CN106834345A

CN106834345A - 一种多基因叠加共转化提高油菜综合抗逆性的方法

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Publication number: CN106834345A
Application number: CN201611225064.7A
Authority: CN
Inventors: 王道杰; 杨翠玲; 王再青; 宋纯鹏; 张骁
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2016-12-27
Filing date: 2016-12-27
Publication date: 2017-06-13
Anticipated expiration: 2036-12-27
Also published as: CN106834345B

Abstract

本发明属于植物基因工程研究技术领域，具体涉及一种多基因叠加共转化提高油菜综合抗逆性的方法。该方法包括：多基因植物表达载体的构建、载体的鉴定、载体转化农杆菌、制备转化液、浸花法转化油菜、筛选、鉴定、自交获得纯合体等步骤；所述多基因植物表达载体中，包含依次串联的5种抗逆功能基因和3种选择标记基因，具体排列顺序为：LB‑HYG –GUS‑BAR‑ ICE1‑ LOS5 ‑CBF3‑ABAR‑NCED3‑RB。本发明通过优化抗性基因组合，并将多个抗逆关键节点基因构建于同一表达载体中。在将该载体转化植物体后，一次转化即可使植物体能够同时适应多种逆境条件，提高植物的综合抗逆能力，表现较好的生产应用价值。

Description

一种多基因叠加共转化提高油菜综合抗逆性的方法

技术领域

本发明属于植物基因工程研究技术领域，具体涉及一种多基因叠加共转化提高油菜综合抗逆性的方法。

背景技术

油菜属十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)，是世界上最重要的油料作物之一，其应用遍及生产生活的各个领域。当前油菜育种工作者面临的主要问题是培育油菜高抗新品种来适应因全球气候变化导致的非生物和生物胁迫日渐频繁等问题。利用遗传工程改良油菜品种在一定程度上克服了传统育种模式基因交流范围局限性的问题，是油菜育种工作可资利用的有效途径之一。

干旱、盐碱化、极端气候等非生物胁迫严重影响作物产量潜力的发挥。干旱所造成的损失几乎是其它自然灾害所造成损失的总和。因此，如何通过提高作物的抗逆能力来增加作物产量，已成为农业可持续高效发展的重大需求。作物抗逆育种的主要任务就是聚合存在于不同种质资源中的有利基因，为农业生产培育优良的品种。由于植物耐逆性是多基因控制的复杂的数量性状，不同抗逆信号通路之间又存在交叉对话，因此，相对于单基因转化，将抗逆信号通路中的关键节点基因采用多基因叠加共转化的方式提高植物的抗逆性具有许多不可替代的优点。但现有技术中尚未见到这一方面较好的应用报道。

发明内容

本发明目的在于一种多基因叠加共转化以提高油菜综合抗逆性的方法，该方法通过多基因叠加共转化，将含五种抗逆基因表达载体同时转入油菜，从而提高油菜对多种胁迫的综合适应能力。

本发明所采取的技术方案详述如下。

一种多基因叠加共转化提高油菜综合抗逆性的方法，包括如下步骤：

（1）多基因植物表达载体的构建

通过Gateway技术，结合Cre/Loxp重组系统和λ噬菌体位点特异性重组系统，以多轮重组叠加的方式构建了pABA-oriT载体，该载体的T-DNA区的克隆基因表达盒包含了依次串联的5种抗逆功能基因和3种选择标记基因；

所述5种抗逆功能基因包括：2个ABA合成相关基因NCED3、LOS5，1个ABA信号途径相关基因ABAR，2个抗冻调节基因ICE1、CBF3；

所述3种选择标记基因包括潮霉素抗性基因HYG、GUS和草铵膦抗性基因BAR；

5种抗逆功能基因和3种选择标记基因在pABA-oriT载体T-DNA区的具体排列顺序为：LB-HYG–GUS-BAR-ICE1-LOS5-CBF3-ABAR-NCED3-RB；

需要解释的是：

5种抗逆功能基因由2类启动子进行驱动表达，具体而言：

ICE1和LOS5基因由pSuper组成型超表达启动子驱动，该启动子的组成元件为：在甘露碱合成酶启动子的上游依次加入甘露碱合成酶转录激活域和三个章鱼碱合成酶转录激活域（Lee at.al.，2007，Novel plant transformation vectors containing thesuperpromotor. Plant physiology 145: 1294-1300）；

CBF3、ABAR和NCED3三个基因由胁迫诱导型超表达启动子pRD29A驱动；

3种选择标记基因均由35S启动子驱动表达，以此3种选择标记基因作为后期转基因植物的筛选标记；

（2）对步骤（1）中所构建的重组表达载体的鉴定

首先，利用PCR鉴定方法对步骤（1）中所构建的重组表达载体进行鉴定，以确保5种功能基因共存于同一表达载体中，PCR鉴定时，设计的引物序列如下：

NCED –F：5' AACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTT 3'，

NCED-R：5' TAGTGTTGGATTCTTTGGCTTTGG 3'；

ABAR-F：5' AACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTT 3'，

ABAR-R：5’ ACTTTAATCGCCAATTCCTCGACG 3’；

CBF–F： 5' AACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTT 3'，

CBF-R： 5’ TTGAAATGTTCCGAGCCAAATCCT 3’；

LOS5-F：5’ ATAGATACGCTGACACGCCAAGCC 3’，

LOS5-R：5’ CTATAAGGTCACTGGTGGCCGAAC 3’；

ICE1-F：5’ ATAGATACGCTGACACGCCAAGCC 3’，

ICE1-R：5’ CTCTTCCCTTTCTCCACCACCACC 3’；

其次，对PCR鉴定正确的重组表达载体进一步进行测序验证，以确保5种功能基因的表达框完整正确；

（3）对步骤（2）中鉴定正确的重组表达载体转化农杆菌，制备转化液

将步骤（2）中鉴定正确的重组表达载体质粒电击转化农杆菌感受态细胞，具体步骤参考如下：

吸取1~2μL质粒加入到100μL农杆菌感受态细胞中，2.5KV电击转化5ms，然后迅速加入1mL SOC培养基，28℃、200rpm振荡复苏培养1~2 h；

取200μL菌液涂布于含50 mg/L 卡那霉素、50 mg/L庆大霉素、10 mg/L四环素的YEB固体培养基平板上，28℃倒置培养1~2d；然后挑选阳性克隆进行PCR鉴定；

首先，挑取2~3个PCR鉴定正确的阳性单克隆菌斑混合（以防单个克隆小质粒丢失影响转化效率）接种于YEP液体培养基（含50 mg/L卡那霉素、50 mg/L庆大霉素、10 mg/L四环素）中，28℃、220 rpm恒温振荡培养至OD₆₀₀= 0.6左右；

然后，取1 mL菌液接种至500 mL的YEP液体培养基（含25 mg/L卡那霉素、25 mg/L庆大霉素、5 mg/L四环素）中，28℃、220 rpm恒温振荡培养至OD₆₀₀ = 1.0~1.5左右；

最后，4000 rpm室温离心15 min，弃上清，将富集的菌种用转化Buffer重悬，稀释至OD₆₀₀ = 0.8~1.0左右，即为转化液，备用；

所述转化Buffer，为1/2 MS培养液+5%质量分数蔗糖+0.05%体积分数Silwet-L77+0.01mg/L的6-BA+8 mg/L的乙酰丁香酮（acetosyringone）；

需要注意的是，转化Buffer及转化液需现用现配；

（4）采用农杆菌介导的浸花法（Flower-dip）转化油菜

首先，对油菜进行预处理，将油菜种子播种后，在油菜第一朵花开放后的2~3天内，于转化的前一天，选择生长健壮的植株，去掉多余分枝（即去除多余侧花序），每株仅保留主花序及2~3枝生长状态较好的侧花序，摘除已开花朵以及花序顶端直径小于5 mm的小花蕾，将保留花序套袋待转化用；

其次，转化时，将整个花序浸入转化液中浸泡90~120秒，期间轻轻晃动转化液，以防止农杆菌沉淀，从而影响转化效果；

转化后套袋并挂牌标记；

优选情况下，相同操作方式及方法，隔天转化1次，连续转化3次；

最后，在最后一次转化后，继续套袋5天后去袋，剪掉多余的正在开放的花朵和未开放花蕾，使转化荚果正常生长，直至成熟后，按单株收获种子；

需要说明的是，所述油菜具体例如为甘蓝型油菜，室外转化操作时为避免白天紫外线过强对农杆菌活力造成影响，转化操作优选在傍晚时分进行；

（5）转化体的筛选和鉴定

将步骤（4）中所收获油菜种子播种，播种7~10天后，在油菜幼苗心叶刚长出时，喷施50mg/L除草剂 Basta（主要成分为草铵膦），隔日一次，共三次；

对对Basta表现出抗性的油菜幼苗进行潮霉素抗性筛选，具体为：在四叶期时，在油菜幼苗完全舒展的第三片真叶表面涂抹50 mg/L潮霉素，进行潮霉素抗性筛选；

对对Basta和潮霉素均表现出抗性的油菜幼苗，取其叶片，提取基因组DNA进行PCR鉴定和测序鉴定，PCR鉴定时所用引物序列同步骤（2）中引物序列；

（6）转化体自交获得纯合体

对步骤（5）中筛选、鉴定正确的转化体继续培养，于花期时套袋，使其自交，收获单株种子；

对收获的种子继续种植，同步骤（5）操作，继续进行Basta抗性、潮霉素抗性、PCR鉴定和测序鉴定，并对鉴定正确的转化体继续自交；

经4代连续自交鉴定后获得转化纯合体，即具有综合抗逆特性的转基因油菜。

（7）对筛选所获得转基因油菜进行抗逆特性分析

对步骤（6）中所获得的转基因油菜种子，在播种后，可进一步对其表型、农艺性状进行分析，另外可对其在不同胁迫条件下生长状况时的叶温、气孔开度、失水率、脱落酸（ABA）含量、丙二醛（MDA）含量等生理指标变化情况进行测定，从而综合判定转基因油菜的抗逆能力和生产应用潜力。

一种培育具有综合抗逆性油菜新品种的方法，该方法通过多基因叠加共转化法实现。

和现有技术相比，本发明方法的有益效果：

植物的许多性状如产量、抗逆性等由多基因控制，运用遗传工程方法改良这些由多基因控制的性状，必须进行多基因的叠加组合。传统的多基因转化方法主要有：1）将多个基因分别转化不同植株，然后通过杂交成功获得多基因转化体；2）多个基因分别构建于不同表达载体，通过重转化获得多基因转化植株。这些方法费时费力、周期较长，限制了它们在应用领域的优势。

本发明通过优化抗性基因组合，并将多个抗逆关键节点基因构建于同一表达载体中。在将该载体转化植物体例如油菜后，一次转化即可使植物体能够同时获得多种抗逆性，即：可使植物在多种逆境胁迫条件下高效快速的启动机体抗逆反应，降低逆境胁迫对机体的损伤；而且，由于多种抗性基因具有一定协同作用，可高效改良作物的多基因控制的数量性状，提高植物的综合抗逆能力，使其在营养生长和生殖生长阶段均表现出明显的生长优势，具有较好的生产应用价值。

附图说明

图1为油菜遗传转化流程，其中a.初花期转化；b.转化后套袋；c.转化株结实；

图2为转化体Basta和潮霉素抗性筛选；

图3 为高温胁迫处理生长表型，其中a、b. 苗期；c. 花期；d. 结实期；

图4为干旱胁迫处理生长表型；

图5为冷胁迫处理生长表型；

图6为 15% PEG 6000干旱胁迫处理下5种功能基因的表达分析，其中**：两个样本平均数t 检验P值≦0.01；*：两个样本平均数t 检验P值≦0.05；误差值：平均数+s.e；

图7为150 mM NaCl盐胁迫处理下5种功能基因的表达分析，其中**：两个样本平均数t检验P值≦0.01；*：两个样本平均数t 检验P值≦0.05；误差值：平均数+s.e；

图8 为幼苗根长和株高比较，其中(A) 不同胁迫处理下幼苗根长差异；(B) 不同胁迫处理下幼苗株高差异；Mock：空白对照；NaCl：100 mM NaCl；甘露醇：200mM甘露醇；ABA：5 μMABA；**：两个样本平均数t 检验P值≤0.01；*：两个样本平均数t 检验P值≤0.05；误差值：平均数+s.d；

图9 为多基因转化体K15与非转基因植株WT的叶面温度比较，其中(A) 第二片真叶叶面温度；(B) 第三片真叶叶面温度 a. 土壤含水量35%；b. 土壤含水量5%；

图10为气孔开度和失水率，其中(A) 气孔开度观察；(B) 气孔开度测量；(C) 叶片失水率；**：两个样本平均数t 检验P值≤0.01；*：两个样本平均数t 检验P值≤0.05；误差值：平均数+s.d；

图11为ABA含量测定和MDA含量测定，其中(A) 幼苗中ABA含量；(B) 叶片中ABA含量35%、0%：土壤含水量；(C) 叶片中MDA含量 Mock：空白对照；**：两个样本平均数t 检验P值≤0.01；*：两个样本平均数t 检验P值≤0.05；误差值：平均数+s.d。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请的技术方案做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及部分物料、实验设备、实验场地等情况简要介绍如下。

生物材料：

需要解释的是，本申请中所采用的5种抗逆功能基因和3种选择标记基因PCR扩增引物组合，由发明人设计，由上海生工生物工程公司合成提供，pABA-oriT载体的构建，按照现有技术操作，通过Gateway技术，结合Cre/Loxp重组系统和λ噬菌体位点特异性重组系统构建而成，由于相关操作属于现有基因重组技术中较为常规操作，故此不再详细说明；

下述实施例中所采用的转基因受体材料为甘蓝型油菜Y42，属于一种公开型的杂交油菜细胞质雄性不育恢复系，但本发明的实现并不依赖于该特定油菜品种，也可采用其他油菜品种（品系）进行相关操作；

下述实施例中相关引物合成、测序工作均由上海生工生物工程公司进行完成；

主要实验设备：

远红外热成像仪SC-3000 ，美国热电产品；

失水测量系统 (QUIN TIX-224-1CN)，德国赛多利斯产品；

实验场地：

油菜材料的室内种植在河南大学的相关人工气候室内进行，室外种植在河南大学校内试验田内进行；日常管理参考现有育种试验田条件常规操作；

人工气候室材料种植在7cm×7cm×8cm（长×宽×高）的营养钵中，基质材料为拟南芥营养土；

水培材料种植在1/2 Hoagland中。

实施例1

本发明所提供的多基因叠加共转化提高油菜综合抗逆性的方法，其以构建含有多基因植物重组表达载体作为基础，因而本实施例仅就该重组表达载体的构建过程及其鉴定过程简要介绍如下。

需要说明的是，下述实施例中所用重组载体pABA-oriT载体，通过Gateway技术，结合Cre/Loxp重组系统和λ噬菌体位点特异性重组系统，以多轮重组叠加的方式构建而成，相关技术操作具体例如可参考专利《一种构建同时表达多个基因的重组表达载体的方法》（专利申请号：2010102949516）中相关操作即可，本申请不再重复。

需要强调的是，本申请中所采用的重组载体pABA-oriT载体，该载体的T-DNA中的克隆基因表达盒所包含基因序列是经过特定设计和组合的，共包含了依次串联的5种抗逆功能基因和3种选择标记基因；

5种抗逆功能基因和3种选择标记基因在pABA-oriT载体T-DNA区的具体排列顺序为：LB-HYG–GUS-BAR-ICE1-LOS5-CBF3-ABAR-NCED3-RB。

需要解释的是：

5种抗逆功能基因由2类启动子进行驱动表达，具体而言：

ICE1和LOS5基因由pSuper组成型超表达启动子驱动，该启动子的组成元件为：在甘露碱合成酶启动子的上游依次加入甘露碱合成酶转录激活域和三个章鱼碱合成酶转录激活域；

3种选择标记基因均由35S启动子驱动表达，以此3种选择标记基因作为后期转基因植物的筛选标记。

利用PCR鉴定方法对所构建的pABA-oriT重组表达载体进行鉴定，以确保5种抗逆功能基因共存于同一表达载体中，PCR鉴定时，引物序列设计如下：

NCED–F：5' –AACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTT- 3'，

NCED-R：5' –TAGTGTTGGATTCTTTGGCTTTGG-3'；

ABAR-F：5' –AACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTT- 3'，

ABAR-R：5'-ACTTTAATCGCCAATTCCTCGACG -3’；

CBF–F： 5'–AACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTT-3'，

CBF-R： 5'–TTGAAATGTTCCGAGCCAAATCCT-3'；

LOS5-F：5'–ATAGATACGCTGACACGCCAAGCC-3'，

LOS5-R：5'–CTATAAGGTCACTGGTGGCCGAAC-3'；

ICE1-F：5'–ATAGATACGCTGACACGCCAAGCC-3'，

ICE1-R：5' –CTCTTCCCTTTCTCCACCACCACC-3'；

进一步地，对PCR鉴定正确的重组表达载体进一步进行测序验证，以确保5种功能基因的表达框完整正确。

实施例2

利用实施例1所制备的pABA-oriT重组载体，发明人进一步制备了转化液，并利用农杆菌介导的浸花法（flower-dip）对油菜进行了转基因操作，相关实验过程简要介绍如下。

制备转化液

将鉴定正确的重组载体pABA-oriT电击转化农杆菌感受态细胞，具体过程为：

吸取1 μL质粒加入到100 μL农杆菌感受态细胞中，2.5 KV电击转化5 ms，然后迅速加入1mL SOC培养基，28℃、200 rpm振荡复苏培养1.5 h；

取200 μL菌液涂布于含50 mg/L 卡那霉素、50 mg/L庆大霉素、10 mg/L四环素的YEB固体培养基平板上，28℃倒置培养2 d；然后挑选阳性克隆进行PCR鉴定；

首先，挑取2个PCR鉴定正确的阳性单克隆菌斑混合接种于YEP液体培养基（含50 mg/L卡那霉素、50 mg/L庆大霉素、10 mg/L四环素）中，28℃、220 rpm恒温振荡培养至OD₆₀₀=0.6左右；

然后，取1 mL菌液接种至500 mL的YEP液体培养基（含25 mg/L卡那霉素、25 mg/L庆大霉素、5 mg/L四环素）中，28℃、220 rpm恒温振荡培养至OD₆₀₀ = 1.0左右；

最后，4000 rpm室温离心15 min，弃上清，将富集的菌种用转化Buffer重悬，稀释至OD₆₀₀ = 1.0左右，即为转化液，备用；

所述转化Buffer，为1/2 MS培养液+5%质量分数蔗糖+0.05%质量分数Silwet-77+0.01mg/L的6-BA+8 mg/L的乙酰丁香酮（acetosyringone）；

需要注意的是，转化Buffer及转化液需现用现配。

转化油菜

本实施例主要是采用农杆菌介导的浸花法（Flower-dip）将含ABAR、NCED3、LOS5、CBF3、ICE1五种抗逆功能基因的真核表达双元载体（重组载体pABA-oriT）转化油菜；转化受体材料为甘蓝型油菜Y42，转化于油菜初花期进行，部分实验操作如图1所示，具体过程简要介绍如下。

首先，对油菜进行预处理，将油菜种子播种后，在油菜第一朵花开放后的2~3天内，于转化的前一天，选择生长健壮的植株，去掉多余分枝（即去除多余侧花序），每株仅保留主花序及2~3枝生长健壮的侧花序，摘除已开花朵以及花序顶端直径小于5 mm的小花蕾，将保留花序套袋待转化用。

其次，选择下午17:00左右进行转化操作，转化时，将整个花序浸入转化液中浸泡90~120秒左右，期间轻轻晃动转化液，以防止农杆菌沉淀，从而影响转化效果；

转化后套袋保湿并挂牌标记；

相同操作，隔天转化1次，连续转化3次；

最后一次转化后，继续套袋5天后去袋，剪掉多余的正在开放的花朵和未开放花蕾，使转化荚果正常生长，直至成熟后，按单株收获种子。

最终，在5株转化受体油菜上收获T0代种子约4100粒，平均结实率为820粒/株。

实施例3

对实施例2所获得的转基因油菜种子，由于存在一部分假阳性种子，因而尚需进一步进行抗性筛选和鉴定，同时为便于生产使用，还需进一步制备纯合体，本实施例就相关的筛选、鉴定及纯合体的获得过程简要介绍如下。

转化体的筛选和鉴定

将实施例2中所收获的T0代种子播种于温室中，播种7~10天后，在油菜幼苗心叶刚长出时（即第一片真叶出线时），叶面喷施50 mg/L 除草剂 Basta（主要成分为草铵膦），隔日一次，共喷施三次。一周后，非转化体植株对Basta敏感而叶缘发黄、叶片皱缩、新生真叶失绿、植株逐渐干枯死亡；而转化体表现出对Basta抗性而生长正常 (如图2所示)。

对对Basta表现出抗性的油菜幼苗继续培养其至四叶期，在幼苗完全舒展的第三片真叶表面涂抹50 mg/L潮霉素，5天后观察幼苗的潮霉素抗性，非转基因植株叶片涂抹潮霉素区域密布褐色斑点，并逐渐失绿干枯；而转基因植株叶片生长正常 (如图2所示)。

对Basta和潮霉素均表现出抗性（双重抗性）的油菜幼苗，取其叶片，提取基因组DNA，分别用Basta抗性基因引物和潮霉素抗性基因引物进行两轮PCR鉴定；

PCR鉴定时，Basta抗性基因引物设计为：

BAR-F：5'-CGGTCTGCACCATCGTCAACCACT-3'，

BAR-R：5' –ACGCTCTTGAAGCCCTGTGCCTC- 3'；

潮霉素抗性基因引物设计为：

HYG-F：5'- TGCTGCTCCATACAAGCCAA- 3'，

HYG-R：5'-ACCGCAAGGAATCGGTCAAT-3'；

PCR反应程序设计为：95℃、5min；95℃、40s，55℃~65℃、30s，72℃、30~60s，35个循环，72℃、10min。

对两轮PCR鉴定均呈阳性的植株移至田间培养，于花期套袋自交，成熟后按单株收获种子并继续重复上述鉴定工作，进行Basta抗性、潮霉素抗性、PCR鉴定，直至获得转化纯合体。

最终，经过连续4代鉴定，获得了9个转基因纯合株系。

实施例4

对实施例3中筛选所获得的其中一个具有综合抗逆特性的转基因油菜株系命名为多基因转化材料K15，以非转基因原始材料（即，甘蓝型油菜Y42，WT）作为对照，发明人进一步对其农艺性状、逆境胁迫条件下生长表型、生理变化等进行了分析，相关实验简要介绍如下。

大田生长环境下农艺性状

大田模式下（植株间距和行间距各约25 cm）分别播种K15和WT材料，于全部植株开花时测量K15及WT材料的农艺形状，包括分枝数、根长、株高、鲜重、干重等。测定结果如下表所示：

注：* 两个样本平均数t 检验存在显著性差异；** 两个样本平均数t 检验存在极显著性差异。

对上表数据进行分析，可以看出，在盛花期，K15植株分枝数、根长、株高、鲜重、干重均显著或极显著多于或高于WT。如K15植株的鲜重和干重分别为660.0g、99.2 g，而WT植株的鲜重和干重分别为282.5 g、45.6 g，无论是鲜重还是干重均高于WT植株两倍多。

逆境胁迫条件下的生长表型

（1）高温胁迫下的生长表型

分别在苗期和营养生长阶段对K15和WT材料进行高温胁迫 (30℃~35℃)处理，具体处理方法：

完成点种的营养钵按每盘15钵的数量放置于塑胶盘内，移入人工智能调节气候室，于16/8光/暗、30~35℃、空气相对湿度35-40% 的培养条件下培养，培养过程中适时浇灌1/2Hoagland营养液，使营养土湿度始终保持在30% 左右；

5叶期移入塑料桶中在相同条件下继续生长观察表型。

结果表明，K15植株对高温胁迫的耐受性明显高于WT (图3)。而且K15植株的耐高温性不仅表现在K15植株在苗期和营养生长阶段均具有绝对的生长优势；最主要的区别在于，持续高温下，K15可以顺利完成由营养生长到生殖生长的转变，而WT植株在持续高温下因未进行低温春化而不能完成营养生长到生殖生长的过渡。

（2）干旱胁迫下的生长表型

温室种植的K15和WT材料，在营养生长两个月后停止灌水，进行持续干旱并观察植株长势和表型。

实验结果表明，转基因材料能继续生长进入生殖生长阶段，而非转基因材料无法进入生殖生长阶段而逐渐干枯死亡，转基因材料的抗旱性明显强于非转基因对照材料（图4）。

（3）低温胁迫下的生长表型

首先在人工气候室16/8 光/暗、25℃、空气相对湿度35-40%正常条件下，营养钵幼苗生长至四叶期，选取生长状况一致的K15幼苗和WT幼苗置于0℃低温下处理12 h，之后移入人工气候室继续在正常条件下培养，观察植株的受害程度及表型。

实验结果表明，低温胁迫处理后，相对于K15，WT幼苗萎蔫程度更严重，K15植株的抗冷能力明显优于WT，表现出绝对的生长优势（图5）。

材料抗逆性的综合分析

（1）萌发率

分别在含100 mM NaCl、200 mM甘露醇、5 μM ABA的MS固体培养基上点播K15和WT种子，暗处理两天后进行萌发率统计实验。分别于点种后第3天、第4天、第5天和第9天统计种子萌发数，统计时间固定在每天上午8: 00点。

胁迫处理下不同时间点种子萌发率的统计结果如下表所示：

注：萌发率用重复测量平均值表示。

对上表数据分析可以发现，相对于WT而言，K15种子具有明显的萌发优势，对逆境胁迫的敏感性显著低于WT。在100 mM NaCl、200 mM甘露醇、5 μM ABA处理条件下，K15种子分别于第5天、第7天、第9天达到最高萌发率，分别为100%、99%、98%。而WT种子在NaCl、甘露醇胁迫处理条件下，萌发率始终较低，至第9天其萌发率分别为81%、77%；ABA处理条件下，WT种子至第9天才达到最高萌发率 (97%)。

（2）幼苗根长和株高

对上述萌发率实验中的种子继续进行培育，在点种后第10天，测量幼苗根长和株高，以每培养皿内某样品所有植株根长、株高的平均数代表一个有效数据 (cm/株)。

结果表明 (图8)，3种胁迫处理条件下，K15幼苗的根长均显著高于WT。在100 mMNaCl、200 mM甘露醇处理条件下，K15幼苗的株高略高于WT幼苗，并没有达到显著性差异；5μM ABA处理条件下，K15幼苗的株高显著高于WT。

（3）幼苗干重和鲜重

幼苗根长、株高测量完成后，称量鲜重，以每培养皿中某样品编号内所有植株总鲜重除以该编号植株总数后的平均数代表一个有效数据 (mg/株)，每编号测量5皿，共得5个有效数据，每组实验重复3次。幼苗鲜重称量完成后，装入对应编号透气性强的牛皮纸袋中。于105℃烘箱中烘焙15 min杀青；之后于75℃电热鼓风干燥箱中，恒温干燥24 h。称量干重，有效数据计算方法同鲜重 (mg/株)。相对鲜重或相对干重以胁迫处理下幼苗鲜重或干重与未胁迫处理时幼苗鲜重或干重的比值表示。统计结果如下表所示：

注：* 两个样本平均数t 检验存在显著性差异。

对上表统计数据分析后，可以看出，三种胁迫处理条件下，K15幼苗的相对干重和相对鲜重均高于WT。但是只有200 mM甘露醇处理条件下K15幼苗的相对鲜重显著高于WT (P=0.027)，其余均没有达到显著性差异。与正常生长幼苗相比，胁迫处理后K15幼苗干重和鲜重的下降幅度均低于WT幼苗，说明同等胁迫条件下，K15受胁迫影响较小，其持水能力及生物量积累量均高于WT。

综上结果，从种子萌发及萌发后幼苗的生长指标来看，K15对逆境胁迫的抗性显著高于WT。

（4）叶面温度测量

温室分别种植K15和WT材料，在幼苗生长至四叶期时，分别于土壤含水量为35% 和5%时利用远红外热成像仪测量幼苗第二片和第三片离体真叶的叶面温度。

结果如图9所示。测定结果表明，当土壤含水量为35% 左右时，两种材料第二片和第三片离体真叶的叶面温度差别不大；当土壤含水量降至5% 左右时，K15幼苗第二片和第三片离体真叶叶面温度明显高于WT，平均温度分别高出2℃、1.5℃左右。这一结果表明，干旱胁迫后，由于K15幼苗叶面温度高于WT，说明K15蒸腾失水速率和失水量小于WT，植株持水能力高于WT，对干旱胁迫的耐受性高于WT。

（5）气孔开度和失水率测定

温室分别种植K15和WT材料，在幼苗生长至四叶期时，观测当日8: 00点左右取样，选取第二片真叶以叶脉为中轴线，平均分为两部分：

一部分置于油菜气孔缓冲液中(60 mM KCl、10 mM，固体Tris调PH至6.15)，在285 μmol/m²/s光强下光照诱导气孔开放，诱导过程中叶片下表皮面向光照；5 h后小心撕取叶片下表皮，毛笔轻轻刷去叶肉细胞，制片后于体视显微镜下观察照相，并进行气孔观察和气孔开度测量；

同一叶片中另一半叶片继续生长，于观测当日10: 00点左右，离体置于气孔缓冲液中，叶片处理、观察照相同上；

气孔开度以实测气孔宽度与实测气孔长度比值的百分比表示 (%)。

结果如图10。图10A 表明，两种材料的气孔密度并没有明显差异。进一步测量气孔开度后发现(图10B)，不管有无光照处理，WT叶片的气孔开度都极显著大于K15。光照处理后，WT叶片的气孔开度迅速增加 (t检验P值为1.34×10^-8)；K15叶片气孔虽然也受光照诱导，但是与WT相比，其气孔开度仅略有增大 (t检验P值为4.8×10^-4)。

气孔开度直接影响到植株的持水能力，利用失水测量系统进一步测量K15和WT离体叶片 (第二片真叶) 的失水率。测量时，于测量当日10: 00点左右开始，测量时间持续至22: 00点，历时12 h。

结果表明 (图10 C)，K15叶片具有更强的持水能力。由图10C 可知，失水测量实验进行30 min后，K15和WT的离体叶片失水率开始出现明显差异。实验持续到350 min时，K15离体叶片的失水率仅有20% 左右，而此时WT离体叶片失水率已高达50% 以上。700 min后，K15离体叶片的失水率接近35%，而WT离体叶片失水率高达80% 左右。

以上结果说明，在逆境胁迫条件下，与WT相比，K15可以更加有效的控制气孔开度，进而降低叶片蒸腾失水，增强植株保水能力，有效提高对干旱胁迫的抵抗力。

（6）ABA和MDA含量测定

由于转化的5个功能基因中含2个ABA合成相关基因 (NCED3、LOS5) 和1个ABA信号途径相关基因 (ABAR)，为验证这些功能基因超表达后的作用，发明人进一步测定了K15和WT植株中的ABA（脱落酸）含量和MDA（丙二醛）含量。

MDA含量采用硫代巴比妥酸 (TBA)法测定，ABA含量采用酶联免疫法（Elisa）测定。

植株中ABA含量测定时，植株材料来源有两部分：Hoagland营养液中培养7天的幼苗浇灌15% PEG6000胁迫处理12 h后取样；温室营养钵中培养至四叶期的幼苗，停止灌水后用土壤水分测定仪（英国Delta-T公司，WET-2）测量土壤含水量，分别于土壤含水量35%、0%时取第三片真叶；

植株中MDA含量测定时，温室营养钵中培养至四叶期的正常生长幼苗，用20% PEG6000处理12 h后取第三片真叶为测量样本。

测定结果表明：

未胁迫处理条件下，K15幼苗中的ABA含量分别为357.8 ng/g和299.3 ng/g，叶片中分别为168.3 ng/g和130.5 ng/g，幼苗和叶片中的ABA含量显著高于WT；

胁迫处理后，K15和WT幼苗中的ABA含量分别为507.7 ng/g、380.6 ng/g，叶片中分别为267.9 ng/g、190.9 ng/g；

胁迫处理后K15幼苗和叶片中的ABA含量迅速增加，与WT相比达到极显著差异(图11A，B)。

MDA为膜脂过氧化产物，植物体内MDA含量可直接反应植株体内自由基水平和胁迫条件下植物中细胞的生理损伤水平。

MDA含量测定结果表明：

未胁迫处理时，K15和WT叶片中的MDA平均含量分别为5.73 μM /g、3.20 μM /g；

胁迫处理后，K15和WT叶片中的MDA含量均急剧增加，分别高达11.16 μM /g、7.37 μM /g；此时K15中的MDA含量极显著低于WT，其增加倍数也明显低于WT (K15为1.9倍，WT为2.3倍) (图11C)。

综合上述ABA和MDA含量测定结果表明，K15体内ABA含量极显著高于WT，同时MDA含量极显著低于WT，这种结果可以准确解释K15与WT之间的一系列表型差异和抗逆性差异。

基因表达分析

上述实验均是基于植株的表型、生理指标方面的分析，发明人进一步就K15材料中所转化的相关基因在不同胁迫处理时的表达量变化情况进行了测定分析，相关实验简要介绍如下。

需要说明的是，所构建的转化载体中5种功能基因表达盒的表达模式不尽相同，其中，ICE1和LOS5基因表达盒中为pSuper组成型超表达启动子；CBF3、ABAR和NCED3三个基因表达盒为胁迫诱导型启动子pRD29A，受胁迫诱导表达。

对基因表达量进行测定时，采用qRT-PCR技术进行分析，qRT-PCR分析时，引物序列设计如下：

。

温室内营养钵中分别种植K15和WT，对生长至第7天的幼苗进行胁迫处理。胁迫处理分两种：15% PEG6000模拟干旱胁迫处理和150 mM NaCl盐胁迫处理。

模拟干旱胁迫处理

15% PEG6000胁迫处理后，5种功能基因的qRT-PCR表达分析表明，K15植株中5种功能基因具有不同的表达模式。

胁迫处理前，pSuper驱动的ICE1和LOS5在K15植株中的表达量已经显著高于WT (3倍左右)；PEG6000胁迫处理后，两种材料中ICE1和LOS5基因表达量均上调，K15植株中基因表达量上调幅度更大。处理12 h时，K15中ICE1、LOS5基因和WT中LOS5基因的表达丰度均达到最高点，之后开始下降。

诱导型启动子pRD29A驱动表达的CBF3、ABAR和NCED3三个基因的表达模式极为相似。胁迫处理前，两种材料中3种基因的表达丰度几乎没有差异。而PEG6000胁迫处理后，在K15中3种基因的表达丰度迅速上调，并在12 h左右达到最高点，此时K15中NCED3表达量上调75倍左右、ABAR表达量上调45倍左右、CBF3表达量上调35倍左右，在WT中3种基因的表达丰度上调幅度甚小。PEG6000胁迫处理超过12 h ，在两种材料中3种基因的表达量均迅速下降(图6)。

盐胁迫处理

150 mM NaCl处理后，K15与WT幼苗表现出与15% PEG6000处理类似的基因表达差异(图7)。盐胁迫处理12 h ，K15植株中NCED3表达量上调20倍左右、ABAR表达量上调25倍左右、CBF3表达量上调30倍左右，且3种诱导表达基因的相对表达丰度均达到峰值，但相对于PEG6000处理后3种基因表达量的最大值明显偏低。

Claims

1.一种多基因叠加共转化提高油菜综合抗逆性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）多基因植物表达载体的构建，

构建pABA-oriT载体，该载体的T-DNA中的克隆基因表达盒包含依次串联的5种抗逆功能基因和3种选择标记基因；

（2）对步骤（1）中所构建的重组表达载体的鉴定，确保5种功能基因共存于同一表达载体中；

（3）对步骤（2）中鉴定正确的重组表达载体转化农杆菌，制备转化液；

（4）采用农杆菌介导的浸花法转化油菜，转化后，继续培育至成熟，按单株收获种子；

（5）转化体的筛选和鉴定，将步骤（4）中所收获油菜种子播种，依次进行Basta抗性、潮霉素抗性筛选，并对双抗性植株进行PCR鉴定；

（6）转化体自交获得纯合体，对步骤（5）中筛选、鉴定正确的转化体继续培养，于花期时套袋，使其自交，收获单株种子；

对收获的种子继续种植，同步骤（5）操作，继续进行Basta抗性、潮霉素抗性、PCR鉴定，并对鉴定正确的转化体继续自交，并最终获得转化纯合体，即为具有综合抗逆特性的转基因油菜。

2.如权利要求1所述多基因叠加共转化提高油菜综合抗逆性的方法，其特征在于，步骤（2）中，重组表达载体鉴定时，采用PCR鉴定法，PCR鉴定时，引物序列设计如下：