KR20140107419A

KR20140107419A - 애그로박테리움을 사용하는 개선된 형질전환 방법

Info

Publication number: KR20140107419A
Application number: KR1020147019173A
Authority: KR
Inventors: 폴 데이빗 밀러
Original assignee: 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨
Priority date: 2011-12-15
Filing date: 2012-12-14
Publication date: 2014-09-04
Also published as: US20130157369A1; RU2014128796A; MX2014007161A; MX348271B; HK1203215A1; CN104114708A; TW201333197A; AU2012352095A1; JP6170939B2; CA2858117A1; EP2791340A4; JP2015502156A; PH12014501339A1; EP2791340A1; RU2620975C2; AR089254A1; WO2013090734A1; NZ625401A; TWI582233B; CN104114708B

Abstract

애그로박테리움을 형질전환체로 사용시 식물에서의 형질전환 빈도를 증가시키는 방법이 기재된다. 방법은 계면활성제를 함유하는 액체 배지중 애그로박테리움 세포에 식물세포를 노출시키는 단계를 포함한다. 일부 방법은 식물세포를 애그로박테리움 세포에의 노출 후 연속광에 노출시키는 단계를 포함한다. 이들 방법으로 유용한 식물의 예는 옥수수 식물 (예를 들어, 미성숙 옥수수 배)을 포함한다.

Description

애그로박테리움을 사용하는 개선된 형질전환 방법{METHOD FOR IMPROVED TRANSFORMATION USING AGROBACTERIUM}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2011년 12월 15일에 출원된 미국 가출원 61/576,138을 우선권 주장한다.

식물 형질전환은 일반적으로 외래 유전자를 안정하게 유지 및 발현하는 임성(fertile) 후손 식물이 수득될 수 있도록 식물세포중으로의 식물-발현가능한 외래 유전자의 도입에 요구되고 활용되는 방법론을 포함한다. 단자엽식물 및 쌍자엽식물 분류의 다수 구성원이 형질전환되었다. 트랜스제닉 농작물, 및 과일과 채소는 상업적 관심사이다. 그러한 작물은 옥수수, 벼, 대두, 캐놀라, 해바라기, 자주개자리, 수수속의 식물, 밀, 목화, 땅콩, 토마토, 감자 등을 포함하며 그들에 한정되지 않는다.

식물세포중으로 외래 유전물질의 도입, 및 도입된 유전자를 안정하게 유지 및 발현하는 식물의 수득을 위한 몇몇 기술이 알려져 있다. 그러한 기술은 세포중으로 직접 미세입자에 코팅한 유전물질의 가속을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 4,945,050 및 미국 특허 5,141,131). 다른 형질전환 기술은 위스커스(WHISKERS)^TM 기술을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 5,302,523 및 미국 특허 5,464,765 참조). 전기천공 기술 또한 식물의 형질전환에 사용되어 왔다. 예를 들어 WO 87/06614, 미국 특허 5,472,869, 미국 특허 5,384,253, WO 92/09696 및 WO 93/21335 참조. 부가적으로, 식물 원형질체와 전달시키고자 하는 DNA를 함유하는 리포좀의 융합, DNA의 직접 주입, 및 그밖의 가능한 방법이 채용될 수 있다.

일단 삽입된 DNA가 식물 게놈중으로 통합되면, 보통은 후속 세대 전체에 걸쳐서 비교적 안정하다. 형질전환된 세포는 통상의 방법으로 식물 내부에서 성장한다. 그들은 생식세포를 형성하고 형질전환된 형질(들)을 후손 식물에 전해줄 수 있다. 그러한 식물은 통상의 방법으로 성장시킬 수 있고 동일한 형질전환된 유전적 인자 또는 그밖의 유전적 인자를 보유하는 식물과 교잡시킬 수 있다. 생성되는 하이브리드 개체는 상응하는 표현형 특성, 예를 들어 식물 해충의 섭식 방제능을 보유한다.

숙주식물 세포중으로의 DNA 삽입에 다수의 대안 기술이 또한 이용될 수 있다. 그들 기술은 형질전환제로서 애그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 또는 애그로박테리움 리조진스(Agrobacterium rhizogenes)에 의하여 전달된 T-DNA로의 형질전환을 포함하며 그에 한정되지 않는다. 식물은 예를 들어 미국 특허 5,177,010, 미국 특허 5,104,310, 유럽 특허출원 0131624B1, 유럽 특허출원 120516, 유럽 특허출원 159418B1, 유럽 특허출원 176112, 미국 특허 5,149,645, 미국 특허 5,469,976, 미국 특허 5,464,763, 미국 특허 4,940,838, 미국 특허 4,693,976, 유럽 특허출원 116718, 유럽 특허출원 290799, 유럽 특허출원 320500, 유럽 특허출원 604662, 유럽 특허출원 627752, 유럽 특허출원 0267159, 유럽 특허출원 0292435, 미국 특허 5,231,019, 미국 특허 5,463,174, 미국 특허 4,762,785, 미국 특허 5,004,863 및 미국 특허 5,159,135에 기재된 바와 같이 애그로박테리움 기술을 이용하여 형질전환시킬 수 있다. 식물세포의 형질전환을 위한 T-DNA-함유 벡터의 사용은 집중적으로 연구되었고 유럽 특허출원 120516; 문헌 [An et al., (1985, EMBO J. 4:277-284)]; [Fraley et al., (1986, Crit. Rev. Plant Sci. 4:1-46)] 및 [Lee and Gelvin (2008, Plant Physiol. 146:325-332)에 충분히 기재되었으며, 당기술분야에 잘 확립되어 있다.

애그로박테리움 종에 의한 식물세포의 형질전환에서 중요한 제1 단계는 형질전환시키고자 하는 숙주식물의 세포에 박테리아 세포의 밀착, 결합 또는 부착이다. 세포-세포 결합 후, 애그로박테리움으로부터 식물세포에로의 T-DNA 전달에 관한 생물학은 알려져 있다. 예를 들어 문헌 [Gelvin, 2003, Microbiol. Molec. Biol. Rev. 67:16-37]; 및 [Gelvin, 2009, Plant Physiol. 150:1665-1676] 참조. 최소한으로, Ti 또는 Ri 플라스미드의 적어도 T-DNA 우측 경계 반복물, 그러나 종종 우측 경계 반복물과 좌측 경계 반복물 양쪽 모두가 식물세포중으로 삽입시키고자 소망하는 유전자의 플랭킹 영역으로서 연결될 것이다. 좌우 T-DNA 경계 반복물은 T-DNA 전달에 요구되는 중요한 시스-작용 서열이다. 다양한 트랜스-작용 성분이 총 애그로박테리움 게놈내에서 코딩된다. 이들 가운데서도 일차적인 것들은 Ti 또는 Ri 플라스미드상에서 일련의 오페론으로서 정상적으로 발견되는 vir 유전자에 의하여 코딩된 단백질이다. 다양한 Ti 및 Ri 플라스미드는 vir 유전자의 상보체에 있어서 다소 상이하며, 예를 들어 virF는 항상 존재하는 것은 아니다. vir 유전자에 의하여 코딩된 단백질은 몇가지 예를 들자면 식물세포/박테리아 상호작용의 인식 및 신호전달, vir 유전자 전사의 유도, 타입 IV 분비 채널의 형성, T-DNA 경계 반복물의 인식, T-가닥의 형성, 식물세포에로의 T-가닥 전달, 식물세포 핵중으로 T-가닥의 임포트, 및 식물 핵 염색체중으로의 T-가닥 통합을 포함하여 다수의 상이한 기능을 수행한다. 예를 들어 문헌 [Tzfira and Citovsky, 2006, Curr. Opin. Biotechnol. 17:147-154] 참조.

애그로박테리움 균주가 형질전환용으로 사용되면, 식물세포중으로 삽입시킬 DNA는 특수 플라스미드, 예를 들어 중간체 (셔틀) 벡터중으로 또는 바이너리 벡터중으로 클로닝시킬 수 있다. 중간체 벡터는 애그로박테리움 세포에서는 독립적인 복제를 행할 수 없지만, 통상의 에쉐리키아 콜라이 분자 클로닝 균주에서는 조작 및 복제될 수 있다. 그러한 중간체 벡터는 좌우 T-DNA 경계 반복물 영역에 의하여 프레임을 이루고 있으며, 형질전환된 식물세포의 선택을 위해 기능적인 선택마커 유전자, 클로닝 링커, 클로닝 폴리링커, 또는 식물세포 형질전환 예정된 유전자에 대한 도입 부위로서 기능할 수 있는 다른 서열을 포함할 수 있는 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 식물에게로 전달시키고자 소망하는 유전자의 클로닝 및 조작은 따라서 셔틀 벡터를 클로닝 벡터로 사용하여 이. 콜라이에서 표준 방법론에 의하여 손쉽게 수행될 수 있다. 최종적으로 조작된 셔틀 벡터는 후속하여 추가 작업을 위해 애그로박테리움 식물 형질전환 균주중으로 도입될 수 있다. 중간체 벡터는 헬퍼 플라스미드에 의하여 (박테리아 접합을 통해), 전기천공에 의하여, 화학적으로 매개되는 직접 DNA 형질전환에 의하여, 또는 다른 공지 방법론에 의하여 애그로박테리움중으로 전달될 수 있다. 셔틀 벡터는 Ti 또는 Ri 플라스미드 또는 그들의 유도체와 중간체 플라스미드간에 상동인 서열로 인하여 상동 재조합에 의하여 Ti 또는 Ri 플라스미드 또는 그들의 유도체중으로 통합시킬 수 있다. 그에 따라 이러한 상동 재조합 (즉, 플라스미드 통합) 사건은 개변된 셔틀 벡터를 애그로박테리움에서 안정하게 유지시키는 수단을 제공하며, 복제 기원 및 그밖의 플라스미드 유지 기능은 공-필요불가결한(co-integrant) 플라스미드의 Ti 또는 Ri 플라스미드 부분에 의하여 제공된다. Ti 또는 Ri 플라스미드는 또한 T-DNA의 전달에 필요한 vir 유전자를 포함하는 vir 영역을 포함한다. vir 영역을 운반하는 플라스미드는 좌우 T-DNA 경계 반복물을 포함한 T-DNA 영역을 결실시킨 돌연변이된 Ti 또는 Ri 플라스미드 (헬퍼 플라스미드)인 것이 일반적이다. 기능성 vir 유전자를 보유하고 T-영역 및 회합된 요소의 전부 또는 실질적으로 전부가 결여된 그러한 pTi-유래 플라스미드는 본원에서 헬퍼 플라스미드로서 기재적으로 언급된다.

수퍼바이너리(superbinary) 시스템은 셔틀 벡터/상동 재조합 시스템의 특수화된 예이다 (문헌 [Komari et al., 2006, In: Methods in Molecular Biology (K. Wang, ed.) No. 343: Agrobacterium Protocols, pp.15-41]; 및 [Komori et al., 2007, Plant Physiol. 145:1155-1160]에 의하여 검토). 균주 LBA4404(pSB1)는 두 독립적으로 복제하는 플라스미드 pAL4404와 pSB1을 담지한다. pAL4404는 vir 유전자의 무손상 세트 (Ti 플라스미드 pTiACH5로부터)를 함유하지만 T-DNA 영역을 보유하지 않으며 (따라서 T-DNA 좌우 경계 반복 서열을 보유하지 않는) Ti-플라스미드-유래 헬퍼 플라스미드이다. 플라스미드 pSB1은 pTiBo542에서 유래한 vir 유전자의 부가적인 부분적 세트를 공급하고; 이러한 부분적 vir 유전자 세트는 virB 오페론과 virC 오페론, 및 유전자 virG와 virD1을 포함한다. 수퍼바이너리 시스템에 사용되는 셔틀 벡터의 일례는 좌우 T-DNA 경계 반복물 영역에 의하여 플랭킹된, 식물세포 형질전환 예정된 유전자에 대한 도입 부위로서 작용하는 클로닝 폴리링커를 함유하는 pSB11이다. 셔틀 벡터 pSB11은 애그로박테리움에서 독립적인 복제를 행할 수는 없지만, pSB1 및 pSB11상에 존재하는 공통 서열간의 상동 재조합에 의하여 pSB1중으로 통합되면 공-필요불가결한 플라스미드로서 안정하게 유지된다. 따라서, 변형된 pSB11 벡터상 LBA4404(pSB1)중으로 도입된 완전 변형 T-DNA 영역은 두 상이한 애그로박테리움 Ti 플라스미드 공급원 (pTiACH5 및 pTiBo542)에서 유래한 Vir 단백질에 의하여 식물세포상에 생산적으로 작용하여 그 안으로 전달된다. 수퍼바이너리 시스템과 채용되는 애그로박테리움 투메파시엔스 숙주 균주는 LBA4404(pSB1)이다. 수퍼바이너리 시스템은 단자엽식물 종의 형질전환에 특히 유용한 것으로 입증되었다. 문헌 [Hiei et al., (1994) Plant J. 6:271-282]; 및 [Ishida et al., (1996) Nat. Biotechnol. 14:745-750] 참조.

애그로박테리움 Ti 플라스미드에 의하여 담지된 vir 유전자 외에도, 그밖의 염색체상에 있는(chromosomally-borne) 독성 제어 유전자 (chv 유전자로 호칭)가 애그로박테리움 세포와 식물세포의 상호작용의 특정 측면을 제어하고, 따라서 전체 식물 형질전환 빈도에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다 (문헌 [Pan et al., 1995, Molec. Microbiol. 17:259-269). 독성 및 부착에 요구되는 염색체상에 있는 유전자중 몇몇은 29 킬로염기를 스패닝하는 염색체 좌위에 함께 군을 이루고 있다 (Matthysse et al., 2000, Biochim. Biophys. Acta 1490:208-212).

식물을 형질전환하는 다수의 기술 외에도, 외래 유전자와 접촉되는 조직의 타입 역시 다양할 수 있다. 그러한 조직은 배발생 조직, 캘러스 조직 타입 I 및 II, 배축(hypocotyl) 및 분열조직을 포함할 수 있으며 그들에 한정되지 않는다. 거의 모든 식물 조직은 당업자 역량내 적당한 기술을 이용하여 탈분화 동안에 형질전환시킬 수 있다. 식물 형질전환분야 당업자라면 다수의 방법론이 형질전환된 식물의 생산에 이용가능하다는 점과, 그들이 다양한 숙주식물 종간의 생물학적 차이에 순응하도록 변형 및 특수화될 수 있다는 점을 이해할 것이다. 식물 외식편(explant) (예를 들어, 잎 조각, 줄기 단편, 분열조직, 뿌리, 그리고 또한 원형질체 또는 현탁-배양 세포)은 유리하게는 식물세포중으로의 DNA 전달을 위하여 애그로박테리움 투메파시엔스 또는 애그로박테리움 리조진스와 배양시킬 수 있다.

캘러스 배양 식물 조직 배양물은 유리하게는 식물세포중으로의 DNA 전달을 위하여 애그로박테리움 투메파시엔스 또는 애그로박테리움 리조진스와 배양시킬 수 있으며, 일반적으로는 잎 또는 뿌리와 같은 기관의 조각으로 이루어질 수 있는 전체식물의 불임 조각(sterile piece)으로부터 개시되거나, 또는 꽃가루나 내배유와 같은 특정 세포 타입일 수 있다. 외식편의 다수 특질이 배양 개시의 효율에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 정확한 조건이 마련된다면 어떠한 식물 조직도 외식편으로서 사용될 수 있다고 생각된다. 일반적으로, 보다 어리고 보다 신속하게 성장하는 조직 (또는 발달 초기 단계의 조직)이 가장 효과적이다. 적당한 배지상에서 배양된 외식편은 세포의 미조직화된 성장 분열하는 매스 (캘러스)를 산출할 수 있다. 배양에 있어서, 주기적으로 미사용 배지상에 계대배양한다면 캘러스는 어느정도 무기한으로 유지시킬 수 있다. 캘러스 형성 동안, 형태 (캘러스는 보통 비-특수화 연조직(parenchyma) 세포로 구성되어 있다)와 대사 양쪽 모두에 있어서 어느 정도의 탈분화가 존재한다.

캘러스 배양은 식물 생물공학에서 지극히 중요하다. 배양배지중 식물 호르몬 비율의 조작은 추후 전체식물이 생산될 수 있는 새순, 뿌리 또는 체세포 배(somatic embryo)의 발달로 인도할 수 있다 (재생). 캘러스 배양은 다양한 방식으로 식물 형질전환 연구에 사용되는 세포 현탁의 개시에 또한 이용될 수 있다.

세포 현탁 배양 캘러스 배양은 대체로 말하면 두 카테고리중 하나에 들어간다: 치밀성(compact) 또는 파쇄성(friable). 치밀성 캘러스의 경우에 세포는 조밀하게 응집되고, 반면에 파쇄성 캘러스의 경우에 세포는 단지 서로와 느슨하게 회합되어 있어 캘러스는 부드러워지고 손쉽게 부서진다. 파쇄성 캘러스는 세포-현탁 배양물을 형성할 접종물을 제공한다. 일부 식물 종 또는 특정 세포 타입으로부터의 외식편은 파쇄성 캘러스를 형성하지 않는 경향이 있어, 세포 현탁 개시를 어렵게 한다. 캘러스의 취약성은 종종 배지 성분의 조작에 의하여, 반복 계대배양에 의하여, 또는 반-고체 배지 (저농도의 겔화제 함유 배지)상에서의 배양에 의하여 개선될 수 있다. 파쇄성 캘러스를 액체 배지에 넣고 이어서 교반하면, 단일 세포 및/또는 세포의 작은 덩어리가 배지중으로 방출된다. 정확한 조건하에서, 이들 방출된 세포는 계속 성장하고 분열하여 결국에는 세포-현탁 배양물을 생성한다. 세포 현탁액은 삼각플라스크에서 배치 배양물로서 비교적 간단하게 유지시킬 수 있으며 미사용 배지중으로 반복 계대배양함으로써 증식된다. 계대배양 후, 세포는 분열하고 배양물의 바이오매스는 특징적인 방식으로 증가한다. 세포 현탁 배양물은 유리하게는 식물세포중으로의 DNA 전달을 위하여 애그로박테리움 투메파시엔스 또는 애그로박테리움 리조진스와 배양시킬 수 있다.

경정(shoot tip) 및 분열조직 배양 (경정분열조직을 함유하는) 새순의 선단부를 시험관내에서 배양시킬 수 있고 그에 따라 액아(axillary bud) 또는 부정아(adventitious bud) 어느 한쪽으로부터 새순의 덩어리가 생성되며, 유리하게는 식물세포중으로의 DNA 전달을 위하여 애그로박테리움 투메파시엔스 또는 애그로박테리움 리조진스와 배양시킬 수 있다. 새순 분열조직 배양은 곡물 재생용으로 사용된다 (묘목은 도너 물질로서 사용될 수 있다).

배 배양(embryo culture) 배는 캘러스 배양물 또는 체세포 배를 생성하기 위한 외식편으로서 사용될 수 있다. 미성숙 및 성숙 배 양쪽 모두 외식편으로서 사용될 수 있다. 미성숙 배-유래 배발생 캘러스는 단자엽식물 재생에 사용되는 조직이며 유리하게는 식물세포중으로의 DNA 전달을 위하여 애그로박테리움 투메파시엔스와 배양시킬 수 있다. 미성숙 배는 세포 분열을 하여 전체식물의 조직 및 기관을 생성하도록 분화할 수 있는 캘러스 세포를 산출할 수 있는 무손상 조직이다. 미성숙 배는 성숙 옥수수 식물의 수정된 이삭으로부터, 예를 들어 문헌 [Neuffer et al. (1982, Growing maize for genetic purposes. In: Maize for Biological Research. W. F. Sheridan, Ed. University Press, University of North Dakota, Grand Forks, ND).]의 방법을 이용하여 수분된 식물로부터 수득될 수 있다. 옥수수로부터 미성숙 배를 분리하는 예시적인 방법은 문헌 [Green and Phillips (Crop Sci. 15:417-421 (1976)]에 의하여 기재되어 있다. 미성숙 배는 바람직하게는 발달중인 이삭으로부터 무균 방법을 이용하여 분리되고 사용시까지 멸균 배지에서 유지된다. 미성숙 배의 형질전환에 애그로박테리움의 사용은 문헌 [Sidorov & Duncan, (2009, Methods in Molecular Biology: Transgenic Maize, vol.526 Chapter 4, M. Paul Scott (Ed.))]에 의하여 및 미국 특허 5,981,840에 개시되어 있다.

소포자 배양 반수체 조직은 꽃가루 또는 꽃밥을 외식편으로 사용함으로써 시험관내에서 배양시킬 수 있으며 유리하게는 식물세포중으로의 DNA 전달을 위하여 애그로박테리움 투메파시엔스와 배양시킬 수 있다. 캘러스와 배 양쪽 모두 꽃가루로부터 생산될 수 있다. 반수체 조직으로부터 시험관내에서 배양물을 생산하기 위해서는 두 접근법이 취해질 수 있다. 첫번째의 경우에, 꽃밥 (꽃가루를 둘러싸고 함유하는 체세포 조직)을 고체 배지상에서 배양한다. 그 후 성숙 꽃밥의 열개를 통해 꽃가루-유래 배가 생산된다. 꽃밥의 열개는 정확한 단계에서의 그의 분리와 정확한 배양 조건에 좌우된다. 일부 종에서, 자연 열개에의 의존은 꽃밥의 벽을 절단함으로써 우회될 수 있다. 두번째 방법의 경우에, 꽃밥을 액체 배지에서 배양하고, 꽃밥으로부터 방출된 꽃가루는 배를 형성하도록 유도시킬 수 있다. 미성숙 꽃가루는 또한 발달중인 꽃밥으로부터 추출되어 직접 배양될 수 있다.

다수의 곡물 (벼, 밀, 보리 및 옥수수)은 꽃가루 또는 꽃밥 배양을 위해 식물 성장 조절제로 보충된 배지를 요구한다. 소포자 외식편으로부터의 재생은 직접 배아발생에 의하여, 또는 캘러스 단계와 후속 배아발생을 통해 수득될 수 있다.

반수체 조직 배양은 또한 암컷 배우체 (배주)로부터 개시될 수 있다. 일부 경우에서, 이는 꽃가루 또는 꽃밥을 사용하는 것보다 효율적인 방법이다.

반수체 배양으로부터 수득된 식물은 반수체가 아닐 수 있다. 이는 배양 기간중 염색체 배가의 결과일 수 있다. 다수 경우에서 반수체 식물은 반수체 조직으로부터의 재생의 목적하는 결과가 아님에 따라, (화학약품, 예컨대 콜히친으로의 처리에 의하여 유도될 수 있는) 염색체 배가는 이점이 될 수 있다. 그러한 식물은 종종 디-반수체(di-haploid)로 언급되는데, 이유는 그들이 동일한 반수체 게놈의 두 카피를 함유하기 때문이다.

식물세포중으로의 DNA 전달을 위해 애그로박테리움 투메파시엔스와의 배양에 의한 전술한 식물 물질 중 어느 것의 형질전환을 행한 뒤에는, 이어서 형질전환된 식물세포의 선택을 위한 항생제 또는 제초제를 함유할 수 있는 적합한 성장 조건 및 배양배지에 투입한 뒤 감염된 식물 물질로부터 전체식물이 재생될 수 있다. 그렇게 수득된 식물은 이어서 삽입된 DNA의 존재에 대하여 시험될 수 있다.

세포 형질전환 (식물세포 형질전환 포함)은 특정 세포에서 기능하게 될 발현벡터의 구축을 수반할 수 있다. 그러한 벡터는 조절 요소 (예를 들어, 프로모터)의 제어하에 있는, 또는 거기에 작동가능하게 연결된 유전자를 포함하고 있는 DNA를 포함할 수 있다. 발현벡터는 1종 이상의 그러한 작동가능하게 연결된 유전자/조절 요소 조합을 함유할 수 있다. 벡터(들)은 플라스미드 형태일 수 있으며 트랜스진(들)을 식물세포의 유전물질중으로 혼입하기 위한 본원 기재의 형질전환 방법을 이용하여 형질전환된 세포를 제공하기 위하여 단독으로 또는 다른 플라스미드와 조합하여 사용될 수 있다.

식물세포 발현벡터는 마커를 함유하는 형질전환된 세포가 음성 선택 (즉, 선택마커 유전자를 함유하지 않는 세포의 성장 억제)에 의하여 또는 양성 선택 (즉, 유전자마커에 의해 코딩된 생성물에 대한 스크리닝)에 의하여 회수되도록 해주는 조절 요소 (예를 들어, 프로모터)에 작동가능하게 연결된 적어도 1종의 유전자마커를 포함할 수 있다. 식물 형질전환에 적합한 다수의 선택마커 유전자가 형질전환 분야에 주지이며, 예를 들어 항생제 또는 제초제일 수 있는 선택적 화학제를 대사적으로 무독화하는 효소를 코딩하는 유전자, 또는 억제제에 둔감할 수 있는 개변된 표적을 코딩하는 유전자를 포함한다. 몇몇 양성 선택 방법이 또한 당기술분야에 알려져 있다. 개별적으로 채용되는 선택마커 유전자는 따라서 형질전환된 세포의 선택을 가능케할 수 있고 반면에 삽입된 DNA를 함유하지 않는 세포의 성장은 선택적 화합물에 의하여 억제될 수 있다. 특정 선택마커 유전자에 대한 선호는 당업자의 재량이지만, 하기 선택마커 중 어느 것, 및 선택마커로서 기능할 수 있는 본원에 수록되지 않은 여타 유전자가 사용될 수 있다. 선택마커의 예는 카나마이신, G418, 히그로마이신, 블레오마이신, 메토트렉세이트, 포스피노트리틴 (비알라포스), 글리포세이트, 이미다졸리논, 술포닐우레아 및 트리아졸로피리미딘 제초제, 예컨대 클로로술푸론, 브로목시닐 및 달라폰(DALAPON)에 대한 저항성 또는 내성을 포함하며 그에 한정되지 않는다.

선택마커 외에도, 리포터 유전자를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 경우에서, 리포터 유전자는 선택마커 없이 사용될 수 있다. 리포터 유전자는 전형적으로 수용자 유기체 또는 조직에 성장 이점을 제공하지 않는 유전자이다. 리포터 유전자는 전형적으로 일부 표현형 변화 또는 효소 특성을 제공하는 단백질을 코딩한다. 적합한 리포터 유전자는 베타-글루쿠로니다제 (GUS), 개똥벌레 루시페라제, 또는 형광 단백질, 예컨대 녹색형광 단백질 (GFP) 또는 황색형광 단백질 (YFP, 본질적으로 미국 특허 7,951,923에 개시된 바와 같은)을 코딩하는 것들을 포함하며 그들에 한정되지 않는다.

활용되는 형질전환 기술에 관계 없이, 외래 유전자는 벡터에 식물 프로모터를 포함시킴으로써 식물세포에서 외래 유전자를 발현하도록 순응된 유전자 전달 벡터중으로 혼입될 수 있다. 식물 프로모터 외에도, 다양한 공급원으로부터의 프로모터가 외래 유전자를 발현시키기 위하여 식물세포에 효율적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 박테리아 기원의 프로모터, 예컨대 옥토핀 신타제 프로모터, 노팔린 신타제 프로모터, 만노핀 신타제 프로모터; 바이러스 기원의 프로모터, 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV)의 35S 및 19S 프로모터, 사탕수수 간상(bacilliform) 바이러스로부터의 프로모터 등이 사용될 수 있다. 식물-유래 프로모터는 리불로스-1,6-비스포스페이트 (RUBP) 카르복실라제 스몰 서브유닛 (ssu), 베타-콩클리시닌 프로모터, 페이즈올린 프로모터, ADH (알콜 데히드로게나제) 프로모터, 열 쇼크 프로모터, ADF (액틴 해중합 인자) 프로모터 및 조직-특이적 프로모터를 포함하며 그들에 한정되지 않는다. 프로모터는 또한 전사 효율을 개선할 수 있는 특정 인핸서 서열 요소를 함유할 수 있다. 전형적인 인핸서는 알콜 데히드로게나제 1 (ADH1) 인트론 1 및 ADH1-인트론 6을 포함하며 그들에 한정되지 않는다. 구성적 프로모터가 사용될 수 있다. 구성적 프로모터는 거의 모든 세포 타입에서 및 거의 항상 연속적인 유전자 발현을 지시한다 (예를 들어, 액틴, 유비퀴틴, CaMV 35S). 조직-특이적 프로모터는 특정 세포 또는 조직 타입, 예컨대 잎 또는 종자에서 유전자 발현을 담당한다. 사용될 수 있는 다른 프로모터의 예는 특정 식물 조직과 기관에서 활성일 뿐 아니라 식물의 발달 특정 단계 동안 활성인 것들을 포함한다. 그러한 프로모터의 예는 뿌리-특이적, 꽃가루-특이적, 배-특이적, 옥수수 수염-특이적, 목화 섬유-특이적, 종자 내배유-특이적 및 체관부-특이적인 프로모터를 포함하며 그들에 한정되지 않는다.

특정 상황하에서는, 유도성 프로모터를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 유도성 프로모터는 특정 신호, 예컨대: 물리적 자극 (예를 들어, 열 쇼크 유전자); 광 (예를 들어, 리불로스-비스-포스페이트 1,5 카르복실라제); 호르몬 (예를 들어, 글루코코르티코이드); 항생제 (예를 들어, 테트라사이클린); 대사산물; 및 스트레스 (예를 들어, 가뭄)에 반응하여 유전자의 발현을 담당한다. 식물에서 기능하는 다른 바람직한 전사 및 번역 요소, 예컨대 예를 들어 5' 비-번역 리더 서열 및 3' RNA 전사 종결 및 폴리아데닐레이트 부가 신호 서열이 또한 사용될 수 있다. 당기술분야에 알려져 있는 임의의 적합한 식물-특이적 유전자 전달 벡터가 사용될 수 있다.

곤충 저항성 (IR) 형질을 함유하는 트랜스제닉 작물은 북미 전역 옥수수 및 목화 식물에 널리 보급되어 있으며, 이들 형질의 사용은 전세계적으로 확장일로에 있다. IR 및 제초제 내성 (HT) 형질을 겸비하는 시판 트랜스제닉 작물이 다수 종자회사에 의하여 개발되어 왔다. 이러한 것들로는 바실루스 투린지엔시스 (B.t.) 살충 단백질에 의하여 부여된 IR 형질과 HT 형질, 예컨대 아세토락테이트 신타제 (ALS) 억제제, 예컨대 술포닐우레아, 이미다졸리논, 트리아졸로피리미딘, 술폰아닐리드 등, 글루타민 합성효소 (GS) 억제제, 예컨대 비알라포스, 글루포시네이트 등, 4-히드록시페닐피루베이트 디옥시게나제 (HPPD) 억제제, 예컨대 메소트리온, 이속사플루톨 등, 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS) 억제제, 예컨대 글리포세이트 등, 및 아세틸-코엔자임 A 카르복실라제 (ACCase) 억제제, 예컨대 할록시폽, 퀴잘로폽, 디클로폽 등에 대한 내성의 조합을 포함한다. 트랜스제닉적으로 제공된 단백질이 식물에게 제초제 화학적 부류, 예컨대 페녹시산 제초제와 피리딜옥시아세테이트 옥신 제초제 (WO 2007/053482 A2 참조), 또는 페녹시산 제초제와 아릴옥시페녹시프로피오네이트 제초제 (WO 2005/107437A1 참조)에 대한 내성을 제공하는 다른 예가 알려져 있다. IR 형질을 통해 복합적 해충 문제를 제어하는 능력은 귀중한 상업적 제품 개념이며, 곤충방제 형질과 잡초방제 형질이 동일 식물에 겸비된다면 이러한 제품 개념의 편익이 증진된다. 또한, B.t. 살충 단백질에 의하여 부여된 IR 형질과 1종 이상의 부가적인 HT 형질, 예컨대 전술한 것들, 그에 더하여 1종 이상의 부가적인 입력 형질 (예를 들어, B.t.-유래 또는 다른 살충 단백질에 의하여 부여된 다른 곤충 저항성, RNAi 등과 같은 메카니즘에 의하여 부여된 곤충 저항성, 내병성, 스트레스 내성, 향상된 질소 이용 등), 또는 출력 형질 (예를 들어, 높은 유분, 건강상 좋은 오일 조성, 영양 개선 등)의 단일 식물 조합을 통해 향상된 가치가 달성될 수 있다. 그러한 조합은 통상적인 육종 (예를 들어, 육종 스택)을 통해서 또는 다수 유전자의 동시 도입 (예를 들어, 분자 스택)을 수반하는 신규 형질전환 사건으로서 연대적으로 수득될 수 있다. 이익으로는 생산자 및/또는 소비자에게 이차 이익을 제공하는 작물 식물에서의 해충 관리능과 개선된 잡초방제를 포함한다. 따라서, 본원 개시의 방법은 향상된 작물 품질의 완전한 농학적 패키지를 포함하는 형질과 여러 가지 농학적 현안을 유연하게 그리고 비용 효과적으로 관리하는 능력을 겸비한 형질전환된 식물의 제공에 이용될 수 있다.

식물세포 형질전환 방법이 기재된다. 이들 방법은 계면활성제를 함유하는 액체 배지중 애그로박테리움 세포에 식물세포를 노출시키는 단계를 포함한다. 애그로박테리움 세포는 계면활성제를 함유하는 액체 배지에 현탁시키기에 앞서 고체 배지에서 긁어낼 수 있거나 또는 액체 성장배지에서 성장시킬 수 있다. 계면활성제의 농도는 0.001 중량% 내지 0.08 중량% 범위일 수 있다. 계면활성제는 비-이온성 트리실록산 계면활성제일 수 있고 1종보다 많은 계면활성제가 사용될 수 있다. 식물세포는 옥수수 세포일 수 있다. 식물세포는 애그로박테리움 세포에의 노출 후 연속광에 노출시킬 수 있다.

도 1은 공-배양에 앞서 애그로박테리움 세포 (플라스미드 pEPS1083을 담지하는)의 현탁액을 생성하기 위하여 사용된 감염배지에 계면활성제 브레이크-쓰루(BREAK-THRU)^® S 233 첨가시 옥수수 미성숙 배 형질전환의 증진을 도시하는 막대 그래프이다.
도 2는 공-배양에 앞서 애그로박테리움 세포의 현탁액을 생성하기 위하여 사용된 감염배지에 계면활성제 브레이크-쓰루^® S 233 첨가시 옥수수 미성숙 배 형질전환의 증진을 도시하는 막대 그래프이다. 도 2에 도시된 각 실험에 사용된 플라스미드는 다음을 포함한다: 실험 1 = pEPS1053; GOI = IPT, 선택마커 = aad1. 실험 2 = pEPS1038; GOI=GF14, 선택마커 = aad1. 실험 3 및 실험 4 = pEPS1027; GOI 없음, 선택마커 = aad1.

애그로박테리움 사용시 식물에서 형질전환 빈도를 증가시키는 방법이 기재된다. 방법은 계면활성제를 함유하는 액체 배지중 애그로박테리움 세포에 식물세포를 노출시키는 단계를 포함한다. 일부 방법은 식물세포를 애그로박테리움 세포에의 노출 후에 연속광에 노출시키는 단계를 포함한다. 이들 방법으로 유용한 식물의 예는 옥수수 식물 및 미성숙 옥수수 배를 포함한다.

애그로박테리움의 균주는 다양한 종의 식물세포를 형질전환시키는 그들의 능력에 있어 서로 다르다. 고려되는 애그로박테리움 균주/숙주식물의 특정 조합에 관계 없이, 애그로박테리움은 형질전환 동안 숙주세포에의 부착을 통해 작용한다. 문헌 [McCullen and Binns, 2006, Ann. Rev. Cell. Dev. Biol. 22:101-127]; 및 [Citovsky et al., 2007, Cell. Microbiol. 9:9-20.] 참조. 이러한 이유로 해서, 식물세포에의 애그로박테리움 세포 결합을 증진시키는 방법, 예컨대 계면활성제를 사용하는 본원 개시의 것들은 형질전환 효율의 증가를 가져올 수 있다. 상이한 식물 종 및 더 나아가서 단일 종의 식물의 상이한 조직은 그들의 세포벽의 화학적 및 생화학적 조성에 있어서 상이할 수 있으므로, 식물세포에의 애그로박테리움 세포 결합을 증진시키는 것은 상이한 종 및 조직 타입에 대하여 상이하다. 더욱이, 그러한 차이는 또한 단일 식물 조직의 상이한 발달 단계 동안 다양할 수 있다.

박테리아의 부가적으로 상이한 속과 종, 그리고 그뿐 아니라 박테리아 종의 상이한 균주는 종종 그들의 세포벽의 화학적 및 생화학적 조성에 있어서 상이하고, 이들 차이는 박테리아 성장주기 동안 변할 수 있다. 따라서 본원 개시의 방법에 의한 식물 형질전환 효율의 증가는 애그로박테리움 세포벽과 식물 세포벽간의 소수성 반발 상호작용을 감소시키고, 따라서 긴밀한 세포-세포 상호작용이 일어나게 해주는 계면활성제의 능력에서 기인할 수 있다.

그러므로 증진된 형질전환 효율이 관찰될 수 있도록 식물 조직의 배양의 다양한 단계 동안 상이한 애그로박테리움 균주의 세포 (및 그러한 세포의 상이한 성장기)와 상이한 숙주식물의 세포 및 조직간의 세포-세포 상호작용을 촉진하기 위하여 상이한 계면활성제간의 화학적 차이를 이용할 수 있다.

계면활성제는 몇몇 화학적 부류에 속하며, 식물 형질전환 분야의 당업자라면 계면활성제의 상이한 화학적 부류가 상이한 식물 숙주로의 식물 형질전환 효율을 증진시키는 데에 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 본원 개시의 방법으로 유용한 이들 화학적 부류로부터의 계면활성제의 예는 아주반트, 비-이온성 계면활성제, 음이온 계면활성제, 유성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제 및 중합체 계면활성제를 포함한다. 본원 기재의 방법으로 유용한 바람직한 계면활성제의 예는 비-이온성 트리실록산 계면활성제, 예컨대 브레이크-쓰루^® S233 (에보닉 인더스트리즈(Evonik Industries), 독일 에센)이다. 본원 기재의 방법으로 유용한 추가 바람직한 계면활성제의 예는 트리실록산 알콕실레이트, 에톡실화 대두유, 알콜 에톡실레이트 C-13, C₁₂-C₁₄-알킬디메틸 베타인, 및 디-sec-부틸페놀 에틸렌 옥시드-프로필렌 옥시드 블록 공중합체를 포함한다. 표 1에 본원 기재의 방법 실시에 사용될 수 있는 다양한 화학적 타입의 계면활성제의 비-제한 목록을 제시하였다.

본원 개시의 방법은 애그로박테리움 (예를 들어, 애그로박테리움 투메파시엔스)에 의하여 식물, 예컨대 미성숙 옥수수 배에서의 형질전환 효율을 극적으로 증가시키기 위하여 계면활성제의 형질전환-증진 특성을 이용한다. 본원 기재의 방법과 사용되는 계면활성제는 앞서 제시한 바와 같이 형질전환 효율을 증진시킬 세포-세포 상호작용을 촉진하는 능력에 기초하여 선택된다. 액체 배지중 계면활성제의 농도는 0.001 중량% 내지 0.08 중량%, 0.001 중량% 내지 0.07 중량%, 0.001 중량% 내지 0.06 중량%, 0.001 중량% 내지 0.05 중량%, 0.001 중량% 내지 0.04 중량%, 0.001 중량% 내지 0.035 중량%, 0.001 중량% 내지 0.03 중량%, 0.001 중량% 내지 0.025 중량%, 0.001 중량% 내지 0.02 중량%, 0.001 중량% 내지 0.015 중량%, 0.001 중량% 내지 0.01 중량%, 또는 0.005 중량% 내지 0.01 중량%일 수 있다.

1종 이상의 부가적인 계면활성제가 또한 본원 기재의 방법과 사용될 수 있다. 전술한 바와 같이, 형질전환 효율은 식물 종과 조직 타입 및 애그로박테리움 균주를 포함하여 다양한 요인에 좌우된다. 다양한 상호작용이 수반되었다고 가정하면, 2종 이상 계면활성제의 시스템은 증진된 형질전환 효율을 제공할 수 있다. 2종 이상 계면활성제의 시스템에 사용되는 부가적인 계면활성제는 예를 들어 표 1에서 선택될 수 있다.

본원 기재의 방법은 단자엽식물 및 쌍자엽식물을 포함하여 다양한 식물 종 및 품종에 광범위하게 적용가능하다. 관심 작물은 옥수수, 벼, 대두, 캐놀라, 해바라기, 자주개자리, 수수속의 식물, 밀, 목화, 땅콩, 토마토, 감자 등을 포함하며 그들에 한정되지 않는다. 본원에서의 방법은 다양한 발달 단계에서의 세포, 예를 들어 미성숙 배와 사용될 수 있다. 따라서, 본원 기재의 방법은 옥수수 미성숙 배의 형질전환에 이용될 수 있다. 본원 기재의 방법에 사용되는 미성숙 배의 크기는 다양할 수 있다. 예를 들어, 미성숙 배는 1.5 mm 이상 및 2.5 mm 이하의 길이일 수 있다.

세포가 본원 기재의 방법에 따라 애그로박테리움에의 노출 후에 유지되는 외부 환경은 통제될 수 있다. 예를 들어, 본원 기재의 방법에 따른 형질전환 후 세포가 배치되는 성장배지의 온도, pH 및 기타 구성요소는 변동될 수 있고 일반적으로 당업자에게 주지이다. 그들 변수 중 하나는 노광이다. 본원 기재의 방법은 식물세포를 애그로박테리움 세포에의 노출 후 통상적인 18시간 명/6시간 암 프로토콜에 또는 이와 달리 연속광에 노출시키는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원 기재의 방법에 따라 처리한 세포는 처리 후 수주 동안 24시간 백색 형광등 조건에, 예를 들어 식물 제제의 재생 및 모종 분리 단계때까지 노출시킬 수 있다.

부가적인 방법은 계면활성제를 함유하는 액체 배지를 제조하는 단계, 애그로박테리움 세포를 액체 배지에 현탁시키는 단계, 및 계면활성제를 함유하는 액체 배지중 애그로박테리움 세포에 식물세포를 노출시키는 단계를 포함한다. 애그로박테리움 세포는 계면활성제를 함유하는 액체 배지에 현탁시키기에 앞서 고체 배지로부터 긁어낼 수 있다. 부가적으로, 애그로박테리움 세포는 계면활성제를 함유하는 액체 배지에 현탁시키기에 앞서 액체 성장배지에서 성장시킬 수 있다.

애그로박테리움을 사용하여 식물을 형질전환하는 프로토콜 및 방법은 분자생물학 분야의 당업자에게 주지이다. 식물의 형질전환에 애그로박테리움의 사용에 대해 알려진 어떠한 타입의 방법도 본원 기재의 방법과 사용될 수 있다. 하기 실시예는 본원 기재 방법의 유효성을 증명해 보여주는 방법의 실시양태를 제공하며, 특허청구범위의 범위에 대한 제한이도록 의도되지 않는다.

본원에 참조되거나 인용된 모든 특허, 특허 출원, 가출원, 및 간행물은 그들이 본 명세서의 명시적 교시와 모순되지 않는 한도까지 그 전문이 참조로 포함된다.

실시예

하기 실시예는 특허청구범위의 실시를 위한 절차를 설명한다. 본원 기재의 실시예 및 실시양태는 오직 설명하기 위한 것이며 그에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제안될 것이며 특허청구범위의 취지와 범위 안에 포함시키고자 한다. 별도로 명시하지 않는 한 모든 %는 중량 기준이며 모든 용매 혼합물 비율은 부피 기준이다. 모든 온도는 섭씨이다.

실시예 1. 수퍼바이너리 벡터의 생성을 위한 애그로박테리움 형질전환

애그로박테리움 수퍼바이너리 시스템은 단자엽식물 식물 숙주의 형질전환에 편리하게 사용되고 있다. 수퍼바이너리 벡터의 구축 및 검증을 위한 방법론은 잘 개시되어 있으며 본원에 참조로 포함된다 (문헌 [Operating Manual for Plasmid pSB1, Version 3.1, Japan Tobacco, Inc.(일본 도쿄)로부터 입수가능]). 표준 분자생물학적 및 미생물학적 방법이 수퍼바이너리 플라스미드의 생성에 사용되었다. 수퍼바이너리 플라스미드의 구조 확인/검증은 문헌 [Operating Manual for Plasmid pSB1]에 제시된 바와 같은 방법론을 이용하여 행하였다.

다양한 수퍼바이너리 플라스미드를 담지하고 있는 애그로박테리움 균주를 당해 작업에 사용하였다. 모든 이들 플라스미드는, 본질적으로 미국 특허 5,641,876 및 진뱅크(GENBANK)^TM 수탁번호 EU155408.1에 개시된 바와 같은, 자신의 발현이 벼 액틴1 프로모터 및 회합된 인트론 1의 전사적 제어하에 있는 AAD1 단백질에 대한 코딩 서열 (CDS) (미국 특허 7,838,733)을 선택마커/제초제 내성 유전자로서 함유하였다. aad1 mRNA의 전사 종결 및 폴리아데닐화는 본질적으로 진뱅크^TM 수탁번호 gb|L35913.1|MZELIPASE의 염기 921 내지 1277로서 및 미국 특허 7,179,902에 개시된 바와 같은 옥수수 리파제 3'UTR에 의하여 측정되었다. 또한, 수퍼바이너리 플라스미드는 자신의 발현이 형질전환 빈도에 영향을 미칠 것으로 예상되지 않았던 유전자를 담지하였다. 특히, 플라스미드 pEPS1083에서, YFP 단백질을 코딩하는 CDS (본질적으로 미국 특허 7,951,923에 개시된 바와 같은) (그의 전사는 회합된 인트론 1과 더불어 옥수수 유비퀴틴 1 프로모터에 의하여 제어되었고 (미국 특허 5,510,474), 그의 mRNA는 옥수수 Per5 3'UTR에 의하여 종결되었다 (미국 특허 6,384,207))가 가시적 마커로 유리하게 사용되어 형질전환을 모니터링하고 상대적 형질전환 효율을 측정하였다. 본원 개시의 방법을 예증하는 데 사용된 다른 수퍼바이너리 플라스미드 (플라스미드 pEPS1013, pEPS1018, pEPS1028, pEPS1036, pEPS1038, pEPS1059, pEPS1064, pEPS1066, pEPS1068, pEPS6004 및 pEPS6008)는, YFP CDS에 대하여 사용되었던 것과 동일한 전사/종결 요소에 의하여 발현이 제어되는, 다우 애그로사이언시즈 특허 단백질을 코딩하는 CDS를 담지하였다.

YFP의 발현을 이용하여 일부 실험에서 형질전환 효율을 측정하였다. 형질전환 효율 %는 YFP의 발현을 나타낸 캘러스의 수를 처리된 배의 수로 나눈 다음, 거기에 100을 곱하여 계산하였다. YFP 발현은 514 nm에서의 여기 및 527 nm에서 측정한 방출에 대한 범위를 커버하는 YFP 필터를 장착한, 올림푸스(Olympus) SZX12 (올림푸스 아메리카 인코포레이티드(Olympus America Inc.), 미국 펜실베이니아주 센터 밸리) 또는 레이카(Leica) M165FC (레이카 마이크로시스템즈 인코포레이티드(Leica Microsystems Inc.), 미국 일리노이주 버팔로 그로브) 형광 현미경을 사용하여 가시적 관찰에 의하여 측정하였다.

YFP 유전자가 결여된 수퍼바이너리 플라스미드를 담지하는 애그로박테리움 균주를 채용한 다른 실험에서, 할록시폽에 대한 저항성에 의하여 선택된 배로부터 생산된 후손 식물의 택맨(TAQMAN)^® 분석 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국 캘리포니아주 칼스배드)에 이어서 형질전환 효율을 계산하였다. 사용된 택맨^® 성분은 aad1 코딩 영역에 대하여 특이적이었다. 형질전환 효율은 측정된 택맨^®-양성 사건의 수를 처리된 배의 수로 나눈 다음, 거기에 100을 곱하여 계산하였다. 이들 목적을 위한 "사건(event)"은 하나 이상의 택맨^®-확인 식물(들)을 생산한 배인 것으로 간주하였다. 개별적인 배는 그것이 얼마나 많은 식물을 생산할 수 있었느냐에 관계 없이 1사건으로 간주하였다.

실시예 2. 애그로박테리움 균주에 의한 옥수수의 형질전환 (형질전환 프로토콜 1)

기본적인 작업 흐름은 다음과 같이 요약된다. 어린 배가 약 1.4 내지 1.9 mm 길이인 발달 단계에 있는 옥수수의 미성숙 이삭으로부터 배를 추출하였다. 상이한 형질전환 조건을 비교하고자 한 경우, 단일 이삭에서 분리한 대략 동수의 배를 모든 처리들간에 분배하였다. 배를 애그로박테리움 세포와 계면활성제를 함유하는 (또는 비교를 위하여 계면활성제를 함유하지 않는) 현탁액과 인큐베이션하고, 이어서 고체 배지 플레이트로 옮긴 다음 3 내지 5일 동안 공-배양시켰다. 처리된 배를 항생제 (애그로박테리움 세포의 억제와 사멸을 위해) 및 형질전환된 옥수수 조직 및 식물의 선택적 분리를 위한 화합물을 함유하는 배지로 옮겼다. 옥수수 조직 (보통은 캘러스, 그러나 그에 한정되지 않음)을 식물이 재생될 때까지 선택배지상에서 성장시켰다. 이들 식물을 시험하여 그들의 형질전환을 확인하였으며 목적하는 변형을 보유하는 것들을 종자 생산을 위하여 성숙상태로 성장시켰다.

미성숙 배 생산 B104 근친교잡체로부터의 종자를 선샤인 커스텀 블렌드 160(SUNSHINE CUSTOM BLEND 160, 선 그로 호티컬춰(SUN GRO HORTICULTURE), 미국 워싱턴주 벨뷰)을 함유하는 4 갤론 포트에 재식하였다. 식물을 고압 나트륨 및 금속 할라이드 램프의 조합을 사용하여 16:8시간 명암(Light:Dark) 광주기로 온실에서 성장시켰다. 형질전환을 위한 미성숙 배를 수득하기 위하여, 통제된 형매수분을 수행하였다. 배가 대략 1.4 내지 1.9 mm 크기였을 때 수분후 10 내지 13일차에 미성숙 배를 분리하였다. 옥수수 이삭을 겉껍질과 옥수수 수염을 제거한 후 50% 시판 표백제 (클로록스(CLOROX)^®, 5.25% 차아염소산나트륨) + 트윈(Tween)^®20 (1 또는 2 방울/500 mL)에 10분 동안 침지시킴으로써 표면 멸균한 다음 멸균수로 3회 세정하였다.

현탁된 애그로박테리움 세포 및 필요에 따라 계면활성제를 함유하는 2 mL의 감염배지가 들어있는 마이크로 원심분리관중으로 직접 미성숙 배를 무균적으로 분리하였다. 배를 계면활성제를 함유하는 (또는 대조군 실험의 경우 계면활성제를 함유하지 않는) 애그로박테리움 세포의 현탁액과 5 내지 30분 동안 인큐베이션하였다.

먼저 세포를 50 mg/L 스펙티노마이신; 10 mg/L 리팜피신; 및 50 mg/L 스트렙토마이신이 첨가된 YEP-함유 고체 한천 플레이트 (gm/L: 효모 추출물, 5; 펩톤, 10; NaCl, 5; 한천, 15)상 25℃에서 4일 동안 또는 28℃에서 3일 동안 론(lawn)으로서 성장시킴으로써 수퍼바이너리 벡터를 함유하는 애그로박테리움 세포의 현탁액을 제조하였다. (일부 실험에서는 애그로박테리움 세포를 상기한 바와 같은 항생제가 첨가된 고체 LB 배지 (시그마-알드리치; 미국 미주리주 세인트 루이스) 20 gm/L상에서 성장시켰다). 당해 배양물을 동일한 조건하에서 확립된 단일 콜로니 분리체로부터 도말하였다. 1 또는 2 백금이량의(loopful) 세포를 론으로부터 긁어내고, 이어서 감염배지 (IfM)에 (부드럽게 상하로 피펫팅함으로써) 0.35 내지 0.45의 600 nm에서의 광학밀도 (OD₆₀₀)가 되게 균일하게 재현탁시켰다. 감염배지는 pH 5.2에서 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형 MS 비타민; 68.4 gm/L 수크로스; 36 gm/L 글루코스; 700 mg/L L-프롤린; 3.3 mg/L 디캄바-KOH; 및 100 μM 아세토시링곤 (DMSO중에 제조)을 함유하였다. 실험에 따라서는, 세포를 현탁시킨 후 감염배지에 적당량의 계면활성제 용액 (예를 들어, 브레이크-쓰루^® S 233, 0.01% 최종 농도)을 첨가하였다.

애그로박테리움 및 배 용액을 5 내지 30분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 이어서 배를 pH 5.8에서 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형 MS 비타민; 30 gm/L 수크로스; 700 mg/L L-프롤린; 100 mg/L 마이오-이노시톨; 3.3 mg/L 디캄바-KOH; 100 mg/L 카제인 효소 가수분해물; 15 mg/L AgNO₃; 100 μM 아세토시링곤; 및 3 gm/L 겔잔(GELZAN)^TM을 함유한 공-배양배지로 옮겼다. 공-배양 인큐베이션은 24시간 백색 형광등 (대략 50 μEm^-2s^-1)하에 25℃에서 3 내지 4일 동안 행하였다.

휴면 및 선택 공-배양 후, 배 (36개 배/플레이트)를 pH 5.8에서 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형 MS 비타민; 30 gm/L 수크로스; 700 mg/L L-프롤린; KOH중 3.3 mg/L 디캄바; 100 mg/L 마이오-이노시톨; 100 mg/L 카제인 효소 가수분해물; 15 mg/L AgNO₃; 0.5 gm/L MES; 250 mg/L 카르베니실린; 및 2.3 gm/L 겔잔^TM을 함유하는 미사용 비-선택 휴면배지로 조심스럽게 옮겼다. 24시간 백색 형광등 (대략 50 μEm ^- ²s^-1)하에 28℃에서 7일 동안 인큐베이션을 지속하였다.

7일간의 휴면기에 이어서, 배를 선택배지로 옮겼다. 식물-발현가능한 aad1 선택마커 유전자를 함유하는 수퍼바이너리 플라스미드로 형질전환된 옥수수 조직의 선택을 위하여, 배 (36개/플레이트)를 먼저 100 nM R-할록시폽산 (0.0362 mg/L)을 함유하는 휴면배지 (상기)를 포함한 선택배지 I로 옮겼다. 배를 1주일 동안 (28℃; 연속광) 인큐베이션하고, 이어서 500 nM R-할록시폽산 (0.1810 mg/L)을 함유하는 휴면배지를 포함한 선택배지 II로 옮겼으며, 거기에서 그들을 연속광하에 7일 동안 더 인큐베이션하였다. 이때 그들을 미사용 선택배지 II로 옮기고 1주일 동안 더 상기에서와 같이 인큐베이션을 지속하였다.

옥수수 형질전환 분야의 당업자라면 다른 식물-발현가능한 선택마커 유전자 (예를 들어, 제초제 내성 유전자)가 사용되는 경우에 형질전환된 식물의 다른 선택 방법이 이용가능함을 이해할 것이다.

예비 재생(pre-regeneration) 선택 과정에 이어서, 배양물을 pH 5.8에서 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형 MS 비타민; 45 gm/L 수크로스; 350 mg/L L-프롤린; 100 mg/L 마이오-이노시톨; 50 mg/L 카제인 효소 가수분해물; 1.0 mg/L AgNO₃; 0.25 gm/L MES; NaOH중 0.5 mg/L 나프탈렌아세트산; 에탄올중 2.5 mg/L 앱시스산; 1 mg/L 6-벤질아미노퓨린; 250 mg/L 카르베니실린; 2.5 gm/L 겔잔^TM; 및 500 nM R-할록시폽산을 함유하는 예비-재생배지로 옮겼다. 상기에서와 같은 연속 백색 형광등하에 28℃에서 7일 동안 인큐베이션을 지속하였다.

재생 및 모종 분리 재생을 위하여, 배양물을 pH 5.8에서 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형 MS 비타민; 60 gm/L 수크로스; 100 mg/L 마이오-이노시톨; 125 mg/L 카르베니실린; 2.5 gm/L 겔잔^TM; 및 500 nM R-할록시폽산을 함유하는 재생배지 I로 옮기고, 모종을 생성시켜 28℃에서 연속 백색 형광등하에 3주까지 동안 성장시켰다.

모종이 적합한 성장 단계에 이르렀을 때, 그들을 겸자와 외과용 메스로 절제하여 pH 5.8에서 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형 MS 비타민; 30 gm/L 수크로스; 100 mg/L 마이오-이노시톨; 및 3.0 gm/L 겔잔^TM을 함유하는 재생배지 II로 옮긴 다음; 새순 및 뿌리의 추가 성장 및 발달을 허용하도록 상기에서와 같은 연속 백색 형광등하에 28℃에서 인큐베이션하였다.

종자 생산 식물을 메트로-믹스 360(METRO-MIX 360) 무토양 성장배지 (선 그로 호티컬춰; 미국 워싱턴주 벨뷰)에 이식한 다음 성장실에서 차츰 찬 기운에 쐬어 강하게 하였다(hardened-off). 이어서 식물을 선샤인 커스텀 블렌드 160 토양 혼합물에 이식한 다음 온실에서 개화기까지 성장시켰다. 종자 생산을 위한 통제된 수분을 수행하였다.

실시예 3. 애그로박테리움 균주에 의한 옥수수의 형질전환 (형질전환 프로토콜 2)

기본적인 작업 흐름은 다음과 같이 요약된다. 어린 배가 약 1.8 내지 2.4 mm 길이인 발달 단계에 있는 옥수수의 미성숙 이삭으로부터 배를 추출하였다. 상이한 형질전환 조건을 비교하고자 한 경우, 단일 이삭에서 분리한 대략 동수의 배를 모든 처리들간에 분배하였다. 배를 애그로박테리움 세포와 계면활성제를 함유하는 (또는 비교를 위하여 계면활성제를 함유하지 않는) 현탁액과 인큐베이션하고, 이어서 고체 배지 플레이트로 옮긴 다음 1 내지 4일 동안 공-배양시켰다. 처리된 배를 항생제 (애그로박테리움 세포의 억제와 사멸을 위해) 및 형질전환된 옥수수 조직 및 식물의 선택적 분리를 위한 화합물을 함유하는 배지로 옮겼다. 옥수수 조직 (보통은 캘러스, 그러나 그에 한정되지 않음)을 식물이 재생될 때까지 선택배지상에서 성장시켰다. 이들 식물을 시험하여 그들의 형질전환을 확인하였으며 목적하는 변형을 보유하는 것들을 종자 생산을 위하여 성숙상태로 성장시켰다.

미성숙 배 생산 옥수수 근친교잡 계통 B104 (1980년대 초 상업적으로 출시된 아이오와주 품종)로부터의 종자를 선샤인 커스텀 블렌드 160 (선 그로 호티컬춰, 미국 워싱턴주 벨뷰)을 함유하는 4 갤론 포트에 재식하였다. 식물을 고압 나트륨 및 금속 할라이드 램프의 조합을 사용하여 16:8시간 명암 광주기로 온실에서 성장시켰다. 형질전환을 위한 미성숙 배를 수득하기 위하여, 통제된 형매수분을 수행하였다. 배가 대략 1.8 내지 2.4 mm 크기였을 때 수분후 10 내지 13일차에 미성숙 배를 분리하였다. 옥수수 이삭을 겉껍질과 옥수수 수염을 제거한 후 50% 시판 표백제 (클로록스^®, 6.15% 차아염소산나트륨) + 트윈^® 20 (1 또는 2 방울/500 mL)에 10분 동안 침지시킴으로써 표면 멸균한 다음 멸균수로 3회 세정하였다.

이와 달리, 옥수수 이삭은 이삭이 완전히 침지될 때까지 70% 에탄올의 새로 제조한 용액으로 철저히 분무함으로써 표면 멸균시킬 수 있다. 사용에 앞서, 이삭을 멸균 이송 후드에서 30분 동안 공기 건조되도록 하여 에탄올 용액이 완전히 증발되게 한다.

현탁된 애그로박테리움 세포 및 필요에 따라 계면활성제를 함유하는 2 mL의 접종배지가 들어있는 마이크로 원심분리관중으로 직접 미성숙 배를 무균적으로 분리하였다. 배를 계면활성제를 함유하는 (또는 대조군 실험의 경우 계면활성제를 함유하지 않는) 애그로박테리움 세포의 현탁액과 5 내지 30분 동안 인큐베이션하였다.

먼저 세포를 50 mg/L 스펙티노마이신; 10 mg/L 리팜피신; 및 50 mg/L 스트렙토마이신을 함유하는 125 mL (500 mL 배플(baffled) 플라스크중)의 LB 배지 (시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스) 20 gm/L에서 진탕하에 (250 rpm, 암실) 26℃에서 6 hr 동안 성장시킴으로써 수퍼바이너리 벡터를 함유하는 애그로박테리움 세포의 현탁액을 제조하였다. 25 mL 철야 배양물 (동일 배지에서 성장)을 미사용 배지에 1:5 희석함으로써 당해 배양물을 확립하였다. 15 min 동안 3500 rpm으로 4℃에서 원심분리에 의하여 세포를 펠릿화하고 이어서 접종배지 (InM)에 (부드럽게 상하로 피펫팅함으로써) 대략 1.0의 600 nm에서의 광학밀도 (OD₆₀₀)가 되게 균일하게 재현탁시켰다. 접종배지는 pH 5.4에서 2.2 gm/L MS 염 (문헌 [Frame et al. (2011, Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos . In Plant Embryo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. T. A. Thorpe and E. C. Yeung, (Eds), Springer Science and Business Media, LLC. pp 327-341)]); 1X ISU 변형 MS 비타민 (문헌 [Frame et al., 2011 상기]); 68.4 gm/L 수크로스; 36 gm/L 글루코스; 115 mg/L L-프롤린; 100 mg/L 마이오-이노시톨; 및 200 μM 아세토시링곤 (DMSO중에 제조)을 함유하였다. 실험에 따라서는, 세포를 현탁시킨 후 접종배지에 적당량의 계면활성제 용액 (예를 들어, 브레이크-쓰루^® S 233, 0.01% 최종 농도)을 첨가하였다.

애그로박테리움 및 배 용액을 5 내지 15분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 이어서 배를 pH 5.8에서 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형 MS 비타민; 30 gm/L 수크로스; 700 mg/L L-프롤린; KOH중 3.3 mg/L 디캄바 (3,6-디클로로-o-아니스산 또는 3,6-디클로로-2-메톡시벤조산); 100 mg/L 마이오-이노시톨; 100 mg/L 카제인 효소 가수분해물; 15 mg/L AgNO₃; DMSO중 100 μM 아세토시링곤; 및 3 gm/L 겔잔^TM (시그마-알드리치)을 함유한 공-배양배지로 옮겼다. 공-배양 인큐베이션은 연속 백색 형광등 (대략 50 μEm^-2s^-1)하에 25℃에서 3 내지 4일 동안 행하였다.

휴면 및 선택 공-배양 후, 배 (36개 배/플레이트)를 pH 5.8에서 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형 MS 비타민; 30 gm/L 수크로스; 700 mg/L L-프롤린; KOH중 3.3 mg/L 디캄바; 100 mg/L 마이오-이노시톨; 100 mg/L 카제인 효소 가수분해물; 15 mg/L AgNO₃; 0.5 gm/L MES (2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 일수화물 (파이토테크놀로지스 래보러토리즈(PhytoTechnologies Labr.), 미국 캔자스주 레넥사); 250 mg/L 카르베니실린; 및 2.3 gm/L 겔잔^TM을 함유하는 비-선택 휴면배지로 조심스럽게 옮겼다. 상기에서와 같이 연속 백색 형광등 조건하에 28℃에서 7일 동안 인큐베이션을 지속하였다.

7일간의 휴면기 뒤에, 배를 선택배지로 옮겼다. 식물-발현가능한 aad1 선택마커 유전자를 함유하는 수퍼바이너리 플라스미드로 형질전환된 옥수수 조직의 선택을 위하여, 배 (18개 배/플레이트)를 먼저 휴면배지 (상기)로 이루어지고 100 nM R-할록시폽산 (0.0362 mg/L)을 함유하는 선택배지 I로 옮겼다. 배를 1주일 동안 인큐베이션하고, 이어서 휴면배지 (상기)로 이루어지고 500 nM R-할록시폽산 (0.1810 mg/L)을 함유하는 선택배지 II로 옮겼으며 (12개 배/플레이트), 거기에서 그들을 2주 동안 더 인큐베이션하였다. 24시간 백색 형광등 조건 (대략 50 μEm^-2s^-1)하에 28℃에서 대략 4 내지 6주에 걸쳐서 형질전환된 분리체를 수득하였다. 회수된 분리체를 재생의 개시 및 추가 분석을 위해 미사용 예비-재생배지로 옮겼다.

예비-재생 선택 과정에 이어서, 24시간 조명 상황에 노출시킨 배양물을 pH 5.8에서 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형 MS 비타민; 45 gm/L 수크로스; 350 mg/L L-프롤린; 100 mg/L 마이오-이노시톨; 50 mg/L 카제인 효소 가수분해물; 1.0 mg/L AgNO₃; 0.25 gm/L MES; NaOH중 0.5 mg/L 나프탈렌아세트산; 에탄올중 2.5 mg/L 앱시스산; 1 mg/L 6-벤질아미노퓨린; 250 mg/L 카르베니실린; 2.5 gm/L 겔잔^TM; 및 500 nM R-할록시폽산을 함유하는 예비-재생배지로 옮겼다 (6 내지 8개 캘러스/플레이트). 연속 백색 형광등 (대략 50 μEm^-2s^-1)하에 28℃에서 7 내지 14일 동안 인큐베이션을 지속하였다.

재생 및 모종 분리 재생을 위하여, 배양물을 pH 5.8에서 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형 MS 비타민; 60 gm/L 수크로스; 100 mg/L 마이오-이노시톨; 125 mg/L 카르베니실린; 3.5 gm/L 젤란 검(GELLAN GUM) G434 (파이토테크놀로지스 래보러토리즈); 및 500 nM R-할록시폽산을 함유하는 일차 재생배지로 옮기고 (12개까지의 캘러스/파이타트레이(PHYTATRAY)^TM(파이토테크놀로지스 래보러토리즈)), 모종을 생성시켜 3주까지 동안 성장시켰다.

모종이 3 내지 5 cm 길이에 이르렀을 때, 그들을 pH 5.8에서 4.33 gm/L MS 염; 1X ISU 변형 MS 비타민; 30 gm/L 수크로스; 100 mg/L 마이오-이노시톨; 3.5 gm/L 젤란 검 G434; 및 NaOH중 0.5 mg/L 인돌아세트산을 함유하는 식물 성장배지로 옮긴 다음 (6개 식물/파이타트레이^TM), 새순 및 뿌리의 추가 성장 및 발달을 허용하도록 16시간 백색 형광등 조건 (대략 50 μEm^-2s^-1)하에 25℃에서 인큐베이션하였다.

종자 생산 식물을 메트로-믹스 360 무토양 성장배지 (선 그로 호티컬춰, 미국 워싱턴주 벨뷰)에 이식한 다음 성장실에서 차츰 찬 기운에 쐬어 강하게 하였다. 이어서 식물을 선샤인 커스텀 블렌드 160 토양 혼합물에 이식한 다음 온실에서 개화기까지 성장시켰다. 종자 생산을 위한 통제된 수분을 수행하였다.

실시예 4. 액체 배지에서 성장한 애그로박테리움 세포를 사용한 형질전환 효율

애그로박테리움 수퍼바이너리 균주 LBA4404(pEPS1083)를 사용하여 실시예 2에 개시된 방법 (형질전환 프로토콜 1)에 의하여 옥수수 미성숙 배를 형질전환시켰다. 애그로박테리움 세포를 YEP 한천 플레이트로부터 긁어내어 감염배지 (IfM)에 재현탁시켰을 때 수득된 형질전환 효율을, 액체 배지 LB에서 성장시키고 원심분리에 의하여 수확하여 IfM에 재현탁시킨 애그로박테리움 세포를 사용하여 동시에 행해진 실험과 대비하여 비교하였다. 비교 형질전환 효율은 형질전환 실험의 개시 1 내지 5주 후 처리된 조직 조각상 황색 형광 스폿 (YFP+)의 수를 계수함으로써 과정의 다양한 단계에서 측정되었다. 표 2에 수득한 결과를 요약하였다.

표 2에 요약된 결과는 액체 배양물로부터 새로 수확한 애그로박테리움 세포를 사용하는 옥수수 배의 감염은 한천 플레이트로부터 긁어낸 세포를 사용하여 수득되는 것보다 현저히 더 높은 형질전환 효율을 제공함을 증명해 보여준다.

실시예 5. 형질전환 프로토콜 1에의 계면활성제 첨가에 의한 형질전환 효율의 향상

애그로박테리움 수퍼바이너리 균주 LBA4404(pDAB108652)를 사용하여 실시예 2에 개시된 방법에 의하여 옥수수 미성숙 배를 형질전환시켰다. 플라스미드 pDAB108652는 자신의 발현이 ZmUbi1 프로모터에 의하여 구동된 YFP-코딩 영역을 함유하고, 벼 액틴1 프로모터의 발현 제어하에 있는 aad1 제초제 내성-코딩 영역을 또한 담지한다. 애그로박테리움 세포를 계면활성제가 결여된 IfM에 현탁시켰을 때 수득된 형질전환 효율을 계면활성제 브레이크-쓰루^® S 233을 다양한 농도로 첨가한 IfM으로 동시에 행한 실험과 대비하여 비교하였다. 할록시폽 선택 4주 후에 형광 섹터가 있는 캘러스 (각각의 캘러스는 단일 배로부터 발생)를 계수함으로써 형질전환 효율을 계산하였다. 이때, 형광 섹터는 컸으며 따라서 조직은 안정하게 형질전환된 섹터를 나타내었다. 표 3에 요약된 결과는 계면활성제의 사용이 형질전환 효율을 증가시킨다는 것을 증명해 보여주고, 사용된 계면활성제의 농도에 대한 증진 효과의 민감성이 존재함을 증명해 보여준다.

애그로박테리움 수퍼바이너리 균주 LBA4404(pEPS1083)을 사용하여 실시예 2에 개시된 방법에 의하여 옥수수 미성숙 배를 형질전환시켰다. 애그로박테리움 세포를 계면활성제가 결여된 IfM에 현탁시켰을 때 수득된 형질전환 효율을 IfM중 첨가된 계면활성제의 존재하에 동시에 행한 실험과 대비하여 비교하였다. 비교 형질전환 효율은 형질전환 실험의 개시 1 내지 5주 후 처리된 조직 조각상 황색 형광 스폿 (YFP+)의 수를 계수함으로써 과정의 다양한 단계에서 측정되었다. 표 4에 수득한 결과를 요약하였다.

일부 실험에서, 현탁 및 온화한 원심분리에 의한 공-배양 단계 전에 애그로박테리움 세포를 IfM (계면활성제를 함유하거나 또는 함유하지 않는)으로 세척하였다 (표 4에서의 "세척"). 또한, 실험 5 (표 4)에서는 200 μM 아세토시링곤 (실시예 2에서 특정한 바와 같은 100 μM이 아니라)을 사용하여 vir 유전자 발현을 유도하였으며, 애그로박테리움 세포를 YEP 배지보다는 적당한 항생제를 함유하는 LB 배지의 플레이트상에서 성장시켰다.

표 4에 요약된 실험은 고체 배지 플레이트로부터 긁어낸 애그로박테리움 세포의 재현탁에 사용된 감염배지중 계면활성제 브레이크-쓰루^® S 233의 존재는 미성숙 배의 형질전환 효율을 극적으로 증가시킴을 명백히 보여준다. 또한, 계면활성제 택틱^TM은 형질전환 효율 증진에 긍정적이지만 보다 덜 극적인 효과를 나타낸다.

본원 개시 방법의 추가 예시에서, 미성숙 옥수수 배를 실시예 2의 방법에 의하여 애그로박테리움 균주 LBA4404(pEPS1083)의 세포로 형질전환시켰다. 형질전환 효율은 미성숙 배로부터의 발달하는 캘러스상 YFP+ 스폿 또는 섹터의 출현에 의하여 모니터링하였다. 도 1의 좌측은 고체 한천 플레이트로부터 긁어낸 애그로박테리움 세포를 사용하는 5개 실험 (실험 1 내지 5)을 보여주고, 도 1의 우측은 애그로박테리움 세포를 액체-성장 배양물로부터 수확한 3개 실험 (실험 6 내지 9)으로부터의 결과를 보여준다. 조합 실험 1 내지 5에서, 형질전환 효율은 수확한 이삭 9개 모두 (100%)로부터의 배에서 증가하였고, 형질전환 효율 증가는 9개 이삭 중 6개 (67%)로부터의 배에서 통계적 유의성이 있었다 (피셔의 직접확률법(Fisher's Exact) p<-0.05). 조합 실험 6 내지 9 (액체-성장 애그로박테리아)에서, 수확된 이삭 8개 전부 (100%)로부터의 배는 형질전환 효율의 통계적 유의성 있는 증가를 보였다. 따라서, 도 1에 요약된 결과로부터 감염배지에 브레이크-쓰루^® S 233의 첨가는 옥수수 미성숙 배의 형질전환 효율을 극적으로 증가시키는 것이 명백하며, 일부 경우에서는 90%를 초과하는 형질전환 효율이 도출된다.

본원 개시 방법의 또 다른 예시에서, 미성숙 옥수수 배를 실시예 2의 방법에 의하여 다양한 플라스미드 (그들 전부는 aad1 선택마커 유전자를 함유하였다)를 담지하는 애그로박테리움 균주 LBA4404의 세포로 형질전환시켰다. 전과 같이, 실험 처리는 0.01% 계면활성제 브레이크-쓰루^® S 233의 사용 또는 사용없이 형질전환 효율을 비교하였다. 식물 생산에로의 할록시폽 선택 처음부터 끝까지 배를 재생시키고 취하였다. 따라서, 데이터는 도 1에 요약한 것보다 실질적으로 더 늦은 단계에서 수집되었다. 트랜스제닉 식물을 생산한 배 ("사건")의 수를 처리된 미성숙 배의 수로 나눈 다음, 거기에 100을 곱함으로써 형질전환 효율 %를 계산하였다. 이러한 목적을 위하여, 하나의 배는 비록 그것이 다수 트랜스제닉 식물을 생산하였더라도 단일 사건으로 계수하였다. 한천 플레이트로부터 긁어낸 애그로박테리움 세포를 사용하는 3개 실험의 결과를 도 2 (실험 1, 2 및 3)에 도시하였다. 또한, 도 2에는 애그로박테리움 세포를 액체 배지에서 성장시켜 원심분리에 의하여 수확하고 IM (브레이크-쓰루^® S 233을 함유하거나 또는 함유하지 않는)에 재현탁시킨 실험 (실험 4)의 결과를 도시하였다. 도 2에서 짝을 이룬 막대는 개별 이삭으로부터의 배의 반응을 나타낸다.

도 2의 데이터로부터 계면활성제 브레이크-쓰루^® S 233의 첨가는 애그로박테리움 세포의 이전 성장형태에 관계없이 및 형질전환 플라스미드의 유전자 조성에 관계없이 옥수수 미성숙 배의 애그로박테리움-매개 형질전환 효율에 있어서 극적인 증가를 도출함이 명백하다. 조합 실험 1, 2 및 3에서, 형질전환 효율은 수확된 26개 이삭중 23개 (88%)로부터의 배에서 증가하였고, 형질전환 효율 증가는 26개 이삭중 12개 (46%)로부터의 배에서 통계적 유의성이 있었다 (피셔의 직접확률법 p<-0.05). 실험 4 (액체 성장 애그로박테리아)에서는 수확된 12개 이삭중 10개 (83%)로부터의 배가 형질전환 효율의 증가를 나타내었고, 그 증가는 12개 이삭중 1개 (8%)에서 통계적 유의성이 있었다.

실시예 6. 다양한 화학적 부류의 계면활성제의 형질전환-증진 작용의 비교

표 1에 몇몇 화학적 부류의 계면활성제의 비-제한 목록을 제공하였다. 실시예 3에 제공된 바와 같은 형질전환 프로토콜 2를 이용하여 미성숙 배의 형질전환 실험을 수행하였다. 다양한 플라스미드를 담지하고 있는 애그로박테리움 세포를 브레이크-쓰루^® S 233 또는 다양한 다른 계면활성제 (모두 0.01%의 농도)를 함유하는 접종배지 (InM)에 현탁시키고, 형질전환율 (aad1 유전자의 택맨^® 검정에 의하여 측정)을 실험 개시 7 내지 10주후에 비교하였다. 트랜스제닉 식물을 생산한 배 ("사건")의 수를 처리된 미성숙 배의 수로 나눈 다음, 거기에 100을 곱함으로써 형질전환 효율 %를 계산하였다. 이러한 목적을 위하여, 하나의 배를 비록 그것이 다수 트랜스제닉 식물을 생산하였더라도 단일 사건으로 계수하였다. 표 5에 수득된 형질전환 효율을 제시하였다.

표 5에 요약된 결과는 액체 배지에서 성장시켜 그로부터 수확한 애그로박테리움 접종물 세포의 재현탁에 사용된 접종배지에 포함시켰을 때 브레이크-쓰루^® S 233의 사용은 시험된 대다수 다른 계면활성제로 수득된 것들보다 우수한 형질전환 효율을 제공하였음을 증명해 보여준다. 3개 실험 (실험 2, 실험 9 및 실험 11)에서, 관찰된 형질전환 효율은 두 계면활성제간에 거의 동일하였다.

실시예 7. 상이한 조작자로부터의 형질전환 결과

옥수수 형질전환 분야의 당업자라면 식물 형질전환 방법론은 종종 실험 수개월 또는 수년에 걸쳐 획득되는 상당한 전문기술을 요구함을 이해할 것이다. 절차가 상이한 조작자에 의하여 실시되는 방식에 있어서 불일치에 기인하여 형질전환 효율은 광범위에 걸쳐서 다양할 수 있다. 따라서, 상이한 시간에 상이한 조작자에 의하여 수득된 형질전환 효율에 있어서 예측가능성을 향상시키는 옥수수 형질전환 절차를 제공하는 것이 유리하다. 옥수수 미성숙 배의 형질전환은 실시예 3의 방법 (다양한 플라스미드를 담지하고 있는 애그로박테리움 균주 LBA4404)을 사용하고 접종배지에 브레이크-쓰루^® S 233을 포함시켜 수개월의 기간에 걸쳐서 수행되었다. 수득된 할록시폽-내성 캘러스 조직의 총수로부터 형질전환 효율을 산정하였다. 표 6에 수득된 결과를 요약하였다.

표 6에 요약된 결과는, 실시예 3에 개시된 형질전환 프로토콜이, 접종배지에 브레이크-쓰루^® S 233을 포함시켜 실시될 때, 형질전환 효율의 조작자-조작자 변이를 감소시키는 강건하고 예측가능한 방법론을 제공한다는 것을 보여준다. 또한, 방법의 향상된 예측가능성은 목적하는 결과 (예를 들어, 수득된 형질전환된 사건의 수)를 수득하기 위한 실험의 크기 (예를 들어, 처리해야 하는 배의 수)를 보다 정확하게 결정하게 해준다.

본 발명은 발명의 몇몇 측면의 실례로서 의도되는 본원 개시의 실시양태에 의하여 범위가 제한받지 않으며 기능적으로 동등한 어떠한 실시양태도 본 발명의 범위 안에 들어온다. 본원에 나타내고 기재된 것들 외에도 방법의 다양한 변형이 당업자에게 자명해질 것이며 첨부 특허청구범위의 범위 안에 들어오는 것으로 의도된다. 또한, 본원 개시의 방법 단계의 오직 특정한 대표적 조합만이 상기 실시양태에서 구체적으로 논의되고 있지만, 방법 단계의 다른 조합이 당업자에게 자명해질 것이며 또한 첨부 특허청구범위의 범위 안에 들어오는 것으로 의도된다. 따라서, 단계의 조합이 명백히 본원에 언급될 수 있으며; 그러나, 비록 명백히 진술하고 있지 않더라도 단계의 다른 조합이 포함된다. 어떤 값이 명백히 열거되는 경우에, 그 열거된 값과 거의 동일한 수량 또는 양인 값들 역시 발명의 범위 안에 들어오는 것으로 이해하기로 한다. 어떤 범위의 값들이 열거되는 경우에, 그 범위의 열거된 상한과 하한 사이에 있는 각 끼어들어가는 정수값 및 그의 각 분수가 또한 그러한 값들간의 각 하위 범위와 더불어 구체적으로 개시된다. 본원에서 사용되는 용어 "포함하는(comprising)" 및 그의 어미 변화는 용어 "포함하는(including)" 및 그의 어미 변화와 동의어로 사용되며 열린 개념의 비-제한 용어이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "변형하다" 또는 "변경하다" 또는 그의 임의 형태는 변형, 개변, 대체, 결실, 치환, 제거, 변이 또는 형질전환시키는 것을 의미한다.

Claims

계면활성제를 함유하는 액체 배지중 애그로박테리움 세포에 식물세포를 노출시키는 단계를 포함하며, 계면활성제는 액체 배지중 0.001 중량% 내지 0.08 중량%의 농도를 갖는, 식물세포 형질전환 방법.
제1항에 있어서, 부가적인 계면활성제를 추가로 포함하는 식물세포 형질전환 방법.
제1항에 있어서, 계면활성제는 아주반트, 비-이온성 계면활성제, 음이온 계면활성제, 유성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제 또는 중합체 계면활성제인 식물세포 형질전환 방법.
제1항에 있어서, 계면활성제는 비-이온성 트리실록산 계면활성제인 식물세포 형질전환 방법.
제1항에 있어서, 계면활성제는 트리실록산 알콕실레이트, 에톡실화 대두유, 알콜 에톡실레이트 C-13, C₁₂-C₁₄-알킬디메틸 베타인, 또는 디-sec-부틸페놀 에틸렌 옥시드-프로필렌 옥시드 블록 공중합체인 식물세포 형질전환 방법.
제1항에 있어서, 식물세포는 옥수수 세포인 식물세포 형질전환 방법.
제1항에 있어서, 식물세포는 미성숙 배에서 유래되는 식물세포 형질전환 방법.
제7항에 있어서, 미성숙 배는 1.5 mm 이상 및 2.5 mm 이하의 길이인 식물세포 형질전환 방법.
제1항에 있어서, 식물세포를 애그로박테리움 세포에의 노출 후 연속광에 노출시키는 식물세포 형질전환 방법.
계면활성제를 함유하는 액체 배지를 제조하며, 계면활성제는 액체 배지중 0.001 중량% 내지 0.08 중량%의 농도를 갖는 단계;
애그로박테리움 세포를 액체 배지에 현탁시키는 단계; 및
계면활성제를 함유하는 액체 배지중 애그로박테리움 세포에 식물세포를 노출시키는 단계를 포함하는, 식물세포 형질전환 방법.
제10항에 있어서, 애그로박테리움 세포를 계면활성제를 함유하는 액체 배지에 현탁시키기에 앞서 고체 배지로부터 긁어내는 식물세포 형질전환 방법.
제10항에 있어서, 애그로박테리움 세포를 계면활성제를 함유하는 액체 배지에 현탁시키기에 앞서 액체 성장 배지에서 성장시키는 식물세포 형질전환 방법.
제10항에 있어서, 부가적인 계면활성제를 추가로 포함하는 식물세포 형질전환 방법.
제10항에 있어서, 계면활성제는 아주반트, 비-이온성 계면활성제, 음이온 계면활성제, 유성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제 또는 중합체 계면활성제인 식물세포 형질전환 방법.
제10항에 있어서, 계면활성제는 비-이온성 트리실록산 계면활성제인 식물세포 형질전환 방법.
제10항에 있어서, 계면활성제는 트리실록산 알콕실레이트, 에톡실화 대두유, 알콜 에톡실레이트 C-13, C₁₂-C₁₄-알킬디메틸 베타인, 또는 디-sec-부틸페놀 에틸렌 옥시드-프로필렌 옥시드 블록 공중합체인 식물세포 형질전환 방법.
제10항에 있어서, 식물세포는 옥수수 세포인 식물세포 형질전환 방법.
제10항에 있어서, 식물세포는 미성숙 배에서 유래되는 식물세포 형질전환 방법.
제18항에 있어서, 미성숙 배는 1.5 내지 2.5 mm 길이인 식물세포 형질전환 방법.
제10항에 있어서, 식물세포를 애그로박테리움 세포에의 노출 후 연속광에 노출시키는 식물세포 형질전환 방법.