CN101451149B

CN101451149B - 农杆菌介导的高效玉米遗传转化方法

Info

Publication number: CN101451149B
Application number: CN2008101478250A
Authority: CN
Inventors: 张志明; 沈亚欧; 畅乃迪; 潘光堂; 林海建; 赵茂俊; 马永毅; 丁海萍
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2008-12-12
Filing date: 2008-12-12
Publication date: 2011-08-10
Anticipated expiration: 2028-12-12
Also published as: CN101451149A

Abstract

本发明涉及农杆菌介导的高效玉米遗传转化方法，包括以下步骤：1)将含有目的基因的农杆菌用转化培养液悬浮；2)在大田条件下对活体进行花序浸泡法转化：在雌花花丝吐出5~10cm，雄花序主花轴有少于30％的小花开始散粉时，将待转化玉米植株的雌花序或雄花序浸泡于上述转化培养液中，或将上述转化培养液洒到待转化的玉米植株的雌花序或雄花序上，通过农杆菌介导，将目的基因整合到植株的目的基因组中。本发明利用这种转基因方法，解决了常规转基因方法转化率低的问题，具有较大的应用价值。

Description

农杆菌介导的高效玉米遗传转化方法

技术领域

本发明属于植物转基因方法领域，涉及利用农杆菌介导的禾谷类作物基因转化方法，特别是玉米遗传转化的方法。

背景技术

玉米，学名玉蜀黍，属禾本科玉米属(Zea mays L.)，原产于美洲大陆的墨西哥、秘鲁及智利。玉米属于C4高产粮食作物，是世界三大粮食作物之一，在世界粮食生产中占有重要地位。

20世纪80年代以前，玉米品种更新换代主要采用常规育种方法，即通过有性杂交实现基因重组，依据表型进行人工选择，实现优良基因重组。这种方法已有上百年历史，也育成了成千上万个优良作物品种，对农业生产做出了重大贡献，但由于作物的表型性状易受外界环境条件干扰和季节的影响，育种周期长(6~8年)、规模(如土地)大，但效率却很低，预见性也差；此外，有性杂交受到种间隔离的限制，在一定程度上限制了可利用基因资源的范围。植物转基因技术的迅猛发展，推动了作物转基因育种技术的迅猛发展，不仅使作物的转基因工程技术育种成为可能，而且取得了传统常规育种技术难以达到的效果和效益。作物转基因技术已成为农业生物技术的核心领域，它正在成为作物遗传改良一种极为重要的辅助手段，世界各国纷纷将作物转基因工程育种技术作为国家战略予以推动和发展，尤其是玉米转基因工程育种技术已成为各国玉米生物技术育种的发展重点和优先领域。

玉米的转基因方法主要有两大类：农杆菌介导转化法和无需载体的DNA直接导入转化法。DNA直接导入转化法主要包括基因枪法、花粉管通道法、子房注射法、PEG法、电击法、阳离子转化法等。无论何种外源基因转化方法，都需要依靠转化细胞的脱分化和在分化这一组织培养植株的再生过程，实现外源基因的转移，获得转基因植株。

玉米组织培养效率受基因型限制较大，许多基因型材料都存在着愈伤组织诱导频率低、愈伤组织质量差、转化再生植株难、畸形苗多等现象，这直接影响了遗传转化技术的运用范围及遗传转化中转化体的筛选和植株再生。此外，试管苗存活率较低是玉米组织培养技术尚需提高的一个环节，试管苗的成功移栽是较困难的步骤，污染是组织培养过程中经常遇到的问题，褐化也是组织培养过程中经常遇到的问题。它们均不同程度地制约了玉米组织培养的成效。

花序浸蘸法(flroal dip)属于原位渗透法的一种。该方法避开了组织培养阶段，排除了因组织培养中体细胞变异所产生的对目的基因的遗传学研究及正确表达极为不利的遗传背景，同时为一些组织培养不易成苗的作物种类提供了有效的基因转移新方法。该方法与其它转基因方法相比较，其优越性在于：①不受宿主植物基因型的影响，可以将外源基因导入难以建立再生系统的植物中；②操作简单，无需经过烦琐的组织培养阶段，大大减少了产生体细胞无性系变异的可能性；③对精密仪器和昂贵药品的依赖较小，所投入的人力、物力、财力很少；④可以在短期内获得大量的转基因植株，创造大量的突变株，对功能基因组的研究意义重大。功能基因研究是基因工程研究的核心，然而功能基因组的研究要以获得大量突变体为基础，花序浸蘸法在短期内能获得大量转基因植株。因此，花序浸蘸法对功能基因组研究和转基因育种均具有深远意义。

发明内容

针对现有转基因技术的不足，本发明以花序浸蘸法为基础，提供一种高效的玉米遗传转化的方法。

1.将含有目的基因的农杆菌用转化培养液悬浮，所述转化培养液以改良的N6培养基为基本营养成分，附加物有表面活性剂CSO40、Triton X-100、乙酰丁香酮(AS)、赤霉素(GA)、6-卞氨基腺嘌呤(6-BA)、生长素(IAA)、水解酪蛋白、L-脯氨酸和甘露醇。

2.对活体进行花序浸泡法转化：在雌花花丝吐出5~10cm，雄花序主花轴有少于30％的小花散粉时，将待转化玉米植株的雌花序或雄花序浸泡于上述转化培养液中，或将上述转化培养液洒到待转化的玉米植株的雌花序或雄花序上，利用农杆菌介导，将目的基因整合到植株的目的基因组中。

花序浸蘸法转化常采用抽真空的方法提高转化效率，然而对株型较大的植物显然不适宜，因此在大田条件下进行转化须对常规使用的共培养转化液进行改良。除正确的植物发育状态外，含农杆菌的转化培养液中的蔗糖含量和表面剂两种成分是成功转化所需的另两个关键因素。目前常用的添加剂是有机硅表面活性剂Silwet L-77。本发明首次采用了德国Cognis公司生产的蓖麻油聚氧乙烯醚表面活性剂CSO40替换Silwet L-77。CS040的作用主要为乳化和分散润湿，可在液珠表面形成具有一定强度和稳定性的保护膜，田间操作可降低液珠蒸发，增加农杆菌浸染花序的机会。Triton X-100(曲拉通X-100)化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚，是一种优异的非离子表面活化剂，具有润湿及洗涤剂的作用，同时还可用来做细胞破膜剂/细胞通透剂，即在细胞膜上打孔，这样有助于农杆菌顺利进入细胞体内，增加转化几率。AS，即乙酰丁香酮，它是vir基因的天然诱导剂，可用来激活vir基因，利于外源基因的转化。GA，即赤霉素，是一类属于双萜类化合物的植物激素，能促进细胞的伸长和分裂，促进萌发、开花和坐果，还可以防止果皮腐烂。6-BA是细胞分裂素，与生长素IAA配合使用，主要功能是促进细胞分裂。植物激素的主要作用是修复农杆菌浸染造成的伤口，以利于植物细胞成长。本发明中选用甘露醇用来代替蔗糖，起到调节细胞渗透压的作用，用甘露醇而不用蔗糖的原因是玉米大田生产中使用糖分过多的转化培养液太多会招来更多的玉米害虫。

本发明中，转化培养液中的CSO40的用量为30~300μl/L，Triton X-100的用量为10~100μl/L，AS用量为10~30mg/L，GA用量为1~5μg/L，6-BA用量为0.5~2μg/L，IAA用量为0.5~1mg/L，水解酪蛋白用量为100~500mg/L，L-脯氨酸用量为0.5~2mg/L，甘露醇用量为10~20mg/L。

含有目的基因农杆菌的获得，是通过将目的基因插入到表达载体中后，再将该载体转化导入农杆菌。常用载体包括、但不限于pCAMBIA系列载体(如pCAMBIA1304等)；常用菌株包括、但不限于C58、EHA105、LBA4404等。

本发明利用这种转基因方法，解决了常规转基因方法转化率低(不足1％)的问题，具有较大的应用价值。本发明已经成功地获得了玉米转基因植株。

下面结合附图，通过具体实施例对本发明作进-步说明。

附图说明

图1质粒pCAMBIA1302图谱

图2质粒pCAMBIA1302酶切图谱

图3当代玉米花丝GFP瞬时表达观察

图4、图5当代玉米花粉粒GFP瞬时表达观察

图6、图7玉米雌花转化后收获的T0代种子中GFP的荧光观察

图8、图9、图10玉米雄花转化后收获的T0代种子中GFP的荧光观察

图11、图12普通未转化玉米种子荧光观察

图13阳性植株的PCR检测

具体实施方法

农杆菌介导的高效玉米遗传转化方法，具体如下：

1、实验材料

1)植物材料

选用优良玉米自交系18599红(18R)、18599白(18W)作为供试植物材料。材料由四川农业大学玉米研究所保存。

2)菌株

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)：C58(胭脂碱型nopaline)，购自中国农业菌种保藏中心。

3)质粒

选用澳大利亚CAMBIA公司生产的pCAMBIA系列载体之一的pCAMBIA1302。该质粒含有来源于水母的绿色荧光蛋白报告基因GFP，带有hpt选择表及基因，可抗Hygmycin。

2、方法

1)农杆菌培养及储备液的制备

(1)取-70℃保存的含有质粒pCAMBIA1302的农杆菌，迅速溶解，重悬，于含卡那霉素50mg/L和潮霉素50mg/L的YEB固体培养基平板上划线，28℃过夜培养。

(2)挑取单菌落接种于5ml含Kan和Hyg的YEB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12~16h。

(3)取2ml菌液转接于100ml含Kan和Hyg的YEB液体培养基中，220rpm28℃振荡培养12~16h。

(4)监测其OD₆₀₀值，当OD₆₀₀＝2.0时停止摇菌，至于4℃冰箱，以备转化使用。

2)转化培养液的制备

配制改良玉米N6液体培养基，每一升加入CSO40 200μl，Triton X-10050μl，GA 5μg，AS 20mg，6-BA 2μg，IAA 1mg，水解酪蛋白250mg，L-脯氨酸的用量为1.5mg，甘露醇20mg作为转化培养液，调节pH值至6.0。

将YEB菌液5000rpm离心15min，收集菌体，用转化培养液重悬，稀释到OD₆₀₀＝1.0左右备用。

2)播种及植物材料的准备

选择健康饱满的成熟种子播种，按照常规进行田间管理。选取露天生长处于初花期，生长健壮的植株作为待转化植株，对其进行挂牌、编号。

3)田间转化

雌花：提前套袋的雌花待雌蕊伸长至5～10cm时，将伸出的雌蕊浸泡于菌液中1～1.5min，并不时轻摇，间隔30~60min后再次转化，共转化3~4次。或用喷雾器将雌花序喷湿，间隔30~60min再次喷湿，共喷湿3~4次。或剪掉吐出的花丝，用注射器吸取转化培养液缓慢滴注到苞叶里，直到有液体从花序顶部溢出。

雄花：选取有雄花序主花轴有少于30％的小花开放的植株，将已开放小花去除，弯曲雄花序，使之完全浸泡于含质粒农杆菌的转化培养液中，并不时轻轻摇动，保持5~8min，间隔30~60min后再次浸泡，共浸泡3~次，然后套透明塑料袋，外面套雄花袋。待散粉后收集花粉，自交套袋。

注意转化前为保证吸收，可停止浇水一天。转化时间宜选在清晨温度不太高时(26~30℃)进行。注意植株防病虫害。

4)收获

转化后的其他管理按照常规技术进行，直至种子成熟收获。每个转化植株采取单株收种(T0代的种子)，对T1代进行筛选。

二、当代花器官检测和T1代转化株的筛选及检测

1.转化24h后，取当代花丝和花药于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的瞬时表达，并拍照。

图3显示了转化24h后在当代玉米花丝中已有GFP表达；图4、图5则显示了转化24h后在当代玉米花粉粒中GFP的表达情况，且荧光表达量强。结果表明玉米雌花及雄花对农杆菌均是敏感的。

2.T0代种子的GFP荧光观察

从田间取回玉米果穗，随机选取种子进行观察。将种子破碎，做徒手切片及石蜡切片，将组织和细胞置于荧光显微镜下观察，并拍照。

图6、图7为玉米雌花转化后收获的T0代种子中GFP的荧光观察，图8、图9、图10为玉米雄花转化后收获的T0代种子中GFP的荧光观察。如图所示，GFP在细胞内表达呈现为发出绿色荧光的亮点，可知GFP基因已整合到玉米核基因组中。由图可见，通过玉米雄花序的转化，GFP亮点更加均匀，效果更为明显，推测与花粉粒主要为核基因组有关。

3.T0代种子抗性筛选

将收获的T0代种子用Hygmycin筛选。转化株由于带有hpt抗性基因而对Hyg不敏感。

具体的筛选方法是：温水浸种12h，整齐播于洗净的沙中，出苗后用浓度为20mg/L的Hyg溶液涂抹子叶，两周后选取抗性植株作进一步检测。收获的T0代种子有220粒用于Hygmycin筛选实验，其中转化雌花获得的种子有89粒。共有126粒种子发芽，其中转化雌花获得的种子发芽40粒。整体发芽率较低，为57.2％，原因可能是：①种子成熟度不够；②种子自身带菌，易霉烂和腐烂；③存在致死突变的可能。经抗性筛选，共有14株幼苗表现阳性，阳性率为11.1％，其中转化雌花的幼苗3株，阳性率7.5％，转化雄花幼苗11株，阳性率12.8％。

4.转基因植株的PCR检测

1)玉米抗性植株总DNA的获得

对表现Hygmycin抗性的植株用CTAB法提取基因组DNA，用琼脂糖电泳和核酸蛋白仪分别检测DNA质量和浓度。

总DNA的提取步骤：

(1)取5g左右再生植株的新鲜叶片于研钵中，加入液氮快速研磨成粉末状，转入-20℃预冷5ml离心管，加入65℃预热的CTAB提取液2ml充分混匀，65℃保温20~30min，在此期间轻轻颠倒离心管几次。加入等体积的氯仿/异戊醇(24/1)混合液轻轻摇动5~10min。10,000rpm离心10min。

(2)取上清液，再用等体积的氯仿/异戊醇抽提一次，10,000rpm离心10min。

(3)小心吸出上清液于另一5ml离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，缓慢混匀，放于-20℃冰箱中沉淀DNA。

(4)挑出成团的DNA，用70％乙醇洗2-3次，

(5)无水乙醇洗1-2次

(6)于DNA干燥仪中烘干，加200μl左右的TE或无菌水溶解，再加入RNase消化于37℃保温30min。

(7)取2μl DNA样品于0.8％琼脂糖凝胶电泳初步测定DNA浓度，其余样品保存于-20℃备用。

2)PCR的分子检测

PCR检测hpt基因。根据hpt基因序列设计引物序列如下：

P1：5’-TCGGCGAGTACTTCTACACAGC-3’

P2：5’-CTGGCAAACTGTGATGGACGAC-3’

反应体系(20μl)：

基因组DNA 1μl

P1(HPT) 2μl

P2(HPT) 2μl

10×buffer 2μl

Mg²⁺ 1.2μl 1.5mM 25mM

dNTP 3μl

Taq酶 0.3μl

ddH₂O 8μl

20μl

反应程序：

95℃5min；94℃20sec，55℃30sec，72℃1min，循环30次；72℃10min。反应结束后1％琼脂糖电泳检测扩增结果，如图13所示，阳性植株含约700bp的hyg片段，M代表DNA marker。

Claims

1.一种农杆菌介导的高效玉米遗传转化方法，包括以下步骤：

1)将含有目的基因的农杆菌用转化培养液悬浮，所述转化培养液以改良的N6培养基为基本营养成分，附加物有表面活性剂CSO40、Triton X-100、乙酰丁香酮(AS)、赤霉素(GA)、6-苄氨基腺嘌吟(6-BA)、生长素(IAA)、水解酪蛋白、L-脯氨酸和甘露醇；转化培养液中CSO40的用量为30～300μl/L，Triton X-100的用量为10～100μl/L，AS的用量为10～30mg/L，GA的用量为1～5μg/L，6-BA的用量为0.5～2μg/L，IAA的用量为0.5～1mg/L，水解酪蛋白的用量为100～500mg/L，L-脯氨酸的用量为0.5～2mg/L，甘露醇的用量为10～20mg/L；

2)在对活体进行花序浸泡法转化：在雌花花丝吐出5～10cm，雄花序主花轴有少于30％的小花散粉时，将待转化玉米植株的雌花序或雄花序浸泡于上述含有农杆菌的转化培养液中，或将上述含有农杆菌的转化培养液喷洒到待转化的玉米植株的雌花序或雄花序上，利用农杆菌介导，将目的基因整合到植株的目的基因组中。

2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的高效玉米遗传转化方法，其特征在于：所述含有农杆菌的转化培养液是通过农杆菌培养及储备液制备的，农杆菌培养及储备液是

3)取-70℃保存的含有目的基因的农杆菌，迅速溶解，重悬，于含卡那霉素50mg/L和潮霉素50mg/L的YEB固体培养基平板上划线，28℃过夜培养；

4)挑取单菌落接种于5ml含Kan和Hyg的YEB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12～16h；

5)取2ml菌液转接于100ml含Kan和Hyg的YEB液体培养基中，220rpm28℃振荡培养12～16h；

6)监测其OD₆₀₀值，当OD₆₀₀＝2.0时停止摇菌，至于4℃冰箱，以备转化使用；

所述含有目的基因的农杆菌的获得是将目的基因插入pCAMBIA1302表达载体中，再将该表达载体转化入农杆菌中。

3.根据权利要求2所述的农杆菌介导的高效玉米遗传转化方法，其特征在于：所述农杆菌选自下列菌株：C58、EHA105、LBA4404。

4.根据权利要求2所述的农杆菌介导的高效玉米遗传转化方法，其特征在于：所述步骤2)的转化过程为：将雄花序完全浸没于转化培养液中，并不时轻摇，保持5～8min，间隔30～60min后再次浸泡，共浸泡3～4次；将雌花序浸没于转化培养液中，并不时轻摇，保持1～1.5min，间隔30～60min再次转化，共转化3～4次；转化后雄花先套透明塑料袋，外套雄花袋，直至散粉；雌花套硝酸纸袋，24h后即可去掉纸袋授粉。

5.根据权利要求4所述的农杆菌介导的高效玉米遗传转化方法，其特征在于：所述步骤2)的转化过程，转化时间应选择在清晨和傍晚时进行，气温25℃～30℃，避免在下雨时进行，转化前一天不浇水。