CN104114708B - 改进使用土壤杆菌属转化的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请描述了增加当使用土壤杆菌作为转化体时的植物转化频率的方法。所述方法包括将植物细胞暴露于含有表面活性剂的液体培养基中的土壤杆菌细胞。有些方法包括在暴露于土壤杆菌细胞之后将植物细胞暴露于持续光照。可用于这些方法的植物实例包括玉米植物(例如，未成熟的玉米胚)。

Description

改进使用土壤杆菌属转化的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年12月15日提交的美国临时专利申请系列号61/576,138的权益。
发明背景
植物转化通常涵盖将植物可表达的外源基因引入植物细胞，从而可以获得稳定维持并表达该外源基因的能育的后代植物所需要并加以利用的方法学。已经转化了单子叶植物和双子叶植物类别的众多成员。转基因的农作物以及水果和蔬菜具有产业价值。这类作物包括但不限于：玉米、稻、大豆、芸苔、向日葵、苜蓿、高粱、小麦、棉花、花生、番茄、马铃薯等。
已知数项用于将外源遗传物质引入植物细胞，并用于获得稳定维持和表达该引入基因的植物的技术。这类技术包括加速包覆于微粒上的遗传物质直接进入细胞(例如美国专利号4,945,050和美国专利号5,141,131)。其他转化技术包括WHISKERSTM技术。参见，例如，美国专利号5,302,523和美国专利号5,464,765。电穿孔技术也已用于转化植物。参见，例如WO87/06614、美国专利号5,472,869、美国专利号5,384,253、WO92/09696和WO93/21335。另外，可以采用植物原生质体与含有待递送的DNA的脂质体的融合、DNA的直接注射、以及其他可能的方法。
插入的DNA一旦整合到植物基因组中，其在全部后续世代中通常是相对稳定的。转化细胞在植物内以通常方式生长。它们可以形成生殖细胞并将转化的一个或多个性状传递给后代植物。可以以正常的方式种植这类植物，并且可以将其与具有相同的转化遗传因子或其他遗传因子的植物杂交。所得杂交个体具有相应的表型特性，例如，能够控制植物害虫进食的能力。
还可以使用多种可选的技术将DNA插入到宿主植物细胞中。那些技术包括但不限于，使用由根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)递送的T-DNA作为转化剂来进行转化。可以使用土壤杆菌技术来转化植物，如记载于例如美国专利号5,177,010、美国专利号5,104,310、欧洲专利申请号0131624B1、欧洲专利申请号120516、欧洲专利申请号159418B1、欧洲专利申请号176112、美国专利号5,149,645、美国专利号5,469,976、美国专利号5,464,763、美国专利号4,940,838、美国专利号4,693,976、欧洲专利申请号116718、欧洲专利申请号290799、欧洲专利申请号320500、欧洲专利申请号604662、欧洲专利申请号627752、欧洲专利申请号0267159、欧洲专利申请号0292435、美国专利号5,231,019、美国专利号5,463,174、美国专利号4,762,785、美国专利号5,004,863、和美国专利号5,159,135。已经深入研究了含有T-DNA的载体用于转化植物细胞的用途，并充分记载于欧洲专利申请120516；An et al.,(1985,EMBO J.4:277-284)；Fraley et al.,(1986,Crit.Rev.Plant Sci.4:1-46)，以及Lee和Gelvin(2008,PlantPhysiol.146:325-332)中，在本领域中已经确立。
通过土壤杆菌转化植物细胞的第一个关键步骤是使所述细菌细胞与待转化的宿主植物细胞紧密接触、结合或附着。在细胞-细胞结合之后，T-DNA从土壤杆菌转移至植物细胞的生物学是已知的。参见，例如Gelvin,2003,Microbiol.Molec.Biol.Rev.67:16-37；和Gelvin,2009,Plant Physiol.150:1665–1676。在最低程度上，至少T-DNA右边界重复序列(但经常是Ti或Ri质粒的右边界重复序列和左边界重复序列)被连接到一起成为期望插入到植物细胞中的基因的侧翼区。T-DNA的左和右边界重复序列是T-DNA转移所需的至关重要的顺式作用序列。在总的土壤杆菌属基因组中编码了各种反式作用组件。其中主要的是由vir基因编码的蛋白质，这些基因通常被发现是Ti或Ri质粒上的一系列操纵子。不同的Ti和Ri质粒在vir基因补足中有些不同，例如，virF并不总是存在。由vir基因编码的蛋白质实施许多不同的功能，包括识别植物细胞/细菌相互作用并进行信号传导、诱导vir基因转录、形成IV型分泌通道、识别T-DNA边界重复序列、形成T链、将T链转移至植物细胞、将T链输入到植物细胞核中、以及将T链整合到植物核染色体中，仅举几例。参见，例如Tzfira和Citovsky,2006,Curr.Opin.Biotechnol.17:147-154。
如果将土壤杆菌属菌株用于转化，那么可以将待插入植物细胞中的DNA克隆至特殊的质粒中，例如克隆至中间(穿梭)载体或二元载体中。中间载体不能在土壤杆菌属细胞中独立复制，但可以在一般的大肠杆菌(Escherichia coli)分子克隆菌株中对其进行操作和复制。这类中间载体通常包含这样的序列，它们被T-DNA右边界和左边界重复序列区包围，可包括对转化植物细胞的选择起作用的选择标志基因、克隆接头、克隆多接头、或其他可以充当预定用于植物细胞转化的基因的引入位点的序列。由此，使用穿梭载体作为克隆载体，可以在大肠杆菌中用标准方法学对期望转移至植物的基因容易地实施克隆和操作。随后，可以将最后经过操作的穿梭载体引入土壤杆菌属植物转化菌株中用于进一步的工作。可以通过辅助质粒(经由细菌接合)、通过电穿孔、通过化学法介导的直接DNA转化、或通过其他已知的方法学将中间载体转移至土壤杆菌中。由于在Ti或Ri质粒或其衍生物和中间质粒之间同源的序列，穿梭质粒可以通过同源重组整合到Ti或Ri质粒或其衍生物中。由此，该同源重组(即质粒整合)事件提供了在土壤杆菌属中稳定维持改变的穿梭载体的手段，所述改变的穿梭载体具有复制起点和由共整合质粒的Ti或Ri质粒部分提供的其他质粒维持功能。Ti或Ri质粒还包含vir区，vir区包含T-DNA转移所必需的vir基因。携带vir区的质粒通常是突变的Ti或Ri质粒(辅助质粒)，其中T-DNA区(包括右和左T-DNA边界重复序列)已经缺失。这类具有功能性vir基因且缺少所有或基本上所有T区和相关元件的pTi衍生质粒，在本文中被描述性地称为辅助质粒。
超二元系统是穿梭载体/同源重组系统的一个特殊化实例(综述见Komari etal.,2006,于:Methods in Molecular Biology(K.Wang编辑)No.343:AgrobacteriumProtocols,第15-41页；和Komori et al.,2007,Plant Physiol.145:1155-1160)。菌株LBA4404(pSB1)携带两种独立复制的质粒，pAL4404和pSB1。pAL4404是Ti-质粒-衍生的辅助质粒，其含有完整的vir基因集(来自Ti质粒pTiACH5)，但没有T-DNA区(且由此没有T-DNA左和右边界重复序列)。质粒pSB1供应了另一从pTiBo542衍生的vir基因部分集合；此vir基因部分集合包括virB操纵子和virC操纵子，以及基因virG和virD1。在该超二元系统中使用的穿梭载体的的一个实例是pSB11，其含有充当预定用于植物细胞转化的基因的引入位点的克隆多接头，侧翼为右和左T-DNA边界重复序列区。穿梭载体pSB11不能在土壤杆菌中独立复制，但它在通过pSB1和pSB11上存在的相同序列之间的同源重组整合到pSB1中时，被稳定维持为共整合质粒。因此，自两种不同的土壤杆菌属Ti质粒来源(pTiACH5和pTiBo542)衍生的Vir蛋白高效地(productively)作用于被引入到经修饰的pSB11载体上的LBA4404(Psb1)中的完全修饰的T-DNA区，并将其转移至植物细胞中。对超二元系统采用的根瘤土壤杆菌宿主菌株是LBA4404(pSB1)。已经证明超二元系统在单子叶植物物种的转化中特别有用。参见，Hiei et al.,(1994)Plant J.6:271–282；和Ishida et al.,(1996)Nat.Biotechnol.14:745–750。
除了土壤杆菌属Ti质粒携带的vir基因外，还已知其他染色体携带的毒力控制基因(称为chv基因)控制着土壤杆菌属细胞和植物细胞相互作用的某些方面，并由此影响总体植物转化频率(Pan et al.,1995,Molec.Microbiol.17:259-269)。毒力和附着所需要的数种染色体携带基因聚集在跨越29kb的染色体基因座中(Matthysse et al.,2000,Biochim.Biophys.Acta 1490:208-212)。
除了用于转化植物的多种技术之外，与外源基因接触的组织类型也可不同。此类组织可包括但不限于胚生组织、I型和II型愈伤组织、下胚轴以及分生组织。几乎所有植物组织均可在去分化过程中使用本领域技术人员的合适技术来转化。植物转化领域的技术人员会理解多种方法学可用于生成经转化的植物，并且它们可被修饰和特化以适应不同宿主植物种类之间的生物学差异。植物外植体(例如，叶片、茎段、分生组织、根，以及原生质体或悬浮培养细胞)可有利地与根瘤土壤杆菌或发根土壤杆菌一起培养用于将DNA转移至植物细胞中。
愈伤组织培养物 植物组织培养物可有利地与根瘤土壤杆菌或发根土壤杆菌一起培养用于将DNA转移至植物细胞中，并且通常起始于完整植物的无菌碎块，所述无菌碎块可由器官，例如，叶或根的碎块组成，或可能是特定的细胞类型，例如花粉或胚乳。已知外植体的许多特征影响培养物起始的效率。据认为，如果发现合适的条件，任何植物组织均可用作外植体。通常，较幼小、生长较迅速的组织(或处于发育早期的组织)最为有效。在合适培养基上培养的外植体可产生无结构的、处于生长及分裂中的细胞团(愈伤组织)。在培养中，愈伤组织或多或少地可无限维持，只要将它定期地传代培养至新鲜培养基上。在愈伤组织形成过程中，在形态学(愈伤组织通常由未特化的薄壁细胞组成)上和代谢上都有一定程度的去分化。
愈伤组织培养在植物生物技术中极其重要。操控培养基中的植物激素比可导致芽、根或体细胞胚的发育，随后可从芽、根或体细胞胚产生完整植物(再生)。愈伤组织培养物还可用于引发细胞悬浮物，在植物转化研究中以多种方式使用细胞悬浮物
细胞悬浮培养物 广义上讲，愈伤组织培养物归为两类之一：致密或脆弱。在致密愈伤组织中，细胞稠密聚集，而在脆弱愈伤组织中，细胞仅疏松地彼此连接，愈伤组织变得柔软并容易断开。脆弱愈伤组织提供了形成细胞悬浮培养物的接种物。来自某些植物种类或特定细胞类型的外植体往往不形成脆弱愈伤组织，使得难以引发细胞悬浮。愈伤组织的脆性有时可通过操控培养基组分、重复传代培养或将其培养于半固体培养基(具有低浓度胶凝剂的培养基)来改善。当将脆弱愈伤组织置于液体培养基中并然后搅拌时，单个细胞和/或小的细胞团释放至培养基中。在合适的条件下，这些释放的细胞继续生长并分裂，最终产生细胞悬浮培养物。细胞悬浮物可相对简单地在锥形瓶中作为分批培养物来维持，并通过重复传代培养至新鲜培养基中来繁殖。在传代培养之后，细胞分裂，培养物的生物质以特有方式增加。细胞悬浮培养物可有利地与根瘤土壤杆菌或发根土壤杆菌一起培养用于将DNA转移至植物细胞中。
茎尖和分生组织培养物 茎尖(含有茎顶端分生组织)可在活体外培养，从腋芽或不定芽产生芽团，并且可有利地与根瘤土壤杆菌或发根土壤杆菌一起培养用于将DNA转移至植物细胞中。芽分生组织培养物用于谷类再生(幼苗可用作供体材料)。
胚培养物 胚可用作外植体以产生愈伤组织培养物或体细胞胚。未成熟和成熟的胚均可用作外植体。未成熟的胚衍生的胚生愈伤组织是用于单子叶植物再生的组织，可有利地与根瘤土壤杆菌一起培养用于将DNA转移至植物细胞中。未成熟胚是能够进行细胞分裂而产生愈伤组织细胞的完整组织，其产生的愈伤组织细胞可分化产生完整植物的组织和器官。未成熟的胚可获自成熟玉米植株的受精穗，例如，使用Neuffer et al.(1982,Growing maize for genetic purposes.于:Maize for Biological Research.W.F.Sheridan编辑，UNIVERSITY PRESS,University of North Dakota,GrandForks,ND)的方法授粉的植株。Green和Phillips(Crop Sci.15:417-421(1976))描述了从玉米分离未成熟胚的例示方法。优选地，使用无菌方法自发育穗分离未成熟胚，并保持在无菌培养基中直至使用。Sidorov和Duncan,(2009,Methods in Molecular Biology:Transgenic Maize，卷526，第4章，M.Paul Scott(编辑))和美国专利号5,981,840揭示了土壤杆菌属在未成熟胚的转化中的使用。
小孢子培养物 单倍体组织可通过使用花粉或花药作为外植体而在活体外培养，可有利地与根瘤土壤杆菌一起培养用于将DNA转移至植物细胞中。愈伤组织和胚均可由花粉产生。可采用两种方法从单倍体组织体外产生培养物。第一种方法中，在固体培养基上培养花药(包围并容纳花粉的体细胞组织)。随后通过成熟花药开裂而产生花粉衍生胚。花药的开裂取决于在合适时期分离与合适的培养条件。在某些物种中，可通过切开花粉壁来避免对天然开裂的依赖。在第二种方法中，在液体培养基中培养花药，并且可诱导自花药释放的花粉形成胚。还可从发育中的花药提取未成熟的花粉并直接培养。
许多谷类(稻、小麦、大麦和玉米)需要添加有用于花粉或花药培养的植株生长调节剂的培养基。可通过直接的胚发生或通过愈伤组织期和随后的胚发生而获得自小孢子外植体的再生。
还可从雌配子体(胚珠)引发单倍体组织培养物。在某些情况下，这是比使用花粉或花药更为有效的方法。
从单倍体培养物获得的植株可能并非单倍体。这可能是由于培养期间染色体加倍的结果。染色体加倍(可通过使用诸如秋水仙素的化学试剂处理而诱导)可为有利的，这是因为在许多情况下单倍体植株并非自单倍体组织再生的所需结果。此类植株常常被称为双单倍体，这是因为它们含有两个拷贝的相同单倍体基因组。
在通过将任何前述植物材料与根瘤土壤杆菌一起培养用于将DNA转移至植物细胞而对其进行转化之后，可在置于合适的生长条件和培养基之后从受感染的植物材料再生完整植株，所述培养基可含有用于选择所转化的植物细胞的抗生素或除草剂。然后可检测如此获得的植株是否存在所插入的DNA。
细胞转化(包括植物细胞转化)可涉及构建将在特定细胞中发挥作用的表达载体。这样的载体可包含含有在调控元件(例如启动子)的调控下或与之操作性连接的基因的DNA。表达载体可含有一种或多种此类操作性连接的基因/调控元件组合。载体可为质粒形式，可单独或与其他质粒联合使用，以利用本文所述转化方法将转基因引入植物细胞的遗传材料中而提供转化细胞。
植物细胞表达载体可包含至少一种可操作地与调控元件(例如启动子)连接的遗传标志，所述遗传标志可允许含有所述标志的转化细胞通过阴性选择(即抑制不含有选择标志基因的细胞生长)或阳性选择(即筛选遗传标志编码的产物)而回收。许多适于植物转化的选择标志基因是转化技术领域公知的，包括，例如，编码对选择性化学剂(其可以是抗生素或除草剂)进行代谢性去毒的酶的基因，或编码改变的靶物(其可对抑制剂不敏感)的基因。有若干阳性选择方法也是本领域已知的。因此，单独采用的选择标志基因可允许对转化细胞进行选择，不含有所插入的DNA的细胞的生长可能被选择性化合物所抑制。对于特定选择标志基因的偏好属于本领域技术人员的自由裁量，但下文任何选择标志以及任何未在本文中列出但可以充当选择标志的其他基因都可以使用。选择标志的实例包括但不限于，对下列物质的抗性或耐受性：卡那霉素、G418、潮霉素、博来霉素、甲氨蝶呤、膦丝菌素(双丙氨膦(Bialaphos))、草甘膦、咪唑啉酮、磺酰脲及三唑嘧啶(Triazolopyrimidine)除草剂，诸如氯磺隆(Chlorosulfuon)、溴草腈(Bromoxynil)、和茅草枯(DALAPON)。
除了选择标志之外，使用报告基因也是合乎需要的。在一些情况下，可以使用报告基因而不使用选择标志。报告基因是通常不向受体生物体或组织提供生长优势的基因。报告基因通常编码提供表型变化或酶特性的蛋白质。合适的报告基因包括但不限于，编码β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、萤火虫萤光素酶、或诸如绿色荧光蛋白(GFP)和黄色荧光蛋白(YFP，基本如美国专利号7,951,923所公开)的荧光蛋白的那些。
不管采用哪种转化技术，都可以将外源基因引入基因转移载体中，该基因转移载体通过在载体中纳入植物启动子而适于在植物细胞中表达该外源基因。除了植物启动子外，还可以在植物细胞中有效地使用来自多种来源的启动子来表达外源基因。例如，可以使用细菌来源的启动子，例如章鱼碱(octopine)合酶启动子、胭脂碱(nopaline)合酶启动子、甘露碱(mannopine)合酶启动子；病毒来源的启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S和19S启动子，来自甘蔗杆状病毒的启动子等。植物衍生的启动子包括但不限于，核酮糖-1,6-二磷酸(RUBP)羧化酶小亚基(ssu)启动子、β-伴大豆球蛋白(conglycinin)启动子、菜豆蛋白(phaseolin)启动子、ADH(醇脱氢酶)启动子、热休克启动子、ADF(肌动蛋白解聚因子)启动子以及组织特异性的启动子。启动子还可以含有特定的增强子序列元件，其可以改善转录效率。典型的增强子包括但不限于，醇脱氢酶1(ADH1)内含子1和ADH1内含子6。可以使用组成型启动子。组成型启动子在近乎所有的细胞类型中且在近乎所有的时间都指导持续的基因表达(例如肌动蛋白、泛素、CaMV35S)。组织特异性启动子负责诸如叶或种子的特定细胞或组织类型中的基因表达。其他可以使用的启动子的实例包括在植物发育的某个时期有活性的以及在特定植物组织和器官中有活性的那些。此类启动子的实例包括但不限于，根特异性、花粉特异性、胚特异性、玉米穗丝(corn silk)特异性、棉花纤维特异性、种子胚乳特异性以及韧皮部特异性的启动子。
在某些情况下，可能期望使用可诱导的启动子。可诱导的启动子负责应答特定信号的基因表达，所述特定信号例如物理刺激(例如热休克基因启动子)；光(例如核酮糖二磷酸1,5羧化酶启动子)；激素(例如糖皮质激素)；抗生素(例如四环素)；代谢物；和应激(例如干旱)。还可以使用其他在植物中发挥功能的合意的转录和翻译元件，诸如例如5’非翻译前导序列、RNA转录终止序列和聚腺苷酸化添加信号序列。可以使用本领域已知的任何合适的植物特异性的基因转移载体。
含有昆虫抗性(IR)性状的转基因作物盛行于遍及北美洲的谷物/玉米和棉花植物中，并且这些性状的使用正在全球扩张。多个种子公司已经开发出商业化的转基因作物，其组合了IR和除草剂耐受(HT)性状。这些包括由Bt(苏云金芽孢杆菌)杀虫蛋白赋予的IR性状和HT性状的组合，所述HT性状对诸如以下物质耐受：乙酰乳酸合酶(ALS)抑制剂，诸如磺酰脲、咪唑啉酮、三唑嘧啶、磺酰苯胺(Sulfonanilide)等；谷氨酰胺合成酶(GS)抑制剂，诸如双丙氨膦、草铵膦(Glufosinate)等；4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)抑制剂，诸如甲基磺草酮(Mesotrione)、异噁唑草酮(Isoxaflutole)等；5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EnolPyruvylShikimate-3-Phosphate Synthase)(EPSPS)抑制剂，诸如草甘膦等；以及乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂，诸如吡氟氯禾灵(Haloxyfop)、喹禾灵(Quilzalofop)、氯甲草(Diclofop)等。其他其中转基因提供的蛋白质提供了植物对化学类除草剂耐受性的实例是已知的，所述化学类除草剂诸如苯氧酸除草剂和吡啶基氧乙酸盐(pyridyloxyacetate)生长素除草剂(参见WO2007/053482A2)、或苯氧酸除草剂和芳基氧苯氧丙酸酯(aryloxyphenoxypropionate)除草剂(参见WO2005/107437A1)。通过IR性状控制多种害虫问题的能力是有价值的商业化产品构思，而且如果在同一植物中组合昆虫控制性状和杂草控制性状，那么该产品构思的方便性也得到增强。进一步地，通过单一植物组合由Bt杀虫蛋白赋予的IR性状与一个或多个另外的HT性状(诸如那些上文所提及的)、加上一个或多个额外的输入性状(例如由Bt衍生的或其他杀虫蛋白赋予的其他昆虫抗性、由诸如RNAi等机制赋予的昆虫抗性、疾病抗性、应激耐受、改善的氮利用等)、或输出性状(例如高油含量、健康的油组成、营养改善等)，可以获得更好的价值。这类组合可以经由常规育种(例如育种堆叠)来获得，或作为牵涉同时引入多种基因(例如分子堆叠)的新转化事件共同获得。有益之处包括管理虫害的能力以及作物植物中改善的杂草控制，这为生产者和/或消费者提供次生效益。因此，可以使用本文所述方法来提供具有诸多性状的组合的转化植物，这些性状构成一个完整的改良作物品质的农艺包，能够灵活、经济地控制任何数量的农艺问题。
发明概述
本发明描述了用于植物细胞转化的方法。这些方法包括将植物细胞暴露于含有表面活性剂的液体培养基中的土壤杆菌属细胞。土壤杆菌属细胞可从固体培养基刮取或在液体生长培养基中培养，然后悬浮于含有表面活性剂的液体培养基中。表面活性剂的浓度可为0.001重量％至0.08重量％的范围。表面活性剂可为非离子型三硅氧烷表面活性剂，并且可以使用多于一种的表面活性剂。植物细胞可为玉米细胞。可在暴露于土壤杆菌属细胞之后将植物细胞暴露于持续光照。
附图简述
图1是条形图，显示了在共培养之前将表面活性剂S233添加至用于产生土壤杆菌属细胞(携带质粒pEPS1083)悬浮液的感染培养基时玉米未成熟胚的转化提升。
图2是条形图，显示了在共培养之前将表面活性剂S233添加至用于产生土壤杆菌属细胞悬浮液的感染培养基时玉米未成熟胚的转化提升。图2中显示的用于各实验的质粒包括：实验1＝pEPS1053；GOI＝IPT,选择标志＝aad1。实验2＝pEPS1038；GOI＝GF14,选择标志＝aad1。实验3和实验4＝pEPS1027；无GOI,选择标志＝aad1。
发明详述
本发明描述了增加使用土壤杆菌属时的植物转化频率的方法。所述方法包括将植物细胞暴露于含有表面活性剂的液体培养基中的土壤杆菌属细胞。有些方法包括将植物细胞在暴露于土壤杆菌属细胞之后暴露于持续光照。可用于这些方法的植物的实例包括玉米植株和未成熟的玉米胚。
各种土壤杆菌属菌株在其转化不同物种的植物细胞的能力上彼此不同。不管所考虑的土壤杆菌属菌株/宿主植物是何种的特定组合，土壤杆菌属均在转化过程中通过附着宿主细胞起作用。参见，McCullen和Binns,2006,Ann.Rev.Cell.Dev.Biol.22:101–127；和Citovsky et al.,2007,Cell.Microbiol.9:9–20。由于该原因，增强土壤杆菌属细胞与植物细胞结合的方法，诸如本文所披露的使用表面活性剂的那些方法，可导致转化效率增加。增强土壤杆菌属细胞与植物细胞的结合因物种和组织类型的不同而有差异，这是因为不同植物物种，乃至单一物种的植物的不同组织，在其细胞壁的化学和生化组成上有差异。另外，这样的差异在单个植物组织的不同发育时期还可以有所变化。
另外，不同属和种的细菌，而且实际上，一种细菌的不同菌株，常常在其细胞壁的化学和生物化学组成上也有差异，而且这些差异在细菌生长周期中可能有所变化。本文公开的方法对植物转化效率的增加可能是由于表面活性剂能够降低土壤杆菌属细胞壁和植物细胞壁之间的疏水性排斥相互作用，由此使得紧密细胞-细胞相互作用可能发生。
因此，可以利用不同表面活性剂之间的化学差异在植物组织的不同培养期中促进不同土壤杆菌属菌株的细胞(和此类细胞的不同生长期)与不同宿主植物细胞和组织之间的细胞-细胞相互作用，由此可观察到提高的转化效率。
表面活性剂属于几种化学类别，植物转化领域的技术人员会理解不同化学类别的表面活性剂可用于提高不同植物宿主的植物转化效率。属于这些化学类别的可用于本文公开的方法的表面活性剂的实例包括助剂、非离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、油基表面活性剂、两性表面活性剂及聚合表面活性剂。可用于本文所述方法的优选表面活性剂的一个实例是非离子型三硅氧烷表面活性剂，例如来自Evonik Industries(Essen,Germany)的S233。可用于本文所述方法的进一步优选的表面活性剂的实例包括三硅氧烷烷氧化物(trisiloxane alkoxylates)、乙氧化大豆油(ethoxylatedsoybean oils)、醇乙氧化物C-13(alcohol ethoxylate C-13s)、C12-C14-烷基二甲基甜菜碱(C12-C14-alkyldimethyl betaines)及二-仲丁基苯酚氧化乙烯-氧化丙烯嵌段共聚物(di-sec-butylphenol ethylene oxide-propylene oxide block co-polymers)。表1呈现了可用于实施本文所述方法的不同化学类型的表面活性剂的非限制列表。
表1.表面活性剂分组、化学名称和化学作用/类别
*EO＝与特定疏水物反应的氧化乙烯摩尔数
**POE＝与特定疏水物反应的氧化丙烯摩尔数
本文公开的方法利用了表面活性剂的转化增强特性来显著提高土壤杆菌属(例如根瘤土壤杆菌)对于诸如未成熟玉米胚的植物的转化效率。本文所述方法的表面活性剂是如上所建议地基于促进将会提高转化效率的细胞-细胞相互作用的能力来选择的。液体培养基中的表面活性剂浓度可为0.001重量％至0.08重量％,0.001重量％至0.07重量％,0.001重量％至0.06重量％,0.001重量％至0.05重量％,0.001重量％至0.04重量％,0.001重量％至0.035重量％,0.001重量％至0.03重量％,0.001重量％至0.025重量％,0.001重量％至0.02重量％,0.001重量％至0.015重量％,0.001重量％至0.01重量％,或0.005重量％至0.01重量％。
一种或多种另外的表面活性剂也可用于本文所述的方法。如所指明的，转化效率取决于多种因素，包括植物种、组织类型及土壤杆菌属菌株。考虑到所涉及的相互作用的多样性，具有两种或更多种表面活性剂的体系可能提供提高的转化效率。具有两种或多种表面活性剂的体系中使用的其他表面活性剂可选自例如表1。
本文所述方法广泛适用于多种植物种和品种，包括单子叶植物和双子叶植物。感兴趣的作物包括但不限于玉米、稻、大豆、加拿大油菜(canola)、向日葵、苜蓿、高粱、小麦、棉花、花生、番茄、马铃薯等。本文所述方法可用于不同发育阶段的细胞，例如未成熟胚。由此，本文所述方法可用于转化玉米未成熟胚。用于本文所述方法的未成熟胚的尺寸可以变化。例如，未成熟胚的长度可大于或等于1.5mm和小于或等于2.5mm。
可以控制在根据本文所述方法暴露于土壤杆菌属之后维持细胞的外部环境。例如，在根据本文所述方法转化之后细胞放置的温度、pH及生长培养基的其他组分可变化，它们是本领域技术人员普遍熟知的。那些变量之一是光照暴露。本文所述方法可包括在暴露于土壤杆菌属细胞之后将植物细胞暴露于常规的18小时光照/6小时黑暗方案或取而代之地暴露于持续光照。例如，根据本发明所述方法处理的细胞可在处理之后暴露于24小时白荧光条件数周，例如，直至植物制备的再生和小植株分离阶段。
另外一种方法包括制备含有表面活性剂的液体培养基，将土壤杆菌属细胞悬浮于液体培养基，及将植物细胞暴露于含有表面活性剂的液体培养基中的土壤杆菌属细胞。在悬浮于含有表面活性剂的液体培养基之前，可从固体培养基刮取土壤杆菌属细胞。另外，可在悬浮于含有表面活性剂的液体培养基之前在液体生长培养基中培养土壤杆菌属细胞。
使用土壤杆菌属转化植物的方案和方法为分子生物学领域的技术人员所公知。任何类型已知使用土壤杆菌属转化植物的方法均可用于本文所述方法。下文实施例提供了呈现本文所述方法的有效性的方法的实施方案，但并非旨在限制权利要求书的范围。
本文所提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请以及出版物均通过引用以并非与本说明书明确教导一致的程度整体并入本文。
实施例
下述实施例描述了实践权利要求书的操作程序。本文所述实施例和实施方案仅用于例示的目的，本领域技术人员将能想到根据它们所作的多种改良或改变，并且这些改良或改变包括在权利要求书的精神和范围内。除非另有指明，所有百分数均按重量计，所有溶剂混合物比例均按体积来计。所有温度均按摄氏度计。
实施例1.用于生成超二元载体的土壤杆菌属转化
土壤杆菌超二元系统方便用于转化单子叶植物宿主。用于构建和确认超二元载体的方法有充分公开，并且通过提及并入本文(Operating Manual for Plasmid pSB1,Version 3.1,获自Japan Tobacco,Inc.,Tokyo,Japan)。使用标准分子生物学和微生物学方法来生成超二元质粒。使用“Operating Manual forPlasmid pSB1”中所建议的方法学对超二元质粒的结构进行验证/确认。
该工作中使用携带不同超二元质粒的土壤杆菌菌株。所有这些质粒均含有AAD1蛋白的编码序列(CDS)(美国专利7,838,733)作为选择标志/除草剂耐受基因，其表达处于一种稻肌动蛋白1启动子和相关的内含子1(如美国专利号5,641,876和GENBANKTM登录号EU155408.1所实质公开的)的转录调控下。aad1 mRNA的转录终止和多腺苷酸化由一种玉米脂肪酶3'UTR(如GENBANKTM登录号gb|L35913.1|MZELIPASE的公开的碱基921至1277和美国专利号7,179,902所实质公开的)所决定。另外，超二元质粒携带一种其表预期不会影响转化频率的基因。特别地，在质粒pEPS1083中，一种编码YFP蛋白(实质上如美国专利号7,951,923所公开)的CDS(其转录受玉米泛素1启动子及相关的内含子1的调控；美国专利号5,510,474)，其mRNA被一个玉米Per53'UTR(美国专利号6,384,207)所终止，其被有利地用作监测转化和确定相关转化效率的可视标志。其他用于例示本文所公开的方法的超二元质粒(质粒pEPS1013,pEPS1018,pEPS1028,pEPS1036,pEPS1038,pEPS1059,pEPS1064,pEPS1066,pEPS1068,pEPS6004,及pEPS6008)携带编码Dow AgroSciences专属蛋白的CDS，它们的表达受与YFP CDS相同的转录/终止元件的调控。
在某些实验中，利用YFP的表达测试转化效率。计算表现YEP表达的愈伤组织的数量除以所处理的胚数并乘以100，作为转化效率百分数。通过使用Olympus SZX12(OlympusAmerica Inc.；Center Valley,PA)或Leica M165FC(Leica Microsystems Inc.；BuffaloGrove,IL)荧光显微镜可视观察来测量YFP表达，YFP滤光片覆盖514nm激发光和527nm测量的发射光的范围。
在其他应用携带缺乏YFP基因的超二元质粒的土壤杆菌菌株的实验中，在对基于吡氟氯禾灵抗性选择的胚产生的子代植物的分析(Life Technologies；Carlsbad,CA)之后计算转化效率。所使用的组分是aad1编码区特异性的。转化效率如下计算：用所确定的阳性事件数除以所处理的胚的数量，乘以100。用于这些目的的“事件”理解为产生一个或多个验证植株的胚。单个胚视为一个事件，不管其产生多少植株。
实施例2.土壤杆菌菌株对玉米的转化(转化方案1)
基本的工作流程如下概述。从处于幼胚长度为约1.4至1.9mm的发育期的未成熟玉米穗提取胚。当要对不同转化条件进行比较时，将从单个穗分离的约相同数量的胚分配到所有处理中。将胚与含有土壤杆菌细胞和表面活性剂(或不含表面活性剂以用于对照)的悬浮液一起温育，然后将其移至固体培养基平板，让共培养进行3至5天。将经过处理的胚转移至含有抗生素(用于抑制和杀死土壤杆菌细胞)和用于选择性分离遗传转化玉米组织和植株的化合物的培养基上。在选择性培养基上培养玉米组织(通常为但不限于愈伤组织)直至植株再生。测试这些植株以证实其遗传转化，并将具有所需修饰者培养至成熟用于种子生成。
未成熟胚的生成 将来自B104近交系的种子种植到含有SUNSHINE CUSTOM BLEND160(SUN GRO HORTICULTURE；Bellevue,WA)的4加仑盆(pot)中。使用高压钠和金属卤化物灯与16:8小时光照:黑暗光周期的组合在温室中培养植物。为了获得用于转化的未成熟胚，实施受控的近缘授粉。在授粉后10-13天，当胚大小为约1.4至1.9mm时，分离未成熟胚。在去除外壳和花丝之后，对玉米穗进行表面消毒，方法是将玉米穗浸没到含有(1或2滴/500mL)的50％商业漂白剂(5.25％次氯酸钠)中10分钟，并用无菌水漂洗3次。
将未成熟胚直接无菌分离至含有2mL感染培养基和悬浮的土壤杆菌细胞及适量表面活性剂的微量离心管中。将胚与含有表面活性剂(或用于对照实验而不含表面活性剂)的土壤杆菌细胞悬浮液一起温育5-30分钟。
如下制备含有超二元载体的土壤杆菌细胞悬浮液：首先在含有YEP(5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠、15g/L琼脂)和50mg/L壮观霉素、10mg/L利福平及50mg/L链霉素的固体琼脂平板上将细胞以菌苔形式培养4天。在有些实验中，在固体LB培养基(SIGMAALDRICH；St.Louis,MO)20g/L(含有如上所述的抗生素)上培养土壤杆菌细胞。该培养物是从相同条件下建立的单个菌落分离物划线取得的。从菌苔刮取1或2个菌环细胞，然后均匀重悬浮(通过轻柔上下吹打)于感染培养基(IfM)至600nm(OD600)的光密度为0.35至0.45。感染培养基含有：4.33g/L MS盐，1X ISU改良的MS维生素，68.4g/L蔗糖，36g/L葡萄糖，700mg/L L-脯氨酸，3.3mg/L Dicamba-KOH，及100μM乙酰丁香酮(在DMSO中制备)，pH5.2。取决于实验，在悬浮细胞之后向感染培养基中加入合适量的表面活性剂溶液(例如，终浓度为0.01％的S233)。
将土壤杆菌和胚溶液在室温下温育5至30分钟，然后将胚转移至共培养培养基，该培养基含有4.33g/L MS盐，1X ISU改良的MS维生素，30g/L蔗糖，700mg/L L-脯氨酸，100mg/L肌醇，3.3mg/L Dicamba-KOH，100mg/L酪蛋白酶水解物，15mg/L AgNO3，100μM乙酰丁香酮，及3g/L GELZANTM，pH5.8。共培养温育在24小时白荧光光照(约50μEm-2s-1)下于25℃进行3至4天。
静息和选择 在共培养之后，将胚(36个胚/平板)小心转移至新鲜的非选择静息培养基中，该培养基含有4.33g/L MS盐，1X ISU改良的MS维生素，30g/L蔗糖，700mg/L L-脯氨酸，3.3mg/L溶于KOH中的Dicamba，100mg/L肌醇，100mg/L酪蛋白酶水解物，15mg/L AgNO3，0.5g/L MES，250mg/L羧苄青霉素，及2.3g/L GELZANTM，pH5.8。共培养温育在24小时白荧光光照(约50μEm-2s-1)下于28℃持续7天。
在7天静息期之后，将胚转移至选择培养基中。为了选择经超二元质粒(含有植物可表达的aad1选择标志基因)转化的玉米组织，首先将胚(36个/平板)转移至包含含有100nM R-吡氟氯禾灵酸(0.0362mg/L)的静息培养基(如上)的选择培养基I。温育胚1周(28℃，持续光照)，然后转移至包含含有500nM R-吡氟氯禾灵酸(0.1810mg/L)的静息培养基的选择培养基II，在持续光照下于该培养基上再温育7天。此时，将其移至新鲜的选择培养基II，并如上再持续温育1周。
玉米转化领域的技术人员会理解，当使用其他的植物可表达的选择标志基因(如除草剂耐受基因)时，有其他选择转化植物的方法可供使用。
预再生 在选择过程之后，将培养物转移至预再生培养基，该培养基含有4.33g/LMS盐，1X ISU改良的MS维生素，45g/L蔗糖，350mg/L L-脯氨酸，100mg/L肌醇，50mg/L酪蛋白酶水解物，1.0mg/L AgNO3，0.25g/L MES，0.5mg/L溶于NaOH中的萘乙酸，2.5mg/L溶于乙醇中的脱落酸，1mg/L6-苄氨基嘌呤，250mg/L羧苄青霉素，2.5g/L GELZANTM，及500nM R-吡氟氯禾灵酸，pH5.8。如上所述，在持续白荧光光照下于28℃持续温育7天。
再生和小植株分离 对于再生，将培养物转移至再生培养基I中，该培养基含有4.33g/L MS盐，1X ISU改良的MS维生素，60g/L蔗糖，100mg/L肌醇，125mg/L羧苄青霉素，2.5g/L GELZANTM，及500nM R-吡氟氯禾灵酸，pH5.8。在持续白荧光光照下于28℃使得小植株产生并生长最长达3周。
当小植株达到合适生长阶段时，使用镊子和解剖刀切离并转移至再生培养基II中，该培养基含有4.33g/L MS盐，1X ISU改良的MS维生素，30g/L蔗糖，100mg/L肌醇，3.0g/LGELZANTM，pH5.8，如上所述在持续白荧光光照下于28℃温育，让芽和根进一步生长和发育。
种子生成 将植株移植至METRO-MIX360无土生长培养基(SUN GRO HORTICULTURE；BELLEVUE,WA)中，并在生长室中以使其长壮(harden off)。然后将植株移植至SUNSHINECUSTOM BLEND 160土混合物并在温室中开花。进行受控授粉以生成种子。
实施例3.土壤杆菌菌株对玉米的转化(转化方案2)
基本的工作流程如下概述。从处于幼胚长度为约1.8至2.4mm的发育期的未成熟玉米穗提取胚。当要对不同转化条件进行比较时，将从单个穗分离的约相同数量的胚分配到所有处理中。将胚与含有土壤杆菌细胞和表面活性剂(或不含表面活性剂以用于对照)的悬浮液一起温育，然后将其移至固体培养基平板，使得共培养1至4天。将所处理的胚转移至含有抗生素(用于抑制和杀死土壤杆菌细胞)和用于选择性分离遗传转化玉米组织和植株的化合物的培养基上。在选择培养基上培养玉米组织(通常为但不限于愈伤组织)直至植株再生。测试这些植株以证实其遗传转化，并将具有所需修饰者培养至成熟用于种子生成。
未成熟胚的生成 将来自玉米近交系B104的种子(20世纪80年代早期商业发放的亥俄华州品种)种植到含有SUNSHINE CUSTOM BLEND 160(SUN GRO HORTICULTURE；Bellevue,WA)的4加仑盆(pot)中。使用高压钠和金属卤化物灯与16:8小时光照:黑暗光周期的组合在温室中培养植物。为了获得用于转化的未成熟胚，实施受控的近缘授粉。在授粉后10-13天，当胚大小为约1.8至2.4mm时，分离未成熟胚。在去除外壳和花丝之后，通过将玉米穗浸没到含有(1或2滴/500mL)的50％商业漂白剂(6.15％次氯酸钠)中10分钟，并用无菌水漂洗3次对其进行表面消毒。
可选地，可通过使用新鲜配制的70％乙醇溶液充分喷洒直至穗完全浸湿来对玉米穗进行表面消毒。在使用前，在无菌转移罩中将穗空气干燥半小时以使得乙醇溶液完全蒸发。
将未成熟胚直接无菌分离至含有具有悬浮的土壤杆菌细胞的2mL温育培养基及适量表面活性剂的微量离心管中。将胚与含有表面活性剂(或用于对照实验而不含表面活性剂)的土壤杆菌细胞悬浮液一起温育5-30分钟。
如下述制备含有超二元载体的土壤杆菌细胞悬浮液：首先在125mL(500mL带挡板烧瓶)LB培养基(SIGMA ALDRICH；St.Louis,MO)(20g/L)中于26℃振荡培养细胞6小时，该培养基含有50mg/L壮观霉素，10mg/L利福平，及50mg/L链霉素。通过将25mL过夜培养物(在相同培养基中培养的)1:5稀释至新鲜培养基来建立该培养物。通过在4℃下3500rpm离心15分钟来沉淀细胞，然后在接种培养基(InM)中均匀重悬(通过轻柔上下吹打)至600 nm(OD600)的光密度为约1.0。接种培养基含有：2.2g/L MS盐(Frame et al.(2011,GeneticTransformation Using Maize Immature Zygotic Embryos.于Plant EmbryoCulture Methods and Protocols:Methods in Molecular Biology.T.A.Thorpe andE.C.Yeung,(编辑),Springer Science and Business Media,LLC.第327-341页)，1X ISU改良的MS维生素(Frame et al.,2011，如上)，68.4g/L蔗糖，36g/L葡萄糖，115mg/L L-脯氨酸，100mg/L肌醇，及200μM乙酰丁香酮(在DMSO中制备)，pH5.4。取决于实验，在悬浮细胞之后，向接种培养基中添加合适量的表面活性剂溶液(例如，终浓度为0.01％的S233)。
将土壤杆菌与胚溶液在室温下温育5至15分钟，然后将胚转移至共培养培养基，该培养基含有4.33g/L MS盐，1X ISU改良的MS维生素，30g/L蔗糖，700mg/L L-脯氨酸，3.3mg/L溶于KOH中的Dicamba(3,6-二氯-o-茴香酸或3,6-二氯-2-甲氧苯甲酸)，100mg/L肌醇，100mg/L酪蛋白酶水解物，15mg/L AgNO3，100μM于DMSO中的乙酰丁香酮，及3g/L GELZANTM(SIGMA-ALDRICH)，pH5.8。共培养温育在持续白荧光光照(约50μEm-2s-1)下于25℃进行3至4天。
静息和选择 在共培养之后，将胚(36个胚/平板)小心转移至新鲜的非选择静息培养基中，该培养基含有4.33g/L MS盐，1X ISU改良的MS维生素，30g/L蔗糖，700mg/L L-脯氨酸，3.3mg/L溶于KOH中的Dicamba，100mg/L肌醇，100mg/L酪蛋白酶水解物，15mg/L AgNO3，0.5g/L MES(2-(N-吗啉代)甲磺酸一水合物(PHYTOTECHNOLOGIES LABR.；Lenexa,KS)，250mg/L羧苄青霉素，及2.3g/L GELZANTM，pH5.8。如上所述在持续白荧光光照条件下下于28℃持续温育7天。
在7天静息期之后，将胚转移至选择培养基中。为了选择经超二元质粒(含有植物可表达的aad1选择标志基因)转化的玉米组织，首先将胚(18个胚/平板)转移至含有静息培养基(如上)并含有100nM R-吡氟氯禾灵酸(0.0362mg/L)的选择培养基I。将胚温育1周，然后转移至含有静息培养基(如上)和500nM R-吡氟氯禾灵酸(0.1810mg/L)的选择培养基II，在该培养基上再温育2周。在24小时白荧光光照条件(约50μEm-2s-1)下28℃经约4至6周获得转化分离物。将回收的分离物转移至新鲜的预再生培养基用于起始再生和进一步的分析。
玉米转化领域的技术人员会理解，当使用其他的植物可表达的选择标志基因(如除草剂耐受基因)时，有其他选择转化植物的方法可供使用。
预再生 在选择过程之后，将暴露于24小时光照方案的培养物转移(6至8个愈伤组织/平板)至预再生培养基，该培养基含有4.33g/L MS盐，1X ISU改良的MS维生素，45g/L蔗糖，350mg/L L-脯氨酸，100mg/L肌醇，50mg/L酪蛋白酶水解物，1.0mg/L AgNO3，0.25g/LMES，0.5mg/L溶于NaOH中的萘乙酸，2.5mg/L溶于乙醇中的脱落酸，1mg/L6-苄氨基嘌呤，250mg/L羧苄青霉素，2.5g/L GELZANTM，及500nM R-吡氟氯禾灵酸，pH5.8。在持续白荧光光照(约50μEm-2s-1)下于28℃持续温育7至14天。
再生和小植株分离 对于再生，将培养物转移(最多达12个愈伤组织每个PHYTATRAYTM(PHYTOTECHNOLOGIES LABR.))至基本再生培养基中，该培养基含有4.33g/L MS盐，1X ISU改良的MS维生素，60g/L蔗糖，100mg/L肌醇，125mg/L羧苄青霉素，3.5g/L GELLANGUM G434(PHYTOTECHNOLOGIES LABR.)，及500nM R-吡氟氯禾灵酸，pH5.8。使得小植株产生并生长达3周。
当小植株长度达3至5cm时，将其转移(6个植株每个PHYTATRAYTM)至植株生长培养基中，该培养基含有4.33g/L MS盐，1X ISU改良的MS维生素，30g/L蔗糖，100mg/L肌醇，3.5g/L GELLAN GUM G434，0.5mg/L于NaOH中的吲哚乙酸，pH5.8，在16小时白荧光光照条件(约50μEm-2s-1)下于25℃温育，让芽和根进一步生长和发育。
种子生成将植株移植至METRO-MIX 360无土生长培养基(SUN GRO HORTICULTURE；BELLEVUE,WA)中，并在生长室中以使其长壮。然后，将植株移植至SUNSHINE CUSTOM BLEND160土壤混合物中，并在温室中培养至开花。进行受控的授粉以生成种子。
实施例4.使用在液体培养基中培养的土壤杆菌细胞的转化效率
用实施例2中所述方法(转化方案1)以土壤杆菌超二元菌株LBA4404(pEPS1083)转化玉米未成熟胚。对于从YEP琼脂平板刮取土壤杆菌细胞并重悬浮于感染培养基(IfM)时获得的转化效率与同时使用在液体培养基LB中培养、通过离心收获并重悬浮于IfM中的土壤杆菌细胞所进行的实验中获得的转化效率进行比较。在过程的不同阶段，通过对转化实验开始后的1至5周所处理的组织切片上的黄色荧光点(YFP+)数量进行计数来确定比较的转化效率。表2总结了所获得的结果。
表2.使用从琼脂平板刮取的细胞或在液体培养物中生长之后收获的细胞制备的土壤杆菌LBA4404(pEPS1083)接种物的转化效率比较
表2中总结的结果显示，使用从液体培养物新鲜收获的土壤杆菌细胞感染玉米胚提供的转化效率显著高于使用从琼脂平板刮取的细胞所获得的转化效率。
实施例5.通过将表面活性剂添加至转化方案1改进转化效率
通过实施例2所述方法将土壤杆菌超二元菌株LBA4404(pDAB108652)用于转化玉米未成熟胚。质粒pDAB108652含有YEP编码区(其表达受到ZmUbi1启动子的驱动)，并且还携带在稻肌动蛋白1启动子表达调控下的aad1除草剂耐受性编码区。将在缺乏表面活性剂的IfM中悬浮土壤杆菌细胞时获得的转化效率，与同时使用含有以不同浓度添加的表面活性剂S233的IfM所进行的实验获得的转化效率进行比较。通过对4周吡氟氯禾灵选择之后荧光区域(sector)的愈伤组织(每个愈伤组织由单个胚产生)进行计数来计算转化效率。此时，荧光区域较大，因此这些组织代表了稳定转化的区域。表3总结的结果显示使用表面活性剂增加了转化效率，并且这种提高转化效率的作用对于所使用的表面活性剂的浓度有一定的敏感度。
表3.不同浓度表面活性剂S233对于转化效率的影响
通过实施例2所述的方法将土壤杆菌超二元菌株LBA4404(pEPS1083)用于转化玉米未成熟胚。对于将土壤杆菌细胞悬浮于缺乏表面活性剂的IfM中获得的转化效率与同时在IfM中添加的表面活性剂的存在下进行的实验所获得的转化效率进行比较。在该过程的不同阶段，通过对于转化实验开始后的1至5周所处理的组织切片上的黄色荧光点(YFP+)数量进行计数来确定比较的转化效率。表4总结了所获得的结果。
在某些实验中，在共培养步骤之前通过悬浮和温和离心使用IfM(含有或不含有表面活性剂)洗涤土壤杆菌细胞(表4中的“洗涤”)。另外，在实验5(表4)中，用200μM(而非实施例2中指明的100μM)乙酰丁香酮诱导vir基因表达，并在含有合适抗生素的LB培养基(而非YEP培养基)平板上培养土壤杆菌细胞。
表4.通过使用表面活性剂提高土壤杆菌转化效率。对用于在共培养之前产生土壤杆菌细胞悬浮液的感染培养基添加表面活性剂S233、或TACTICTM(工作浓度0.01％)。
*S233为S233
**IfM是用于悬浮和/或洗涤土壤杆菌细胞的感染培养基。
***在含有抗生素的LB培养基平板上培养土壤杆菌细胞，并使用200μM乙酰丁香酮诱导vir基因表达。
表4中总结的实验清楚地显示，在用于重悬从固体培养基平板刮取的土壤杆菌细胞的感染培养基中，表面活性剂S233的存在显著增加了未成熟胚的转化效率。另外，表面活性剂TACTICTM对于提高转化效率具有积极影响，但不如前者显著。
在本公开内容的方法的一个进一步的例示中，通过实施例2的方法用土壤杆菌菌株LBA4404(pEPS1083)转化未成熟玉米胚。通过监测从未成熟胚发育的愈伤组织上YFP+点或区域的出现来监测转化效率。图1的左侧显示了使用从固体琼脂平板刮取的土壤杆菌细胞进行的5个实验(实验1至5)，图1的右侧显示了其中土壤杆菌细胞收获自液体培养物的3个实验(实验6至9)的结果。将实验1至5合起来看，来自收获的所有9个穗(100％)的胚的转化效率均增加，并且来自9个穗中的6个穗(67％)的胚的转化效率显著增加(费希尔确切检验，p<-0.05)。将实验6至9合起来看(液体培养的土壤杆菌)，来自所有收获的8个穗(100％)的胚的转化效率均显著增加。因此，由图1总结的结果容易看出，将S233添加至感染培养基可显著增加玉米未成熟胚的转化效率，在某些情况下，导致了超过90％的转化效率。
在本公开内容的方法的另一个例示中，通过实施例2的方法使用携带不同质粒(所有质粒均含有aad1选择标志基因)的土壤杆菌菌株LBA4404细胞转化未成熟玉米胚。如前所述，实验处理比较了使用或未使用0.01％表面活性剂S233时的转化效率。将胚再生，并完成了从吡氟氯禾灵选择直至植株生成的全过程。因此，这些数据是在大大晚于图1中总结的数据的阶段采集的。用产生了转基因植株(“事件”)的胚的数目除以所处理的未成熟胚的数目，再乘以100来计算转化效率百分数。为此目的，将一个胚计数为单一事件，即使其产生了多个转基因植株亦然。图2中显示了使用自琼脂平板刮取的土壤杆菌细胞的3个实验的结果(实验1、2和3)。另外，图2显示了在液体培养基中培养后，离心收获并重悬浮于IM(含有或不含有S233)的土壤杆菌细胞的实验(实验4)的结果。图2中各成对的条形显示来自单个穗的胚的响应。
从图2的数据显而易见的是，不管土壤杆菌细胞先前的培养方式(growthconfiguration)如何，也不管转化质粒的基因组成如何，添加表面活性剂S233均导致了土壤杆菌介导的玉米未成熟胚的转化效率显著增加。将实验1、2和3合起来看，所收获的26个穗中的23个穗(88％)的胚的转化效率增加，并且26个穗中的12个穗(46％)的胚的转化效率显著增加(费希尔确切检验(Fisher’s Exact)，p<-0.05)。在实验4(液体培养土壤杆菌)中，来自所收获的12个穗中有10个穗(83％)的胚显示转化效率增加，且在12个穗中有1个穗(8％)的转化效率显著增加。
实施例6.不同化学类别的表面活性剂提高转化作用的比较
表1提供了数个化学类别的表面活性剂的非限制性列表。使用实施例3中所提供的转化方案2进行未成熟胚的转化实验。将携带不同质粒的土壤杆菌细胞悬浮于含有S233或不同其他表面活性剂(浓度均为0.01％)的接种培养基(InM)中，比较实验开始之后7至10周的转化率(通过aad1基因的测定来检测)。用产生了转基因植株(“事件”)的胚的数目除以所处理的未成熟胚的数目乘以100来计算转化效率百分数。为此目的，将一个胚计数为单个事件，即使其产生多个转基因植株亦然。表5呈现了所获得的转化效率。
表5.使用不同化学类别的表面活性剂获得的转化效率的比较。使用0.01％浓度的S233和其他表面活性剂。
*平均每个给定的实验中使用4个穗。将从单个穗收获的各个胚分给每个实验中的两个处理。
表5中总结的结果显示，当在用于重悬在液体培养基中培养并从液体培养基收获的土壤杆菌接种体细胞接种培养基中包含S233时，使用S233所提供的转化效率要优于使用大多数受试的其他表面活性剂获得的转化效率。在3个实验(实验2、实验9及实验11)中，两种表面活性剂的转化效率接近相同。
实施例7.不同操作者的转化结果
玉米转化领域的技术人员会理解，植物转化方法学常常要求相当高的专业技能，此技能需要经年累月的实验方可获得。由于不同操作者实施操作的方式不一致，转化效率可能有相当大的变化。因此，如果提供这样的玉米转化操作，其能提高不同操作者在不同时间获得的转化效率的可预测性，将会是有利的。使用实施例3(携带不同质粒的土壤杆菌菌株LBA4404)的方法，并且接种培养基中含有S233，历时数月进行玉米未成熟胚的转化。根据所获得的吡氟氯禾灵耐受性愈伤组织组织数来估计转化效率。表6总结了所获得的结果。
表6.多个操作者使用接种培养基中掺入表面活性剂的方法获得的转化效率
操作者识别号 使用的穗数 胚数 总事件数 估计的转化效率(％)* 标准差
1 52 6466 2172 33.6 0.21
2 118 13069 5009 38.3 0.20
3 135 14525 5519 38.0 0.19
4 146 16874 6253 37.1 0.22
5 152 16463 5671 34.4 0.18
6 1 72 27 37.5 0.00
7 20 1840 716 38.9 0.14
8 22 2516 645 25.6 0.15
9 48 3779 1143 30.2 0.20
10 76 72 33 45.8 0.18
总计 770 75676 27188 36.0**
*人工事件计数-并非所有事件均经过分析验证。吡氟氯禾灵选择的逃逸率为约5％。
**所有操作者的平均转化效率。
表6中总结的结果显示，当使用实施例3中所公开的转化方案，且在接种培养基中包含S233时，提供了一种可降低操作者之间转化效率变差的鲁棒且可预测的方法。另外，这些方法的改善的可预测性，为更准确地确定要获得期望结果(例如，获得的转化事件数)的实验规模(例如，必需处理的胚数)提供了可能。
本发明的范围不受本文所公开的实施方案的限制，这些实施方案旨在例示本发明的少数方面；任何功能上等同的实施方案均落入本发明范围内。对于方法的各种修改，除了本文所公开和描述的那些修改之外，对于本领域技术人员来说是容易想到的，并且旨在落入所附权利要求书的范围内。另外，尽管在上述实施方案中仅具体讨论了本文所公开的方法步骤的某些代表性组合，方法步骤的其他组合对于本领域技术人员来说也是容易想到的，并且也旨在落入所附权利要求书的范围内。由此，步骤的组合可以是在本文中明确提及的，然而，即使未明确指明，步骤的其他组合也包括在内。在明确描述某个数值的情况下，应理解与所述数值大约相同的量的数值也在本发明范围内。在描述某个数值范围的情况下，该范围的上限和下限之间的各个居间的整数值，及它们的各个分数，连同此类数值之间的各个子范围也被明确公开。本文所用的术语“包含”(comprising)及其变化形式与术语“包括”(including)及其变化形式同义使用，并且为开放式非限制性术语。如本文所使用的，术语“修饰”(modify)或“改变”(alter)或其任何形式，是指修饰、改变、替换、缺失、取代、去除、变化或转化。

Claims (6)

1.一种植物细胞转化方法，所述方法包括在含有Break-Thru S 233非离子型三硅氧烷表面活性剂的液体培养基中将玉米未成熟胚植物细胞暴露于土壤杆菌属(Agrobacterium)细胞，所述Break-Thru S 233表面活性剂在所述液体培养基中的浓度为0.001重量％至0.08重量％；和
将植物细胞和土壤杆菌属在光照下共培养1至4天，
其中所述植物细胞衍生自长度大于或等于1.5mm和小于或等于2.5mm的玉米未成熟胚。
2.权利要求1的植物细胞转化方法，还包括其他的表面活性剂。
3.一种植物细胞转化方法，所述方法包括：
制备含有Break-Thru S 233非离子型三硅氧烷表面活性剂的液体培养基，所述液体培养基中Break-Thru S 233表面活性剂的浓度为0.001重量％至0.08重量％；
将土壤杆菌属细胞悬浮于所述液体培养基中；
在该含有表面活性剂的液体培养基中将玉米未成熟胚植物细胞暴露于该土壤杆菌属细胞；和
将植物细胞和土壤杆菌属在光照下共培养1至4天，
其中所述植物细胞衍生自长度大于或等于1.5mm和小于或等于2.5mm的玉米未成熟胚。
4.权利要求3的植物细胞转化方法，其中所述土壤杆菌属细胞在被悬浮于所述含有表面活性剂的液体培养基之前是从固体培养基刮取的。
5.权利要求3的植物细胞转化方法，其中所述土壤杆菌属细胞在被悬浮于所述含有表面活性剂的液体培养基之前是在液体生长培养基中培养的。
6.权利要求3的植物细胞转化方法，还包括其他的表面活性剂。
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