MX2014007161A - Metodo para la transformacion mejorada usando agrobacterium. - Google Patents

Abstract

Se describen métodos para aumentar la frecuencia de transformación en plantas cuando se usan Agrobacterium como el transformador. Los métodos incluyen exponer las células vegetales a células de Agrobacterium en un medio líquido que contiene un tensoactivo. Algunos métodos incluyen exponer las células vegetales a la luz continua después de la exposición a células de Agrobacterium. Ejemplos de las plantas útiles con estos métodos incluyen plantas de maíz (por ejemplo embriones de maíz inmaduras).

Description

MÉTODO PARA LA TRANSFORMACIÓN MEJORADA USANDO AGROBACTERIUM Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de patente norteamericana no. de serie 61/576,138 presentada el 15 de diciembre de 2011.

Antecedentes de la Invención La transformación de plantas generalmente abarca las metodologías necesarias y utilizadas para la introducción de un gen extraño expresable en plantas en células vegetales, de tal modo que plantas fértiles de la progenie se pueden obtener de forma que mantienen y expresan el gen extraño de forma estable. Se han transformado numerosos miembros de las clasificaciones monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los cultivos agronómicos transgénicos, así como frutas y verduras, son de interés comercial. Estos cultivos incluyen pero no se limitan a maíz, arroz, soya, cañóla, girasol, alfalfa, sorgo, trigo, algodón, cacahuates, tomates, papas, y similares.

Se conocen varias técnicas para introducir material genético extraño en células vegetales, y para obtener plantas que mantienen y expresan el gen introducido de forma estable. Tales técnicas incluyen la aceleración de material genético revestido sobre micropartículas directamente en las células (por ejemplo, la patente norteamericana no. 4,945,050 y la patente de norteamericana no. 5,141,131). Otra tecnología de transformación incluye la tecnología BARBAS™ (ver, por ejemplo, la patente norteamericana no. 5,302,523 y la patente norteamericana no. 5,464,765). La tecnología de electroporación también se ha utilizado para transformar plantas. Véase, por ejemplo, el documento WO 87/06614, la patente norteamericana no. 5,472,869, la patente norteamericana no. 5,384,253, el documento WO 92/09696, y WO 93/21335.

Además, la fusión de protoplastos de plantas con liposomas que contienen el ADN que se va a utiliar, la inyección directa del ADN, así como otros métodos posibles, se puede emplear.

Una vez que el ADN insertado se ha integrado en el genoma de la planta, por lo general es relativamente estable a lo largo de generaciones posteriores. Las células transformadas crecen dentro de las plantas de la manera usual. Pueden formar células germinales y transmitir el o los rasgos transformados a plantas de la progenie. Tales plantas pueden ser cultivadas de la manera normal y se pueden cruzar con plantas que tienen los mismos factores hereditarios transformados u otros factores hereditarios. Los individuos híbridos resultantes tienen las propiedades fenotípicas correspondientes, por ejemplo, la capacidad de controlar la alimentación de insectos de plagas de plantas.

Un número de técnicas alternativas también se puede utilizar para insertar ADN en una célula vegetal anfitriona. Esas técnicas incluyen, pero no se limitan a, la transformación con T-ADN suministrada por Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformación. Las plantas pueden transformarse usando la tecnología de Agrobacterium, como se describe, por ejemplo, en la patente norteamericana no. 5,177,010. la patente norteamericana no. 5,104,310. la solicitud de patente Europea No. 0131624B1, la solicitud de patente europea no. 120516, la solicitud de patente europea no. 159418B1, la solicitud de patente europea no. 176,112, la patente norteamericana no. 5,149,645, la patente norteamericana no. 5,469,976, la patente norteamericana no. 5,464,763, la patente norteamericana no. 4,940.838, la patente norteamericana no. 4,693,976, la solicitud de patente europea no. 116718, solicitud de patente europea no. 290799, solicitud de patente europea no. 320500. solicitud de patente europea no. 604662, solicitud de patente europea no. 627752, la solicitud de patente europea no. 0267159, la solicitud de patente europea no. 0292435, la patente norteamericana no. 5,231,019, la patente norteamericana no. 5,463,174, la patente norteamericana no. 4,762,785, la patente norteamericana no. 5,004,863, y la patente norteamericana no. 5,159,135. El uso de T-ADN que contienen los vectores para la transformación de células vegetales ha sido intensamente investigado y suficientemente descrito en la solicitud de patente europea 120.516; An et al, (1985, EMBO J. 4:277-284); Fraley et al, (1986, Crit Rev. Plant Sci. 4: 1-46), y Lee y Gelvin (2008, Plant Physiol 146:325-332), y está bien establecida en el campo.

Un primer paso crítico en la transformación de las células vegetales mediante Agrobacterium spp. es el contacto estrecho, la unión, o adherencia de las células bacterianas a las células vegetales huésped que van a ser transformadas. Después de la unión célula-célula, se conoce la biología de la transferencia de T-ADN de Agrobacterium a las células vegetales. Véase, por ejemplo, Gelvin, 2003, Microbiol. Molec. Biol. Rev. 67: 16-37; y Gelvin, 2009, Plant Physiol. 150: 1665-1676. Como mínimo, al menos una repetición de borde derecho de T-ADN, pero frecuentemente tanto la repetición del borde derecho como la repetición del borde izquierdo del plásmido Ti o Ri se unirán como la región flanqueante de los genes deseados para ser insertados en la célula vegetal. Las repeticiones de T-DNA de bordes izquierdo y derecho son secuencias cruciales de acción cis requeridas para la transferencia de T-ADN.

Varios componentes de acción trans están codificados en el genoma total de Agrobacterium. Destacan entre estos las proteínas codificadas por los genes vir, que se encuentran normalmente como una serie de operones en los plásmidos Ti o Ri. Varios plásmidos Ti y Ri difieren en cierta medida en el complemento de los genes vir, ya que por ejemplo, virF no siempre está presente. Las proteínas codificadas por los genes vir realizan muchas funciones diferentes, incluyendo el reconocimiento y la señalización de la interacción de las células vegetales/bacterias, la inducción de la transcripción de genes vir, la formación de un canal de secreción Tipo IV, el reconocimiento de repeticiones de bordes del T-ADN, formación de hebras T, transferencia de las hebras T a la célula vegetal, la importación de las hebras T en el núcleo de la célula vegetal, y la integración de hebras T en el cromosoma nuclear de la planta, por nombrar sólo unos pocos. Véase, por ejemplo, Tzfira y Citovsky, 2006, Curr. Opin. Biotechnol. 17: 147-154.

Si para la transformación se usan cepas Agrobacterium, el ADN que va a ser insertado en la célula vegetal puede ser clonado en plásmidos especiales, por ejemplo, ya sea en un vector intermedio (de transporte) o en un vector binario. Los vectores intermedios no son capaces de replicación en las células de Agrobacterium independientes, pero pueden ser manipulados y se replican en cepas de clonación molecular de Escherichia coli comunes. Es común que tales vectores presenten secuencias intermedias, enmarcados por las regiones de repetición de T-ADN de borde derecho e izquierdo, que pueden incluir un gen marcador seleccionable funcional para la selección de células vegetales transformadas, un enlazador de clonación, un polienlazador de clonación, u otra secuencia que puede funcionar como un sitio de introducción de los genes destinados a la transformación de células vegetales. La clonación y la manipulación de los genes deseados para ser transferidos a las plantas de este modo se pueden realizar fácilmente por las metodologías estándar en E. coli, utilizando el vector de transporte como un vector de clonación. El vector de transporte finalmente manipulado posteriormente se puede introducir en cepas de transformación de plantas de Agrobacterium para seguir trabajando. El vector intermedio se puede transferir a Agrobacterium por medio de un plásmido auxiliar (a través de la conjugación bacteriana), por electroporación, por transformación directa de ADN mediada químicamente, o por otras metodologías conocidas. Los vectores de transporte se pueden integrar en el plásmido Ti o Ri o derivados de los mismos por recombinación homologa debido a secuencias que son homologas entre el plásmido Ti o Ri, o derivados de los mismos, y el plásmido intermedio. Este evento de recombinación homologa (es decir, la integración del plásmido) proporciona de ese modo un medio para mantener de forma estable el vector de transporte alterado en Agrobacterium, con un origen de funciones de replicación y otras funciones de mantenimiento de plásmido proporcionadas por la porción de plásmido Ti o Ri del plásmido co-integrante. El plásmido Ti o Ri también comprende las regiones vir que comprenden genes vir necesarios para la transferencia del ADN-T. Es común que el plásmido que lleva la región vir sea el plásmido mutado Ti o Ri (plásmido auxiliar) del que se haya eliminado la región T-DNA, incluyendo repeticiones de bordes del T-ADN derecho e izquierdo. Tales plásmidos derivados de pTi, que tienen los genes funcionales vir y que carecen de la totalidad o sustancialmente la totalidad de la región T y los elementos asociados se denominan aquí como plásmidos auxiliares.

El sistema superbinario es un ejemplo especializado del sistema vector de transporte/recombinación homologa (revisado por Komari et al, 2006, En: Métodos en Biología Molecular (K. Wang, ed) no 343: Agrobacterium Protocols, pp 15-41, y Komori et al, 2007, Plant Physiol 145: 1155/60). La cepa LBA4404 (pSB1) alberga dos plásmidos replicantes de forma independiente, pAL4404 y pSB 1. PAL4404 es un plásmido auxiliar derivado de plásmido Ti que contiene un conjunto de genes vir intactos (del plásmido Ti pTiACH5), pero que no tiene ninguna región de ADN-T (y por lo tanto no hay secuencias de repetición de ADN-T de borde derecho e izquierdo). El plásmido pSB1 suministra un conjunto parcial adicional de genes vir derivados de pTiBo542; este conjunto de genes vir parcial incluye el operón virB y el operón virC, así como los genes virG y virD1. Un ejemplo de un vector de transporte utilizado en el sistema superbinario es pSB11, que contiene un polienlazador de clonación que sirve como un sitio de introducción de los genes destinados a la transformación de células vegetales, flanqueado regiones de repetición de repetición de ADN-T de borde derecho e izquierdo. El vector de transporte pSB11 no es capaz de realizar la replicación independiente en Agrobacterium, pero está mantenido de forma estable como un plásmido co-integrante cuando se integra en pSB1 por medio de recombinación homologa entre secuencias comunes presentes en pSB1 y pSB11. Por lo tanto, se actúa de manera productiva en la región de ADN-T modificado totalmente introducida en LBA4404 (pSB1) en un vector modificado pSB11 y se transfiere a las células vegetales por proteínas vir derivadas de dos fuentes diferentes de plásmido Ti de Agrobacterium (pTiACH5 y pTiBo542). La cepa anfitriona de Agrobacterium tumefaciens empleada con el sistema superbinario es LBA4404 (pSB1). El sistema superbinario ha demostrado ser particularmente útil en la transformación de especies de plantas monocotiledóneas. Ver Hiei et al, (1994) Plant J. 6:271-282; e Ishida et al, (1996) Nat. Biotechnol. 14:745-750.

Además de los genes vir albergadas por plásmidos Ti de Agrobacterium , otros genes que controlan la virulencia cromosómicamente transmitida (denominados genes de chv) se sabe que controlan ciertos aspectos de las interacciones de las células de Agrobacterium y las células vegetales, y por lo tanto afectan la frecuencia general de transformación de la planta (Pan et al, 1995, Molec. Microbiol. 17:259-269). Varios de los genes transmitidos cromosómicamente necesarios para la virulencia y la unión se agrupan en un locus cromosómico que abarca 29 kilobases (Matthysse et al, 2000. Biochim. Biophys. Acta 1490:208-212).

Además de las numerosas tecnologías para transformar plantas, el tipo de tejido que está en contacto con los genes extraños también puede variar. Tai tejido puede incluir, pero no se limitan a, tejido embriogénico, tejido calloso tipos I y II, hipocotilo, y meristemo. Casi todos los tejidos vegetales pueden transformarse durante la desdiferenciación usando técnicas apropiadas dentro de la experiencia de un técnico. Un experto en el campo de la transformación de la planta entenderá que están disponibles múltiples metodologías para la producción de plantas transformadas, y que pueden ser modificadas y especializadas para ajusfar las diferencias biológicas entre varias especies de plantas anfitrionas. Explantos de plantas (por ejemplo, trozos de hoja, segmentos de tallo, meristemos, raíces, pero también protoplastos o células cultivadas en suspensión) pueden ser ventajosamente cultivados con Agrobacteríum tumefaciens o Agrobacteríum rhizogenes para la transferencia del ADN en la célula vegetal.

Cultivos callosos. Los cultivos de tejidos vegetales pueden ser ventajosamente cultivados con Agrobacteríum tumefaciens o Agrobacteríum rhizogenes para la transferencia del ADN en la célula vegetal, y se inicia generalmente a partir de piezas estériles de una planta entera que puede consistir en piezas de órganos, tales como hojas o raíces, o tipos de células específicas, tal como el polen o endospermo. Muchas funciones del explanto se sabe que afectan la eficiencia de la iniciación del cultivo. Se cree que cualquier tejido de la planta se puede utilizar como un explanto, si se encuentran las condiciones correctas. Generalmente, el tejido más joven de más rápido crecimiento (o tejido en una etapa temprana de desarrollo) es más eficaz. Los explantos cultivados en el medio apropiado pueden producir crecimiento y división desorganizados de la masa de las células (callo). En cultivo, el callo se puede mantener más o menos indefinidamente, siempre que se subcultivaron en medio fresco periódicamente. Durante la formación del callo, hay un cierto grado de desdiferenciación, tanto en la morfología (un callo se compone generalmente de células de parénquima no especializadas) y el metabolismo.

Los cultivos callosos son extremadamente importantes en la biotecnología vegetal. La manipulación de las proporciones de hormona de la planta en el medio de cultivo puede conducir al desarrollo de brotes, raíces, o embriones somáticos a partir de plantas completas que posteriormente se pueden producir (regeneración). Cultivos callosos también se pueden utilizar para iniciar suspensiones de células, que se utilizan en una variedad de maneras en estudios de transformación de plantas.

Cultivos de suspensiones celulares. Los cultivos callosos, a grandes rasgos, caen en una de dos categorías: compactos o friables. En los callos compactos, las células están densamente agrupadas, mientras que en el callo friable, las células sólo están holgadamente asociadas entre sí y el callo se convierte en suave y se rompe fácilmente. El callo friable proporciona el inoculo para formar cultivos en suspensión de células. Los explantos de algunas especies de plantas o tipos de células particulares tienden a no formar callos friables, por lo que es difícil iniciar la suspensión de células. La friabilidad del callo a veces se puede mejorar mediante la manipulación de los componentes del medio, por subcultivo repetido, o mediante el cultivo en un medio semisólido (medio con una baja concentración de agente gelificante). Cuando el callo friable se coloca en un medio líquido y luego es agitado, las células individuales y/o pequeños grupos de células se liberan en el medio. Bajo las condiciones adecuadas, estas células liberadas continúan creciendo y dividiéndose, produciendo eventualmente un cultivo de células en suspensión. Las suspensiones celulares se pueden mantener relativamente simplemente como cultivos discontinuos en matraces cónicos y se propagan por el subcultivo repetido en medio fresco. Después de el subcultivo, las células se dividen y la biomasa del cultivo aumenta de una manera característica. Los cultivos de suspensiones de células pueden ser cultivadas de manera ventajosa con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para la transferencia del ADN en la célula vegetal.

Cultivo de la punta del brote v los meristemos. Las puntas de brotes (que contienen el meristemo apical del brote) pueden ser cultivadas in vitro, produciendo grupos de brotes a partir de ya sea brotes axilar o adventicios y puede ventajosamente ser cultivadas con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para la transferencia del ADN en la célula vegetal. Cultivos de meristemas disparares se utilizan para la regeneración de cereales (las plántulas se pueden utilizar como material donante).

Cultivo de embriones. Los embriones pueden ser utilizados como explantos para generar cultivos callosos o embriones somáticos. Ambos embriones inmaduros y maduros pueden ser utilizados como explantos. Los callos embriogénicos inmaduros, derivados de embriones son un tejido utilizado en la regeneración de plantas monocotiledóneas y pueden ventajosamente ser cultivados con Agrobacterium tumefaciens para la transferencia del ADN en la célula vegetal. Los embriones inmaduros son un tejido intacto que es capaz de división celular para dar lugar a células callosas que pueden diferenciarse para producir tejidos y órganos de una planta entera.

Los embriones inmaduros se pueden obtener a partir de mazorcas fertilizadas de una planta de maíz madura, por ejemplo, de plantas polinizadas utilizando los métodos de Neuffer et al. (1982, Cultivo de maíz para fines genéticos En: Maíz para la Investigación Biológica W.F. Sheridan, Ed .UNIVERSITY PRESS, de la Universidad de Dakota del Norte, Grand Forks, Dakota del Norte.). Ejemplos de métodos para el aislamiento de los embriones inmaduros de maíz son descritos por Green y Phillips (Crop Sci. 15:417-421 (1976)).

Los embriones inmaduros se aislan preferiblemente desde la mazorca en desarrollo usando métodos asépticos y se mantienen en medio estéril hasta su uso. El uso de Agrobacterium en la transformación de embriones inmaduros se da a conocer por Sidorov y Duncan (2009, Métodos en Biología Molecular: Maíz transgénico, vol. 526 capítulo 4, M. Paul Scott (Ed.)) y en la patente norteamericana no. 5,981,840.

Cultivo de microesporas. Tejido haploide puede ser cultivado in vitro mediante el uso de polen o anteras como un explanto y puede ventajosamente ser cultivado con Agrobacterium tumefaciens para la transferencia del ADN en la célula vegetal. Tanto el callo como los embriones pueden ser producidos a partir de polen. Dos enfoques se pueden tomar para producir cultivos in vitro a partir de tejido haploide. En el primera, anteras (tejido somático que rodea y contiene el polen) se cultivan en medio sólido. Los embriones de polen derivado se producen posteriormente a través de la dehiscencia de las anteras maduras. La dehiscencia de la antera depende tanto de su aislamiento en la etapa correcta y en las condiciones de cultivo correctas. En algunas especies, la dependencia de dehiscencia natural puede ser evitada mediante la reducción de la pared de la antera. En el segundo método, anteras se cultivaron en medio líquido, y el polen liberado de las anteras puede ser inducido a formar embriones. El polen inmaduro también puede ser extraído de anteras en desarrollo y cultivarse directamente.

Muchos de los cereales (arroz, trigo, cebada y maíz) requieren el medio suplementado con reguladores de crecimiento de plantas para el polen o el cultivo de anteras. La regeneración a partir de explantos de microsporas se puede conseguir por embriogénesis directa, o a través de una etapa callosa y posterior embriogénesis.

Los cultivos de tejidos haploides también se pueden iniciar desde el gametofito femenino (óvulo). En algunos casos, este es un método más eficaz que utilizar el polen o anteras.

Las plantas obtenidas a partir de cultivos haploides pueden no ser haploides. Esto puede ser una consecuencia de la duplicación del cromosoma durante el periodo de cultivo. La duplicación del cromosoma (que puede ser inducido por tratamiento con productos químicos tales como colchicina) puede ser una ventaja, ya que en muchos casos las plantas haploides no son el resultado deseado de la regeneración de los tejidos haploides. Tales plantas frecuentemente son llamadas di-haploides, debido a que contienen dos copias del mismo genoma haploide.

Después de la transformación de cualquiera de los materiales vegetales antes mencionados mediante el cultivo con Agrobacterium Agrobacterium para la transferencia del ADN en la célula vegetal, plantas enteras pueden entonces ser regeneradas a partir del material vegetal infectado después de la colocación en adecuadas condiciones de crecimiento y medios de cultivo, el cual puede contener antibióticos o herbicidas para la selección de las células vegetales transformadas. Las plantas así obtenidas pueden ser probados para la presencia del ADN insertado.

La transformación celular (incluyendo la transformación de células vegetales) puede implicar la construcción de un vector de expresión que funciona en una célula particular. Dicho vector puede comprender ADN que incluye un gen bajo el control de, o unido operativamente a, un elemento regulador (por ejemplo, un promotor). El vector de expresión puede contener uno o más de tales combinaciones de elementos genéticos/reguladores unidos operativamente. El vector puede estar en la forma de un plásmido y se puede utilizar solo o en combinación con otros plásmidos para proporcionar células transformadas utilizando métodos de transformación como se describe aquí para incorporar transgenes en el material genético de una célula vegetal.

Los vectores de expresión de células vegetales pueden incluir al menos un marcador genético, unido operativamente a un elemento regulador (un promotor, por ejemplo) que permite a las células transformadas que contienen el marcador para ser recuperados por selección negativa (es decir, inhibir el crecimiento de células que no contienen el gen marcador seleccionable) o por la selección positiva (es decir, el cribado para el producto codificado por el marcador genético). Muchos genes marcadores seleccionables adecuados para la transformación de plantas son bien conocidos en las artes de transformación e incluyen, por ejemplo, genes que codifican enzimas que desintoxican metabólicamente un agente químico selectivo el cual puede ser un antibiótico o un herbicida, o genes que codifican un objetivo alterado que puede ser insensible al inhibidor. Unos pocos métodos de selección positivos son también conocidos en la técnica. El gen marcador seleccionable empleado individualmente puede permitir en consecuencia la selección de células transformadas, mientras que el crecimiento de las células que no contienen el ADN insertado se puede suprimir por el compuesto selectivo. La preferencia por un gen marcador seleccionable en particular es a discreción del experto, pero cualquiera de los siguientes marcadores seleccionabas puede ser utilizado, así como cualquier otro gen no listado aquí que pudiera funcionar como un marcador seleccionable. Ejemplos de marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan, a la resistencia o tolerancia a kanamicina, G418, higromicina, bleomicina, metotrexato, fosfinotricina (bialafos), glifosato, imidazolinonas, sulfonilureas y herbicidas triazolopirimidina, como clorosulfurona, bromoxinil y DALAPON.

Además de un marcador seleccionable, puede ser deseable utilizar un gen reportero. En algunos casos, un gen reportero puede ser utilizado sin un marcador seleccionable. Los genes indicadores son los genes que normalmente no proporcionan una ventaja de crecimiento al organismo o tejido receptor. El gen indicador típicamente codifica una proteína que proporciona algún cambio fenotípico o propiedad enzimática. Genes informadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, aquellos que codifican la beta-glucuronidasa (GUS), luciferasa de luciérnaga, o proteínas fluorescentes como la proteína verde fluorescente (GFP) o la proteína amarilla fluorescente (YFP, esencialmente como se describe en la patente norteamericana no. 7,951,923).

Independientemente de la técnica de transformación utilizada, el gen extraño puede ser incorporado en un vector de transferencia de gen adaptado para expresar el gen extraño en la célula vegetal incluyendo en el vector un promotor vegetal. Además se pueden utilizar promotores vegetales, promotores de una variedad de fuentes de manera eficiente en las células vegetales para expresar genes extraños. Por ejemplo, los promotores de origen bacteriano, tal como el promotor de la sintasa de octopina, el promotor de sintasa de nopalina, promotor de sintasa de manopina; se pueden usar promotores de origen viral, tales como los promotores 35S y 19S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), un promotor de virus baciliforme de la caña de azúcar, y similares. Promotores derivados de plantas incluyen, pero no se limitan a subunidad pequeña (SSU) de carboxilasa de ribulosa-1 ,6-bisfosfato (RUBP), promotor de beta-conglicinina, promotor de faseolina, promotor ADH (alcohol deshidrogenasa), promotores de choque térmico, promotor ADF (factor de despolimerización de la actina), y promotores específicos de tejido. Los promotores también pueden contener ciertos elementos de la secuencia promotor de que pueden mejorar la eficiencia de la transcripción. Potenciadores típicos incluyen, pero no se limitan a, intrón 1 de alcohol deshidrogenase 1 (ADH1) y el intrón 6 ADHL. Los promotores constitutivos pueden ser utilizados. Los promotores constitutivos de expresión directa continua de genes en casi todos los tipos de células y en casi todas las veces (por ejemplo, actina, ubiquitina, CaMV 35S). Los promotores específicos de tejidos son responsables de la expresión génica en tipos de células o de tejidos específicos, tales como las hojas o las semillas Ejemplos de otros promotores que pueden ser utilizados incluyen aquellos que son activos durante cierta etapa del desarrollo de la planta, así como activos en tejidos y órganos específicos en la planta. Ejemplos de tales promotores incluyen, pero no se limitan a, promotores que son específicos a la raíz, específicos al polen, específicos al embrión, específicos a las barbas de maíz, específicos a la fibra de algodón específica, específicas al endospermo de las semillas, y específica del floema.

En ciertas circunstancias, puede ser deseable utilizar un promotor inducible. Un promotor ¡nducible es responsable de la expresión de genes en respuesta a una señal específica, tales como: (por ejemplo, genes de choque térmico) estímulo físico; luz (por ejemplo, la ribulosa bis-fosfato-1 ,5-carboxilasa); hormonas (por ejemplo, glucocorticoides); antibióticos (por ejemplo, tetraciclina); metabolitos; y el estrés (por ejemplo, la sequía). También pueden ser utilizados otros elementos de transcripción y translación deseables que funcionan en plantas, tales como, por ejemplo, secuencias líder no trasladadas 5', y de terminación de la transcripción de 3' ARN y secuencias de señal de adición de poli-ciclasa. Cualquier vector de transferencia génica específica de la planta adecuada conocida en la técnica puede ser utilizada.

Los cultivos transgénicos que contienen rasgos de resistencia a insectos (IR) son frecuentes en las plantas de maíz y algodón en toda América del Norte, y el uso de estos rasgos se está expandiendo a nivel mundial.

Los cultivos transgénicos comerciales que combinan rasgos IR y la tolerancia a los herbicidas (HT) han sido desarrollados por varias compañías de semillas. Estos incluyen combinaciones de rasgos conferidos por IR de Bacillus thuringiensis (Bt) proteínas insecticidas y rasgos HT tales como la tolerancia a los inhibidores de sintasa de acetolactato(ALS), tales como sulfonilureas, imidazolinonas, triazolopirimidina, sulfonanilidas, y similares, inhibidores sintetasa de glutamina (GS) como Bialafos, glufosinato, y similares, inhibidores dioxigenasa de 4-Hidroxifenilpiruvato (HPPD) como mesotriona, isoxaflutol, y similares, inhibidores de sintasa 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato (EPSPS) tales como glifosato y similares, e inhibidores de coenzima A carboxilasa de acetilo (ACCasa) tales como haloxifop, quizalofop, diclofop, y similares. Otros ejemplos son conocidos en el cual las proteínas proporcionadas transgénicas proporcionan a las plantas tolerancia a clases químicas de herbicidas tales como herbicidas de ácidos fenoxi y herbicidas piridiloxiacetatos de auxina (véase el documento WO2007/053482A2), o ácidos herbicidas y herbicidas ariloxifenoxipropionatos fenoxi (véase WO2005/107437 A1). La capacidad de controlar múltiples problemas de plagas a través de rasgos IR es un concepto de producto comercial valioso, y la conveniencia de este concepto de producto se ve reforzada si las características de control de insectos y rasgos de control de malezas se combinan en la misma planta. Además, puede obtenerse un mejor valor a través de combinaciones de plantas individuales de rasgos IR conferidos por una proteína insecticida de Bt con uno o más rasgos HT adicionales tales como los mencionados anteriormente, además de uno o más rasgos de entrada adicionales (por ejemplo, otra resistencia a los insectos conferida por derivados de Bt u otras proteínas insecticidas, resistencia a los insectos conferida por mecanismos tales como ARNi y similares, resistencia a enfermedades, tolerancia al estrés, la utilización de nitrógeno mejorada y similares), o rasgos de salida (por ejemplo, contenido de alta aceites, composición de aceite saludable, mejora nutricional, y similares). Estas combinaciones se pueden obtener bien a través de la reproducción convencional (por ejemplo, pila de cría) o conjuntamente, según un nueve de transformación que implica la introducción simultánea de múltiples genes (por ejemplo, la pila molecular). Los beneficios incluyen la capacidad de controlar las plagas de insectos y un mejor control de malezas en una planta de cultivo que proporciona beneficios secundarios para el productor y/o el consumidor. Por lo tanto, los métodos de esta descripción pueden utilizarse para proporcionar plantas transformadas con combinaciones de rasgos que comprenden un paquete agronómico completa de la mejora de calidad de la cosecha con la capacidad de controlar de forma flexible y rentable cualquier número de cuestiones agronómicas.

Breve descripción de la invención Se describen los métodos para la transformación de células vegetales. Estos métodos incluyen la exposición de las células vegetales a células de Agrobacterium en un medio líquido que contiene un agente tensoactivo. Las células de Agrobacterium pueden ser desprendidas de un medio sólido o se cultivan en un medio de crecimiento líquido antes de ser suspendidas en el medio líquido que contiene el tensoactivo. La concentración de tensoactivo puede estar en el intervalo de 0.001 por ciento en peso a 0.08 por ciento en peso. El tensoactivo puede ser un tensoactivo de trisiloxano no iónico y puede ser utilizado más de un tensoactivo. Las células vegetales pueden ser células de maíz. Las células vegetales pueden ser expuestas a luz continua después de la exposición a las células de Agrobacterium.

Breve descripción de los dibujos La figura 1 es un gráfico de barras que muestra la mejora de la transformación de embriones inmaduros de maíz cuando se añade el tensoactivo BREAK-THRU® S 233 al medio de infección utilizado para crear una suspensión de células de Agrobacterium (que alberga el plásmido pEPS1083) antes del co-cultivo.

La figura 2 es un gráfico de barras que muestra la mejora de la transformación de embriones inmaduros de maíz cuando se añade el tensoactivo BREAK-THRU® S 233 al medio de infección utilizado para crear una suspensión de células de Agrobacterium antes del co-cultivo. Los plásmidos usados para cada experimento que se muestran en la figura 2 incluyen: Experimento 1 = pEPS1053; GOI = IPT, marcador seleccionable = add1. Experimento 2 = pEPS1038; GOI = GF14, marcador seleccionable = addl. Experimento 3 y Experimento 4 = pEPS1027; no GOI, marcador seleccionable = addl.

Descripción detallada de la invención Se describen métodos para aumentar la frecuencia de transformación en plantas utilizando Agrobacterium. Los métodos incluyen la exposición de las células vegetales a las células de Agrobacterium en un medio líquido que contiene un agente tensoactivo. Algunos métodos incluyen la exposición de las células vegetales a la luz continua después de la exposición a las células de Agrobacterium. Ejemplos de plantas útiles con estos métodos incluyen plantas de maíz y embriones de maíz inmaduros.

Las cepas de Agrobacterium difieren entre sí en su capacidad para transformar células vegetales de diversas especies. Independientemente de la combinación particular de cepa de Agrobacterium! planta anfitriona considerada, Agrobacterium actúa a través de unión a la célula anfitriona durante la transformación. Ver cCullen y Binns, 2006, Ann. Rev. Cell. Prog. Biol. 22: 101-127; y Citovsky et al, 2007, Cell. Microbiol. 9:9-20. Por esta razón, los métodos que mejoran la unión de células de Agrobacterium a las células vegetales, tales como los descritos aquí usando tensoactivos, pueden producir aumentos en la eficiencia de transformación. La mejora de la unión de células de Agrobacterium a las células vegetales es diferente para diferentes especies y tipos de tejido ya que diferentes especies de plantas, y además, diferentes tejidos de una planta de una sola especie, pueden diferir en la composición química y bioquímica de sus paredes celulares. Además, tales diferencias pueden también variar durante diferentes etapas de desarrollo de un solo tejido de la planta.

Además diferentes géneros y especies de bacterias, y de hecho, diferentes cepas de una especie bacteriana, frecuentemente difieren en la composición química y bioquímica de sus paredes celulares, y estas diferencias pueden cambiar durante el ciclo de crecimiento bacteriano. Los incrementos en la eficiencia de transformación de plantas por los métodos descritos aquí por lo tanto pueden ser el resultado de la capacidad de los tensoactivos para disminuir las interacciones repulsivas hidrófobas entre las paredes celulares de Agrobacterium y las paredes celulares de la planta, y por lo tanto permiten que se produzcan estrechas interacciones célula-célula.

Por lo tanto se pueden utilizar las diferencias químicas entre diferentes agentes tensoactivos para promover las interacciones célula-célula entre células de diferentes cepas de Agrobacterium (y diferentes fases de crecimiento de tales células) y las células y tejidos de diferentes plantas anfitrionas durante varias fases del cultivo de los tejidos vegetales de manera que se pueden observar mejoras la eficiencia de transformación.

Los tensoactivos pertenecen a varias clases químicas, y un experto en el campo de la transformación de las plantas entenderá que diferentes clases químicas de los tensoactivos se pueden utilizar para mejorar la eficiencia de transformación de plantas con diferentes anfitriones vegetales. Los ejemplos de tensoactivos de estas clases químicas útiles con los métodos descritos aquí incluyen adyuvantes, agentes tensoactivos no iónicos, tensoactivos amónicos, tensoactivos a base de aceite, tensoactivos anfóteros, y tensoactivos poliméricos. Un ejemplo de un agente tensoactivo preferido útil con los métodos descritos aquí es un tensoactivo de trisiloxano no iónico tal como BREAK-THRU® S233 de Evonik Industries (Essen, Alemania). Ejemplos de otros tensoactivos preferidos, útiles con los métodos descritos aquí incluyen alcoxilatos de trisiloxano, aceites de soya etoxilados, etoxilatos de alcohol C-13s, betaínas de Ci2-C14-alquildimet¡l, y copolímeros de bloque de óxido de etileno-óxido de propileno de di-sec-butilfenol. La tabla 1 presenta una lista no limitativa de agentes tensoactivos de diversos tipos químicos que se puede usar para poner en práctica los métodos descritos aquí.

Tabla 1. Agrupaciones de tensoactivos, nombres comerciales y acción química/clase.

* EO = moles de óxido de etileno se hacen reaccionar con un hidrófobo en particular * *POE = moles de óxido de propileno se hacen reaccionar con un hidrófobo en particular Los métodos descritos aquí utilizan las propiedades que mejoran la transformación de los tensoactivos para aumentar drásticamente la eficiencia de transformación en plantas tales como embriones de maíz inmaduros por Agrobacterium (por ejemplo, Agrobacterium tumefaciens). Los tensoactivos utilizados con los métodos descritos aquí se seleccionan, como se sugirió anteriormente, en base a la capacidad de promover las interacciones célula-célula que mejorarán la eficiencia de transformación. La concentración de agente tensoactivo en el medio líquido puede ser 0.001 por ciento en peso a 0.08 por ciento en peso, 0.001 por ciento en peso a 0.07 por ciento en peso, 0.001 por ciento en peso a 0.06 por ciento en peso, 0.001 por ciento en peso a 0.05 por ciento en peso, 0.001 por ciento en peso a 0.04 por ciento en peso, 0.001 por ciento en peso a 0.035 por ciento en peso, 0.001 por ciento en peso a 0.03 por ciento en peso, 0.001 por ciento en peso a 0.025 por ciento en peso, 0.001 por ciento en peso a 0.02 por ciento en peso, 0.001 por ciento en peso a 0.015 por ciento en peso, 0.001 por ciento en peso a 0.01 por ciento en peso, o 0.005 por ciento en peso a 0.01 peso ciento.

Uno o más tensoactivos adicionales también se pueden usar con los métodos descritos aquí. Como se ha indicado, la eficacia de la transformación depende de una variedad de factores, incluyendo las especies de plantas y del tipo de tejido y la cepa Agrobacterium. Dada la variedad de interacciones implicadas, un sistema de dos o más tensoactivos, puede aumentar la eficiencia de transformación. Los tensoactivos adicionales usados en un sistema de dos o más tensoactivos se pueden seleccionar, por ejemplo, de la Tabla 1.

Los métodos descritos aquí son ampliamente aplicables a una variedad de especies y variedades de plantas incluyendo monocotiledóneas y dicotiledóneas. Cultivos de interés incluyen, pero no se limitan a maíz, arroz, soya, cañóla, girasol, alfalfa, sorgo, trigo, algodón, cacahuates, tomates, papas, y similares. Los presentes métodos se pueden utilizar con células en diversas etapas de desarrollo, por ejemplo, embriones inmaduros. Por lo tanto, los métodos descritos aquí se pueden utilizar para transformar embriones inmaduros de maíz. El tamaño de los embriones inmaduros utilizados en los métodos descritos aquí puede variar. Por ejemplo, los embriones inmaduros pueden tener una longitud mayor o igual a 1.5 mm y menor que o igual a 2.5 mm de longitud.

El entorno externo en el que se mantienen las células después de la exposición a Agrobacterium puede ser controlado de acuerdo con los métodos descritos aquí. Por ejemplo, la temperatura, el pH, y otros componentes del medio de crecimiento en el que las células se colocan después de la transformación de acuerdo con los métodos descritos aquí pueden variar y son generalmente bien conocidos por los expertos en la técnica. Una de esas variables es la exposición a la luz. Los métodos descritos aquí pueden incluir la exposición de las células vegetales a los protocolos comunes de 18 horas de luz/6 horas de oscuridad o, alternativamente, a la luz continua después de la exposición a las células de Agrobacterium. Por ejemplo, las células tratadas de acuerdo con los métodos descritos aquí pueden estar expuestas a -condiciones de 24 horas de luz fluorescente blanca por semanas después del tratamiento, por ejemplo, hasta las etapas de regeneración y aislamiento de las plántulas de la preparación de la planta.

Un método adicional incluye la preparación de un medio líquido que contiene un agente tensoactivo, la suspensión de células de Agrobacterium en el medio líquido, y la exposición de las células vegetales a la células de Agrobacterium en el medio líquido que contiene el tensoactivo. Las células de Agrobacterium pueden ser desprendidas de un medio sólido antes de ser suspendidas en el medio líquido que contiene un agente tensoactivo. Además, las células de Agrobacterium pueden cultivarse en un medio de crecimiento líquido antes de ser suspendidas en el medio líquido que contiene un agente tensoactivo.

Los protocolos y métodos para la transformación de plantas usando Agrobacterium son bien conocidos por los expertos en la técnica de la biología molecular. Cualquier tipo de métodos conocidos para el uso de Agrobacterium en plantas de transformación se pueden utilizar con los métodos descritos aquí. Los siguientes ejemplos proporcionan modalidades de métodos que demuestran la eficacia de los métodos descritos aquí, pero no se pretende que sean limitaciones del alcance de las reivindicaciones.

Todas las patentes, solicitudes de patentes, las solicitudes provisionales, y publicaciones mencionadas o citadas aquí se incorporan por referencia en su totalidad en la medida en que no sean incompatibles con las enseñanzas explícitas de esta descripción.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos ilustran procedimientos para la práctica de las reivindicaciones. Los ejemplos y modalidades descritos aquí sólo tienen fines ilustrativos y diversas modificaciones o cambios a los mismos se sugerirán a los expertos en la técnica y han de incluirse dentro del espíritu y alcance de las reivindicaciones. Todos los porcentajes son en peso y todas las proporciones de mezclas de disolventes son en volumen a menos que se indique lo contrario. Todas las temperaturas son en grados Celsius.

EJEMPLO 1. Transformación de Agrobacterium para la generación de vectores superbinarios.

El sistema superbinario de Agrobacterium se utiliza convenientemente para la transformación de anfitriones de plantas monocotiledóneas. Metodologías para la construcción y validación de vectores superbinarios están bien descritas y se incorporan aquí como referencia (Manual de Operación para el plásmido pSB1, Versión 3.1, disponible de Japan Tobacco, Inc., Tokio, Japón). Métodos biológicos y microbiológicos moleculares estándar se usaron para generar plásmidos superbinarios. La verificación/validación de la estructura del plásmido superbinario se realizó utilizando metodologías tales como las sugeridas en el Manual de Operación para el plásmido pSB1.

En este trabajo se utilizaron cepas de Agrobacterium que albergan diversos plásmidos superbinarios. Todos estos plásmidos contenían, como el gen marcador/de tolerancia a herbicidas seleccionable, la secuencia codificadora (CDS) para la proteína AAD1 (patente norteamericana no. 7,838,733), cuya expresión estaba bajo el control transcripcional de un promotor actina 1 de arroz y el intrón 1 asociado esencialmente como se describe en la patente norteamericana no. 5,641,876 y GENBANK ™ no de ccceso EU155408.1.

La terminación de la transcripción y poliadenilación de los mRNA addl se determinaron mediante 3'UTR de lipasa de maíz, esencialmente como se describe como bases 921 a 1277 de GEN BA K™ no de acceso gblL35913.1 IMZELIPASE y en la patente norteamericana no. 7,179,902. Además, los plásmidos superbinarios albergan un gen cuya expresión no se espera que afecte a la frecuencia de transformación. En particular, en el plásmido pEPS1083, un CDS que codifica una proteína YFP (esencialmente como se describe en la patente norteamericana no. 7,951,923) (cuya transcripción que fue controlada por un promotor de ubiquitina de maíz 1 con el intrón 1 asociado; patente norteamericana no. 5,510,474), y cuyo ARNm se terminó mediante un maíz per5 3'UTR (patente norteamericana no. 6,384,207)) fue usado ventajosamente como un marcador visual para supervisar la transformación y determinar las eficacias de transformación relativas. Otros plásmidos superbinarios utilizados para ejemplificar los métodos descritos aquí (plásmidos pEPS1013, pEPS1018, pEPS1028, pEPS1036, pEPS1038, pEPS1059, pEPS1064, pEPS1066, pEPS1068, pEPS6004 y pEPS6008) albergaban un CDS que codifica una proteína propiedad de Dow AgroSciences, la expresión de la cual fue controlado por los mismos elementos de transcripción/terminación como se utilizaron para la CDS YFP.

La expresión de YFP se utilizó para medir la eficiencia de transformación en algunos experimentos. Los porcentajes eficiencia de transformación se calcularon como el número de callos que muestran la expresión de YFP, dividido por el número de embriones tratados, por 100. La expresión de YFP se midió por observación visual utilizando un microscopio de fluorescencia ya sea Olympus SZX12 (Olympus America Inc.; Center Valley, PA). o una Leica M165FC (Leica Microsystems Inc.; Buffalo Grove, IL), con filtros de YFP que cubren los intervalos de excitación a 514 nm y emisión medidos a 527 nm.

En otros experimentos que emplean cepas de Agrobacterium que albergan plásmidos superbinarios que carecen del gen YFP, se calcularon las eficacias de transformación siguiendo el análisis TaqMan® de (Life Technologies, Carlsbad, CA) de plantas de la progenie producida a partir de embriones que fueron seleccionados por medio de la resistencia a Haloxifop. Los componentes TaqMan® utilizados fueron específicos para la región de codificación addl . La eficiencia de transformación se calculan a partir del número de eventos positivos a TaqMan® determinada, dividido por el número de embriones tratados, multiplicado por 100. Un "evento" para estos fines se consideran ser un embrión que produce una o más plantas verificadas con TAQMAN®. Un embrión individual se considera como un evento independientemente del número de plantas que pueden haberse producido.

EJEMPLO 2. Transformación de maíz por cepas de Agrobacterium (protocolo de transformación 1).

El flujo de trabajo básico se resume de la siguiente manera. Los embriones se extraen de mazorcas inmaduras de maíz en la etapa de desarrollo en la que los embriones jóvenes miden aproximadamente 1.4 a 1.9 mm de longitud. Cuando se han de comparar diferentes condiciones de transformación, aproximadamente el mismo número de embriones aislados a partir de una sola mazorca se dividen entre todos los tratamientos. Los embriones se incuban con una suspensión que contiene células de Agrobacterium y tensoactivo (o sin tensoactivo, para la comparación), luego se trasladaron a placas de medio sólido y se permitió el co-cultivo durante 3 a 5 días. Los embriones tratados se transfieren a un medio que contiene antibióticos (para la supresión y la muerte de las células de Agrobacterium) y compuestos para el aislamiento selectivo de tejidos y plantas de maíz transformadas genéticamente. El tejido de maíz (por lo general, pero no limitado a, callo) se cultiva en medio de selección hasta que se regeneran las plantas. Estas plantas se prueban para confirmar su transformación genética y las que tienen una modificación deseada se cultivan hasta la madurez para la producción de semillas.

Producción de embriones inmaduros. Semillas de una producción endogámica B104 fueron plantadas en macetas de 4 galones que contenían SUNSHINE BLEND CUSTOM 160 (SUN GRO HORTICULTURE; Bellevue, WA). Las plantas fueron cultivadas en un invernadero utilizando una combinación de lámparas de sodio de alta presión y halogenuros metálicos con un fotoperiodo luz:oscuridad de 16:08 horas. Para obtener embriones inmaduros para la transformación, se realizaron polinizaciones sib controladas. Los embriones inmaduros se aislaron 10 a 13 días después de la polinización cuando los embriones median aproximadamente 1.4 a 1.9 mm de longitud. Las mazorcas se esterilizaron superficialmente después de quitar la cáscara y sedas por inmersión en el 50% de blanqueador comercial (CLOROX®, 5.25% de hipoclorito de sodio con Tween ®-20 (1 o 2 gotas por 500 mL) durante 10 minutos y enjuagar tres veces con agua estéril.

Los embriones inmaduros se aislaron asépticamente directamente en un tubo micro centrífugo que contenía 2 mL de medio de infección con células de Agrobacterium en suspensión, y el agente tensoactivo según fuera apropiado. Los embriones se incubaron con la suspensión de células de Agrobacterium, que contenía tensoactivo (o sin tensoactivo, para experimentos de control), durante 5-30 minutos.

Una suspensión de células de Agrobacterium que contenía un vector superbinario se preparó al primero cultivar las células en forma de césped durante 4 días a 25°, o 3 días a 28°, en placas de agar sólido que contenían YEP (g/L: extracto de levadura, 5; peptona, 10; de NaCI, 5; agar, 15) con 50 mg/L de espectinomicina; 10 mg/L de rifampicina; y 50 mg/L de estreptomicina. (En algunos experimentos, las células de Agrobacterium se cultivaron en medio LB sólido (Sigma Aldrich; St.

Louis, O) 20 g/L, con antibióticos como anteriormente). Este cultivo se sembró a partir de una sola colonia aislada establecida bajo las mismas condiciones. Uno o dos de paladas llenas de células se desprenderon del césped, después se resuspendieron uniformemente (pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo) en medio de infección (IfM) a una densidad óptica a 600 nm (ODe) entre 0.35 y 0.45. El medio de infección contiene: 4.33 g/L de sales de MS; vitaminas MS modificadas con 1X ISU; 68.4 g/L de sacarosa; 36 g de glucosa/L; 700 mg/L de L-prolina; 3.3 mg/L de Dicamba-KOH; y 100 µ? acetosiringona (preparado en DMSO); a un pH de 5.2. Dependiendo del experimento, se añadió una cantidad apropiada de solución de tensoactivo (por ejemplo BREAK-THRU® S 233 a una concentración final de 0.01) al medio de infección después de la suspensión de las células.

La solución de Agrobacterium y embriones se incubó durante 5 a 30 minutos a temperatura ambiente, y a continuación, los embriones se transfirieron a medio de co-cultivo, que contenía 4.33 g/L de sales MS; vitaminas MS modificadas con 1X ISU; 30 g/L de sacarosa; 700 mg/L de L-prolina; 100 mg/L de myo-inositol; 3.3 mg/L de Dicamba-KOH; 100 mg/L de hidrolizado enzimático de caseína; 15 mg/L de AgN03; 100 µ? acetosiringona; y 3 g/L GELZAN™; a un pH 5.8. La incubación del co-cultivo fue de 3 a 4 días a 25°C bajo 24 horas de luz fluorescente blanca (aproximadamente 50 Em"2s"').

Descanso v Selección. Después del co-cultivo, los embriones (36 embriones/placa) se transfirieron cuidadosamente a medio de de reposo sin selección fresco que contiene 4.33 g/L de sales de MS; vitaminas MS modificadas con 1X ISU; 30 g/L de sacarosa; 700 mg/L de L-prolina; 3.3 mg/L de Dicamba en KOH; 100 mg/L de myo-inositol; 100 mg/L de hidrolizado enzimático de caseína; 15 mg/L de AgN03; 0.5 g/L MES; 250 mg/L de carbenicilina; y 2.3 g/L GELZAN™; a un pH 5.8. La incubación se continuó durante 7 días a 28° bajo 24 horas de luz fluorescente blanca (aproximadamente 50 µ????1).

Después del periodo de reposo de 7 días, los embriones se transfirieron al medio de selección. Para la selección de los tejidos de maíz transformados con un plásmido que contiene un gen vegetal marcador addl superbinarío expresable seleccionable, los embriones (36/placa) fueron trasladados primero al medio de selección I, que consta de medio de reposo (anterior) que contiene ácido R-Haloxifop 100 nM (0.0362 mg/L). Los embriones se incubaron durante 1 semana (28°; luz continua), y luego fue trasladado a un medio de selección II, que consiste de medio de reposo con de ácido R-Haloxifop 500 nM (0.1810 mg/L), sobre el cual se incubaron bajo luz continua durante 7 días más. En este momento fueron trasladados a medio de selección fresco II y la incubación se continuó como antes durante una semana adicional.

Los expertos en la técnica de la transformación de maíz entenderán que otros métodos de selección de plantas transformadas están disponibles cuando se utilizan otros genes vegetales marcadores expresables seleccionables (por ejemplo, genes de tolerancia a herbicidas).

Pre-regeneración Después del proceso de selección, los cultivos se transfirieron a medio de pre-regeneración que contenía 4.33 g/L de sales de MS; vitaminas MS modificadas con 1X ISU; 45 g/L de sacarosa; 350 mg/L de L-prolina; 100 mg/L de myo-inositol; 50 mg/L de hidrolizado enzimático de caseína; 1.0 mg/L de AgN03; 0.25 gm/L de MES; 0.5 mg/L de ácido naftalenacético en NaOH; 2.5 mg/L de ácido abscísico en etanol; 1 mg/L de 6-bencilaminopurina; 250 mg/L de carbenicilina; 2,5 g/L GELZAN™; y ácido R-haloxifop 500 nM; a un pH de 5.8. La incubación se continuó durante 7 días a 28°C bajo luz fluorescente blanca continua como anteriormente.

Regeneración v aislamiento de plántulas Para la regeneración, los cultivos se transfirieron a medio de regeneración I que contenía 4.33 g/L de sales MS; vitaminas MS modificadas con 1X ISU; 60 g/L de sacarosa; 100 mg/L de myo-inositol; 125 mg/L de carbenicilina; 2,5 g/L GELZAN™; y ácido R-haloxifop 500 nM; a un pH de 5.8 y se permitió que las plántulas se generaran y crecieran a 28°C bajo luz fluorescente blanca continua durante un máximo de 3 semanas.

Cuando las plántulas alcanzaron una etapa de crecimiento adecuado, fueron extraídas con fórceps y bisturí y se transfirieron a medio de regeneración II que contenía 4.33 de sales de MS; vitaminas MS modificadas con 1X ISU; 30 g/L de sacarosa; 100 mg/L de myo-inositol; 3.0 g/L GELZAN™ ; a un pH de 5.8; y se incubaron a 28°C bajo luz fluorescente blanca continua como anteriormente para permitir un mayor crecimiento y desarrollo de los brotes y las raíces.

Las plantas de producción de semillas fueron trasplantadas en medio de cultivo sin tierra METRO- IX 360 (SUN GRO HORTICULTURE; BELLEVUE, WA) y fueron aclimatadas en una cámara de crecimiento. Las plantas fueron luego trasplantadas a mezcla de tierra SUNSHINE CUSTOM BLEND 160 y crecieron hasta la floración en el invernadero, se llevaron condujeron controladas para la producción de semillas.

EJEMPLO 3. Transformación de maíz por cepas de Agrobacterium (protocolo de transformación 2).

El flujo de trabajo básico se resume de la siguiente manera. Los embriones se extraen de mazorcas inmaduras de maíz en la etapa de desarrollo en la que los embriones jóvenes miden aproximadamente 1.8 a 2.4 mm de longitud. Cuando diferentes condiciones de transformación se han de comparar, aproximadamente el mismo número de embriones aislados a partir de un solo mazorca se dividen entre todos los tratamientos. Los embriones se incubaron con una suspensión que contenía células de Agrobacterium y tensoactivo (o sin tensoactivo, para la comparación), luego se trasladan a placas de medio sólido y se permite el co-cultivo durante 1 a 4 días. Los embriones tratados se transfieren a un medio que contenía antibióticos (para la supresión y la muerte de las células de Agrobacterium) y compuestos para el aislamiento selectivo de tejidos y plantas de maíz transformadas genéticamente. El tejido de maíz (por lo general, callo pero sin limitarse al mismo) se cultiva en medio de selección hasta que se regeneran las plantas. Estas plantas se prueban para confirmar su transformación genética y las que tienen una modificación deseada se cultivan hasta la madurez para la producción de semillas.

Producción de embriones inmaduros Semillas de embriones de producción de maíz B104 línea pura (una variedad del estado de lowa lanzado comercialmente a principios de 1980) se sembraron en macetas de 4 galones que contenían SUNSHINE BLEND CUSTOM 160 (SUN GRO HORTICULTURE; Bellevue, WA). Las plantas fueron cultivadas en un invernadero utilizando una combinación de lámparas de sodio de alta presión y halogenuros metálicos con un fotoperiodo luz:oscuridad de 16:08 horas. Para obtener embriones inmaduros para la transformación, se realizaron polinizaciones sib controladas. Los embriones inmaduros se aislaron a las 10 a 13 días después de la polinización cuando los embriones eran de aproximadamente 1.8 a 2.4 mm de tamaño. Las mazorcas se esterilizaron superficialmente después de quitar la cáscara y sedas por inmersión en el 50% de blanqueador comercial (CLOROX®, 6.15% de hipoclorito de sodio) con Tween ®-20 (1 o 2 gotas por 500 mL) durante 10 minutos y enjuagar tres veces agua estéril.

Alternativamente, las mazorcas de maíz pueden ser esterilizadas superficialmente mediante rociado profunda con una solución recién preparada de etanol al 70% hasta que la mazorca esté completamente empapada. Antes de su uso, se permite que la mazorca se seque al aire durante media hora en una campana de transferencia estéril para permitir que la solución de etanol se evapore completamente.

Los embriones inmaduros se aislaron asépticamente directamente en un tubo micro centrífugo que contenía 2 mL de medio de inoculación con células de Agrobacterium en suspensión, y el agente tensoactivo según sea apropiado. Los embriones se incubaron con la suspensión de células de Agrobacterium, que contenía tensoactivo (o sin tensoactivo, para experimentos de control), durante 5-30 minutos.

Una suspensión de células de Agrobacterium que contenía un vector superbinario se preparó primero al cultivar células (en un matraz de 500 mL) en 125 mL de medio LB (SIGMA ALDRICH; St. Louis, MO) 20 g/L, que contenía 50 mg/L de espectinomicina; 10 mg/L de rifampicina; y 50 mg/L de estreptomicina con agitación (250 rpm en la oscuridad) a 26° durante 6 horas. Este cultivo se estableció por dilución 1:5 de un cultivo de una noche de 25 mL (cultivada en el mismo medio) en el medio fresco. Las células se sedimentaron por centrifugación durante 15 min a 3500 rpm a 4o, a continuación, se volvieron a suspender uniformemente (pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo) en medio de inoculación (INM) a una densidad óptica de aproximadamente 1.0 a 600 nm (OD6o)- El medio de inoculación contenía: 2.2. gm /L salesde MS (Frame et al (2011, Transformación genética utilizando embriones cigóticos inmaduros de maíz En Métodos y protocolos de cultivo de embriones vegetales:. Métodos en Biología Molecular TA Thorpe y EC Yeung, (Eds), Springer Science and Business Media, LLC pp 327-341); vitaminas MS modificadas con 1X ISU (Frame et al, 2011, supra);. 68.4 g/L de sacarosa; 36 g/L de glucosa, 115 mg/L de L-prolina; 100 mg/L myo-inositol, y 200 µ? acetosiringona (preparado en DMSO); a un pH de 5.4. Dependiendo del experimento, se agregó una cantidad apropiada de solución de tensoactivo (por ejemplo, BREAK-THRU®S 233 a una concentración final de 0.01%) al medio de inoculación después de suspender las células.

La solución de Agrobacterium y embriones se incubó durante 5 a 15 minutos a temperatura ambiente, y a continuación, los embriones se transfirieron a medio de co-cultivo, que contenía 4.33 g/L de sales MS; vitaminas MS modificadas con 1X ISU; 30 g/L de sacarosa; 700 mg/L de L-prolina; 3.3 mg/L de Dicamba en KOH (3,6-dicloro-o-anísico o ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzoico); 100 mg/L de myo-inositol; 100 mg/L de hidrolizado enzimático de caseína; 15 mg/L de AgN03; 100 µ? acetosiringona en DMSO; y 3 g/L de GELZAN™ (Sigma-Aldrich); a un pH de 5-8. La incubación del co-cultivo fue de 3 a 4 días a 25°C bajo luz fluorescente blanca continua (aproximadamente 50 pEm"2s'1).

Reposo v selección Después del co-cultivo, los embriones (36 embriones/placa) se transfirieron cuidadosamente al medio de reposo no selectivo que contenía 4.33 de sales de MS; vitaminas MS modificadas con 1X ISU; 30 g/L de sacarosa; 700 mg/L de L-prolina; 3.3 mg/L de Dicamba en KOH; 100 mg/L de myo-inositol; 100 mg/L de hidrolizado enzimático de caseína; 15 mg/L de AgN03; 0.5 gm/L MES monohidrato de ácido (2-(N-morfolino) etanosulfónico (PHYTOTECHNOLOGI ES LABR; Lenexa, KS); 250 mg/L de carbenicilina; y 2,3 g/L GELZAN™; a un pH de 5.8. Se continuó la incubación durante 7 días a 28 ° en condiciones de luz blanca fluorescente continua como anteriormente.

Después del periodo de reposo de 7 días, los embriones se transfirieron a un medio de selección. Para la selección de los tejidos de maíz transformados con un plásmido que contenía un gen marcador vegetal addl superbinario expresable seleccionable, los embriones (18 embriones/placa) se transfirieron primero a un medio de selección I que consistía de medio de reposo (anterior), y que contenía ácido R-haloxifop 100 nM (0.0362 mg/L). Los embriones se incubaron durante 1 semana, y luego fueron transferidos (12 embriones/placa) a un medio de selección II, que consistía de medio de reposo (anterior), y con ácido R-haloxifop 500 nM (0.1810 mg/L), en el que se incubaron durante 2 semanas adicionales. Los aislados transformados se obtienen en el transcurso de aproximadamente 4 a 6 semanas a 28°C bajo condiciones de 24 horas de luz fluorescente blanca (aproximadamente 50 Em"2s'1). Los aislados recuperados fueron transferidos a un medio de pre-regeneración fresco para la iniciación de la regeneración y su posterior análisis.

Los expertos en la técnica de la transformación de maíz entenderán que otros métodos de selección de plantas transformadas están disponibles cuando se utilizan otros genes vegetales marcadores expresables seleccionables (por ejemplo, genes de tolerancia a herbicidas).

Pre-regeneración Después del proceso de selección, los cultivos expuestos al régimen de luz de 24 horas fueron transferidos (6 al 8 callos/placa) a medio a pre-regeneración que contenía 4.33 de sales de MS; vitaminas MS modificadas con 1X ISU; 45 g/L de sacarosa; 350 mg/L de L-prolina; 100 mg/L de myo-inositol; 50 mg/L de hidrolizado enzimático de caseína; 1.0 mg/L de AgN03 ; 0.25 MES gm/L; 0.5 mg/L de ácido naftalenacético en NaOH; 2.5 mg/L de ácido abscísico en etanol; 1 mg/L de 6-bencilaminopurina; 250 mg/L de carbenicilina; 2.5 g/L GELZAN™; y ácido R-haloxifop 500 nM; a un pH de 5.8. La incubación se continuó durante 7 a 14 días a 28° bajo luz blanca fluorescente continua (aproximadamente 50 Em"2s'1).

Regeneración v aislamiento de plántulas Para la regeneración, los cultivos se transfirieron (hasta 12 callos por PHYTATRAY™ (PHYTOTECHNOLOGIES LABR.)) a un primer medio de regeneración que contenía 4.33 gm/L de sales de MS; vitaminas MS modificadas con 1X ISU; 60 g/L de sacarosa; 100 mg/L de myo-inositol; 125 mg/L de carbenicilina; 3,5 g/L GELLAN GUM G434 (PHYTOTECHNOLOGIES LABR.); y ácido R-haloxifop 500 nM; a un pH de 5.8 y se les permitió que se generaran plántulas y crecieran durante un máximo de 3 semanas.

Cuando las plántulas alcanzaron de 3 a 5 cm de longitud, fueron trasladados (6 plantas por PHYTATRAY™) al medio de crecimiento para plantas que contenía 4.33 gm/L de sales MS; vitaminas MS modificadas con 1X ISU; 30 g/L de sacarosa; 100 mg/L de myo-inositol; 3.5 g/L GELLAN GUM G434; y 0.5 mg/L de ácido indolacético en NaOH; a un pH de 5.8, y se incubaron a 25°C bajo condiciones de 16 horas de luz fluorescente blanca (aproximadamente 50 pEm'2s'1) para permitir el posterior crecimiento y desarrollo de los brotes y las raíces.

Producción de semillas Las plantas de fueron trasplantadas en medio de crecimiento METRO-MIX 360 sin tierra, (SUN GRO HORTICULTURE; BELLEVUE, WA) y se aclimataron en una cámara de crecimiento. Las plantas fueron luego trasplantadas a mezcla de tierra SUNSHINA CUSTOM BLEND 160 y crecieron hasta la floración en el invernadero. Se realizaron polinizaciones controladas para la producción de semillas.

EJEMPLO 4. Eficiencias de transformación que utilizan células de Agrobacterium cultivadas en medio líquido.

La cepa superbinaria de Agrobacterium LBA4404 (pEPS1083) se utilizó para transformar embriones inmaduros de maíz mediante el método descrito en el ejemplo 2 (protocolo de transformación 1).

Se realizaron comparaciones de las eficacias de transformación obtenidas cuando las células de Agrobacterium se desprenderon de placas de agar YEP y se resuspendieron en medio de infección (If ), contra los experimentos realizados al mismo tiempo usando de células de Agrobacterium cultivadas en medio LB líquido, cosechadas por centrifugación, y resuspendidas en IfM. Las eficiencias de transformación comparativas se determinaron en las diversas etapas del proceso contando el número de manchas fluorescentes amarillas (YFP + ) en piezas de tejido tratadas una a cinco semanas después de la iniciación de los experimentos de transformación. La tabla 2 resume los resultados obtenidos.

Tabla 2. Comparación de las eficacias de transformación usando inóculos de Agrobacterium LBA4404 (pEPS1083) preparados a partir de células tomadas por desprendedo de las placas de agar o cosechadas después de crecimiento en cultivo Los resultados resumidos en la tabla 2 demuestran que la infección de embriones de maíz utilizando células de Agrobacterium recién cosechadas del líquido cultivo proporciona eficacias de transformación significativamente mayores que la que se obtienen de las células desprendidas de las placas de agar.

EJEMPLO 5. Mejora de la eficiencia de transformación mediante adición de tensoactivo al protocolo de transformación 1.

La cepa superbinaria de Agrobacterium LBA4404 (APR 108652) se utilizó para transformar embriones inmaduros de maíz por los métodos descritos en el ejemplo 2. El plásmido pDAB108652 contenía la región de codificación de YFP, cuya expresión fue dirigida por el promotor ZmUbil, y también alberga la región codificante a la tolerancia a herbicidas addl bajo el control del promotor de expresión actinal de arroz. Se realizaron comparaciones de las eficacias de transformación obtenidas cuando las células se suspendieron en Agrobacterium IfM sin tensoactivo, en comparación con los experimentos realizados al mismo tiempo con IfM que contenía tensoactivo BREAK-THRU® S 233 en varias concentraciones. Las eficiencias de transformación se calculan contando callos con sectores fluorescentes (cada callo derivado de un solo embrión) después de 4 semanas de selección con Haloxifop. En este momento, los sectores fluorescentes eran grandes y por lo tanto los tejidos representaban sectores transformados de manera estable. Los resultados resumidos en la tabla 3 demuestran que el uso de tensoactivo aumenta la eficiencia de transformación, y que hay una sensibilidad del efecto de mejora sobre la concentración del agente tensoactivo utilizado.

Tabla 3. Efecto de diversas concentraciones del tensoactivo BREAK-THRU® S 233 en las eficacias de transformación.

La cepa superbinario de Agrobacterium LBA44Q4 (pEPS1083) se utilizó para transformar embriones inmaduros por el método descrito en el ejemplo 2. Se realizaron comparaciones de las eficacias de transformación obtenidas cuando las células de Agrobacterium se suspendieron en IfM sin tensoactivo, en comparación con experimentos realizados al mismo tiempo en la presencia de tensoactivo añadido en el IfM. Las eficiencias de transformación comparativas se determinaron en las diversas etapas del proceso contando el número de manchas fluorescentes amarillas (YFP + ) en pedazos de tejido tratados devuna a cinco semanas después de la iniciación de los experimentos de transformación. La tabla 4 resume los resultados obtenidos.

En algunos experimentos, las células de Agrobacterium se lavaron con IfM (con, o sin, tensoactivo) antes de la etapa de co-cultivo por suspensión y centrifugación suave ("enjuague" en la Tabla 4). Además, en el experimento 5 (tabla 4) 200 µ? deacetosiringona, (en lugar de 100 µ? como se especifica en el ejemplo 2) se utilizaron para inducir la expresión de genes vir, y las células de Agrobacterium se cultivaron en una placa de medio LB con los antibióticos apropiados, en lugar de medio YEP.

Tabla 4. Mejora de la eficiencia de transformación por Agrobacterium mediante el uso de un agente tensoactivo. Los tensoactivos BREAK-THRU® S 233, PREFERENCE® o TACTIC™ se agregaron al medio de infección (concentración de trabajo 0.01%) utilizado para crear una suspensión de células de Agrobacterium antes del co-cultivo.

* S233 es BREAK-THRU S 233 ** IfM es Medio de Infección utilizado para suspender y/o enjuagar las células de Agrobacterium .

*** Las células de Agrobacterium se cultivaron en una placa de medio LB con antibióticos y la expresión de genes se indujo con 200 µ? acetosiringona.

Los experimentos se resumen en la tabla 4 muestran claramente que la presencia del tensoactivo BREAK-THRU®S 233 en el medio de infección utilizado para volver a suspender las células de Agrobacterium desprendidas de las placas de medio sólido aumenta dramáticamente la eficiencia de transformación de embriones inmaduros. Además, el tensoactivo TÁCTICA™ tiene un efecto positivo pero menos dramático en la mejora de la eficiencia de transformación.

En una ejemplificación adicional de los métodos de esta descripción, los embriones inmaduros de maíz se transformaron con células de Agrobacterium cepa LBA4404 (pEPS1083) por los métodos del ejemplo 2. Eficacias de transformación fueron monitoreadas mediante la aparición de puntos o sectores YFP+ en callos en desarrollo en los embriones inmaduros. El lado izquierdo de la figura 1 muestra cinco experimentos (Experimentos 1 a 5) utilizando células de Agrobacterium desprendidas de las placas de agar sólido, y el lado derecho de la figura 1 muestra los resultados de tres experimentos (Experimentos 6 a 9) en el que se recogieron las células de Agrobacterium de cultivos en líquido. En los experimentos combinados 1 a 5, la eficiencia de transformación se incrementó en los embriones de las nueve mazorcas cosechadas (100%) y el aumento en la eficiencia de transformación fue estadísticamente significativo (exacta de Fisher p<-0.05) en embriones de seis de las nueve mazorcas (67%). En los experimentos combinados 6 a 9 (Agrobacteria cultivadas en líquido), los embriones de todas las ocho mazorcas cosechadas (100%) mostraron un aumento estadísticamente significativo en la eficiencia de transformación. Por lo tanto, es evidente a partir de los resultados resumidos en la figura 1 que la adición de BREAK-THRU® S 233 al medio de infección aumenta drásticamente la eficiencia de transformación de embriones inmaduros de maíz, en algunos casos dando por resultado eficacias de transformación mayores al 90%.

En otra ilustración de los métodos de esta descripción, embriones inmaduros de maíz se transformaron con células de cepa la LBA4404 de Agrobacterium que albergan diversos plásmidos (todos los cuales contenían el gen marcador seleccionable addl) por los métodos del ejemplo 2. Como anteriormente, los tratamientos experimentales compararon la eficiencia de transformación con, o sin, el uso de 0.01% de tensoactivo BREAK-THRU® S 233. Los embriones se regeneran y se sometieron a toda la selección de Haloxifop para la producción de plantas. Por lo tanto, los datos se recogieron en una fase sustancialmente más tardía que aquella que se resume en la figura 1. Los porcentajes de la eficiencia de transformación se calcularon dividiendo el número de embriones que produjo una planta transgénica ("un evento") por el número de embriones inmaduros tratados multiplicado por 100. Para este propósito, un embrión se contó como un único evento, incluso si se produjeron múltiples plantas transgénicas. Los resultados de tres experimentos con células de Agrobacterium desprendidas de las placas de agar se muestran en la figura 2 (experimentos 1, 2 y 3). Además, la figura 2 muestra los resultados de un experimento (experimento 4) en el que se cultivan las células de Agrobacterium en medio líquido, se cosechadas por centrifugación, y se resuspendieron en IM, (con, o sin, BREAK-THRU® S 233). Las barras en pares en la figura 2 muestran las respuestas de los embriones de mazorcas individuales.

De los datos de la figura 2 es claro que la adición del tensoactivo BREAK-THRU® S 233 da como resultado un aumento dramático en la eficiencia de transformación de embriones inmaduros de maíz mediada por células de Agrobacterium, independientemente de la configuración de la composición genética del plasmido transformado. En los experimentos combinados 1, 2 y 3, las eficiencias de transformación se incrementaron en embriones de 23 de las 26 mazorcas cosechadas (88%) y los aumentos de eficiencia de transformación fueron estadísticamente significativas (exacta de Fisher p<-0.05) en embriones de 12 de los 26 mazorcas ( 46%). En el Experimento 4 (de crecimiento líquido Agrobacteria), los embriones de 10 de los 12 mazorcas cosechadas (83%) mostraron un incremento en la eficiencia de transformación, y el aumento fue estadísticamente significativo en uno de los 12 mazorcas (8%).

EJEMPLO 6. Comparación de la acción de mejora de la transformación de los tensoactivos de varias clases químicas.

La Tabla 1 proporciona una lista no limitativa de agentes tensoactivos de varias clases químicas. Los experimentos de transformación de embriones inmaduros se realizaron utilizando el protocolo de transformación 2 como se proporciona en el ejemplo 3. Células de Agrobacterium que albergan diversos plásmidos se suspendieron en medio de inoculación (InM) que contenía BREAK-THRU® S 233 o varios otros tensoactivos (todos a una concentración de 0.01%), y las tasas de transformación (medidas por un ensayo Taqman® del gen addl se compararon a de 7 a 10 semanas después del inicio del experimento.

Los porcentajes de la eficiencia de transformación se calcularon dividiendo el número de embriones que produjo una planta transgénica ("un evento") por el número de embriones inmaduros tratados, multiplicado por 100. Para este propósito, un embrión se contó como un único evento, incluso si produce múltiples plantas transgénicas. La tabla 5 presenta las eficacias de transformación obtenidas.

Tabla 5. Comparación de las eficacias de transformación obtenidas con tensoactivos de diferentes clases químicas. BREAK-THRU® S 233 y otros tensoactivos se utilizaron a una concentración de 0.01%.

* En promedio se utilizaron 4 mazorcas en un experimento dado. Los embriones recolectados de una sola mazorca se dividieron entre los dos tratamientos en cada experimento.

Los resultados se resumen en la tabla 5 demuestran que el uso de BREAK-THRU ® S 233, cuando se incluye en el medio de inoculación utilizado para re-suspender las células del inoculo de Agrobacterium cultivadas en y cosechadas en medio líquido, proporcionaron eficiencias de transformación que fueron superiores a las obtenidas con la mayoría de los otros tensoactivos ensayados. En tres experimentos (experimento 2, experimento 9, y experimento 11), las eficiencias de transformación observadas fueron casi iguales entre los dos tensoactivos.

EJEMPLO 7. Resultados de transformación de diferentes operadores.

Un experto en la técnica de la transformación de maíz entenderá que las metodologías de transformación de plantas frecuentemente requieren considerable experiencia, la cual se adquiere a lo largo de meses o años de experimentación. Las eficiencias de transformación pueden variar en un amplio intervalo debido a las inconsistencias en las formas en las que los procedimientos se puestos en práctica por diferentes operadores. Por lo tanto, es ventajoso proporcionar procedimientos de transformación de maíz que mejoren la previsibilidad en las eficacias de transformación obtenidas por diferentes operadores en diferentes momentos. Las transformaciones de embriones inmaduros de maíz se realizaron durante un periodo de varios meses usando los métodos del ejemplo 3 (cepa de Agrobacterium LBA4404 que alberga diversos plásmidos) y que contenía BREAK-THRU® S 233 en el medio de inoculación. Las eficiencias de transformación se estimaron a partir de los recuentos de tejidos callosos tolerantes a Haloxifop. La tabla 6 resume los resultados obtenidos.

Tabla 6. Eficacias de transformación obtenidas por múltiples operadores que utilizan métodos que incorporan un agente tensoactivo en el medio de inoculación.

* De recuentos de eventos manuales - no todos los eventos se verificaron mediante análisis Taqman®. La frecuencia de escape para la selección Haloxifop es de aproximadamente 5%.

***Eficiencia Transformación promedio para todos los operadores.

Los resultados resumidos en la tabla 6, muestran que el protocolo de transformación descrito en el ejemplo 3, cuando se practica con la inclusión de BREAK-THRU® S 233 en el medio de inoculación, proporciona una metodología sólida y predecible que reduce las variaciones entre operadores en la eficiencia de transformación. Además, la predictibilidad mejorada de los métodos permite una determinación más precisa de la dimensión del experimento (por ejemplo, números de embriones que deben ser tratados) para obtener un resultado deseado (por ejemplo, números de eventos transformados obtenidos).

La presente invención no está limitada en su alcance por las modalidades aquí descritas que se presentan como ilustraciones de algunos aspectos de la invención y cualquier modalidad que sea funcionalmente equivalente está dentro del alcance de esta invención. Diversas modificaciones de los métodos, además de las mostradas y descritas aquí serán evidentes para los expertos en la técnica y se pretende que caigan dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Además, aunque sólo ciertas combinaciones representativas de las etapas del método descritas aquí se discuten específicamente en las modalidades anteriores, otras combinaciones de las etapas del método serán evidentes para los expertos en la técnica y también se pretende que caigan dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Por lo tanto puede mencionarse explícitamente aquí una combinación de pasos; sin embargo, se incluyen otras combinaciones de pasos, aunque no se indica explícitamente. Cuando se indica explícitamente un valor, debe entenderse que los valores que son aproximadamente iguales el valor indicado, también están dentro del alcance de la invención. Cuando se indica un intervalo de valores, cada valor entero, y cada fracción del mismo, entre los límites superior e inferior de ese intervalo citado, también se describe específicamente, junto con cada sub-intervalo entre tales valores. El término "que comprende" y variaciones del mismo tal como se utiliza aquí se usa como sinónimo con el término "incluye" y variaciones del mismo y son términos abiertos no limitativo. Tal como se usa aquí, los términos "modificar" o "alterar", o cualquier forma de los mismos, significan modificar, alterar, sustituir, eliminar, reemplazar, eliminar, modificar, o transformar.

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Un método para la transformación de células vegetales que comprende exponer las células vegetales a las células de Agrobacterium en un medio líquido que contiene un tensoactivo, el tensoactivo tiene una concentración de 0.001 por ciento en peso a 0.08 por ciento en peso en el medio líquido.

2. El método para la transformación de células vegetales de la reivindicación 1, que comprende además un agente tensoactivo adicional.

3. El método para la transformación de células vegetales de la reivindicación 1, en el que el tensoactivo es un adyuvante, un agente tensoactivo no iónico, un tensoactivo aniónico, un tensoactivo a base de aceite, un tensoactivo anfótero, o un agente tensoactivo polimérico.

4. El método para la transformación de células vegetales de la reivindicación 1, en el que el tensoactivo es un tensoactivo de trisiloxano no iónico.

5. El método para la transformación de células vegetales de la reivindicación 1, en el que el tensoactivo es un alcoxilato de trisiloxano, aceite de soya etoxilado, etoxilato de alcohol C-13, betaínas de Ci2-C14-alquildimetilo, o copolímero de bloques de óxido de di-sec-butilfenol etileno-óxido de propileno.

6. El método para la transformación de células vegetales de la reivindicación 1, en el que las células vegetales son células de maíz.

7. El método para la transformación de células vegetales de la reivindicación 1, en el que las células vegetales se derivan de embriones inmaduros.

8. El método para la transformación de células vegetales de la reivindicación 7, en el que los embriones inmaduros tienen una longitud mayor o igual a 1.5 mm y menor o igual a 2.5 mm.

9. El método para la transformación de células vegetales de la reivindicación 1, en el que las células vegetales se exponen a luz continua después de la exposición a las células de Agrobacterium.

10 Un método para la transformación de células vegetales que comprende: preparar un medio líquido que contiene un tensoactivo, el tensoactivo presenta una concentración de 0.001 por ciento en peso a 0.08 por ciento en peso en el medio líquido; la suspensión de células de Agrobacterium en el medio líquido; y exponer las células vegetales a las células de Agrobacterium en el medio líquido que contiene el tensoactivo.

11. El método para la transformación de células vegetales de la reivindicación 10, en el que las células de Agrobacterium se desprenden de un medio sólido antes de ser suspendidas en el medio líquido que contiene un agente tensoactivo.

12. El método para la transformación de células vegetales de la reivindicación 10, en el que las células de Agrobacterium se cultivan en un medio de crecimiento líquido antes de ser suspendidas en el medio líquido que contiene un agente tensoactivo.

13. El método para la transformación de células vegetales de la reivindicación 10, que comprende además un agente tensoactivo adicional.

14. El método para la transformación de células vegetales de la reivindicación 10, en el que el tensoactivo es un adyuvante, un agente tensoactivo no iónico, un tensoactivo aniónico, un tensoactivo a base de aceite, un tensoactivo anfótero, o un agente tensoactivo polimérico.

15. El método para la transformación de células vegetales de la reivindicación 10, en el que el tensoactivo es un tensoactivo de trisiloxano no iónico.

16. El método para la transformación de células vegetales de la reivindicación 10, en el que el tensoactivo es un alcoxilato de trisiloxano, aceite de soya etoxilado, etoxilato de alcohol C-13, betaínas de C12-C14-alquildimetilo, o copolímero de bloques de óxido de di-sec-butilfenol etileno-óxido de propileno.

17. El método para la transformación de células vegetales de la reivindicación 10, en el que las células vegetales son células de maíz.

18. El método para la transformación de células vegetales de la reivindicación 10, en el que las células vegetales se derivan de embriones inmaduros.

19. El método para la transformación de células vegetales de la reivindicación 18, en el que los embriones inmaduros tienen una longitud de 1.5 a 2.5 mm.

20. El método para la transformación de células vegetales de la reivindicación 10, en el que las células vegetales se exponen a luz continua después de la exposición a las células de Agrobacterium.