CN103155858B - 一种百脉根的快速繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种百脉根的快速繁殖方法。本发明提供了一种百脉根的快速繁殖方法，包括以下步骤：1)消毒百脉根种子；2)将消毒并冲洗后的百脉根种子在无菌状态下置于培养皿中，在光照、潮湿环境中培养3～5天发芽；3)将步骤2)所得发芽种子转入不加激素的MS基本培养基中，室温25～27℃，光强2000lux，每天12h光照时数，培养20～25天；4)待芽长至10～12cm长度时取出，无菌条件下切断，每茎段长约1.5～2cm，带1片成熟叶片；5)将茎段转入一次性生长培养基内；6)茎段扦插好后，置于25～27℃室温，2000～3000lux、每天12h光照时数培养20～25天。本发明培养周期短，易于操作管理和应用推广，可显著降低生产成本，移栽成活率显著提高，彻底杜绝玻璃苗现象。

Description

一种百脉根的快速繁殖方法

技术领域

本发明涉及植物无性繁殖技术领域，具体地，涉及一种百脉根的快速繁殖方法。

背景技术

百脉根Lotus cornioulatus L.)别名鸟足豆，瘠地首蓿，为豆科百脉根属多年生草本植物，是一种优良的多年生牧草，也是常见的庭院观赏植物，亦是优良的蜜源植物和水土保持植物，原产于欧亚湿润温暖地区。我国的华南、西南、西北、华北等地均有分布，是我国温带亚热带地区极具发展潜力的优良牧草。过去一直沿用种子繁殖，但苗期生长缓慢，种子硬实率高。发芽率受诸多因素制约偏低，一定程度上影响了百脉根规模化种植。上世纪九十年代起，国内多家科研单位、大专院校采用组织培养方法进行百脉根的无性繁殖的研究，其繁殖程序是经愈伤组织-丛生芽-生根苗的三阶段培养体系，而通过生长茎段扦插一次性生根成苗(即不经过愈伤组织、丛生芽阶段，直接生根成苗)的培养方法目前未见报道。

现有的培养方法是，通过愈伤组织→丛生芽或不定芽→生根培养的三步培养法。该法不仅培养周期长，生长速度慢，费时费工费材料，并且难以规模化、工厂化生产。长期以来，国内多家科研单位和大专院校都在摸索百脉根一次性生根成苗及规模化生产的培养基配方和培养方法，虽取得一些进展，但未形成一套行之有效的技术和方法。一次生根成苗培养技术具有培养周期短、设施简易、成本较低、易于推广等特点，但是通过扦插一次性生根成苗技术繁殖百脉根时，在无菌条件培养下，百脉根茎段基部切口极易形成不规则愈伤组织和细胞团，极大地影响根系的正常发育和生长，成为本技术需要解决的一大难题。

通过扦插一次性生根成苗技术在其他植物，特别是无性繁殖植物中也有应用，由于不同植物生根生长所需的养分、激素和其他生长物质及生长(培养)条件存在较大差异，故针对百脉根生长设计的培养基配方具有较强的针对性和专一性。此前，我们选择了几种不同植物(甘薯、马铃薯、蝴蝶兰、蕙兰、菊花等)的嫩茎、不定芽等切段和单芽接种于百脉根生根培养基，并用上述植物原有生根配方作对照，30d后观察比较，生长结果显示，各试验植物明显不适应百脉根配方，多数切段和苗茎部膨大，不长根或长势很弱的不定根，地上部分生长缓慢，有的呈停滞状态。各对照植株生长正常，根茎叶比例均衡，营养体发育良好。实验结果说明，百脉根生根配方的培养方法适用于特定植物，具有较强的专一性和排它性。

发明内容

本发明的发明人经多年工作经验和配方试验，摸索总结出适宜百脉根茎段生长，包括茎叶和根系的生长发育，并在生长期间达到苗质复壮效果的培养基配方。

因此，本发明的目的是提供一种百脉根的快速繁殖方法。

根据本发明的百脉根的快速繁殖方法，包括以下步骤：

1)消毒百脉根成熟种子；

2)将消毒并冲洗后的百脉根种子在无菌状态下置于培养皿中，在光照、潮湿环境下培养3～5天发芽，在暗环境，饱和湿度环境下培养3～5天萌发，该环境条件下种子萌发时间比正常光照湿度条件提前2～3天；

3)将步骤2)所得发芽种子转入不加激素的MS基本培养基中，室温25～27℃，光强2000lux，每天12h光照时数(种子生长期常规光照条件)，室内相对湿度75％～90％，培养20～25天；适宜的室温、光照强度、光照时数、相对湿度等，光、温、适度等因素所构成的最佳培养条件使种子苗正常、健康生长的必要保证。适当的培养天数为植株处于生长旺盛期，此时各种生理活动十分活跃，有利于扦插成活率；

4)待芽长至10～12cm长度时取出，无菌条件下切段，每茎段长约1.5～2cm，至少带1片成熟叶片；

5)将茎段转入一次性生长培养基内；

6)茎段扦插好后，置于25～27℃室温，2000～3000lux、每天12h光照时数相对湿度75％～90％，培养20～25天。给茎芽生长提供适宜的温度、光强、光照时数、相对湿度等环境条件是植株生长发育的必要保证，适当的生长天数是因为此时植株正处于生长旺盛期，各种生理活动活跃，有利于扦插成活率；

根据本发明的百脉根的快速繁殖方法，其中，用0.1％升汞消毒百脉根种子20min后无菌水冲洗3次，每次2分钟。

根据本发明的百脉根的快速繁殖方法，其中，所述的一次性生长培养基由MS基本培养基、IBA(乙哚丁酸)、NAA(萘乙酸)、蔗糖和琼脂组成，其中，IBA/NAA的配比比值为2～5。植物组培过程中，培养材料(外植体)的生长取向，如根系生长，地上部分生长、愈伤组织等取决于生长激素种类和配比，如细胞分裂素与植物生长素的浓度之比决定何种培养物的生长，如比例＞1时有利于芽分化，比例＜1时有利于根生长，等于1时产生愈伤组织，而IBA/NAA两者均为植物生长素(IBA-吲哚丁酸，NAA-萘乙酸)，但两者使用浓度和浓度之比决定了百脉根植株和根系生长势的强弱。经过多年激素浓度比较试验，最终确定IBA0.1mg·L^-1(0.1ppm)，NAA0.05mg·L^-1(0.05ppm)的浓度值和二者浓度之比在2～5的范围内植株处于最佳长势，生根效果最显著。

根据本发明的百脉根的快速繁殖方法，其中，所述的一次性生长培养基配方为MS基本培养基全营养成分(见附表1)、IBA 0.1mg·L^-1、NAA 0.05mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1和琼脂8g·L^-1(注明：上述药品和材料浓度和用量(重量)均为1升(L)培养基内用量，ppm-浓度单位，百万分率浓度；g-克，重量单位，mg-毫克，重量单位，L-升，容量单位，mg·L^-1表示1升溶液中所含的毫克量)。

例如，根据本发明的具体实施方式，配制1000克一次性生长培养基，其中每升培养基包含MS基本培养基全营养成分、IBA0.1毫克、NAA0.05毫克、蔗糖30克和琼脂8克。

本发明与现有的百脉根组织培养方法相比较，具有以下优点：

1、培养周期短，继代1次仅为20～25天，现有方法从愈伤组织到生根需三个月，新法生长速率是常规方法的3～5倍。

2、省去愈伤组织和丛生芽分化培养两个阶段，植株和根系生长更为粗壮。

3、分生能力强，继代增殖率可达到3～5倍。

4、采用一种培养基配方和培养条件，设施和技术要求大大降低，易于操作管理和应用推广。

5、生产成本显著降低，整个生产过程所消耗的人工、水电及其耗材约为过去的1/3。

6、移栽成活率显著提高，由于一次性生根成苗，苗质根系均长势良好，弱苗、病苗少，移栽成活率比种子苗和常规方法生产的瓶苗提高10％～15％左右。

7、彻底杜绝玻璃苗现象，种苗合格率大大提高。

8、有效利用增殖材料。

具体实施方式

实施例1

将0.5～1克(千粒重1～1.2克)百脉根成熟饱满种子，用0.1％升汞液消毒20min，无菌水冲洗；将冲洗后的百脉根种子在无菌状态下置于含湿润滤纸的培养皿中，光照培养5天发芽；将所得发芽种子转入不加激素的MS基本培养基中，室温25～27℃，光强2000lux，每天12h光照时数，培养25天；待芽长至10～12cm长度时取出，无菌条件下切段，每茎段长约1.5cm，带1片成熟叶片；将茎段转入含一次性生长培养基的瓶内，每瓶扦插20个茎段；茎段扦插好后将瓶置于25～27℃室温，2000lux、每天12h光照时数的培养室内培养，25天后或出瓶移栽或继代培养。

其中，一次性生长培养基配方为MS基本培养基全营养成分(mg·L^-1)、IBA 0.1mg·L^-1、NAA 0.05mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1和琼脂8g·L^-1。

实施例2

将0.5～1克(干粒重1～1.2克)百脉根成熟饱满种子，用0.1％升汞消毒20min，无菌水冲洗；将冲洗后的百脉根种子在无菌状态下置于含湿润滤纸的培养皿中，光照培养3～5天发芽；将所得发芽种子转入不加激素的MS基本培养基中，室温25～27℃，光强2000lux，每天12h光照时数，培养20～25天；待芽长至10～12cm长度时取出，无菌条件下切段，每茎段长约2cm，带1片成熟叶片；将茎段转入含一次性生长培养基的瓶内，每瓶扦插20个茎段；茎段扦插好后将瓶置于25～27℃室温，3000lux、每天12h光照时数的培养室内培养，20天后或出瓶移栽或继代培养。

其中，一次性生长培养基配方为：1、全MS+IBA 0.1mg·L^-1+NAA 0.05mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂8g·L^-1，PH 5.5～5.8(IBA/NAA＝2)；2、全MS+IBA 0.1mg·L^-1+NAA0.02mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂8g·L^-1，PH 5.5～5.8(IBA/NAA＝5)。说明：IBA/NAA比值在2～5内的配方其生根生长效果均呈显著值，以比值2的配方效果最佳。

实施例3

近年用该技术繁殖了多批百脉根植株，通过大田种植，与常规种子苗(对照)进行多次品种移植比较试验，试验方法为随机区组法，三次重复，每区种植100株，秋季种植，生长期三个月，结果为无性繁殖系移植成活率较对照提高10％～15％左右，并且植株长势强，生长快。从2007年开始至2010年的4年时间里，每年11月份对秋季栽植，田间生长60天得百脉根植株进行茎叶鲜重测定，每次测定100株处理植株，100株同期播种的种子苗植株作为对照，称测百株茎叶鲜重取平均值(平均单株鲜重＝100株茎叶总鲜重(克)/100)，连续测定4年，结果显示，无性繁殖系处理植株的茎叶鲜重比对照种子苗增产10％～20％。详见附表2。

实施例4

玻璃苗试验：一次性配方(处理)与常规生根配方(对照)比较。从2007年起，相同培养条件和无性繁殖系材料，每年用一次性配方(MS+IBA0.1mgL^-1+NAA0.05mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂8g·L^-1，PH 5.5～5.8)和2007年以前常用生根配方(MS+6-BA0.4mg·L^-1+NAA0.1mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂8g·L^-1，PH 5.5～5.8)各转30瓶，每瓶20条茎段，培养20天后检测，处理瓶内茎段的叶芽和根系生长正常，未发现玻璃化苗，对照植株长势较弱，根系发育迟缓，约7％～10％为玻璃化苗。几年的种植结果表明，正常苗移植成活率高，长势良好，抗逆性较强，无不良反应。对照玻璃化或半玻璃化苗移植成活率很低，生长不正常，即使当时成活，也会逐渐枯萎死亡。详见附表3。

附表1.MS培养基配方

说明：这里不包括发明人使用的植物生长调节剂和复合营养混合物，因为这些化合物的数量和组分随不同组织和器官的培养而变动。

附表2.百脉根处理与对照植株移植成活率、单株茎叶鲜重及长势比较

说明：处理为一次性配方培养无性系植株，对照为种子苗。

附表3.百脉根培养玻璃化苗统计表

说明：处理为一次性配方，对照为2007年以前的生根配方，培养材料为同代同种无性系茎段苗。

Claims (2)

1.一种百脉根的快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤： 

1）消毒百脉根种子； 

2）将消毒并冲洗后的百脉根种子在无菌状态下置于培养皿中，在光照、潮湿环境中培养3～5天发芽； 

3）将步骤2）所得发芽种子转入不加激素的MS基本培养基中，室温25～27℃，光强2000lux，每天12h光照时数，培养20～25天； 

4）待芽长至10～12cm长度时取出，无菌条件下切断，每茎段长1.5～2cm，至少带1片成熟叶片； 

5）将茎段转入一次性生长培养基内； 

6）茎段扦插好后，置于25～27℃室温，2000～3000lux、每天12h光照时数培养20～25天， 

其中，所述的一次性生长培养基配方为MS基本培养基的全营养成分、IBA0.1mg·L^-1、NAA0.05mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1和琼脂8g·L^-1， 

MS基本培养基的配方为： 

营养成分                含量mg/L 

大量营养元素 

微量营养元素 

有机添加物 

维生素 

其他有机添加物 

甘氨酸 2 

PH值   5.8。

2.根据权利要求1所述的百脉根的快速繁殖方法，其特征在于，在步骤1）中，用0.1%升汞消毒百脉根种子20min后无菌水冲洗，无菌水冲洗3次，每次2分钟，期间不停振荡瓶子，将升汞残液彻底洗净。