CN101185421A - 寒富苹果花药培养植株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及农业领域寒富苹果花药培养植株的方法。经过寒富苹果花药的获取与消毒清洗过程1、胚状体的诱导过程2、植株分化过程3和诱导生根和试管苗嫁接过程4完成。与现有技术相比：1、在胚状体诱导培养基中减少了2，4－D、IAA、K、BA这几种价格昂贵激素，降低了成本，缩短了胚状体诱导时间60天。2、在胚状体分化培养基中，采用了活性较好的新型激素TDZ，提高了分化率，而且分化植株生长健壮，有利于植株生根和嫁接。3、可在3月份于温室盆栽的山丁子上进行嫩枝嫁接，提高成活率，延长生长周期长，可达到完全木质化而安全越冬。本发明方法适宜采用苹果花药培养苹果植株的应用。
Description
技术领域
本发明涉及农业领域植物育苗的方法，具体地说是寒富苹果花药培养植株的方法。
背景技术
苹果是异花授粉植物，在遗传学上具有高度杂合性，要想获得纯系材料非常困难，若能通过花药培养获得单倍体植株，再经染色体加倍获取纯系材料则比较容易，此项技术在苹果育种研究中具有非常重要的意义。
中国农业科学院果树研究所是我国最早利用苹果花药培养单倍体植株的试验研究机构，其中对元帅、国光、赤阳、金冠、祝光、红玉、富士、秋锦和红富士等苹果品种的花药进行组织培养获得了成功。
在相关论文中公布了利用苹果花药组织培养的方法，其内容是：诱导胚状体培养基为MS附加2，4-D、IAA、GA、K、BA不同配比或浓度，蔗糖每升30克，洋菜每升6～7.5克，PH值5.8左右；分化培养基为MS附加GA、IBA、BA，蔗糖、洋菜、PH值5.8；生根培养基为1/2MS附加IAA 1.5ppm。在温度25～30℃，光照强度1500～2000勒克司，日光照10小时的培养条件下进行培养，产生单倍体胚状体。
将单倍体胚状体进行增殖分化成为植株，将分化植株增殖培养并诱导生根，所获得的植株进行移栽或嫁接，获得植株幼苗。
植株分化：将胚状体转移到MS附加GA3 0.1～2ppm，IBA0.1～0.5ppm、BA 1ppm的培养基上进行胚状体分化培养。
分化植株的增殖：在分化培养基上进行分化植株的增殖培养。
分化植株的诱导生根：选取2-3cm高、且生长健壮的植株，插入到1/2MS附加IAA 1.5ppm的生根培养基上诱导生根。
生根植株的移栽：将生根植株进行光照锻炼后，在温室条件下移栽至营养钵中，经过管理以获得苹果幼苗。
嫁接：也可将试管植株切下直接嫁接到苹果树嫩梢上，可直接在田间获得花培植株。
由于在培养基中含有2，4D激素，虽然对苹果花药诱导胚状体有利，但影响植株的后期生长与发育。由于寒富苹果品种的花药生物学特性较为特殊，因此目前所公布的苹果花药培养获取植株的方法难以满足对寒富品种苹果花药培养植株的需要。
发明内容
为了克服现有苹果花药培养植株方法的不足，本发明提出了寒富苹果花药培养植株的方法。该方法以寒富苹果的花药为材料进行培养，解决寒富苹果育种的技术问题。
本发明解决技术问题所采用的方案是：
1、寒富苹果花药的获取与消毒清洗
在花粉发育单核期时采集花蕾，经双氧水消毒和无菌水冲洗，剥取花药进行培养。
2、胚状体的诱导
将花药接种在胚状体诱导培养基上，在温度26～28℃，光照1500～2000LX，每天光照10小时左右的培养室中。经过90～150天的培养，从花药裂口处产生乳白色具有两片叶子的胚状体。
胚状体诱导培养基组成：由MS附加GA3 5mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5.5g/L的水溶液组成，调整PH＝5.8。
3、植株分化
将诱导出的胚状体转入植株分化培养基上，在温度26～28℃，光照1500～2000LX条件下培养1个月使胚状体转绿增殖，经2个月分化出幼叶和小植株。小植株可在分化培养基上继代培养增殖。
植株分化培养基组成：由MS附加GA3 0.5mg/L、NAA 0.5/L、TDZ 1.0mg/L、蔗糖30g和琼脂5.5g的水溶液组成，PH＝5.8。
4、诱导生根和试管苗嫁接
分化植株达到2cm左右高时，可以切下来转入诱导生根培养基上诱导生根。在温度26～28℃，光照1500～2000LX条件下培养，经过20天左右培养产生根系。选择诱导生根比较好的植株，经过光照锻炼后进行移栽。对于不能生根的植株，采用在早春时节先在温室内盆栽的山丁子上进行嫩枝嫁接，待完全成活并已达到半木质化时再移入田间。
诱导生根培养基组成：由1/2MS附加IAA 1.0mg/L、IBA 1.0mg/L蔗糖20g/L和琼脂5.5g/L水溶液组成，PH＝5.8。
本发明方法与已经公布的技术相比，其积极效果是：
1、在胚状体诱导培养基中减少了2，4-D、IAA、K、BA这几种价格昂贵激素，不但降低了成本，而且缩短了胚状体诱导所需时间，由原来的150天开始产生胚状体缩短至90天。
2、在胚状体分化培养基中，采用了活性较好的新型激素TDZ，不仅提高了分化率，而且分化植株生长健壮，有利于植株生根和嫁接。
3、采用本发明方法可在3月份于温室盆栽的山丁子上进行嫩枝嫁接，在人工控制条件下使嫁接成活率大大提高，成活植株生长周期长，可达到完全木质化而安全越冬。
本发明方法适宜采用苹果花药培养苹果植株的应用。
具体实施方式
培养过程：
1、寒富苹果花药的获取与消毒清洗
在花粉发育单核期时采集花蕾，经5％的双氧水消毒和无菌水冲洗，剥取花药。
2、胚状体的诱导
将花药接种在胚状体诱导培养基上，在温度26～28℃，光照1500～2000LX，每天光照10小时左右的培养室中。经过90～120天的培养，从花药裂口处产生乳白色具有两片叶子的胚状体。
胚状体诱导培养基组成：由MS附加GA3 5mg/L、蔗糖30g/L、和琼脂5.5g/L水溶液组成，PH＝5.8。
3、植株分化
将诱导出的胚状体转入植株分化培养基上，在温度26～28℃，光照1500～2000LX条件下培养1个月使胚状体转绿增殖，经2个月分化出幼叶和小植株。小植株可在分化培养基上继代培养增殖。
植株分化培养基组成：由MS附加GA3 0.5mg/L、NAA 0.5mg/L、TDZ 1.0mg/L、蔗糖30g和琼脂5.5g水溶液组成，PH＝5.8。
4、诱导生根和试管苗嫁接
分化植株达到2cm左右高时，可以切下来转入诱导生根培养基上诱导生根。在温度26～28℃，光照1500～2000LX条件下经过20天左右培养产生根系。选择诱导生根比较好的植株，经过光照锻炼后转入移栽。也可采用试管苗嫁接的方法在温室或田间的嫩稍上嫁接。
诱导生根培养基组成：由1/2MS附加IAA 1.0mg/L、IBA 1.0mg/L蔗糖20g和琼脂5.5g水溶液组成，PH＝5.8。
由于在培养基配料中减少了2，4-D、IAA、K、BA，所以成本低，干扰因素少，有利于胚状体的诱导与分化，提高诱导、分化的成功率。
通过对培养出的小植株的细胞观察：采取试管苗的茎尖或根尖作材料，用铁钒苏木精染色法或去壁低渗吉母沙染色法观察细胞染色体数为2n＝17。
通过苹果花药培养植株生产试验观察，其胚状体诱导率提高50％以上，植株分化率在50％以上，生根率在60％以上，嫁接成活率在80％以上，而且嫁接后的苹果植株生长茂盛，发育良好，证明本发明方法适宜以寒富苹果品种花药培养成植株并在苹果育种试验中进行应用。
采用本发明方法与原来直接在田间大树上嫁接相比，既提高了嫁接成活率，又能使嫁接成活的植株延长生长时间，使其充分成熟而安全越冬。
本发明方法与已经公布的技术相比，有以下几点改进：
1、在胚状体诱导培养基中减少了2，4-D、IAA、K、BA这几种价格昂贵激素，不但降低了成本，而且缩短了胚状体诱导所需时间，由原来的150天开始产生胚状体缩短至90天就可以产生胚状体，节省了60天的时间。
2、在胚状体分化培养基中，采用了活性较好的新型激素TDZ，不仅提高了分化率，而且分化植株生长健壮，有利于植株生根和嫁接。
3、花药培养植株生根是较难的，所以试管苗的嫁接是试管苗能否安全转移到田间的关键环节。原来采用的方法是6月份在田间苹果大树的嫩梢上直接嫁接，这种方法的缺点是嫁接时间较晚，温度高，成活率低，而且成活的植株在越冬前不能完全成熟。改进后采用3月份在温室盆栽的山丁子上进行嫩枝嫁接，在人工控制条件下使嫁接成活率大幅度提高，成活植株生长周期长，可达到完全木质化而安全越冬。
Claims (3)
1.寒富苹果花药培养植株的方法，包括苹果花药采集、花药处理、花药在培养基中进行胚状体诱导、分化、生根、幼株嫁接步骤，其特征在于：
(1)、寒富苹果花药的获取与消毒清洗
在花粉发育单核期时采集花蕾，经5％的双氧水消毒和无菌水冲洗，剥取花药；
(2)、胚状体的诱导
将花药接种在胚状体诱导培养基上，在温度26～28℃，光照1500～2000LX，每天光照10小时左右的培养室中，经过90～120天的培养，从花药裂口处产生乳白色具有两片叶子的胚状体；
胚状体诱导培养基组成：由MS附加GA3 5mg/L、蔗糖30g/L、和琼脂5.5g/L水溶液组成，PH＝5.8；
(3)、植株分化
将诱导出的胚状体转入植株分化培养基上，在温度26～28℃，光照1500～2000LX条件下培养1个月使胚状体转绿增殖，经2个月分化出幼叶和小植株，小植株可在分化培养基上继代培养增殖；
植株分化培养基组成：由MS附加GA3 0.5mg/L、NAA 0.5mg/L、TDZ 1.0mg/L、蔗糖30g和琼脂5.5g水溶液组成，PH＝5.8；
(4)、诱导生根和试管苗嫁接
分化植株达到2cm左右高时，可以切下来转入诱导生根培养基上诱导生根，在温度26～28℃，光照1500～2000LX条件下经过20天左右培养产生根系，选择诱导生根比较好的植株，经过光照锻炼后转入移栽，也可采用试管苗嫁接的方法在温室或田间的嫩稍上嫁接；
诱导生根培养基组成：由1/2MS附加IAA 1.0mg/L、IBA1.0mg/L、蔗糖20g和琼脂5.5g水溶液组成，PH＝5.8；
2.根据权利要求1所述的培养植株的方法，其特征在于：在植株分化培养基中加有TDZ成分。
3.根据权利要求1所述的培养植株的方法，其特征在于：对于不能生根的植株，采用在早春时节先在温室内盆栽的山丁子上进行嫩枝嫁接，待完全成活并已达到半木质化时再移入田间。
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