CN102057872A - 扁豆整个子叶节再生培养方法 - Google Patents

Abstract

扁豆整个子叶节再生培养方法，属现代生物技术领域，其特征在于依次包括下列步骤：（1）扁豆种子消毒、浸泡后，接种到MSB₅＋6-BA0～0.5mg/L萌发培养基上培养，萌发无菌苗；（2）无菌苗去掉原叶、上胚轴和胚根，保留两片子叶和3cm下胚轴，并在两片子叶结合处制造微小伤口，然后转移到MSB₅＋6-BA0.6～2.0mg/L＋IBA0.2mg/L不定芽诱导培养基中诱导出芽；（3）将步骤（2）得到的外植体转入不定芽伸长培养基中伸长；（4）然后转入MSB₅+IBA0.1～0.2mg/L生根培养基生根，再移栽得到再生植株。本发明的积极效果是：产生的不定芽数目多，封顶芽少，芽伸长快，再生周期短，再生植株生长旺盛，各种间组织培养差异较小，重复性好。本发明适用于各扁豆品种的组织培养。

Description

扁豆整个子叶节再生培养方法

技术领域

本发明属现代生物技术领域，涉及一种扁豆整个子叶节再生培养方法。

背景技术

利用生物技术改良作物已成为现代农业发展的一个重要途径。组织培养是生物技术的基础。组织培养的成功与否取决于是否具有良好的再生培养方法。马晓红等在2008年27（3）期《大豆科学》中撰文“大豆整个子叶节外植体再生体系的建立及与子叶节、胚尖再生体系的比较”。该文建立了大豆整个子叶节外植体再生体系，并对不同大豆外植体再生体系在再生频率、出芽数目、芽伸长情况、再生周期等方面进行比较，研究表明，大豆整个子叶节外植体再生体系在再生频率及出芽数量优于子叶节再生体系和胚尖再生体系，但再生周期较长、芽伸长较慢。

现有的扁豆组织培养技术中存在再生能力低、不定芽数少、再生周期长和基因型间差异大等难点，利用生物技术改良扁豆，建立一个高效的扁豆再生体系，是现代生物技术研究人员努力的目标，但在扁豆再生培养方面的研究报道较少。

发明内容

本发明的目的是：提供一种高效的扁豆整个子叶节再生培养方法，使组织培养的扁豆再生能力高、不定芽数多、再生周期短、各品种间组织培养差异小。

为达到上述目的，采用的技术方案是：扁豆整个子叶节再生培养方法，其特征在于依次包括下列步骤：

（1）萌发培养  扁豆种子消毒、浸泡后，种脐向下接种到MSB₅＋6-BA 0～0.5 mg/L萌发培养基上培养4～6天，萌发无菌苗；

（2）诱导出芽  无菌苗去掉原叶、上胚轴和胚根，保留两片子叶和3cm下胚轴，并在两片子叶结合处制造微小伤口，然后转移到MSB₅＋6-BA 0.6～2.0 mg/L＋IBA0.2mg/L不定芽诱导培养基中诱导13～15天出芽；

（3）培养伸长  将步骤（2）得到的外植体转入不定芽伸长培养基中培养20～25天，每10天换一次新鲜培养基，直至不定芽伸长到3～4cm；

（4）生根移栽  伸长后转入MSB₅+ IBA 0.1－0.2 mg/L生根培养基培养，生根2～3条后，移栽得到再生植株。

步骤（1）所述扁豆种子消毒、浸泡是扁豆种子用70%酒精消毒1分钟，然后用饱和次氯酸钠溶液消毒50分钟，接着无菌水冲洗4次，于无菌水中浸泡1小时。

步骤（3）所述伸长培养基为MSB₅＋6-BA 0.05 mg/L＋IBA 0.1mg/L、 MSB₅＋6-BA 0.1 mg/L＋IBA 0.1 mg/L和MSB₅＋6-BA 0.1 mg/L＋IBA 0.2 mg/L中的一种。

本发明的积极效果是：与选用子叶、子叶节等外植体培养再生植株相比，本发明采用扁豆叶腋分生组织再生法，使扁豆产生的不定芽数目多，封顶芽少，芽伸长较快，再生周期短，再生植株生长旺盛，各种间组织培养差异较小，重复性好。本扁豆整个子叶节再生培养方法适用于各扁豆品种的组织培养。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例中所述萌发培养基、不定芽诱导培养基、不定芽伸长培养基和生根培养基中的MSB₅为MS无机盐+B₅维生素。MSB₅培养基中蔗糖浓度为2%，琼脂浓度为10g/L。用1mol/L NaOH调节培养基溶液pH值至5.8～6.0。培养温度为25℃±1℃。

实施例1

试验品种为‘青扁豆1号’，30粒。

选取饱满扁豆种子，用自来水冲洗干净，再用70%酒精消毒一分钟，用饱和次氯酸钠溶液消毒50分钟，接着无菌水冲洗4次，于无菌水中浸泡1小时。然后种脐向下接种到MSB₅萌发培养基上培养4天。将萌发的扁豆，去掉种皮、原叶、上胚轴和胚根，保留两片子叶，下胚轴留3cm，并在两片子叶结合处制造微小伤口，将外植体转移到MSB₅＋6-BA 1.0 mg/L＋IBA0.2mg/L不定芽诱导培养基中培养14天诱导出芽。诱导出芽后，切下整个子叶和部分下胚轴， 将外植体转入MSB₅＋6-BA 0.05 mg/L＋IBA 0.1mg/L不定芽伸长培养基中培养20天。不定芽伸长至3 cm时，切下芽转入MSB₅+ IBA 0.1 mg/L生根培养基培养10天，不定芽生出3条根/株，将瓶盖打开炼苗2天，小心用镊子取出小苗，温水洗净根部残留琼脂，然后种植在盛有灭菌土的营养钵中，温度控制在20℃左右，2周后移栽大棚或温室中。

青扁豆1号获得再生植株459株，产生不定芽14～16个/外植体，平均再生频率达15.3个/外植体。组织培养48天，再生周期短，芽伸长快，封顶芽少，扁豆产生的不定芽数目多。

实施例2

试验品种为‘青扁豆2号’，30粒。

选取饱满扁豆种子，用自来水冲洗干净，再用70%酒精消毒一分钟，用饱和次氯酸钠溶液消毒50分钟，接着无菌水冲洗4次，于无菌水中浸泡1小时。然后种脐向下接种到MSB₅＋6-BA 0.5 mg/L萌发培养基上培养5天。将萌发的扁豆，去掉种皮、原叶、上胚轴和胚根，保留两片子叶，下胚轴留3cm，并在两片子叶结合处制造微小伤口，将外植体转移到MSB₅＋6-BA 0.6 mg/L＋IBA0.2mg/L不定芽诱导培养基中培养15天诱导出芽。诱导出芽后，切下整个子叶和部分下胚轴，将外植体转入MSB₅＋6-BA 0.1 mg/L＋IBA 0.1mg/L不定芽伸长培养基中培养25天。不定芽伸长至3 cm时，切下芽转入MSB₅+ IBA 0.1 mg/L生根培养基培养10天，不定芽生出2条根/株，将瓶盖打开炼苗2天，小心用镊子取出小苗，温水洗净根部残留琼脂，然后种植在盛有灭菌土的营养钵中，温度控制在20℃左右，2周后移栽大棚或温室中。

青扁豆2号获得再生植株267株，产生不定芽8～10个/外植体，平均再生频率达8.9个/外植体。组织培养55天，再生周期较短，芽伸长较快，封顶芽少，扁豆产生的不定芽数目较多。

实施例3

试验品种为‘艳红扁’，30粒。

选取饱满扁豆种子，用自来水冲洗干净，再用70%酒精消毒一分钟，用饱和次氯酸钠溶液消毒50分钟，接着无菌水冲洗4次，于无菌水中浸泡1小时。然后种脐向下接种到MSB₅＋6-BA 0.5 mg/L萌发培养基上培养6天。将萌发的扁豆，去掉种皮、原叶、上胚轴和胚根，保留两片子叶，下胚轴留3cm，并在两片子叶结合处制造微小伤口，将外植体转移到MSB₅＋6-BA 2.0 mg/L＋IBA0.2mg/L不定芽诱导培养基中培养13天诱导出芽。诱导出芽后，切下整个子叶和部分下胚轴， 将外植体转入MSB₅＋6-BA 0.1 mg/L＋IBA 0.2mg/L不定芽伸长培养基中培养25天。不定芽伸长至4cm时，切下芽转入MSB₅+ IBA 0.2 mg/L生根培养基培养10天，不定芽生出3条根/株，将瓶盖打开炼苗2天，小心用镊子取出小苗，温水洗净根部残留琼脂，然后种植在盛有灭菌土的营养钵中，温度控制在20℃左右，2周后移栽大棚或温室中。

艳红扁获得再生植株372株，产生不定芽12～14个/外植体，平均再生频率达12.4个/外植体。组织培养54天，再生周期较短，芽伸长较快，封顶芽少，扁豆产生的不定芽数目较多。

本发明与选用子叶、子叶节等外植体再生培养相比，不定芽生长较快且封顶芽少；产生的不定芽8～16个/株、再生频率达到8.9～15.3个/外植体； 再生周期48～55天，比其它类型外植体的培养时间缩短12～17天；各品种间组织培养再生差异小，重复性好；再生植株生长旺盛。本扁豆整个子叶节再生培养方法适用于各扁豆品种的组织培养。

Claims (3)

1.扁豆整个子叶节再生培养方法，其特征在于依次包括下列步骤：

（1）萌发培养  扁豆种子消毒、浸泡后，种脐向下接种到MSB₅＋6-BA 0～0.5 mg/L萌发培养基上培养4～6天，萌发无菌苗；

（2）诱导出芽  无菌苗去掉原叶、上胚轴和胚根，保留两片子叶和3cm下胚轴，并在两片子叶结合处制造微小伤口，然后转移到MSB₅＋6-BA 0.6～2.0 mg/L＋IBA0.2mg/L不定芽诱导培养基中诱导13～15天出芽；

（3）培养伸长  将步骤（2）得到的外植体转入不定芽伸长培养基中培养20～25天，至不定芽伸长到3～4cm；

（4）生根移栽  伸长后转入MSB₅+ IBA 0.1～0.2 mg/L生根培养基10天，生根2～3条后，移栽得到再生植株。

2.根据权利要求1所述扁豆整个子叶节再生培养方法，其特征在于：

步骤（1）所述扁豆种子消毒、浸泡是指扁豆种子用70%酒精消毒1分钟，然后用饱和次氯酸钠溶液消毒50分钟，接着无菌水冲洗4次，于无菌水中浸泡1小时。

3.根据权利要求1所述扁豆整个子叶节再生培养方法，其特征在于：

步骤（3）所述伸长培养基为MSB₅＋6-BA 0.05 mg/L＋IBA 0.1mg/L、 MSB₅＋6-BA 0.1 mg/L＋IBA 0.1 mg/L和MSB₅＋6-BA 0.1 mg/L＋IBA 0.2 mg/L中的一种。