CN105230495B - 一种苦荞的快速再生组织培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种苦荞的快速再生组织培养方法，包括苦荞无菌苗的培养、苦荞丛生芽的诱导、苦荞再生芽的生根、炼苗和移栽等四个步骤，最终培养出完整的苦荞再生植株。本发明具有适用性强、操作简便、快速、经济等优点，是一种快速繁殖苦荞麦优良种质的高效再生技术。本发明主要利用植物组织细胞的全能性，以苦荞麦的顶端分生组织为外植体，通过特定培养基的诱导培养，同时调控环境因子的强度，通过直接诱导苦荞丛生芽的产生和苦荞再生芽的生根，进而完成苦荞麦的快速再生。

Description

一种苦荞的快速再生组织培养方法

技术领域

本发明属于苦荞麦组织培养再生技术领域，尤其涉及一种苦荞的快速再生组织培养方法。

背景技术

荞麦是一种药食同源的植物，分为苦荞和甜荞两大类。其中，苦荞(F.tataricumGaertn)在分类学上属蓼科(Polygonaceae)，荞麦属(Fagopyrum)，一年生双子叶草本植物。苦荞发源于中国，其性味苦、平、寒，有益气力、续精神、利耳目、降气宽肠健胃的作用，具有极高的营养保健功能。苦荞的种子、根、茎、叶等多种器官中都富含黄酮类物质，具有“降血糖、降血压、降血脂”的作用，被誉为“三降食品”。随着对苦荞营养价值和药用价值研究的不断深入，其越来越受到人们的青睐。苦荞在组培再生及遗传育种方面的研究还尚处于起步阶段，相关报道并不多见。这主要是由于苦荞自身的开花习性及遗传特点所决定的。苦荞麦为自花授粉，这就使得许多具有优良性状的基因难以通过人工杂交等方式转入苦荞中，且在人工杂交过程中还存在植株易被病虫侵害，而且增殖速度较慢，难以适应规模化生产的趋势，难以满足旺盛的市场需求。而利用植物组织培养技术结合转基因技术对现有苦荞品种进行遗传改良，可以在一定程度上解决苦荞在育种上所遇到的问题。但是，现有苦荞再生体系的研究还比较零散，且已经报道的相关研究成果还存在许多需要改进的地方。其中，利用传统组培再生手段对苦荞麦进行再生培养通常再生时间较长，从苦荞外植体诱导出愈伤组织，再由愈伤组织诱导出再生芽，然后再进行再生芽的生根诱导，通常需要12周至16周，且步骤较为复杂、操作不够简便，组培的成本也较高，在实际应用中具有一定的局限性。而苦荞麦在快速再生过程中也存在着部分品种再生芽诱导困难、诱导率低等问题。同时，苦荞麦的营养价值和药用价值越来越受到人们的关注，具有极大的市场潜力。目前采用的组培再生方法又存在着一定的弊端，我国苦荞麦的快速再生技术较为落后，这也间接阻碍了我国苦荞市场的迅速发展。因此，仍需要进一步优化组培技术。虽然苦荞已实现了经由原生质体、下胚轴及子叶的组培再生，但是经由顶端分生组织的快速再生技术却鲜有报道。因而，建立一个更加成熟、高效、迅速的苦荞快速再生体系对于我国苦荞麦的产业化发展具有重大的现实意义，这也将为苦荞转基因研究和分子遗传育种研究打下良好的基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种苦荞的快速再生组织培养方法，旨在解决苦荞麦在组培再生过程中部分品种再生芽诱导困难、诱导率低的的问题。

本发明是这样实现的，一种苦荞的快速再生组织培养方法，所述苦荞的快速再生组织培养方法包括以下步骤：

采用MS基础培养基对苦荞无菌苗的培养；

苦荞丛生芽的诱导；

苦荞再生芽的生根；

炼苗和移栽。

进一步，所述的MS基础培养基组分如下：

20×MS大量元素母液：NH4NO3 33.0g，KNO3 38.0g，MgSO4·7H2O 7.4g，KH2PO43400mg；

200×MS微量元素母液：KI 0.166g，H3BO3 1.24g，MnSO4·4H2O 4.46g，ZnSO4·7H2O 1.72g，Na2MnO4·2H2O 0.05g，CuSO4·5H2O 0.005g，CoCl2·6H2O 0.005g；

200×MS铁盐母液：FeSO4·7H2O 5.56g，Na2-EDTA·2H2O 7.46g；

200×MS有机母液：肌醇20.0g，烟酸0.1g，VB6 0.1g，VB1 0.1g，甘氨酸0.4g；

20×MS钙盐母液：CaCl2 6.64g。

进一步，所述MS基础培养基制备方法如下：

组分称量后，使用去离子水溶解并定容到1L；置于121℃高压灭菌锅中灭菌15min备用；

MS基础培养基的配置：20×大量元素母液50mL，200×微量元素母液5mL，200×铁盐母液5mL，20×钙盐母液50mL，200×有机母液5mL，植物凝胶2.5g，蔗糖30g；

1/2MS培养基的配置：20×大量元素母液25mL，200×微量元素母液2.5mL，200×铁盐母液2.5mL，20×钙盐母液25mL，200×有机母液2.5mL，植物凝胶2.5g，蔗糖20g；

使用去离子水定容到1L，再用0.5M NaOH调节PH值至5.8—6.2之间，最后，将其置于121℃高压灭菌锅中灭菌15min。

进一步，所述苦荞麦丛生芽的诱导具体包括：将剪取的苦荞麦外植体倾斜45°插入苦荞麦丛生芽诱导培养基之中，每个培养基中接种数5-10个外植体；苦荞麦丛生芽诱导培养基的配置为MS基础培养基中添加2.0mg/L 6-BA和0.5mg/L TDZ，之后，将接种好苦荞麦外植体的培养皿置于暗室中进行暗处理，处理时间为2天，之后将其置于人工光照培养箱中进行不定芽的诱导；期间，光照培养箱中光照强度为2000Lux，光照时间为白天16h、夜间8h，温度为白天25℃、夜间20℃，3-5周后在培养皿中即可得到众多诱导的不定芽。

进一步，所述苦荞麦再生芽诱导生根具体包括：将诱导出的苦荞麦不定芽从基部切下，垂直插入到苦荞麦生根培养基中，每瓶接种数为8-10株，苦荞麦生根培养基的配置为1/2MS基础培养基中添加1.0mg/L IBA；随后将培养瓶放置于人工光照培养箱中进行生根培养，光照培养箱中光照强度为2000Lux，光照时间为白天16h、夜间8h，温度为白天25℃、夜间20℃，2-3周后在组培瓶中的不定芽即可生根。

进一步，所述苦荞麦丛生芽的诱导之前需要制备苦荞麦快速再生外植体，具体包括：

苦荞麦组织培养无菌苗的获得：选择颗粒饱满的苦荞种子，在100mg/L的赤霉素溶液中浸泡2h，剥去种皮，之后用75％的乙醇浸泡60s，再用10％的次氯酸钠震荡处理8min，接着使用无菌水冲洗3次，每次5min，最后，将灭菌后的种子均匀铺于滤纸上，吸干其表面残留水分后均匀播撒至MS培养基上，之后，将处理好的种子放于光照培养箱中，温度为白天25℃光照16h，夜间20℃持续8h；

苦荞麦快速再生外植体的制备：取12-15日龄的苦荞麦无菌苗，在工作台内剪取苦荞组培苗的顶端分生组织作为外植体。

进一步，所述苦荞再生植株的炼苗与移栽：选择组培瓶中生长健壮的苦荞麦再生苗，打开瓶盖，洗去不定根上的培养基，移栽到装有营养土的花盆中，在室内炼苗4-6天，再将花盆中的再生苦荞麦幼苗取出，最后移栽至松软的土壤中生长。

进一步，所述MS基础培养基的pH值为5.8-6.2，同时添加0.25％的植物凝胶。

本发明提供的苦荞的快速再生组织培养方法，通过苦荞丛生芽的诱导和生根等简单步骤，即可实现苦荞麦的快速再生，简化了组培程序，从外植体的获得到再生苗的生成仅需5-8周，极大地节省了苦荞麦的再生时间，是一种快速培育苦荞麦优良种苗，提高苦荞麦再生效率的关键技术。同时，本发明还具有适用性广泛的特点，打破了不同苦荞麦品种间的界限，其再生方法适用于多个品种的苦荞，解决了苦荞麦在快速再生过程中部分品种再生芽诱导困难、诱导率低的难题。本发明是一种快速、高效、经济和简便的苦荞麦组培再生方法，通过利用配制的再生培养基进行苦荞麦优良品种的快速再生，提高了苦荞麦的再生效率，简化了苦荞麦的组培程序，缩短了组织培养的再生时间，有效降低了其组培成本，实现了对不同品种苦荞麦不定芽的高效诱导、快速再生。

附图说明

图1是本发明实施例提供的苦荞的快速再生组织培养方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例的苦荞的快速再生组织培养方法包括以下步骤：

S101：苦荞麦组织培养无菌苗的获得：选择颗粒饱满的苦荞种子，在100mg/L的赤霉素溶液中浸泡2h，剥去种皮，之后用75％的乙醇浸泡60s，再用10％的次氯酸钠(其中含有0.1％Tween 20)震荡处理8min，接着使用无菌水冲洗3次，每次5min，最后，将灭菌后的种子均匀铺于滤纸上，吸干其表面残留水分后均匀播撒至MS培养基上，之后，将处理好的种子放于光照培养箱中，温度为白天25℃光照16h，夜间20℃持续8h；

S102：苦荞麦快速再生外植体的制备：取12-15日龄的苦荞麦无菌苗，在超净工作台内剪取苦荞组培苗的顶端分生组织作为外植体；

S103：苦荞麦丛生芽的诱导：将剪取的苦荞麦外植体倾斜45°插入培养基之中，每个培养基中接种数5-10个外植体；苦荞麦丛生芽诱导培养基的配置为MS基础培养基中添加2.0mg/L 6-BA和0.5mg/L TDZ，之后，将接种好苦荞麦外植体的培养皿置于暗室中进行暗处理，处理时间为2天，之后将其置于人工光照培养箱中进行不定芽的诱导；期间，光照培养箱中光照强度为2000Lux，光照时间为白天16h、夜间8h，温度为白天25℃、夜间20℃，3-5周后在培养皿中即可得到众多诱导的不定芽；

S104：苦荞麦再生芽诱导生根：将上述诱导出的苦荞麦不定芽从基部切下，将其垂直插入到生根培养基中，每瓶接种数为8-10株，瓶中生根培养基的配置为1/2MS基础培养基中添加1.0mg/L IBA；随后将培养瓶放置于人工光照培养箱中进行生根培养，光照培养箱中光照强度为2000Lux，光照时间为白天16h、夜间8h，温度为白天25℃、夜间20℃，2-3周后在组培瓶中的不定芽即可生根；

S105：苦荞再生植株的炼苗与移栽：选择组培瓶中生长健壮的苦荞麦再生苗，打开瓶盖，轻轻洗去不定根上的培养基，注意不要伤及根部，将其移栽到装有营养土的花盆中，在室内炼苗4-6天，再将花盆中的再生苦荞麦幼苗取出，最后移栽至松软的土壤中生长。

上述所有培养基的pH值为5.8-6.2，同时添加0.25％的植物凝胶。

进一步，所述的MS基础培养基组分如下：

20×MS大量元素母液：NH4NO3 33.0g，KNO3 38.0g，MgSO4·7H2O 7.4g，KH2PO43400mg；

200×MS微量元素母液：KI 0.166g，H3BO3 1.24g，MnSO4·4H2O 4.46g，ZnSO4·7H2O 1.72g，Na2MnO4·2H2O 0.05g，CuSO4·5H2O 0.005g，CoCl2·6H2O 0.005g；

200×MS铁盐母液：FeSO4·7H2O 5.56g，Na2-EDTA·2H2O 7.46g；

200×MS有机母液：肌醇20.0g，烟酸0.1g，VB6 0.1g，VB1 0.1g，甘氨酸 0.4g；

20×MS钙盐母液：CaCl2 6.64g。

进一步，所述MS基础培养基制备方法如下：

组分称量后，使用去离子水溶解并定容到1L；置于121℃高压灭菌锅中灭菌15min备用；

MS基础培养基的配置：20×大量元素母液50mL，200×微量元素母液5mL，200×铁盐母液5mL，20×钙盐母液50mL，200×有机母液5mL，植物凝胶2.5g，蔗糖30g；

1/2MS培养基的配置：20×大量元素母液25mL，200×微量元素母液2.5mL，200×铁盐母液2.5mL，20×钙盐母液25mL，200×有机母液2.5mL，植物凝胶2.5g，蔗糖20g；

使用去离子水定容到1L，再用0.5M NaOH调节PH值至5.8—6.2之间，最后，将其置于121℃高压灭菌锅中灭菌15min。

进一步，所述苦荞麦丛生芽的诱导具体包括：将剪取的苦荞麦外植体倾斜45°插入苦荞麦丛生芽诱导培养基之中，每个培养基中接种数5-10个外植体；苦荞麦丛生芽诱导培养基的配置为MS基础培养基中添加2.0mg/L 6-BA和0.5mg/L TDZ，之后，将接种好苦荞麦外植体的培养皿置于暗室中进行暗处理，处理时间为2天，之后将其置于人工光照培养箱中进行不定芽的诱导；期间，光照培养箱中光照强度为2000Lux，光照时间为白天16h、夜间8h，温度为白天25℃、夜间20℃，3-5周后在培养皿中即可得到众多诱导的不定芽。

进一步，所述苦荞麦再生芽诱导生根具体包括：将诱导出的苦荞麦不定芽从基部切下，垂直插入到苦荞麦生根培养基中，每瓶接种数为8-10株，苦荞麦生根培养基的配置为1/2MS基础培养基中添加1.0mg/L IBA；随后将培养瓶放置于人工光照培养箱中进行生根培养，光照培养箱中光照强度为2000Lux，光照时间为白天16h、夜间8h，温度为白天25℃、夜间20℃，2-3周后在组培瓶中的不定芽即可生根。

进一步，所述苦荞麦丛生芽的诱导之前需要制备苦荞麦快速再生外植体，具体包括：

苦荞麦组织培养无菌苗的获得：选择颗粒饱满的苦荞种子，在100mg/L的赤霉素溶液中浸泡2h，剥去种皮，之后用75％的乙醇浸泡60s，再用10％的次氯酸钠震荡处理8min，接着使用无菌水冲洗3次，每次5min，最后，将灭菌后的种子均匀铺于滤纸上，吸干其表面残留水分后均匀播撒至MS培养基上，之后，将处理好的种子放于光照培养箱中，温度为白天25℃光照16h，夜间20℃持续8h；

苦荞麦快速再生外植体的制备：取12-15日龄的苦荞麦无菌苗，在工作台内剪取苦荞组培苗的顶端分生组织作为外植体。

进一步，所述苦荞再生植株的炼苗与移栽：选择组培瓶中生长健壮的苦荞麦再生苗，打开瓶盖，洗去不定根上的培养基，移栽到装有营养土的花盆中，在室内炼苗4-6天，再将花盆中的再生苦荞麦幼苗取出，最后移栽至松软的土壤中生长。

进一步，所述MS基础培养基的pH值为5.8-6.2，同时添加0.25％的植物凝胶。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的说明。

(1)分别以苦荞地方品种“园子荞”、“西昌苦荞”以及主要栽培品种“川荞3号”为实施对象，首先在100mg/L的赤霉素溶液中浸泡2h，剥去种皮，之后利用75％的乙醇浸泡60s，再用10％的次氯酸钠(其中含有0.1％Tween 20)震荡处理8min，接着使用无菌水冲洗3次，每次5min。再将种子均匀铺于滤纸上，吸干其表面残留水分，均匀播撒至MS培养基上。之后，将处理好的种子放于光照培养箱中，温度为白天25℃光照16h，夜间20℃持续8h。

(2)在超净工作台内分别剪取12-15日龄的“园子荞”、“西昌苦荞”以及“川荞3号”的顶端分生组织作为快速再生外植体，并在超净工作台中，将剪取的苦荞外植体倾斜45°插入苦荞丛生芽诱导培养基之中，苦荞丛生芽诱导培养基为MS基础培养基中添加2.0mg/L 6-BA和0.5mg/L TDZ，3％的蔗糖，0.25％的植物凝胶；

(3)将接种有苦荞外植体的培养皿置于暗室中进行暗处理，处理时间为2d。之后将其放置于人工光照培养箱中进行苦荞麦丛生芽的诱导；其中，光照培养箱中光照强度为2000Lux，光照时间为白天16h、夜间8h，温度为白天25℃、夜间20℃。3-5周后，在培养皿中得到长度约2-3cm的丛生芽，其中“园子荞”的丛生芽诱导率可以达到71.2％，“西昌苦荞”的丛生芽诱导率为58.9％，而“川荞3号”的丛生芽诱导率则为63.4％。

(4)将上述诱导出的苦荞麦再生芽自基部切下，将其垂直插入到生根培养基中，每瓶接种数为8-10株，瓶中生根培养基的配置为1/2MS基础培养基中添加1.0mg/L IBA，2％的蔗糖、0.25％的植物凝胶；随后将培养瓶放置于人工光照培养箱中进行生根培养，光照培养箱中光照强度为2000Lux，光照时间为白天16h、夜间8h，温度为白天25℃、夜间20℃，2-3周后在组培瓶中的再生芽即可生根。其中“园子荞”再生苗根的诱导率可以达到82.4％，“西昌苦荞”再生苗根的诱导率为70.4％，而“川荞3号”再生苗根的诱导率则为80.6％。

(5)待苦荞再生苗根部生长至3-5cm后，轻轻洗去不定根上的培养基，注意不要伤及根部，将其移栽到装有营养土的花盆中，在室内炼苗4-6天，再将花盆中的苦荞麦再生苗取出，最后移栽至松软的土壤中生长。最终，“园子荞”的再生率可以达到58.7％，“西昌苦荞”的再生率为41.5％，而“川荞3号”的再生率则为51.1％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种苦荞的快速再生组织培养方法，其特征在于，所述苦荞的快速再生组织培养方法包括以下步骤：

采用MS基础培养基对苦荞无菌苗的培养：选取颗粒饱满的苦荞种子，在100mg/L的赤霉素溶液中浸泡2h，剥去种皮，用75％的乙醇浸泡60s，再用10％的次氯酸钠震荡处理8min；接着使用无菌水冲洗3次，每次5min；最后，将消毒后的种子均匀铺于滤纸上，吸干表面残留水分后播撒至MS培养基上，置于光照培养箱中进行无菌苗的培养；

苦荞丛生芽的诱导：将外植体倾斜置于苦荞麦丛生芽诱导培养基之中，丛生芽诱导培养基的配制 为MS培养基中加入2.0mg/L 6-BA和0.5mg/L TDZ，随后，将接种有外植体的培养皿置于暗室中暗处理2天；之后置于人工光照培养箱中进行丛生芽的诱导；

苦荞再生芽的生根：将诱导出的苦荞麦不定芽从基部切下，垂直插入苦荞麦生根培养基中，生根培养基的配制 为1/2MS基础培养基中添加1.0mg/L IBA，随后将培养瓶放置于人工光照培养箱中进行生根培养；

炼苗和移栽：选取生根培养基中生长健壮的苦荞麦再生苗，打开瓶盖，洗去不定根上的培养基，移栽到装有营养土的花盆中，室内炼苗4-6天，再将花盆中的再生苦荞麦幼苗取出，最后移栽至松软的土壤中生长；

所述的MS基础培养基组分如下：

20×MS大量元素母液：NH4NO3 33.0g，KNO3 38.0g，MgSO4·7H2O 7.4g，KH2PO43400mg；

200×MS微量元素母液：KI 0.166g，H3BO3 1.24g，MnSO4·4H2O 4.46g，ZnSO4·7H2O1.72g，Na2MnO4·2H2O 0.05g，CuSO4·5H2O 0.005g，CoCl2·6H2O 0.005g；

200×MS铁盐母液：FeSO4·7H2O 5.56g，Na2-EDTA·2H2O 7.46g；

200×MS有机母液：肌醇20.0g，烟酸0.1g，VB6 0.1g，VB1 0.1g，甘氨酸0.4g；

20×MS钙盐母液：CaCl2 6.64g；

所述MS基础培养基制备方法如下：

组分称量后，使用去离子水溶解并定容到1L；置于121℃高压灭菌锅中灭菌15min备用；

MS基础培养基的配制 ：20×大量元素母液50mL，200×微量元素母液5mL，200×铁盐母液5mL，20×钙盐母液50mL，200×有机母液5mL，植物凝胶2.5g，蔗糖30g；

1/2MS培养基的配制 ：20×大量元素母液25mL，200×微量元素母液2.5mL，200×铁盐母液2.5mL，20×钙盐母液25mL，200×有机母液2.5mL，植物凝胶2.5g，蔗糖20g；

使用去离子水定容到1L，再用0.5M NaOH调节PH值至5.8—6.2之间，最后，将其置于121℃高压灭菌锅中灭菌15min；

所述苦荞麦丛生芽的诱导具体包括：将剪取的苦荞麦外植体倾斜45°插入苦荞麦丛生芽诱导培养基之中，每个培养基中接种数5-10个外植体；苦荞麦丛生芽诱导培养基的配制为MS基础培养基中添加2.0mg/L 6-BA和0.5mg/L TDZ，之后，将接种好苦荞麦外植体的培养皿置于暗室中进行暗处理，处理时间为2天，之后将其置于人工光照培养箱中进行不定芽的诱导；期间，光照培养箱中光照强度为2000Lux，光照时间为白天16h、夜间8h，温度为白天25℃、夜间20℃，3-5周后在培养皿中即可得到诱导的不定芽；

所述苦荞麦再生芽诱导生根具体包括：将诱导出的苦荞麦不定芽从基部切下，垂直插入到苦荞麦生根培养基中，每瓶接种数为8-10株，苦荞麦生根培养基的配制 为1/2MS基础培养基中添加1.0mg/L IBA；随后将培养瓶放置于人工光照培养箱中进行生根培养，光照培养箱中光照强度为2000Lux，光照时间为白天16h、夜间8h，温度为白天25℃、夜间20℃，2-3周后在组培瓶中的不定芽即可生根；

所述苦荞麦丛生芽的诱导之前需要制备苦荞麦快速再生外植体，具体包括：

苦荞麦组织培养无菌苗的获得：选择颗粒饱满的苦荞种子，在100mg/L的赤霉素溶液中浸泡2h，剥去种皮，之后用75％的乙醇浸泡60s，再用10％的次氯酸钠震荡处理8min，接着使用无菌水冲洗3次，每次5min，最后，将灭菌后的种子均匀铺于滤纸上，吸干其表面残留水分后均匀播撒至MS培养基上，之后，将处理好的种子放于光照培养箱中，温度为白天25℃光照16h，夜间20℃持续8h；

苦荞麦快速再生外植体的制备：取12-15日龄的苦荞麦无菌苗，在工作台内剪取苦荞组培苗的顶端分生组织作为外植体；

所述苦荞再生植株的炼苗与移栽：选择组培瓶中生长健壮的苦荞麦再生苗，打开瓶盖，洗去不定根上的培养基，移栽到装有营养土的花盆中，在室内炼苗4-6天，再将花盆中的再生苦荞麦幼苗取出，最后移栽至松软的土壤中生长；

所述MS基础培养基的pH值为5.8-6.2，同时添加0.25％的植物凝胶。