CN1214116C

CN1214116C - 一种利用双t－dna载体培育无选择标记转基因水稻的方法

Info

Publication number: CN1214116C
Application number: CN 02107429
Authority: CN
Inventors: 朱祯; 李旭刚
Original assignee: Institute of Genetics of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2002-03-15
Filing date: 2002-03-15
Publication date: 2005-08-10
Anticipated expiration: 2022-03-15
Also published as: CN1445370A

Abstract

本发明提供了一种生产无选择标记转基因水稻的方法，包括：构建选择标记基因和目的基因分别位于两个独立T-DNA结构域的带MAR序列单子叶植物表达载体；利用表达载体转化单子叶植物水稻；分子检测筛选双T-DNA发生共转移的转化植株；种植转化植株后代株系，获得经遗传分离后去除了选择标记基因的转基因水稻。利用本发明的方法可以培育高效稳定的无选择标记转基因水稻。

Description

一种利用双T-DNA载体培育无选择标记转基因水稻的方法

发明领域

本发明涉及培育无选择标记转基因水稻的方法。

背景技术

水稻是中国第一大作物，其生产在中国国民经济中占有举足轻重的地位。近年来，由于人口的迅速增长、资源短缺与环境恶化、人民需求增加，中国粮食生产正面临着越来越严峻的挑战。因此，利用植物基因工程手段改良水稻，培育水稻优良新品种有着重要意义。随着植物转基因技术的长足发展，研究人员可以利用多种转化方法将外源基因转化到植物体内，如农杆菌介导法、基因枪法、PEG(聚乙二醇)、电激法等(Sawahel W A，et al.1992.Biotech Advances.10：393~412)。利用这些转化方法将外源目的基因导入到植物细胞时，通常只有部分细胞可以成为稳定的转化细胞。因此，一般在转化系统中使用抗生素抗性基因或除草剂抗性基因等作为选择标记基因筛选转化细胞。在选择压力下，不含选择标记基因及其产物的非转化细胞将死亡；转化细胞和组织则整合有选择标记基因而存在抗性，从而能够继续成活并分化成植株(Dale E C，etal.1991.Proc Natl Acad Sci USA.88：10558~10562)。选择标记基因的应用使植物基因工程成为可能。然而另一方面，选择标记基因及其蛋白产物毕竟不是基因工程的目的产品，这些基因存在于转基因植物中会带来许多问题，如影响环境和人类健康的安全性(Zechendorf B.1994.12：870~875)。人们担心选择标记基因及其产物在食用时可能有毒性或会引起过敏反应；尤其是选择标记基因编码产物如具有某一临床或肠道应用的抗生素抗性时，人们担心选择标记基因转移进微生物中将增强病原微生物的抗药性，从而引起抗生素失效。此外，如抗除草剂型的选择标记基因平行转移进野草中，可能会使其转变为难以控制的害草，造成生态平衡的破坏(Dale P J.1992.Plant Physiol.100：13~15)。再者，通过基因工程手段将多个目的基因重复转化导入受体植物中，集中高产、优质，抗虫、抗病等多种性状，是培育作物新品种的一种良策。经过一次转化获得的转基因植物如已存在选择标记基因，该基因在随后的再次转化中将不能再作为选择标记。目前可供利用的选择标记基因为数甚少，不可能每次转化都更换新的选择标记基因。但假如培育的转基因植物不含有选择标记基因，这个问题就会迎刃而解(Dekeyser R，et al.1989.Plant Physiol.90：217～223)。总言之，培育无选择标记基因的安全转基因植物有着重要的意义。水稻作为中国乃至世界上最重要的粮食作物之一，其转基因产品的无选择标记化尤为重要。

无选择标记转基因植物的研究和培育已成为国际上植物基因工程领域的一个方向。迄今，已有一些方法可获得不带选择标记基因的转化植物，如共转化方法，转座子成份介导法及位点特异性重组系统介导法等(Yoder J I，et al.1994.Bio/Technology，12：263～267)。

利用根癌农杆菌Ti质粒能够介导目的基因转化到受体植物基因组中。Ti质粒是根癌农杆菌中一种体外遗传的环状双链DNA分子。Ti质粒上的一段称为transferred DNA(T-DNA)的区段在毒性区(virulenceregion)的激活下能从质粒转移并整合到受体植物基因组中。在植物遗传转化过程中，T-DNA的每次转移和整合行为是独立的，它在植物染色体中的插入是随机的，可以插入到受体植物的任何一条染色体上(王关林等.1998.植物基因工程原理与技术.科学出版社.151～153)。共转化方法正是基于T-DNA插入随机性的原理。该法以两个分离的T-DNA(分别包含目的基因和选择标记基因)，共同转化受体植物，获得目的基因与选择标记基因分别整合于不同染色体的转化植株后，再经过遗传分离筛选只携带有目的基因的植株。Mcknight等(1987.Plant Mol Biol.8：439～445)用分别含有新霉素磷酸转移酶(neomycin phosphotransferase II，NPT-II)基因(nptII)和胭脂碱合成酶(Nopaline synthase，Nos)基因的两个载体共转化烟草，结果表明，分开的T-DNA在一定条件下共同转化植物时，可以分别整合在植物基因组的不同位点的。转化植株后代中，如果两个T-DNA结构域处于不同的染色体中，则发生分离，从而获得只含有单基因的转化植株。Komari等(1996.Plant J.10：165～174)将两个带有同源序列的T-DNA载体转化到农杆菌中，通过同源重组形成了单一“超级”Ti质粒载体。该“超级”载体含有两个T-DNA，分别包含选择标记nptII基因和报告基因β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase，GUS)基因(uidA)。利用此载体转化烟草，报告基因与选择标记基因的共转化频率为47％。通过对转基因植株后代进行分析，发现在部分植株后代中两个T-DNA可以分离，超过半数的转基因植株出现了GUS阳性而不带nptII活性。上述研究结果说明共转化方法可以获得无选择标记的转基因植物。

转座子成分能利用保守的切割粘连机制从植物染色体中的某个位置转移到新的遗传座位，转座后的新座位有一半的机率与原来的遗传座位不连锁。利用转座子成分的这一特性能够去除转基因植物中的选择标记基因和其它多余序列(Yoder J I，et al.1994.Bio/Technology.12：263～267)。Goldsbrough等(1993.Bio/Technology.11：1286～1292)把选择标记nptII基因插入到玉米转座子成分Ds的反向重复序列之间，把报告基因uidA构建在Ds反向重复序列外，然后以此载体转化番茄。结果发现在转座酶基因Ac作用下，Ds成分连带nptII基因转移到植物基因组中新的遗传座位。在转基因植株后代中uidA基因与nptII基因发生了分离，从而获得了只带uidA基因而无选择标记nptII基因的植株。

位点特异性重组系统是一类能够通过对特定DNA序列进行切割和重新连接，使其发生重组的DNA重组体系。近年来，这些系统也已被应用于转基因植物选择标记基因的剔除。其原理在于，把选择标记基因插入到两个同向位点特异性重组序列的中间，然后当载体转化植物后，再表达位点特异性重组酶基因，介导两个同向位点特异性重组序列重组，从而剔除选择标记基因。早期的研究需要通过二次转化或有性杂交导入重组酶，使得无选择标记转基因作物的选育过于复杂(Dale E C，et al.1991.Proc Natl Acad Sci USA.88：10558～10562；Russell S H，et al.1992.MolGen Genetic.234：49～59)。后来进一步发展的可调控表达的位点特异性重组系统可以一次性将目的基因、选择标记基因和重组酶转入受体植株中，然后在适当的时候诱导重组酶表达，进而去除选择标记基因和重组酶基因本身(Sugita K，et al.2000.Plant J.22：461～469；Hoff T，et al.2001.Plant Mol Biol.45：41～49；Zuo J，et al.2001.Nature Biotech.19：157～161)。可调控表达位点特异性重组系统介导策略简化了无选择标记转基因植物培育的程序。

尽管上述方法能用于培育无选择标记的转基因植物，但均存在一定的缺陷。共转化法和转座子成分介导法获得无选择标记转基因植株的频率偏低且操作相对复杂，周期较长。位点特异性重组系统介导的方法目前仅限于在烟草、拟兰芥等双子叶模式植物的应用，而单子叶植物水稻在遗传转化、基因调控表达等方面与双子叶植物存在着很大差异。

目的基因在转基因植物及其后代中的高效稳定表达是培育转基因优良作物的一个先决条件。然而已有的研究表明，外源基因在转基因植株中由于各种因素如DNA甲基化(DNA methylation)、反式失活(trans-inactivation)、共抑制(co-suppression)及位置效应(position effect)等的影响，经常会导致基因在转基因植株体内不表达或表达水平极低，发生了基因沉默(gene silencing)现象(Finnegan J，et al.1994.Bio/Tech.12：883～888)，因此有效提高并稳定目的基因在受体植物中的表达是植物基因工程利用中的一个关键问题。利用核基质结合区(matrix attachmentregion.MAR)序列克服外源基因失活是近年发展起来的一种有效方法。MAR是染色质上的一段特殊的DNA序列，富含AT，在碱基序列组成上大都包含A-box(AATAAAAA/CAA)，T-box(TTTTATTTTT)、TATAAA结构域及拓扑异构酶II识别切割序列(Mielke C，et al.1990 Biochemistry.29：7475～7845)。MAR可以通过与核基质结合，把染色质分隔为一个环状结构。这种染色质环不仅是染色体的结构单位，而且是独立的基因表达调控单位，其可以避免环内基因的表达受位置效应影响，从而提高目的基因在转化细胞中的稳定性和表达水平(Spiker S，et al.1996.PlantPhysiol.110：15～21)。研究表明，在转基因植物系统中，MAR序列的应用能够提高目的基因在受体植物中的表达水平及表达稳定性(Breyne P，etal.1992.Plant Cell.4：463～471；Allen G C，et al.1996.Plant Cell.8：899～913；Li X G，et al.2001.Science in China(series C).44：400～408)。

基于上述原因，本发明的目的是提供一种适合于单子叶植物的培育高效稳定无选择标记转基因水稻的方法。

本申请所披露的内容中，使用了很多术语。在申请中，“基因”是指编码一种特定蛋白的全部或部分的核酸片段，并包括该编码区前面(5’非编码区)和后面(3’非编码区)的调控序列。“目的基因”是指正常情况下宿主生物中没有的、通过基因转移导入的基因；也可指正常存在于宿主生物中的，但又被重新导入其基因组中其天然基因座之外的另一基因座的基因，这种变化会导致一种内源基因的编码序列的一个或几个额外拷贝的出现。

“启动子”是指一段可与RNA聚合酶及其他一些影响转录的反式因子结合而准确有效地起始转录的DNA序列。“组成型启动子”是能驱动目的基因在生物体各发育阶段和不同部位表达，且表达水平没有明显差异的一类启动子。“组织特异性启动子”是指驱动目的基因在生物体特定组织中表达的一类启动子。“器官特异性启动子”是指驱动目的基因在生物体特定器官中表达的一类启动子。“诱导型启动子”是指在一定的外界条件下(如光、温、化学物质等)诱导下驱动目的基因表达的一类启动子。

“植物表达载体”是指能驱动目的基因在植物体内表达的载体。

“Ti质粒”是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中的一种环状双链DNA分子，一般具有T-DNA区(transferred-DNA regions)、毒性区(virulence region)、质粒复制起点(origin of replication)和质粒结合转移位点(regions encoding conjugation)。在农杆菌侵染植物细胞时，T-DNA区在毒性区的激活下能从Ti质粒上转移并整合到植物染色体中。毒性区对T-DNA区的作用包括位于同一Ti质粒顺式方式和位于不同Ti质粒上的反式方式。Ti质粒载体系统根据毒性区对T-DNA区的作用方式可以分为一元载体系统和二元载体系统。前者T-DNA区与毒性区位于同一质粒上，后者T-DNA区和毒性区分别位于两个质粒上。Ti质粒载体系统目前被广泛应用于植物基因工程领域。

“T-DNA”是根农杆菌内Ti质粒上的一段能从质粒上转移并整合到寄主植物基因组中的DNA区段，即transferred DNA。T-DNA两端各有一段长约25bp的边界序列(border sequence)，分别称为左边界(TL)和右边界(TR)。边界序列的存在是T-DNA保留转移特性的必须元件。当保留T-DNA的边界序列时，以外源目的基因取代野生型T-DNA的部分基因组后，改造后的T-DNA仍能进入植物细胞并整合到植物染色体组上。T-DNA在受体植物染色体上的整合位点是随机的。目前，植物基因工程应用中野生型根农杆菌T-DNA中的致瘤基因被外源目的基因和选择标记基因替换，仅保留边界序列。

本发明利用体外构建的双T-DNA载体系统代替传统的两个载体共转化法，能较大地提高T₀代植株中目的基因与选择标记基因的共转化频率，进而提高无选择标记转化植株的获得频率。本发明同时创造性地将MAR序列应用于双T-DNA载体系统，MAR序列的应用能够提高目的基因在受体植物中的表达水平及表达稳定性(Li X G，et al.2001.Sciencein China(series C).44：400～408)。应用本发明能够培育高效稳定的无选择标记转基因水稻。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于培育无选择标记转基因水稻的双T-DNA载体。该载体上包含两个独立的T-DNA，分别携带选择标记基因和两侧有两个同向MAR序列的目的基因。在本发明所述的载体中，选择标记基因可以包括任何适用于水稻遗传转化的选择标记基因，例如潮霉素磷酸转移酶(hygromycin phosphotransferase，Hyg)基因(hpt)、膦丝霉素乙酰转移酶(phosphinothricin acetyltransferase，Bar)基因(bar)和5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase，EPSPs)基因等。核基质结合区(matrix attachment region，MAR)序列可以包括微生物、植物及动物来源的MAR序列。目的基因可以包括任何在生产上有应用价值的基因：抗虫基因、抗病基因、抗除草剂基因、抗逆基因、品质改良基因以及由上述基因组成的融合或多价基因。外源基因的启动子可以包括组成型启动子、器官特异性启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子或者由启动子和调控元件组成的复合启动子。

本发明的另一个目的是提供一种利用双T-DNA载体培育无选择标记转基因水稻的方法，该方法包括以下步骤：

(a)构建携带相应目的基因的双T-DNA植物表达载体，并转入根癌农杆菌中；

(b)利用农杆菌介导的方法，将构建好的植物表达载体转化水稻愈伤组织；

(c)PCR、Southern杂交分析T₀代水稻植株，筛选同时含有选择标记基因和目的基因的转基因水稻植株；

(d)种植中选T₀代植株自交所得的T₁代转基因水稻株系，进行选择标记基因反向筛选和目的基因PCR分析，排除选择标记基因和目的基因连锁整合的转基因水稻植株以及只含有标记基因的后代植株，获得只含有目的基因而不含标记基因的植株；

(e)种植中选T₁代植株自交所得的T₂代植株，通过PCR分析目的基因的分离比，并筛选出无选择标记转基因水稻的纯合株系。

本发明的再一个目的是提供由上述转化方法得到的水稻植株及其后代，以及以这些材料为亲本通过有性杂交转育所获得的携带有目的基因的水稻，所述的水稻可以是籼稻、粳稻或爪哇稻；包括的水稻材料可以是常规稻，杂交稻不育系、保持系、恢复系。

附图简要说明

图1：中间载体pCDMAR

图2：中间载体pC1300LacZ

图3：双T-DNA通用植物表达载体pCDMAR-Hyg

图4：携带目的抗虫基因修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂(cowpea trypsininhibitor，CpTI)基因(sck)的双T-DNA植物表达载体pCDMARUSCKHyg

图5：利用双T-DNA系统培育无选择标记转基因水稻的过程

图6：水稻转基因植株的获得 a：共培养；b：筛选；c：分化；d：生根

图7：转pCDMARUSCKHyg水稻自交T₁代植株PCR分析的电泳图谱

a：阴性对照；b：空白对照；c：阳性对照；1～16：sck目的基因和hpt选择标记基因共转移之T₀代植株自交所得的T₁代植株；1、7、16：只具有sck目的基因无hpt标记基因的植株；其它为非目标植株。

下面结合实施例进一步阐明本发明，而不构成对本发明权利要求范围的限制。在实施例中，所用的术语和缩写是本领域技术人员通用的术语和缩写。

实施例1：双T-DNA植物空表达载体pCDMAR-Hyg的构建

选用本实验室分离的来源于豌豆的MAR序列(Li X G，et al.2001.Science in China(series C)44：400～408)构建双T-DNA单子叶植物空表达载体pCDMAR-Hyg。Sma I/Sal I双酶切pPMAR(-)m获得PMAR片段，与BstX I/Xho I双酶切pC2300PMAR(T₄ DNA聚合酶削平BstX I)获得的大片段连接，获得质粒pCDMAR(图1)。EcoR I/Hind III双酶切pCAMBIA1300(Klenow补平酶切位点)，连接后获得质粒pC1300LacZ^-。Sac II/Sph I双酶切质粒pC1300LacZ^-(图2)，获得含有植物选择标记基因的T-DNA结构域，插入到pCDMAR的Sac II(T₄DNA聚合酶削平Sac II)位点，获得双T-DNA植物空表达载体pCDMAR-Hyg(图3)。构建过程中质粒提取、酶切、DNA的回收、纯化均按分子克隆中的方法进行(分子克隆：实验室手册，Sambrook et al，New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)。载体pCDMAR-Hyg含有两个T-DNA结构域。其中一个T-DNA结构域中含有CaMV35S启动子驱动的潮霉素磷酸转移酶(hygromycin phosphotransferase，Hyg)基因(hpt)表达结构作为单子叶植物选择标记基因。另一个T-DNA结构域中含有与LacZ相连的多克隆位点，该位点可用于插入各种目的基因。在多克隆位点的两侧插入了两段同向核基质结合区(matrix attachment region，MAR)序列，该序列可以提高和稳定外源基因在受体植物中的表达。

实施例2：双T-DNA植物抗虫表达载体pCDMARUSCK-Hyg的构建

选用修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂(cowpea trypsin inhibitor，CpTI)基因sck(李慧芬等.2001.高技术通讯.11：7～12)构建双T-DNA植物抗虫表达载体pCDMARUSCK-Hyg。经过修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因sck其表达产物可定点位于内质网中，使外源蛋白处于代谢不活跃的环境中，提高了外源蛋白在细胞内的稳定性和积累水平，因而抗虫能力得到明显增强。利用Pvu II/EcoR V双酶切质粒pBlueUSCK，获得泛素Ubiqutin基因启动子驱动的sck表达结构，插入到载体pCDMAR-Hyg的Sma I位点，得到植物表达载体pCDMARUSCK-Hyg(图4)。参照BIO-DAD公司电激仪的说明书，将此植物表达载体通过电激法转化到根农杆菌LBA4404。

实施例3：水稻转化植株的获得

取开花后12～15d水稻幼穗，剥去颖壳后在70％酒精中漂洗2min，然后在25％次氯酸钠中消毒30min，用无菌水冲洗3次后吸干水渍，取出幼胚，接种于诱导培养基上诱导愈伤组织。

将含植物表达载体pCDMARUSCK-Hyg的根农杆菌LBA4404接于20ml YEB液体培养基中(含Km，Rif各50mg/L)28℃避光培养过夜，次日按2％～4％转接到无抗菌素的YEB培养基中(含乙酰丁香酮100μM/L)，剧烈振荡培养3h。测OD值稀释至相应浓度(OD约0.5)。选取生长状态好的胚性愈伤为受体，加入相应浓度的根癌土壤杆菌液浸泡3～5min后将愈伤组织转接于共培养基上，28℃暗培养2～3d。将共培养愈伤组织于无菌培养皿中，用含Cef 400mg/L的无菌水漂洗2～3次，在无菌滤纸上吸干后转接于预培养基中25℃暗培养5～7d。然后依次经30～50mg/L HygB的严格筛选。获得的抗性愈伤组织在含50mg/LHygB的NMBr上进行分化(初期为暗培养，10～15d后为14h/d的光周期培养)。得到的抗性小芽再经含20mg/L HygB的NMBg上进一步生根成完整的抗性植株。待植株长至6～10cm时，进行开放式水培养，长出新根后移栽温室。

实施例4：T₀代转基因水稻植株的分子检测

4.1水稻总DNA的提取

取水稻新鲜叶片0.3mg置于研钵中，加液氮研成粉末，再加入0.6ml 60℃预热的CTAB缓冲液(30g/L CTAB，1.4mol/L NaCl，0.2％的巯基乙醇，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HCl，pH8.0)。60℃保温30min，其间轻摇数次。然后加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次，上清液转移到新的离心管中加入2/3倍体积异丙醇，形成的沉淀既是DNA，加入少许洗液(体积分数为76％的乙醇，10mmol/L NH₄AC)洗涤沉淀一次，干燥后用500μl TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA)溶解DNA。随后加入RNase A(终浓度10mg/L)，37℃保温30min，依次用等体积的苯酚、苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提一次，水相加入2.5倍体积无水乙醇沉淀DNA。DNA干燥后溶解于100μl无菌水中。

4.2 PCR检测

对T₀代共61个抗性克隆分化成的植株进行PCR检测。修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂(cowpea trypsin inhibitor，CpTI)基因sck扩增引物为：

P1，5’AAAATGAAGAGCACCATCTTC 3’；

P2，5’TCTAGAGTTCATCTTTCTCATC 3’。潮霉素磷酸转移酶(hygromycin phosphotransferase，Hyg)基因(hpt)k扩增引物为：

P3，5’TACACAGCCATCGGCCAGA 3’；

P4，5’TAGGAGGGCGTGGATATGTC 3’.反应体系为50μl中，包括：5μl 10×PCR反应缓冲液、1μl 10mM引物P1、1μl 10mM引物P2、1μl DNA模板、4μl 2.5mM dNTP，补加无菌水至总体积50μl。PCR反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性1min、52℃复性1min、72℃延伸1.5min，进行30个循环，最后72℃延伸10min。取10μl PCR产物进行琼脂糖电泳检测结果。PCR检测的结果显示sck基因与hpt基因发生共转化的克隆有39个，二者共转化率为63.93％。

4.3 Southern杂交

对部分共转化有sck基因与hpt基因的植株进行Southern分析。约40μg DNA加入适量的EcoR I酶切后，经1％的琼脂糖凝胶电泳分离，用0.4N NaOH转移到Hybond-N⁺(Amersham pharmacia)膜上，转移后的膜在2×SSC中洗一下，80℃真空固定2h。在含有7％SDS(W/V)的0.5M磷酸钠缓冲液中65℃预杂交2h。用[α-³²P]dCTP(Amersham pharmacia)随机引物法进行探针标记(Promega标记试剂盒)。65℃杂交过夜，0.1×SSC中65℃洗膜，压X光片，放射性自显影。杂交结果与PCR检测结果一致。

实施例5：无选择标记转sck基因水稻植株的获得

种植sck基因和hpt基因发生共转移的T₀代转化植株，套袋自交收获种子。种植自交获得的T₁代株系，对其中的6个T₁代株系进行PCR检测，对部分只含有sck基因而无hpt基因的植株进行Southern blot分析验证。总DNA提取、PCR检测及Southern blot分析的方法同实施例4。结果表明在6个株系中，sck基因与hpt基因均发生了分离。在6个株系的总共459个单株中，有129个植株是无选择标记hpt基因而具有sck抗虫基因，无选择标记转基因植株的平均获得频率为28.1％(表1)。

表1转双T-DNA载体pCDMARUSCKHyg T₁代水稻株系

sck基因与hpt基因分离比分析

T₁代株系编号	检测株数	sck(+)hpt(-)	sck(-)hpt(+)	sck(+)hpt(+)	sck(-)hpt(-)
T₁代株系编号	检测株数	sck(+)hpt(-)	sck(-)hpt(+)	sck(+)hpt(+)	sck(-)hpt(-)	MH09-3MH24-1MH12-1MH08-2MH20-7MH60-6总计比率	967584956247459	17263511152512928.10％	7021611275.88％	65494556451727760.35％	7021214265.66％

注sck：修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂(cowpea trypsin inhibitor，CpTI)基因

hpt：潮霉素磷酸转移酶(hygromycin phosphotransferase，Hyg)基因

sck(+)hpt(-)：只具有sck基因而无hpt基因的植株；

sck(-)hpt(+)：只具有hpt基因而无sck基因的植株；

sck(+)hpt(+)：同时具有sck基因和hpt基因的植株；

sck(-)hpt(-)：sck和hpt基因都没有的植株。

Claims

1.一种培育无选择标记转基因水稻的方法，包括以下步骤：

a.构建目的基因和选择标记基因分别位于两个独立T-DNA结构域的带核基质结合区序列单子叶植物表达载体；

b.利用双T-DNA单子叶植物表达载体转化单子叶植物水稻，产生转化植株；

c.检测转化植株，获得目的基因和选择标记基因共转移的水稻植株；

d.种植转化植株自交后代株系，筛选并培育通过遗传分离所产生的无选择标记转基因水稻。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，用带有目的基因的双T-DNA载体转化水稻受体组织是将待转化植物受体组织与有转化能力的根癌农杆菌接触而转化所述组织，所述菌株所含Ti质粒的两个独立T-DNA区分别含有目的基因和选择标记基因。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的水稻是籼稻、粳稻或爪哇稻。

4.按照权利要求3所述的方法，所述的籼稻、粳稻或爪哇稻，是常规稻，或者杂交稻不育系、保持系或恢复系。

5.按照权利要求1所述的方法，其无选择标记转基因水稻，是一种直接利用双T-DNA载体系统转化得到的无选择标记转基因水稻及以之作亲本通过有性杂交转育所获得的携带有目的基因的水稻材料。

6.按照权利要求1所述的方法，其目的基因是有应用价值的抗逆基因、抗虫基因、抗病基因、抗除草剂基因、抗衰老基因、品质改良基因或者由上述基因组成的融合或多价基因。

7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的载体带有能提高并稳定外源基因表达的核基质结合区序列。

8.按照权利要求7所述的方法，其所述的核基质结合区序列，是一种来源于植物、动物或微生物基因组来源的核基质结合区序列。