CN100425126C - 一种薰衣草快速再生方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种薰衣草快速再生方法，本发明选择经薰衣草种子萌发后的下胚轴为外植体在固体再生培养基上可以直接分化不定芽，然后在固体生根培养基上生根，并最终形成完整植株。本发明薰衣草下胚轴的直接出芽率为46.7%，生根率为95%，组培周期为60天。与愈伤组织再生系统相比，本发明可以越过外植体愈伤组织诱导和分化的阶段，培养周期减少了3-4个月，因此具有生长速度快、发芽率高等优点。使用本发明扩繁薰衣草不仅可以大大缩短生产周期，而且可以减小劳动强度从而节省大量的人力资源，具有很强的实用价值，为薰衣草规模化组培快繁提供了技术保障。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及植物组织培养技术，具体为以薰衣草下胚轴为外植体材料建立的快速再生方法。
背景技术
薰衣草(Lavender)是唇形科薰衣草属多年生半阴性亚灌木，有强烈芳香气味，原产于地中海地区，其生长迅速，根系发达，喜光耐旱，适合在广袤的干旱地区种植。薰衣草精油具有安宁镇静、洁净心身、清热解毒、散淤消肿、超风发汗等功效，被广泛应用于医药、食品、化妆品等领域。新疆是我国薰衣草主要的种植基地，其种植面积和薰衣草精油产量均占全国的95％以上，但目前实际生产中大多采用播种或扦插的方法进行繁殖，存在着繁殖速度慢、成活率低、形态学和化学特征易发生变异等缺点(Plant Cell，Tissue and OrganCulture，1999，56)。此外，在新疆，薰衣草需覆土才能度过最低达-30℃～-40℃的寒冬，从而使得薰衣草的种植成本较高。因此，为了促进薰衣草种植和加工业的发展，追求低成本、高品质和高效益，开发新的高频再生技术已成为当前我国薰衣草种植业发展的关键问题之一。
利用现代生物工程技术，通过植物组织培养方法实现薰衣草快速、高效的无性繁殖，不但可以解决播种或扦插繁殖所带来的问题，而且可以固定杂交优势，保持品种特异性。利用薰衣草外植体在合适的培养基上进行离体培养，可摆脱植物自然生长对季节、气候等因素的依赖，而且可以用少量的个体原料在较少的空间和时间内获得大量在遗传特性上与亲本植株完全相同的无菌再生苗。这种新的组培快繁技术为薰衣草产业化发展开拓了一条有效途径，其经济效益和社会效益巨大，但关键在于能否建立合适的高频再生体系。目前，薰衣草组织培养已有少量报道，C.Sudria等通过茎尖获得了薰衣草(Lavandula dentate L.)的再生植株(Plant Cell，Tissue and OrganCulture，1999，58)；Jordan AM等通过茎段培养获得了薰衣草(Lavandula dentate L.)的再生植株(Biotech，1998，73(1))；中国专利CN200410085334X一种薰衣草组织培养方法是将薰衣草愈伤组织悬浮培养获得再生植株。本发明是以薰衣草下胚轴为外植体直接分化出芽获得再生植株的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种以薰衣草下胚轴为外植体材料建立的快速再生体系，为薰衣草大规模组培快繁和遗传转化体系的建立奠定基础。根据植物细胞无性繁殖理论，本发明以薰衣草下胚轴为外植体，在科学配方的固体再生培养基上直接分化出芽，然后在生根培养基上生根形成完整植株的组培快繁方法。本发明薰衣草下胚轴的直接出芽率为46.7％，生根率为95％，组培周期为60天左右。与其它组培方法相比，本发明再生方法越过了外植体愈伤组织诱导阶段，因此具有生长速度快、发芽率高等优点。使用本发明扩繁薰衣草不仅可以大大缩短生产周期，而且可以减小劳动强度从而节省大量的人力资源，具有很强的实用价值。
本发明所述的一种薰衣草快速再生体系，按下列步骤进行：
a、挑取饱满的薰衣草种子，40℃温水浸泡，水凉后继续浸泡24h，将经过浸泡的薰衣草种子流水冲洗30min，75％的乙醇漂洗15-30s，无菌水冲洗1次后，用0.2％的二氯异氰尿酸钠溶液浸泡20-40min，然后用无菌水冲洗4-5次，将种子接种于MS固体培养基中，置25±1℃，8h光照，16h暗培养条件下进行培养，光照强度为1000-1500lx，15-20天后种子开始萌发，萌发率为53％；
b、取经过种子萌发的无菌苗的下胚轴剪成3-6mm的小段，横向放置，接入琼脂固化MS+IAA 0-1.0mg·L-1+6-BA 1.0-2.0mg·L-1的直接分化出芽培养基，15-20天后得到薰衣草不定芽；
c、将不定芽接入琼脂固化的MS+NAA 2.0mg·L-1+6-BA 0.5mg·L-1培养基上进行继代培养，15-20天，得到大量的组培苗；
d、将组培苗接种于无激素的1/2MS培养基上进行生根培养，10-15天形成生根的小植株。
所选的薰衣草外植体为具有10-20天苗龄的下胚轴，并将其剪成3-6mm长的小段，横向放置进行接种。
固体再生培养基条件是1000-1500lx日光灯照射，光照12-16h/d，25±1℃下培养，湿度保持55±5％。
固体培养基接种量是100ml三角瓶5-8个外植体，每瓶40-60ml琼脂固化培养基。
再生的组培苗长到3-6cm，转接到琼脂固化的固体培养基上进行生根。
固体培养基需添加3％的蔗糖，0.35％-0.6％的琼脂，调节pH5.90±0.05，121℃灭菌25min。
本发明提供了一种薰衣草直接分化出芽高效再生体系。本发明薰衣草下胚轴的直接出芽率为46.7％，生根率为95％，组培周期为60天。与其它组培方法相比，本发明再生方法越过了外植体愈伤组织诱导和分化阶段，培养周期减少了3-4个月，因此具有生长速度快、发芽率高等优点。使用本发明扩繁薰衣草不仅可以大大缩短生产周期，而且可以减小劳动强度从而节省大量的人力资源，具有很强的实用价值。
附图说明
图1为本发明在固体再生培养基上接种的下胚轴外植体照片；
图2为本发明所选下胚轴外植体在固体再生培养基上直接分化的不定芽照片；
图3为本发明在固体生根培养基上获得的完整小植株照片；
图4为本发明获得的移栽成功的薰衣草植株照片。
本发明要建立薰衣草下胚轴直接分化出芽再生系统，必须先获得下胚轴；挑取饱满的薰衣草种子，40℃温水浸泡，水凉后继续浸泡24h。将经过浸泡的薰衣草种子流水冲洗30min，75％的乙醇漂洗15-30s，无菌水冲洗1次后，用0.2％的二氯异氰尿酸钠(优氯净)溶液浸泡20-40min，然后用无菌水冲洗4-5次，将种子接种于MS固体培养基中，置25±1℃，8h光照，16h暗培养条件下进行培养，光照强度为1500lx，15-20天后种子开始萌发，萌发率为53％，选择10-20天苗龄的由薰衣草种子萌发的无菌苗的下胚轴为外植体材料(图1)；
将选择的下胚轴材料剪成3-6mm的小段，横向放置，接入琼脂固化MS+IAA 0-1.0mg·L-1+6-BA 1.0-2.0mg·L-1的直接分化出芽培养基，15-20天后得到薰衣草不定芽(图2)；
将不定芽接入琼脂固化的MS+NAA 2.0mg·L-1+6-BA 0.5mg·L-1培养基上进行继代培养，15-20天，得到大量的组培苗(图3)；
将组培苗接种于琼脂固化的1/2MS培养基上进行生根培养，10-15天形成生根的小植株，生根苗取盖炼苗2-3天，即可移栽到室内花盆中，注意保湿，成活率可达100％，半个月可长出新叶，表明移栽成活(图4)；
固体培养的条件是光照时间12-16h·d-1，温度25±1℃，光照强度为1000-1500lx，湿度保持55±5％。
固体培养基需添加3％的蔗糖，0.35％-0.6％的琼脂，调节pH(5.90±0.05)，121℃灭菌25min。
具体实施方式
下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质内容，但不能解释为本发明被下述实施例所限制。
实施例1：
薰衣草下胚轴外植体的获得
a、挑取饱满的薰衣草种子，40℃温水浸泡，水凉后继续浸泡24h，将经过浸泡的薰衣草种子流水冲洗30min，75％的乙醇漂洗25s，无菌水冲洗1次后，用0.2％的二氯异氰尿酸钠(优氯净)溶液浸泡20min，然后用无菌水冲洗4-5次，将种子接种于0.4％琼脂固化的MS固体培养基中，置25±1℃，8h光照，16h暗培养条件下进行培养，光照强度为1500lx。15-20天后种子开始萌发，萌发率为53％。
薰衣草下胚轴外植体直接分化不定芽
b、取经过种子萌发的无菌苗的下胚轴剪成5mm左右的小段，横向放置，接入0.5％琼脂固化MS+6-BA 1.0mg·L-1的直接分化出芽培养基，15-20天后得到薰衣草不定芽，其不定芽分化率为33.3％。
薰衣草分化不定芽生根与移栽
c、将不定芽接入0.5％琼脂固化的MS+NAA 2.0mg·L-1+6-BA 0.5mg·L-1培养基上进行继代培养，15-20天，得到大量的组培苗；
d、将组培苗接种于0.5％琼脂固化的1/2MS培养基上进行生根培养，10-15天形成生根的小植株，生根率为95％。生根苗取盖炼苗2-3天，即可移栽到室内花盆中，注意保湿，成活率可达100％，半个月可长出新叶，表明移栽成活。
实施例2：
薰衣草下胚轴外植体的获得
a、挑取饱满的薰衣草种子，40℃温水浸泡，水凉后继续浸泡24h，将经过浸泡的薰衣草种子流水冲洗30min，75％的乙醇漂洗25s，无菌水冲洗1次后，用0.2％的二氯异氰尿酸钠(优氯净)溶液浸泡20min，然后用无菌水冲洗4-5次，将种子接种于0.4％琼脂固化的MS固体培养基中，置25±1℃，8h光照，16h暗培养条件下进行培养，光照强度为1500lx，15-20天后种子开始萌发，萌发率为53％。
薰衣草下胚轴外植体直接分化不定芽
b、取经过种子萌发的无菌苗的下胚轴剪成5mm左右的小段，横向放置，接入0.5％琼脂固化MS+IAA 0.1mg·L-1+6-BA 1.0mg·L-1的直接分化出芽培养基，15-20天后得到薰衣草不定芽，其不定芽分化率为36.7％。
薰衣草分化不定芽生根与移栽
c、将不定芽接入0.5％琼脂固化的MS+NAA 2.0mg·L-1+6-BA 0.5mg·L-1培养基上进行继代培养，15-20天，得到大量的组培苗；
d、将组培苗接种于0.5％琼脂固化的1/2MS培养基上进行生根培养，10-15天形成生根的小植株，生根率为95％。生根苗取盖炼苗2～3天，即可移栽到室内花盆中，注意保湿，成活率可达100％，半个月可长出新叶，表明移栽成活。
实施例3：
薰衣草下胚轴外植体的获得
a、挑取饱满的薰衣草种子，40℃温水浸泡，水凉后继续浸泡24h。将经过浸泡的薰衣草种子流水冲洗30min，75％的乙醇漂洗25s，无菌水冲洗1次后，用0.2％的二氯异氰尿酸钠(优氯净)溶液浸泡20min，然后用无菌水冲洗4-5次，将种子接种于0.4％琼脂固化的MS固体培养基中，置25±1℃，8h光照，16h暗培养条件下进行培养，光照强度为1500lx，15-20天后种子开始萌发，萌发率为53％。
薰衣草下胚轴外植体直接分化不定芽
b、取经过种子萌发的无菌苗的下胚轴剪成5mm左右的小段，横向放置，接入0.5％琼脂固化MS+IAA 0.1mg·L-1+6-BA 2.0mg·L-1的直接分化出芽培养基，15-20天后得到薰衣草不定芽，其不定芽分化率为16.7％。
薰衣草分化不定芽生根与移栽
c、将不定芽接入0.5％琼脂固化的MS+NAA 2.0mg·L-1+6-BA 0.5mg·L-1培养基上进行继代培养，15-20天，得到大量的组培苗；
d、将组培苗接种于0.5％琼脂固化的1/2MS培养基上进行生根培养，10-15天形成生根的小植株，生根率为95％。生根苗取盖炼苗2-3天，即可移栽到室内花盆中，注意保湿，成活率可达100％，半个月可长出新叶，表明移栽成活。
实施例4：
薰衣草下胚轴外植体的获得
a、挑取饱满的薰衣草种子，40℃温水浸泡，水凉后继续浸泡24h，将经过浸泡的薰衣草种子流水冲洗30min，75％的乙醇漂洗25s，无菌水冲洗1次后，用0.2％的二氯异氰尿酸钠(优氯净)溶液浸泡20min，然后用无菌水冲洗4-5次，将种子接种于0.4％琼脂固化的MS固体培养基中，置25±1℃，8h光照，16h暗培养条件下进行培养，光照强度为1500lx，15-20天后种子开始萌发，萌发率为53％。
薰衣草下胚轴外植体直接分化不定芽
b、取经过种子萌发的无菌苗的下胚轴剪成5mm左右的小段，横向放置，接入0.5％琼脂固化MS+IAA 0.5mg·L-1+6-BA 2.0mg·L-1的直接分化出芽培养基，15-20天后得到薰衣草不定芽，其不定芽分化率为46.7％。
薰衣草分化不定芽生根与移栽
c、将不定芽接入0.5％琼脂固化的MS+NAA 2.0mg·L-1+6-BA 0.5mg·L-1培养基上进行继代培养，15-20天，得到大量的组培苗；
d、将组培苗接种于0.5％琼脂固化的1/2MS培养基上进行生根培养，10-15天形成生根的小植株，生根率为95％。生根苗取盖炼苗2-3天，即可移栽到室内花盆中，注意保湿，成活率可达100％，半个月可长出新叶，表明移栽成活。
实施例5：
薰衣草下胚轴外植体的获得
a、挑取饱满的薰衣草种子，40℃温水浸泡，水凉后继续浸泡24h，将经过浸泡的薰衣草种子流水冲洗30min，75％的乙醇漂洗25s，无菌水冲洗1次后，用0.2％的二氯异氰尿酸钠(优氯净)溶液浸泡20min，然后用无菌水冲洗4-5次，将种子接种于0.4％琼脂固化的MS固体培养基中，置25±1℃，8h光照，16h暗培养条件下进行培养，光照强度为1500lx，15-20天后种子开始萌发，萌发率为53％。
薰衣草下胚轴外植体直接分化不定芽
b、取经过种子萌发的无菌苗的下胚轴剪成5mm左右的小段，横向放置，接入0.5％琼脂固化MS+IAA 1.0mg·L-1+6-BA 2.0mg·L-1的直接分化出芽培养基，15-20天后得到薰衣草不定芽，其不定芽分化率为30％。
薰衣草分化不定芽生根与移栽
c、将不定芽接入0.5％琼脂固化的MS+NAA 2.0mg·L-1+6-BA 0.5mg·L-1培养基上进行继代培养，15-20天，得到大量的组培苗。
d、将组培苗接种于0.5％琼脂固化的1/2MS培养基上进行生根培养，10-15天形成生根的小植株，生根率为95％。生根苗取盖炼苗2-3天，即可移栽到室内花盆中，注意保湿，成活率可达100％，半个月可长出新叶，表明移栽成活。
本发明提供了一种薰衣草直接分化出芽高效再生体系，本发明薰衣草下胚轴的直接出芽率为46.7％，生根率为95％，组培周期为60天。与其它组培方法相比，本发明再生方法越过了外植体愈伤组织诱导和分化阶段，培养周期减少了3-4个月，因此具有生长速度快、发芽率高等优点。使用本发明扩繁薰衣草不仅可以大大缩短生产周期，而且可以减小劳动强度从而节省大量的人力资源，具有很强的实用价值。
Claims (5)
1、一种薰衣草快速再生方法，其特征在于按下列步骤进行：
a、挑取饱满的薰衣草种子，40℃温水浸泡，水凉后继续浸泡24h，将经过浸泡的薰衣草种子流水冲洗30min，75％的乙醇漂洗15-30s，无菌水冲洗1次后，用0.2％的二氯异氰尿酸钠溶液浸泡20-40min，然后用无菌水冲洗4-5次，将种子接种于MS固体培养基中，置25±1℃，8h光照，16h暗培养条件下进行培养，光照强度为1000-1500lx，15-20天种子开始萌发，萌发率为53％；
b、取经过种子萌发的无菌苗的下胚轴剪成36mm的小段，横向放置，接入琼脂固化MS+IAA 0-1.0mg·L-1+6-BA 1.0-2.0mg·L-1的直接分化出芽培养基，15-20天得到薰衣草不定芽；
c、将不定芽接入琼脂固化的MS+NAA 2.0mg·L-1+6-BA 0.5mg·L-1培养基上进行继代培养，15-20天，得到大量的组培苗；
d、将组培苗接种于无激素的1/2MS培养基上进行生根培养，10-15天形成生根的小植株；
e、在固体培养基上再生培养条件是1000-1500lx日光灯照射，光照12-16h/d，25±1℃下培养，湿度保持55±5％。
2、根据权利要求1所述的一种薰衣草快速再生方法，其特征是所选的薰衣草外植体为具有10-20天苗龄的下胚轴，并将其剪成3-6mm长的小段，横向放置进行接种。
3、根据权利要求1所述的一种薰衣草快速再生方法，其特征是固体培养基接种量是100ml三角瓶5-8个外植体，每瓶40-60ml琼脂固化培养基。
4、根据权利要求1所述的一种薰衣草快速再生方法，其特征是再生的组培苗长到3-6cm，转接到琼脂固化的固体培养基上进行生根。
5、根据权利要求1-5所述的一种薰衣草快速再生方法，其特征是固体培养基需添加0.35-0.6％的琼脂。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20081015 Termination date: 20120303 |