CN104938337B - 铁皮石斛快速繁殖成苗的培养基系列及组培方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种铁皮石斛快速繁殖成苗的培养基系列及组培方法。所述培养基系列包括播种培养基、增殖培养基、壮苗培养基、分化苗培养基以及生根培养基。本发明的组培方法，首先种子在萌发培养基中培养，无需经过黑暗培养处理直接进行光照处理，种子萌发形成原球茎后，在原球茎增殖诱导培养基中诱导产生愈伤组织，愈伤组织进一步形成类原球茎；类原球茎经过分化形成小苗；将小苗移至壮苗培养基中，小苗长成大苗后；大苗在生根培养基中经过培养成为铁皮石斛成苗。本发明可以缩短铁皮石斛的培育时间，不仅操作简单，且不受时间地点的限制，类原球茎的不断分裂增殖可以保证周年生产，便于大规模工业化生产应用。
Description
技术领域
本发明涉及药用植物种苗的繁殖方法，具体来说涉及一种铁皮石斛快速繁殖培养基系列以及组培方法。
背景技术
铁皮石斛种子细如粉尘，一个蒴果内所含种子达100万粒之多。由于缺乏胚乳，种子需与真菌共生才能萌发，自然条件下萌发率非常低(不足5％)。铁皮石斛自然繁殖力极低，常规繁殖又较困难，且多年来对铁皮石斛的采集量远大于其生长量，野生铁皮石斛自然繁殖已濒临绝迹。为发展人工栽培满足市场需求，药用石斛中的一些珍贵品种已成为目前组织快繁研究的重点。
目前关于铁皮石斛的组织培养研究已经有相关报道，但是组织培养所需的成本过高和试管成苗周期长的问题是制约铁皮石斛产业化大生产的瓶颈。因此亟需一种能快速繁殖铁皮石斛的组织培养体系，为推广人工培植技术和大规模工厂化育苗奠定理论与实践基础。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题，本发明从铁皮石斛种子培养入手，对铁皮石斛组织培养的培养基组分，通过多年的实验摸索发现，能快速繁殖铁皮石斛且能够周年生产的组织培养体系，为工厂化育苗提供技术支撑。该铁皮石斛快速繁殖培养基系列能够明显提高铁皮石斛种子的萌发时间，从传统的75天左右的时间直接缩短为14-25天，并且野生种子萌发率高达96-98％，铁皮石斛组培苗移栽成活率高达98％。
本发明提出一种铁皮石斛快速繁殖培养基系列，其技术方案是这样实现的：
一种铁皮石斛快速繁殖成苗的培养基系列，该培养基系列包括播种培养基、增殖培养基、壮苗培养基、分化苗培养基以及生根培养基，所述培养基各组成成分含量分别为：
播种培养基：1000毫升A液体、1000毫升B液体、100毫升C液体、100毫升D液体、20毫升L液体、8毫升M1液体、380-420g蔗糖、74-78g琼脂、34-38g碳粉、1900-2100g土豆、苹果或者香蕉与10升水；
增殖培养基：1000毫升A液体、1000毫升B液体、100毫升C液体、100毫升D液体、20毫升L液体、8毫升M1液体、5毫升M2液体、380-420g蔗糖、74-78g琼脂、34-38g碳粉、1900-2100g土豆、苹果或者香蕉与10升水；
壮苗培养基：1000毫升A液体、1000毫升B液体、100毫升C液体、100毫升D液体、20毫升L液体、15毫升M1液体、10毫升M2液体、380-420g蔗糖、74-78g琼脂、38-42g碳粉、1900-2100g土豆、苹果或者香蕉与10升水；
分化苗培养基：1000毫升A液体、1000毫升B液体、100毫升C液体、100毫升D液体、20毫升L液体、15毫升M1液体、15毫升M2液体、、380-420g蔗糖、74-78g琼脂、38-42g碳粉、1900-2100g土豆、苹果或者香蕉与10升水；
生根培养基：1000毫升A液体、1000毫升B液体、100毫升C液体、100毫升D液体、20毫升L液体、20毫升M1液体、10毫升M2液体、480-520g蔗糖、74-78g琼脂、38-42g碳粉、2400-2600g土豆或者香蕉与10升水；
其中，所述A液体、B液体、C液体、D液体、L液体、M1液体与M2液体中元素组成分别为：
A液体：16.5g/L硝酸铵、19.0g/L硝酸钾、3.7g/L硫酸镁与1.7g/L磷酸二氢钾；
B液体：4.4g/L氯化钙；
C液体：0.4g/L甘氨酸、0.02g/L维生素B1、0.1g/L烟酸、0.1g/L盐酸比哆辛VB6与20g/L肌醇；
D液体：5.56g/L硫酸亚铁与7.46g/L乙二胺四乙酸二钠；
L液体：16.9g/L硫酸锰、8.6g/L硫酸锌、6.2g/L硼酸、0.83g/L碘化钾、0.025g/L硫酸铜、0.025g/L氯化钴与0.25g/L钼酸钠；
M1液体：0.5g/La―奈乙酸与0.4g/L氢氧化钠；
M2液体：0.5g/L 6-苄基腺嘌呤与0.4g/L氢氧化钠。
进一步，所述播种培养基的pH值为5.4-5.8，用酸碱调节剂调节所述播种培养基的pH值，即培养基发黄则添加氢氧化钠调节，发黑则添加盐酸调节；所述增殖培养基的pH值为5.4-5.8，用酸碱调节剂调节所述增殖培养基的pH值，即培养基发黄则添加氢氧化钠调节，发黑则添加盐酸调节；所述壮苗培养基的pH值为5.4-5.8，用酸碱调节剂调节所述壮苗培养基的pH值，即培养基发黄则添加氢氧化钠调节，发黑则添加盐酸调节；所述分化苗培养基的pH值为5.4-5.8，用酸碱调节剂调节所述分化苗培养基的pH值，即培养基发黄则添加氢氧化钠调节，发黑则添加盐酸调节；所述生根苗培养基的pH值为5.4-5.8，用酸碱调节剂调节所述生根苗培养基的pH值，即培养基发黄则添加氢氧化钠调节，发黑则添加盐酸调节。
进一步，所述培养基及所述A液体、B液体、C液体、D液体、L液体、M1液体与M2液体中所用的水均为矿泉水。
本发明还公开了使用上述培养基系列由铁皮石斛快速繁殖成苗的组培方法，其步骤如下：
⑴铁皮石斛种子的无菌萌发
采集铁皮石斛蒴果种子，依次用酒精与次氯酸钠溶液进行消毒灭菌，将灭菌后的种子的一端将其切开，将粉末状胚均匀的播撒到播种培养基上，在有光照的组培室培养14-25天，萌发的种子形成原球茎，保持组培室温度在22-25℃；
⑵铁皮石斛原球茎的增殖
将种子萌发形成的原球茎均匀转入到增殖培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在22-25℃，原球茎长出淡黄色愈伤组织，22-27天，愈伤组织不断分离增殖成类原球茎；
⑶铁皮石斛类原球茎的分化
将类原球茎挑出并均匀转入到分化培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在22-25℃，26-30天，类原球茎分化成小苗；
⑷铁皮石斛小苗的壮苗
将小苗放置在预先消毒过的大培养皿上，并把小苗插入到壮苗培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在22-25℃，32-45天，小苗成长为长势良好的铁皮石斛大苗；
⑸铁皮石斛大苗的生根
将大苗放置在预先消毒过的大培养皿上，并把大苗插入到生根培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在22-25℃，32-60天，大苗成长为完整的铁皮石斛组培苗。
本发明的有益效果：
本发明通过对播种培养基组分调节，使得通过该培养基播种的铁皮石斛种子无需经过黑暗培养时间，直接进行光照处理，14-25天左右萌发的种子形成原球茎，萌发率达到96-98％；进一步，对增殖培养基、壮苗培养基、分化培养基以及生根培养基的组分调整，使得生长出来的铁皮石斛组培苗健壮，移栽成活率高达98％。生根培养基优选采用香蕉，使用香蕉的生根培养基成苗时间为32-45天，而使用土豆的生根培养基成苗时间为46-60天。
附图说明
图1为铁皮石斛原球茎照片；
图2为铁皮石斛类原球茎照片；
图3为铁皮石斛小苗照片；
图4为铁皮石斛组培苗照片。
具体实施方式
实施例1
配制A液体：称取硝酸铵16.5g、硝酸钾19.0g、硫酸镁3.7g、磷酸二氢钾1.7g，然后加入1L水中混匀溶解，即可。
配制B液体：称取氯化钙4.4g，然后放入1L水中混匀溶解，即可。
配制C液体：称取甘氨酸0.4g、0.02g维生素B1、烟酸0.1g与0.1g盐酸比哆辛VB6加入800ml水中混匀溶解得到混合液I，再称取20g肌醇用200ml水混匀溶解得到混合液II，将混合液I与混合液II混合即可。
配制D液体：称取5.56g硫酸亚铁与7.46g乙二胺四乙酸二钠，用水分别溶解后，再混匀配制成1L溶液。
配制L液体：称取16.9g/L硫酸锰、8.6g/L硫酸锌、6.2g/L硼酸、0.83g/L碘化钾、0.025g/L硫酸铜与0.025g/L氯化钴用水溶解，再称取0.25g钼酸钠用水溶解，再将两种溶液混合均匀加水配制成1L溶液。
配制M1液体：称取0.5g/La―奈乙酸与0.4g/L氢氧化钠，用1L水配制成溶液，放入冰箱保存；
配制M2液体：称取0.5g/L 6-苄基腺嘌呤与0.4g/L氢氧化钠，用1L水配制成溶液，避光保存。
配制播种培养基：称取1000毫升A液体、1000毫升B液体、100毫升C液体、100毫升D液体、20毫升L液体与8毫升M1液体混匀，然后加入400g蔗糖、76g琼脂、36g碳粉与2000g经粉碎的土豆，再加10升水高温加热，随后在80℃下混合，装瓶，进行高压灭菌锅灭菌，冷却即可。
配制增殖培养基：称取1000毫升A液体、1000毫升B液体、100毫升C液体、100毫升D液体、20毫升L液体、8毫升M1液体与5毫升M2液体混匀，然后加入400g蔗糖、76g琼脂、36g碳粉与2000g经粉碎的土豆，再加10升水高温加热，随后在80℃下混合，装瓶，进行高压灭菌锅灭菌，冷却即可。
配制壮苗培养基：称取1000毫升A液体、1000毫升B液体、100毫升C液体、100毫升D液体、20毫升L液体、15毫升M1液体与10毫升M2液体混匀、然后加入400g蔗糖、76g琼脂、40g碳粉与2000g经粉碎的土豆，再加10升水高温加热，随后在80℃下混合，装瓶，进行高压灭菌锅灭菌，冷却即可。
配制分化苗培养基：称取1000毫升A液体、1000毫升B液体、100毫升C液体、100毫升D液体、20毫升L液体、15毫升M1液体与15毫升M2液体混匀，然后加入400g蔗糖、76g琼脂、40g碳粉与2000g经粉碎的土豆，再加10升水高温加热，随后在80℃下混合，装瓶，进行高压灭菌锅灭菌，冷却即可。
配制生根培养基：称取1000毫升A液体、1000毫升B液体、100毫升C液体、100毫升D液体、20毫升L液体、20毫升M1液体与10毫升M2液体混匀，然后加入500g蔗糖、76g琼脂、40g碳粉与2500g经粉碎的香蕉，再加10升水高温加热，随后在80℃下混合，装瓶，进行高压灭菌锅灭菌，冷却即可。
铁皮石斛快速繁殖成苗的组培方法，其步骤如下：
⑴铁皮石斛种子的无菌萌发
采集铁皮石斛蒴果种子，依次用酒精与次氯酸钠溶液进行消毒灭菌，将灭菌后的种子的一端将其切开，将粉末状胚均匀的播撒到播种培养基上，在有光照的组培室培养14天，萌发的种子就形成原球茎(参见图1)，保持组培室温度在22-25℃；根据瓶数计算，萌发率达到98％。
⑵铁皮石斛原球茎的增殖
将种子萌发形成的原球茎均匀转入到增殖培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在22-25℃，原球茎长出淡黄色愈伤组织，22天，愈伤组织不断分离增殖成类原球茎(参见图2)；
⑶铁皮石斛类原球茎的分化
将类原球茎挑出并均匀转入到分化培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在22-25℃，26天，类原球茎分化成小苗(参见图3)；
⑷铁皮石斛小苗的壮苗
将小苗放置在预先消毒过的大培养皿上，并把小苗插入到壮苗培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在22-25℃，32天，小苗成长为长势良好的铁皮石斛大苗；
⑸铁皮石斛大苗的生根
将大苗放置在预先消毒过的大培养皿上，并把大苗插入到生根培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在22-25℃，32天，大苗成长为完整的铁皮石斛组培苗(参见图4)。
将铁皮石斛组培苗在自然光下炼苗一周后取出瓶苗并洗净根部培养基，移栽至泥炭土和苔藓体积比为1:1的混合基质中，成活率在98％以上。
实施例2
A液体、B液体、C液体、D液体、L液体、M1液体与M2液体的含量与配制方法与实施例1相同。
配制播种培养基：称取1000毫升A液体、1000毫升B液体、100毫升C液体、100毫升D液体、20毫升L液体与8毫升M1液体混匀，然后加入380g蔗糖、74g琼脂、34g碳粉与1900g经粉碎的香蕉，再加10升水高温加热，随后在80℃下混合，装瓶，进行高压灭菌锅灭菌，冷却即可。
配制增殖培养基：称取1000毫升A液体、1000毫升B液体、100毫升C液体、100毫升D液体、20毫升L液体、8毫升M1液体与5毫升M2液体混匀，然后加入380g蔗糖、74g琼脂、34g碳粉与1900g经粉碎的香蕉，再加10升水高温加热，随后在80℃下混合，装瓶，进行高压灭菌锅灭菌，冷却即可。
配制壮苗培养基：称取1000毫升A液体、1000毫升B液体、100毫升C液体、100毫升D液体、20毫升L液体、15毫升M1液体与10毫升M2液体混匀、然后加入380g蔗糖、74g琼脂、38g碳粉与1900g经粉碎的香蕉，再加10升水高温加热，随后在80℃下混合，装瓶，进行高压灭菌锅灭菌，冷却即可。
配制分化苗培养基：称取1000毫升A液体、1000毫升B液体、100毫升C液体、100毫升D液体、20毫升L液体、15毫升M1液体与15毫升M2液体混匀，然后加入380g蔗糖、74g琼脂、38g碳粉与1900g经粉碎的香蕉，再加10升水高温加热，随后在80℃下混合，装瓶，进行高压灭菌锅灭菌，冷却即可。
配制生根培养基：称取1000毫升A液体、1000毫升B液体、100毫升C液体、100毫升D液体、20毫升L液体、20毫升M1液体与10毫升M2液体混匀，然后加入480g蔗糖、74g琼脂、38g碳粉与2400g经粉碎的香蕉，再加10升水高温加热，随后在80℃下混合，装瓶，进行高压灭菌锅灭菌，冷却即可。
铁皮石斛快速繁殖成苗的组培方法，其步骤如下：
⑴铁皮石斛种子的无菌萌发
采集铁皮石斛蒴果种子，依次用酒精与次氯酸钠溶液进行消毒灭菌，将灭菌后的种子的一端将其切开，将粉末状胚均匀的播撒到播种培养基上，在有光照的组培室培养25天，萌发的种子就形成原球茎，保持组培室温度在22-25℃；根据瓶数计算，萌发率达到96％。
⑵铁皮石斛原球茎的增殖
将种子萌发形成的原球茎均匀转入到增殖培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在22-25℃，原球茎长出淡黄色愈伤组织，27天，愈伤组织不断分离增殖成类原球茎；
⑶铁皮石斛类原球茎的分化
将类原球茎挑出并均匀转入到分化培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在22-25℃，30天，类原球茎分化成小苗；
⑷铁皮石斛小苗的壮苗
将小苗放置在预先消毒过的大培养皿上，并把小苗插入到壮苗培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在22-25℃，45天，小苗成长为长势良好的铁皮石斛大苗；
⑸铁皮石斛大苗的生根
将大苗放置在预先消毒过的大培养皿上，并把大苗插入到生根培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在22-25℃，45天，大苗成长为完整的铁皮石斛组培苗。
将铁皮石斛组培苗在自然光下炼苗一周后取出瓶苗并洗净根部培养基，移栽至泥炭土和苔藓体积比为1:1的混合基质中，成活率在98％以上。
实施例3
A液体、B液体、C液体、D液体、L液体、M1液体与M2液体的含量与配制方法与实施例1相同。
配制播种培养基：称取1000毫升A液体、1000毫升B液体、100毫升C液体、100毫升D液体、20毫升L液体与8毫升M1液体混匀，然后加入420g蔗糖、78g琼脂、38g碳粉与2100g经粉碎的苹果，再加10升水高温加热，随后在80℃下混合，装瓶，进行高压灭菌锅灭菌，冷却即可。
配制增殖培养基：称取1000毫升A液体、1000毫升B液体、100毫升C液体、100毫升D液体、20毫升L液体、8毫升M1液体与5毫升M2液体混匀，然后加入420g蔗糖、78g琼脂、38g碳粉与2100g经粉碎的苹果，再加10升水高温加热，随后在80℃下混合，装瓶，进行高压灭菌锅灭菌，冷却即可。
配制壮苗培养基：称取1000毫升A液体、1000毫升B液体、100毫升C液体、100毫升D液体、20毫升L液体、15毫升M1液体与10毫升M2液体混匀、然后加入420g蔗糖、78g琼脂、42g碳粉与2100g经粉碎的苹果，再加10升水高温加热，随后在80℃下混合，装瓶，进行高压灭菌锅灭菌，冷却即可。
配制分化苗培养基：称取1000毫升A液体、1000毫升B液体、100毫升C液体、100毫升D液体、20毫升L液体、15毫升M1液体与15毫升M2液体混匀，然后加入420g蔗糖、78g琼脂、42g碳粉与2100g经粉碎的苹果，再加10升水高温加热，随后在80℃下混合，装瓶，进行高压灭菌锅灭菌，冷却即可。
配制生根培养基：称取1000毫升A液体、1000毫升B液体、100毫升C液体、100毫升D液体、20毫升L液体、20毫升M1液体与10毫升M2液体混匀，然后加入520g蔗糖、78g琼脂、42g碳粉与2600g经粉碎的土豆，再加10升水高温加热，随后在80℃下混合，装瓶，进行高压灭菌锅灭菌，冷却即可。
铁皮石斛快速繁殖成苗的组培方法，其步骤如下：
⑴铁皮石斛种子的无菌萌发
采集铁皮石斛蒴果种子，依次用酒精与次氯酸钠溶液进行消毒灭菌，将灭菌后的种子的一端将其切开，将粉末状胚均匀的播撒到播种培养基上，在有光照的组培室培养20天，萌发的种子就形成原球茎，保持组培室温度在22-25℃；根据瓶数计算，萌发率达到97％。
⑵铁皮石斛原球茎的增殖
将种子萌发形成的原球茎均匀转入到增殖培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在22-25℃，原球茎长出淡黄色愈伤组织，25天，愈伤组织不断分离增殖成类原球茎；
⑶铁皮石斛类原球茎的分化
将类原球茎挑出并均匀转入到分化培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在22-25℃，28天，类原球茎分化成小苗；
⑷铁皮石斛小苗的壮苗
将小苗放置在预先消毒过的大培养皿上，并把小苗插入到壮苗培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在22-25℃，40天，小苗成长为长势良好的铁皮石斛大苗；
⑸铁皮石斛大苗的生根
将大苗放置在预先消毒过的大培养皿上，并把大苗插入到生根培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在22-25℃，60天，大苗成长为完整的铁皮石斛组培苗。
将铁皮石斛组培苗在自然光下炼苗一周后取出瓶苗并洗净根部培养基，移栽至泥炭土和苔藓体积比为1:1的混合基质中，成活率在98％以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种铁皮石斛快速繁殖成苗的培养基系列，其特征在于，该培养基系列包括播种培养基、增殖培养基、壮苗培养基、分化苗培养基以及生根培养基，所述培养基各组成成分含量分别为：
播种培养基：1000毫升A液体、1000毫升B液体、100毫升C液体、100毫升D液体、20毫升L液体、8毫升M1液体、380-420g蔗糖、74-78g琼脂、34-38g碳粉、1900-2100g土豆、苹果或者香蕉与10升水；
增殖培养基：1000毫升A液体、1000毫升B液体、100毫升C液体、100毫升D液体、20毫升L液体、8毫升M1液体、5毫升M2液体、380-420g蔗糖、74-78g琼脂、34-38g碳粉、1900-2100g土豆、苹果或者香蕉与10升水；
壮苗培养基：1000毫升A液体、1000毫升B液体、100毫升C液体、100毫升D液体、20毫升L液体、15毫升M1液体、10毫升M2液体、380-420g蔗糖、74-78g琼脂、38-42g碳粉、1900-2100g土豆、苹果或者香蕉与10升水；
分化苗培养基：1000毫升A液体、1000毫升B液体、100毫升C液体、100毫升D液体、20毫升L液体、15毫升M1液体、15毫升M2液体、380-420g蔗糖、74-78g琼脂、38-42g碳粉、1900-2100g土豆、苹果或者香蕉与10升水；
生根培养基：1000毫升A液体、1000毫升B液体、100毫升C液体、100毫升D液体、20毫升L液体、20毫升M1液体、10毫升M2液体、480-520g蔗糖、74-78g琼脂、38-42g碳粉、2400-2600g土豆或者香蕉与10升水；
其中，所述A液体、B液体、C液体、D液体、L液体、M1液体与M2液体中元素组成分别为：
A液体：16.5g/L硝酸铵、19.0g/L硝酸钾、3.7g/L硫酸镁与1.7g/L磷酸二氢钾；
B液体：4.4g/L氯化钙；
C液体：0.4g/L甘氨酸、0.02g/L维生素B1、0.1g/L烟酸、0.1g/L盐酸比哆辛VB6与20g/L肌醇；
D液体：5.56g/L硫酸亚铁与7.46g/L乙二胺四乙酸二钠；
L液体：16.9g/L硫酸锰、8.6g/L硫酸锌、6.2g/L硼酸、0.83g/L碘化钾、0.025g/L硫酸铜、0.025g/L氯化钴与0.25g/L钼酸钠；
M1液体：0.5g/Lα-萘乙酸与0.4g/L氢氧化钠；
M2液体：0.5g/L 6-苄基腺嘌呤与0.4g/L氢氧化钠。
2.根据权利要求1铁皮石斛快速繁殖成苗的培养基系列，其特征在于，所述播种培养基的pH值为5.4-5.8，用酸碱调节剂调节所述播种培养基的pH值；所述增殖培养基的pH值为5.4-5.8，用酸碱调节剂调节所述增殖培养基的pH值；所述壮苗培养基的pH值为5.4-5.8，用酸碱调节剂调节所述壮苗培养基的pH值；所述分化苗培养基的pH值为5.4-5.8，用酸碱调节剂调节所述分化苗培养基的pH值；所述生根苗培养基的pH值为5.4-5.8，用酸碱调节剂调节所述生根苗培养基的pH值。
3.一种使用权利要求1所述培养基系列由铁皮石斛快速繁殖成苗的组培方法，其特征包括以下的步骤：
⑴铁皮石斛种子的无菌萌发
采集铁皮石斛蒴果种子，依次用酒精与次氯酸钠溶液进行消毒灭菌，将灭菌后的种子的一端切开，将粉末状胚均匀的播撒到播种培养基上，在有光照的组培室培养14-25天，萌发的种子形成原球茎，保持组培室温度在22-25℃；
⑵铁皮石斛原球茎的增殖
将种子萌发形成的原球茎均匀转入到增殖培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在22-25℃，原球茎长出淡黄色愈伤组织，22-27天，愈伤组织不断分离增殖成类原球茎；
⑶铁皮石斛类原球茎的分化
将类原球茎挑出并均匀转入到分化培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在22-25℃，26-30天，类原球茎分化成小苗；
⑷铁皮石斛小苗的壮苗
将小苗放置在预先消毒过的大培养皿上，并把小苗插入到壮苗培养基中， 置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在22-25℃，32-45天，小苗成长为长势良好的铁皮石斛大苗；
⑸铁皮石斛大苗的生根
将大苗放置在预先消毒过的大培养皿上，并把大苗插入到生根培养基中，置于组培室进行光照培养，保持组培室温度在22-25℃，32-60天，大苗成长为完整的铁皮石斛组培苗。
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