CN115136890A - 一种辣木植株高效再生方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种辣木植株高效再生方法，属于植物组织培养技术领域。所述方法，具体包括以下步骤：A、将种子进行灭菌处理后，接种于不含任何激素的MS培养基中培养，获得无菌苗；B、切取无菌苗中的子叶节或顶芽作为外植体；C、将外植体接种于添加KT+6‑BA的MS培养基中培养，诱导分化出不定芽，所述KT的浓度为0.05～0.1mg/L，所述6‑BA的浓度为0.6～1.4mg/L；D、从不定芽中剪取粗壮的单株芽，接种于添加KT+6‑BA的MS培养基中培养，进行增殖；E、选取增殖培养得到的健壮幼苗，接种于添加NAA的MS培养基中诱导生根；F、将根系健壮的幼苗进行驯化移栽。本发明方法通过优化培养基和培养条件，克服了辣木叶片再生难的问题，提供一种以辣木叶片为外植体的辣木高效再生方法。本发明利用辣木无菌苗子叶节、顶芽为外植体，通过组织培养技术建立稳定、可靠的植株高效再生技术体系，不仅能满足市场对种苗需求，而且可以通过转基因研究对辣木种质资源进行改良和创新，为辣木种质资源可持续利用奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，涉及一种辣木植株高效再生方法，具体涉及辣木无菌苗子叶节、顶芽的组织培养和植株高效再生的方法。
背景技术
辣木(Moringa oleifera Lam.)，是一种辣木科(Moringaceae)辣木属(MoringaAdans.)的多年生速生小乔木树种，原产自印度河和巴基斯坦延伸的喜马拉雅山脉，在我国的云南、海南、福建、两广等南部地区均有引种栽培。辣木耐旱，根系深厚，树干单一清晰，因其生长迅速、抗旱、营养价值和药用价值高等优点又被称为“神奇树”，年生物量产量可达每公顷43至115吨；叶粉富含的必需氨基酸与人体所需接近，是较为优质的蛋白质资源；富含钙、镁、磷、钾等微量元素，低钠高钙的辣木作为食材逐渐被开发；辣木籽油的营养非常丰富，可作为橄榄油的替代品之一；辣木含有多种天然植物化学物质导致了丰富的药理活性。
目前，人工栽培所需的幼苗大多通过种子播种经自然繁殖的方式获得，但种子产量不高，且活性下降也快，生长周期长且品种高度杂合；嫩梢扦插存在茎段难生根、增殖苗少且细弱、根系少易脱落、移栽成活率低等问题，这些原因对辣木的人工栽培产生较大影响。
植物组织培养技术在植物科学中获得了极大的认可，并为植物物种的体外微繁殖和改良作出了巨大贡献。到目前为止，已经发表了一些关于辣木的再生方案，包括茎节、上胚轴、叶子作为外植体，然而，这些研究面临着再生效率低或外植体选择具有局限性的问题。
发明内容
针对上述问题，本发明利用辣木无菌苗子叶节、顶芽为外植体，通过组织培养技术建立稳定、可靠的植株高效再生技术体系，不仅能满足市场对种苗需求，而且可以通过转基因研究对辣木种质资源进行改良和创新，为辣木种质资源可持续利用奠定基础。
本发明的目的是提供一种辣木植株高效再生方法，包括以下步骤：
A、将辣木种子进行灭菌处理后，接种于MS培养基中培养，获得无菌苗；
B、切取无菌苗中的子叶节或顶芽作为外植体；
C、将外植体接种于添加KT+6-BA的MS培养基中培养，诱导分化出不定芽，所述KT的浓度为0.05～0.1mg/L，所述6-BA的浓度为0.6～1.4mg/L；
D、从不定芽中剪取粗壮的单株芽，接种于添加KT+6-BA的MS培养基中培养，进行增殖；
E、选取增殖培养得到的健壮幼苗，接种于添加NAA的MS培养基中诱导生根；
F、将根系健壮的幼苗进行驯化移栽。
优选地，步骤C所述的将外植体接种于添加KT+6-BA的MS培养基中培养，是以顶芽为外植体，接种于添加KT 0.05～0.1mg/L+6-BA 0.6～1.2mg/L的MS培养基中培养；更优选地，是接种于添加KT 0.05mg/L+6-BA 1.2mg/L的MS培养基中培养。
优选地，步骤C所述的将外植体接种于添加KT+6-BA的MS培养基中培养，是以子叶节为外植体，接种于添加KT 0.05～0.1mg/L+6-BA0.6～1.0mg/L的MS培养基中培养；更优选地，接种于添加KT 0.05mg/L+6-BA 1.0mg/L的MS培养基中培养。
优选地，步骤A中所述的灭菌处理，是用体积分数75％无水乙醇对种子灭菌50s后，用无菌水振荡洗涤，再用质量分数1％HgCl溶液灭菌15min～18min，用无菌水振荡洗涤。
优选地，步骤D中所述添加KT+6-BA的MS培养基是添加KT 0.05mg/L+6-BA 1.2mg/L的MS培养基。
优选地，步骤E中所述添加NAA的MS培养基是添加NAA0.02 mg/L的MS培养基。
优选地，步骤B中所述的子叶节为不含下胚轴的子叶节。
本发明分别取辣木的子叶节和顶芽作为外植体进行组培，利用特定的不定芽诱导分化培养基和增殖培养基，能够获得大量不定芽，平均芽数分别可达4.40个和4.13个，远比仅添加6-BA或添加6-BA和NAA的培养基所获得的不定芽数要多。本发明的高效组织培养和植株再生方法，可摆脱外界条件的影响，规模化和工厂化生产出健壮、整齐一致的辣木组培幼苗；该方法不仅能满足市场对种苗的需求，并且可以通过转基因研究对辣木种质资源进行遗传改良和创新，为辣木种质资源的可持续利用奠定基础。
附图说明
图1为辣木种子培养14d得到的无菌苗，用于切取子叶节和顶芽外植体。
图2为在含KT 0.05mg/L+6-BA 1.0mg/L分化培养基上培养30d的子叶节外植体。
图3为在含KT 0.05mg/L+6-BA 1.2mg/L分化培养基上培养30d的顶芽外植体。
图4为健壮的有效芽在生根培养基中，根的诱导状况。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
以下实施例所述的MS培养基成分为：4.43g/LMS(Murashige et al.,1962)+6g/L琼脂+30g/L蔗糖，配制方法是将上述成份混合均匀，然后灭菌备用。
实施例1辣木子叶节的不定芽诱导
辣木无菌苗的获得：辣木种子采用改良品种PKM1，将成熟饱满的种子剥离种皮后用流水冲洗表面，然后浸入清水中，直至种子完全吸水饱和。将饱胀的种子置于超净工作台，体积分数75％乙醇中灭菌50s，无菌水振荡冲洗一次。质量分数0.1％氯化汞溶液中灭菌18min，无菌水振荡冲洗五次。接种于不含任何激素的MS培养基上，培养基pH值为6.0，培养温度25±2℃，光照强度2500lux，光照时间12h/d。培养14d后得到无菌苗(图1)。
切取无菌苗中不带下胚轴的子叶节作为外植体，设置不同激素配比的不定芽诱导培养基，将子叶节朝上置于培养基表面进行培养，培养条件：温度25±2℃，光照强度2500lux，光照时间12h/d，每组处理设置十个样本，重复三次。结果如表1所示，放在添加KT0.05～0.1mg/L+6-BA0.6～1.2mg/L的MS培养基中，培养30d后，获得大量不定芽(图2)，其中，KT0.05mg/L+6-BA 1.0mg/L的MS培养基外植体的芽诱导率达66.7％，平均芽数可达4.40个。
表1 KT和6-BA对辣木子叶节不定芽诱导的影响
注：同一指标同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
实施例2辣木顶芽的不定芽诱导
辣木无菌苗的获得方法同实施例1。切取无菌苗中顶芽作为外植体，设置不同激素配比的不定芽诱导培养基，将顶芽朝上置于培养基表面进行培养，培养条件：温度25±2℃，光照强度2500lux，光照时间12h/d，每组处理设置十个样本，重复三次。结果如表2所示，放在添加KT0.05～0.1mg/L+6-BA0.6～1.4mg/L的MS培养基中，培养30d后，获得大量不定芽(图3)，其中，KT0.05 mg/L+6-BA 1.2mg/L的MS培养基外植体的芽诱导率达100％，平均芽数可达4.40个。
表2 KT和6-BA对辣木顶芽不定芽诱导的影响
注：同一指标同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
实施例3辣木组织培养及植株再生
从实施例1和实施例2分化出不定芽的外植体中切取健壮的单芽，转接到MS+KT0.05mg/L+6-BA 1.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L的增殖培养基中培养，培养条件：温度25±2℃，光照强度2500lux，光照时间12h/d。
选取健壮的有效芽，转接到MS+NAA0.02 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L的生根诱导培养基中培养。生根情况如图4所示。
生根培养30d后，将带瓶的组培苗移到温室中适应外界环境1d，然后将组培瓶盖从半开到全开炼苗，喷雾保持瓶内湿度；3d后将组培苗小心取出，洗净粘于根上的培养基，移栽到蛭石和泥炭土混合比例为1:3的基质上，在移栽两周内，控制相对湿度75％～85％，温度20℃～30℃；10d后按生长需求浇水，该移栽成活率为75％。
对比例1仅含6-BA的MS培养基对辣木子叶节不定芽诱导的影响
辣木无菌苗的获得方法同实施例1。切取不带下胚轴的子叶节作为外植体，设置不同激素配比的不定芽诱导培养基，将子叶节朝上置于培养基表面进行培养，培养条件：温度25±2℃，光照强度2500lux，光照时间12h/d，每组处理设置十个样本，重复三次。结果如表3所示，放在添加6-BA0.6～1.2mg/L的MS培养基中，培养30d后，获得少量不定芽。实验表明只含6-BA的MS培养基子叶节外植体的最高平均芽数仅为2.71个。
表3 6-BA对辣木子叶节不定芽诱导的影响
注：同一指标同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
对比例2仅含6-BA的MS培养基对辣木顶芽不定芽诱导的影响
辣木无菌苗的获得方法同实施例1。切取顶芽作为外植体，设置不同激素配比的不定芽诱导培养基，将顶芽朝上置于培养基表面进行培养，培养条件：温度25±2℃，光照强度2500lux，光照时间12h/d，每组处理设置十个样本，重复三次。结果如表4所示，放在添加6-BA0.6～1.2mg/L的MS培养基中，培养30d后，获得少量不定芽。实验表明只含6-BA的MS培养基顶芽外植体的最高平均芽数仅为1.95个。
表4 6-BA对辣木顶芽不定芽诱导的影响
注：同一指标同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
对比例3含NAA和6-BA的MS培养基对辣木子叶节不定芽诱导的影响
辣木无菌苗的获得方法同实施例1。切取不带下胚轴的子叶节作为外植体，设置不同激素配比的不定芽诱导培养基，将子叶节朝上置于培养基表面进行培养，培养条件：温度25±2℃，光照强度2500lux，光照时间12h/d，每组处理设置十个样本，重复三次。结果如表5所示，放在添加NAA0.05～0.1mg/L+6-BA0.6～1.2mg/L的MS培养基中，培养30d后，获得少量不定芽。实验表明NAA+6-BA的MS培养基子叶节外植体最高平均芽数仅为2.33个。
表5 NAA和6-BA对辣木子叶节不定芽诱导的影响
注：同一指标同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
对比例4含NAA和6-BA的MS培养基对辣木顶芽不定芽诱导的影响
辣木无菌苗的获得方法同实施例1。切取顶芽作为外植体，设置不同激素配比的不定芽诱导培养基，将顶芽朝上置于培养基表面进行培养，培养条件：温度25±2℃，光照强度2500lux，光照时间12h/d，每组处理设置十个样本，重复三次。结果如表6所示，放在添加NAA0.05～0.1mg/L+6-BA0.6～1.2mg/L的MS培养基中，培养30d后，获得少量不定芽。实验表明NAA+6-BA的MS培养基顶芽外植体最高平均芽数仅为2.24个。
表6 NAA和6-BA对辣木顶芽不定芽诱导的影响
注：同一指标同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
以上结合附图对本发明的具体实施方式作了说明，但这些说明不能被理解为限制了本发明的范围，本发明的保护范围由随附的权利要求书限定，任何在本发明权利要求基础上的改动都是本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种辣木植株高效再生方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、将辣木种子进行灭菌处理后，接种于MS培养基中培养，获得无菌苗；
B、切取无菌苗中的子叶节或顶芽作为外植体；
C、将外植体接种于添加KT+6-BA的MS培养基中培养，诱导分化出不定芽，所述KT的浓度为0.05～0.1mg/L，所述6-BA的浓度为0.6～1.4mg/L；
D、从不定芽中剪取粗壮的单株芽，接种于添加KT+6-BA的MS培养基中培养，进行增殖；
E、选取增殖培养得到的健壮幼苗，接种于添加NAA的MS培养基中诱导生根；
F、将根系健壮的幼苗进行驯化移栽。
2.根据权利要求1所述的辣木植株高效再生方法，其特征在于，步骤C所述的将外植体接种于添加KT+6-BA的MS培养基中培养，是以顶芽为外植体，接种于添加KT 0.05～0.1mg/L+6-BA 0.6～1.2mg/L的MS培养基中培养。
3.根据权利要求1所述的辣木植株高效再生方法，其特征在于，步骤C所述的将外植体接种于添加KT+6-BA的MS培养基中培养，是以顶芽为外植体，接种于添加KT 0.05mg/L+6-BA1.2mg/L的MS培养基中培养。
4.根据权利要求1所述的辣木植株高效再生方法，其特征在于，步骤C所述的将外植体接种于添加KT+6-BA的MS培养基中培养，是以子叶节为外植体，接种于添加KT 0.05～0.1mg/L+6-BA 0.6～1.0mg/L的MS培养基中培养。
5.根据权利要求1所述的辣木植株高效再生方法，其特征在于，步骤C所述的将外植体接种于添加KT+6-BA的MS培养基中培养，是以子叶节为外植体，接种于添加KT 0.05mg/L+6-BA 1.0mg/L的MS培养基中培养。
6.根据权利要求1所述的辣木植株高效再生方法，其特征在于，步骤A中所述的灭菌处理，是用体积分数75％无水乙醇对种子灭菌50s后，用无菌水振荡洗涤，再用质量分数1％HgCl溶液灭菌15min～18min，用无菌水振荡洗涤。
7.根据权利要求1所述的辣木植株高效再生方法，其特征在于，步骤D中所述添加KT+6-BA的MS培养基是添加KT 0.05mg/L+6-BA 1.2mg/L的MS培养基。
8.根据权利要求1所述的辣木植株高效再生方法，其特征在于，步骤E中所述添加NAA的MS培养基是添加NAA 0.02mg/L的MS培养基。
9.根据权利要求1所述的辣木植株高效再生方法，其特征在于，步骤B中所述的子叶节为不含下胚轴的子叶节。
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| CN105961197A (zh) * | 2016-05-09 | 2016-09-28 | 华南农业大学 | 一种辣木高效再生方法 |
| CN108184667A (zh) * | 2017-12-31 | 2018-06-22 | 杭州师范大学 | 一种辣木离体快速繁殖的方法 |
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| Title |
|---|
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