CN105420272A - 一种培育无选择标记抗除草剂转基因植物的方法及其专用载体 - Google Patents

一种培育无选择标记抗除草剂转基因植物的方法及其专用载体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种培育无选择标记抗除草剂转基因植物的方法及其专用载体。本发明所提供的专用载体，包含区段甲和区段乙；所述区段甲依次包括如下元件：T-DNA右边界、选择标记基因表达盒、T-DNA左边界；所述区段乙依次包括如下元件：T-DNA右边界、抗除草剂基因表达盒、T-DNA左边界。利用本发明提供的方法，可筛选出无选择标记的转基因后代，获得无选择标记的转基因水稻的比率为42.39％；与野生型水稻幼苗相比，利用本发明提供的方法培育的无选择标记的转基因水稻对草甘膦有明显的抗性。可见，随着抗除草剂作物种植面积的扩大和市场效益的提高，本发明提供的方法将进一步推动新型除草剂的开发和利用。

Description

一种培育无选择标记抗除草剂转基因植物的方法及其专用载体
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种培育无选择标记抗除草剂转基因植物的方法及其专用载体。
背景技术
自1983年世界上首例转基因烟草(Nicotianatabacum)在美国成功种植以来(Zambryskitetal.,1983)，转基因作物种植面积持续增加。截止2014年，全球28个国家转基因作物的种植面积为1.815亿公顷，比2013年的1.752亿公顷增加了630万公顷，年增长率为3％～4％。转基因作物的抗除草剂性状自1996年商业化种植以来对全球粮食、饲料和纤维生产做出了巨大的贡献，2014年抗除草剂性状被单独或复合应用于玉米、水稻、棉花、油菜、苜蓿、茄子、甜菜和白杨等主要粮食作物和经济作物(James，2015)。通过转基因技术使农作物获得对除草剂的耐性，不仅克服了除草剂的选择性问题，使多灭生性广谱除草剂得到广泛应用，而且更重要的是提高了除草剂效果，降低了除草成本。当前，中国的水稻、玉米、大豆、小麦和油菜等作物杂草危害相当严重，而传统的选择性除草剂在使用过程中需要增加施用量，且残留期长、容易影响后续作物的正常生长。因此，在中国开展抗除草剂转基因育种具有巨大的市场需求。
所有除草剂都是通过干扰与抑制植物生长发育过程中的代谢作用而造成杂草的死亡，其中包括光合作用、细胞分裂、氨基酸、蛋白质及脂肪酸合成、激素合成、叶绿素及色素合成等。除草剂草甘膦(glyphosate)特异性地抑制植物和细菌中芳香族氨基酸合成关键酶的活性，即抑制植物和细菌中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolypyruvylshikimate-3-phosphatesynthase，EPSPS)的活性。当施用草甘膦时，进入植物体内的草甘膦分子与磷酸烯醇丙酮酸竞争性地结合EPSPS的活性位点，终止了芳香族氨基酸的合成途径，造成苯丙氨酸、络氨酸和色氨酸等氨基酸的缺乏，最终导致植物死亡。
随着植物转基因技术的发展，研究人员可以利用多种转化方法将抗草甘膦基因转化到植物体内，但通常只有部分细胞可以成为稳定的转化细胞。因此，一般在转化过程中使用抗生素抗性基因等作为选择标记基因筛选转化细胞。在选择压力下，不含选择标记及其产物的非转化细胞将死亡；转化细胞和组织则整合有选择标记基因而存在抗性，从而能够继续成活并分化成植株。但是，选择标记基因及其蛋白产物毕竟不是基因工程的目的产品，尽管目前的研究表明多数选择标记基因及其产物并未带来安全性隐患，但有些人仍会担心这些基因存在于转基因植物中会带来影响环境和人类健康安全性的问题。如果培育出不含选择标记基因的转基因植物，这个问题即会迎刃而解。总而言之，建立无选择标记植物抗草甘膦的转基因水稻的培育方法具有重要的意义，不仅为培育抗逆、高产、优质的新品种提供重要的材料基础，同时随着抗除草剂作物种植面积的扩大和市场效益的提高，必将进一步推动新型除草剂的开发和利用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是培育无选择标记抗除草剂转基因植物。
为解决上述问题，本发明首先提供了一种植物表达载体。
本发明所提供的植物表达载体，包含区段甲和区段乙；
所述区段甲依次可包括如下元件：T-DNA右边界、选择标记基因表达盒、T-DNA左边界；
所述区段乙依次可包括如下元件：T-DNA右边界、抗除草剂基因表达盒、T-DNA左边界。
所述区段甲中的T-DNA右边界和所述区段乙中的T-DNA右边界的核苷酸序列均可如序列表中序列1自5’末端起第491至516位所示。
所述区段甲中的T-DNA左边界和所述区段乙中的T-DNA左边界的核苷酸序列均可如序列表中序列1自5’末端起第7182至7207位所示。
所述区段乙依次可包括如下元件：所述T-DNA右边界、MAR序列甲、所述抗除草剂基因表达盒、MAR序列乙和所述T-DNA左边界。
所述MAR序列甲和所述MAR序列乙均可为核基质结合序列，置于外源表达结构的两侧可提高外源基因表达的水平，或明显减少了外源基因在转基因植株间的表达差异。利用MARs来稳定、提高外源基因的表达是克服外源基因失活的一种有效方法。
所述植物表达载体中，所述选择标记基因表达盒和所述抗除草剂基因表达盒的方向相反。
所述选择标记基因表达盒的核苷酸序列的反向互补序列可如序列表中序列1自5’末端起第13533至15604位所示。
所述抗除草剂基因表达盒的核苷酸序列可如序列表中序列1自5’末端起第1797至5620位所示。
所述除草剂可为草甘膦。
所述抗除草剂基因具体可为EPSPS基因；
所述EPSPS基因的核苷酸序列可如序列表中序列1自5'末端起第3708至5351位所示。
所述区段甲的核苷酸序列的反向互补序列可如序列表中序列1自5’末端起第13458至276位所示(序列表中序列1为环形质粒的序列，因此所述区段甲自上游至下游依次由序列表中序列1自5’末端起第13458至15859位核苷酸和序列表中序列1自5’末端起第1至276位所示核苷酸组成)。
所述区段乙的核苷酸序列可如序列表中序列1自5’末端起第491至7207位所示。
所述植物表达载体具体可为环状质粒。
所述植物表达载体的核苷酸序列可如序列表中序列1所示。
上述任一所述植物表达载体在培育无选择标记抗除草剂转基因植物中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了一种培育无选择标记抗除草剂转基因植物的方法。
本发明所提供的培育无选择标记抗除草剂转基因植物的方法，可包括b1)或b2)：
b1)将上述任一所述植物表达载体转化受体植物，借助所述选择标记基因或其对应的表型进行筛选，得到T0代植株；将所述T0代植株进行自交，得到含有所述抗除草剂基因且不含有所述选择标记基因的T1代植株，即无选择标记抗除草剂转基因植株；
b2)将上述任一所述植物表达载体转化受体植物，借助条件甲和条件乙进行筛选，得到T0代植株；将所述T0代植株进行自交，得到含有所述抗除草剂基因且不含有所述选择标记基因的T1代植株，即无选择标记抗除草剂转基因植株；所述条件甲为所述选择标记基因或其对应的表型；所述条件乙为所述抗除草剂基因或其对应的表型。
上述方法中，用所述植物表达载体转化受体植物时，所述抗除草剂基因和所述选择标记基因通常非连锁整合到受体植物的基因组中，所述具有选择标记基因表型的植株在很大概率上也具有所述抗除草剂基因。同时具有抗除草剂基因和所述选择标记基因的植株进行自交后，获得的后代中抗除草剂基因和选择标记基因发生分离，因此可以获得无选择标记抗除草剂转基因植株。
所述受体植物可为如下a1)至a6)中的任一种：
a1)双子叶植物；
a2)单子叶植物；
a3)水稻；
a4)籼稻；
a5)水稻品种明恢86；
a6)粳稻。
所述除草剂可为草甘膦。
所述抗除草剂基因具体可为EPSPS基因；
所述EPSPS基因的核苷酸序列可如序列表中序列1自5'末端起第3708至5351位所示。
所述选择标记基因可为潮霉素磷酸转移酶编码基因。
所述潮霉素磷酸转移酶编码基因的核苷酸序列可如序列表中序列1自5'末端起第13777至14799位所示。
实验证明，利用本发明提供的方法，可筛选出无选择标记的转基因后代，获得无选择标记的转基因水稻的比率为42.39％；与野生型水稻幼苗相比，利用本发明提供的方法培育的无选择标记的转基因水稻对草甘膦有明显的抗性。可见，随着抗除草剂作物种植面积的扩大和市场效益的提高，本发明提供的方法将进一步推动新型除草剂的开发和利用。
附图说明
图1为植物表达载体pDTepsps-hyg的结构示意图。
图2为水稻的遗传转化。
图3为T0代转基因水稻植株的PCR分析电泳图。
图4为T0代转基因水稻植株的hpt基因和epsps基因连锁情况的电泳图。
图5为T1代转基因水稻植株的PCR分析电泳图。
图6为T2代转基因水稻植株的草甘膦抗性分析。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
籼稻品种明恢86记载于如下文献中：苏军等.农杆菌介导籼稻明恢86高效稳定转化体系的建立。福建农业学报，2003，18(4)，209-213.公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。籼稻品种明恢86以下简称为明恢86或野生型水稻。
YEB液体培养基：将牛肉浸膏5g、酵母膏1g、蛋白胨5g、蔗糖5g、MgSO4·7H2O0.04g溶于1L去离子水，用10MNaOH水溶液调节pH至7.2，高温高压灭菌20min。
诱导培养基：将50×N6大量母液20mL、100×B5微量母液10mL、200×MS铁盐母液5mL、1000×B5有机母液1mL、水解酪蛋白300mg、谷氨酰胺500mg、脯氨酸2.8g、2，4-D2.0mg、蔗糖30.0g和植物凝胶4.5g溶于1L蒸馏水，调节pH至5.8，121℃灭菌15min。
共培养培养基：将50×N6大量母液20mL、100×B5微量母液10mL、200×MS铁盐母液5mL、1000×B5有机母液1mL、水解酪蛋白300mg、谷氨酰胺500mg、脯氨酸2.8g、2,4-D2.0mg、蔗糖30.0g、植物凝胶4.5g、羧苄青霉素100mg和头孢霉素400mg溶于1L蒸馏水，调节pH至5.2，121℃灭菌15min，待冷却至50～60℃时加入经过0.22μM过滤除菌的葡萄糖10g、羧苄青霉素100mg和头孢霉素400mg和乙酰丁香酮，乙酰丁香酮在体系中的终浓度为100μM。
预培养基：将50×N6大量母液20mL、100×B5微量母液10mL、200×MS铁盐母液5mL、1000×B5有机母液1mL、水解酪蛋白300mg、谷氨酰胺500mg、脯氨酸2.8g、2，4-D2.0mg、蔗糖30.0g、植物凝胶4.5g溶于1L蒸馏水，调节pH至5.8，121℃灭菌15min，待冷却至50～60℃时加入经过0.22μM过滤除菌的葡萄糖10g、羧苄青霉素100mg和头孢霉素400mg。
一次筛选培养基：将50×N6大量母液20mL、100×B5微量母液10mL、200×MS铁盐母液5mL、1000×B5有机母液1mL、水解酪蛋白300mg、谷氨酰胺500mg、脯氨酸2.8g、2，4-D2.0mg、蔗糖30.0g、植物凝胶4.5g溶于1L蒸馏水，调节pH至5.8，121℃灭菌15min，待冷却至50～60℃时加入经过0.22μM过滤除菌的潮霉素30mg、羧苄青霉素100mg和头孢霉素400mg。
二次筛选培养基：除将一次筛选培养基中的潮霉素30mg替换为潮霉素50mg，其它成分及含量均不变。
分化培养基：将20×MS大量母液50mL、200×MS微量母液5mL、200×MS铁盐母液5mL、200×MS有机母液5mL、水解酪蛋白1000mg、谷氨酰胺500mg、蔗糖30.0g、山梨醇20g、NAA0.4mg、6-BA2.0mg、KT1mg和植物凝胶4.5g溶于1L蒸馏水，调节pH至5.8，121℃灭菌15min。
生根培养基：将20×MS大量母液25mL、200×MS微量母液2.5mL、200×MS铁盐母液2.5mL、200×MS有机母液2.5mL、蔗糖15g和植物凝胶4.5g溶于1L蒸馏水，调节pH至5.8，121℃灭菌15min，待冷却至50～60℃时加入经过0.22μM过滤除菌的潮霉素30mg。
1/2MS培养液：将20×MS大量母液25mL、200×MS微量母液2.5mL、200×MS铁盐母液2.5mL、200×MS有机母液2.5mL溶于1L蒸馏水中，调节pH至5.8。
50×N6大量母液的溶质及其浓度为：141.50g/LKNO3、20g/LKH2PO4、23.15g/L(NH4)2SO4、9.25g/LMgSO4·7H2O、8.30g/LCaCl2·2H2O，溶剂为水，pH自然。
100×B5微量母液的溶质及其浓度为：0.3g/LH3BO3、1g/LMnSO4·4H2O、0.0025g/LCoCl2·6H2O、0.0025g/LCuSO4·5H2O、0.2g/LZnSO4·7H2O、0.025g/LNa2MoO4·2H2O、0.075g/LKI，溶剂为水，pH自然。
1000×B5有机母液的溶质及其浓度为：2g/L甘氨酸、100g/L肌醇、1g/L烟酸、1g/L盐酸吡哆醇、10g/L盐酸硫胺素，溶剂为水，pH自然。
20×MS大量母液的溶质及其浓度为：38.00g/LKNO3，8.80g/LCaCl2·2H2O，7.40g/LMgSO4·7H2O，3.40g/LKH2PO4，33.00g/LNH4NO3，溶剂为水，pH自然。
200×MS微量母液的溶质及其浓度为：4.46g/LMnSO4·4H2O，0.166g/LKI，1.24g/LH3BO3，1.72g/LZnSO4·7H2O，0.050g/LNa2MoO4·2H2O，0.005g/LCuSO4·5H2O，0.005g/LCoCl2·6H2O，溶剂为水，pH自然。
200×MS铁盐母液的溶质及其浓度为：5.56g/LFeSO4·7H2O，7.46g/LNa2·EDTA·2H2O，溶剂为水，pH自然。
200×MS有机母液的溶质及其浓度为：20g/L肌醇，100mg/L烟酸，100mg/L盐酸吡哆醇，100mg/L盐酸硫胺素，400mg/L甘氨酸，溶剂为水，pH自然。
实施例1、无选择标记抗草甘膦转基因水稻的获得及草甘膦抗性鉴定
一、植物表达载体pDTepsps-hyg的构建
人工合成序列表中序列1所示的植物表达载体pDTepsps-hyg(环形质粒，结构示意图见图1)。序列表的序列1中，自5’末端起第491-516位为右边界B序列，第563-1309位为第一个MAR序列，第1797-3707位为P-Ubi启动子序列，第3708-5351位为EPSPS基因序列，第5358-5620位为T-nos终止子序列，第6045-6906位为第二个MAR序列，第7182-7207位为左边界B序列，第13458-13483位为左边界A序列，第13533-13748位为CaMV35SpolyA终止子序列，第13777-14799位为hpt基因序列，第14835-15604位为CaMV35Spromoter序列，第251-276位为右边界A序列。
二、水稻的遗传转化和T0代转基因水稻植株的分子检测
1、将步骤一构建的植物表达载体pDTepsps-hyg通过电击导入根癌农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌，命名为LBA4404-pDTepsps-hyg。
2、将LBA4404-pDTepsps-hyg单克隆接种于20mL含卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L的YEB液体培养基，28℃、220rpm震荡培养12～16h后，然后按2％-4％(体积百分含量)的比例接种于含乙酰丁香酮100μM的YEB液体培养基，28℃、220rpm振荡培养至OD600值达到0.5左右，得到农杆菌侵染液。
3、成熟明恢86种子去壳脱粒，置于100mL三角瓶中，加入70％(体积百分比)乙醇水溶液浸泡30sec，再置于25％(体积百分比)次氯酸钠水溶液中，120rpm震荡灭菌30min，无菌水冲洗3次，用滤纸吸干水分，然后将种子胚朝下置于诱导培养基上诱导愈伤，30℃全光照诱导7天，长出的愈伤掐芽后用于水稻转化(图2中的A)。
4、完成步骤3后，取生长状态较好的胚性愈伤组织，浸泡于步骤2得到的农杆菌侵染液，28℃、80rpm摇床轻摇愈伤，侵染30min，然后，放在铺有一层灭菌滤纸的共培养培养基上，25℃暗培养4天。
5、完成步骤4后，取愈伤组织置于无菌培养皿中，用含Cef400mg/L的无菌水漂洗2～3次，在无菌滤纸上吸干，然后置于预培养基上，25℃暗培养3～4天。
6、取步骤5得到的愈伤组织，置于一次筛选培养基，光照交替培养2周后，更换新的一次筛选培养基，愈伤组织继续光照交替培养2周，将原愈伤组织上长出的抗性愈伤组织转移至二次筛选培养基上，光照交替培养2周(图2中B)。所述光照交替培养即光培养和暗培养交替，条件为：28℃；14小时光照培养/10小时黑暗培养；光照培养时的光照强度为90μE/m2/s。
7、完成步骤6后，取生长旺盛的抗性愈伤组织，置于分化培养基，光照交替培养(即光培养和暗培养交替，条件为：28℃；14小时光照培养/10小时黑暗培养；光照培养时的光照强度为90μE/m2/s)3周，抗性愈伤组织上分化出抗性小芽(图2中C)。
8、完成步骤7后，取抗性小芽，置于生根培养基，光照交替培养(即光培养和暗培养交替，条件为：28℃；14小时光照培养/10小时黑暗培养；光照培养时的光照强度为90μE/m2/s)，得到抗性植株(图2中D)。待抗性植株长至6～10cm时，进行开放式水培养，长出新根后移栽温室，得到188个T0代转基因水稻植株。然后用CTAB法分别提取188个T0代转基因水稻植株叶片的基因组DNA。
10、分子检测
分别用T0代转基因水稻植株叶片的基因组DNA作为模板，采用引物1hpt-F：5'-CGGTCGGCATCTACTCTATT-3'和引物2hpt-R：5'-CGTTATGTTTATCGGCACTTT-3'组成的引物对甲进行PCR扩增，用于鉴定hpt基因；采用引物1epsps-F：5'-TTGGTGACTTGGTTGTCGGGTTG-3'和引物2epsps-R：5'-CGTAGGTGTCGATTGCCGTGATG-3'组成的引物对乙进行PCR扩增，用于鉴定epsps基因；采用引物1link-F：5'-GATTGTGCGTCATCCCTTAC-3'和引物2link-R：5'-ACATCGTCTCTGCCTCCTCT-3'组成的引物对丙进行PCR扩增，用于鉴定hpt基因和epsps基因是否连锁整合。
PCR反应条件：94℃，5分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃60秒，30个循环；72℃延伸5分钟。
采用引物对甲进行PCR扩增，获得的电泳图见图3中A，采用引物对乙进行PCR扩增，获得的电泳图见图3中B(图3中，泳道M为DNAMarker，泳道N为以野生型水稻叶片的基因组DNA作为模板，泳道P为以植物表达载体pDTepsps-hyg作为模板，泳道1至泳道22为T0代转基因水稻植株)，结果显示，如果采用引物对甲能够扩增获得大小约为861bp条带(图3中A的箭头所示)，且采用引物对乙能够扩增获得大小约为804bp条带(图3中B的箭头所示)，则为T0代转基因水稻植株。泳道1、2、3、4、6、8、9、12、17和22为T0代转基因水稻植株。
用引物对丙进行PCR扩增，获得的电泳图见图4(泳道M为DNAMarker，泳道N为以野生型水稻叶片的基因组DNA作为模板，泳道P为以植物表达载体pDTepsps-hyg作为模板，泳道1至泳道10为T0代转基因水稻植株)，结果显示，如果采用引物对丙能够扩增获得大小约为1750bp条带(图4中箭头所示)，则为hpt基因和epsps基因连锁整合T0代转基因水稻植株。泳道1、2、3、5、6、7、8、9和10为hpt基因和epsps基因连锁整合T0代转基因水稻植株
188个T0代转基因水稻植株的PCR检测结果显示，hpt基因检测呈阳性的T0代转水稻植株共184株；hpt基因与epsps基因发生共转化T0代转基因水稻植株共141株，共转化率为76.63％，其中hpt基因和epsps基因连锁整合到水稻基因组的T0代转基因水稻植株共37株、连锁频率为26.24％(表1)，hpt基因与epsps基因非连锁整合到水稻基因组的T0代转基因水稻植株共104株、非连锁频率为73.76％。
表1.T0代转基因水稻共转化频率及连锁频率
三、T1代转基因水稻植株的分子检测
将步骤二中hpt基因与epsps基因发生共转化、且hpt基因与epsps基因非连锁整合到水稻基因组的T0代转基因水稻植株在温室中培养至成熟，套袋自交，收获种子。将每株水稻植株作为一个T1代株系。随机选择8个T1代株系进行分析，编号分别为70、74、139、216、247、255、256和296。
取8个T1代株系的种子，先用30％(质量百分比)次氯酸水溶液浸泡30min进行表面消毒，然后用无菌水冲洗3次，置于培养皿中，加入无菌水浸泡，37℃催芽。2天后待种子刚刚露白，选取萌发一致的种子胚芽鞘朝上放置于剪开小孔的96孔板中，一起置于盛有1/2MS培养液的培养盒中，光照交替培养(即光培养和暗培养交替，条件为：28℃；14小时光照培养/10小时黑暗培养；光照培养时的光照强度为90μE/m2/s)两周，获得T1代转基因水稻植株的两周幼苗。
按照步骤二中10的方法，提取T1代转基因水稻植株的两周幼苗的叶片基因组DNA，并分别采用引物对甲和引物对乙进行分子检测。
采用引物对甲进行PCR扩增，获得的电泳图见图5中A，采用引物对乙进行PCR扩增，获得的电泳图见图5中B(图5中，泳道M为DNAMarker，泳道N为以野生型水稻叶片的基因组DNA作为模板，泳道P为以植物表达载体pDTepsps-hyg作为模板，泳道1至泳道22为T0代转基因水稻植株)，结果显示，如果采用引物对甲不能够扩增获得大小约为861bp条带(图5中A的箭头所示)，且采用引物对乙能够扩增获得大小约为804bp条带(图5中B的箭头所示)，则为仅含epsps基因的T1代转基因水稻植株。泳道13为仅含epsps基因的T1代转基因水稻植株。
8个T1代转基因水稻株系中，6个株系出现了选择标记hyg基因与epsps基因的分离，从而筛选出无选择标记hpt基因且有epsps基因的转基因水稻T1代株系，说明T1代检测非连锁比率为75.00％，统计结果如表2所示，结果表明筛选出无选择标记的转基因后代，获得无选择标记的转基因植株的比率为42.39％。
无选择标记的转基因植株的比率＝T0代共转化率×T0代检测非连锁频率×T1代检测非连锁的比率。
表2.8个T1代转基因水稻株系中hpt基因与epsps基因分离比分析
注：hpt+表示hpt基因阳性；hpt-表示hpt基因阴性；epsps+表示epsps基因阳性；epsps-表示epsps基因阴性；T0植株基因遗传座位数通过对分离比群体按3:1，15:1，63:1的理论比例卡平方测验应用统计软件spss17.0计算获得；epsps+/hpt-植株频率(％)＝epsps+/hpt-植株数/总株数×100％；epsps+hpt+：同时具有hpt基因和epsps基因的植株；epsps-hpt+：只具有hpt基因而无epsps基因的植株；epsps+hpt-：只具有epsps基因而无hpt基因的植株；epsps-hpt-：hpt基因和epsps基因都没有的植株。
四、T2代转基因水稻植株的草甘膦抗性检测
将步骤三中仅含epsps基因的T1代转基因水稻植株在温室中培养至成熟，套袋自交，收获T2代转基因水稻种子。
实验重复三次，每次重复的步骤如下：取T2代转基因水稻种子100粒，先用30％(质量百分比)次氯酸水溶液浸泡30min进行表面消毒，然后用无菌水冲洗3次，置于培养皿中，加入无菌水浸泡，37℃催芽。2天后待T2代转基因水稻种子刚刚露白，选取萌发一致的种子胚芽鞘朝上放置于剪开小孔的96孔板中，一起置于盛有1/2MS培养液的培养盒中，光照交替培养(即光培养和暗培养交替，条件为：28℃；14小时光照培养/10小时黑暗培养；光照培养时的光照强度为90μE/m2/s)。当T2代转基因水稻幼苗长至四叶一心时，喷施30mg/L草甘膦水溶液，每100株T2代幼苗喷施量为30mL。分别喷施后的第3天，观察T2代转基因水稻幼苗的生长状态。
按照上述方法，将T2代转基因水稻种子替换为野生型水稻的种子，其它步骤均不变。作为对照。
实验结果(图6)表明，野生型水稻幼苗基本死亡，而T2代转基因水稻幼苗生长状态良好，仅叶尖部分萎蔫发黄。结果表明本实验室培育的转基因水稻对草甘膦有明显的抗性。

Claims (10)

1.一种植物表达载体，包含区段甲和区段乙；
所述区段甲依次包括如下元件：T-DNA右边界、选择标记基因表达盒、T-DNA左边界；
所述区段乙依次包括如下元件：T-DNA右边界、抗除草剂基因表达盒、T-DNA左边界。
2.如权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于：
所述区段甲中的T-DNA右边界和所述区段乙中的T-DNA右边界的核苷酸序列均如序列表中序列1自5’末端起第491至516位所示；
所述区段甲中的T-DNA左边界和所述区段乙中的T-DNA左边界的核苷酸序列均如序列表中序列1自5’末端起第7182至7207位所示。
3.如权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于：所述区段乙依次包括如下元件：所述T-DNA右边界、MAR序列甲、所述抗除草剂基因表达盒、MAR序列乙和所述T-DNA左边界。
4.如权利要求1至3任一所述的植物表达载体，其特征在于：所述选择标记基因表达盒和所述抗除草剂基因表达盒的方向相反。
5.如权利要求1至4任一所述的植物表达载体，其特征在于：
所述选择标记基因表达盒的核苷酸序列的反向互补序列如序列表中序列1自5’末端起第13533至15604位所示；
所述抗除草剂基因表达盒的核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端起第1797至5620位所示。
6.如权利要求1至5任一所述的植物表达载体，其特征在于：
所述区段甲的核苷酸序列的反向互补序列如序列表中序列1自5’末端起第13458至276位所示；
所述区段乙的核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端起第491至7207位所示。
7.如权利要求1至6任一所述的植物表达载体，其特征在于：所述植物表达载体的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
8.权利要求1至7任一所述植物表达载体在培育无选择标记抗除草剂转基因植物中的应用。
9.一种培育无选择标记抗除草剂转基因植物的方法，包括b1)或b2)：
b1)将权利要求1至7任一所述植物表达载体转化受体植物，借助所述选择标记基因或其对应的表型进行筛选，得到T0代植株；将所述T0代植株进行自交，得到含有所述抗除草剂基因且不含有所述选择标记基因的T1代植株，即无选择标记抗除草剂转基因植株；
b2)将权利要求1至7任一所述植物表达载体转化受体植物，借助条件甲和条件乙进行筛选，得到T0代植株；将所述T0代植株进行自交，得到含有所述抗除草剂基因且不含有所述选择标记基因的T1代植株，即无选择标记抗除草剂转基因植株；所述条件甲为所述选择标记基因或其对应的表型；所述条件乙为所述抗除草剂基因或其对应的表型。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述受体植物可为如下a1)至a6)中的任一种：
a1)双子叶植物；
a2)单子叶植物；
a3)水稻；
a4)籼稻；
a5)水稻品种明恢86；
a6)粳稻。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105734077A (zh) * 2016-04-05 2016-07-06 中国农业科学院作物科学研究所 一种表达载体及其在制备转基因植物中的应用
CN107475286A (zh) * 2017-08-04 2017-12-15 福建省农业科学院生物技术研究所 一种绿色安全无标记转基因水稻培育方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1597969A (zh) * 2004-09-20 2005-03-23 扬州大学 一种双t－dna载体及其在无选择标记转基因水稻培育中的应用
CN1214116C (zh) * 2002-03-15 2005-08-10 中国科学院遗传研究所 一种利用双t－dna载体培育无选择标记转基因水稻的方法
CN1654662A (zh) * 2004-02-09 2005-08-17 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种培育无选择标记转基因植物的方法及其专用表达载体
CN103468792A (zh) * 2013-07-11 2013-12-25 江西省农业科学院水稻研究所 水稻双t-dna转基因非连锁整合的分子标记检测方法
CN103898135A (zh) * 2012-12-26 2014-07-02 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种优化的获得无选择标记转基因生物的双t-dna表达载体及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1214116C (zh) * 2002-03-15 2005-08-10 中国科学院遗传研究所 一种利用双t－dna载体培育无选择标记转基因水稻的方法
CN1654662A (zh) * 2004-02-09 2005-08-17 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种培育无选择标记转基因植物的方法及其专用表达载体
CN1597969A (zh) * 2004-09-20 2005-03-23 扬州大学 一种双t－dna载体及其在无选择标记转基因水稻培育中的应用
CN103898135A (zh) * 2012-12-26 2014-07-02 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种优化的获得无选择标记转基因生物的双t-dna表达载体及其应用
CN103468792A (zh) * 2013-07-11 2013-12-25 江西省农业科学院水稻研究所 水稻双t-dna转基因非连锁整合的分子标记检测方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105734077A (zh) * 2016-04-05 2016-07-06 中国农业科学院作物科学研究所 一种表达载体及其在制备转基因植物中的应用
CN105734077B (zh) * 2016-04-05 2020-01-07 中国农业科学院作物科学研究所 一种表达载体及其在制备转基因植物中的应用
CN107475286A (zh) * 2017-08-04 2017-12-15 福建省农业科学院生物技术研究所 一种绿色安全无标记转基因水稻培育方法

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