CN100523194C - 短芒披碱草转杀虫蛋白基因的技术方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种短芒披碱草转杀虫基因的技术，按照本技术，以短芒披碱草成熟胚为外植体，进行了愈伤组织再生、农杆菌介导的杀虫基因转化及转基因植株的杀虫性研究，建立了高效的愈伤组织再生体系；进行了遗传转化条件的研究，获得的抗性愈伤组织以体细胞胚发生途径形成再生植株，经过分子鉴定和杀虫性实验，获得了杀虫转基因短芒披碱草植株。杀虫转基因短芒披碱草具有杀草地飞蝗特性，在我国草原畜牧业发展、防止草地沙化等方面有广阔的市场前景。

Description

短芒披碱草转杀虫蛋白基因的技术方法

技术领域

本发明专利涉及一种短芒披碱草(Elymus breviaristatus)转杀虫蛋白基因技术的方法，属于农业生物技术领域或植物基因工程技术领域。

背景技术

草原的过度开发利用，是草原生态系统恶化-草地退化和荒漠化的主要因素，而蝗灾的危害则加速了草地生态环境的退化进程。这些因素致使川西北更为恶化，严重的影响了我国西部地区畜牧业的发展，增加了对蝗虫危害控制的难度。现在普遍采用的化学防治方法，但只能治标不能治本，还会带来环境污染等诸多社会公害，因此寻求生物防治和培育杀虫植物就显得十分重要。1985年，Vasil在国际草原学大会上第一次提出利用遗传转化技术将其它来源的特定基因导入牧草的可行性，为基因工程技术改良牧草，包括改善牧草营养品质，提高产量和利用率，增加牧草对逆境的适应能力，增强对各种虫害、病害的抗性等奠定了理论基础。

自1983年世界上第一例转基因烟草(Zambrysh，1983)诞生以来，植物转基因研究和应用发展迅速。到1997年为止，全世界转基因植物涉及到至少35科的200多个种，涵盖了绝大多数主要经济作物、观赏植物、药用植物、蔬菜、果树、树木和牧草(Birch，1997).截止1999年，至少30个国家进行了总计三万次以上的转基因作物的田间试验，改良的经济性状有十多个：已有大豆、玉米、棉花、油菜、蕃茄、马铃薯、烟草、西葫芦和蕃木瓜等九种作物的转基因品种投入了商业化生产。1999年，全球转基因作物的商业化种植面积达到3990万公顷，创造商业收入21-23亿美元，比1998年分别增加1210万公顷和5-7亿美元(James，1999)。2000年全球转基因作物品种商业化种植面积为4420万公顷，预计市场销售收入将达到30亿美元(James，2000)。

20世纪80年代以来，我国的植物基因工程研究也发展很快，尤其是农业生物基因工程技术发展迅速。目前报道的转基因牧草主要有苜蓿、多年生黑麦草(Lolium perenne L.)、中华结缕草(Zoysia sinica Steud.)及草地早熟禾(Poa pratensis L.)等少数品种，而且研究主要集中在提高其抗逆性和品质的改良上，而利用转基因技术培育杀虫牧草品种，国内外的研究都比较少。

短芒披碱草(Elymus breviaristatus)是禾本科披碱草属多年生、疏丛型草本植物，是国家重点保护野生植物之一。改品种具有很强的可塑性，对我国严寒的高原气候有很强的适应能力。短芒披碱草抽穗期草质优良，营养价值高，适口性好，能调制成营养丰富的青干草。但该品种也易遭受蝗虫的危害。蝗虫危害严重，是推广应用后保持草场稳产高产的一大障碍，也是急待解决的技术难题。

本实验室克隆到一种类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)杀虫蛋白基因，命名为scp，该基因在大肠杆菌中能够表达有活力的蛋白质，对蝗虫有很好的杀灭效果(杨志荣，朱文，葛绍荣等，类产碱假单胞菌防治草地蝗虫的研究[J].中国生物防治，1996，12(2)：55-57；刘世贵，朱文，杨志荣等，一株蝗虫病原菌的分离与鉴定[J].微生物学报，1995，35：90-96)。该杀虫蛋白与苏云金杆菌伴孢晶体相比较，存在着显著的差异性，且不易被蝗虫体内蛋白酶降解，因此，类产碱假单胞菌杀虫蛋白是一种新的更为安全的细菌杀虫蛋白(张文，杨志荣，朱文等.类产碱假单胞菌杀虫物质的分离纯化和鉴定[J].微生物学报，1998，38：57-62；杨志荣，朱文，葛绍荣等。中国生物防治[J]，1996，12(3)：114-116)。而有关类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因克隆及转基因植物的研究，国内外均未见报道。

利用基因工程培育和改良禾本科牧草品种是一种便捷和实用的途径，而且农杆菌转化技术已趋成熟，该方法具有操作简便、转化效率高、较少的插入拷贝数以及整合机制相对简单等优点，被植物转基因工作者广泛推崇。但由于禾本科植物自身的特点，许多牧草植物组织培养和再生体系的建立和完善较为困难，而禾本科草的转基因操作和应用研究难度更大。针对于此，本研究对禾本科牧草的组织培养和植株再生进行了探索性研究，在此基础上，建立了披碱草的农杆菌介导的遗传转化体系，以期为其转基因操作奠定良好的基础；同时，将类菌杀虫蛋白基因导入短芒披碱草，以提高其在病害环境中的生存能力，为畜牧业的发展提供保障。

发明内容

本发明涉及短芒披碱草转杀虫基因技术，杀虫转基因短芒披碱草(Elymus breviaristatus)新材料的创建。该杀虫蛋白基因来自类产碱假单孢菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)，该基因转入短芒披碱草基因组后，能够编码杀虫蛋白质，对草地飞蝗(直翅目(Orthoptera)蝗科(Locustidae))有致死作用。

1991年在重庆市歌乐山林场发现了许多黄脊竹蝗(Ceracris kiangsu)的自然病死虫，从虫尸内分离到一种病原菌，经回复感染原宿主，能引起原宿主致病并死亡，从虫尸体中分离到同样的病原菌，证明该病原菌为蝗虫自身的致病菌。经感染主要草地害虫的初步试验结果表明，该病原菌对多种草地蝗虫具有较高的感染力，5天的致死率高达90％以上，对草地的草原毛虫(Gynephorap runergensis)、粘虫(Leucania separata)也有一定的感染力。并对多种草地蝗虫有较强的感染力该菌株经鉴定为类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)(刘世贵，朱文，杨志荣，等.微生物学报[J]，1995，35(2)：86-89)。

近年来对其杀虫致死机理、杀虫蛋白(张文，杨志荣。微生物学报[J]，1998，38(1)：57-62)、安全性(杨志荣，朱文，葛绍荣等。中国生物防治[J]，1996，12(3)：114-116)等方面进行了深入研究，证明该菌对蝗虫致病，是由于其代谢产生的一种杀虫蛋白所致.该蛋白分子量为25100Da，在国内外属首次报道.经研究表明该菌无芽孢，本身具有较强毒蛋白，故具有构建成为遗传工程菌广泛用于生物防治的潜力。

短芒披碱草(Elymus breviaristatus)是禾本科披碱草属多年生、疏丛型草本植物，是国家重点保护野生植物之一。改品种具有很强的可塑性，对我国严寒的高原气候有很强的适应能力。短芒披碱草抽穗期草质优良，营养价值高，适口性好，能调制成营养丰富的青干草。短芒披碱草是适合川西北牧区建设高产优质打贮草基地的主要栽培草种。但该牧草蝗虫危害严重，是推广应用后保持草场稳产高产的一大障碍，也是急待解决的技术难题。

本发明的一个目的就是建立短芒披碱草转杀虫蛋白基因技术的方法。

具体地，就是建立短芒披碱草愈伤组织再生系统，利用具有自主知识产权的类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因，构建转化短芒披碱草愈伤组织的表达载体，然后对转化后愈伤组织进行抗性筛选和分化，再生出植株，从而创建杀蝗虫转基因短芒披碱草。

本发明所需的类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因(scp)(GenBank：DQ790644)的克隆和类产碱假单胞菌杀虫蛋白的分离纯化及方法详见本实验室的另一专利-类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因(授权号：ZL200310110908.X)。该杀虫蛋白基因能够在大肠杆菌中进行表达，其表达产物对直翅目昆虫有毒杀作用。该杀虫蛋白基因可以不经改造，利用全长的野生型基因或只用其5’端314-1078核苷酸共765bp的毒性区序列，均可直接用于植物细胞核转化。同时对基因序列进行人工改造，并选择适宜的表达载体，可显著提高其表达量或杀虫效果。

本发明所需的表达载体是已知的，为一种改造后的双元载体pCAMBIA1304。在进行植物转化时，可将该基因插入到单子叶植物通用的质粒pCAMBIA1304上，并在植物基因启动子Ubi的驱动下，其T-DNA可定点插入植物基因组中。

本发明的另一个目的是提供一种生产杀虫的转基因单子叶植株的方法，包括短芒披碱草愈伤组织再生系统的建立方法和杀虫蛋白基因转化单子叶植物的程序。

单子叶植物遗传转化是否成功的关键之一就是建立其高效而稳定的愈伤组织再生系统。本发明通过选择适宜的外植体材料，优化影响短芒披碱草出愈和分化的各种参数，首次建立了高效而稳定的短芒披碱草愈伤组织再生系统，为其遗传转化提供了保障。

附图说明

图1是pCAMBIA1304-scp转化载体构建

图2是pCAMBIA1304-scp转化载体的验证：M1和M2为DNA marker，1是pUC18-scp质粒的PCR片段，2是pCAMBIA1304质粒PCR，3～6是pCAMBIA1304-scp质粒的PCR片段，7是pCAMBIA1304-scp质粒Nco I和Bst EII双酶切片段，8是pCAMBIA1304-SCP质粒。

图3是短芒披碱草抗性愈伤组织的再生过程：A潮霉素筛选后的抗性愈伤组织及分化(①开始分化的潮霉素抗性愈伤组织，②球形胚，③已经分化的潮霉素抗性愈伤组织，④梨形胚)；B抗性愈伤组织的分化植株。

图4是转化植株的PCR验证：M：Del2000；1-4是转化植株植株(引物为SCF和SCR)；5是转化植株(引物为hptII F和hptII R)；NC：阴性对照，PC：阳性对照。

图5是转化植株的Southern杂交鉴定：1-3是转化植株；NC：阴性对照，PC：阳性对照。

图6是转化植株的RT-PCR鉴定：1，2为转化植株，3非转化材料作阴性对照，4未加AMV RTase XL(作阴性对照)，5为阳性对照。(a内标基因，b目的基因)。

具体实施方式

下文将通过实施例对本发明做进一步说明，但实施例不以任何方式限制本发明。

实施例1

短芒披碱草愈伤组织再生系统的建立

1.1 外植体准备

将成熟种子经过两次温水浸泡和阴干后，剥去外颍壳后，用70％乙醇浸泡90s，再转入0.1％升汞浸泡15min，中间摇动2-3次，用无菌水冲洗3-4次，接种在诱导培养基上。待长出愈伤组织后，接到继代培养基上培养。每4周继代一次。当愈伤组织形成大量结构致密、颗粒状、黄白色的胚性愈伤组织后，可将胚性愈伤组织转至分化培养基上。经过1-2月培养后，长出1-2cm的幼苗，再将其转移到生根培养基。待苗长大并长出根后经2-3天的温室炼苗后移植到土中。

愈伤组织的诱导和继代培养在黑暗中进行，愈伤组织的分化和幼苗生根培养的培养条件为25-26℃，每日光照12h，光强20001x。

1.2 愈伤组织诱导培养基的筛选

选用单子叶植物愈伤诱导常用的MS，N6和MSN6三种基本培养基，在其愈伤组织诱导培养基上，分别接种120粒成熟的牧草种子，并设置三个重复，30天后计数每种培养基的出愈数，计算其出愈率。

1.3 2，4-D浓度和不同外植体的选择

设置3mg/L、6mg/L、9mg/L¹和12mg/L四个不同的2，4-D浓度，在MS诱导培养基上，对牧草品种的成熟胚进行愈伤组织诱导，以期对愈伤诱导寻求一个较为适宜的激素浓度。

1.4 添加植物生长调节剂对愈伤组织诱导的影响

分别在MS诱导培养基上添加NAA、6-BA、KT和ABA四种植物激素，设置三个重复，每个接种120粒外植体，培养20天后观察出愈情况，并计算出愈率，筛选适宜披碱草出愈的激素种类。实验结果表明，2，4-D和KT是短芒披碱草愈伤组织再生的必须生长调节剂。单独使用2，4-D或其它的植物生长调节剂，短芒披碱草的出愈率极低或不出愈，并且难以分化。愈伤组织诱导的最佳的激素组合为6.0mg/L2，4-D和0.05mg/LKT；而愈伤组织分化的最佳激素组合为2.0mg/LNAA。所以愈伤组织诱导的最适培养基为MS基本培养基并添加6.0mg/L2，4-D和0.05mg几激动素，出愈率可达到85.6％，而最适的分化培养基为1/2MS盐添加2.0mg/LNAA，约有54.3％的愈伤组织能分化出芽并生根。

1.5 愈伤组织分化培养基的筛选

在MS，N6和MSN6三种不同的基本培养基上，分别接种50粒质地基本一致的胚性愈伤组织，设置三个重复，在25-26℃，光强20001x条件下，每日光照12h，培养60天，观察愈伤组织的分化情况，选择适宜愈伤组织分化的培养基。

1.7 愈伤组织继代培养时间对其分化能力的影响

在愈伤组织易分化的培养基MS培养基上，分别接种50粒质地基本一致的胚性愈伤组织，观察继代培养20天、40天、60天、80天和100天后，愈伤组织的分化情况，根据分化率来确定愈伤组织的继代时间。

1.8 植物生长调节剂对愈伤组织分化能力的影响

在MS分化培养基里分别添加不同浓度的NAA、KT和NAA与KT组合，观察每种组合愈伤组织的分化率，以确定添加物的种类和浓度。同时，研究减少蔗糖和MS浓度对披碱草愈伤组织分化率的影响。

实验结果表明，继代培养时间对愈伤组织的诱导和分化产生影响。刚诱导出的愈伤组织分化能力很弱，继代一定时间后，愈伤组织分化为不同类型的愈伤组织，其中质地紧密，颗粒状，黄色愈伤组织分化能力最强，而其他类型分化能力很弱甚至不分化。同时实验表明，在愈伤组织分化时，降低培养基中无机盐特别是钙离子的浓度，可以促进愈伤组织的分化。

1.9 短芒披碱草组培体系的建立

经过筛选和优化，建立了短芒披碱草组培体系的最佳方案：

愈伤组织诱导的培养基配方：(暗培养40d)

MS+2，4-D6.0mg/L+KT0.05mg/L+3％Sucrose+1.0％琼脂，pH5.8

愈伤组织继代培养的培养基配方：(暗培养，每8周继代一次，共2次)

MS+2，4-D5.0mg/L+KT0.05mg/L+3％Sucrose+1.0％琼脂，pH5.8

愈伤组织分化的培养基配方(260C，2000Lux，光照培养1-2月)

1/2MS+NAA2.0mg/L+2％Sucrose+1％琼脂，pH5.8

生根培养基的配方：(260C，2000Lux，光照培养)

1/2MS+NAA2.0mg/L+2％Sucrose+1％琼脂，pH5.8

在此组培体系下，披碱草成熟胚的出愈率可达到85％以上，分化率在55％以上，移栽成活率达到50％以上(再生过程见附图3)。

实施例2

短芒披碱草程序化转基因体系的建立。

2.1 短芒披碱草转化载体pCAMBIA1304-scp的构建。

克隆玉米的Ubi启动子，替换pCAMBIA1304质粒载体上的一个35s启动子。然后从含有杀虫蛋白基因的pUC18质粒上高保真克隆出scp杀虫蛋白基因。按照分子克隆实验手册上的方法，将scp基因定点插入到pCAMBIA1304质粒载体上NcoI和BstEII之间，通过双酶切和PCR来验证scp片段是否连接到pCAMBIA1304质粒上(具体的构建方法和验证见附图1，2)。

2.2 农杆菌转化

2.2.1 大肠杆菌CaCl₂法感受态细胞的制备及转化

大肠杆菌(Esherichia coli)DH5α感受态细胞的制备。LB平板上挑取DH5α单菌落，在2ml LB培养基中37℃培养过夜。取0.5ml培养物，加入50ml LB培养基中16℃继续培养至OD₆₀₀≈0.5。加入50ml离心管中，4℃离心收集菌体。用500μl 0.1mol/L冰CaCl₂重悬，冰浴30分钟后再离心，用200μl0.1mol/L冰CaCl₂重悬，于0℃保存30分钟至24小时后用于转化。

大肠杆菌的转化。在200μl感受态细胞中加入5-10μl质粒，冰浴30分钟后，迅速放入42℃水浴中热激2分钟，迅速取出后0℃放置2分钟。然后加入800μl LB，37℃培养1小时。最后离心2分钟，将菌体涂布于LB+抗生素的平板上，37℃培养过夜。

2.2.2 农杆菌感受态细胞的制备和转化(王关林等，植物基因工程原理与技术，科学出版社，1999).

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105，感受态细胞的制备。根癌农杆菌菌液于28℃培养至OD₆₀₀≈0.5时，4℃离心收集菌体，用0.1mol/L冰CaCl₂重悬，冰浴30分钟后离心，用0.1mol/L冰CaCl₂重悬后，于0℃保存。

冻融法转化根癌农杆菌。在200μl感受态细胞中加入5-10μl质粒，冰浴30分钟后，在液氮中速冻1-2分钟，迅速取出，放入37℃水浴中溶解。溶解完全后加入800μl LB，28℃培养3～5小时。最后离心2分钟，将菌体涂布于LB+利福平(40mg/L)+链霉素(25mg/L)+卡那霉素(75mg/L)平板上，28℃培养2天。

2.3 通过愈伤组织转化短芒披碱草

2.3.1 潮霉素(Hn)有效筛选浓度的试验

设置20mg/L、40mg/L、60mg/L和80mg/L四个潮霉素浓度处理，每个处理接入100个左右长势旺的胚性愈伤组织。26.0℃暗培养10d后，观察愈伤组织生长情况，选择合适的潮霉素筛选浓度。实验结果显示，80mg/L潮霉素浓度造成披碱草愈伤组织迅速死亡，而细胞在死亡过程中会分泌大量的有毒次生代谢物质，因此在选择培养基上使用这个潮霉素浓度筛选转化细胞，势必造成转化细胞的生长受抑制，影响转化效率。20mg/L和40mg/L潮霉索不能有效抑制披碱草愈伤组织生长，若用于抗性愈伤组织筛选，容易造成大量的非转化细胞的逃逸。而60mg/L潮霉素既能有效抑制愈伤组织的生长，又不至于造成细胞迅速死亡，是比较理想的筛选浓度。

2.3..2 愈伤组织生理状态与农杆菌侵染的关系

取两个不同状态的愈伤组织，即直接诱导1月的愈伤组织和继代培养2月后的愈伤组织。经相同条件的预培养、共培养和抗性筛选，然后统计和比较两处理的抗性愈伤率，选择适合农杆菌侵染的愈伤组织生理状态。实验发现直接诱导产生的愈伤组织的质地较硬，成块状，黄白色：而继代以后的愈伤的质地较松散，颗粒状，黄色。取大小基本相同的两种愈伤，经相同条件的预培养、共培养和筛选培养。试验结果表明，继代培养的愈伤组织经转化后能获得更高的抗性愈伤率。

2.3.3 不同共培养培养基与农杆菌侵染的关系

设置五种不同共培养培养基处理。经相同培养时间、相同的农杆菌处理浓度和相同筛选培养基的条件培养后，通过统计和比较不同处理的抗性愈伤率，确定最适的预培养和共培养培养基。不同处理的抗性愈伤组织数和抗性愈伤率的结果见下表。

预培养与共培养培养基对抗性愈伤率的影响

注l：培养基

1)：MS+2，4-D6.0mg/L+100μMAS+2％Sucrose+1％Glucose+1％Agar Powder

2)：1/2MS+2，4-D6.0mg/L+100μMAS+2％Sucrose+1％Glucose+1.0％Agar Powder

3)：1/4MS+2，4-D6.0mg/L+100μMAS+2％Sucrose+1％Glucosc+1.0％Agar Powder

4)：1/4MS+100μMAS+CH600mg/L+2％Sucrose+1％Glucose+1.0％Agar Powder

5)：AA+2，4-D5.0mg/L+100μMAS+2％Sucrose+1％Glucose+1.0％Agar Powder

注2：培养基pH：预培养培养基pH5.8，共培养培养基pH5.6

统计结果显示，不同共培养培养基对农杆菌的侵染影响很大。随着培养基无机盐浓度的降低，抗性愈伤率逐渐增高，也即农杆菌的侵染力逐渐增强。而在培养基中添加氨基酸和短肽对提高抗性愈伤率影响不大，因此选择3号培养基作为共培养基。

2.3.4 农杆菌处理菌液浓度与其侵染力的关系。

用相同的悬浮培养基配制0.5OD、1.0OD、1.5OD和2.0OD四种农杆菌菌液浓度，分别处理预培养后的质地、大小和生理状态基本一致的愈伤。处理后，经相同的方法共培养和筛选，最后统计和比较不同处理的抗性愈伤率，确定农杆菌的最适使用浓度。

用接种环将LB培养基上生长2d后的农杆菌刮入MS₀液体培养基，振荡培养3～4h，用分光光度计600nm波长光测定，调至0.5OD、1.0OD、1.5OD和2.0OD四种菌液浓度。按前面介绍的方法侵染、共培养和筛选培养。两次筛选培养后，统计抗性愈伤数，结果显示，并不是农杆菌苗液浓度越高，则抗性愈伤率越高；而是1.0OD浓度的农杆菌苗液侵染愈伤组织才能获得最高的抗性愈伤率。

2.3.5 共培养温度与农杆菌侵染的关系

预培养后的愈伤组织，经相同的农杆菌苗液处理后，分别置于15℃，19℃，23℃和27℃四种温度条件下共培养。共培养后，经相同的方法和条件筛选，最后统计和比较不同处理的抗性愈伤率，确定最适的共培养温度。实验结果表明，19℃～23℃共培养温度条件下，农杆菌具有最高的侵染活性，产生最高的转化率。

2.3.6 程序化转基因体系的建立及其有效性的验证试验

根据各项参数优化试验的结果，建立模式化的农杆菌介导的牧草转基因操作体系，并严格按照这个操作程序进行三次重复实验，验证该实验程序的有效性和稳定性。

2.4 转化植物的分子检测

2.4.1 转基因植株基因组总DNA的提取、PCR和southern blotting分析

取1-2g新鲜叶片，采用CTAB法抽提待测的植株的基因组DNA。用DNA含量测定仪测定DNA浓度，用TE将各样品的DNA浓度调至300ng/ul和30ng/ul各一份，存于4.0℃备用。以插入了scp片断的质粒作阳性对照，非转化植株作阴性对照，通过PCR来验证试验材料的基因组DNA中是否转入了类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因(scp)和潮霉素磷酸转移酶(hptII)基因，试验结果见图4。

通过Southern blotting分析验证scp基因是否转入目的植株。取10μg待测材料的基因组DNA，用HindIII消化；取10μg非转化植株的基因组DNA，用同样的酶消化，作阴性对照；同时取10pg质粒pCAMBIA1304-scp进行EcoRV酶切，作为阳性对照。电泳检测酶切是否完全。在电压为45V，胶浓度为0.8％的琼脂糖凝胶中电泳16-18h，然后转移到尼龙膜上。用扩增scp基因约500bp片断作为杂交探针的模板，采用PCR法对探针实行地高辛-dUTP(digoxigenin(DIG)-dUTP)(PCR DIG Probe Synthesis Kit，Roche)标记。然后用(DIG)-dUTP)标记的scp基因探针与尼龙膜上的DNA片段进行杂交，试验结果见图5。

2.4.2 转基因植株RT-PCR分析

提取待测植株的总RNA，事先采用乙醇沉淀法将RNA样品浓缩至3μg/μL以上。使用TaKaRa公司的One Step RNA PCR Kit(AMV)进行RT-PCR反应，反应结束后，取PCR反应液8μl进行1％的琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物

实验显示(图6)，转基因材料中，内标基因和目的基因均能够正常表达，非转化材料只有内标基因表达，未加AMV RTase XL的转基因材料目的基因和内标基因均不表达，实验结果表明，外源基因在短芒披碱草基因组中能够正常转录，形成RNA。

2.5 转基因植株的杀虫性鉴定

取杀虫蛋白基因转化体(T1代)的叶片饲喂竹蝗，四天后统计蝗虫死亡率。结果表明短芒披碱草杀虫蛋白基因转化体具有较高的杀虫性。此结果证明了本发明中的类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因在短芒披碱草中能够高效表达，并且杀虫效果显著。

2.6 农杆菌介导的短芒披碱草转基因操作体系及体系效率的验证

根据以上的试验结果，建立操作程序如下：

(1)成熟胚去壳，70％乙醇泡lmin，0.1％升汞消毒15min，无菌水洗3～-4次，接种到诱导培养基上，26℃暗培养诱导愈伤组织。

(2)诱导培养2月后，取活力强、颗粒状愈伤转入继代培养基继代培养。

(3)取继代培养2月的愈伤颗粒，接入预培养培养基，26℃暗培养3d。然后接入诱导培养

(4)在预培养的第二天，用LB(LB+1.5％琼脂)划线接种农杆菌菌株，28℃静止培养2d之后，将农杆菌全部刮入MS₀液体培养基；28℃，200rpm振荡培养3--4h。分光光度计600nm波长光测定菌液浓度，调至1.0OD。

(5)将预培养后的愈伤组织接入100ml桶形瓶，加入调制好的农杆菌苗液，浸泡30min；中间摇动数次。

(6)倒去菌液，将愈伤置于灭菌滤纸上吸干表面菌液，接入共培养培养基，暗培养3d，

(7)将共培养后的愈伤用无菌水先快速摇动清洗两次；然后加入无菌水浸泡10min，使愈伤组织内部的菌体游离出来；倒去洗液，再加入含400mg/L羧苄青霉素的无菌水浸泡15min；倒干洗液，将愈伤置于灭菌滤纸上吸干，接入筛选培养基；26℃暗培养。每两周继代一次，共两次。

(9)将共培养后的愈伤组织转入分化培养基(改用三角瓶或平底试管)；25℃，2000Lux光照(16/8)培养，再生转基因植株。

(10)待小植株3～5cm：转入生根培养基上发根。

(11)将根系健壮的植株移入盆钵，凉棚过渡3～5d；然后移到自然条件下生长，直至成熟。

建立的这个经过优化的转基因体系，效率究竟如何？需要经过试验验证.试验设三个重复严格按上面操作程序，试验结果下表。

农杆菌介导的短芒披碱草基因转化系统的转化效率

从试验的结果看，建立的短芒披碱草农杆菌介导的转基因体系具有很高的抗性愈伤率：最高达到56.3％，平均为53.9％；以及较高的转化率，平均为42.6％，完全能满足实际工作的需要。

Claims (1)

1、一种短芒披碱草转杀虫蛋白基因技术方法，包括：

(1)外植体制备及愈伤组织诱导：短芒披碱草成熟种子去壳，70％乙醇泡90s，0.1％升汞消毒15min，无菌水洗3-4次，接种到诱导培养基上进行愈伤组织诱导，26℃暗培养；所述愈伤组织诱导培养基的成分及其含量为：MS+2，4-D6.0mg/L+KT0.05mg/L+3％Sucrose+1.0％琼脂，pH5.8；

(2)愈伤组织继代培养：所述外植体诱导培养40d后，取愈伤组织转入继代培养基继代培养，每8周继代一次，共2次，26℃暗培养；所述继代培养基的成分及其含量为：MS+2，4-D5.0mg/L+KT0.05mg/L+3％Sucrose+1.0％琼脂，pH5.8；

(3)类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因表达载体的构建：所述表达载体的启动子为Ubi启动子；所述表达载体的杀虫蛋白基因为类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因；所述杀虫蛋白基因序列登记号为：GenBank DQ790644；所述表达载体的构建方法：①克隆玉米的Ubi启动子，替换pCAMBIA1304质粒载体上的一个35s启动子；②从含有杀虫蛋白基因的pUC18质粒上高保真克隆出类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因，将类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因定点插入到pCAMBIA1304质粒载体上NcoI和Bst EII之间；③将构建出的类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因表达载体转化进入根癌农杆菌EHA105；

(4)愈伤组织预培养：所述的愈伤组织为步骤(2)继代培养后产生的黄白色、颗粒状的胚性愈伤组织；取愈伤组织接入预培养基，预培养温度及条件为26℃暗培养3d；所述预培养基的成分及其含量为：1/4MS+2，4-D6.0mg/L+100μMAS+2％Sucrose+1％Glucosc+1.0％Agar Powder，pH5.8；

(5)愈伤组织与农杆菌共培养：所述的愈伤组织为步骤(4)预培养后的愈伤组织；所述共培养使用的农杆菌为含有步骤(3)构建的类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因表达载体的农杆菌EHA105，其侵染愈伤组织的最佳农杆菌液浓度为1.0OD；共培养条件为19-23℃暗培养3d；所述共培养基的成分及其含量为：1/4MS+2，4-D6.0mg/L+100μMAS+2％ Sucrose+1％Glucosc+1.0％ Agar Powder，pH5.6；

(6)愈伤组织分化培养：所述愈伤组织分化培养的潮霉素筛选浓度为60mg/L；所述愈伤组织分化培养期抑制农杆菌生长的羧苄青霉素浓度为400mg/L；所述愈伤组织分化培养的条件为26℃，每天2000Lux光照培养16小时、暗培养8小时，培养4周；所述分化培养基的成分及其含量为1/2MS+NAA2.0mg/L+2％ Sucrose+1％琼脂，pH5.8；

(7)愈伤组织的生根培养：所述愈伤组织生根培养的选择压与步骤(6)相同，即潮霉素浓度为60mg/L，羧苄青霉素浓度为400mg/L；所述愈伤组织生根培养的条件为26℃，2000Lux，光照培养直到再生出抗性植株；所述生根培养基的成分及其含量为1/2MS+NAA2.0mg/L+2％ Sucrose+1％琼脂，pH5.8。

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