和脂酶的制剂组成的实验的GFP沉默功效结果
使用壬酸(5号处理)与Palatase(2257U/ml)组合对植物的处理在真正幼小(2-3周龄)处理幼苗与龄期略微更大(3-4周龄)处理幼苗两者中均产生沉默。
实施例9.含有从其它微生物分离的脂酶的液体制剂可将针对GFP的dsRNA递送至本赛姆氏烟草16C植物中
在这个实施例中，测试可商购获得的从许多微生物分离的脂酶将含dsRNA的制剂递送至幼小本赛姆氏烟草植物(2-3周龄植物)中的能力。进行两个实验，两者均利用使用手动施加制剂进行的1步递送方法。在两个实验中，基础制剂均含有4mM MES和4mg/mldsRNAGFP触发剂。脂酶以粉末形式从Sigma获得，并且再混悬于1xPBS中。最终酶浓度在约20U/ml至约2283U/ml的范围内。在这个实验中，每个处理测试6个植物。表13概述浓度和由测试获得的结果。
表13.用于将dsRNA递送至本赛姆氏烟草中的制剂研究中使用的脂酶和观察结果
在用来自黑曲霉(5/6植物具有GFP沉默表型)、米根霉和爪哇毛霉(在两种情况下均观察到4/6植物具有沉默表型)的脂酶制剂处理的植物中观察到强力作用。
在第二递送实验中，脂酶在制剂中的浓度加倍(2x/处理)，并且进一步考查表13中所列的一子组脂酶的递送能力。在这个实验中，每个处理测试3个植物。这些处理的结果概述于表14中。
表14.用含有来自不同微生物的脂酶和dsRNA的制剂处理本赛姆氏烟草的结果。
用来自米根霉和爪哇毛霉的脂酶在400U/ml下处理显示使3/3测试植物中GFP表达沉默。
实施例10.基于水的含有脂酶和dsRNA的液体制剂足以抑制转基因的表达。
在这个实施例中，用如表15中所述的在水基质中含有不同或浓度和靶向GFP的dsRNA的制剂局部处理幼小本赛姆氏烟草16C幼苗(2-3周龄植物)。使用1步施加方案将制剂施加于2个最幼小出现叶的顶端区域。对于各酶浓度，处理3个植物。
表15：本赛姆氏烟草16C幼苗中使用的基于水的制剂组成和结果
对于各测试酶浓度，用酶处理导致3/3植物具有抑制表型。
实施例11.表达角质酶、脂酶和/或植物细胞壁水解酶的微生物溶解产物和dsRNA触发剂足以抑制转基因或抑制内源性基因的表达。
在这个实施例中，用从表达溶角质(角质酶)和/或溶脂(脂酶)酯酶和/或植物细胞壁水解酶(包括但不限于纤维素酶和果胶酶)的植物病原性或腐生真菌或细菌获得的微生物溶解产物或液体培养液和靶向转基因GFP或内源性MgChl基因的dsRNA局部处理幼小本赛姆氏烟草16C、番茄或拟南芥幼苗(2-3周龄植物)。溶角质(角质酶)和/或溶脂(脂酶)酯酶和/或植物细胞壁水解酶可由植物病原性或腐生真菌或细菌天然表达，或可从转基因表达。细菌溶解产物或液体培养液的实例包括但不限于从灰葡萄孢获得的溶解产物或液体培养液。可向溶解产物或液体培养液中添加以下中的一者或多者：渗透调节物质，诸如甘露糖醇和/或甘油；缓冲剂，诸如MES、PBS和/或Tris-HCl；核糖核酸酶抑制剂，诸如Zn2SO4和/或和表面活性剂，诸如L77、TritonTM X-100和/或壬酸。
用含有水解酶的溶解产物或液体培养液处理在大多数测试植物中产生抑制表型，从而指示微生物溶解产物或液体培养液中提供的水解酶在将dsRNA递送至植物中方面是有效的。
实施例12.通过与生物表面活性剂和脂酶一起施加制剂中的dsRNA多核苷酸达成的基因抑制
在这个实施例中，与或酶一起用靶向转基因GFP或内源性MgChl基因的dsRNA局部处理幼小本赛姆氏烟草16C、番茄或拟南芥幼苗(2-3周龄植物)，所述dsRNA处于如下表16中所述的含有不同生物表面活性剂的基础制剂中。
表16：本赛姆氏烟草16C、番茄和拟南芥幼苗中使用的包含生物表面活性剂的组成
用含生物表面活性剂以及和/或的制剂处理在大多数处理植物中产生抑制表型。
实施例13.基因抑制通过在具有脂酶的制剂中添加特定渗透调节物质而增强。
在这个实施例中，与或不与酶一起用靶向转基因GFP的dsRNA局部处理幼小本赛姆氏烟草16C幼苗(2-3周龄植物)，所述dsRNA处于如下表17中所述的含有不同渗透调节物质的基础制剂中。对于各处理，使用的多核苷酸是在2μg/μL的浓度下的GFP dsRNA(124bp)。使用1步施加方案将制剂施加于2个最幼小出现叶的顶端区域。对于各渗透调节物质，处理3个植物。观察植物的抑制表型显现。所有叶都在施加后10天从植物收集，并且使用Image J图像分析软件(用于科学图像分析的开放平台，可在fiji.sc/Downloads#Fiji处获得)对抑制百分比定量。这个方法将褪色面积(代表沉默量)定量为相较于总叶面积的百分比。
表17：与一起用于本赛姆氏烟草16C中的包含渗透调节物质的组成
结果指示尽管多种渗透调节物质对GFP抑制具有一定影响，但山梨糖醇本身对GFP抑制具有最强烈影响。
实施例14.用含有最少80mM山梨糖醇和脂酶的制剂实现基因抑制。
在这个实施例中，在PBS(pH 7.0)缓冲液中透析酶，并且测定蛋白质浓度。在透析之后，溶液中的酶浓度被测定为是初始商业储备物的浓度的约1/3。接着将经透析在等效于1,500-4,500U/mL的商业酶的体积下添加至基础制剂中以虑及在透析期间的稀释。另外，测定商业中的山梨糖醇的浓度是约2400mM，并且在透析之后仅有约3.86mM山梨糖醇存在。与酶一起或与经透析一起用靶向转基因GFP的dsRNA局部处理幼小本赛姆氏烟草16C幼苗(2-3周龄植物)，所述dsRNA处于如下表18中所述的含有不同浓度的渗透调节物质山梨糖醇的基础制剂中。对于各处理，使用的多核苷酸是在2μg/μL的浓度下的GFP dsRNA(124bp dsRNA)。所有制剂都处于pH 5.7MES缓冲液中。使用1步施加方案将制剂施加于2个最幼小出现叶的顶端区域。对于各山梨糖醇浓度，处理3个植物。在局部处理之后10天，从各处理植物收集处于同等阶段的叶，并且如实施例13中所述对相较于总叶面积的GFP抑制百分比定量。
表18.具有或不具有Palatase酶的包含山梨糖醇的组成和结果
在用仅山梨糖醇而无酶处理的植物中观察到抑制。然而，当将至少80mM山梨糖醇和的组合施加于植物时观察到最一致的抑制(所有植物都展现抑制)。最有效用于基因抑制的组合似乎是3000U/mL添加100mM山梨糖醇。将实验再重复3次，获得类似结果。
实施例15.非离子聚山梨醇酯表面活性剂Tween-80使基于的局部施加的活性增强。
在这个实施例中，与或不与表面活性剂和乳化剂掺合物一起以及与或不与如实施例14中所述的经透析一起用靶向GFP的dsRNA多核苷酸触发剂(124bp dsRNA触发剂)局部处理幼小本赛姆氏烟草16C植物(2-3周)，所述dsRNA多核苷酸触发剂处于含有渗透调节物质的制剂中。使用的表面活性剂:乳化剂是Tween 80:Span 80(两者均来自Croda,Industrial Chemicals,USA)。使用1步方案施加制剂。实验和结果描述于表19中。
表19.具有或不具有经透析Palatase酶的包含Tween80:Span80的组成
结果指示可使用具有80mM山梨糖醇、Tween80和经透析商业酶的基本制剂(minimal formulation)实现抑制。类似地，在80mM山梨糖醇存在下，以及添加经透析表面活性剂:乳化剂的组合有效产生抑制表型。
实施例16.通过施加dsRNA多核苷酸触发剂来对除草基因靶标的基因抑制。
在这个实施例中，与商业酶一起用针对除草剂靶标基因的dsRNA多核苷酸触发剂局部处理幼小本赛姆氏烟草16C植物(2-3周)，所述dsRNA多核苷酸触发剂处于如下表20中所述的含有渗透调节物质的基础制剂中。测试的表面活性剂是Tween-80(Croda)或SP131或SP133(两者均来自Evonik)。测试的dsRNA多核苷酸靶向植物生物合成路径中的必需基因。靶向3个全都来自本赛姆氏烟草的单独基因：1.)甘氨酸脱羧酶(N.b.LDH1；150bp dsRNA触发剂)，2.)20s蛋白酶(N.b.20sProt；153bpdsRNA触发剂)，和3.)纤维素合成酶(N.b.CesA1；148bp dsRNA触发剂)。将靶向必需基因的dsRNA个别地或以组合形式施加，如表21中所概述。使用1步方案施加制剂。观察植物的表型显现。结果概述于表21的第三列中。
表20：用于对本赛姆氏烟草16C幼苗局部施加的包含除草剂靶标的组成。
表21.必需基因靶标的局部施加和结果
向基础制剂中的所有表面活性剂添加都导致植物总叶面积显著降低，其中SP131和SP133表面活性剂略微更加有效。当施加靶向植物必需基因的不同dsRNA的组合时观察到对叶面积降低的作用得以改进。
实施例17：通过使脂酶与脱水山梨糖醇脂肪酸酯或非离子聚山梨醇酯脂肪酸酯表面活性剂一起预孵育来在有机硅酮表面活性剂存在下达成的基因抑制。
在这个实施例中，用靶向GFP的中聚体dsRNA多核苷酸触发剂(124bp)局部处理本赛姆氏烟草16C植物(2-3周)。在室温下在表22中所列的组分存在下预孵育商业储备物1小时。在这个预孵育步骤之后，向具有4mM MES(pH＝5.7)、4mg.ml-1 dsRNA触发剂，以及具有在表22上所列的浓度下的有机硅酮超级散布表面活性剂Silwet L77或Break-through S210(BT-S210)的基础制剂中添加商业或预孵育储备物直至2,500U.ml-1的浓度。无酶的对照制剂含有250mM山梨糖醇。使用手持式气刷喷雾器在20PSI压力下在离叶约10cm的距离处，将总体积300μL的制剂施加于每个处理3个幼苗的叶的近轴表面和远轴表面。在处理之后10天在蓝光下使植物成像，并且将结果报道为显示GFP沉默表型的相对叶面积(％GFP)。
表22：Palatase预孵育和基础制剂组成以及报道为具有GFP沉默表型的相对叶面积(％)的功效
在0.1％和0.55％的表面活性剂BT-S210存在下观察到最有效抑制。
在一单独实验中，用靶向GFP的中聚体dsRNA多核苷酸触发剂(124bp)局部处理本赛姆氏烟草16C植物(2-3周)。在室温下在表23上所列的组分存在下预孵育商业储备物(C-PAL)或经透析商业储备物(D-PAL)1h。接着，向具有4mM MES(pH＝5.7)、3mg.ml-1dsRNA触发剂和0.3％的有机硅酮超级散布表面活性剂Silwet L77的基础制剂中添加商业或预孵育储备物直至2,500U.ml-1的浓度(表2)。将D-PAL在等效于3,500或7,500U.ml-1的C-PAL的体积下添加至相同基础制剂中以虑及在透析过程期间的脂酶浓度稀释(表23)。无酶的对照制剂具有250mM山梨糖醇。无的预孵育混合物所对应的对照制剂接受与用预孵育C-PAL进行的处理相等体积的预孵育混合物。使用手持式气刷喷雾器在20PSI压力下在离幼苗叶约10cm的距离处，将总计500μL的制剂施加于每个处理3个幼苗的叶的近轴表面和远轴表面。在处理之后10天在蓝光下使植物成像，并且将结果报道为显示GFP沉默表型的相对叶面积(％GFP)。
表23：Palatase预孵育和基础制剂组成以及报道为具有GFP沉默表型的相对叶面积(％)的功效
向商业酶或经透析酶中添加0.1％提供最佳抑制作用。
实施例18：基因抑制由含有黄原胶和真菌磷酸脂酶A1的制剂增强
在这个实施例中，用2种中聚体dsRNA多核苷酸触发剂局部处理本赛姆氏烟草16C植物(2-3周龄)，一种靶向GFP，并且另一种靶向内源性镁螯合酶(MgChl)基因。除表24中详述的组分之外，用于递送这种触发剂混合物的所有制剂也都含有4mM MES缓冲剂(pH＝5.7)和1mM内体释放剂Retro-2(Sigma)。包括在这些制剂中的所用脂酶包括可商购获得的(C-PAL)、脂酶G(AL-G)、疏绵状嗜热丝孢菌磷酸脂酶A1(Tl-PLA1)和硅藻土固定化的脂酶PS(iAL-PS，来自洋葱伯克霍尔德菌)。商业黄原胶(XG)在0％至0.2％的范围内的浓度下使用。使用手持式气刷喷雾器在20PSI压力下在离幼苗叶约10cm的距离处，将总计400μl制剂施加于每个处理4个幼苗。在处理之后11天在蓝光和白光下使植物成像。
表24.制剂组成和报道为显示MgChl或GFP沉默表型的相对叶面积％的功效
在含有0.2％黄原胶的制剂的情况下观察到最有效抑制。除黄原胶之外，含有与硅藻土固定化的脂酶PS(iAL-PS，来自洋葱伯克霍尔德菌)联合使用的疏绵状嗜热丝孢菌磷酸脂酶A1(Tl-PLA1)的制剂提供抑制。
实施例19：基因抑制由含有磷酸脂酶A1或磷酸脂酶A1和脂酶的混合物的制剂增强
在这个实施例中，用2种中聚体dsRNA多核苷酸触发剂的组合局部处理本赛姆氏烟草16C植物(2-3周龄幼苗)，一种靶向GFP，并且另一种靶向内源性镁螯合酶(MgChl)基因。除表25上详述的组分之外，用于递送这种触发剂混合物的所有制剂都含有4mM MES缓冲剂(pH＝5.7)、10mg.ml-1固定化的Amano脂酶PS和0.15％黄原胶。所用脂酶包括可商购获得的在550u.ml-1下的疏绵状嗜热丝孢菌磷酸脂酶A1和经PBS缓冲液透析的商业储备物(D-PAL，1X＝0.137mg总蛋白.ml-1)。使用手持式气刷喷雾器在20PSI压力下在离幼苗叶约10cm的距离处，将总计400μl制剂施加于每个处理4个幼苗。在处理之后11天在蓝光和白光下使植物成像。
表25：制剂组成和报道为显示MgChl或GFP沉默表型的相对叶面积％的功效
平均来说，包括磷酸脂酶A1或脂酶和磷酸脂酶A1的混合物的处理(酶加渗透调节物质)显示GFP和MgChl的叶面积沉默是仅含有等效水平的渗透调节物质的制剂的分别3.9倍和5.5倍大。
实施例20：与脂酶一起使用液体制剂将dsRNA递送至长芒苋(Amaranthuspalmeri)植物中。
在这个实施例中，用在由150mM脯氨酸、4mM MES(pH 5.7)或50mM蔗糖、4mM MES(pH5.7)组成的缓冲溶液中含有靶向镁螯合酶(MgChl)的短dsRNA或作为阴性对照的靶向GFP的dsRNA的制剂处理幼小长芒苋或繁穗苋(Amarnthus cruentus)植物(2-3周龄植物)。额外组分是来自含有>100,000U/ml100,000U/g储备物(Sigma L0777)的510U/mLlipolase、具有来自黄单胞菌(Xanthomonas campestris)的0.75％黄原胶(Sigma G1253)的50mg/ml Amano脂酶PS-IM(固定在硅藻土上)(Aldrich 709603)、和表面活性剂(含0.75％脱水山梨糖醇单棕榈酸酯(Aldrich 388920)的0.375％F127F-127Sigma2443)和0.25％)或0.04％Silwet L-77，如下表26中所说明。
表26.施加于幼小处理植物的制剂和递送方法。各处理由4个植物组成。
使用1步法将制剂施加于植物叶，借此将组分首先混合在一起，孵育1小时，接着喷洒于各植物的2个叶和顶端分生组织上。用美术刷式重力馈料喷雾器在20psi下将200ul喷洒于4个植物上。当喷洒时将气刷固持在叶表面上方约1至2cm处。
第二递送方法采用2步，其中用吸移器将制剂温和滴于叶上。用吸移器尖端的侧面在叶的顶部上温和散布制剂，使其干燥，接着用涂布有360目碳化硅粒子的棉拭温和磨蚀叶的表面。在这个方法中，将10ul制剂施加于4个植物各自的叶3和4以及分生组织。
表27.施加于苋植物的制剂的组成
在处理之后1、2、5和7天(DAT)观察植物的表型显现。在2步施加方法的情况下，早在1DAT就可见MgChl表达的抑制，如由在白光下在绿色叶绿素中显示的黄色斑点所证实。在2DAT，在用相应触发剂处理的2步和1步植物上，MgChl抑制是易于可见的。在处理之后任一天，在用GFP触发剂处理的任何植物上都不存在发黄。表28概述在处理的植物中观察到的局部化MgChl抑制。
表28.对苋属物种中MgChl表达的抑制
用2步施加方法处理的植物显现早在1DAT就勉强可见的局部化抑制症状。在两种施加方法的情况下在2DAT均明确观察到MgChl抑制。基于展现局部化MgChl抑制的植物的数目、所述抑制的更早可见性和更强烈抑制作用，似乎2步施加方法倾向于更有效地将多核苷酸递送至植物细胞中以引发抑制。
实施例21.酶辅助递送和粒子辅助递送的组合有效将dsRNA递送至长芒苋植物中。
在这个实施例中，用靶向镁螯合酶(MgChl)基因序列的dsRNA多核苷酸(长度是54bp)处理幼小长芒苋植物(3-4周龄)，并且观察植物的指示基因抑制的褪绿表型的显现。以16小时日长方案使植物在保持在25℃下的生长室中增殖。用含有酶的液体制剂或通过对植物远轴表面进行磨蚀(被称为粒子辅助递送(PAD)的方法)来处理植物。对于PAD递送方法，将2.5mg/mL dsRNA于具有20mg/mL 1:1 Celite 512和360砂砾碳化硅粒子(C512/360SiC)混合物的混合物中的喷雾混悬液施加于植物。类似地，将两种递送方法组合成所谓酶-粒子辅助递送(e-PAD)。在PAD方法与e-PAD方法两者中，喷雾混悬浆液均处于含有4mM MES(pH 5.7)的基础制剂中。另外，将渗透调节物质甘露糖醇或山梨糖醇添加至dsRNA溶液中，所述dsRNA溶液处于含有Silwet L-77(0.1％vol/vol)或Tween 80(0.75％vol/vol)的基础溶液中，如表29中所概述。在处理之后7天对结果评分。将实验重复5次。
表29.用于长芒苋中的包含dsRNA、渗透调节物质、表面活性剂和酶-粒子混合物的施加物的组成和结果。
甘露糖醇或山梨糖醇和粒子辅助递送(PAD)的组合就观察的叶褪绿而言产生最佳响应。更高剂量的Palatase似乎在症状显现方面不更加有效。相比于Silwet L-77，Tween80表面活性剂似乎在实现症状方面具有略微更好倾向。
实施例22.使用氧化铝粒子进行的颗粒辅助触发多核苷酸递送
这个实施例说明适用于将核酸递送至植物或植物的细胞或组织中的方法、装置和组合物的非限制性实施方案。更具体来说，这个实施例描述通过颗粒辅助将诸如RNA“触发剂”或沉默元件的核酸递送至植物中的方式来使靶标基因沉默。方法大体上涉及用磨蚀剂或颗粒以及用核酸处理植物的表面(或植物细胞或组织)。
在这个实施例中，具有50、78、124和249个碱基对(bp)，并且靶向绿色荧光蛋白(GFP)的四种dsRNA“触发剂”(沉默元件)用于使表达GFP的转基因本赛姆氏烟草株系(16c)中的GFP基因沉默。对于各触发剂，将420微克总RNA溶解于210微升中；移除10微升供稍后分析，并且在15毫升培养管中将剩余200微升添加至200毫克氧化铝(约220目)粒子中。在37摄氏度下将制剂孵育过夜，接着脱盖在250rpm下离心。添加1毫升100％乙醇以将RNA涂布的氧化铝粒子转移至称重托盘中；通过吸移器移除过量液体，并且使粒子风干。将干燥粒子的各制剂装载至气刷的腔室中，并且在45-65磅/平方英寸(psi)下喷洒于6个植物各自的单个叶上。在用124bp dsRNA触发剂喷洒的6个植物中的3个中，而非在用50或78bp dsRNA触发剂处理的植物中，观察到处理叶中的局部沉默。在用249bp dsRNA触发剂处理的植物中未观察到沉默，但基于随后触发剂品质分析，不考虑这些结果。在这个实验中未观察到系统性GFP沉默(在处理叶的外部)。
实施例23.使用氧化铝粒子进行的颗粒辅助的触发多核苷酸递送
这个实施例说明适用于将核酸递送至植物或植物的细胞或组织中的方法、装置和组合物的非限制性实施方案。更具体来说，这个实施例描述通过颗粒辅助将诸如RNA“触发剂”或沉默元件的核酸递送至植物中的方式来使靶标基因沉默。
在另一实施例中，在6孔板中将含1500微克dsRNA触发剂的1毫升水添加至200毫克氧化铝(320目(20.1–23.1微米)或400目(15.5–17.5微米))中，并且在室温下在振荡器(150rpm)上孵育过夜。添加1毫升100％乙醇以将RNA涂布的氧化铝粒子转移至称重托盘中；通过吸移器移除过量液体，并且使粒子风干。将干燥粒子的各制剂装载至气刷的腔室中，并且在55磅/平方英寸(psi)下喷洒于9个转基因本赛姆氏烟草16c植物的叶上。结果提供于表30中。在几乎所有用GFP dsRNA触发剂处理的植物中都观察到处理叶中的局部沉默，其中在用GFP/PDS融合dsRNA触发剂(其在它的3’末端含有GFPdsRNA触发剂的完整序列)处理的植物中观察到的GFP沉默效率较低。相比于较小粒子(400目)，较大粒度(320目)提供更好沉默效率。在这个实验中未观察到系统性GFP沉默(在处理叶的外部)。
表30
实施例24.通过使用氧化铝或碳化硅粒子进行颗粒辅助的核酸递送达成的系统性靶标基因沉默
这个实施例说明适用于将核酸递送至植物或植物的细胞或组织中的方法、装置和组合物的非限制性实施方案。更具体来说，这个实施例描述通过颗粒辅助将诸如RNA“触发剂”或沉默元件的核酸递送至植物中的方式来使靶标基因系统性沉默。
在另一实施例中，将1.5毫克总RNA(124bp dsRNA)涂布于氧化铝或碳化硅粒子上，并且使用气刷喷雾器(65psi)施加于9个2至3周龄转基因本赛姆氏烟草16c植物上。在处理之后17天记录表型。将仅在喷洒叶上显示GFP沉默(在紫外光下红色斑点/区段)的植物评分为显示局部沉默。将另外在植物的除喷洒叶以外的部分中显示GFP沉默(在紫外光下红色斑点/区段)的植物评分为显示系统性沉默；在这个实验中，系统性沉默以维管结构相关的GFP沉默样式在新生长叶中被观察到。结果提供于表31中。
表31
实施例25.通过使用碳化硅粒子进行颗粒辅助的核酸递送达成的系统性靶标基因沉默
这个实施例说明适用于将核酸递送至植物或植物的细胞或组织中的方法、装置和组合物的非限制性实施方案。更具体来说，这个实施例描述通过颗粒辅助将诸如RNA“触发剂”或沉默元件的核酸递送至植物中的方式来使靶标基因系统性沉默。
在另一实施例中，比较被设计以使GFP沉默的不同RNA触发剂。若干触发剂是钝端dsRNA；一种触发剂是被设计以进行自身杂交且被加工以产生靶向GFP的成熟miRNA的单链miRNA前体转录物。对于各RNA触发剂，将1.5毫克总RNA涂布于SiC粒子上。将各个别RNA触发剂溶解于水中以构成1毫升，在6孔板的孔中添加至200毫克SiC(320目)中。将板放置在通风橱中以在温和振荡下风干。在板完全干燥之后，添加100％乙醇以将RNA涂布的SiC粒子转移至称重托盘中；通过吸移器移除过量液体，并且使粒子风干过夜。将干燥的RNA涂布粒子转移至2毫升微量离心管中，在管中短暂研磨，并且使用气刷喷雾器(60psi)施加于9个3周龄转基因本赛姆氏烟草16c植物上。在处理之后4–5天开始观察局部沉默。在处理之后9天(对于局部沉默)和19天(对于系统性沉默)记录表型。在这个实验中，系统性沉默再次以维管结构相关的GFP沉默样式在新生长叶中被观察到。结果提供于表32中。
表32
实施例26.颗粒辅助的DNA病毒载体递送
这个实施例说明适用于将核酸递送至植物或植物的细胞或组织中的方法、装置和组合物的非限制性实施方案。更具体来说，这个实施例描述通过颗粒辅助将诸如DNA病毒载体的核酸递送至植物中的方式来使靶标基因系统性沉默。
病毒载体用于使处理的植物中的绿色荧光蛋白(GFP)转基因或内源性八氢番茄红素(phytoene)去饱和酶(PDS)靶标基因沉默。使靶向PDS的质粒A1或靶向GFP的质粒A2与质粒B(含ToGMoV DNA-B的pUC19载体)组合以产生VIGS系统。在600微升水中将250微克质粒A1或质粒A2添加至250微克质粒B中。在6孔板的孔中将DNA混合物各自添加至150毫克氧化铝粒子(400目或600目)中，并且在室温下在通风橱中在振荡器(150rpm)上孵育过夜以进行风干。在板完全干燥之后，添加1毫升70％乙醇以将RNA涂布的氧化铝粒子转移至称重托盘中；通过吸移器移除过量液体，并且使粒子风干。使用气刷喷雾器(55psi)将干燥的DNA涂布粒子的各制剂施加于6个转基因本赛姆氏烟草16c植物上。结果显示于表33中。结果证明粒子辅助的病毒载体递送导致在完整植物中表达的转基因或内源性基因的系统性沉默。这个技术适用于其它应用中，诸如适用于病毒抗性测定中，因为方法不涉及土壤杆菌(Agrobacterium)介导的感染。
表33
实施例27.通过对植物表面进行磨蚀达成的系统性靶标基因沉默
这个实施例说明适用于将核酸递送至植物或植物的细胞或组织中的方法、装置和组合物的非限制性实施方案。更具体来说，这个实施例描述通过用颗粒对植物表面进行磨蚀以破坏角质层或表皮，由此将诸如RNA“触发剂”或沉默元件的核酸递送至植物中的方式来使靶标基因系统性沉默。
双链RNA用作为荧光标记的Cy3标记，并且涂布于SiC粒子(320目)上，接着将所述粒子喷洒于叶上。在处理之后1天，用共焦荧光显微术使叶成像。获得的图像显示荧光标记的粒子位于通过粒子撞击在叶表皮深处的一些层次所形成的“凹坑”的底部，并且表明尽管大多数荧光仍然与粒子相伴，但一些荧光扩散至邻近未受损害细胞中。图像表明粒子上的核酸不以在使用小得多的粒子进行基因枪递送的情况下所见的方式直接递送至细胞中，而是采用相对低压递送，通过扩散至邻近于此处所用的较大粒子的细胞中达成递送至细胞中。
实施例28.在气刷喷嘴与植物表面之间的不同距离的比较
这个实施例说明适用于将核酸递送至植物或植物的细胞或组织中的方法、装置和组合物的非限制性实施方案。更具体来说，这个实施例描述通过颗粒辅助将诸如RNA“触发剂”或沉默元件的核酸递送至植物中的方式来使靶标基因系统性沉默。
这个实验将在气刷喷嘴与植物表面之间的不同距离进行比较。将1.5毫克靶向GFP的钝端dsRNA涂布于100毫克碳化硅(360目)上，并且风干过夜。在干燥之后，将混合物研磨以使粒子单个化，并且装载至固定于环架的G78气刷中。在3、5和7厘米喷嘴至叶距离处，以3次1秒喷发来对各转基因本赛姆氏烟草16c植物进行喷洒。在处理之后7天，使用蓝光激发对表型(GFP沉默)进行目视评估。此外，使用qPCR对红色(沉默)和绿色(非沉默)区段中的GFP表达进行定量。结果：3厘米喷洒距离使植物损害，并且导致少许沉默；在5和7厘米喷洒距离处观察到近似等效沉默。qPCR测量结果证明GFP表达与目视表型相关联(图1)。
实施例29.依序施加RNA和颗粒磨蚀剂
这个实施例说明适用于将核酸递送至植物或植物的细胞或组织中的方法、装置和组合物的非限制性实施方案。更具体来说，这个实施例描述通过颗粒辅助将诸如RNA“触发剂”或沉默元件的核酸递送至植物中的方式来使靶标基因系统性沉默。
进行用以测试依序施加RNA和颗粒磨蚀剂的实验。将靶向GFP的钝端dsRNA在1、5和10毫克/毫升下溶解于水中，其中添加硅酮表面活性剂(0.1％Silwet L77)以帮助在叶表面上散布。将20微升RNA溶液施加于转基因本赛姆氏烟草16c植物的3个叶，并且使其短暂干燥。使用固定于环架的G78气刷在离植物5厘米的喷嘴至叶距离处在60psi下将干燥未涂布碳化硅(360目)粒子喷洒于RNA涂布的叶上。在处理之后7天，使用蓝光激发对GFP沉默进行目视评估。叶损害阻碍对dsRNA比率数据的全面解释，但使用这个依序方法观察到GFP沉默，其中将RNA施加于植物的表面继之以用尺寸大于约2.5微米的颗粒对植物的表面进行磨蚀。
实施例30.比较单步施加RNA涂布的颗粒和两步依序施加的沉默效率
这个实施例说明适用于将核酸递送至植物或植物的细胞或组织中的方法、装置和组合物的非限制性实施方案。更具体来说，这个实施例描述通过颗粒辅助将诸如RNA“触发剂”或沉默元件的核酸递送至植物中的方式来使靶标基因系统性沉默。
这个实验比较单步施加RNA涂布的颗粒和两步依序施加的沉默效率。也考查甘露糖醇和表面活性剂的影响。
对于单步施加干燥的RNA涂布颗粒，将1.5毫克靶向GUS的钝端dsRNA触发剂或靶向GFP的钝端dsRNA触发剂溶解于水或200毫摩尔的甘露糖醇中。将100毫克SiC粒子(360目)添加至RNA溶液中，并且将混合物风干过夜。使用固定于环架的G78气刷在离植物5厘米的喷嘴至叶距离处在60psi下以3次1秒喷发将干燥的RNA涂布粒子喷洒于转基因本赛姆氏烟草16c植物的叶上。对于两步依序施加，将dsRNA触发剂溶解于水中，具有或不具有0.2％SilwetL77，以及具有或不具有200毫摩尔甘露糖醇。将20微升RNA溶液施加于转基因本赛姆氏烟草16c植物的3个叶中的每一个，并且使其短暂干燥。使用固定于环架的G78气刷在离植物5厘米的喷嘴至叶距离处在60psi下将干燥未涂布碳化硅(360目)粒子喷洒于RNA涂布的叶上。在处理之后7天，使用蓝光激发对GFP沉默进行目视评估。发现干燥涂布粒子和依序施加的沉默出现率近似相同。添加甘露糖醇在单步施加干燥的RNA涂布粒子时不具有影响，但由于叶损害明显降低而对两步依序施加具有正面影响。
实施例31.比较不同颗粒磨蚀剂在两步依序施加方法中的沉默效率
这个实施例说明适用于将核酸递送至植物或植物的细胞或组织中的方法、装置和组合物的非限制性实施方案。更具体来说，这个实施例描述通过颗粒辅助将诸如RNA“触发剂”或沉默元件的核酸递送至植物中的方式来使靶标基因系统性沉默。
这个实验比较不同颗粒磨蚀剂在两步依序施加方法中的沉默效率，其中将RNA施加于植物的表面继之以用尺寸大于约2.5微米的颗粒对植物的表面进行磨蚀。
测试的颗粒磨蚀剂包括具有各种尺寸范围的碳化硅(SiC，有棱角)、氧化铝(Al2O3，有棱角)、钠钙玻璃(“SLG”，圆形)和硅藻土(diatomaceous silica)(“硅藻土(diatomaceous earth)”、“DE”，有棱角)粒子。适用于本文公开的方法和组合物中的颗粒磨蚀剂的非限制性实例提供于下表34中。
表34
将靶向GFP或镁螯合酶的钝端dsRNA触发剂于含有0.05％Silwet L77的200毫摩尔甘露糖醇中稀释至5毫克/毫升。使用吸移器将15微升RNA溶液手动施加于转基因本赛姆氏烟草16c植物的2个叶上，并且使其短暂干燥。使用固定于环架的G78气刷在离植物7厘米的喷嘴至叶距离处在60psi下以3次1秒喷发将干燥未涂布粒子喷洒于RNA涂布的叶上。在处理之后7天，使用蓝光激发对GFP沉默进行目视评估。比较不同颗粒的目视沉默功效的结果描绘于图2中。在这个实验中的条件下，具有最低叶损害的最大沉默通常由使用尺寸是约10至约25微米的粒子所致。使用更大粒子也导致GFP沉默，但也导致更重的叶损害。使用更小粒子导致较小沉默和较小叶损害。颗粒形状(有棱角或圆形)对沉默效率具有少许影响。密度似乎是一个重要因素，因为在作为最小密度测试粒子的硅藻土的情况下观察到少许沉默。
实施例32.比较单步施加方法和两步施加方法的沉默效率
这个实施例说明适用于将核酸递送至植物或植物的细胞或组织中的方法、装置和组合物的非限制性实施方案。更具体来说，这个实施例描述通过颗粒辅助将诸如RNA“触发剂”或沉默元件的核酸递送至植物中的方式来使靶标基因系统性沉默。
这个实验比较单步施加RNA涂布的颗粒和两步依序施加的沉默效率。也比较124bpdsRNA触发剂的GFP沉默功效和22bp dsRNA触发剂的GFP沉默功效。
在单步法中，将dsRNA触发剂于水中稀释，并且添加至200毫克SiC(400目)中，在温和搅拌下风干过夜，温和研磨，并且经由270目加以筛分。将30微升具有0.05％Silwet L77、200毫摩尔甘露糖醇的水溶液手动施加于转基因本赛姆氏烟草16c植物的顶部2个展开叶和末端叶；使用固定于环架的G78气刷在离植物7厘米的喷嘴至叶距离处在60psi下以3次1秒喷发将干燥的dsRNA涂布粒子喷洒于Silwet L77/甘露糖醇涂布的叶上。为估计递送的dsRNA的量，将3次1秒喷发的干燥的dsRNA涂布粒子喷洒至离心管中的100微升水中，接着将离心管涡旋，并且通过UV光谱测定法来估计dsRNA浓度。
在两步法中，将dsRNA触发剂于水中稀释。将Silwet L77和甘露糖醇添加至dsRNA溶液中以分别达到0.05％和200毫摩尔的最终浓度。将30微升dsRNA溶液手动施加于转基因本赛姆氏烟草16c植物的顶部2个展开叶和末端叶；使处理的叶风干10分钟。使用固定于环架的G78气刷在离植物7厘米的喷嘴至叶距离处在60psi下以3次1秒喷发将SiC(400目)粒子喷洒于Silwet L77/甘露糖醇涂布的叶上。
在处理之后7天，使用蓝光激发对GFP沉默进行目视评估。在这个实验中，单步施加方法和两步施加方法的GFP沉默效率似乎是类似的，并且，尽管基于质量，22bp dsRNA触发剂比124bp dsRNA触发剂更高效，但当基于摩尔比较时，效率是类似的。
实施例33.比较各种单步施加方法和两步施加方法的沉默效率
这个实施例说明适用于将核酸递送至植物或植物的细胞或组织中的方法、装置和组合物的非限制性实施方案。更具体来说，这个实施例描述通过颗粒辅助将诸如RNA“触发剂”或沉默元件的核酸递送至植物中的方式来使靶标基因系统性沉默。
这个实验比较单步施加RNA涂布的颗粒、两步依序施加、在无颗粒下单步高压喷洒施加RNA、以及单步高压喷洒施加RNA/颗粒混悬液的沉默效率。使用装配在履带式喷雾器中的商业喷洒尖端。
将靶向GFP或镁螯合酶的钝端dsRNA触发剂于含有0.05％Silwet L77的200毫摩尔甘露糖醇中稀释至5毫克/毫升。对于RNA/颗粒混悬液，将硅藻土(Celite 512)或SiC(360目)在20毫克/毫升下添加至以上RNA溶液中。使用离植物7厘米加以定位的配备有TeeJet40005E平扇形喷嘴的罐式喷雾器在60或85psi下将RNA制剂喷洒于转基因本赛姆氏烟草16c植物上。用干燥未涂布粒子对在60psi下喷洒的植物进行第二次喷洒，所述粒子用配备有TeeJet DG110015喷嘴的罐式喷雾器离植物10厘米在80psi下施加。在处理之后7天，使用蓝光激发对GFP沉默进行目视评估。在仅用RNA溶液(无颗粒)喷洒的植物中，沉默效率极低。使用RNA/Celite或RNA/SiC混悬液，观察到GFP与镁螯合酶两者的沉默；对于GFP，沉默功效小于由两步依序施加所致的沉默功效，但对于镁螯合酶，沉默功效是类似的。这些结果指示单步施加RNA/颗粒混悬液是有效的，并且可有利地与商业喷洒设备一起使用。
实施例34.通过颗粒辅助将核酸递送至玉米中来使靶标基因系统性沉默
这个实施例说明适用于将核酸递送至植物或植物的细胞或组织中的方法、装置和组合物的非限制性实施方案。更具体来说，这个实施例描述通过颗粒辅助将RNA“触发剂”递送至玉米植物中的方式来使靶标基因系统性沉默。
这个实验显示使玉米(玉米(Zea mays))中的GFP转基因沉默。将靶向GFP的121bpdsRNA于含有0.05％Silwet L77的水中稀释至5毫克/毫升。将30微升RNA溶液施加于单个玉米(玉米(Zea mays))叶，并且使其短暂干燥。使用固定于环架的G78气刷离植物5厘米在60psi下将干燥未涂布碳化硅粒子(280、320、360和400目)喷洒在dsRNA涂布的叶上。在处理之后7天，使用蓝光激发对GFP沉默进行目视评估。在用280、320和360目SiC喷洒的植物中观察到GFP沉默。沉默区段显现为长条纹(在一个用360目SiC处理的植物中)或多个小斑点(在两个分别用280和320目SiC处理的植物中)。对叶中的沉默区段和非沉默区段取样，并且测量GFP表达。观察到相较于非沉默区段，在沉默区段中，在两种沉默区段类型(条纹和斑点)的情况下，GFP表达均降低约30至约50％。
实施例35.使用棉拭作为用以负载磨蚀剂的基体进行的颗粒辅助的核酸递送
这个实施例说明适用于将核酸递送至植物或植物的细胞或组织中的方法、装置和组合物的非限制性实施方案。更具体来说，这个实施例描述通过包括使植物表面与负载磨蚀剂的基体接触的各种方法来使靶标基因系统性沉默。在这些实验中，负载未涂布或涂布有dsRNA触发剂的颗粒磨蚀剂的棉拭用于对植物表面进行磨蚀以及将dsRNA触发剂递送至植物中。
在第一实验中，通过混合每1毫升制剂100毫克碳化硅(360目)粒子来制备干燥的dsRNA涂布粒子，所述制剂在a)水，b)4毫摩尔MES缓冲液，c)200毫摩尔甘露糖醇，或d)4毫摩尔MES缓冲液和200毫摩尔甘露糖醇中含有1.5毫克/毫升针对GFP的78bp dsRNA。将dsRNA-SiC混合物在旋转振荡器上风干过夜。通过将拭子按压至制备的SiC粒子中来使棉拭装载有干燥的dsRNA涂布的SiC粒子，接着用于通过沿叶表面温和滚动拭子来对约4周龄转基因本赛姆氏烟草16c植物的上部叶表面进行温和磨蚀，其中用操作者的手指从下部对叶进行支撑。在处理之后7天，使用蓝光激发对GFP沉默进行目视评估。在这个实验中，向dsRNA制剂中添加200毫摩尔甘露糖醇防止叶在使用棉拭滚动用dsRNA涂布的SiC粒子进行磨蚀之后脱水。向dsRNA制剂中添加4毫摩尔MES和200毫摩尔甘露糖醇使处理叶中GFP沉默灶的出现率增加。
在第二实验中，通过混合每1毫升在以下触发剂浓度下的dsRNA水溶液100毫克碳化硅(360目)粒子来制备干燥的dsRNA涂布的SiC粒子：a)1.5毫克/毫升针对GFP的78bpdsRNA触发剂，b)1.5毫克/毫升针对本赛姆氏烟草16C镁螯合酶的76bp dsRNA触发剂，和c)各自在0.75毫克/毫升下的两种触发剂的混合物。将dsRNA-SiC混合物在旋转振荡器上风干过夜。通过将拭子按压至制备的SiC粒子中来使棉拭装载有干燥的dsRNA涂布的SiC粒子，接着用于通过沿叶表面温和滚动拭子来对约4周龄转基因本赛姆氏烟草16c植物的上部叶表面进行温和磨蚀，其中用操作者的手指从下部对叶进行支撑。使用气刷将相同的干燥的dsRNA涂布的SiC粒子制剂递送至第二组植物中。在处理之后7天，使用环境光线或蓝光激发对沉默进行目视评估。在这个实验中，在用所有粒子涂布方案和递送方法处理的叶中都观察到GFP和镁螯合酶沉默灶。在用单一dsRNA触发剂处理的植物中观察到预期基因靶标特异性表型，并且在用两种dsRNA触发剂处理的植物中观察到表型共定位。
在第三实验中，在本赛姆氏烟草16C幼苗中测试使用棉拭滚动技术进行的三种不同两步依序递送方法的功效。在这些方法中，在用负载在棉拭上的未涂布颗粒对植物表面进行磨蚀之前将dsRNA触发剂施加于植物表面。
测试的两步依序递送方法是：
(a)方法1：将dsRNA制剂吸移于叶表面上，并且用吸移器尖端进行散布以确保均一覆盖，随后通过滚动携带未涂布SiC粒子的棉拭来进行磨蚀；
(b)方法2：通过滚动携带未涂布SiC粒子的棉拭来对叶进行磨蚀，随后进行dsRNA制剂的吸移递送和散布；和
(c)方法3：首先将棉拭浸没于dsRNA制剂中，接着在未涂布SiC粒子上进行滚动，并且最后在叶表面上温和滚动。
测试针对GFP的78bp dsRNA触发剂的三种液体制剂：2毫克/毫升dsRNA于水中；2毫克/毫升dsRNA于200毫摩尔甘露糖醇和20毫摩尔MES中；以及0.0125毫克/毫升dsRNA于制剂中。对于各处理，对约4周龄转基因本赛姆氏烟草16c植物的每个处理叶施加总计20微升dsRNA制剂(每个处理3个植物)。在处理之后4和7天，使用蓝光激发对沉默进行目视评估。在这个实验中，所有三种递送方法和所有dsRNA制剂都在处理叶中产生GFP沉默灶。通过方法1处理的植物维持正常叶生长，并且每个处理叶显示较高GFP沉默灶出现率。相较于用处于制剂中的0.0125毫克/毫升dsRNA处理的植物，用2毫克/毫升的dsRNA浓度处理的植物中的GFP沉默灶的出现率显著更大。跨越各递送处理类型，添加200毫摩尔甘露糖醇和20毫摩尔MES使GFP沉默灶的出现率增加。
实施例36.使用砂纸进行的颗粒辅助的核酸递送
这个实施例说明适用于将核酸递送至植物或植物的细胞或组织中的方法、装置和组合物的非限制性实施方案。更具体来说，这个实施例描述通过包括使植物表面与负载磨蚀剂的基体接触的各种方法来使靶标基因系统性沉默。在这些实施例中，砂纸充当负载颗粒磨蚀剂的基体，并且用于对植物表面进行磨蚀以及将dsRNA触发剂递送至植物中。
供湿式砂磨的砂纸用于将针对GFP的78bp dsRNA触发剂递送至约3周龄转基因本赛姆氏烟草16c植物中。使用三种不同砂砾尺寸：P180、P600和P2500，其分别具有82、25.8和8.4微米的平均粒度直径。砂纸由3/4英寸直径PVC管支撑以有助于在处理叶的表面上温和滚动。在水中或在0.05％Silwet L77水溶液中在2毫克/毫升的最终浓度下制备dsRNA的制剂。将10或20微升dsRNA制剂吸移于每个植物2个叶的表面上，并且用吸移器尖端进行散布以确保均一覆盖，随后通过在处理叶表面上温和滚动砂纸来磨蚀。为进行比较，仅用dsRNA制剂(无磨蚀)处理额外植物，或用dsRNA制剂处理额外植物，随后用负载SiC粒子(360目)的棉拭进行磨蚀。在处理之后4和7天，使用蓝光激发对沉默进行目视评估。
如下概述结果。在处理的本赛姆氏烟草叶中未观察到叶损害或膨压丧失迹象。在处理之后立刻或在处理之后1天，处理的植物未显示枯萎或严重叶损害的迹象。观察的GFP沉默灶出现率取决于砂纸砂砾尺寸；用600砂纸辊磨蚀的植物比在其它砂纸砂砾尺寸下磨蚀的、用负载未涂布SiC粒子的棉拭磨蚀的植物具有更大GFP沉默灶出现率。在两步依序施加(首先施加dsRNA，随后进行磨蚀)中，发现用砂纸磨蚀在诱导GFP沉默灶方面比用负载未涂布SiC粒子的棉拭磨蚀更高效，而与dsRNA制剂或磨蚀剂处理时机无关。
来自这些实验和类似实验的结果提供进一步推断。当使dsRNA处理叶在磨蚀之前保持1天时，观察到沉默活性在植物中得以保留；当在磨蚀之前持续至少20分钟使dsRNA制剂保持在叶的表面上以干燥时观察到更强烈表型和更频繁GFP沉默灶。用“平”辊进行的产生降低的沉默功效的实验表明叶表面磨蚀而非单独压力是dsRNA递送机理。依序磨蚀方法已显示始终较高功效水平和成功率。在处理之后约10-13天，在不同条件下生长的经砂纸磨蚀的本赛姆氏烟草16C植物中以及在不同位置中观察到系统性GFP沉默，而与使用的dsRNA触发剂尺寸无关。也证明机械磨蚀方法针对包括镁螯合酶、PAT1和PDS的内源性基因靶标具有功效。
在拟南芥中进行证明通过粒子辅助核酸递送而诱导局部化靶标基因沉默的类似实验。由于发育拟南芥叶来自在24孔块体中生长的小植物，所以对砂纸磨蚀方法进行修改。通过以下方式来改进圆头镊：用纸垫和实验室薄膜(ParafilmBemis NA,Neenah,WI)(用以支撑叶和防止叶损害)包裹一端，以及用双面粘性胶带使砂纸连接于另一端。类似地，使用棉拭滚动技术进行磨蚀的方法也可对拟南芥幼苗使用。
也在表达GFP的转基因番茄株系中进行类似实验。在用包括dsRNA施加继之以砂纸磨蚀的两步依序方法处理的番茄幼苗中观察到GFP和镁螯合酶沉默灶。推定GFP沉默灶的出现率较低(每个处理叶1-2个灶)，但存在于10个处理番茄幼苗中的6至7个中。在处理的番茄幼苗中观察到具有低出现率的镁螯合酶沉默灶，用混合的dsRNA触发剂处理的番茄幼苗显示预期共定位GFP和镁螯合酶沉默灶。
实施例37.通过砂纸磨蚀来递送dsRNA触发剂
这个实施例说明适用于将核酸递送至植物或植物的细胞或组织中的方法、装置和组合物的非限制性实施方案。更具体来说，这个实施例描述通过将相对较小(22个碱基对)dsRNA触发剂施加于植物表面，随后用负载颗粒磨蚀剂的基体进行磨蚀来使靶标基因系统性沉默。
这个实施例描述通过22bp dsRNA触发剂与砂纸磨蚀组合来使转基因本赛姆氏烟草16c植物中的GFP系统性沉默。非特异性dsRNA用作实验中的对照。将dsRNA溶解于水中以达到1毫克/毫升最终浓度，并且将总计20微升dsRNA施加于个别转基因本赛姆氏烟草16c植物上的2个幼小叶。用600砂纸辊对处理叶进行磨蚀。在处理之后24和48小时收集样品以对GFP mRNA水平进行RNA印迹分析。在处理之后2、5、8和13天，使用蓝光激发对沉默进行目视评估。在处理之后1天，观察到dsRNA处理的植物中的GFP mRNA表达降低，并且在处理之后2天观察到强烈GFP表达降低。在处理之后2天在处理叶上观察到局部化GFP沉默，并且从处理之后5天开始，局部化沉默表型变得明显得多和强烈得多。在处理之后10至13天，在未处理幼小叶上观察到系统性GFP沉默。
在一类似实验中，使用靶向内源性基因镁螯合酶的22bp dsRNA触发剂。将dsRNA溶解于水中以达到1毫克/毫升最终浓度，并且将总计20微升dsRNA施加于个别转基因本赛姆氏烟草16c植物上的2个幼小叶。用600砂纸辊对处理叶进行磨蚀。在处理之后2、5、8和13天，在可见光下对沉默进行目视评估。局部化沉默以用dsRNA处理的叶中的预期叶绿素缺乏表型被观察到。
实施例38.通过磨蚀来递送dsRNA触发剂
这个实施例说明适用于将核酸递送至植物或植物的细胞或组织中的方法、装置和组合物的非限制性实施方案。更具体来说，这个实施例描述通过用靶向靶标基因的启动子区域的dsRNA处理，随后用负载颗粒磨蚀剂的基体进行磨蚀来使所述靶标基因系统性沉默。
将来自本赛姆氏烟草16c的转基因GFP插入物的上游区域克隆并测序。测序区域的尺寸是2278bp，并且含有编码花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus，CaMV)35S启动子的835bp区域。含有nos终止子的上游表达盒位于离CaMV 35S启动子的5’末端698bp处。尺寸在122-127bp的范围内的三种dsRNA触发剂被设计以匹配来自CaMV 35S启动子区域的3’末端的DNA序列：CaMV.35S-1、CaMV.35S-2、CaMV.35S-3，以及靶向GFP的编码区的124bpdsRNA(作为对照)。将dsRNA溶解于水中以达到4毫克/毫升最终浓度，并且将总计10–20微升dsRNA施加于来自2周龄植物转基因本赛姆氏烟草16c植物的叶3和4。在叶上等分RNA之后，使用吸移器尖端在各叶的近轴侧的表面上均匀散布RNA。使RNA溶液干燥30分钟，接着用胶粘于在叶上加以滚动的销钉的P600砂纸对叶的顶部进行一次磨蚀。接着将植物放置在生长室中，所述生长室设置成263微摩尔光，设为14小时/10小时(光照/黑色循环)，采用23摄氏度/18摄氏度(昼/夜)的温度设置。在处理之后7天，使用蓝光激发对沉默进行目视评估。最靠近启动子的末端的前2种触发剂CaMV.35S-1和CaMV.35S-2产生强烈沉默表型，在处理叶上具有许多小沉默灶。CaMV.35S-3产生最弱表型，在仅少许区域中具有仅微弱沉默水平。靶向GFP的编码区的对照dsRNA产生最强烈表型，具有合并以覆盖大部分处理叶的许多大型沉默斑点。
实施例39.通过不同磨蚀剂来递送RNA触发剂
这个实施例说明适用于将核酸递送至植物或植物的细胞或组织中的方法、装置和组合物的非限制性实施方案。更具体来说，这个实施例描述通过用核酸处理，随后用破坏植物的角质层或表皮或角质层与表皮两者中的细胞的颗粒进行磨蚀来使靶标基因系统性沉默。
将双链RNA用Cy3荧光标记，并且涂布于SiC粒子(320目)或具有三种尺寸范围(10–22、22–27和35-45微米)的钠钙玻璃珠粒上。以相同方式制备对照粒子，但不进行Cy3标记。使用固定于环架的G78气刷在离植物5–7厘米喷嘴至叶距离处在65psi下将干燥的dsRNA涂布的SiC或玻璃珠粒喷洒于3周龄本赛姆氏烟草16c植物的叶和中心轴上。在各处理之间用乙醇清洁设备以使交叉污染最小化。
对于活体成像研究，用4–5毫米活检穿孔器取出目标区域(在UV光下鉴定为红色区域的沉默斑点)，并且用共焦荧光显微术使活组织成像。此外，用多聚甲醛固定组织样品，用蔗糖加以低温保护，封固在OCT培养基中，并且低温切片以进行落射荧光和亮视野成像。这些显微研究证明喷洒的粒子主要撞击表皮细胞。
对用包括dsRNA施加继之以用具有不同砂砾尺寸的砂纸进行磨蚀的两步依序方法处理的番茄叶进行类似显微研究。结果证明沉默效率按照砂砾尺寸顺序P200<P400<P2000(即从较粗糙砂砾至较精细砂砾)进行增加，从而指示最有效砂纸具有可破坏叶角质层的砂砾尺寸，并且仅损害或部分损害表皮细胞层，而不导致更深损害。
实施例40.比较具有不同砂砾尺寸的砂纸和使用RNA酶抑制剂的沉默效率
这个实施例说明适用于将核酸递送至植物或植物的细胞或组织中的方法、装置和组合物的非限制性实施方案。更具体来说，这个实施例描述通过用dsRNA处理，随后用负载颗粒磨蚀剂的基体进行磨蚀来使靶标基因系统性沉默。
这个实验比较具有不同砂砾尺寸的砂纸在两步依序施加中的沉默效率。也考查核酸酶抑制剂的影响。
制备三种dsRNA制剂。基础制剂在水中含有在2毫克/毫升下的124bp dsRNA触发剂、200毫摩尔甘露糖、4毫摩尔MES缓冲剂最终浓度。第二制剂与基础制剂相同，但包括4.8毫摩尔Zn2SO4作为RNA酶抑制剂。第三制剂与基础制剂相同，但包括3.7％核糖核酸酶抑制剂(Promega Corporation,Madison,WI)作为RNA酶抑制剂。将总计10或20微升dsRNA施加于3周龄植物转基因本赛姆氏烟草16c植物的2个叶。在叶上等分RNA之后，使用吸移器尖端在各叶的近轴侧的表面上均匀散布RNA。使RNA溶液干燥30分钟，接着用附着于在叶上加以滚动的3/4英寸PVC管的具有两种不同砂砾尺寸(P180或P600)的砂纸对叶的顶部进行一次磨蚀。在处理之后7天，使用蓝光激发对沉默进行目视评估。结果提供于表35中。
表35
这些结果显示在所有制剂中，相比于用更粗糙P180砂纸磨蚀的叶，经P600磨蚀的叶具有的每个叶的GFP沉默灶是约10倍多。与使用的砂纸砂砾无关，包括RNA酶抑制剂的制剂具有的每个叶的GFP沉默灶更多。相比于经P600磨蚀的叶，对于经更粗糙P180砂纸磨蚀的叶，核酸酶抑制剂对使每个叶的GFP沉默灶的数目增加的影响相对更强烈。在使用的浓度下，Zn2SO4对使每个叶的GFP沉默灶的数目增加的影响最强烈。
实施例41.递送预防系统性病毒感染的dsRNA触发剂
这个实施例说明适用于将核酸递送至植物或植物的细胞或组织中的方法、装置和组合物的非限制性实施方案。更具体来说，这个实施例描述通过颗粒辅助将诸如DNA病毒载体的核酸递送至植物中的方式来使靶标基因系统性沉默。这个实施例证明直接施加的dsRNA触发剂在预防系统性TSWV感染方面具有作用。
进行实验以评估在无细菌溶解产物下施加的dsRNA触发剂预防本赛姆氏烟草中番茄斑枯病毒(TSWV)感染的能力。GFP沉默充当触发剂递送和处理的示踪标志。产生两种298bp嵌合dsRNA触发剂；第一触发剂TSWV-GFP-TSWV包括侧接靶向TSWV N基因的dsRNA区域的靶向GFP的两个dsRNA区域，并且第二触发剂GFP-TSWV-GFP包括靶向GFP的dsRNA区域的靶向TSWV N基因的两个dsRNA区域。靶向GFP的钝端141bp dsRNA触发剂用作对照。
将嵌合和对照dsRNA触发剂直接施加于显示3个真叶(在发芽之后约26天)的本赛姆氏烟草16c植物，随后用600砂砾砂纸进行磨蚀。在处理之后4天，在所有处理的情况下在处理叶上都观察到局部GFP沉默；此时，将TSWV摩擦接种于显示局部GFP沉默的叶上。在TSWV激发之后14天，评估植物的TSWV症状显现。用单独GFP触发剂处理的所有植物都具有强烈TSWV症状。小于20％的用嵌合GFP/TSWVdsRNA触发剂处理的植物受TSWV明显感染。类似结果出现在其中在处理之后7天用TSWV接种植物的类似实验中，从而证明直接施加嵌合dsRNA触发剂保护植物免遭TSWV感染持续处理之后至少7天。
实施例42.递送靶向基因的非编码调控区的dsRNA触发剂
这个实施例说明适用于将核酸递送至植物或植物的细胞或组织中的方法、装置和组合物的非限制性实施方案。更具体来说，这个实施例描述使用靶向待沉默的基因的非编码调控区的dsRNA触发剂使靶标基因系统性沉默，以及表型在子代植物中的可遗传性。
碧冬茄(Petunia hybrida)中的查耳酮(chalcone)合成酶chs(A)基因的启动子区域的序列由Van der Meer等(1990)Plant Mol.Biol.,15:95–190公布。产生靶向上游启动子区域的258bp钝端dsRNA触发剂。使用先前工作实施例中的单步法或两步法中的任一者，以磨蚀将dsRNA触发剂施加于碧冬茄叶。使处理叶再生成R0植物。选择显示预期白花表型的R0植物。白花表型可通过表观遗传效应在后代植物中遗传。
实施例43.递送用于体内编辑植物基因的核酸
这个实施例说明适用于将核酸递送至植物或植物的细胞或组织中的方法、装置和组合物的非限制性实施方案。更具体来说，这个实施例描述使用包括将核酸施加于植物的表面，随后用颗粒进行磨蚀的方法，借此核酸被递送至所述植物中，并且导致对所述植物中基因的体内编辑或序列替换。
用于对基因进行体内编辑或序列替换的方法在本领域中是已知的，例如通过使用锌指核酸酶、CRISPR和Cas9。参见例如Townsend等(2009)Nature,459:442–446；Qi等(2012)Nature Biotechnol.,30:1002–1007；Cong等(2013)Science,339:819–823；以及Hsu等(2013)Nature Biotechnol.,31:827–834。在这个实施例中，用于体内编辑的核酸与类似于本文在先前实施例中所述的那些方法的方法一起使用以修饰植物中内源性基因的序列。
烟草(烟草(Nicotiana tabacum))中共有高度保守编码区的内源性乙酰乳酸合成酶基因(ALS SuRA和SuRB)的特异性氨基酸点突变导致对某些除草剂的抗性。三种所述氨基酸点突变是P191A(赋予对氯磺隆(chlorsulphuron)的抗性)、W568L(赋予对氯磺隆与灭草喹(imazaquin)两者的抗性)和S647T(赋予对灭草喹的抗性)，其相应核苷酸突变已被报道(描绘于Townsend等(2009)Nature,459:442–446的图1b中)。
制备三种核酸：(1)CAS9表达DNA质粒；(2)含有融合靶标序列/引导RNA的合成ssRNA，其中靶标RNA包括待在体内编辑的所选区域的约20个核苷酸，其融合于引导RNA；和(3)供体DNA(以质粒形式或以dsDNA片段形式提供)，其包括选自P191A、W568L和S647T的替换序列加上如所需要的额外5’和3’侧接序列。使用先前工作实施例中的单步法或两步法中的任一者，以磨蚀将三种核酸施加于烟草叶。除草剂抗性R0烟草植物由处理叶在含有适当除草剂的选择性培养基上再生。

Claims (24)

1.一种用于将多核苷酸从植物或植物部分的外表面递送至植物细胞的内部中的组合物，其包含至少一种多核苷酸和至少一种能够破坏所述植物或植物部分的至少一个屏障的试剂。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种试剂选自一种或多种酶、一种或多种磨蚀剂及其任何组合。
3.如权利要求2所述的组合物，其还包含一种或多种渗透调节物质、一种或多种表面活性剂或其任何组合。
4.一种用于将多核苷酸从植物或植物部分的外表面递送至植物细胞的内部中的组合物，其包含至少一种多核苷酸、一种或多种渗透调节物质和一种或多种表面活性剂。
5.如权利要求5所述的组合物，其还包含至少一种选自一种或多种酶、一种或多种磨蚀剂及其任何组合的试剂。
6.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸是非可转录多核苷酸。
7.如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸选自由单链DNA、单链RNA、双链DNA、双链RNA和RNA/DNA杂交体组成的组。
8.如权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸包含与靶标序列或从所述靶标序列转录的RNA的18个或更多个连续核苷酸基本上同一或基本上互补的序列。
9.如权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸编码位点特异性酶或RNA引导的核酸酶的一个或多个RNA组分。
10.如权利要求2或5所述的组合物，其中所述一种或多种酶选自由纤维素、半纤维素、果胶酶、角质酶、脂酶及其任何组合组成的组。
11.如权利要求2或5所述的组合物，其中所述一种或多种磨蚀剂选自由矿物质磨蚀剂、金属磨蚀剂、合成磨蚀剂、有机磨蚀剂及其任何组合组成的组。
12.如权利要求2或5所述的组合物，其中所述磨蚀剂由基体负载，附着于基体，或包埋在基体中。
13.如权利要求2或5所述的组合物，其中所述磨蚀剂具有大于约2.5微米的尺寸。
14.如权利要求3或4所述的组合物，其中所述一种或多种渗透调节物质选自蔗糖、甘露糖醇、甘油及其任何组合。
15.如权利要求3或4所述的组合物，其中所述一种或多种表面活性剂是非离子表面活性剂。
16.如权利要求1至15中任一项所述的组合物，其还包含化学除草剂。
17.如权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述组合物是液体、固体、粉末、溶液、乳液或混悬液。
18.一种用于将多核苷酸从植物或植物部分的外表面递送至植物细胞的内部中的方法，其包括向所述植物或植物部分的所述外表面施加如权利要求1至17中任一项所述的组合物。
19.一种用于将多核苷酸从植物或植物部分的外表面递送至植物细胞的内部中的方法，其包括
a)将至少一种能够破坏所述植物或植物部分的至少一个屏障的试剂施加于所述植物或植物部分的表面上，以及
b)将一种或多种多核苷酸施加于所述植物或植物部分的表面上，
其中步骤a)和b)同时或以任何顺序依序进行。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述至少一种试剂选自一种或多种酶、一种或多种磨蚀剂及其任何组合。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述方法还包括将一种或多种渗透调节物质、一种或多种表面活性剂或两者施加于所述植物或植物部分的表面上，
其中所述多核苷酸、所述磨蚀剂、所述酶、所述渗透调节物质和所述表面活性剂同时或以任何顺序依序施加，并且以其任何组合加以分组。
22.一种用于将多核苷酸从植物或植物部分的外表面递送至植物细胞的内部中的方法，其包括将一种或多种多核苷酸、一种或多种渗透调节物质和一种或多种表面活性剂施加于所述植物或植物部分的表面上，
其中所述多核苷酸、所述渗透调节物质和所述表面活性剂同时或以任何顺序依序施加，并且以其任何组合加以分组。
23.如权利要求18至22中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸抑制至少一个靶标基因的表达。
24.如权利要求18至22中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸编码位点特异性酶或RNA引导的核酸酶的一个或多个RNA组分。
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