CN103250636B

CN103250636B - 豆类植物高效体胚发生与植株建成

Info

Publication number: CN103250636B
Application number: CN201210038793.7A
Authority: CN
Inventors: 朱木兰; 卫志明
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2012-02-20
Filing date: 2012-02-20
Publication date: 2016-01-27
Anticipated expiration: 2032-02-20
Also published as: CN103250636A

Abstract

本发明涉及豆类植物高效体胚发生与植株建成。具体地，本发明方法以豆类幼嫩的子叶切块为起始外植体，经体细胞胚胎发生途径，成功建成大量的再生植株，所述方法包括步骤：对豆类幼嫩子叶进行剥离与切割，获得子叶切块；对子叶切块进行诱导，获得胚性愈伤组织；进一步诱导胚性愈伤组织，获得体细胞胚胎；以及将体细胞胚胎再生为植株。本发明的豆类体细胞胚胎发生方法快速高效，且植株遗传稳定性好。

Description

豆类植物高效体胚发生与植株建成

技术领域

本发明涉及植物生物学和植物组织工程学领域，具体地，本发明涉及豆类植物高效体胚发生与植株建成。

背景技术

目前全球人口膨胀，地球资源遭到日益严重的威胁，粮食产量和粮食安全成为21世纪的重要课题。在我国，水稻、小麦、玉米、棉花和大豆等五大作物是保障国家经济发展和农业安全的重要战略物资。

豆类是我国最常见的经济农作物，包括大豆，豌豆，蚕豆，绿豆，赤豆，菜豆，芸豆等。大豆(GlycinemaxL.)属豆科，蝶形亚科，大豆属的二倍体(2n＝40)植物，既是重要的油料作物和粮食作物，全球植物蛋白的主要来源，又是植物功能基因组研究中重要的模式植物。

虽然稻类，小麦，玉米，棉花等育种取得了长足的进步，但是大豆的常规人工育种技术长期受到育种年限长、多基因重组率低、性状连锁难以打破、远缘杂交困难等问题的困扰。随着植物分子操作技术的发展，遗传转化手段使物种间的生殖隔离得以打破，实现了遗传物质的种间交流，为大豆的遗传育种带来新的生机。然而也存在着许多问题，如目前广泛使用的大豆遗传转化系统存在遗传转化频率低(平均转化效率远低于2％)、嵌合体发生频率高、外源基因逃逸等缺陷，这些问题严重地滞缓了大豆的遗传育种和品种改良进程。

目前本领域还没有大规模大跨度的分子育种方法，因此，本领域非常需要开发新的再生豆类体系和方法，尤其是高效再生大豆植株的方法，以克服现有技术中存在的瓶颈问题。

发明内容

本发明的目的就是提供一种制备豆类体细胞胚胎和植株的方法及应用。

在本发明的第一方面，提供了一种制备豆类植物体细胞胚胎的方法，包括步骤：

(1)提供豆类植物的子叶切块，并对所述子叶切块进行诱导，获得胚性愈伤组织；和

(2)对获得的胚性愈伤组织进行诱导，获得体细胞胚胎。

在另一优选例中，所述子叶切块切过的周长占总周长的至少50％，较佳地60％，更加地为100％。

在另一优选例中，所述的子叶切块为上表面积为1mm×1mm-5mm×5mm的子叶切块，较佳地为上表面积为2mm×4mm的子叶切块。

在另一优选例中，所述的子叶切块来自于豆类的幼嫩豆荚。

在另一优选例中，所述的幼嫩豆荚是在豆类植物开花2-6周(较佳地3-5周)时采摘的。

在另一优选例中，步骤(1)所述的诱导为：将子叶切块接种于含2，4-D和蔗糖的MSB培养基中培养。

在另一优选例中，步骤(1)中MSB培养基中2，4-D的浓度为10-50mg/L，较佳地30-40mg/L，最佳地40mg/L。

在另一优选例中，步骤(1)中MSB培养基中蔗糖的浓度为1-10wt％，较佳地5wt％。

在另一优选例中，步骤(1)所述的诱导是在光照强度为5-20μmol.m^-2.s^-1(较佳地10μmo1.m^-2.s^-1)的条件下进行的。

在另一优选例中，步骤(2)所述诱导为：将步骤(1)获得的胚性愈伤组织接种于含2，4-D、AgNO₃和蔗糖的MSB培养基中进行培养。

在另一优选例中，步骤(2)获得的体细胞胚胎为球形胚。

在另一优选例中，步骤(2)中MSB培养基中2，4-D的浓度为10-50mg/L，较佳地30-40mg/L，最佳地30mg/L。

在另一优选例中，步骤(2)中MSB培养基中AgNO₃的浓度为1-10mg/L，较佳地2-7mg/L，最佳地5mg/L。

在另一优选例中，步骤(2)中MSB培养基中蔗糖的浓度为1-10wt％，较佳地6wt％。

在另一优选例中，步骤(2)所述的诱导是在光照强度为10-20μmol.m^-2.s^-1的条件下进行的。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤(3)：

(3)以步骤(2)获得的体细胞胚胎作为受体，转入外源基因，从而获得转基因的体细胞胚胎。

在另一优选例中，所述的外源基因包括(但不限于)：抗性基因；标记基因；豆类品质相关基因。

在另一优选例中，所述的抗性基因选自下组：抗除草剂基因、抗病毒基因、耐寒基因、和抗虫基因。

在另一优选例中，所述的标记基因选自下组：gus(β-葡萄糖苷酸酶)基因、hyg(潮霉素)基因、和gfp(绿色荧光蛋白)基因。

在另一优选例中，所述的豆类品质相关标记基因选自下组：脂肪改良相关基因、雄性不育相关基因、花形相关基因、和花色相关基因。

在另一优选例中，转入外源基因的方法选自下组：农杆菌法、基因枪法、花粉管通道法。

在本发明的第二方面，提供了一种制备豆类再生植株的方法，包括步骤：

将本发明第一方面获得的体细胞胚胎诱导为再生植株。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(i)对体细胞胚胎进行扩增，获得扩增的体细胞胚胎；

(ii)对步骤(i)扩增的体细胞胚胎进行体细胞胚胎成熟和分化培养，获得成熟和分化的体细胞胚胎；和

(iii)对步骤(ii)获得的成熟和分化的体细胞胚胎进行干化和萌发培养，获得有根的再生植株。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：

(iv)将步骤(iii)获得的有根的再生植株进行炼苗培养和移栽。

在另一优选例中，步骤(iv)所述的炼苗培养是在光照强度为80μmol.m^-2.s^-1、28±1℃的条件下进行。

在另一优选例中，步骤(i)所述的扩增为：将体细胞胚胎接种于含2，4-D、AgNO₃和蔗糖的MSB培养基中培养。

在另一优选例中，步骤(i)扩增的体细胞胚胎为球形胚和/或指形胚。

在另一优选例中，步骤(i)MSB培养基中2，4-D的浓度为10-50mg/L，较佳地20-40mg/L，最佳地20mg/L。

在另一优选例中，步骤(i)MSB培养基中AgNO₃的浓度为1-10mg/L，较佳地1-5mg/L，最佳地3mg/L。

在另一优选例中，步骤(i)MSB培养基中蔗糖的浓度为1wt-10wt％，较佳地3wt％。

在另一优选例中，步骤(i)所述的扩增是在光照强度为2-7μmol.m^-2.s^-1的条件下，较佳地5μmol.m^-2.s^-1的条件下进行的。

在另一优选例中，步骤(ii)所述的成熟和分化培养为：将步骤(i)获得的扩增的体细胞胚胎接种于含ABA、麦芽糖和活性炭的MSB培养基中。

在另一优选例中，步骤(ii)所述成熟与分化的体细胞胚胎为叶状胚或子叶期胚。

在另一优选例中，步骤(ii)MSB培养基中ABA的浓度为1-10mg/L，较佳地2-3mg/L。

在另一优选例中，步骤(ii)MSB培养基中麦芽糖的浓度为2wt-10wt％，较佳地6wt％。

在另一优选例中，步骤(ii)MSB培养基中活性炭的浓度为0.2wt-2wt％，较佳地0.5wt％。

在另一优选例中，步骤(ii)所述成熟和分化培养是在光照强度为15-40μmol.m^-2.s^-1的条件下，较佳地20-30μmol.m^-2.s^-1的条件下进行的。

在另一优选例中，步骤(iii)所述的干化和萌发培养包括步骤：

(A)将步骤(iii)获得的成熟与分化的体细胞胚胎置于含麦芽糖和活性炭的MSB薄层培养基培养，获得进一步成熟、分化与干化的体细胞胚胎；

(B)将步骤(A)获得的体细胞胚胎接种于含蔗糖的MSB培养基中，进行体细胞胚胎萌发培养，获得再生植株。

在另一优选例中，步骤(A)所述麦芽糖的浓度为2wt-10wt％，较佳地为6wt％。

在另一优选例中，步骤(A)所述活性炭的浓度为0.2wt-2wt％，较佳地0.5wt％。

在另一优选例中，步骤(B)所述蔗糖的浓度为2wt-5wt％，较佳地3wt％。

在另一优选例中，本发明第一或第二方面所述的豆类选自下组：大豆、豌豆、蚕豆、绿豆、菜豆、芸豆或赤豆。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1为本发明的大豆幼嫩子叶切块体细胞胚胎发生与植株再生的过程，其中，

图1A为幼嫩子叶切块，棒状基线(bar)＝4mm；

图1B为胚性愈伤组织，棒状基线(bar)＝4mm；

图1C为附着在愈伤组织上的球形胚，棒状基线(bar)＝2mm；

图1D为扩增的球形胚和指状胚，棒状基线(bar)＝3mm；

图1E为叶状胚和子叶期胚，棒状基线(bar)＝3mm；

图1F为经体胚发生的再生小植株，棒状基线(bar)＝1cm。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，筛选和测试了各种不同的材料，意外地发现将豆类子叶进行切块，能大大提高体细胞胚胎的诱导效率，并据此首次建立了一种豆类高效体胚发生和植株再生的方法。以大豆为例，本发明方法以开花3-5周的大豆幼嫩子叶切块为起始外植体，大量获得体细胞胚胎，获得的体细胞胚胎还可以作为转基因的优良受体。体细胞胚胎经扩增、成熟和分化培养、以及萌发等培养环节，可稳定地获得大量的再生植株(平均每个子叶切块可获得50株或更多)，且植株遗传稳定。在此基础上完成了本发明。

在一个优选例中，本发明方法包括步骤：获得切块的豆类幼嫩子叶；对幼嫩子叶切块进行诱导，获得胚性愈伤组织；以诱导胚性愈伤组织获得体细胞胚胎，并进行扩增；对体细胞胚胎进行成熟和分化培养；将分化的体细胞胚胎培养成再生植株。

豆类

如本文所用，术语“豆类”是指属于豆目的植物，特别地，是指豆科植物，包括(但不限于)大豆，豌豆，蚕豆，绿豆，赤豆，菜豆，芸豆等。

再生植株

如本文所用，术语“再生植株”是指将豆类的幼嫩子叶切块为起始外植体，使其形成愈伤组织，经体细胞胚胎发生途径，形成完整植株的方法或用所述方法获得的植株。

培养基

MSB母液配方可以参见以下文献：

Murashige，TandF.Skoog，1962：Arevisedmediumforrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissue-culture.Physiol.Plant.15：473-497.

在本发明的一个优选例中，MSB母液配方如下(以1L为例)，

700ml蒸馏水再加入下面的成分：

大量元素10倍100ml；氯化钙20倍50ml；微量元素100倍10ml；铁盐100倍10ml；

B5有机100倍10ml；

加入蔗糖后定容，调节pH调5.8；加入琼脂8g，煮沸两次；分装后封闭；121℃灭菌20分钟。

本发明提供了一类适于豆类高效体胚发生与植株建成的MSB培养基。根据不同培养条件，MSB培养基还具有选自下组的成分：

10-50mg/L的2，4-D(较佳地30-40mg/L)；

1-10mg/lLAgNO₃(较佳地3-5mg/L)；

1-10mg/LABA(较佳地3-5mg/L)：

2wt-10wt％麦芽糖(较佳地5wt-6wt％)：

0.2wt-2wt％活性炭(较佳地0.5wt％)。

体细胞胚胎及其诱导

如本文所用，术语“体细胞胚胎”是指由起源于豆类非合子细胞(即体细胞)却历经合子胚发育过程的胚。

本发明提供了一种豆类体细胞胚胎的制备方法，在一个优选例中，所述方法包括步骤：

(1)提供豆类植物的子叶切块，并对所述子叶切块进行诱导，获得胚性愈伤组织；和(2)对获得的胚性愈伤组织进行诱导，获得体细胞胚胎。

在另一选例中，所述子叶切块切过的周长占总周长的至少50％，较佳地60％，更佳地为100％；子叶切块为上表面积为1mm×1mm-5mm×5mm的子叶切块，较佳地为上表面积为2mm×4mm的子叶切块；子叶切块来自于豆类的幼嫩豆荚，所述的幼嫩豆荚是在豆类植物开花2-6周(较佳地3-5周)时采摘的。

在另一优选例中，步骤(1)所述的诱导为将子叶切块接种于含2，4-D和蔗糖的MSB培养基中培养；2，4-D的浓度为10-50mg/L，较佳地30-40mg/L，最佳地40mg/L；蔗糖的浓度为1-10wt％，较佳地5wt％；在光照强度为5-20μmol.m^-2.s^-1(较佳地10μmol.m^-2.s^-1)的条件下进行。

在另一优选例中，步骤(2)所述诱导为：将步骤(1)获得的胚性愈伤组织接种于含2，4-D、AgNO₃和蔗糖的MSB培养基中进行培养；步骤(2)获得的体细胞胚胎为球形胚；2，4-D的浓度为10-50mg/L，较佳地30-40mg/L，最佳地30mg/L；AgNO₃的浓度为1-10mg/L，较佳地2-7mg/L，最佳地5mg/L；蔗糖的浓度为1-10wt％，较佳地6wt％；在光照强度为10-20μmol.m^-2.s^-1的条件下进行。

本发明还提供了一种转基因的体细胞胚胎及其制备方法。如本文所用，术语“转基因的体细胞胚胎”是指将体细胞胚胎作为受体，转入外源转基因。

在一个优选例中，可以使用本发明诱导体细胞胚胎生成的方法制备体细胞胚胎，将其作为受体，转入外源基因，从而获得转基因的体细胞胚胎。

本领域的普通技人员可以使用通用的方法以体细胞胚胎作为受体，转入外源转基因。如农杆菌法、基因枪法、花粉管通道法。

农杆菌介导法

农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，与植物基因转化有关的有2种类型：根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)，分别含有Ti质粒和Ri质粒。由于根瘤农杆菌具有趋化性，侵染受体时，在植物受伤组织产生的一些糖类和酚类物质诱导下，向受伤组织集中，通过供体和受体特异互作，农杆菌细胞识别并附着到植物细胞表面，将Ti质粒上的一段T2DNA片段导入植物细胞基因组中。农杆菌介导的遗传转化，通常以单拷贝或者低拷贝的形式将外源基因插入到植物基因组，转育周期短、重复性好、基因沉默现象少、组织培养简单，但是转化和再生受材料基因型限制。

基因枪法

基因枪法是DNA吸附在微载体(钨粉或金粉粒子)表面，然后以高压气体或高压放电为动力，金属微粒被射入受体植物细胞，实施转化。基因枪法技术主要以大豆幼胚的胚轴、茎尖、胚性悬浮细胞和未成熟胚茎尖为转化受体，通过潮霉素筛选转化植株。基因枪转化法不受基因型的限制、产生的微创有利于基因转移、具有较高的转化率、能够转移多拷贝的重组DNA或者DNA片段。但比农杆菌介导法耗资大，技术难，在植物基因组中拷贝数高，易引起基因沉默。

花粉管通道法

花粉管通道法是将含目的基因的DNA放到授粉后不久经切割的花柱上，DNA沿着花粉管到达胚珠，并进一步整合到胚珠的基因组中，当携带外源基因的受精卵发育成植株时，即获得了转基因植物。利用花粉管通道法导入外源基因的方法有子房和胚囊微注射法、柱头滴加法、花粉粒携带法和生殖细胞浸泡法等。

植株的再生

本发明还提供了一种豆类植株再生的方法，将体细胞胚胎诱导为再生植株。在本发明的另一优选例中，包括步骤：

(i)对体细胞胚胎进行扩增，获得扩增的体细胞胚胎；

(iii)对步骤(ii)获得的成熟和分化的体细胞胚胎进行干化和萌发培养，获得有根的再生植株；

(iv)将步骤(iii)获得的有根的再生植株进行炼苗培养和移栽；炼苗培养是在光照强度为80μmol.m^-2.s^-1、28±5℃(较佳地28±1℃)的条件下进行。

在另一优选例中，步骤(i)所述的扩增为：将体细胞胚胎接种于含2，4-D、AgNO₃和蔗糖的MSB培养基中培养；体细胞胚胎为球形胚和/或指形胚；2，4-D的浓度为10-50mg/L，较佳地20-40mg/L，最佳地20mg/L；AgNO₃的浓度为1-10mg/L，较佳地1-5mg/L，最佳地3mg/L；蔗糖的浓度为1wt-10wt％，较佳地3wt％；在光照强度为2-7μmol.m^-2.s^-1的条件下，较佳地5μmol.m^-2.s^-1的条件下进行。

在另一优选例中，步骤(ii)所述的成熟和分化培养为：将步骤(i)获得的扩增的体细胞胚胎接种于含ABA、麦芽糖和活性炭的MSB培养基中；成熟与分化的体细胞胚胎为叶状胚或子叶期胚；ABA的浓度为1-10mg/L，较佳地2-3mg/L；麦芽糖的浓度为2wt-10wt％，较佳地6wt％；活性炭的浓度为0.2wt-2wt％，较佳地0.5wt％；在光照强度为15-40μmol.m^-2.s^-1的条件下，较佳地20-30μmol.m^-2.s^-1的条件下进行的。

在另一优选例中，步骤(iii)所述的干化和萌发培养包括步骤：(A)将步骤(iii)获得的成熟与分化的体细胞胚胎置于含麦芽糖和活性炭的MSB薄层培养基培养，获得进一步成熟、分化与干化的体细胞胚胎；和(B)将步骤(A)获得的体细胞胚胎接种于含蔗糖的MSB培养基中，进行体细胞胚胎萌发培养，获得再生植株；步骤(A)所述麦芽糖的浓度为2wt-10wt％，较佳地为6wt％；活性炭的浓度为0.2wt-2wt％，较佳地0.5wt％；步骤(B)所述蔗糖的浓度为2wt-5wt％，较佳地3wt％。

本发明的主要优点在于：

1.本发明方法快速高效，重复性好；

2.利用本发明方法能获得大量的再生植株；

3.获得的植株遗传稳定，产量高。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1培养基的制备

MSB基本培养基由MS培养基的盐类、B5培养基的有机为骨干成分混合物而成，MSB母液配制(1L)：

700ml蒸馏水再加入下面的成分：

大量元素10倍100ml；氯化钙20倍50ml；微量元素100倍10ml；铁盐100倍10ml；B5有机100倍10ml；加入30g蔗糖后定容；

调节pH调5.8；加入琼脂8g，煮沸两次；分装后封闭；121℃灭菌20分钟。

体细胞胚胎发生全过程均使用该培养基作为基本培养基。

实施例2获取豆荚

选取饱满健壮的大豆种子适时播种于田间或温室，待植株开花3-5周时采摘幼嫩的豆荚，用流动的自来水冲洗60分钟，吸干豆荚表面的水分，获得的豆荚可以4℃冰箱保存备用或直接进入体细胞胚胎诱导环节。

实施例3获取子叶切块

选取实施例2中表面完整的豆荚，在超净工作台上用70％的乙醇消毒60秒，无菌滤纸吸干无菌材料表面水珠，拨开豆荚，取出未成熟的种子(又称幼胚)，获得幼嫩子叶(3mm×4mm--5mm×6mm)。将幼嫩子叶切成2mm×4mm的切块，备用。

图1A显示了切块的幼嫩子叶，棒状基线(bar)＝4mm。

实施例4诱导并形成胚性愈伤组织

将实施例3获得的幼嫩子叶切块接种于含40mg/l2，4-D和5％蔗糖的MSB培养基中，进行胚性愈伤组织诱导。

培养条件：光照(10μmol.m^-2.s^-1)16h/d培养，培养温度为23±1℃，2周继代一次，培养基不变。

结果表明：培养4-6周后，绿黄色且结构致密的胚性愈伤组织形成。图1B为胚性愈伤组织，棒状基线(bar)＝4mm。

实施例5诱导并形成体细胞胚胎

将实施例4所得的胚性愈伤组织转接在附含30mg/l2，4-D、1-5mg/lAgNO₃和6％蔗糖的MSB培养基中，进行体细胞胚胎诱导。

培养条件：光照(10-20μmol.m^-2.s^-1)16h/d培养，培养温度为23±1℃，2周继代一次，培养基不变。AgNO₃经过滤灭菌后直接添加到42±2℃的无菌培养基中。

结果表明：培养2-4周后，晶莹剔透的黄绿色球形胚形成。图1C为附着在愈伤组织上的球形胚，棒状基线(bar)＝2mm，

实施例6体细胞胚胎的扩增培养

将实施例5所得的黄绿色球形胚连同其附着愈伤组织一起转接至附20mg/l2，4-D、1-3mg/lAgNO₃和3％蔗糖的MSB培养基中，进行体细胞胚胎扩增培养。

培养条件：光照(5μmol.m^-2.s^-1)16h/d培养，培养温度为23±1℃，2周继代一次，培养基不变。AgNO₃经过滤灭菌后直接添加到42±2℃的无菌培养基中。

结果表明：培养4-6周后，扩增出大量淡黄色的球形胚和指状胚。图1D为扩增的球形胚和指状胚，棒状基线(bar)＝3mm。

实施例7体细胞胚胎的成熟与分化培养

将实施例6所得的扩增后的淡黄色球形胚和指状胚连同其附着愈伤组织一起转接至附含1-3mg/lABA+6％麦芽糖+0.5％活性炭的MSB培养基中，进行体细胞胚胎成熟与分化培养。

培养条件：光照(20-30μmol.m^-2.s^-1)16h/d培养，培养温度为23±1℃，2周继代一次，培养基不变。麦芽糖和活性炭直接添加到培养基中与培养基混合灭菌。

结果表明：培养4-6周后，大量淡黄色的球形胚和指状胚经由双子叶植物胚胎发生的各个不同发育时期，分化成为叶状胚或子叶期胚。图1E为叶状胚和子叶期胚，棒状基线(bar)＝3mm。

实施例8植株生成

将含6％麦芽糖+0.5％活性炭的MSB培养基3-4ml倒入直径为9cm的培养皿中平铺成薄层，把实施例8所得的叶状胚或子叶期胚单一放置在该薄层上，用parafilm膜封口后，置于相对湿度为80-90％的培养箱内，进行体细胞胚胎得进一步成熟、分化与干化培养。5-7天后，将经干化处理过的子叶期胚转接至附含3％蔗糖的MSB培养基上，进行体细胞胚胎萌发培养。

培养条件：光照(50-80μmol.m^-2.s^-1)16h/d培养，培养温度为23±1℃，2周继代一次，培养基不变。

结果表明：培养4-5周后，大量子叶期胚经由双子叶植物胚胎发生的各个不同发育时期，再生成根系发达的小植株。图1F为经体胚发生的再生小植株，棒状基线(bar)＝1cm。

实施例9炼苗、移植

将实施例8所得的生根苗连同培养基、培养瓶等一起转入28±2℃、光照(80μmol.m^-2.s^-1)16h/d的培养条件下进行耐受培养1-2周后，打开培养瓶盖子，注入10-20ml无菌水或去离子水，炼苗5-8天。

将再生小苗移栽到泥炭、菜园土和珍珠岩(3∶6∶1)的基质中，在28±2℃、自然光照的大棚中生长良好，成为与自然生长小苗一致的大豆再生植株。

实施例10

用150个子叶切块，重复实施例2-9，重复三批，其中子叶切块大小为(1mm-2mm)×(2mm--4mm)。

结果表明，每个幼嫩子叶切块经培养，平均获得大豆再生植株51-58株，再生植株遗传稳定性好。

对比例

大豆幼嫩子叶(未切块)大小为：1-3mm×3-5mm

胚芽大小为：1--2mm

成熟大豆种子的子叶大小为：6mm-10mm

结果表明：以大豆幼嫩子叶(未切块)为起始外植体能诱导出体细胞胚，但数量较少(少于15％)，无法再生出完整植株；胚芽和成熟大豆种子的子叶均不能经由体细胞胚胎继而实现植株建成。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种制备豆类植物体细胞胚胎的方法，其特征在于，包括步骤：

(2)对获得的胚性愈伤组织进行诱导，获得体细胞胚胎，

其中，所述豆类植物为大豆，

并且，所述的子叶切块为上表面积为1mm×1mm—5mm×5mm的子叶切块；且所述子叶切块切过的周长占总周长的至少50％；

并且所述的子叶切块来自于豆类的幼嫩豆荚，所述的幼嫩豆荚是在豆类植物开花2-6周时采摘的；

其中，步骤(1)所述的诱导是在光照强度为5-20μmol.m^-2.s^-1的条件下进行的；

并且，步骤(1)所述的诱导为：将子叶切块接种于含2,4-D和蔗糖的MSB培养基中培养；

并且，步骤(2)所述诱导为：将步骤(1)获得的胚性愈伤组织接种于含2,4-D、AgNO₃和蔗糖的MSB培养基中进行培养。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述子叶切块切过的周长占总周长的100％。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，MSB培养基中2,4-D的浓度为10-50mg/L，并且MSB培养基中蔗糖的浓度为1-10wt％。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，MSB培养基中2,4-D的浓度为10-50mg/L，MSB培养基中AgNO₃的浓度为1-10mg/L，以及MSB培养基中蔗糖的浓度为1-10wt％。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤：

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的诱导是在光照强度为10-20μmol.m^-2.s^-1的条件下进行的。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的子叶切块为上表面积为2mm×4mm的子叶切块。

8.一种制备豆类再生植株的方法，其特征在于，包括步骤：

将权利要求1-7任一方法制备的体细胞胚胎诱导为再生植株。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，包括步骤：

(i)对体细胞胚胎进行扩增，获得扩增的体细胞胚胎；

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，还包括步骤(iv)：

(iv)将步骤(iii)获得的有根的再生植株进行炼苗培养和移栽。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(i)所述的扩增为：将体细胞胚胎接种于含2,4-D、AgNO₃和蔗糖的MSB培养基中培养。

12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(ii)所述的成熟和分化培养为：将步骤(i)获得的扩增的体细胞胚胎接种于含ABA、麦芽糖和活性炭的MSB培养基中。

13.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(iii)所述的干化和萌发培养包括步骤：

14.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)中MSB培养基中2,4-D的浓度为10-50mg/L；

步骤(1)中MSB培养基中蔗糖的浓度为1-10wt％；

步骤(2)中MSB培养基中2,4-D的浓度为10-50mg/L；

步骤(2)中MSB培养基中AgNO₃的浓度为1-10mg/L；

步骤(2)中MSB培养基中蔗糖的浓度为1-10wt％。