CN102150619A - 辣木胚愈伤组织诱导和植株再生方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种辣木胚愈伤组织诱导和植株再生方法，它将消毒灭菌的辣木种子在无菌条件下，解剖、分离出辣木胚，并将辣木胚依次接种到诱导、增殖、生根培养基上，先后进行愈伤组织诱导、幼芽分化、增殖、继代、生根培养后，再生出完整植株。本发明解决了辣木种子因发芽率低、出苗不整齐，而难于获得数量充足的健壮移栽苗的问题，尤其在用生物技术改良辣木品种时，因远缘杂交不亲和而导致辣木胚败育时，可通过本发明提供抢救措施，以挽回败育的辣木胚，为生产提供大量优质种苗。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物培养方法，尤其是一种通过辣木胚愈伤组织诱导和植株再生获得辣木移栽苗的方法，属于生物技术领域。
背景技术
辣木（Moringa oleifera）是多年生的多用途速生乔木植物，原产于热带、南亚热带的干旱或半干旱地区，对土壤条件和降雨量有很强的适应性，抗逆性强。辣木全身都是宝，其根、茎、叶、花、果实、种子等均可利用。辣木的叶片及果荚不仅营养全面、丰富，而且富含多种矿物质、维生素，作为蔬菜和食品有增进营养和食疗保健功能；辣木种子含有活性凝结成分，有净化水的特殊功能，因此被广泛应用于农业、工业、畜牧业、医药、美容等多种领域，是一种集美味、营养和保健于一体的珍稀菜肴，被誉为“奇迹之树”。国内繁殖辣木的方法目前主要有种子播种和扦插繁殖，这些方法受到季节的限制，且发芽率和繁殖系数较低，难以进行规模化、标准化生产，难于进行优良品种的大面积推广。
发明内容
为克服现有辣木种苗的繁殖因发芽率低和繁殖系数低而难以规模化生产等缺陷，本发明通过用辣木胚诱导培养出愈伤组织，再进行植株的再生，以提高增殖率，降低生产成本，同时将优良性状的种苗固定下来，操作简变易行。
本发明提供的是这样一种辣木胚愈伤组织诱导和植株再生方法，其特征在于经过下列步骤：
A、将辣木胚接入下列培养基中：
MS基本培养液
6-苄胺基嘌呤6-BA 0.5～1.0 mg/L
萘乙酸NAA 0.05～0.1 mg/L
蔗糖 30000 mg/L
琼脂 6500 mg/L
pH 6.0～6.5
在光照强度为1000～1500 lx，温度为25±2℃，光照时间为10～12h/d的条件下，进行愈伤组织诱导培养25～35d，得愈伤组织；
B、将步骤A的愈伤组织转接到下列培养基中：
6-苄胺基嘌呤6-BA 0.3～0.5 mg/L
激动素KT 0.2 mg/L
萘乙酸NAA 0.1 mg/L
蔗糖 30000 mg/L
琼脂 6500 mg/L
pH 6.0～6.5
在光照强度为1500～2000 lx，温度为25±2℃，光照时间为10～12h/d的条件下，进行诱导培养20～30d，使之长出不定芽；
C、将B步骤诱导培养出的不定芽切成1.5～2cm长的带节茎段，接种到下列培养基中：
激动素KT 费 0.1～0.3 mg/L
6-苄胺基嘌呤6-BA 0.1 mg/L
蔗糖 30000 mg/L
琼脂 6500 mg/L
pH 6.0～6.5
在与B步骤相同的培养条件下进行增殖和继代培养，继代周期为20～25d，繁殖倍数为2～5倍，得增殖苗；
D、将C步骤所得增殖苗上部1～1.5㎝长的茎尖切下，插入下列培养基中：
1/2MS基本培养液
吲哚丁酸 IBA 0.4 mg/L
蔗糖 30000～40000 mg/L
琼脂 7000 mg/L
pH 6.0～6.5
在与C步骤相同的培养条件下进行生根培养20～25d后，得生根植株；而增殖苗余下的基部返回接种到C步骤的增殖培养基中，并在与C步骤相同的培养条件下再次进行增殖和继代培养；
E、取D步骤的生根植株于室外散射光下进行常规炼苗5～7d后，将苗取出，洗净苗上的培养基，放入质量浓度为0.1～0.2%的多菌灵溶液中消毒1～2min后，移栽至装有下列质量比基质的育苗袋中：腐植土︰红土︰珍珠岩=1︰1︰1，按常规进行浇水、施肥管理30d后，得到辣木移栽苗。
所述步骤A的辣木胚通过下列方法获得：从性状优良的辣木植株上，采收无病虫侵害的饱满无皱缩辣木种子，先用洗衣粉水清洗，再用清水冲洗干净，之后先放入质量浓度为0.1%的氯化汞溶液中消毒20min，再放入下列混合液中消毒15min ：每100ml质量浓度为2%的次氯酸钠溶液中滴加有2滴吐温-20，之后再用无菌水冲洗4次，每次2min；在无菌条件下，解剖上述消毒灭菌处理的辣木种子，分离出辣木胚。
所述步骤D中的1/2 MS基本培养液为：MS培养液中的全量元素的浓度减半的培养液。
本发明具有下列优点和效果：
1、用试管繁殖技术在培养室内即可实现周年生产，既节约了土地资源，又提高了经济效益，克服了种苗无法周年进行生产的难点；
2、繁殖速度快，20~25d为一个周期，繁殖倍数可达3～5；
3、解决了常规繁育体系生产的种苗亲本来源复杂，种苗质量不稳定的难题，通过本发明，使种苗性状稳定，种苗来源单一，易于标准化、工厂化操作，有效地提高了种苗质量，可为市场提供统一标准的优良种苗；
4、本发明在外植体的选择方面，选择优良株系，通过本发明中的快速繁殖方法将辣木优良种性快速地固定并保持下来，有效缩短了繁育周期；
5、通过胚诱导愈伤组织再生植株体系的建立，为胚挽救、基因工程育种、多倍体育种搭建相关技术平台；
6、无菌生根苗直接移栽到育苗袋中，省去了组培苗营养钵移栽的环节，移栽成活的种苗便于运输，摘去育苗袋后直接栽种。
具体实施方式
为了更好地说明本发明，下面给出本发明的实施例，但本发明的内容并不仅限于此。
实施例1
A、从性状优良的辣木植株上，采收无病虫侵害的饱满无皱缩的辣木种子，按常规用洗衣粉水清洗，之后用清水冲洗干净，在超净环境下先放入质量浓度为0.1%氯化汞溶液中消毒20min，再放入下列混合液中消毒15min：每100ml质量浓度为2%的次氯酸钠溶液中滴加有2滴吐温-20，之后用无菌水冲洗4次，每次2min；在无菌条件下，解剖上述消毒灭菌处理的辣木种子，分离出辣木胚；
将分离出的辣木胚接入下列培养基中：
MS基本培养液
6-苄胺基嘌呤6-BA 0.5 mg/L
萘乙酸NAA) 0.05 mg/L
蔗糖 30000 mg/L
琼脂 6500 mg/L
pH 6.0
在光照强度为1500 lx，温度为27℃，光照时间为10h/d的条件下，进行愈伤组织诱导培养35d，得愈伤组织；
B、将步骤A诱导的愈伤组织转接到下列培养基中：
6-苄胺基嘌呤6-BA 0.3 mg/L
激动素KT 0.2 mg/L
萘乙酸NAA 0.1 mg/L
蔗糖 30000 mg/L
琼脂 6500 mg/L
pH 6.0
在光照强度为1500 lx，温度为25℃，光照时间为11h/d的条件下，进行诱导培养30d，使之长出不定芽；
C、将B步骤诱导出的不定芽切成2cm长的带节茎段，接种到下列培养基中：
激动素KT 0.1 mg/L
6-苄胺基嘌呤6-BA 0.1 mg/L
蔗糖 30000 mg/L
琼脂 6500 mg/L
pH 6.0
在与B步骤相同的培养条件下进行增殖和继代培养，继代周期为20d，繁殖倍数为2倍，得增殖苗；
D、将步骤C的增殖苗上部1㎝长的茎尖切下，插入下列培养基中：
1/2 MS基本培养液
吲哚丁酸IBA 0.4 mg/L
蔗糖 40000 mg/L
琼脂 7000 mg/L
pH 6.0
在与C步骤相同的培养条件下进行生根培养20d后，得生根植株；而增殖苗余下的基部返回接种到C步骤的增殖培养基中，并在与C步骤相同的培养条件下再次进行增殖和继代培养；
E、取D步骤的生根植株于室外散射光下进行常规炼苗7d，将苗从瓶内取出，洗净苗上的培养基，放入质量浓度为0.2%的多菌灵溶液中消毒1min后，移栽至装有下列质量比基质的育苗袋中：腐植土︰红土︰珍珠岩=1︰1︰1，在常规浇水、施肥管理条件下，生长30d后，即得到辣木移栽苗。
实施例2
A、从性状优良的辣木植株上，采收无病虫侵害的饱满无皱缩的辣木外植体，按常规用洗衣粉水清洗，之后用清水冲洗干净，在超净环境下先放入质量浓度为0.1%氯化汞溶液中消毒20min，再放入下列混合液中消毒15min：每100ml质量浓度为2%的次氯酸钠溶液中滴加有2滴吐温-20，之后用无菌水冲洗4次，每次2min；在无菌条件下，解剖上述消毒灭菌处理的辣木种子，分离出辣木胚；
将分离出的辣木胚接入下列培养基中：
MS基本培养液
6-苄胺基嘌呤6-BA 1.0 mg/L
萘乙酸NAA 0.1 mg/L
蔗糖 30000 mg/L
琼脂 6500 mg/L
pH 6.5
在光照强度为1000 lx，温度为25℃，光照时间为12h/d的条件下，进行愈伤组织诱导培养25d，得愈伤组织；
B、将步骤A的愈伤组织转接到下列培养基中：
6-苄胺基嘌呤6-BA 0.5 mg/L
激动素KT 0.2 mg/L
萘乙酸NAA) 0.1 mg/L
蔗糖 30000 mg/L
琼脂 6500 mg/L
pH 6.5
在光照强度为2000 lx，温度为27℃，光照时间为12h/d的条件下，进行诱导培养20d，使之长出不定芽；
C、取B步骤的不定芽切成1.5cm长的带节茎段，接种到下列培养基中：
激动素（KT) 0.3 mg/L
6-苄胺基嘌呤6-BA 0.1 mg/L
蔗糖 30000 mg/L
琼脂 6500 mg/L
pH 6.5
在与B步骤相同的培养条件下进行增殖和继代培养，继代周期为25d，繁殖倍数为5倍，得增殖苗；
D、将增殖苗上部1.5㎝长的茎尖切下，插入下列培养基：
1/2 MS基本培养液
吲哚丁酸IBA 0.4 mg/L
蔗糖 30000 mg/L
琼脂 7000 mg/L
pH 6.5
在与C步骤相同的培养条件下进行生根培养25d后，得生根植株；而增殖苗余下的基部返回接种到C步骤的增殖培养基中，并在与C步骤相同的培养条件下再次进行增殖和继代培养；
E、取D步骤的生根植株于室外散射光下进行常规炼苗6d，将苗从瓶内取出，洗净苗上的培养基，放入质量浓度为0.1%的多菌灵溶液中消毒2min后，移栽至装有下列质量比基质的育苗袋中：腐植土︰红土︰珍珠岩=1︰1︰1，按常规进行浇水、施肥管理，生长30d后，即得到辣木移栽苗。
实施例3
A、从性状优良的辣木植株上，采收无病虫侵害的饱满无皱缩的辣木外植体，按常规用洗衣粉水清洗，之后用清水冲洗干净，在超净环境下先放入质量浓度为0.1%氯化汞溶液中消毒20min，再放入下列混合液中消毒15min：每100ml质量浓度为2%的次氯酸钠溶液中滴加有2滴吐温-20，之后用无菌水冲洗4次，每次2min；在无菌条件下，解剖上述消毒灭菌处理的辣木种子，分离出辣木胚；
将分离出的辣木胚接入下列培养基中：
MS基本培养液
6-苄胺基嘌呤6-BA 0.8 mg/L
萘乙酸NAA 0.07 mg/L
蔗糖 30000 mg/L
琼脂 6500 mg/L
pH 6.3
在光照强度为1200 lx，温度为23℃，光照时间为12h/d的条件下，进行愈伤组织诱导培养32d；
B、将步骤A诱导的愈伤组织转接到下列培养基中：
6-苄胺基嘌呤6-BA 0.4 mg/L
激动素（KT) 0.2 mg/L
萘乙酸(NAA ) 0.1 mg/L
蔗糖 30000 mg/L
琼脂 6500 mg/L
pH 6.3
在光照强度为2000 lx，温度为23℃，光照时间为10h/d的条件下，进行诱导培养23d，至长出不定芽；
C、取B步骤诱导出的不定芽切成1.5cm长的带节茎段，接种到下列培养基中：
激动素（KT) 0.2 mg/L
6-苄胺基嘌呤6-BA 0.1 mg/L
蔗糖 30000 mg/L
琼脂 6500 mg/L
pH 6.3
在与B步骤相同的培养条件下进行增殖和继代培养，继代周期为25d，繁殖倍数为4倍，得增殖苗；
D、将增殖苗上部1㎝长的茎尖切下，插入下列培养基中：
1/2 MS基本培养液
吲哚丁酸IBA 0.4 mg/L
蔗糖 35000 mg/L
琼脂 7000 mg/L
pH 6.3
在与C步骤相同的培养条件下进行生根培养22d后，得生根植株；而增殖苗余下的基部返回接种到C步骤的增殖培养基中，并在与C步骤相同的培养条件下再次进行增殖和继代培养；
E、取D步骤的生根植株于室外散射光下进行常规炼苗5d，将苗从瓶内取出，洗净苗上的培养基，放入质量浓度为0.1%的多菌灵溶液中消毒2min后，移栽至装有下列质量比基质的育苗袋中：腐植土︰红土︰珍珠岩=1︰1︰1，按常规进行浇水、施肥管理，生长30d后，即得到辣木移栽苗。
Claims (2)
1.一种辣木胚愈伤组织诱导和植株再生方法，其特征在于经过下列步骤：
A、将辣木胚接入下列培养基中：
MS基本培养液
6-苄胺基嘌呤6-BA 0.5～1.0 mg/L
萘乙酸NAA 0.05～0.1 mg/L
蔗糖 30000 mg/L
琼脂 6500 mg/L
pH 6.0～6.5
在光照强度为1000～1500 lx，温度为25±2℃，光照时间为10～12h/d的条件下，进行愈伤组织诱导培养25～35d，得愈伤组织；
B、将步骤A的愈伤组织转接到下列培养基中：
6-苄胺基嘌呤6-BA 0.3～0.5 mg/L
激动素KT 0.2 mg/L
萘乙酸NAA 0.1 mg/L
蔗糖 30000 mg/L
琼脂 6500 mg/L
pH 6.0～6.5
在光照强度为1500～2000 lx，温度为25±2℃，光照时间为10～12h/d的条件下，进行诱导培养20～30d，使之长出不定芽；
C、将B步骤诱导培养出的不定芽切成1.5～2cm长的带节茎段，接种到下列培养基中：
激动素KT 0.1～0.3 mg/L
6-苄胺基嘌呤6-BA 0.1 mg/L
蔗糖 30000 mg/L
琼脂 6500 mg/L
pH 6.0～6.5
在与B步骤相同的培养条件下进行增殖和继代培养，继代周期为20～25d，繁殖倍数为2～5倍，得增殖苗；
D、将C步骤所得增殖苗上部1～1.5㎝长的茎尖切下，插入下列培养基中：
1/2MS基本培养液
吲哚丁酸 IBA 0.4 mg/L
蔗糖 30000～40000 mg/L
琼脂 7000 mg/L
pH 6.0～6.5
在与C步骤相同的培养条件下进行生根培养20～25d后，得生根植株；而增殖苗余下的基部返回接种到C步骤的增殖培养基中，并在与C步骤相同的培养条件下再次进行增殖和继代培养；
E、取D步骤的生根植株于室外散射光下进行常规炼苗5～7d后，将苗取出，洗净苗上的培养基，放入质量浓度为0.1～0.2%的多菌灵溶液中消毒1～2min后，移栽至装有下列质量比基质的育苗袋中：腐植土︰红土︰珍珠岩=1︰1︰1，按常规进行浇水、施肥管理30d后，得到辣木移栽苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤A的辣木胚通过下列方法获得：从性状优良的辣木植株上，采收无病虫侵害的饱满无皱缩辣木种子，先用洗衣粉水清洗，再用清水冲洗干净，之后先放入质量浓度为0.1%的氯化汞溶液中消毒20min，再放入下列混合液中消毒15min ：每100ml质量浓度为2%的次氯酸钠溶液中滴加有2滴吐温-20，之后再用无菌水冲洗4次，每次2min；在无菌条件下，解剖上述消毒灭菌处理的辣木种子，分离出辣木胚。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110817 |