CN102181436B - 植物营养生长保持基因系统、营养生长保持植物的建立及种子植物无限生长能力的利用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种植物营养生长保持基因系统、营养生长保持植物的建立及种子植物无限生长能力利用方法。该营养生长保持基因系统包括启动子、细胞致死因子基因和必要时设置的限定或消除其非靶标细胞毒性的基因装置；种子植物无限生长能力利用将该基因系统整合于植物核基因组，并按照其既定的组织器官与发育阶段特异性准确、正确的开始表达。该营养生长保持基因系统可以有效清除茎端营养分生组织中出现的生殖分生组织细胞，防止营养分生组织异化，从而创造出创造出新型高产、优质的营养体利用植物--营养生长保持植物；本发明可以应用于所有营养体利用植物，使其在原来的基础上大幅度提高营养体的生长速度、生产效率与产量。

Description

植物营养生长保持基因系统、营养生长保持植物的建立及种子植物无限生长能力的利用方法

技术领域

本发明涉及植物生物技术、细胞工程、基因工程与现代农业、生态建设、环保保护领域，具体涉及植物营养生长保持基因系统、营养生长保持植物的建立及种子植物无限生长能力的利用方法。 

背景技术

（一）营养体利用植物在现代农业中的作用与地位

植物提供了人类全部的食物、大部分能源（柴）、衣、住、行，以及其它主要、基本的生活品，是人类赖以生存与发展的物质基础。

种子植物以其器官的性质与功能不同，可分为营养器官（vegetative organs)的根茎叶与生殖器官(reproductive organs)的花、果实与种子。 

植物营养器官与生殖器官对于植物都非常重要，缺一不可，但其作用、地位并非对称：植物体的营养器官的主要任务与功能是生产、制造有机物，以维持其本身的生存；而生殖器官的任务与功能则是消费、转化合成的有机物，进行有性繁殖、制造新的生命、保持种的延续。 

植物体若没有营养器官，不可能产生生殖器官，产生有性后代；但是植物体仅有营养器官而无生殖器官则是可以生存、生长，并且可以生长得更旺、更好，营养体的生产效率更高，虽然不能产生种子，但可以通过无性方式，进行无性繁殖。 

以人们利用植物器官对象、目的的不同，可将植物分为生殖器官利用植物（麦、稻、棉、玉米、大豆、花生、油菜等）与营养体利用植物（牧草，薯类、糖类、麻类作物，桑、茶、烟，大部分蔬菜、林木、中药材等）两类。但此类概念并不严格、绝对，例如通常划归籽实体利用植物的黑樱桃、核桃、梨树等，实际上都是优良的用材树，也可划归营养体植物，或者兼用植物。 

以粮棉油为代表的生殖器官利用植物对人类的重要性是不言而喻的；而属于营养体利用植物的菜、薯、糖、麻、丝、茶、烟、药等农产品；木材、薪炭材、浆纸材、橡胶等林产品；肉、蛋、奶、毛、皮等牧草产品，以及生态保护、城乡绿化用树种、坪草等占据着农林牧业产品的半璧江山，直接关系着人类的生活水平、健康与环境，其对于人类的价值、作用与意义可与粮棉油齐肩。 

（二）营养器官、营养生长与生殖器官、生殖生长的关系

对于营养体利用植物而言，生殖器官的发生与形成不仅会消耗大量的营养物质与能量，而且还严重影响目的产品的产量、质量及其社会、环境与经济价值。

牧草、地坪草一旦开花、结籽，就开始老化，营养体就不再生长、不再鲜嫩与营养，甚至死亡。所以要不断的剎割、修剪，以便使其持续保持旺盛的生长状态。 

甘蔗、甜菜、萝卜、菠菜、莴苣等植物开花，就会严重影响其产量、质量，甚至完全丧失食用或商品价值。 

红麻、黄麻、青麻、大麻、苎麻、亚麻等麻类作物一开花，植株就不再长高，严重制约着其质量与产量。 

用材林、薪炭林、浆纸林、生态林、橡胶林等树种生殖器官的发生与存在，不仅消耗大量养分与能量，还严重影响其目的产品营养体的生产效率、产量。 

橡胶树因长期、反复无性繁殖，造成树体老化，产量大幅度降低，严重困扰着橡胶产业的发展。 

一般优质烟草叶数达到28～32片就开花了，中间的商品叶仅为18～20片。因此，利用现有技术难以提高烟叶片数量及产量。 

杨树、柳树、悬铃木是我国北方的城乡主要绿化树种，其果实、种子（杨柳飞絮、悬铃木的毛毛雨、花粉过敏）会造成了严重的环境污染，危害人们的身体健康。 

采用常规农业措施，包括进一步提高水、肥、光、温等的作用已无太大的能力；而激素（包括植物生长调节剂、杀雄剂）、管理（人工修剪、打顶、摘除）等，则需要年年、季季，甚至经常、不断的处理，都不能从根本上解决问题，而且需耗费大量的时间、人力、机械，甚至污染环境，成本高、效果有限。 

以常规育种技术、杂种优势利用途径，以及物理、化学诱变途径、染色体倍性育种等都能不同程度的提高这些植物营养体产量与质量。这是迄今的主流途径，依然有能力可挖，但进展缓慢，没有实质性突破。 

能否建立一套技术系统使植物营养体的产量获得更大幅度的提高是摆在人类面前、亟待解决的、直接关系到人们人类的食品、健康、能源、材料与环境等基本问题。 

（三）植物生长能力的概念及其利用

人们知道，甘蔗、薯类作物、姜、蒜、山药、地黄以及竹子等通常都是通过其（块）根、（块）茎繁殖的；苹果、柑橘等优良品种一般都是通过嫁接繁殖的；葡萄、泡桐、杨、柳、悬铃木等都是通过扦插、埋根、压条等方法繁殖的；而大多数植物都是可以通过组织培养繁殖的。这表明，植物体可以持久地保持、延续下去。但这些现象仅是植物生长能力的有限体现。

对植物生长能力及其特性的研究可以追溯到18世纪中叶。1868年韩士汀（J．von Hanstein）提出了组织原学说（histogen theory）；1924年史密特（A．Schmidt）提出了原套-原体学说（tunica－corpustheory）。一个多世纪以来对植物形态发生中有关极性、对称和相关性，特别是分化和再生，以及植物顶端分生组织的细胞分裂、组织分化和器官发生的机理及其分子生物学基础进行了详尽研究，并早有定论：植物具有无限生长能力。 

国际著名植物学家Lincoln Taiz和Eduardo Zeiger等著、国际植物生物学领域的重要教科书《植物生理学》中载明：“与动物发育不同，植物发育是一个持续进行的过程。营养体的分生组织具有高度重覆性---它们不断地产生相同或相似的结构，而且它们的活动是无限延续下去的。这种现象称为无限生长（indeterminate grouth）”。有些研究者则得出植物具有“持续生长能力（are capable of continued cellular division）”的结论。维基百科在“分生组织”条目下甚至使用了更为肯定的表述方式：植物在理论上有着潜在的永生能力“永生能力”（immortality），而其中的主角是分生组织（http://zh.wikipedia.org/zh-cn/%E5%88%86%E7%94%9F%E7%BB%84%E7%BB%87、http://en.wikipedia.org/wiki/Meristem）。 

植物生长能力的无限性来源于植物茎端分生组织特殊的结构、特性与功能。植物茎端存在着来源于胚胎发育时期、具有持续分生能力的“营养茎端分生组织（vegetative apical meristem）”。这是一群自我永续的细胞---它的一个细胞分裂后形成2个细胞，其中一个保留在原位，使茎端分生组织的体积保持不变；另一个细胞进一步分裂分化，形成植物地上部分各类不同器官的细胞组分，其中包括茎、叶、腋芽与花器官的各个部分。 

在植物的营养生长期，其茎端分生组织处于营养分生组织状态，可以不断的产生相同或相似的结构，而且它们的活动是无限延续下去的，其结果是茎端分生组织可以持续不断产生、形成新的、由节、叶、腋芽的原基构成的叶体节。形成的叶体节不断伸长，发育成成熟的节、叶、腋芽。从而使植物体由低到高、由小到大，持续生长。 

但是，植物的这种“无限生长” 能力在正常植物中是被程序化的固定在植物的生命周期中了，并不能无限的持续下去。当植物体发育到一定阶段、在一定的环境条件下，植物茎端营养分生组织就会被异化为“生殖分生组织(reproductive meristem)”细胞，并开始改变生长发育的方向，进入生殖生长阶段。生殖分生组织经分化、发育成生殖器官花、果实、种子。在花的形成过程中会耗尽所有的未分化的细胞，终结了分生能力，因此一旦开花就意味着此生命周期的完成、终结。植物的“无限生长”能力在其生命周期的框架内，仅能以“潜在”的形式存在，或以其“有限能力”表现。 

（四）关于细胞致死因子基因或基因装置

表达、或代谢物能直接或间接抑制、干扰细胞基础代谢、导致细胞死亡的基因或基因装置有多种，例如DNA酶、RNA酶、核糖体失活蛋白以及基础、关键代谢酶基因RNA干扰体等，其中仅核糖核酸内切酶酶（RNA酶）就有来源于拟南芥的RNS1、RNS2、RNS3等、来源于解淀粉芽孢杆菌的Barnase。拟南芥RNS1、RNS2、RNS3等来自植物的核糖核酸内切酶基因，在植物中应用不存在表达障碍。Barnase为经典、优良的核糖核酸内切酶基因，活性特别强，细胞中只要有一个拷贝，就可以导致其宿主细胞自杀，但该基因的表达、控制的机制尚不完全清楚，其编码基因单独存在于原核生物细胞时，会产生细胞毒性，导致宿主细胞死亡（见:核糖核酸酶barnase基因的克隆策略研究  宋洪元,丁建刚,宋明 西北植物学报2005 25(6) ）。这一问题长期误导、困扰着一些研究者。随着分子生物学与基因工程的研究的发展，已建立了多种可能解决这一难题的途径。

（五）关于启动子的研究情况

在过去的相关研究与文献中曾使用过一些与植物生殖生长相关基因及其启动子，例如LFY等，“但随着研究的深入，人们逐渐发现，一些过去被认为这些在“花分生组织”和“花序分生组织”中特异表达的“分生组织特征决定基因”，大部分都不用程度地在“营养分生组织”甚至“胚胎发生”过程中表达”。“烟草、凤仙花、豌豆、矮牵牛、水稻、松树等植物中，LFY类基因的表达并不局限于花分生组织，而是广泛地存在于不同发育阶段的茎端分生组织；更重要的是，后来的研究表明，即使在拟南芥中，LFY基因实际上在其早期的发育阶段，即在花序分生组织形成之前，已经在茎端分生组织中表达”；“LFY基因的启动子不仅在种子萌发后不同阶段的茎端分生组织和幼小的器官原基中表达，而且在早期胚胎发生过程中也有表达”（LFY类基因在茎端分生组织形成及其活动中的作用，刘曼 北京大学 政学者论文集 2001年）。

目前，该领域研究已取得重要进展，为其应用提供了全新概念、方向与选择。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种植物营养生长保持基因系统、公开了一种种子植物无限生长能力利用方法、提出了一种营养生长保持植物的建立方法。本发明建立的种子植物营养生长保持基因系统，可以利用植物无限生长能力，创造出新型高产、优质的营养体利用植物--营养生长保持植物；同时从根本上避免一些植物产生的花粉或果实等对人体与环境所带来的危害。 

（一）种子植物无限生长能力利用及其利用技术途径与方法 

1.种子植物无限生长能力利用的目的：

植物无限生长能力的表现是多方面的，可以从多方面加以利用。对于 

植物无限生长能力的利用可因利用者目的的不同，以及利用的方式、角度、层次、技术途径不同，其产品与结果也完全不同。例如，果树的嫁接、马铃薯以块茎繁殖，是其无限生长能力的体现。

本发明则是利用种子植物无限生长能力，创造营养生长保持植物体，以大幅度的提高营养体利用植物的产量、质量与生产效率。 

2.种子植物无限生长能力利用的基础与前提：种子植物具有无限的生长能力，在本发明技术背景部分中已就种子植物存在着无限生长能力、这种能力的来源以及能力展现条件、限制因素与存在状态作了较为详细的表述。 

种子植物无限生长能力在正常植物中仅能表现为有限生长能力，或呈现“潜在”状态源于种子植物的生命周期，或称生活史。种子植物的生命周期包括三个阶段：1）营养生长阶段，从种子萌发开始，历经幼苗期、营养生长期，到营养体的形态建成。2）生殖生长阶段，始于茎端营养分生组织中生殖分生组织细胞的出现、形成，历经花器官的分化、生殖细胞的形成，到花的形成、开放；3）种子生长阶段，从雌、雄配子结合形成受精卵开始，经分裂、分化、胚的形成、生长，到种子的成熟、植株的死亡结束。 

植物体从营养生长期过度到生殖生长期是由于其茎端营养分生组织异化为生殖分生组织的结果。因此，种子植物无限生长能力利用的基础与前提，就是能否有效的阻止营养分生组织异化为生殖分生组织，使其不能进入生殖生长阶段，进而持续的保持着营养分生组织的状态。 

3.种子植物无限生长能力利用的技术途径与方法： 

种子植物无限生长能力利用从本质上就是在茎端营养分生组织中建立起一套完善的防止其异化为生殖分生组织的机制，目前其可行的其技术途径有两个：

1)阻止或干扰营养分生组织异化为生殖分生组织关键基因或基因系统的表达；

2)在营养分生组织中建立起生殖分生组织细胞的识别与清除机制，这种细胞一经出现即刻被清除。

在上述两种技术方案中前一种技术途径更为主动、积极，但背景复杂，涉及诸多基因与代谢途径，在实施、使用时存在着许多问题：（1）很难用一种基因或基因系统去解决如此多的基因问题；（2）用多种基因去解决也存在诸多技术难题；（3）植物的基因都是异质的，即使能解决某种植物的问题，但往往又缺乏其通用性。 

后一种技术途径实施的基础，是将被异化、或已被异化的细胞具有可以被鉴别、利用的特征、或者标记。这些特征可以是细胞本身的，也可以是人为标记的，例如，茎端营养分生组织中异化生成的生殖分生组织细胞有某一特征的基因开始表达。 

因此，后一种途径更为现实、直接，其效果也更为确切、肯定、彻底。 

本发明所称的种子植物无限生长能力利用方法，是采取基因工程技术手段，打破种子植物正常的生命周期，建立起防止营养分生组织异化的生殖分生组织细胞的清除系统，使其营养生长状态得以持续保持。 

4.防止营养分生组织异化为生殖分生组织细胞的基因系统—种子植物营养生长保持基因系统：该基因系统实质上是在植物茎端营养分生组织中出现的生殖分生组织细胞中，开始表达启动子控制的细胞致死因子基因。 

5.种子植物营养生长保持基因系统的作用机制：将营养生长保持基因系统转入种子植物并整合于核基因组，当生殖分生组织细胞在营养分生组织中形成、出现时，这一基因开始表达，产生细胞致死因子，导致该生殖分生组织细胞自杀；出现一个，清除一个；出现多少，清除多少，一个不留，使茎端分生组织持续保持着营养分生组织状态。 

6.种子植物无限生长能力利用最终实现建立起营养生长保持植物为目标的，需要将种子植物营养生长保持基因系统转入植物体。 

（二）营养生长保持基因系统及其组成、结构与核酸序列： 

在营养分生组织中建立生殖分生组织细胞的清除基因系统，即营养生长保持基因系统，有两个基本的作用：1）阻止，或清除生殖器细胞的技术途径；2）阻止，或清除应具有高度的时、空特异性，只能摧毁生殖分生组织细胞，而不能伤及其它的任何组织、器官。

植物营养生长保持基因系统应包括营养生长保持基因、以及必要时设置的限定或消除其非靶标细胞毒性的基因或基因装置，其中营养生长保持基因包括在植物生殖分生组织阶段开始表达的启动子、细胞致死因子基因与终止子三部分：

（1）严格、准确的在植物生殖分生组织细胞中开始表达的启动子

启动子表达的终点与表达持续时间无限定，可短、可长，可以持续到花器官的分化、形成、开放、凋谢，但其具有严格的组织器官与发育阶段特异性，即同时满足以下条件：①组织器官特异性：仅在生殖分生组织细胞及其分化的生殖器官原基细胞中表达，而不在非靶标的根、茎、叶与营养分生组织细胞中表达；②发育阶段特异性：仅在生殖分生组织细胞出现之后及其存续期间，至迟在生殖器官原基形成之前开始表达，其中以在生殖分生组织细胞出现早期开始表达为佳；不能在其之前的营养分生组织细胞或者更早的早期胚胎发生过程中开始表达；也不能在其生殖器官原基形成之后才开始表达；③具有适宜的强度，即其启动表达的细胞致死因子表达量足以致死宿主细胞。

基因启动子的选择只有上述两个时、空标准，而与其基因本身的功能无关，可以是与生殖器官发育有关的基因，也完全可以是与生殖器官发育无关的其它基因的启动子，其中包括但不限于拟南芥的AtREM1基因的启动子。从拟南芥基因数据库中，可以发现与生殖分生组织有关的基因大约有731个（包括重复的及部分基因片段），其中AtREM1基因是第一个定位于拟南芥茎端营养分生组织出现的生殖分生组织细胞中开始表达的基因，即在营养分生组织中央出现有限几个细胞时，AtREM1基因即在其中开始表达（Expression of AtREM1 is developmentally regulated, being first localized in a few central cells of vegetative apical meristems and later expanding to the whole inflorescence meristem, as well as primordia and organs of third and fourth floral whorls.）。原位杂交与PCR的检测结果显示，该基因在植株的根、茎、叶与茎端营养分生组织中都不表达，仅在生殖分生组织细胞中表达（AtREM1, a member of a new family of B3 domain-containing genes, is preferentially expressed in reproductive meristems. Franco-Zorrilla JM,等 2002 Feb;128(2):418-27.）。 

这类基因的发现提供了生殖分生组织细胞被识别特征及其被清除的依据： 

①作为被识别的特征包括表达产物与表达的时、空特异性两个方面；

②作为被清除的依据，是建立在被识别的基础之上的，可以将其表达的时、空特异性作为特征，标记植物。

这为识别、清除植物茎端营养分生组织中出现生殖分生组织细胞，即防止营养分生组织异化技术系统的建立提供了依据与可能。 

（2）可致细胞失活、死亡的基因或基因装置： 

植物生殖分生组织细胞致死基因或基因装置的选择，需满足以下基本条件：①其表达物，或其代谢产物能导致细胞自杀、死亡；②适用面广，具有种子植物的通用性;③无非靶标宿主细胞毒性，或经过对其编码序列的修饰、改造，或设置限制或消除非靶标宿主细胞毒性基因装置措施后无此毒性。

其表达、或代谢物能直接或间接抑制、干扰细胞基础代谢、导致细胞失活、死亡的基因或基因装置有多种，例如DNA酶、RNA酶、真核细胞核糖体失活蛋白、以及基础、关键代谢酶基因RNA干扰体等，其中仅核糖核酸内切酶酶（RNA酶）就有来源于拟南芥的RNS1、RNS2、RNS3等、来源于解淀粉芽孢杆菌的Barnase。拟南芥RNS1、RNS2、RNS3等来自植物的核糖核酸内切酶基因，在植物中应用不存在表达障碍。 

一个优选的细胞致死因子基因是来源于解淀粉芽孢杆菌的核糖核酸酶Barnase基因。该基因有两个突出的特点，其一是活性特别强:一个细胞中只要有一个copy表达就可以导致细胞死亡；其二是Barnase有一个天然的抑制剂基因Barstar，可以控制其对非靶标细胞的伤害。 

(3)终止子：能在植物中有效终止mRNA的转录，满足基因表达的需要的终止子。 

一个优选的植物营养生长保持基因系统包括由在拟南芥AtREM1基因的启动子、Barnase编码基因与豌豆rbcs 3A终止子构成的基因（AtREM1P-Barnase-3AT, RBN）构成的营养生长保持基因和抑制剂基因Barstar。 

其中，Barstar基因（X15545.1 GI:1155006）具有限定或消除Barnase编码基因非靶标细胞毒性的功能，其来源于解淀粉芽孢杆菌，全长474bp。该基因可以在原核生物中表达，抑制Barnase的细胞毒性；但其在植物中不能表达。 

（三）营养生长保持植物株系及其建立技术途径与方法 

以上述种子植物营养生长保持基因系统建立营养生长保持植物的方法，主要包括以下步骤：种子植物营养生长保持基因系统及其表达载体的构建、基因转化植物、转化体鉴定。

将携带营养生长保持基因系统的植物表达载体转入种子植物体的方法或技术系统已很成熟，简单介绍如下： 

1.载体构建：在本发明中，首先应依次构建出含有上述种子植物营养生长保持基因系统的克隆载体、表达载体。

2.目的基因转化植物：转入植物体的方法有多种，如本领域技术人员所熟知的农杆菌介导法、基因枪法等。本发明的一个优选实施方案为农杆菌介导转化法，该转化法是先将携带目的基因的质粒转入农杆菌，利用农杆菌侵染植物，将目的基因转入植物，再通过抗性选择、分化等程序，最终获得阳性植株。 

3.转化体的鉴定：对于转化后经过抗性选择获得的阳性材料，要进行不同层次的鉴定，包括组织化学（GUS）、DNA水平（Southern分析）、RNA水平（Nouthern）、蛋白质水平（Western），以确认营养生长保持基因系统是否真正整合于转化植物的核基因组，是否转录、表达。这些对基因转化体的鉴定方法都已经是很成熟的技术。 

4.转基因植株营养生长特性及其它形态学的鉴定：将经过分子、组织化学鉴定的转基因植株与对照材料同时植于温室或其它相同的环境条件下，以观察其营养生长特性、生殖器官发生情况及其它形态学特性。 

本发明具有积极有益的效果： 

本发明营养生长保持基因系统在植物中表达可使植物持续保持营养生长期的生长状态，建立起营养生长保持植物，具有诸多的特点与优点。

1.速生，营养体的生产效率高：这表现在两个层次，其一是营养生长保持植物株系，叶的数量要较正常植物高得多，叶多光合面积大，总生物量高，这是其速生的物质基础；其二是营养生长保持植物的营养生长量等于总生物量，营养体所占的比率高。 

2.目的产品质量优良：一般植物营养体的速生往往是建立在总生物量并未增加，而是以降低密度，或营养成分为代价，获得其体积或重量的增大的基础上的；而营养生长保持植物的品质是建立在总生物量大的物质基础之上的；一般植物发育到生殖生长阶段之后，茎、叶中的营养物质即会加速转入生殖器官，导致其茎、叶等营养体食用，或经济性状品质的劣化；而营养生长保持植物因其不会形成生殖器官，因而不会发生其营养物质的转移，所以可以很好的保持着茎、叶等营养体的品质。 

3.环保，无污染：营养生长保持植物无生殖器官，不会因花粉（过敏原）、果（毛）、种（毛）造成对人体的危害与环境的污染。 

4.生态安全：营养生长保持植物无生殖器官(包括花序、花、子房、花药、花粉、果实、种子)，不会发生基因的飘逸与扩散，对生态安全。 

5.本发明所构建出的营养生长保持植物可以通过无性繁殖的方式扩大种群，可以保持种优良特性：这种繁殖方式不会发生种的分离或退化，且繁殖的种苗旺盛，生长势强。 

6.本发明构建的营养生长保持植物，既不同于野生植物、常规品种、杂种优势利用体系中的不育系，也不同于与花形成相关基因突变导致的畸形花植物体，其命运也不同，具体表现在：前者遵从常规植物生命周期的限制；而本发明所构建的营养生长保持植物，打破了植物生命周期的限制，使其不进入生殖生长期，可持久的保持着营养生长状态。 

7.本发明适用于所有营养体利用种子植物，无论是天然种、农家种、优良品种，还是具有优势的杂种。应该说明，营养体利用植物是以人们对植物营养器官的需要作为分类标准的，而大多数植物的营养体与籽实体对人都是有价值的，只是价值的主次、大小、轻重不同而已。因此，同一种植物因其追求的目的不同，有人将其归为籽实体植物，例如玉米，但将其作为青储饲料时则归为营养体植物；核桃、樱桃、梨树可作为籽实体植物，但将其作为用材树时，则归为营养体植物。 

8.本发明基因系统可以应用于现代农业、林业、牧草业、园林绿化、环境与生态保护、生物能源、生物医药、生物制造与轻化工业领域的植物，都可以在原来的基础上大幅度提高其生产效率、产量、效果与效益。 

附图说明

图1.为营养生长保持基因系统（BTg-RBN）结构示意图 

营养生长保持基因系统（BTg-RBN）全长2244bp， 5′、3′端的酶切位点分别为NdeⅠ、EcoRⅠ。该基因系统由Barstar基因（BTg 474bp）与营养生长保持基因(RBN 1745bp)两个基因组成；其中营养生长保持基因由拟南芥AtREM1基因启动子AtREMp(918bp)、Barnase基因编码序列(333bp)、3A终止子3AT(478bp)3个基因片段组成;启动子与编码基因间的酶切位点为BamHⅠ，编码基因与A3终止子之间的酶切位点为SacⅠ。

图2为转BTg-RBN烟草PCR鉴定结果图谱 

图中，1、8：DL2000 Marker； 2：阳性对照 (+)；3：阴性对照 (-)；4-7：4个转基因株系。PCR产物片段长度为611bp，与预期结果一致。结论：营养生长保持基因系统已整合于烟草核基因组中。

图3为移栽120天的转BTg-RBN烟草与对照烟草的对照图 

图中，1、2 转BTg-RBN烟草，3、4为普通烟草（对照），顶生花枝上的果实已经成熟，第二茬花已放花；植株的总叶23～24片，下部叶大部分已经干枯、脱落，尚存的仅有3～5片，已开始变黄、老化、下垂。转BTg-RBN烟草1、2与对照相比，在开花前生长势、株高、叶片数无明显差异；在对照开始开花后，转BTg-RBN的烟草生长势特别旺盛，整个植株鲜嫩、生长速度明显加快，叶片增多，总叶数达40片左右，植株上的可见叶达20多片，是对照的4～5倍左右，且叶片变大、增厚，叶色变深绿。

图4为移栽150天的转BTg-RBN烟草与对照烟草的对照图 

图中，1、2、3为转BTg-RBN烟草，4、5、6、7为普通烟草（对照）。普通烟草高82～87cm,果实、种子已成熟，植株在衰亡；转BTg-RBN烟草1、2、3，生长势旺盛，叶片多、大，颜色深绿，幼嫩；植株加速生长，已大幅度高于对照。

图5为移栽190天的转BTg-RBN烟草与对照烟草的对照图 

图中，1、4为转BTg-RBN烟草，2、3为普通烟草（对照）；普通烟草高82～87cm,果实、种子已成熟，植株已干枯、死亡；转BTg-RBN烟草1、4生长势旺盛，叶片已达70多片，颜色深绿、幼嫩；植株加速生长，高度已达170cm左右，为对照高度的2倍多。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步阐述本发明。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料及试剂，如无特别说明，均购自常规生化试剂商店。 

实施例1  种子植物营养生长保持基因系统（BTg-RBN）的构建 

（1）Barstar基因的克隆：

Barstar基因以PCR合成。模板为淀粉芽孢杆菌核DNA，正、反向引物分别为：BTF1 5'- GTCCAATCTGCAGCCGTCCGAGACA -3'，BTR1 5'- CGATTCAGGCGGCTG

ATATTCTCCA -3'。

将合成的Barstar基因片段直接插入TaKaRa公司的pMD20-T载体，测序确认,构建成pMD20-BTg质粒。 

（2）RBN启动子、编码序列、终止子片段的克隆: 

RBN基因由在拟南芥生殖分生组织开始表达的AtREM1基因启动子、Barnase基因编码序列、3A终止子3个片段组成。这三个基因片段全部是利用PCR技术克隆的。

基因启动子：片段序列的来源为AL161579（82727-83643bp），长919bp;5’，3’端的酶切位点分别为HindⅢ-SphⅠ-PstⅠ、BamHⅠ。PCR模板为拟南芥核DNA；正、反向引物分别为：REMF1 5' -CGCCTGCAGCACCCCTACTAACTAAATCGATCA- 3'；REMR1 5'-CATGGATCCTGTTGAATACACTTCAAAAATCTC-3'。 

Barnase基因编码片段：片段序列的来源为 X12871 (1 -333bp)，长333bp；5’、3’端的酶切位点分别为BamHⅠ、SacⅠ；PCR模板为淀粉芽孢杆菌核DNA，正、反向引物分别为：BNF1 5'-GGGGGATCCATGGCACAGGTTATCAACACG-3'，BNR1 5'-CCCGAGCTCTTATCTGATTTTTGTAAAGGTCTG-3'。 

3A终止子：片段序列的来源AF309825 (4248-4717bp),长467bp;5’、 3’端的酶切位点分别为SacⅠ、EcoRⅠ。PCR模板为豌豆核DNA；正、反向引物分别为：3AF1 5'-ACGAGCTCAGTCGATCCAGGCCTCCCAGCTTTC-3'，3AR1 5'-AAGAATTCAAAGCCTATACTGTACTTAACTT-3'。 

以PCR技术克隆的AtREM1基因启动子、3A终止子分别插入pMD19-T载体，经DNA测序确认。 

（3）RBN基因部分片段的重组 

克隆载体为pUC19质粒。分别以相应的酶将AtREM1启动子、3A-Ter从pMD19-T载体中切出，插入同一pUC19质粒的相应位点，获得pUC-AtREM1p-A3.Ter质粒。

（4）种子植物营养生长保持基因系统（BTg-RBN）的构建 

以pMD20-BTg质粒为载体。以BamH1酶切pMD20-BTg质粒，补平，再以EcoR1酶切，回收载体片段。以Pst1酶切pUC-AtREM1-A3质粒，补平，再以EcoR1酶切，回收AtREM1p-3A.Ter片段。将pMD20-BTg载体片段与AtREM1p-3A.Ter片段连接，构建成pND20-BTg-AtREM1p-3A.Ter质粒。

分别以BamH1、Sac1酶切pND20-BTg-AtREM1p-3A.Ter质粒、Barnase片段，并分别pND20-BTg-AtREM1p-3A.Ter载体、Barnase片段，进行连接，构建成营养生长保持基因系统（pMD20-BTg-RBN）。 

RBN-BTg基因系统的结构见附图1；序列见SEQ ID NO:1。 

实施例2  种子植物营养生长保持基因系统(BTg-RBN)植物表达载体的构建 

构建的营养生长保持基因只有装入植物表达载体，转入植物体，才能在植物体中呈现功能，发挥作用。

迄今已经建立起多种植物掌握表达载体，并各具特色，如pBI121、pCAMBIA系列等。本实施例优选表达载体为pCAMBIA3301。该载体带有根瘤农杆菌Ti质粒的T-DNA的左、右边界LB、RB，可以用农杆菌介导方法转化植物；其在植物中的选择标记是Bar。 

营养生长保持基因系统RBN.BTg表达载体的建立，是以HindⅢ、EcoRⅠ将RBN-BTg片段从克隆载体中切下来，插入植物表达载体pCAMBIA3301质粒完成的。 

实施例3 营养生长保持植物体的鉴定 

通过检测转化植物的核基因组是否存在（AtREM1-Barnase-3A）基因片段，或相关片段来确认的。其鉴定程序同一般转基因植物，所用上、下游引物可分别为：RB_tF：5'-TTAGTAGGATTCTGGTGTGTGGG-3'；RB_tR：5'-TTCGATTTTTAATAGATTCGGTTTT-3'。片段长度为611bp（包含AtREM1部分启动子及Barnase编码序列和3A的部分终止子序列）。

对于栽植后多年才能出现生殖器官的植物，可将经过鉴定的转基因植株材料直接嫁接于成年树上（并设对照），以最终确定能否产生殖器官、生长特性及其它形态学特性。一般2～3年时间，即可鉴定出转化植株是否为真正转基因株系，及其它特征。 

实施例4  营养生长保持烟草的建立 

应该特别指出的是，虽然下述实例是以转基因烟草的效果描述本发明的。但这并不意味着本发明营养生长保持基因只能用于生产无生殖器官烟草。给出以下实施例的目的是举例详细描述本发明，而不构成对本发明权利要求保护范围的限制。

以携带植物营养生长保持基因的pCAMBIA3301-BTg-RBN质粒的农杆菌LBA4404转化烟草(K326品种)，获得的转基因株系，见附图4、5。 

应该特别指出的是，虽然下述实例是以转基因烟草的效果描述本发明的。但这绝不意味着本发明营养生长保持基因只能用于生产无生殖器官烟草。给出以下实施例的目的是举例详细描述本发明，而不构成对本发明待批权利范围的限制。 

以携带植物营养生长保持基因的pCAMBIA3301-BTg-RBN质粒的农杆菌LBA4404转化烟草(K326品种)，获得的转基因株系，见附图4、5。 

（1）营养生长保持植物（烟草）的生长、发育特性与形态描述： 

在此需要作三点说明：①烟草品种、来源及栽培管理：转基因烟草及对照均为K362；采用同一批烟草试管苗为材料、同时通过转化/组织培养程序获得的，同时栽植、同样管理；②本实验是在实验室进行的，既不是温室、田间，也不是人工气候室，因此，作为对照的普通烟草的生长、发育与正常栽培条件下的有所不同；试验栽培期间为2006年3月12日～2007年2月10日；③这些特点是以普通烟草作为参照物说明的，使用的一些名词也是借用普通植物的描述方式。

（Ⅰ）在植株营养生长阶段，即植物体生殖生长开始之前，植株的形态特征与普通烟草无异。 

（Ⅱ）普通烟草由营养生长转入生殖生长阶段，即生殖分生组织发生与形成时期，是营养生长保持烟草与普通烟草形态特征出现差异的分界线。 

（Ⅲ）普通烟草进入生殖生长后，作为营养器官的叶片依次变小；而营养生长保持烟草的营养体却朝着完全相反的方向加速发展，叶片增加，并逐渐变大、厚；叶片颜色变深绿；茎变粗；生长势旺盛；其高生长加速，株高达普通烟草的2倍多。 

（Ⅳ）生长势旺盛、不衰老： 

普通烟草：移栽到花盆后90天左右顶部出现花序，并陆续开花，150天左右种子成熟，植株开始衰老、死亡。

营养生长保持烟草：移栽到花盆后80天左右开始生长势明显加快，颜色变深，叶片变多、大；150天时其高度明显超过普通烟草，并持续保持旺盛的生长状态，不衰老，高度近200cm，是对照的2倍多。 

（Ⅴ）株型： 

营养生长保持烟草：主茎优势明显，以高生长为主，几乎没有分叉、侧枝。营养生长保持烟草植株的茎、叶、株高等参数，见表1；而普通烟草：烟草花序下叶腋萌生新枝，并发育成新的花序，开花。

 表1：营养生长保持烟草植株茎、叶、株高主要参数 

	株高(cm)	茎粗(mm)	叶片数	最大叶片(cm)	最大单叶干重(g)
						对照1	82	13	20	28×15	2.3
对照2	87	17	24	33×17	2.8
						对照3	83	15	23	31×16	2.4
转基因株1	＞168	19	＞79	38×19	5.1
						转基因株2	＞210	22	＞83	41×21	5.9
转基因株3	＞217	23	＞85	45×23	6.1
						转基因株/对照	2.36	1.41	3.68	长1.2/宽1.3	2.28

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

SEQUENCE LISTING

 

<110>  河南省天茂生物有限公司

   

<120>  植物营养生长保持基因系统、营养生长保持植物的建立及种子植物无限生长能力的利用方法

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  2244

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<221>  BT-RBN

<222>  (11)...(2238)

<223>  营养生长保持基因系统

 

<220>

<221>  BTg

<222>  (11)...(484)

<223>  Barstar gene

 

<220>

<221>  RBN

<222>  (494)...(2238)

<223>  营养生长保持基因

 

<220>

<221>  ATREM1p

<222>  (494)...(1411)

<223>  ATREM1 promotor

 

<220>

<221>  Barnase

<222>  (1418)...(1753)

<223>  Barnase CDS

 

<220>

<221>  3AT

<222>  (1761)...(2238)

<223>  Pea rbcS-3A terminator

 

<400>  1

catatggatt gtccaatctg cagccgtccg agacaggagg acatcgtcca gctgaaaccg       60

 

gggcagaatc cggccatttc tgaagagaaa aatggtaaac tgatagaata aaatcataag      120

 

aaaggagccg cacatgaaaa aagcagtcat taacggggaa caaatcagaa gtatcagcga      180

 

cctccaccag acattgaaaa aggagcttgc ccttccggaa tactacggtg aaaacctgga      240

 

cgctttatgg gattgtctga ccggatgggt ggagtacccg ctcgttttgg aatggaggca      300

 

gtttgaacaa agcaagcagc tgactgaaaa tggcgccgag agtgtgcttc aggttttccg      360

 

tgaagcgaaa gcggaaggct gcgacatcac catcatactt tcttaatacg atcaatggga      420

 

gatgaacaat atggaaacac aaaccctcag ctatccgatt ggagaatatc agccgcctga      480

 

atcgaatcgg atcgcacccc tactaactaa atcgatcaga aacatcccta atcgaattga      540

 

atttgaagaa acagagcact aaagaaggag actacagtac ctaatggacg aggtaggctc      600

 

catttcagct tgaacctcca tggggaaaga agagtgattt gagttataaa tctttggaaa      660

 

attcctctca gggtacacgt ttcttggcag attcaacgtg atttagacgc atttcgagaa      720

 

gaaagagcga ttaaaaatta cttctttatc agattttcat ttcaatttac agtttttttc      780

 

ccttggattg aggatcttag ttcttaagcg aggttacagc tttttccagt ggattactaa      840

 

attggacgag agagtaatag tcaacactca aaaagtcttt aaccttctgt cggaacaaga      900

 

agggcttgct gtccgttgct catctcatat agtaaggccc aaaaggccca aaggcttctt      960

 

tttccaatta aaactaattt ttgtatagcg aaattatgat gaagaaaatc gtttcatggc     1020

 

acgtcaaaaa actttcgcac aacaattttt ttttacaaaa gggtcacttt tatcagaacc     1080

 

taatctatca tagagttccc atcaacaaaa aacctatcat agagtctagt cctgtgttaa     1140

 

cgtaggtgat gggttggttt catggtttac atggacaatt attatggtgt aagaaaaaga     1200

 

tgatgggtac acatattcca tttaaccaat gtgaaagatt cacatcacct ttttcgattt     1260

 

ttaatagatt cggttttacc ttctcgtaac gtaattctaa gaaaagaaaa cgtcaatcat     1320

 

atttactagg aaagataatt ataatttatt gctttttctc tcactctctg acctgaaatc     1380

 

tcctactgag atttttgaag tgtattcaac aggatccatg gcacaggtta tcaacacgtt     1440

 

tgacggggtt gcggattatc ttcagacata tcataagcta cctgataatt acattacaaa     1500

 

atcagaagca caagccctcg gctgggtggc atcaaaaggg aaccttgcag acgtcgctcc     1560

 

ggggaaaagc atcggcggag acatcttctc aaacagggaa ggcaaactcc cgggcaaaag     1620

 

cggacgaaca tggcgtgaag cggatattaa ctatacatca ggcttcagaa attcagaccg     1680

 

gattctttac tcaagcgact ggctgattta caaaacaacg gaccattatc agacctttac     1740

 

aaaaatcaga taacgagctc agtcgatcca ggcctcccag ctttcgtccg tatcatcggt     1800

 

ttcgacaacg ttcgtcaagt tcaatgcatc agtttcattg cccacacacc agaatcctac     1860

 

taagtttgag tattatggca ttggaaaagc tgttttcttc tatcatttgt tctgcttgta     1920

 

atttactgtg ttctttcagt ttttgttttc ggacatcaaa atgcaaatgg atggataaga     1980

 

gttaataaat gatatggtcc ttttgttcat tctcaaatta ttattatctg ttgtttttac     2040

 

tttaatgggt tgaatttaag taagaaagga actaacagtg tgatattaag gtgcaatgtt     2100

 

agacatataa aacagtcttt cacctctctt tggttatgtc ttgaattggt ttgtttcttc     2160

 

acttatctgt gtaatcaagt ttactatgag tctatgatca agtaattatg caatcaagtt     2220

 

aagtacagta taggctttga attc                                            2244

Claims (6)

1.一种植物营养生长保持基因系统，其特征在于，它由营养生长保持基因和限定或消除前述基因的非靶标细胞毒性的基因构成，所述营养生长保持基因由启动子、细胞致死因子基因、终止子组成；

所述启动子满足以下条件：①组织器官特异性：仅在生殖分生组织细胞及其分化的生殖器官原基细胞中开始表达，而不在非靶标的根、茎、叶与营养分生组织细胞中表达；②发育阶段特异性：仅在生殖分生组织细胞出现之后至生殖器官原基形成之前期间开始表达；③具有适宜的强度，即其启动表达的细胞致死因子表达量足以致死宿主细胞；

所述启动子为拟南芥AtREM1基因的启动子；

所述细胞致死因子基因满足以下条件：①细胞致死因子基因的表达物，或其代谢产物能导致细胞自杀、死亡；②无非靶标宿主细胞毒性，或经过对其编码序列的修饰、改造，或设置限制或消除非靶标宿主细胞毒性基因装置措施后无此毒性；所述细胞致死因子基因非靶标宿主细胞毒性基因为Barnase基因，其对应的限制非靶标宿主细胞毒性的基因为Barstar基因；

所述终止子为能在植物中有效终止mRNA的转录，满足基因表达的需要的终止子，所述终止子为农杆菌的NOS-ter、或为豌豆的rbcs3A终止子。

2.根据权利要求1所述的植物营养生长保持基因系统，其特征在于，所述营养生长保持基因系统由拟南芥AtREM1基因的启动子、Barnase基因、3A终止子及Barstar基因构成，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.一种以权利要求1所述的植物营养生长保持基因系统建立营养生长保持植物的方法，包括以下步骤：种子植物营养生长保持基因系统及其表达载体的构建、基因转化植物、转化体鉴定，其特征在于，在构建种子植物营养生长保持基因系统的过程中，先将Barstar基因置于克隆载体，然后再插入Barnase基因，以保证营养生长保持基因系统结构与功能的完整与正确。

4.一种种子植物无限生长能力利用方法，其特征在于，将权利要求1所述的植物营养生长保持基因系统整合于种子植物核基因组，建立起营养生长保持植物，按照既定的组织器官与发育阶段特异性准确、正确的开始表达，使茎端分生组织持续保持营养分生组织状态，进而使植物体无限制的保持着营养生长状态，即具有以下生长状态：

1)持续的保持着营养生长期的生长状态，表现为叶多、茎高、植株生长速度快、不易衰老，营养体生产效率高，品质好，顶端优势强，以高生长为主；

2)持续的保持着无生殖器官状态，即无任何的生殖器官，包括花、花粉、果实、种子。

5.含有权利要求1或2所述种子植物营养生长保持基因系统的克隆载体。

6.含有权利要求1或2所述种子植物营养生长保持基因系统的表达载体。

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