CN101331227A

CN101331227A - 使用粉体来提高转化效率的方法

Info

Publication number: CN101331227A
Application number: CNA2006800469361A
Authority: CN
Inventors: 石田佑二; 樋江井佑弘; 植木润; 山本岳
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2005-12-13
Filing date: 2006-12-13
Publication date: 2008-12-24
Anticipated expiration: 2026-12-13
Also published as: EP1964919A4; ATE545700T1; US20110131685A1; WO2007069643A1; US8324456B2; EP1964919B1; EP1964919A1; AU2006324560A1; CN101331227B; DK1964919T3; AU2006324560B2; WO2007069301A1

Abstract

本发明提供一种通过土壤杆菌属细菌来进行将基因导入到植物材料中的方法，其特征在于在粉体存在的条件下将土壤杆菌属细菌接种到植物材料。在本发明的方法中，粉体至少是对生物组织没有不利的影响，并且具有选自下列的一种或多种特性：水不溶性；对生物组织具有亲和性；有吸附特性；及具有表面极性。另外，本发明还提供了以使用本发明的基因导入方法为特征的转化植物的制造方法。

Description

使用粉体来提高转化效率的方法

技术领域

本发明是关于通过土壤杆菌属细菌来高效地进行将基因导入到植物材料中的方法。

背景技术

作为主要谷类的玉米、水稻等单子叶植物的转化方法，已知有电穿孔法、基因枪法等。然而，这些物理的基因导入法存在将多拷贝的基因导入，基因并不能以完整的形式插入，转化植物畸形、不育等多种问题。

根据土壤杆菌法的基因导入，是利用土壤杆菌机能的植物转化方法。土壤细菌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens，根瘤土壤杆菌)具有下列机能：感染植物时，使作为与土壤杆菌病原性相关的Ti(tumor-inducing)质粒的一部分的T-DNA整合到植物基因组中。根据土壤杆菌法的植物转化方法是下述方法：制备将Ti质粒的T-DNA结构域置换为希望向植物染色体组中导入的基因的转化用质粒，使用制备成具有以该转化用质粒代替了Ti质粒的土壤杆菌，通过利用土壤杆菌的上述机能，将希望向该植物染色体组中导入的基因导入到植物染色体组中的方法。

使用土壤杆菌属细菌的基因导入法，作为双子叶植物的转化法被普遍使用。由于认为土壤杆菌仅以双子叶植物为宿主，并不寄生在单子叶植物中(DeCleene，M.and De Ley，J.，(1976)Bot.Rev.，42：389-466)，进行了关于根据土壤杆菌法转化单子叶植物的尝试(Grimsley，N.，等，(1987)Nature，325：177-179；Gould，J.，等，(1991)Plant Physiol.，95：426-434；Mooney，P.A.，等，(1991)Plant Cell，Tissues and Organ Culture，25：209-218；Raineri，D.M.，等，(1990)Bio/technology，8：33-38)。据这些研究报告，显示了在水稻、玉米、小麦等稻科作物中也可以利用土壤杆菌进行基因导入，但每个都存在重现性的问题，除此之外，在导入的基因的确认方面不完全，并未显示具有说服性的结果(Potrycus，I.，(1990)Bio/technology，8：535-542)。

Chan等，在2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)共存条件下，将培养两天的水稻未成熟胚创伤后，在含有马铃薯悬浊培养细胞的培养基中接种带有nptII基因与GUS基因的土壤杆菌。在添加了G418的培养基上培养处理过的未成熟胚，由被诱导的愈伤组织得到再分化的植物体。据报道，再分化的植物体及其后代的植物体中的GUS基因的存在由southern分析确定再分化当代、后代任何的植物体中都已被确定有导入基因的存在(Chan，M-T.，等，(1993)Plant Mol.Biol.，22：491-506)。此结果支持了由土壤杆菌对水稻的转化，但转化率为1.6％，非常低，相对于供试的未成熟胚数250，显示为正常生长的再生植物体仅有1个。由于剔除水稻的未成熟胚需要大量的工作，这样低的转化率很难说达到实用的标准。

近年，报道了通过利用带有强病原性土壤杆菌的一部分病原性基因的超级双元载体(super binary vector)，在水稻、玉米等单子叶植物中也能稳定、高效地转化(Hiei，Y.，等，(1994)，The Plant Journal，Vol.6，p.271-282；以及Ishida，Y.，等，(1996)，Nature Biotechnology，Vol.4，p.745-750)。根据这些报道，通过土壤杆菌的转化，可以稳定、高效地转化，并且所得到的转化植物变异少，被导入的基因复制数少，而且具有完整形态的植物很多的优点。继水稻、玉米成功之后，作为主要谷类的小麦(Cheng，M.，等，(1997)Plant Physiol.，115：971-980)、大麦(Tingay，S.，等，(1997)Plant J.，11：1369-1376)和高梁(Zhao，Z.-Y.，等，(2000)Plant Mol.Biol.，44：789-798)的通过土壤杆菌的转化也有报道。

Ishida等以玉米近交(インブレツド)A188和与A188相关的近交株为材料，通过土壤杆菌进行转化(Ishida，Y.，等，(1996)Nature Biotechnology，14：745-750)。接着，报道了通过土壤杆菌的玉米转化，但都是采用的A188以及与A188相关的杂交株(Deji，A.，等，(2000)Biochim.Et Biophys.Acta，1492：216-220；Negrotto，D.，等，(2000)Plant Cell Reports，19：798-803；Nomura，M.，等，(2000)Plant J.，22：211-221；Nomura，M.，等，(2000)Plant Miol.Boil.，44：99-106；Taniguchi，M.，等，(2000)Plant Cell Physiol.，41：42-48；Zhao，Z.-Y.，等，(2001)Mol.Breed.，8：323-333；Frame，B.R.，等，(2002)Plant Physiol.，129：13-22)。作为通过土壤杆菌改善玉米转化的效率的尝试，已经有在N6基础培养基中的转化细胞的筛选(Zhao，Z.-Y.，等，(2001)Mol.Breed.，8：323-333)，向培养基中添加AgNO₃和羧苄青霉素(Zhao，Z.-Y.，等，(2001)Mol.Breed.，8：323-333；Ishida，Y.，等，(2003)Plant Biotechnology，20：57-66)、向共存培养基中添加半胱氨酸(Frame，B.R.，等，(2002)Plant Physiol.，129：13-22)等。Ishida等通过将共存培养后的玉米未成熟胚用含有AgNO₃和羧苄青霉素的培养基筛选，在完成作为A188以外的公共近交株的H99和W117的转化植物的同时，也报道了根据相同方法的A188的转化效率的提高(Ishida，Y.，等，(2003)Plant Biotechnology，20：57-66)。

Singh以及Chawla报道了在硅碳纤维(SCF)的悬浊液中用涡旋混合器将小麦的未成熟胚搅拌2～3分钟后，通过接种土壤杆菌，使表达GUS基因的未成熟胚的数目增加。(Singh，N.和Chawla，S.，(1999)Current Science，76：1483-1485)。这是因为通过SCF，未成熟胚被创伤，在土壤杆菌接种前创伤组织的尝试，其它还有通过基因枪的创伤(Bidney等，1992)、通过超声波处理的创伤(Trick，H.N.和Finer，J.J.，(1997)Transgenic Res.，6：329-336)等。

通过土壤杆菌的玉米转化方法中，为了使转化效率提高已经进行了各种尝试(Negrotto，D.，等，(2000)Plant Cell Peports，19：798-803；Zhao，Z.-Y.，等，(2001)Mol.Breed.，8：323-333；Frame，B.R.，等，(2002)Plant Physiol.，129：13-22；Ishida，Y.，等，(2003)Plant Biotechnology，20：57-66)。然而，其效果与同是单子叶植物水稻相比还较低，不仅是生产实用的转化玉米时，而且在玉米确认新基因的效果时也期望进一步的转化效率的提高。进而伴随近年来基因组学研究的进展，用于阐明基因机能的转化的必要性提高，需要效率高的转化系。

此外，对其它的单子叶植物以及双子叶植物，提高现行方法的转化效率的开发，在利用转化体的各种情况下是有用的。

本说明书中引用的文献，各自在本说明书中被完全引用。

专利文献1：特许第2,649,287号公报

专利文献2：特许第2,329,819号公报

专利文献3：特开2000-342256号公报

专利文献4：国际公开第95/06722号小册子

非专利文献1：Bidney，D.，等，(1992)Plant Mol.Biol.18：301-313.

非专利文献2：Chan，M-T.，等，(1993)Plant Mol.Biol.，22：491-506.

非专利文献3：Cheng，M.，等，(1997)Plant Physiol.，115：971-980.

非专利文献4：De Cleene，M.and De Ley，J.，(1976)Bot.Rev.，42：389-466.

非专利文献5：Deji，A.，等，(2000)Biochim.et Biophys.Acta，1492：2l6-220.

非专利文献6：Frame，B.R.，等，(2002)Plant Physiol.，129：13-22.

非专利文献7：Gould，J.，等，(1991)Plant Physiol.，95：426-434.

非专利文献8：Grimsley，N.，等，(1987)Nature，325：177-179.

非专利文献9：Hiei.Y.，等，(1994)The Plant Journal，6：271-282.

非专利文献10：Ishisa，Y.，等，(1996)Nature Biotechnology，14：745-750.

非专利文献11：Ishisa，Y.，等，(2003)Plant Biotechnology.，20：57-66.

非专利文献12：Mooney，P.A.，等，(1991)Plant Cell，Tissues and OrganCulture，25：209-218.

非专利文献13：Negrotto，D.，等，(2000)Plant Cell Reports，19：798-803.

非专利文献14：Nomura，M.，等，(2000)Plant J.，22：211-221.

非专利文献15：Nomura，M.，等，(2000)Plant Mol.Biol.，44：99-106.

非专利文献16：Potrycus，I.，(1990)Bio/technology，8：535-542.

非专利文献17：Raineri，D.M.，等，(1990)Bio/technology，8：33-38.

非专利文献18：Singh，N.和Chawla，S.，(1999)Current Science，76：1483-1485.

非专利文献19：Taniguchi，M.，等，(2000)Plant Cell Physiol.，41：42-48.

非专利文献20：Trick，H.N.和Finer，J.J.，(1997)Transgenic Res.，6：329-336.

非专利文献21：Tingay，S.，等，(1997)Plant J.，11：1369-1376.

非专利文献22：Zhao，Z.-Y.，等，(2000)Plant Mol.Biol.，44：789-798.

非专利文献23：Zhao，Z.-Y.，等，(2001)Mol.Breed.，8：323-333.

非专利文献24：Hoekema，A.，等，(1983)Nature，303：179-180.

非专利文献25：Komari，T.和Kubo，T.，(1999)Methods of GeneticTransformation：Agrobacterium tumefaciens.In Vasil，I.K.(ed.)，Molecularimprovement of cereal crops，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，p.43-82.

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于，与现有的通过土壤杆菌属细菌向植物中导入基因的方法中的植物基因导入效率相比，更高效率地进行基因导入，从而开发、提供比现有的转化效率更高效率地进行转化的方法。还有，本发明所要解决的课题在于开发、提供使用前述方法制作出转化植物的方法。

解决课题的手段

本发明者们为解决上述问题锐意研究努力的结果是，发现在粉体存在的条件下通过土壤杆菌属细菌向植物进行基因导入，与不存在粉体时相比，获得高效率的基因导入。此外，就基因导入了的植物材料，进一步进行转化体的筛选，发现在粉体存在的条件下进行基因导入了的植物材料，与不存在粉体时相比，转化效率提高。因此，本发明提供了在粉体存在的条件下，通过将土壤杆菌属细菌接种到植物材料，而使得基因导入效率和/或转化效率提高的方法。

使用粉体的基因导入方法

本发明提供一种通过土壤杆菌属细菌来进行将基因导入到植物材料中的方法，其特征在于在粉体存在的条件下将土壤杆菌属细菌接种到植物材料。

本发明的方法中，在粉体存在的条件下，是指将土壤杆菌属细菌接种到植物材料时，有粉体存在的状态。因此，可以让土壤杆菌属细菌悬浊液先与粉体混合，然后将该混合物接种到植物材料；也可以先将植物材料与粉体混合，然后将土壤杆菌属细菌悬浊液接种到该混合物；或者，还可以将土壤杆菌属细菌悬浊液、粉体和植物材料同时混合，从而将土壤杆菌属细菌悬浊液接种到植物材料。另外，在本发明中，混合要适度均匀地混合就可以，没有强力搅拌的必要。例如，使用涡旋混合器等比较强力的搅拌机器进行混合时，进行较短的混合时间，例如1分钟以下，优选45秒以下，更优选30秒以下的时间。

因此，本发明的方法的一种形式为，通过土壤杆菌属细菌来进行将基因导入到植物材料的方法，所述方法特征在于包括在粉体存在的条件下将土壤杆菌属细菌接种到植物材料的工序，该工序包括：

(1)混合土壤杆菌属细菌悬浊液和粉体的工序，以及

(2)将(1)的混合物接种到植物材料的工序。

另外，本发明的其它形式为，通过土壤杆菌属细菌来进行将基因导入到植物材料的方法，所述方法特征在于包括在粉体存在的条件下将土壤杆菌属细菌接种到植物材料的工序，该工序包括：

(1)混合植物材料和粉体的工序；和

(2)将土壤杆菌属细菌悬浊液接种到(1)的混合物的工序。

另外，本发明的其它形式为，通过土壤杆菌属细菌来进行将基因导入到植物材料中的方法，其特征在于该方法包括在粉体存在的条件下将土壤杆菌属细菌接种到植物材料的工序，该工序包括：通过将土壤杆菌属细菌悬浊液、粉体、以及植物材料同时混合来使土壤杆菌属细菌接种到植物材料。

本发明的方法是基于这样的技术思想：在土壤杆菌属细菌接种到植物材料时添加的粉体表面，提供了用于土壤杆菌属细菌感染植物材料的反应场所，从而提高了感染效率，结果使基因导入效率和转化效率提高。因此，本发明的方法中，粉体至少对生物组织没有不利的影响，并且具有选自以下的一种或更多种特性：水不溶性；对生物组织具有亲和性；吸附特性；和具有表面极性。优选地，本发明的方法中使用的粉体具有上述4种特性中的两种以上。更优选地，本发明的方法中使用的粉体对生物组织没有不利的影响、并且是水不溶性的粉体，而且根据期望还具有选自以下的1种或更多种特性：对生物组织具有亲和性；具有吸附特性；和具有表面极性。

对生物组织没有不利的影响是指，不阻碍植物、土壤杆菌的生命活动。本发明的方法中，粉体如果没有对转化、转化后的再分化、再分化后的生长等造成实质性不利影响的毒性的话，就可以使用。

水不溶性是指，对水性溶剂是不溶性或难溶性的。更具体地讲，是对本发明的方法中使用的缓冲剂、培养基等为不溶性或难溶性。进一步具体地讲，在土壤杆菌属细菌悬浊液和植物材料配制时的条件下、以及接种的条件下是不溶性或难溶性。本发明的方法中使用的粉体对水具有不溶性，因而粉体在本发明的方法的任一工序中都不溶解，都能以粉体的状态存在。

对生物组织具有亲和性是指，对生物组织具有吸附性。对生物组织具有亲和性的粒子能够吸附土壤杆菌属细菌和植物材料，这样的粒子表面能提供高效的感染的反应场所。

具有吸附特性是指，能够吸附物质的特性。本发明的方法中通过土壤杆菌属细菌和/或植物材料被吸附于添加的粉体，粉体表面可提供感染的反应场所。具有吸附特性的粉体的例子中可以列举多孔粉体。

具有表面极性是指粉体表面具有极性，即是说粉体表面有相当的亲水性。具有表面极性的粉体能够在粉体表面形成水膜，土壤杆菌属细菌和/或植物材料能包含在该水膜中。

本发明的方法中可能使用的粉体例如选自多孔性陶瓷，玻璃棉和活性炭，以及它们的混合物的粉体，但并不限于这些。多孔性陶瓷中有例如，羟基磷灰石、硅胶和沸石，但并不限于这些。

本发明的方法中可能使用的粉体的粒径没有特殊限制，为1～150μm，优选5～75μm。这样粒径的粉体能够通过筛、各种各样的分级机分级得到，而且一般也有市售的。另外，粒径的测定可以利用激光衍射法或光学显微镜等进行。

本发明的方法中使用的粉体的量并没有限制，在土壤杆菌属细菌接种到植物材料时的浓度为30mg/ml以上，优选60mg/ml以上的量。本发明的方法中使用的粉体的量的上限并没有限制，在土壤杆菌属细菌接种到植物材料时的浓度为240mg/ml以下。

本发明的方法中，土壤杆菌属细菌接种到植物材料，可以通过使土壤杆菌属细菌单独接触植物材料而进行。接种可以通过通常的接种而进行，另外，也可以通过滴注接种而进行。通常的接种为混合植物材料和土壤杆菌属细菌悬浊液(接种源)，将植物材料浸渍在该悬浊液中，取出浸渍的植物材料，使之植入到培养基进行共存培养来进行接种的方法。滴注接种法为将土壤杆菌属细菌悬浊液滴注到植入于培养基的植物材料上，待滴注的悬浊液干后，将植物材料植入到培养基的其它地方或植入到其它的培养基上进行共存培养的接种方法。

共存培养的时间并没有特殊限制，为1小时以上，优选为1日以上，3日以上或7日以上。共存培养时间的上限并没有限定，优选为7日以下、10日以下、或14日以下。

另外，本发明的方法中，粉体与土壤杆菌属细菌悬浊液或植物材料的混合时间，或粉体与土壤杆菌属细菌悬浊液和植物材料的混合物时间，只要是充分混合就没有特别的限制。作为优选的例子，可以列举3分、5分、10分，或30分的混合时间。

本发明的方法中所提供的植物，包含单子叶植物和双子叶植物中的任一种。单子叶植物中并没有特殊限制，包含水稻、玉米、大麦、小麦、芦笋(アスパラガス)、高梁(ソルガム)、甘蔗(サトルキビ)等。双子叶植物中并没有特殊限制，包含烟草、大豆、百脉根(ミヤコグサ)、马铃薯、棉(ワタ)、向日葵等。本发明的方法中提供的植物优选单子叶植物，最优选水稻或玉米。

另外，本发明的方法中，所说“植物材料”包括供以土壤杆菌法进行的植物转化使用的该植物的细胞、叶、根、茎、芽、花(含有雄蕊、雌蕊等)果实、种子、发芽种子及其他的任何部位的植物组织，生长点、外植体(外植片)、未成熟胚，愈伤组织(カルス)或者不定胚样组织(不定胚様組織)(以下在本说明书中称作愈伤组织等，或者简称为愈伤组织)，或者整个植物体等植物所有的形态。作为本发明中使用的植物材料优选为未成熟胚或愈伤组织，最优选为未成熟胚。

利用使用粉体的基因导入方法制造转化植物的方法

另外，本发明提供了使用前述基因导入方法的转化植物的制造方法。

本发明涉及一种通过土壤杆菌属细菌来进行植物材料转化从而得到转化植物的制备方法，其特征在于包含以下工序：

1)在粉体存在条件下将土壤杆菌属细菌悬浊液接种到植物材料；

2)筛选转化的植物材料，然后

3)将筛选出的转化体进行再分化。

本发明的一般形式中，上述工序(1)通过

(i)混合土壤杆菌属细菌悬浊液和粉体；然后

(ii)使将(i)的混合物接种到植物材料；

而完成。

作为本发明的其它形式，上述工序(1)通过

(i)混合植物材料和粉体，然后，

(ii)使土壤杆菌属细菌悬浊液接种到(1)的混合物；

而完成。

作为本发明的其它形式，上述工序(1)通过将土壤杆菌属细菌悬浊液、粉体、和植物材料同时混合从而将土壤杆菌属细菌接种到植物材料而完成。

本发明的转化植物的制造方法中可以使用的粉体的性质、材料、粒径以及用量，与本发明的植物的基因导入的方法中所述的相同。

另外，本发明的转化植物的制造方法中，通过土壤杆菌属细菌悬浊液接种到植物细胞，可依据上述的方法、混合时间和共存培养时间来进行。

进而，本发明的转化植物的制造方法中，制造的转化植物与本发明的基因导入方法中提供的植物相同。

使用土壤杆菌属细菌进行的基因导入以及转化方法

使用土壤杆菌属细菌进行的基因导入，一般地包括以下工序：

a)制备植物材料的工序；

b)制备含有载体的土壤杆菌属细菌的工序，所述载体含有期望导入的基因；

c)使b)中制备的土壤杆菌属细菌感染工序a)中制备的植物材料的工序。

进一步，为了得到转化体，在上述工序c)之后也可以实施：

d)筛选转化细胞的工序；以及

e)根据期望，将筛选的转化体进行再分化的工序。

具体地，在单子叶植物中，可以采用如文献(特许第2,649,287号公报)所述的那样，采用如下方法：将上述a)工序中，用含有植物生长激素(例如2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸))或者细胞因子等的培养基培养，使植物材料成为脱分化的状态或者在脱分化过程中的状态，在上述c)工序中，感染土壤杆菌细菌；或者是采用如文献(特许第3,329,819号公报)所述的那样，采用如下的方法：以该植物的未成熟胚作为植物材料，在上述a)工序中不对未成熟胚进行脱分化处理，在上述c)工序中用含有植物生长激素(例如2，4-D)或者细胞因子等的培养基培养。

关于工序a)

在本说明书中，供基因导入的“植物”包括单子叶植物以及双子叶植物中的任一。用于本发明方法的单子叶植物中包括水稻、玉米、大麦、小麦、芦笋、高梁和其他，但并不限于这些。用于本发明方法的双子叶植物中包括烟草、大豆、百脉根、马铃薯、棉、向日葵和其他，但并不限于这些。本发明方法中的优选植物是单子叶植物，最优选是水稻或玉米。

此外，所说“植物材料”非限定性的包括供于以土壤杆菌法进行转化的该植物的细胞、叶、根、茎、芽、花(含有雄蕊、雌蕊等)、果实、种子、发芽种子及其他的任何部位的植物组织，生长点、外植体、未成熟胚，愈伤组织或者整个植物体等植物所有的形态。

作为本发明方法中使用的植物形态，优选未成熟胚和愈伤组织，最优选未成熟胚。在本说明书中，所说的植物的细胞、组织、整个植物体采用的是在本技术领域中一般采用的意义。在本说明书中，所谓的未成熟胚是受粉后处于成熟过程的未成熟种子的胚。此外，供本发明方法所用的未成熟胚的阶段(熟期)，没有特别的限制，在受粉后的任何时期采摘的都可以。最优选受粉后2天以后的未成熟胚。后述的转化之后，以后述的方法，脱分化，优选使用未成熟胚胚盘，其能够诱导具有再生正常个体能力的愈伤组织。此外，未成熟胚优选近交系、近交系之间的F1、近交系与自然受粉品种之间的F1、市售F1品种的未成熟胚。在本说明书中，所谓愈伤组织是指无秩序增殖的未分化状态的细胞块。为了得到愈伤组织，可以将植物组织分化的细胞置于含有植物生长激素(例如2，4-D)或者细胞因子等植物生长调节物质的培养基(叫做脱分化培养基)中培养得到。该为得到愈伤组织而做的处理叫做脱分化处理，该过程叫做脱分化过程。

在工序a)中，根据需要，将植物组织、未成熟胚等从植物体、种子等中取出，制备成适合转化的材料。此外，根据期望，也可以将植物材料在用土壤杆菌感染之前进行培养。

关于工序b)

很久以前就已知土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens，根瘤土壤杆菌)引起很多双子叶植物的冠瘿病(crown gall disease)，在二十世纪70年代，发现Ti质粒与病原性相关，而且作为Ti质粒的一部分的T-DNA被整合到植物染色体组中。之后明白了该T-DNA上存在与合成诱发肿瘤所必要的荷尔蒙(细胞因子和植物生长激素)相关的基因，其是细菌基因并在植物中发现。在T-DNA的切出与向植物的表达中，在Ti质粒上的病毒结构域(vir结构域)中存在的基因组是必要的，此外为了切出T-DNA，T-DNA两端上存在的边界序列(ボ-ダ-配列)是必要的。作为其他的土壤杆菌属细菌的毛根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)也具有根据Ri质粒的同样的系统(例如特开2000-342256的图3和图4)。

由于土壤杆菌的感染，T-DNA可以整合到植物染色体组中，因此在T-DNA上插入期望的基因的话，期望能将该基因整合到植物染色体中。然而，因为Ti质粒是190kb或190kb以上非常大，用标准的基因工程方法在质粒上的T-DNA上插入基因是困难的。因此，开发了用于在T-DNA上插入外源基因的方法。

首先，制备了从肿瘤性Ti质粒的T-DNA上去除了荷尔蒙合成基因的解除型菌株(disarmed strains)LBA4404(参考Hoekema，A.，等，(1983)，Nature，Vol.303，p.179-180)、C58C1(pGV3850)、GV3Ti11SE等。通过使用这些，开发了2种方法：将期望的基因导入到土壤杆菌的Ti质粒T-DNA中，或者将具有期望基因的T-DNA导入到土壤杆菌中。其中的一种是进行容易的基因操作就可能插入期望的基因方法，该方法通过三系杂交法(triparentalmating)，通过同源整合(相同組換え)，将在大肠杆菌中能够复制的中间载体导入到土壤杆菌的解除型Ti质粒的T-DNA结构域中，称作中间载体法。

还有一种是称作双元载体(binary vector)法，该法是基于在将T-DNA整合到植物中时，需要有病毒(vir)结构域，但没有必要为了机能而存在于同一质粒上。在该vir结构域中存在有virA、virB、virC、virD、virE以及virG，(植物生物技术事典(エンタプライズ株式会社发行(1989)))，所谓vir结构域，是指包含全部virA、virB、virC、virD、virE以及virG。因此，双元载体是将T-DNA整合到可在土壤杆菌和大肠菌双方中复制的小质粒中的东西，将其导入到具有解除型Ti质粒的土壤杆菌中来使用。

在向土壤杆菌导入双元载体时，可以通过电穿孔法和三系杂交法等公知的方法进行。在双元载体中，有pBIN19、pBI121、pGA482等，以这些为基础，构建了大量的新型双元载体用于转化。此外，在Ri质粒系统中，也构建了同样的载体用于转化。

土壤杆菌A281是强病原性(super-virulent)菌系，其宿主范围广，转化效率比其他菌系高。该特性是由于A281具有的Ti质粒的pTiBo542。使用pTiBo542到目前开发了2种新系统。一种是使用了具有pTiBo542解除型Ti质粒的菌系EHA101以及EHA105，由于适用于上述双元载体系统，这些作为转化能力高的系统而在各种植物的转化中被利用。

还有一种是超级双元载体(“super-binary”vector)(参考Hiei，Y.，等，(1994)，The Plant Journal，Vol.6，p.271-282；Ishida，Y.，等，(1996)，Nature Biotechnology，Vol.4，p.745-750；Komari，T.和Kubo T.，(1999)，Methods of GeneticTransformation：Agrobacterium tumefaciens.In Vasil，I.K.(ed.)Molecularimprovement of cereal crops.，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，p.43-82；以及国际公开第95/06722号小册子)系统(例如特开2000-342256的图4)。由于该系统是包括具有vir结构域(virA、virB、virC、virD、virE以及virG(以下也将这些各叫做“vir片段结构域”))的解除型Ti质粒以及具有T-DNA的质粒，因此是双元载体系统的一种。但在使用超级双元载体这点上是不同的，超级双元载体是在具有T-DNA的端的质粒上，即在双元载体上，整合了实质上去除了vir片段结构域中至少一种vir片段结构域的vir结构域片段(其中优选至少含有virB或virG的片段，更优选含有virB和virG的片段)。此外，在具有超级双元载体的土壤杆菌中导入整合了期望基因的T-DNA结构域时，通过三系杂交法的同源整合可作为容易的手法来利用。

在本发明方法中，作为成为宿主的的土壤杆菌属细菌，没有特别的限制，可以优选使用土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens，土壤根瘤杆菌)(例如上述的土壤杆菌LBA4404(参考Hoekema，A，等，(1983)，Nature，Vol.303，p.179-180)以及EHA101。

根据本发明的方法，只要是基于土壤杆菌属细菌中病原性(vir)结构域的基因组的表达的基因导入系，可以没有特别的限制就得到有意义的效果。因此，对于上述的中间载体、双元载体、强病原性双元载体、超级双元载体等中的任何载体系统都可以使用，可以取得本发明的效果。在使用将这些载体改变的不同载体系统时，也是同样的(例如将土壤杆菌属细菌vir结构域的一部分或者全部切除，然后整合加入到质粒中，将vir结构域的一部分或者全部切除，作为新的质粒的一部分导入到土壤杆菌中等)。此外，根据本发明的方法，在野生型的土壤杆菌属细菌中，也可以提高野生型T-DNA结构域向植物的导入效率，事实上提高感染效率。

期望向植物中导入的基因可以基于以下适当的选择标准来选择：可以通过常规方法整合到上述质粒的T-DNA结构域中的限制酶部位中，基于在该质粒上同时或者是以别的途径整合的对PPT(フオスフイノスライシン，草丁膦)，潮霉素、卡那霉素、巴龙霉素等药物具有耐药性的基因等进行选择。对于体积大、具有多个限制部位的基因，以通常亚克隆手法将期望的DNA导入到T-DNA结构域内不是都容易。在这样的情况下，可以通过三系杂交法，利用土壤杆菌属细菌细胞内的同源整合，将目的DNA导入。尽管没有限定，但被导入的基因的大小优选是大约100bp～200kbp。

此外，将质粒导入到土壤杆菌(Agrobactorium tumefaciens，根瘤土壤杆菌)等土壤杆菌属细菌中的操作可以通过现有方法进行，举例的话包括上述的三系杂交法和电穿孔法、电子注射法、PEG等化学处理的方法。

要导入到植物中的基因，与现有技术一样，基本上是配置在T-DNA的左右边界序列之间的。然而，因为质粒是环状的，边界序列的数可以是1，在要将多个基因配置在不同部位上时，边界序列可以是3个或3个以上。此外，在土壤杆菌属细菌中，可以配置在Ti和Ri质粒上，或者也可以配置在其他质粒上。甚至，还可以配置在多种质粒上。

关于工序c)

通过土壤杆菌属细菌进行基因导入的方法，可以通过使植物材料与土壤杆菌属细菌单独的接触来进行。例如，可以通过制备大约10⁶～10¹¹cfu/ml程度的细胞浓度的土壤杆菌属细菌悬浊液，将植物材料在该悬浊液中浸渍3～10分钟左右，在固体培养基上进行数日的共存培养来进行。

优选在使土壤杆菌感染植物材料的同时，或者感染之后除去土壤杆菌之前，将植物材料与土壤杆菌共存培养。在共存培养中使用公知的培养基。例如，在实施例中使用的LS-AS培养基、nN6-As培养基、或者其他、N6S3-AS培养基、2N6-AS培养基(参考Hiei，Y.，等，(1994)，The Plant Journal，Vol.6，p.271-282)等培养基是已知的。

本发明的方法相对于一般的以土壤杆菌法进行基因导入/转化的特色在于，上述土壤杆菌感染植物材料的工序(c)是在粉体存在的条件下进行的。

关于工序d)以及e)

进一步根据期望，为了得到转化体，在上述工序c)之后，需要进行：

d)筛选转化细胞的工序；以及

e)根据期望，将筛选的转化体进行再分化的工序。

即，一般地，为了进行植物的转化，在将外源基因导入到植物细胞后，筛选外源基因稳定地整合到染色体上的植物细胞是必要的。

筛选转化细胞的工序是指，通过表型的数据以及/或者物理数据，筛选具有目的性状的细胞。

表型的数据例如转化效率可以通过进行以下评价来得到：与期望导入到植物中的基因一起，导入标记基因以及/和选择标记基因，评价其表达。作为标记基因以及/和选择标记基因，可以使用例如GUS(β-葡糖醛酸酶)基因，以及/或耐抗生素基因(例如耐PPT(草丁膦)基因，耐潮霉素基因、耐卡那霉素基因、耐巴龙霉素基因)等。作为标记基因使用GUS时，转化的评价可以通过与GUS切割X-Gulc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸)相伴的显色来评价。作为选择标记基因使用耐抗生素基因时，在转化后，可以由在加有抗生素的选择培养基上生长的情况来评价。

进一步，为了确认外源基因稳定地整合到染色体上，也可以得到Southern印迹等的物理数据。此外，也可以进行向有性生殖后代的传递的工序、以及基于向后代集团的遗传性以及分子性分析的筛选的工序。

也可以根据期望进行筛选的转化体的再分化，培育再分化个体，然后得到完整的植物体。在由筛选的转化细胞再生长成完整的植物体中，可以根据公知的方法(例如Hiei，Y.，等，(1994)，The Plant Journal，Vol.6，p.271-282；以及Ishida，Y.，等，(1996)，Nature Biotechnology，Vol.4，p.745-750)进行。

本发明的方法，与不存在粉体而进行的情况相比较，在粉体存在的条件下，以土壤杆菌属细菌来进行将基因导入到植物材料中的情况提高了基因导入效率以及/或转化效率。基因导入效率可以通过例如评价导入的基因的暂时性(一过性)表达范围来进行评价。在后面的实施例中，评价了未成熟胚中GUS基因的暂时性表达。

转化效率可以通过例如将由接种的未成熟胚得到的再分化植物中显示了GUS基因表达的植物作为转化体来计数，以接种的未成熟胚的数除其总数来算出。或者也可以通过将再分化植物中对于筛选压力显示出抵抗性的植物作为转化体来计数，以接种的未成熟胚的数除其总数来算出。

如上所述，本发明的方法的特色在于，上述土壤杆菌感染植物材料的工序(c)是在粉体存在的条件下进行的。因此，本发明的基因导入以及/或转化方法，可以用以下的方式记述也可被理解。

本发明的方法是以土壤杆菌属细菌来进行植物的导入基因以及/或进行转化的方法，其包含以下工序：

a)制备植物材料的工序；

b)制备含有载体的土壤杆菌属细菌的工序，所述载体具有期望导入的基因；以及

c)在粉体存在的条件下，使a)制备的植物材料感染b)制备的土壤杆菌属细菌的工序；

根据期望，为了得到转化体，在上述工序c)之后包括：

d)筛选转化细胞的工序；以及

e)根据期望，将筛选出的转化体进行再分化的工序。

一种形式为，本发明的方法是使用土壤杆菌属细菌来进行植物的导入基因以及/或进行转化的方法，其包含以下工序：

a)制备植物材料的工序；

b)制备含有载体的土壤杆菌属细菌的工序，所述载体具有期望导入基因；

c-1)混合b)制备的土壤杆菌属细菌悬浊液和粉体的工序，以及

c-2)将(c-1)的混合物接种到a)制备的植物材料，从而使植物材料感染土壤杆菌属细菌的工序；

根据期望，为了得到转化体，在上述工序c-2)之后包括：

d)筛选转化细胞的工序；以及

e)根据期望，将筛选出的转化体进行再分化的工序。

其它形式中，本发明的方法是使用土壤杆菌属细菌来进行植物的导入基因以及/或进行转化的方法，其包含以下工序：

a)制备植物材料的工序；

c-1)混合a)制备的植物材料和粉体的工序；以及

c-2)将b)制备的土壤杆菌属细菌的悬浊液接种到c-1)的混合物中，从而使植物材料感染土壤杆菌属细菌的工序；

根据期望，为了得到转化体，在上述工序c-2)之后包括：

d)筛选转化细胞的工序；以及

e)根据期望，将筛选出的转化体进行再分化的工序。

其他形式中，本发明的方法是使用土壤杆菌属细菌来进行植物的导入基因以及/或进行转化的方法，其包含以下工序：

a)制备植物材料的工序；

c)通过同时混合a)制备的植物材料、b)制备的土壤杆菌属细菌悬浊液和粉体，使植物材料感染土壤杆菌属细菌的工序；

根据期望，为了得到转化体，在上述工序c)之后包括：

d)筛选转化细胞的工序；以及

e)根据期望，将筛选出的转化体进行再分化的工序。

本发明的植物的基因导入以及/或转化植物的制造方法中可以使用的粉体的性质、材料、粒径以及用量与本发明的植物的基因导入的方法中所述的相同。

另外，本发明的植物的基因导入以及/或转化植物的制造方法中以土壤杆菌属细菌悬浊液接种到植物细胞，可依据上述的方法、混合时间和共存培养时间来进行。

此外，本发明的植物的基因导入以及/或转化植物的制造方法中制造的转化植物与本发明的基因导入方法中提供的植物相同。

发明的效果

与不存在粉体的现有的方法相比，在粉体存在的条件下，使土壤杆菌属细菌(接种源)接种到植物材料，可见高效的基因导入。另外，利用同样方法的转化愈伤组织的形成率以及转化植物的生成效率都有明确的提高。因此，本发明提供了具有高的基因导入效率和转化效率的，利用土壤杆菌法的植物的基因导入和转化方法。

附图的简单说明

图1为显示粉体的添加对于水稻的转化效率的效果的图。对各区5个未成熟胚进行接种。纵轴表示相对于每个接种未成熟胚所得到的潮霉素抵抗性植物的数目，横轴的SG表示硅胶和HA表示羟基磷灰石。

图2为显示粉体粒径对于水稻的转化效率的效果的图。对各区9～12个未成熟胚进行接种。纵轴表示相对于每个接种未成熟胚得到的再分化愈伤组织的数，横轴表示添加的粉体的粒径。Count.表示不添加粉体的对照。

图3为显示粉体的量对水稻中导入基因的暂时性表达的效果的图。对各区10个未成熟胚进行接种。纵轴表示未成熟胚中GUS基因的表达。该值是这样评价的值：将共存培养后的未成熟胚用X-Gluc染色后，在胚盘的75％以上的部位显示GUS基因表达的未成熟胚作为3，25～74％的部位显示表达的作为2，5～24％的部位显示表达的作为1，不到5％的部位显示表达的作为0.5，没有发现表达的作为0。横轴表示添加的粉体的量。

图4为显示粉体的添加对于水稻的转化效率的效果的图。对各区9～10个未成熟胚进行接种。纵轴表示相对于每个接种未成熟胚所得到的再分化愈伤组织的数目，横轴表示添加的粉体的数量。

图5为显示沸石的量对于水稻中导入基因的暂时性表达的效果的图。对各区14～15个未成熟胚进行接种。纵轴表示未成熟胚的GUS基因的表达。该值是这样评价的值：将共存培养后的未成熟胚用X-Gluc染色后，在胚盘的25％以上的部位显示GUS基因表达的未成熟胚作为3，10～24％的部位显示表达的作为2，不到10％的部位显示表达的作为1，没有发现表达的作为0。横轴表示添加的沸石的粒径。无添加表示无添加粉体的对照

图6为显示向接种源添加混合粉体对于导入基因的暂时性表达的效果的图。对各区12～13个未成熟胚进行接种。纵轴是表示未成熟胚的GUS基因的表达。该值是这样评价的值：将共存培养后的未成熟胚用X-Gluc染色后，在胚盘的75％以上的部位显示GUS基因表达的未成熟胚作为3，25～74％的部位显示表达的为作2，5～24％的部位显示表达的作为1，不到5％的部位显示表达的作为0.5，没有发现表达的作为0。横轴的SG表示硅胶，HA表示羟基磷灰石，GW表示磨碎的玻璃棉。无添加表示无添加粉体的对照。

图7为显示向接种源添加粉体对于向水稻愈伤组织导入基因的暂时性表达的效果的图。对各区6个未成熟胚进行接种。纵轴表示接种愈伤组织中GUS基因的表达。该值是这样评价的值：将共存培养后的愈伤组织用X-Gluc染色后，在胚盘的75％以上的部位显示GUS基因表达的未成熟胚作为3，25～74％的部位显示表达的为作2，5～24％的部位显示表达的作为1，不到5％的部位显示表达的作为0.5，没有表达的作为0。横轴的SG表示硅胶，HA表示羟基磷灰石，无添加表示无添加粉体的对照。

图8为显示向接种源添加粉体对于水稻转化效率的效果的图。对各区6个愈伤组织进行接种。纵轴表示相对于每个接种愈伤组织所得到的再分化愈伤组织的数目，横轴HA表示羟基磷灰石，无添加表示无粉体添加的对照。

图9为显示向接种源添加混合粉体对于向接种了普通双元载体的水稻未成熟胚中导入基因的暂时性的效果的图。对各区11～12个未成熟胚进行接种。纵轴表示未成熟胚中GUS基因的表达。该值是这样评价的值：将共存培养后的未成熟胚用X-Gluc染色后，在胚盘的75％以上的部位显示GUS基因表达的未成熟胚作为3，25～74％的部位显示表达的作为2，5～24％的部位显示表达的作为1，不到5％的部位显示表达的作为0.5，没有表达的作为0。横轴的GW表示磨碎的玻璃棉，HA表示羟基磷灰石，无添加表示无添加粉体的对照。

实施例

以下通过实施例具体地说明本发明，但本发明不被这些实施例所限制。本领域普通技术人员基于本说明书的描述可以容易的在本发明上追加修饰、变更，这些也包含在本发明的技术范围内。

实施例1：粉体存在条件下的水稻的转化

材料及方法

(1)土壤杆菌菌株以及质粒

在土壤杆菌及其载体方面，使用LBA4404(pSB134)。LBA4404(pSB134)按照以下的方法制备。将来自pIG221(Ohta，S.，等，(1990)Plant Cell Physiol.，31：805-813)的GUS表达单元插入到pKY205(Kuraya，Y.，等，(2004)Mol.Breed.，14：309-320)的玉米泛素启动子控制的HPT基因的上游的HindIII限制部位上。将该质粒导入到LBA4404(pSB1)(Komari，T.，等，(1996)Plant J.，10：165-174)得到LBA4404(pSB134)。

(2)供试品种及组织

使用日本稻品种“雪光”作为供试品种。除去开花后第8～14日的未成熟种子的芒，用70％的乙醇进行数秒处理，用含有吐温20(ツイ一ン20)(和光纯药株式会社)的1％的次氯酸钠水溶液进行15分钟的灭菌处理。用灭菌水数次洗净后，挑选出长为1.5～2mm的未成熟胚作为供试组织。

(3)接种源的制备

羟基磷灰石(Bio-Rad)以及硅胶(ICN Pharmaceuticals)作为粉体供试。将80～100mg的粉体放入试管中，高压灭菌釜进行灭菌处理。以白金接种环挑取在AB培养基(Chilton，M-D，等，(1974)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，71：3472-3676)培养3～5天的土壤杆菌的菌落，以1×10⁸～1×10⁹cfu/ml的浓度混悬于改进AA培养基(AA主要无机盐类、AA氨基酸以及AA维生素类(Toriyama K.，等，(1985)Plant Sci.，41：179-183)、MS微量盐类(Murashige，T.and Skoog，F.，(1962)Physiol.Plant，15：473-497)、1.0g/l酪蛋白水解物(カザミノ酸)、100μM乙酰丁香酮、0.2M蔗糖、0.2M葡萄糖)中。放入粉体的试管中加入1ml的土壤杆菌悬浊液作为接种源。

(4)接种以及共存培养

将无菌挑出的未成熟胚接种到2N6-AS培养基上。为了使粉体均匀分散在细菌悬浊液中，用涡旋混合器搅拌数秒后，对每个未成熟胚将5μl的悬浊液滴在未成熟胚上。待滴下的接种源干燥后，将未成熟胚移到相同培养基的其他地方。将培养容器密封后，于25℃，黑暗下进行共存培养7天。对于一部分的未成熟胚通过用X-gluc处理，考察GUS表达(Hiei等，1994)。即，在共存培养处理后，立即将组织浸渍于含有0.1％的Triton X-100的0.1M磷酸缓冲液(pH6.8)中，37℃静置1小时。用磷酸缓冲液除去土壤杆菌后，添加含有1.0mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(X-Gluc)以及20％甲醇的磷酸缓冲液。于37℃处理24小时后，于显微镜下观察呈蓝色的组织。

(5)筛选以及再分化

将共存培养后的未成熟胚用医用刀(メス)分成4～6份，植于nN6CC培养基(N6无机盐、N6维生素、0.5g/L水解酪蛋白氨基酸、0.5g/L L-脯氨酸、1mg/L 2，4-D、0.5mg/L NAA、0.1mg/L 6BA、20g/L蔗糖、55g/L山梨醇、250mg/L头孢噻肟(セフオタキシム)、250mg/L羧苄西林、5g/L凝胶剂(ゲルライト)、pH5.8)或NBK4CC(NBK4主要无机盐、B5微量无机盐、B5维生素、AA氨基酸、0.5g水解酪蛋白氨基酸、0.5g/L L-脯氨酸、1mg/L 2，4-D、0.5mg/L NAA、0.1mg/L 6BA、20g/L麦芽糖、55g/L山梨醇、250mg/L.头孢噻肟、250mg/L羧苄西林、5g/L凝胶剂、pH5.8)。在照明下，于28℃培养1周后，用医用刀分成5份，植于含有潮霉素50mg/L的nN6CC培养基或NBK4CC培养基，同条件下培养10天。使增殖的细胞块植于含有潮霉素50mg/L的再分化培养基(N6无机盐、N6维生素、AA氨基酸、1g/L水解酪蛋白氨基酸、0.5mg/L细胞分裂素(カイネチン)、20g/L蔗糖、30g/L山梨醇、4g/L凝胶剂、pH5.8)或(NBK4主要无机盐、B5微量无机盐、B5维生素、AA氨基酸、1g/L水解酪蛋白氨基酸、2mg/L细胞分裂素、20g/L麦芽糖、30g/L山梨醇、5g/L凝胶剂、pH5.8)。同条件下约培养2周。

(6)转化效率的计算

对接种了土壤杆菌的未成熟胚，在胚盘的大范围观察显示了GUS基因的暂时性表达的点。可以认为即使在一个胚盘中，不同部位观察到的点也是分别来自基因导入形成的独立的转化细胞。当将共存培养以及静息培养(レステイング培养)后增殖的未成熟胚分成4至6块时，认为即使是来源于1个未成熟胚，分割得到20～30个细胞块在潮霉素存在条件下增殖而得的愈伤组织以及其再分化植物是各自独立的转化体。

由分割得到的细胞块增殖形成潮霉素抵抗性愈伤组织，从1个细胞块选择1个愈伤组织，植于含有潮霉素的再分化培养基上。将这样得到的潮霉素抵抗性再分化植物作为转化体计数，以接种的未成熟胚的数除其总数来算出转化效率。

结果

(7)导入基因的暂时性表达

将共存培养后的未成熟胚用X-Gluc处理，在所有的未成熟胚都可见显示GUS基因的暂时性表达的蓝色的点，在接种源中添加粉体，与接种了的未成熟胚中没添加粉体的作为对照的未成熟胚相比，可见大范围部位呈现蓝色，显示粉体的添加促进了基因导入。

(8)转化效率

将共存培养后的未成熟胚在含有潮霉素的培养基中培养，将得到的愈伤组织植于含有潮霉素的再分化培养基中培养。潮霉素抵抗性再分化植物可从任一未成熟胚得到，在接种源中添加粉体接种的未成熟胚与没添加粉体的对照的未成熟胚相比，潮霉素抵抗性再分化植物的数目多，可见通过添加粉体使转化效率提高(图1)。

实施例2：粉体存在条件下的玉米的转化

材料及方法

(1)土壤杆菌菌株以及质粒

在土壤杆菌及其载体方面，使用LBA4404(pSB131)。(Ishida，Y.，等，(1996)Nature Biotechnology，14：745-750)。

(2)供试品种及组织

使用玉米近交株A188作为供试品。从交配后第8～14日的雌穗上无菌摘取大小为1.0～1.2mm的未成熟胚作为供试组织。

(3)接种源的制备

羟基磷灰石(Bio-Rad)、硅胶(ICN Pharmaceuticals)以及乳钵磨碎的玻璃棉作为粉体供试。将80～100mg的粉体放入试管中，高压灭菌釜进行灭菌处理。以白金接种环挑取在YP培养基(5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、5g/LNaCl、pH6.8)上培养3～5天的土壤杆菌的菌落，以1×10⁸～1×10⁹cfu/ml的浓度混悬于LS-inf培养基(Ishida，Y.，等，(1996)NatureBiotechnology，14：745-750)中。放入粉体的试管中加入1ml的土壤杆菌悬浊液作为接种源。

(4)接种以及共存培养

接种以一般接种和滴下接种(滴下接種)2种方法进行。

一般接种按以下方法进行。使无菌挑出的未成熟胚在46℃，处理3分钟后，在15000rpm，4℃下离心处理10分钟。混合热处理以及离心处理了的未成熟胚和接种源，用涡旋混合器搅拌30秒。将未成熟胚植于含有5μM的AgNO₃以及5μM的CuSO₄的LS-AS培养基中，将培养容器密封后，于25℃，黑暗下进行共存培养7日。

滴下接种按以下方法进行。将热处理以及离心处理了的未成熟胚植于含有5μM的AgNO₃以及5μM的CuSO₄的LS-AS培养基中。为了使粉体均匀分散在细菌悬浊液中，用涡旋混合器轻轻搅拌后，对每个未成熟胚滴下5μl的悬浊液。待滴下的接种源干燥后，将未成熟胚移到同一培养基的其它部位。将培养容器密封后，于25℃，黑暗下进行共存培养7日。

对于一部分的未成熟胚通过用X-Gluc处理，考察GUS表达(Hiei等，(1994)The Plant Journal，6：271-282)。即，在共存培养处理后，立即将组织浸渍于含有0.1％的Triton X-100的0.1M磷酸缓冲液(pH6.8)中，37℃静置1小时。用磷酸缓冲液除去土壤杆菌后，添加含有1.0mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(X-Gluc)以及20％甲醇的磷酸缓冲液。于37℃处理24小时后，于显微镜下观察呈蓝色的组织。

(5)筛选以及再分化

将未成熟胚植于含有5mg/L的草丁膦(PPT)的改良LSD1.5培养基(Ishida，Y.，等，(2003)Plant Biotechnology，20：57-66)。于25℃黑暗下培养10～14天后，用含有10mg/L的PPT的改良LSD1.5培养基培养。将增殖的细胞块植于含有5mg/L的PPT以及10μM的CuSO₄的LSZ再分化培养基(Ishida，Y.，等，(1996)Nature Biotechnology，14：745-750)，于25℃照明下培养约2周。切取再分化的植物叶片，通过X-Gluc处理考察GUS基因表达。

结果

(6)导入基因的暂时性表达

将共存培养后的未成熟胚用X-Gluc处理，在所有的未成熟胚都可见显示GUS基因的暂时性表达的蓝色的点，但一般接种、滴下接种的情况都是在接种源中添加粉体而接种的未成熟胚与没添加粉体的对照的未成熟胚相比，可见大范围呈现蓝色。显示粉体的添加促进了基因的导入。

(7)转化效率

将共存培养后的未成熟胚在含有PPT的培养基中培养，将得到的愈伤组织植于含有PPT的再分化培养基中培养。对可见再分化的PPT抵抗性植物进行GUS分析。GUS阳性植物可从任一未成熟胚得到，但一般接种、滴下接种的情况都是在接种源中添加粉体而接种的未成熟胚与没添加粉体的对照的未成熟胚相比，GUS阳性植物的数目多，显示通过添加粉体可提高转化效率(表1)。由于添加粉体而导致的转化效率的提高，当将未成熟胚在与土壤杆菌以及粉体共存的条件下进行搅拌后，不仅可见于植于共存培养基的情况(一般接种)，也可见于将粉体与土壤杆菌的混合液滴到未成熟胚上的情况。这显示转化效率的提高是由于粉体对植物组织的创伤。

[表1]

表1粉体的添加对于玉米转化效率的效果

GW，磨碎玻璃棉；SG，硅胶；HA，羟基磷灰石

实施例3：粉体(硅胶)的粒径的效果

材料及方法

(1)土壤杆菌菌株以及质粒

在土壤杆菌及其载体方面，使用LBA4404(pSB 134)。

(2)供试品种及组织

使用日本稻品种“雪光”作为供试品。除去开花后第8～14日的未成熟种子的芒，用70％的乙醇处理数秒，用含有吐温20(和光纯药株式会社)的1％的次氯酸钠水溶液进行15分钟的灭菌处理。用灭菌水数次洗净后，挑出长为1.5～2mm的未成熟胚作为供试组织。

(3)接种源的制备

不同粒径的硅胶5种(粒径：5～20μm、20～40μm、45～75μm、75～150μm、150～425μm的硅胶；和光纯药工业株式会社)作为粉体供试。将120mg的粉体放入试管中，高压灭菌釜进行灭菌处理。以白金接种环挑取在AB培养基(Chilton，M-D，等，(1974)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，71：3472-3676)上培养了3～5天的土壤杆菌的菌落，以1×10⁸～1×10⁹cfu/ml的浓度混悬于改进AA培养基(AA主要无机盐类、AA氨基酸以及AA维生素类(Toriyama K.，等，(1985)Plant Sci.，41：179-183)、MS微量盐类(Murashige，T.and Skoog，F.，(1962)Physiol.Plant，15：473-497)、1.0g/l水解酪蛋白氨基酸、100μM乙酰丁香酮、0.2M蔗糖、0.2M葡萄糖)中。放入粉体的试管中加入1ml的土壤杆菌悬浊液作为接种源。

(4)转化植物的制备

接种、共存培养、筛选、再分化以及转化效率的计算按照实施例1的方法进行。

结果

(5)导入基因的暂时性表达

将共存培养后的未成熟胚用X-Gluc处理。包括无粉体添加的对照在内，任一处理区都可见显示GUS基因一过性表达的蓝色的点，但将粒径150μm以下的硅胶添加到接种源而接种的未成熟胚，与无粉体添加的对照以及150μm以上的硅胶添加到接种源而接种的未成熟胚相比，可见大范围的呈蓝色部位，显示了粉体粒径所致的对基因导入的促进程度的不同。

(6)转化效率

将共存培养后的未成熟胚在含有潮霉素的培养基中培养，将得到的愈伤组织植于含有潮霉素的再分化培养基中培养。潮霉素抵抗性再分化植物可从任一未成熟胚得到，但将粒径150μm以下的硅胶添加到接种源而接种的未成熟胚，与无粉体添加的对照以及150μm以上的硅胶添加到接种源而接种的未成熟胚相比，可见潮霉素抵抗性再分化植物的数目多，转化效率提高(图2)。

实施例4：粉体(活性炭以及硅胶)的量的效果

材料及方法

(1)土壤杆菌菌株以及质粒

在土壤杆菌及其载体方面，使用LBA4404(pSB 134)。

(2)供试品种及组织

使用日本稻品种“雪光”作为供试品。除去开花后第8～14日的未成熟种子的芒，用70％的乙醇处理数秒，并用含有吐温20(和光纯药株式会社)的1％的次氯酸钠水溶液进行15分钟的灭菌处理。用灭菌水数次洗净后，挑出长为1.5～2mm的未成熟胚作为供试组织。

(3)接种源的制备

将活性炭以及硅胶(和光纯药工业株式会社)作为粉体供试。将0～240mg的粉体放入试管中，高压灭菌釜进行灭菌处理。以白金接种环挑取在AB培养基(Chilton，M-D，等，(1974)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，71：3472-3676)上培养了3～5天的土壤杆菌的菌落，以1×10⁸～1×10⁹cfu/ml的浓度混悬于改进AA培养基(AA主要无机盐类、AA氨基酸以及AA维生素类(Toriyama K.，等，(1985)Plant Sci.，41：179-183)、MS微量盐类(Murashige，T.and Skoog，F.，(1962)Physiol.Plant，15：473-497)、1.0g/l水解酪蛋白氨基酸、100μM乙酰丁香酮、0.2M蔗糖、0.2M葡萄糖)中。放入粉体的试管中加入1ml的土壤杆菌悬浊液作为接种源。

(4)接种、共存培养以及转化植物的制备

结果

(5)导入基因的暂时性表达

将共存培养后的未成熟胚用X-Gluc处理。包括无粉体添加的对照在内，任一的处理区都可见显示GUS基因的暂时性表达的蓝色的点，在以每1mL接种源添加60mg以上的活性炭的方式向接种源添加活性炭而接种的未成熟胚中，与无粉体添加的对照以及30mg以下的粉体添加到接种源中而接种的未成熟胚相比，可见大范围呈现蓝色，显示了粉体的量对基因导入促进程度的不同(图3)。

(6)转化效率

将共存培养后的未成熟胚在含有潮霉素的培养基中培养，将得到的愈伤组织植于含有潮霉素的再分化培养基中培养。潮霉素抵抗性再分化植物可从任一未成熟胚得到，在将30mg以上的硅胶添加到接种源而接种的未成熟胚中，与无粉体添加的对照相比，可见潮霉素抵抗性再分化植物的数目多，转化效率提高(图4)。

实施例5：沸石的效果

材料及方法

(1)土壤杆菌菌株以及质粒

在土壤杆菌及其载体方面，使用LBA4404(pSB131)。

(2)供试品种及组织

使用玉米近交株A188作为供试品。从交配后第8～14日的雌穗中无菌摘取大小为1.0～1.2mm的未成熟胚作为供试组织。

(3)接种源的制备

以两种粒径的沸石(5μm、75μm；和光纯药工业株式会社)作为粉体供试。粉体的灭菌以及接种源的制备按照实施例2所述的方法进行。

(4)接种以及共存培养

接种按照实施例2所述的滴下接种法进行。共存培养后的未成熟胚的GUS未成熟胚的考察按照实施例2所述的方法进行。

结果

(5)导入基因的暂时性表达

将共存培养后的未成熟胚用X-Gluc处理。在所有的未成熟胚中都可见显示GUS基因的暂时性表达的蓝色的点，但在接种源中添加沸石而接种的未成熟胚与对照的未成熟胚相比，可见GUS基因的表达部位范围大。观察到与粒径5μm的沸石相比，用粒径75μm的沸石可见更大范围的GUS基因的表达(图5)。

实施例6：混合的粉体的效果

材料及方法

(1)土壤杆菌菌株以及质粒

在土壤杆菌及其载体方面，使用LBA4404(pSB134)。

(2)供试品种及组织

使用日本稻品种“雪光”作为供试品种。供试组织的制备按照实施例4所述的方法进行。

(3)接种源的制备

将硅胶、羟基磷灰石以及磨碎玻璃棉作为粉体供试。将总量120mg的粉体放入试管中，高压灭菌釜进行灭菌处理。混合两种粉体时各取约60mg，混合3种粉体时各取约40mg放入试管灭菌。土壤杆菌悬浊液的制备按照实施例4所述的方法进行。放入粉体的试管中加入1ml的土壤杆菌悬浊液作为接种源。

(4)接种以及共存培养

接种、共存培养方法以及GUS表达的考察按照实施例1所述的方法进行。

结果

(5)导入基因的暂时性表达

将共存培养后的未成熟胚用X-Gluc处理。包括无粉体添加的对照在内，任一的处理区都可见显示GUS基因的暂时性表达的蓝色的点，但将粉体添加到接种源而接种的未成熟胚，与无粉体添加的对照相比，可见大范围呈现蓝色。1种粉体与2种粉体或3种混合粉体间对基因导入促进的程度未见大的差异(图6)。

实施例7：粉体存在条件下的水稻愈伤组织的转化

(1)土壤杆菌菌株以及质粒

在土壤杆菌及其载体方面，使用LBA4404(pSB134)。

(2)供试品种及组织

使用日本稻品种“雪光”作为供试品种。除去开花后第8～14日的未成熟种子的芒，用70％的乙醇处理数秒，用含有吐温20(和光纯药株式会社)的1％的次氯酸钠水溶液进行15分钟的灭菌处理。用灭菌水数次洗净后，挑出长为1.5～2mm的未成熟胚植于2N6-AS培养基。在黑暗下，于25℃培养1周，由愈伤组织增殖得的未成熟胚作为供试组织。

(3)接种源的制备

将羟基磷灰石(Bio-Rad)作为粉体供试。接种源的制备按照实施例1所述的方法进行。

(4)接种及共存培养

为了确定导入基因的暂时性表达，将愈伤组织植于2N6-AS培养基上。为了使粉体均匀分散在细菌悬浊液中，用涡旋混合器搅拌后，对每个愈伤组织滴下10μl的悬浊液。待滴下的接种源干燥后，将愈伤组织移到同一培养基的其它部位。共存培养的方法以及GUS表达的考察按照实施例4所述的方法进行。

转化植物的制备

为了确定转化效率，对愈伤组织的接种、共存培养、筛选、再分化以及转化效率的计算按照实施例1所述的方法进行。细菌悬浊液的滴下量为10μl。

结果

(5)导入基因的暂时性表达

将共存培养后的未成熟胚用X-Gluc处理。与接种了无粉体添加的接种源的愈伤组织相比，在接种源种添加了羟基磷灰石而接种的愈伤组织，可见大范围呈现蓝色，当以愈伤组织作为材料时，也显示了因粉体添加到接种源而促进基因导入(图7)。

(6)转化效率

将共存培养后的愈伤组织在含有潮霉素的培养基中培养，将增殖了的愈伤组织着床于含有潮霉素的再分化培养基中培养。与接种了无粉体添加的接种源的愈伤组织相比，由将羟基磷灰石添加到接种源而接种的愈伤组织，可见更多的潮霉素抵抗性植物的再分化，转化效率提高(图8)。

实施例8：粉体存在下的通过普通双元载体的转化

(1)土壤杆菌菌株以及质粒

在土壤杆菌及其载体方面，使用LBA4404(pIG121Hm)(Hiei，等，1994，The Plant Journal，6：271-282)。LBA4404(pIG121Hm)是普通双元载体，其不具有超级双元载体所具有的强病原性菌株的vir基因的一部分。

(2)供试品种及组织

(3)接种源的制备

将磨碎的玻璃棉以及羟基磷灰石作为粉体供试。接种源的制备按照实施例1所述的方法进行。

(4)接种以及共存培养

接种、共存培养方法以及GUS表达的考察按照实施例4所述的方法进行。

结果

(5)导入基因的暂时性表达

将共存培养后的未成熟胚用X-Gluc处理，包括无粉体添加的对照在内，任一的处理区都可见显示GUS基因的暂时性表达的蓝色的点，但与无粉体添加的未成熟胚相比，将磨碎的玻璃棉以及羟基磷灰石添加到接种源中而接种的未成熟胚，可见大范围呈现蓝色。显示即使在接种普通双元载体的情况下，通过在接种源中添加粉体也能促进基因导入(图9)。

实施例9：Southern(サザン)分析

从实施例1得到的转化植物、以及从在接种源中添加磨碎玻璃棉或活性炭的与实施例1相同的方法得到的转化植物中，按照小鞠等的方法(Komari，等，1989；Theor.Appl.Genet.，77：547-552)提取DNA，用限制酶Xbal(制限酵素)对提取的DNA进行处理，通过将GUS基因作为探针的Southern法进行基因的检测。Southern法按照Molecular Cloning(Sambrook，等，1989；ColdSpring Harbor Laboratory Press)中所述的方法进行。结果，都可在不同位置见到杂交带(バンド)，证明导入基因随机插入到了水稻基因组中。导入基因的复制数为1～4(表2)。

[表2]

表2通过Southern分析的水稻转化当代中导入基因的拷贝数

各区，分析独立的6个转化植物体。

无添加为无粉体添加的对照，HA、SG、GW、AC分别表示羟基磷灰石、硅胶、磨碎的玻璃棉和活性炭。

实施例10：导入基因向后代植物的遗传

将实施例1得到的转化植物、以及接种源中添加磨碎的玻璃棉并与实施例1同样的方法得到的转化植物进行自我繁殖，播种得到的T1种子。摘取播种后第10天的幼苗的叶子的一部分，按照实施例1的方法，考察GUS的表达。

其结果示于表3中。统计分析得到的结果(χ方分析)，任一系统中T1植物中的GUS基因的表达为适合GUS阳性：阴性的比为3∶1，或15∶1，明确了导入基因遵循孟德尔(メンデル)法则向后代植物遗传。

[表3]

表3水稻转化个体的子代中导入基因的表达

无添加为无粉体添加的对照，HA、SG、GW分别表示羟基磷灰石、硅胶、磨碎的玻璃棉。

非转化表示没有转化的品种“雪光”。

产业上的利用性

本发明开发了比现有土壤杆菌法更高效率地进行基因导入以及转化的简单的方法。根据本发明，从植物的通过土壤杆菌法的基因导入效率以及转化效率提高来看，本发明从高效进行多数的转化植物入手，对高效培育导入实用的基因的品种方面作出了贡献。

Claims

1.一种通过土壤杆菌属细菌来进行将基因导入到植物材料的方法，其特征在于，在粉体存在的条件下将土壤杆菌属细菌接种到植物材料。

2.权利要求1所述的方法，其中在粉体存在的条件下将土壤杆菌属细菌接种到植物材料的工序包括：

(1).混合土壤杆菌属细菌悬浊液和粉体，然后

(2).将(1)的混合物接种到植物材料。

3.权利要求1所述的方法，其中在粉体存在的条件下将土壤杆菌属细菌接种到植物材料的工序包括：

(1)混合植物材料和粉体，然后

(2)将土壤杆菌属细菌的悬浊液接种到(1)的混合物。

4.权利要求1所述的方法，其中在粉体存在的条件下将土壤杆菌属细菌接种到植物材料的工序包括：通过将土壤杆菌属细菌悬浊液、粉体、以及植物材料同时混合来使土壤杆菌属细菌接种到植物材料。

5.权利要求1～4任一项所述的方法，其中粉体为对生物组织没有不利的影响，并且为水不溶性的粉体。

6.权利要求5所述的方法，其中粉体还具有选自以下的一种或多种特性：对生物组织具有亲和性；具有吸附特性；以及具有表面极性。

7.权利要求1～4任一项所述的方法，其中粉体为多孔粉体。

8.权利要求7所述的方法，其中多孔粉体为多孔陶瓷粉体。

9.权利要求1～4任一项所述的方法，其中粉体选自羟基磷灰石、硅胶、沸石、其它的多孔性陶瓷、玻璃棉以及活性炭和它们的混合物。

10.权利要求1～9任一项所述的方法，其中粉体具有1～150μm的粒径。

11.权利要求1～9任一项所述的方法，其中粉体具有5～75μm的粒径。

12.权利要求1～11任一项所述的方法，其中植物材料选自植物细胞、叶、根、茎、芽、花(包含雄蕊、雌蕊等)、果实、种子、发芽种子或其它的任何部位的植物组织、外植体、生长点、未成熟胚、愈伤组织或不定胚样组织、或完全的植物体。

13.权利要求1～12中任一项所述的方法，其中植物是单子叶植物。

14.权利要求13所述的方法，其中单子叶植物选自水稻、玉米、大麦、小麦、芦笋、甘蔗以及高梁。

15.权利要求1～12中任一项所述的方法，其中植物是双子叶植物。

16.权利要求15所述的方法，其中双子叶植物选自烟草、大豆、百脉根、马铃薯、棉、向日葵。

17.一种通过土壤杆菌属细菌来进行将基因导入到植物材料的方法，所述方法包括以下工序：

(1)混合土壤杆菌属细菌悬浊液和粉体的混合工序，以及

(2)将(1)的混合物接种到植物材料的工序；

其中所述粉体选自羟基磷灰石、硅胶、沸石、其它的多孔性陶瓷、玻璃棉以及活性炭、和它们的混合物，粉体粒径为1～150μm。

18.一种通过土壤杆菌属细菌来进行将基因导入到植物材料的方法，所述方法包括以下工序：

(1)混合植物材料和粉体的工序，以及

(2)将土壤杆菌属细菌悬浊液接种到(1)的混合物的工序；

其中，所述粉体选自羟基磷灰石、硅胶、沸石、其它的多孔性陶瓷、玻璃棉以及活性炭、和它们的混合物，粉体粒径为1～150μm。

19.一种通过土壤杆菌属细菌来进行将基因导入到植物材料的方法，所述方法通过土壤杆菌属细菌进行向植物材料导入基因，该方法包括将土壤杆菌属细菌悬浊液、粉体、和植物材料同时混合而将土壤杆菌属细菌接种到植物材料的工序，所述粉体选自羟基磷灰石、硅胶、沸石、其它的多孔性陶瓷、玻璃棉以及活性炭、和它们的混合物，粉体粒径为1～150μm。

20.一种通过植物材料的转化来制备转化植物的方法，所述转化通过土壤杆菌属细菌来进行，所述方法包括以下工序：

(1)在粉体存在条件下将土壤杆菌属细菌悬浊液接种到植物材料；

(2)筛选转化的植物材料，然后

(3)将筛选出的转化体进行再分化。

21.权利要求20所述的方法，其中工序(1)包括

(i)混合土壤杆菌属细菌悬浊液和粉体，然后

(ii)将(i)的混合物接种到植物材料。

22.权利要求20所述的方法，其中工序(1)包括：

(1)混合植物材料和粉体，然后，

(2)将土壤杆菌属细菌悬浊液接种到(1)的混合物。

23.权利要求20所述的方法，其中工序(1)包括将土壤杆菌属细菌悬浊液、粉体和植物材料同时混合而将土壤杆菌属细菌接种到植物材料。