CN104472352B - 一种菜豆直接再生体系的建立方法 - Google Patents

一种菜豆直接再生体系的建立方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104472352B
CN104472352B CN201410661867.1A CN201410661867A CN104472352B CN 104472352 B CN104472352 B CN 104472352B CN 201410661867 A CN201410661867 A CN 201410661867A CN 104472352 B CN104472352 B CN 104472352B
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture
phaseolus vulgaris
seedling
days
kidney bean
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410661867.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104472352A (zh
Inventor
古瑜
韩启厚
于海龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kerun Agricultural Science & Technology Co Ltd Tianjin
Original Assignee
Kerun Agricultural Science & Technology Co Ltd Tianjin
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kerun Agricultural Science & Technology Co Ltd Tianjin filed Critical Kerun Agricultural Science & Technology Co Ltd Tianjin
Priority to CN201410661867.1A priority Critical patent/CN104472352B/zh
Publication of CN104472352A publication Critical patent/CN104472352A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104472352B publication Critical patent/CN104472352B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Cultivation Of Plants (AREA)

Abstract

本发明公开了一种菜豆直接再生体系的建立方法，主要包括菜豆无菌苗的获得方法、直接再生培养基配方、生根培养基配方、组培苗移栽方法等，针对现有技术中菜豆组织培养体系技术方案不完整、不明确，甚至方法本身重复再现性差的缺陷，本发明通过筛选各种功能培养基中不同激素种类及其配比，最终建立高频、高效的菜豆直接再生体系，为菜豆组培快繁及转基因育种的应用奠定基础。

Description

一种菜豆直接再生体系的建立方法
技术领域
本发明涉及以菜豆子叶节为外植体，获得高频、高效的菜豆直接再生体系的方法。
背景技术
菜豆[Phaseolus vulgaris L.]又称芸豆，四季豆，玉豆等，属豆科菜豆属菜豆种植物。菜豆起源于中南美洲的热带地区，主要分布于墨西哥南部和中美洲，15世纪经美洲引入我国。通过不断的演化和变异，出现了以嫩荚供食用的软荚菜豆，因此中国被认为是菜豆的次级起源中心，在中国已有500多年的栽培历史。菜豆在我国各省市均有栽培，面积十分广泛。据联合国粮农组织统计（FAO，2012年），中国粒用菜豆总栽培面积为1456.5万亩，食荚菜豆栽培面积为939万亩。栽培面积仅次于巴西和印度，位居世界第三。
菜豆是严格闭花授粉作物，繁种过程中种性退化严重。加上人工杂交成功率低，知识产权无法保护，因此菜豆品种更新极为缓慢。种性退化对产量和商品性影响很大，菜农急需新品种更新。随着分子生物学和植物基因工程的发展，人们开始借助生物技术手段建立高频、高效的菜豆再生体系并对其进行遗传转化，可大幅度缩短育种周期，提高育种效率。
发明内容
本发明公开的一种菜豆直接再生体系的建立方法，针对现有技术中菜豆组织培养体系技术方案不完整、不明确，甚至方法本身重复再现性差的缺陷，本发明提供了一种以菜豆子叶节为外植体建立高频、高效再生体系的方法。
本发明目的是在基础培养基的基础上，通过筛选培养基中不同激素种类及其用量的配比（筛选的培养基包括再生培养基和生根培养基，再生培养基激素包括6-BA，用量在1.0mg/L-6.0mg/L；IAA，0.1 mg/L-1.0mg/L。生根培养基激素是IBA，用量为0 mg/L-1.0mg/L）最终建立高频、高效的菜豆直接再生体系的方法，为菜豆组培快繁及转基因育种的应用奠定基础。
为实现上述目的，本发明公开了一种菜豆直接再生体系的建立方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）菜豆无菌苗的获得方法：
挑选籽粒均匀、饱满的菜豆种子，置于玻璃容器内，将浓度为10%-30%的次氯酸钠溶液缓缓倒入容器内，使菜豆种子完全浸泡在次氯酸钠溶液中，整个消毒过程用时10-20min，并每隔1-2min搅拌一次，使种子表面与溶液充分接触，以保证消毒彻底，消毒后的菜豆种子用无菌水清洗4-5次，整个消毒过程在超净工作台内完成；将清洗后的菜豆种子插入萌发培养基内，种子插入一半即可，种子萌发环境为温度20℃-25℃，光周期为16h/8h光照/黑暗；
（2）直接再生培养基培养基配方及操作方法：
将萌发5-6天的菜豆无菌苗在超净工作台中取出，放在灭菌后的培养皿里，切除顶端生长点及胚根，留下子叶节上下各1.5-3.5mm的下胚轴，顺着下胚轴将外植体纵向平均分开，得到两个对称的带子叶的子叶节，用刀片对纵切面进行划伤，伤口长3-4mm，深度0.3-0.5mm；将处理好的外植体近轴面向上与培养基成45度角斜插入芽诱导培养基中，密封并置于培养室中培养，培养环境为温度20℃-25℃，光周期为16h/8h光照/黑暗；培养基每隔5-10天更换一次，15-20天后可获得再生植株；所述的芽诱导培养基指的是：MSB5+ 6-BA 1.0-6.0 mg/L+IAA 0.1-1.0 mg/L+活性炭10-50mg/L；
（3）再生芽的生根培养基配方及操作方法：将长到4-5cm的不定芽延基部从外植体上切下，插入1/2MSB5+ IBA 0.1-1.0 mg/L+活性炭5-30mg/L生根培养基内，密封好后置于培养室内培养，培养环境为温度20-25℃，光周期为16h/8h光照/黑暗，7-10天顺利生根；
（4）组培苗的移栽方法：生根后的组培苗，在培养室内开盖炼苗3-5天，然后移栽到装有基质的营养钵内，将移栽好的组培苗放在塑料拱棚内生长，保证拱棚内的温度25-28℃，相对湿度60%，拱棚内生长5天逐渐给拱棚放风，直至幼苗适应温室环境，再将拱棚撤去；
（5）成活的组培苗便可移栽入露地进行正常管理。
本发明所述的菜豆直接再生体系的建立方法，其中的菜豆品种指的是双丰3号。
本发明更进一步公开了菜豆直接再生体系的建立方法在提高菜豆生芽率、生根率、植株成苗率方面的应用。实验结果表明：菜豆直接再生体系的建立方法易于诱导再生芽，
再生芽率提高、生根率提高，再生植株成苗率提高。直接再生周期短，直接再生易于操作，重现性好。
本发明建立的菜豆直接再生体系其中的关键在于：
（1）明确了菜豆种子消毒的最佳方法，此方法易操作，效果最好。
（2）摸索出菜豆子叶节直接再生的最佳培养基配方及操作方法，再生频率高，重复性好。
（3）筛选出再生植株生根的最佳培养基配方及操作方法，使生根速度快，质量好，有利于再生苗的移栽。
本方法更加详细的描述如下：
主要包括菜豆无菌苗的获得方法、直接再生培养基配方及操作方法、生根培养基配方及操作方法、组培苗的移栽方法等，具体步骤如下：
1、菜豆无菌苗的获得方法
挑选籽粒均匀、饱满的菜豆种子，置于玻璃容器内。将浓度为10%-30%的次氯酸钠溶液缓缓倒入容器内，使菜豆种子完全浸泡在次氯酸钠溶液中。整个消毒过程用时10-20min，并每隔1-2min搅拌一次，使种子表面与溶液充分接触，以保证消毒彻底。消毒后的菜豆种子用无菌水清洗4-5次。整个消毒过程在超净工作台内完成。将清洗后的菜豆种子插入萌发培养基内，种子插入一半左右即可。种子萌发环境为温度20℃-25℃，光周期为16h/8h光照/黑暗。
2、直接再生培养基配方及操作方法
将萌发5-6天的菜豆无菌苗在超净工作台中取出，放在灭菌后的培养皿里，切除顶端生长点及胚根，留下子叶节上下各1.5-3.5mm左右的下胚轴，顺着下胚轴将外植体纵向平均分开，得到两个对称的带子叶的子叶节，用刀片对纵切面进行划伤，伤口长3-4mm，深度0.3-0.5mm。将处理好的外植体近轴面向上与培养基成45度角斜插入芽诱导培养基中，密封并置于培养室中培养，培养环境为温度20℃-25℃，光周期为16h/8h光照/黑暗。培养基每隔5-10天更换一次，15-20天后可获得再生植株。
3、生根培养基配方及操作方法
当再生芽长到4-5cm时，将再生植株从外植体上切下，插入到生根培养基内培养，培养环境为温度20℃-25℃，光周期为16h/8h光照/黑暗，7-15天左右便可顺利生根。
4、组培苗的移栽方法
生根后，将瓶盖打开在培养室内炼苗3-10天，移苗至装有基质的营养钵中，将移栽好的组培苗放在塑料拱棚内生长，保证拱棚内的温度25-28℃，相对湿度60%左右。拱棚内生长5-10天，逐渐给拱棚放风，直至幼苗适应温室环境，再将拱棚撤去。
该方法菜豆种子消毒效果达100%，不定芽再生频率为11.2个/外植体，不定芽生根率达到95.3%，生根数量为13.6根/植株，组培苗移栽成活率达97%。
本发明公开的菜豆直接再生体系的建立方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：
（1）种子消毒方法更规范，消毒效果更好，且易于操作。
（2）直接再生更易于得到再生植株，重复性好。
（3）提高了再生植株生根率，进而提高成苗率。
具体实施方式
本发明实施例公开了菜豆直接再生体系的建立方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品、方法和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品、方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
其中所述的MS培养基以及缩写的MSB5培养基指的是（MS和B5培养基是组培上常用的培养基，配方及用量都是已知的。另外MSB5、 6-BA 、IAA 、活性炭、双丰3号菜豆品种均由市售。
实施例1
双丰3号菜豆品种直接再生体系的建立，包括以下步骤：
（1）种子的消毒：在超净工作台内，将整齐一致的双丰3号种子放入玻璃容器内，倒入10%次氯酸钠溶液浸泡10min，每隔2min搅拌一次。将消毒的种子用灭菌水冲洗4次，倒干容器内的灭菌水后备用。
（2）无菌苗的获得：在超净工作台内，用镊子取出消毒后的菜豆种子，将种脐朝下插入萌发培养基内，密封好后置于培养室内培养，培养环境为温度20℃，光周期为16h/8h光照/黑暗。
（3）再生芽的获得：无菌苗培养5天后，在超净工作台内取出无菌苗，置于灭菌后的培养皿内，切除植株的生长点及胚根，留下子叶节上下各1.5mm左右的下胚轴，顺着下胚轴将外植体纵向平均分开，得到两个对称的带子叶的子叶节，用刀片对纵切面进行划伤，伤口长3mm，深度0.3mm。将处理好的外植体近轴面向上与培养基成45度角斜插入1/2M MSB5+ 6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L+活性炭10mg/L芽诱导培养基中，密封好后置于培养室中培养，培养环境为温度20℃，光周期为16h/8h光照/黑暗。培养基每隔5天更换一次，15天可获得再生芽。
（4）再生芽的生根：将长到4-5cm的不定芽延基部从外植体上切下，插入1/2MSB5+IBA 0.1mg/L+活性炭5mg/L生根培养基内，密封好后置于培养室内培养，培养环境为温度20℃，光周期为16h/8h光照/黑暗，7天左右便可顺利生根。
（5）组培苗的移栽：生根后的组培苗，在培养室内开盖炼苗3天左右，然后移栽到装有基质的营养钵内，将移栽好的组培苗放在塑料拱棚内生长，保证拱棚内的温度28℃，相对湿度60%左右。拱棚内生长6天逐渐给拱棚放风，直至幼苗适应温室环境，再将拱棚撤去。
（6）成活的组培苗便可移栽入露地进行正常管理。
实施例2
双丰3号菜豆品种直接再生体系的建立，包括以下步骤：
（1）种子的消毒：菜豆种子消毒相关文献未见报道，试验对比了大豆等一些豆类种子消毒方法，明确了菜豆种子最佳的消毒方法，具体操作如下：在超净工作台内，将整齐一致的双丰3号种子放入玻璃容器内，倒入30%次氯酸钠溶液浸泡16min，每隔2min搅拌一次。将消毒的种子用灭菌水冲洗5次，倒干容器内的灭菌水后备用。
（2）无菌苗的获得：在超净工作台内，用镊子取出消毒后的菜豆种子，将种脐朝下插入萌发培养基内，密封好后置于培养室内培养，培养环境为温度20℃，光周期为16h/8h光照/黑暗。
（3）再生芽的获得：采用愈伤组织诱导再生芽率最高仅为90%，再生频率低。采用直接再生方法再生芽诱导率达100%，再生频率高达11.2个/外植体。直接再生是将无菌苗培养6天后，在超净工作台内取出无菌苗，置于灭菌后的培养皿内，切除植株的生长点及胚根，留下子叶节上下各3.5mm左右的下胚轴，顺着下胚轴将外植体纵向平均分开，得到两个对称的带子叶的子叶节，用刀片对纵切面进行划伤，伤口长4mm，深度0.5mm。将处理好的外植体近轴面向上与培养基成45度角斜插入芽诱导培养基中，密封好后置于培养室中培养，培养环境为温度25℃，光周期为16h/8h光照/黑暗。培养基每隔10天更换一次，20天可获得再生芽。
（4）再生芽的生根：前人报道，再生植株生根率为90%，而通过调整培养基配方，1/2MSB5+ IBA 1.0 mg/L+活性炭30mg/L，生根率可达到95.3%，效率大大提高。具体方法如下：将长到5cm的不定芽延基部从外植体上切下，插入生根培养基内，密封好后置于培养室内培养，培养环境为温度23℃，光周期为16h/8h光照/黑暗，15天左右便可顺利生根。
（5）组培苗的移栽：生根后的组培苗，在培养室内开盖炼苗10天左右，然后移栽到装有基质的营养钵内，将移栽好的组培苗放在塑料拱棚内生长，保证拱棚内的温度28℃，相对湿度60%左右。拱棚内生长10天逐渐给拱棚放风，直至幼苗适应温室环境，再将拱棚撤去。
（6）成活的组培苗便可移栽入露地进行正常管理。
实施例3
（1）菜豆无菌苗的获得：
挑选籽粒均匀、饱满的菜豆种子，置于玻璃容器内，将浓度为25%的次氯酸钠溶液缓缓倒入容器内，使菜豆种子完全浸泡在次氯酸钠溶液中，整个消毒过程用时14min，并每隔2min搅拌一次，使种子表面与溶液充分接触，以保证消毒彻底，消毒后的菜豆种子用无菌水清洗5次，整个消毒过程在超净工作台内完成；将清洗后的菜豆种子插入萌发培养基内，种子插入一半即可，种子萌发环境为温度25℃，光周期为16h/8h光照/黑暗；
（2）直接再生培养基的筛选：
将萌发5天的菜豆无菌苗在超净工作台中取出，放在灭菌后的培养皿里，切除顶端生长点及胚根，留下子叶节上下各2.5mm的下胚轴，顺着下胚轴将外植体纵向平均分开，得到两个对称的带子叶的子叶节，用刀片对纵切面进行划伤，伤口长3.5mm，深度0.4mm；将处理好的外植体近轴面向上与培养基成45度角斜插入芽诱导培养基中，密封并置于培养室中培养，培养环境为温度28℃，光周期为16h/8h光照/黑暗；培养基每隔8天更换一次，15天后可获得再生植株；所述的芽诱导培养基指的是：MSB5+ 6-BA 5.1 mg/L+IAA 0.7 mg/L+活性炭35mg/L；
（3）再生芽的生根：将长到4cm的不定芽延基部从外植体上切下，插入1/2MSB5+IBA 0.7mg/L+活性炭25mg/L生根培养基内，密封好后置于培养室内培养，培养环境为温度25℃，光周期为16h/8h光照/黑暗，10天顺利生根；
（4）组培苗的移栽：生根后的组培苗，在培养室内开盖炼苗5天，然后移栽到装有基质的营养钵内，将移栽好的组培苗放在塑料拱棚内生长，保证拱棚内的温度28℃，相对湿度60%，拱棚内生长5天逐渐给拱棚放风，直至幼苗适应温室环境，再将拱棚撤去；
（5）成活的组培苗便可移栽入露地进行正常管理。
实施例4
对比试验
结论：
（1）直接再生易于诱导再生芽，再生频率高。
（2）该直接再生体系再生芽率提高、生根率提高，最终提升了再生植株成苗率。
（3）直接再生周期短，只需常规做法的一半时间。
（4）直接再生易于操作，重现性好。

Claims (2)

1.一种菜豆直接再生体系的建立方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）菜豆无菌苗的获得：
挑选籽粒均匀、饱满的菜豆种子，置于玻璃容器内，将浓度为10%-30%的次氯酸钠溶液缓缓倒入容器内，使菜豆种子完全浸泡在次氯酸钠溶液中，整个消毒过程用时10-20min，并每隔1-2min搅拌一次，使种子表面与溶液充分接触，以保证消毒彻底，消毒后的菜豆种子用无菌水清洗4-5次，整个消毒过程在超净工作台内完成；将清洗后的菜豆种子插入萌发培养基内，种子插入一半，种子萌发环境为温度20℃-25℃，光周期为16h/8h光照/黑暗；所述的菜豆种子是双丰3号；
（2）直接再生培养基配方及操作方法：
将萌发5-6天的菜豆无菌苗在超净工作台中取出，放在灭菌后的培养皿里，切除顶端生长点及胚根，留下子叶节上下各1.5-3.5mm的下胚轴，顺着下胚轴将外植体纵向平均分开，得到两个对称的带子叶的子叶节，用刀片对纵切面进行划伤，伤口长3-4mm，深度0.3-0.5mm；将处理好的外植体近轴面向上与培养基成45度角斜插入芽诱导培养基中，密封并置于培养室中培养，培养环境为温度20℃-25℃，光周期为16h/8h光照/黑暗；培养基每隔5-10天更换一次，15-20天后可获得再生植株；所述的芽诱导培养基指的是：MSB5+ 6-BA 1.0-6.0 mg/L+IAA 0.1-1.0 mg/L+活性炭10-50mg/L；
（3）再生芽的生根培养基配方及操作方法：将长到4-5cm的不定芽沿基部从外植体上切下，插入1/2MSB5+ IBA 0.1-1.0 mg/L+活性炭5-30mg/L生根培养基内，密封好后置于培养室内培养，培养环境为温度20-25℃，光周期为16h/8h光照/黑暗，7-10天顺利生根；
（4）组培苗的移栽方法：生根后的组培苗，在培养室内开盖炼苗3-5天，然后移栽到装有基质的营养钵内，将移栽好的组培苗放在塑料拱棚内生长，保证拱棚内的温度25-28℃，相对湿度60%，拱棚内生长5天逐渐给拱棚放风，直至幼苗适应温室环境，再将拱棚撤去；
（5）成活的组培苗移栽入露地进行正常管理。
2.权利要求1所述菜豆直接再生体系的建立方法在提高菜豆生芽率、生根率、植株成苗率方面的应用。
CN201410661867.1A 2014-11-19 2014-11-19 一种菜豆直接再生体系的建立方法 Active CN104472352B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410661867.1A CN104472352B (zh) 2014-11-19 2014-11-19 一种菜豆直接再生体系的建立方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410661867.1A CN104472352B (zh) 2014-11-19 2014-11-19 一种菜豆直接再生体系的建立方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104472352A CN104472352A (zh) 2015-04-01
CN104472352B true CN104472352B (zh) 2017-01-18

Family

ID=52747078

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410661867.1A Active CN104472352B (zh) 2014-11-19 2014-11-19 一种菜豆直接再生体系的建立方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104472352B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106613989B (zh) * 2016-12-30 2018-05-11 四川农业大学 一种菜豆高效离体再生体系的建立方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1605248A (zh) * 2004-11-18 2005-04-13 上海交通大学 扁豆原位丛生芽组织培养方法
CN101874585A (zh) * 2009-04-30 2010-11-03 上海亦晨信息科技发展有限公司 再生芸豆及其制备方法
CN102057872A (zh) * 2010-11-10 2011-05-18 上海市浦东新区农业技术推广中心 扁豆整个子叶节再生培养方法
CN103250636B (zh) * 2012-02-20 2016-01-27 中国科学院上海生命科学研究院 豆类植物高效体胚发生与植株建成

Also Published As

Publication number Publication date
CN104472352A (zh) 2015-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102204512B (zh) 细叶百合的组织培养方法
CN103931497B (zh) 一种提高火龙果组培苗成苗率的方法
CN104106468B (zh) 一种五指毛桃的组织培养快速繁殖方法
CN106069753A (zh) 一种三角梅无菌播种与快速繁殖方法
CN106106163A (zh) 一种蝴蝶兰培养繁殖方法
CN111616052A (zh) 一种苹果砧木楸子的快速繁殖及无糖生根培养方法、应用
CN105706880A (zh) 一种紫薯脱毒苗水培快繁的方法
CN104521756A (zh) 一种生产栝楼组培苗的方法
CN107278891A (zh) 一种杏梅组织培养快速繁殖方法
Mirzaeva et al. Efficiency and quality indicators of in vitro propagation of high-yielding mulberry varieties and hybrids
CN106818468A (zh) 一种艳山姜种子无菌萌发与快速繁殖的方法
CN101816286B (zh) 一种利用鳞片组培快速繁殖欧洲水仙的方法
Singh et al. Identification of the suitable hardening protocol and hardening medium in micropropagation of gerbera (Gerbera jamesonii Bolus)
CN103155869A (zh) 甜樱桃砧木Colt组织培养方法
CN103477976B (zh) 一种铁皮石斛茎段组培育苗法
CN105123526B (zh) 一种百日草组培繁殖的种质保存方法
CN104472352B (zh) 一种菜豆直接再生体系的建立方法
CN103843664A (zh) Lycium exsertum组织培养及快速繁殖方法
CN101015279B (zh) 海仙报春的组培快繁方法
CN106358661B (zh) 一种根瘤菌母种的培育方法
CN105993944A (zh) 大樱桃砧木大青叶的繁殖方法
CN102884980B (zh) 巨瓣兜兰组培快繁方法
CN115486368A (zh) 一种适用于茶树组织培养快速繁殖的方法以及应用
KR101064947B1 (ko) 새우난초 엽절편으로부터 재분화된 식물체의 대량생산방법
CN104396746A (zh) 一种黄花贝母不定芽诱导增殖方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant