CN106718941B - 一种辣木再生体系的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种辣木再生体系的构建方法，包括外植体的处理和消毒、无菌苗的获取、愈伤组织的诱导、不定芽的诱导和增殖，生根苗的培养和移栽。本发明的外植体处理和消毒方法，污染率仅为6％；用本发明的培养基进行辣木组培快繁，无菌苗诱导率达95％以上，增殖系数达到4.0倍，生根率达92％以上。本发明通过辣木种子为外植体，提供了一种辣木再生体系的高效构建方法，为解决辣木种苗繁殖提供有效途径，满足了种苗繁育的规模化生产需求。

Description

一种辣木再生体系的构建方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，特别是涉及一种辣木再生体系的构建方法。
背景技术
辣木(Moringa oleifera)为辣木科辣木属植物，是一种有独特经济价值的热带植物，原产于印度北部。辣木是全球最热门的高营养多用途植物，在很多国家都作为重要药食和工业原料来利用，被誉为“植物中的钻石”。
辣木繁育的主要方式是播种育苗，但辣木种子目前还比较贵，采用种子繁殖难以在短时间获得大量苗木，通过组织培养建立植株再生体系，是有效解决辣木种苗繁殖的有效途径。
关于辣木组培再生体系的建立研究，王洪峰等人利用辣木实生苗茎段作为外植体进行了组织培养建立了植株再生体系，但存在实生苗茎段作为外植体不容易消毒，污染率高，不能快速获得无菌芽等问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种辣木再生体系的构建方法，为解决辣木种苗繁殖提供有效途径。本发明通过利用辣木种子作为外植体进行组织培养建立了植株再生体系，比用实生苗茎段作为外植体更容易消毒，污染率低，能快速获得无菌芽，然后通过用无菌芽的嫩茎诱导愈伤组织分化不定芽，最后生根成苗。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种辣木再生体系的构建方法，包括以下步骤：
1)外植体的消毒处理：选取颗粒饱满的良种辣木种子，剥去外种壳，将种仁在超净工作台上消毒，再用无菌水冲洗，沥干水后待用；
2)无菌培养物的建立：将步骤1)消毒好的种仁接种到初始诱导培养基上，放置在培养室用黑布遮盖进行暗培养，培养后种子开始萌动，长出白色根，然后掀开黑布继续培养即可长出无菌苗；
3)愈伤组织诱导：将步骤2)获得的无菌苗剪切成小段，接种到愈伤组织诱导培养基上，接种时使切口与培养基相接触，放在培养室内弱光条件下培养，当材料的切口处长出白色愈伤组织，随后慢慢变成淡黄色；
4)不定芽诱导与增殖：将步骤3)中长出的愈伤组织切下接种至不定芽诱导培养基上培养，待愈伤组织块上分化出不定芽；
5)生根诱导：剪取生长健壮的不定芽接种至生根诱导培养基上，放在培养室内弱光条件下培养，待小苗的基部切口处开始长根；
6)炼苗与移栽：待小苗的根系基本长齐，将生根苗移至炼苗棚进行生根苗的炼苗驯化，经过炼苗的生根苗进行移栽；
所述的培养基的组分及各组分的含量如下：
初始诱导培养基：MS0+蔗糖30g/L，琼脂粉4.2g/L，pH5.8(MS0即没有添加任何生长调节剂的MS基本培养基)；
愈伤组织诱导培养基：MS+2,4-D0.5-0.8mg/L+KT0.2-0.4mg/L+蔗糖30g/L，琼脂粉4.2g/L，pH5.8；
不定芽诱导及增殖培养基：改良MS+6-BA0.6-0.8mg/L+IAA0.2-0.3mg/L+蔗糖30g/L，琼脂粉4.2g/L，pH5.8；
生根培养基：1/2MS+IBA0.3-0.5mg/L+蔗糖20g/L，琼脂粉4.5g/L，pH5.8。
本发明步骤1)所述的良种辣木，优选辣木印度改良种PKM1、PKM2；所述的消毒，优选以0.1％HgCl2溶液消毒10-12分钟；所述的无菌水冲洗，优选无菌水冲洗5遍。
步骤2)所述的无菌培养物的建立，优选将步骤1)消毒好的种仁接种到初始诱导培养基上，放置在培养室用黑布遮盖进行暗培养7天，培养温度控制在25±2℃，暗培养7天后种子开始萌动，长出长约1cm的白色根，然后掀开黑布继续培养3-5天即可长出小苗，15-20天无菌苗可长至3-4cm。
步骤3)所述的愈伤组织诱导，优选将步骤2)中获得的无菌苗剪切成长约1cm的小段，接种到愈伤组织诱导培养基上，接种时使切口与培养基相接触，放在培养室内弱光条件下培养，培养温度25±2℃，光照强度1000-1500lx，每天光照12-14小时，培养20天左右在材料的切口处长出白色愈伤组织，随后慢慢变成淡黄色。
步骤4)所述的不定芽诱导与增殖，优选将步骤3)中长出的愈伤组织切下接种至不定芽诱导培养基上培养，培养温度为培养温度25±2℃，光照强度2000-3000lx，每天光照12-14小时，25天左右愈伤组织块上分化出不定芽，芽高可达3cm，30天后不定芽增殖4.0倍。
步骤5)所述的生根诱导，优选剪取生长健壮，长约3cm的不定芽接种至生根诱导培养基上，放在培养室内弱光条件下培养，培养温度25±2℃，光照强度1000-1500lx，每天光照12-14小时，15天后小苗的基部切口处开始长根。
步骤6)所述的炼苗与移栽，优选30天后，待小苗的根系基本长齐，将生根瓶苗移至炼苗棚进行生根苗的炼苗驯化，炼苗时间为7天，经过炼苗的生根苗进行移栽，移栽时将生根苗从培养瓶中取出，用清水洗去小苗根系的培养基，然后将小苗移栽至装有基质的育苗袋内，移栽基质选用黄心土30％+泥炭土70％，移栽在育苗棚内进行，移栽后要浇透水，用薄膜覆盖保温保湿，15天后逐步通风，20天后移除薄膜。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明采用成熟饱满的良种辣木种子培养获得无菌苗，再切取无菌苗的嫩茎诱导出愈伤组织，并诱导分化出不定芽，通过对不定芽进行增殖和生根，成功建立了辣木的植株再生体系，为解决辣木种苗繁殖提供了新的有效途径。
2、本发明采用去壳的辣木种子作为外植体，其消毒处理比用实生苗茎段作外植体更简单，污染率仅为6％，污染率更低；通过种子诱导获得无菌苗，诱导率较高，达95％以上。
3、本发明用种子培养获得的无菌苗嫩茎诱导愈伤组织分化不定芽，增殖倍数达4.0倍，和现有技术相比，能更快速地构建辣木的植株再生体系，为辣木愈伤组织的诱导拓宽了外植体的选择范围，且操作简便。
具体实施方式
下面以实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。
实施例1：
(一)培养基的配制：包括基本培养基和各培养阶段培养基的组成成分及其每升所含的重量，其中：
1、基本培养基：MS培养基；
2、初始诱导培养基：MS0+蔗糖30g/L，琼脂粉4.2g/L，pH5.8(MS0即没有添加任何生长调节剂的MS基本培养基)；
3、愈伤组织诱导培养基：MS+2,4-D0.5mg/L+KT0.2mg/L+蔗糖30g/L，琼脂粉4.2g/L，pH5.8；
4、不定芽诱导及增殖培养基：改良MS+6-BA0.8mg/L+IAA0.3mg/L+蔗糖30g/L，琼脂粉4.2g/L，pH5.8；
5、生根培养基：1/2MS+IBA0.3mg/L+蔗糖20g/L，琼脂粉4.5g/L，pH5.8；
(二)外植体的消毒处理：选取颗粒饱满的印度改良种PKM1、PKM2辣木种子，剥去外种壳，将种仁在超净工作台上以0.1％HgCl2溶液消毒10分钟，再用无菌水冲洗5次，沥干水后待用；
(三)无菌培养物的建立：将消毒好种仁接种到初始诱导培养基上，放置在培养室用黑布遮盖进行暗培养7天，培养温度控制在25±2℃，暗培养7天后种子开始萌动，长出长约1cm的白色根，然后掀开黑布继续培养3-5天即可长出小苗，15-20天无菌苗可长至3-4cm；
(四)愈伤组织诱导：将上一步中获得的无菌苗剪切成长约1cm的小段，接种到愈伤组织诱导培养基上，接种时使切口与培养基相接触，放在培养室内弱光条件下培养，培养温度25±2℃，光照强度1000-1500lx，每天光照12-14小时，培养20天左右在材料的切口处就可长出白色愈伤组织，随后慢慢变成淡黄色；
(五)不定芽诱导与增殖：将以上获得的愈伤组织切下接种至不定芽诱导培养基上培养，25天左右愈伤组织块上可分化出不定芽，30天后不定芽可增殖4.0倍以上，芽高可达3cm，培养温度为培养温度25±2℃，光照强度2000-3000lx，每天光照12-14小时；
(六)生根诱导：剪取生长健壮，长约3cm的不定芽接种至生根诱导培养基上，放在培养室内弱光条件下培养，培养温度25±2℃，光照强度1000-1500lx，每天光照12-14小时，15天后小苗的基部切口处开始长根；
(七)炼苗与移栽：30天后，待小苗的根系基本长齐，就可以将生根瓶苗移至炼苗棚进行生根苗的炼苗驯化，炼苗时间为7天；经过炼苗的生根苗就可以进行移栽，移栽时将生根苗从培养瓶中取出，用清水洗去小苗根系的培养基，然后将小苗移栽至装有基质的育苗袋内，移栽基质选用黄心土30％+泥炭土70％，移栽在育苗棚内进行，移栽后要浇透水，用薄膜覆盖保温保湿，15天后逐步通风，20天后移除薄膜。
实施例2：
(一)培养基的配制：包括基本培养基和各培养阶段培养基的组成成分及其每升所含的重量，其中：
1、基本培养基：MS培养基；
2、初始诱导培养基：MS0+蔗糖30g/L，琼脂粉4.2g/L，pH5.8；
3、愈伤组织诱导培养基：MS+2,4-D0.8mg/L+KT0.3mg/L+蔗糖30g/L，琼脂粉4.2g/L，pH5.8；
4、不定芽诱导及增殖培养基：改良MS+6-BA0.6mg/L+IAA0.2mg/L+蔗糖30g/L，琼脂粉4.2g/L，pH5.8；
5、生根培养基：1/2MS+IBA0.5mg/L+蔗糖20g/L，琼脂粉4.5g/L，pH5.8；
(二)外植体的消毒处理：选取颗粒饱满的印度改良种PKM1、PKM2辣木种子，剥去外种壳，将种仁在超净工作台上以0.1％HgCl2溶液消毒12分钟，再用无菌水冲洗5次，沥干水后待用；
(三)无菌培养物的建立：将消毒好种仁接种到初始诱导培养基上，放置在培养室用黑布遮盖进行暗培养7天，培养温度控制在25±2℃，暗培养7天后种子开始萌动，长出长约1cm的白色根，然后掀开黑布继续培养3-5天即可长出小苗，15-20天无菌苗可长至3-4cm；
(四)愈伤组织诱导：将上一步中获得的无菌苗剪切成长约1cm的小段，接种到愈伤组织诱导培养基上，接种时使切口与培养基相接触，放在培养室内弱光条件下培养，培养温度25±2℃，光照强度1000-1500lx，每天光照12-14小时，培养20天左右在材料的切口处就可长出白色愈伤组织，随后慢慢变成淡黄色；
(五)不定芽诱导与增殖：将以上获得的愈伤组织切下接种至不定芽诱导培养基上培养，25天左右愈伤组织块上可分化出不定芽，30天后不定芽可增殖4.0倍以上，芽高可达3cm，培养温度为培养温度25±2℃，光照强度2000-3000lx，每天光照12-14小时；
(六)生根诱导：剪取生长健壮，长约3cm的不定芽接种至生根诱导培养基上，放在培养室内弱光条件下培养，培养温度25±2℃，光照强度1000-1500lx，每天光照12-14小时，15天后小苗的基部切口处开始长根；
(七)炼苗与移栽：30天后，待小苗的根系基本长齐，就可以将生根瓶苗移至炼苗棚进行生根苗的炼苗驯化，炼苗时间为7天；经过炼苗的生根苗就可以进行移栽，移栽时将生根苗从培养瓶中取出，用清水洗去小苗根系的培养基，然后将小苗移栽至装有基质的育苗袋内，移栽基质选用黄心土30％+泥炭土70％，移栽在育苗棚内进行，移栽后要浇透水，用薄膜覆盖保温保湿，15天后逐步通风，20天后移除薄膜。
经实施例1-2能够成功地构建辣木再生体系，辣木无菌芽增殖倍数4.0倍以上，生根率92％以上。

Claims (7)

1.一种辣木再生体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)外植体的消毒处理：选取颗粒饱满的良种辣木种子，剥去外种壳，将种仁在超净工作台上以0.1％HgCl2溶液消毒10-12分钟，再用无菌水冲洗，沥干水后待用；
2)无菌培养物的建立：将步骤1)消毒好的种仁接种到初始诱导培养基上，放置在培养室用黑布遮盖进行暗培养，培养后种子开始萌动，长出白色根，然后掀开黑布继续培养即可长出无菌苗；
3)愈伤组织诱导：将步骤2)获得的无菌苗剪切成小段，接种到愈伤组织诱导培养基上，接种时使切口与培养基相接触，放在培养室内弱光条件下培养，材料的切口处长出白色愈伤组织，随后慢慢变成淡黄色；
4)不定芽诱导与增殖：将步骤3)中长出的愈伤组织切下接种至不定芽诱导培养基上培养，待愈伤组织块上分化出不定芽；
5)生根诱导：剪取生长健壮的不定芽接种至生根诱导培养基上，放在培养室内弱光条件下培养，待小苗的基部切口处开始长根；
6)炼苗与移栽：待小苗的根系基本长齐，将生根苗移至炼苗棚进行生根苗的炼苗驯化，经过炼苗的生根苗进行移栽；
所述的培养基的组分及各组分的含量如下：
初始诱导培养基：MS0+蔗糖30g/L，琼脂粉4.2g/L，pH5.8，MS0即没有添加任何生长调节剂的MS基本培养基；
愈伤组织诱导培养基：MS+2,4-D 0.5-0.8mg/L+KT 0.2-0.4mg/L+蔗糖30g/L，琼脂粉4.2g/L，pH5.8；
不定芽诱导培养基：改良MS+6-BA 0.6-0.8mg/L+IAA 0.2-0.3mg/L+蔗糖30g/L，琼脂粉4.2g/L，pH5.8；
生根诱导培养基：1/2MS+IBA 0.3-0.5mg/L+蔗糖20g/L，琼脂粉4.5g/L，pH5.8。
2.根据权利要求1所述的一种辣木再生体系的构建方法，其特征在于：步骤1)所述的良种辣木，为辣木印度改良种PKM1、PKM2，所述的无菌水冲洗，为无菌水冲洗5遍。
3.根据权利要求1所述的一种辣木再生体系的构建方法，其特征在于：步骤2)所述的无菌培养物的建立，是将步骤1)消毒好的种仁接种到初始诱导培养基上，放置在培养室用黑布遮盖进行暗培养7天，培养温度控制在25±2℃，暗培养7天后种子开始萌动，长出长1cm的白色根，然后掀开黑布继续培养3-5天即可长出小苗，15-20天无菌苗长至3-4cm。
4.根据权利要求1所述的一种辣木再生体系的构建方法，其特征在于：步骤3)所述的愈伤组织诱导，是将步骤2)中获得的无菌苗剪切成长1cm的小段，接种到愈伤组织诱导培养基上，接种时使切口与培养基相接触，放在培养室内弱光条件下培养，培养温度25±2℃，光照强度1000-1500lx，每天光照12-14小时，培养20天后在材料的切口处长出白色愈伤组织，随后慢慢变成淡黄色。
5.根据权利要求1所述的一种辣木再生体系的构建方法，其特征在于：步骤4)所述的不定芽诱导与增殖，是将步骤3)中长出的愈伤组织切下接种至不定芽诱导培养基上培养，培养温度为25±2℃，光照强度2000-3000lx，每天光照12-14小时，25天后愈伤组织块上分化出不定芽，芽高达3cm，30天后不定芽增殖4.0倍。
6.根据权利要求1所述的一种辣木再生体系的构建方法，其特征在于：步骤5)所述的生根诱导，是剪取生长健壮，长3cm的不定芽接种至生根诱导培养基上，放在培养室内弱光条件下培养，培养温度25±2℃，光照强度1000-1500lx，每天光照12-14小时，15天后小苗的基部切口处开始长根。
7.根据权利要求1所述的一种辣木再生体系的构建方法，其特征在于：步骤6)所述的炼苗与移栽，是30天后，待小苗的根系基本长齐，将生根苗移至炼苗棚进行生根苗的炼苗驯化，炼苗时间为7天，经过炼苗的生根苗进行移栽，移栽时将生根苗从培养瓶中取出，用清水洗去小苗根系的培养基，然后将小苗移栽至装有基质的育苗袋内，移栽基质选用黄心土30％+泥炭土70％，移栽在育苗棚内进行，移栽后浇透水，用薄膜覆盖保温保湿，15天后逐步通风，20天后移除薄膜。
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