CN101358190B - 一种人工合成的对鳞翅目害虫表达高毒力蛋白的基因序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种人工合成的对鳞翅目害虫表达高毒力蛋白的基因序列及其在植物保护领域的应用，属于生物防治技术领域。一种人工合成的对鳞翅目害虫表达高毒力蛋白的基因序列，其特征在于编码区具有与cryIAh基因相似性达81％，且与cryIAh基因编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。本发明通过调整cryIAh基因的核苷酸组成，使其接近植物基因的密码子频率而不改变编码的氨基酸序列，将本发明获得的基因序列构建到适合的骨架载体中并转化受体植物，使该基因序列得以在植物中表达，检测结果显示，阳性植株因表达了该基因而获得对鳞翅目害虫的抗性。

Description

一种人工合成的对鳞翅目害虫表达高毒力蛋白的基因序列及其应用

技术领域

本发明属于生物防治技术领域，特别是涉及一种人工合成的对鳞翅目害虫表达高毒力蛋白的基因序列及其应用。

背景技术

虫害是世界农作物减产的一个重要因素，平均每年因此损失粮食总产量的10％，直接经济损失达数十亿美元。我国水稻、玉米和棉花的种植面积分别为2837万、2544万、569万公顷(2006，中国农业信息网)，主要的害虫有水稻螟虫、玉米螟虫和棉铃虫等，严重威胁着这些重要的粮食和经济作物的安全生产。过去几十年的防治主要依赖化学农药，在为农业生产做出巨大贡献的同时，化学农药却造成了环境污染、人畜中毒、生态失衡等严重后果。在这些巨大的代价面前，全球都在寻找和开辟新的病虫害防治策略和技术。

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布极其广泛的革兰氏阳性细菌。它在形成芽胞的同时，能产生蛋白性质的伴胞晶体(parasporal crystal)，对鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophaga)等多种昆虫，以及线虫、螨类和原生动物具有特异性的杀虫活性(Schnepf，E.et al.，1998，Microbiol.And Molecular BiologyReview，62(3)：775-806)。这种杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，ICPs)又称δ-内毒素(Delta-endotoxin)，在昆虫中肠首先溶解，成为原毒素，之后被肠道蛋白酶降解为具有专一活性的毒素，与中肠上特异的受体进行结合(Craig，2007，Microbiol.Mol.Biol.Rev，71(2)：255-281)，导致对人畜无害，不污染环境，因而Bt在害虫的生物防治中得到了广泛应用。

目前人们已经克隆了415多种编码杀虫晶体蛋白的Bt杀虫基因，它们分属180种模式基因(可参见http://www.biols.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/list.html)。

1987年，Vaeck等人首次将Bt杀虫晶体蛋白基因转入烟草，开创了人类利用转基因技术防治害虫的先河(Vaeck，et al，1987，Nature，328：33-37)。但是在转基因研究中人们发现将来源于Bt的杀虫蛋白基因直接转入植物，存在着表达产物不稳定、表达量少的缺陷(vanAarssen，et al，1995，Plant Mol Biol，28：513-524)。具体问题包括：1)天然Bt基因高含AT，超过60％，在植物体内这样的基因表达的mRNA极易被植物降解；2)天然Bt基因中存在类似真核基因的内含子切点、转录终止子序列，从而造成转录不完整、mRNA异常剪切等；3)天然Bt基因中使用的密码子与植物存在较大差异，会造成蛋白翻译效率降低；4)天然Bt基因作为原核生物来源的基因，其结构与植物等真核生物差异显著，如真核生物含有5’-UTR序列，3’末端的polyA尾序列。因此，这些关键问题的解决是实现Bt基因在植物中高效、稳定表达的重要保证。随着这些技术的改进和完善，自1996年来的十二年内，转基因抗虫玉米、马铃薯、水稻等作物相继研制成功，并逐步进入应用阶段(James C，ISAAA Briefs，2007)。

中国农业科学院植物保护研究所获得的cry1Ah基因(国家发明专利ZL20041000998.9)，对棉铃虫、小菜蛾、玉米螟、水稻二化螟等重要的鳞翅目害虫具有高毒力。本发明对该基因进行了密码子优化，这样一方面使改造的基因在常见作物中能高效稳定表达，增强杀虫效果，获得实用性更强的转基因抗虫植物；另一方面将丰富转基因抗虫植物中杀虫基因的种类，增强国际竞争力。

发明内容

针对上述领域的不足，本发明提供一种人工合成的对鳞翅目害虫表达高毒力蛋白的基因序列，利用植物偏好的密码子序列对，使cry1Ah基因的表达量增多，提高转基因植物的抗虫能力。

一种人工合成的对鳞翅目害虫表达高毒力蛋白的基因序列，其特征在于编码区具有与SeqNo.2相似性达81％，且与Seq No.2编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。

所述具有的核苷酸序列如Seq No.3所示。

所述人工合成的对鳞翅目害虫表达高毒力蛋白的基因序列，如Seq No.4所示。

所述具有的核苷酸序列与Seq No.3相似性为93％，且与Seq No.3编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。

所述具有的核苷酸序列如Seq No.7所示。

所述人工合成的对鳞翅目害虫表达高毒力蛋白的基因序列，如Seq No.5所示。

包含上述基因序列的植物表达载体。

所述植物表达载体为pUbi-mAh，其结构如图1所示。

所述植物表达载体为pCAMBIAS1Ah，其结构如图3所示。

所述植物表达载体为pCAMBIAUbi-mrAh，其结构如图5所示。

上述植物表达载体的应用。

所述应用是指将pUbi-mAh转化到玉米中，所述转化指基因枪法、花粉管通道法。

所述应用是指将pCAMBIAS1Ah转化烟草和甘蓝，所述转化指农杆菌介导的遗传转化。

所述应用指将pCAMBIAUbi-mrAh转化水稻。

一种转基因植物，其特征在于该植物转化的外源基因为上述任一基因序列。

一种转基因微生物，其特征在于该微生物转化的外源基因为上述任一基因序列。

所述转基因植物在表达具有SeqNo.1所示氨基酸序列的对鳞翅目害虫有高毒力蛋白上的应用。

所述转基因微生物在表达具有Seq No.1所示氨基酸序列的对鳞翅目害虫有高毒力蛋白上的应用。

本发明根据Cry1Ah的氨基酸序列(SEQ NO.1)，在保证氨基酸序列不变的前提下，首先采用植物偏好的密码子对cry1Ah基因的1-2001bp的序列(SEQ NO.2)进行人工优化改造，剔除植物稀有密码子，并调整密码子的使用频率，使Cry1Ah蛋白的密码子使用频率与植物中的使用频率接近(表1)。在此基础上，去除DNA序列中存在的典型的造成植物基因转录本不稳定的富含AT序列，并去除了发夹结构和常用限制性酶切位点，为了在起始密码子处形成一个NcoI(CCATGG)，在第一个起始密码子后加入了一个氨基酸(甘氨酸，GGA)，得到人工改造的基因序列，如SEQ NO.3所示，该序列与cry1Ah基因1-2001bp的同源性为86.18％(图21)，而G+C含量由原来的37％提高到了48％，此人工改造的基因序列能更高效稳定地在大多数植物中表达。

在上述人工改造的基因序列的5’端添加了如Seq No.6所示的Ω序列和Kozak序列(GallieDR et al，1987，Nucleic Acids Res，15：3257-3273；Kozak M，1984，Nucleic Acids Res，12(2)：857-872)，Ω序列是衍生于植物病毒衣壳蛋白质基因编码区的翻译增强序列，(Richards et al，Eur J Biochem1987，84：513-519)。Kozak序列是促进外源基因在植物细胞内翻译过程的编码核糖体结合蛋白质的序列(Kozak et al，Nucleic Acids Res 1984，12：857-872)，能提高mcry1Ah基因在普通植物中的表达水平，在3’端添加了polyA序列(Munroe D，1990，Mol Cell Biol，10：3441-3455)，并设计了几个连续的终止密码子，以确保翻译的准确终止，然后在3’端与5’端分别引入了BamHI和KpnI位点，以便于后续克隆，最终确定本发明人工设计的Btcry1Ah基因序列即mcry1Ah基因，如SEQ NO.4所示。

对本发明根据水稻基因的密码子偏好性与其它植物的密码子偏好性有一定的差异，及Cry1Ah的氨基酸序列(SEQ NO.1)，保证氨基酸序列不变的前提下，在本发明SEQ NO.3的序列基础上进一步改造，采用水稻偏好的密码子对SEQ NO.3的序列进行人工优化改造。调整密码子的使用频率，使Cry1Ah蛋白的密码子使用频率与水稻中的使用频率接近(表2)，得到适合于在水稻中高效表达的改造基因序列，如SEQ NO.7所示，为了后续基因操作方便，在人工合成的基因两边加上了适当的酶切位点，最后确定进一步改造的mcry1Ah基因即mrcry1Ah基因的核苷酸序列，如SEQ NO.5所示。本步骤中改造得到2001bp序列SEQ ID NO.7与SEQ NO.3的相似性为93％(图23)，是在SEQ NO.3基础上稍微的改动，与cry1Ah基因SEQ ID NO2相似性只有81％(图22)，而G+C含量由原来的37％提高到了51％，但保证了其编码的氨基酸不变的情况下使其在水稻中能更高效率地表达。

将本发明人工设计的基因序列进行人工合成并插入到合适的克隆载体中，获得植物表达载体。

将本发明中获得的基因序列即mcry1Ah基因克隆到质粒骨架pGEM-7Zf(+)(为常用质粒，可在美国Promega公司购买到)中得到植物表达载体pUbi-mAh(图1)，该载体的多克隆位点中连有启动子序列为玉米泛素蛋白ubiquitin启动子，和NOS终止子，及mcry1Ah基因，该质粒可以通过直接转化法转化植物，在植物中表达外源基因。用于驱动基因表达的启动子并不限于ubiquitin启动子，可以是来源于水稻的actin启动子、来源于花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子等。为了在转化玉米中利于将转基因愈伤组织筛选出来，可在该载体种连入抗生素筛选基因，本发明在pUbi-mAh连入潮霉素筛选基因，构建得到pUbi-mAh-hpt质粒。筛选标记基因不限于潮霉素筛选标记基因，可以选择来自土壤吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因和来自S.viridochromogenes的pat基因，也可以选择耐草甘膦的编码EPSP合酶的aroA基因。

通过如图3所示的流程构建了含有本发明的mcry1Ah基因的表达载体pCAMBIAS1Ah，该载体为双元载体，可以在大肠杆菌和农杆菌中表达，可以通过农杆菌转化植物，在植物中表达外源基因。

将本发明获得的mrcry1Ah基因按照图5所示的步骤构建，得到植物表达载体pCAMBIAUbi-mrAh，该载体为双元载体，可以在大肠杆菌和农杆菌中表达，通过农杆菌转化植物，特别是适合于在水稻中表达mrcry1Ah基因。

将包含本发明人工合成的基因序列的植物表达载体，应用到植物转基因工程中，使植物获得对鞘翅目害虫的抗性，从而达到植物保护的目的。

将本发明中的植物表达载体pUbi-mAh基因枪法和花粉管通道法，转化到玉米中，对获得的阳性转基因玉米植株接种玉米螟，结果表明，在检测的175株阳性植株中有60株表现抗性，按照国际玉米螟协作组制定的九级分类标准，此60株的抗性皆为1级或者2级(图10)；

将植物表达载体pCAMBIAS1Ah通过农杆菌介导转化到烟草，对烟草阳性植株的叶片接种棉铃虫，由于mcry1Ah基因表达的Bt Cry1Ah的毒害作用，阳性被测植株都表现了较高的杀虫毒性(图14)，棉铃虫的矫正死亡率在90％以上。转化得到的甘蓝也同样明显获得抗性(图15)。

将pCAMBIAUbi-mrAh通过农杆菌介导转化水稻，将对获得的转基因水稻在田间人工接虫，用毛笔轻轻蘸取二龄二化螟，接种于分蘖期水稻叶片，每株接二化螟50头，一月后观察结果。转基因水稻的对二化螟的杀虫效果见图20，转基因水稻对二化螟有抗虫性，而非转基因水稻被二化螟为害，有些植株已经枯死。

将含有本发明中获得的基因序列的重组质粒转化大肠杆菌，结果显示mcry1Ah基因在能够在大肠杆菌中表达。并对提取出的蛋白进行生物活性测定，结果表明，mcry1Ah基因表达的蛋白对小菜蛾与棉铃虫均有较高的致死效应(表3)。mrcry1Ah基因表达的蛋白对水稻二化螟有较高的致死效应(表4)。因此可利用转化了本发明的改造基因的微生物生产对鳞翅目害虫有毒力的蛋白，由于本发明的改造基因在植物中能高效表达，因此也可利用转该基因的植物生产对鳞翅目害虫有毒力的蛋白，这些毒力蛋白可以应用于生产中的害虫防治。

本发明通过对cry1Ah基因的人工改造，使该基因更适于在植物中表达，将本发明获得的基因序列建植物表达载体，转化各种农作物，可以提高玉米、棉花、水稻、蔬菜、林木等植物抗对鳞翅目害虫的能力。

图说明：

图1为pUbi-mAh质粒构建图。

图2为质粒pUbi-mAh酶切鉴定图，

M为λ/HindIII+EcoRI marker，从上到下依次为21227，5148，4973，4268，3530，2027，1904，1584，1375，947，831，564bp；泳道1和泳道3为未酶切的pUbi-mAh载体；泳道2为BamHI+KpnI酶切pUmG2质粒回收后的载体片段；泳道4为BamHI+KpnI酶切验证pUbi-mAh载体。

图3为pCAMBIAS1Ah质粒构建图。

图4为pCAMBIAS1Ah质粒酶切鉴定图，

M为D15000+2000marker，从上到下依次为15000，10000，7500，5000，2500，2000，1000，750，500，250，100bp；泳道1为HindIII/EcoR I酶切pCAMBIAS1Ah质粒；泳道2为XhoI酶切pCAMBIAS1Ah质粒；泳道3为NcoI酶切pCAMBIAS1Ah质粒。

图5为pCAMBIAUbi-mrAh质粒构建图。

图6为pCAMBIAUbi-mrAh质粒酶切鉴定图，

泳道M为Lamda DNA/Eco1301Marker，依次为19329，7743，6223，4254，3472，2690，1882，1489，925，421，71bp；泳道1为HindIII酶切pCAMBIAUbi-mrAh质粒；泳道2为HindIII+EcoRI酶切pCAMBIAUbi-mrAh质粒。

图7pET-1Ahp质粒酶切鉴定及PCR检测图，

泳道M为Lamda DNA/Eco1301Marker，依次为19329，7743，6223，4254，3472，2690，1882，1489，925，421，71bp；泳道1为BamHI酶切pET-1Ahp质粒；泳道2为BamHI+Sal I酶切pET-1Ahp质粒；泳道3为PCR检测扩增的阳性条带；泳道4为PCR检测阴性对照。

图8mcry1Ah在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE检测图，

泳道1、2、3在上清表达的mCry1Ah蛋白；泳道4为沉淀中表达的mCry1Ah蛋白；

泳道5为大分子量蛋白Marker，从上到下依次为200、116、97.4、66.2、45kD。图9为金标试纸条检测结果，

泳道1为阳性蛋白检测结果；泳道2为非转基因玉米蛋白检测结果；泳道3-11为转基因玉米蛋白检测结果。箭头所指为阳性条带。

图10为玉米植株生物活性检测结果，

A为转基因玉米植株接虫20天后结果；B为非转基因植株接虫20天后结果；C为转基因植株接虫40天后结果；D为非转基因植株接虫40天后结果。

图11为转基因玉米的PCR检测结果，

泳道1为100bp ladder；泳道2为非转基因阴性对照；泳道3为阳性对照泳道4-8为转基因玉米样品。

图12为转基因玉米的Western blot检测结果，

泳道1-6为转基因玉米样品；CK-为阴性对照；CK+为阳性对照

图13为转mcry1Ah基因抗虫烟草的PCR检测结果，

泳道M为500bp Ladder，从上到下依次为2000，1000，900，800，700，600，500，400，300，200bp；泳道1为阴性对照；泳道2为阳性对照；泳道3-11为转化烟草植株。

图14为转基因烟草的抗虫性检测结果，

左图：非转化植株，右图：转基因植株

图15为获得的转化甘蓝植株，

左上具柄子叶，左下由具柄子叶获得的转化植株；

右上下胚轴，右下由下胚轴获得的转化植株

图16转化甘蓝的PCR检测结果，

泳道M为DNA Marker，从上到下一次为900，800，700，600，500bp；

泳道N为阴性对照；泳道P为阳性对照；泳道1-10为转化甘蓝植株。

图17转基因甘蓝的金标试纸条检测结果。

图18转mrcry1Ah基因水稻的PCR检测结果，

泳道M为Lamda DNA/Eco1301Marker，依次为19329，7743，6223，4254，3472，2690，1882，1489，925，421，71bp；泳道1、CK为阴性对照；泳道2为阳性对照；泳道3-13为转化水稻植株。

图19转mrcry1Ah基因水稻的Western blot检测结果，

泳道P为阳性对照；泳道CK为阴性对照；泳道1-4为转基因水稻植株。

图20转基因水稻对水稻二化螟的生物活性检测结果。

图21Seq No.2与Seq No.3相似性比对图。

图22Seq No.2与Seq No.7相似性比对图。

图23Seq No.3与Seq No.7相似性比对图。

具体实施方法

实施例1用于普通植物转化的cry1Ah基因的改造合成

本发明根据cry1Ah基因(中国专利，专利号：200410009918.9)的氨基酸序列(SEQ NO.1)，在保证氨基酸序列不变的前提下，首先采用植物优化密码子对cry1Ah基因的1-2001bp序列(SEQ NO.2)进行人工优化改造。尽量避免使用植物稀有密码子，并调整了密码子的使用频率(表1)，使Cry1Ah蛋白的密码子使用频率与植物中的使用频率接近(表1)。在此基础上，去除DNA序列中存在的典型的造成植物基因转录本不稳定的富含AT序列，并去除了发夹结构和常用限制性酶切位点，为了在起始密码子处形成一个NcoI(CCATGG)，在第一个起始密码子后加入了一个氨基酸(甘氨酸，GGA)，得到核苷酸序列为SEQ NO.3。该序列与cry1Ah基因同源性只有86.18％，而G+C含量由原来的37％提高到了48％。密码子在植物、cry1Ah基因和mcry1Ah基因中的使用频率见表1。除了上述发明的杀虫蛋白质Cry1Ah的DNA编码序列外，为了提高该序列在受体生物中的表达水平，在其5’端添加了Ω序列和Kozak序列，如Seq No.6。Ω序列是衍生于植物病毒衣壳蛋白质基因编码区的翻译增强序列，Ω序列由68bp组成，富集TTAAC序列，5’端有一个UAUUUUUACAACAA序列以及4个UUAC序列，这些序列在蛋白质合成的翻译过程中构成核糖体和rRNA结合位点(Richards et al，Eur J Biochem1987，84：513-519)。Kozak序列是促进外源基因在植物细胞内翻译过程的编码核糖体结合蛋白质的序列(Kozak et al，Nucleic Acids Res 1984，12：857-872)。另外，在编码序列3’端设计了几个连续的终止密码子，以确保翻译的准确终止。为了克隆方便，在上述序列两端引入分别引入了BamHI和KpnI，最终确定人工设计基因：mcrylAh基因，如SEQ NO.4所示。化学合成SEQ NO.4序列，并克隆到常用T-载体pTeasy上，获得质粒pTeasy-mcry1Ah。

表1密码子在植物、苏云金芽孢杆菌和改造基因中的使用频率比较

实施例2、用于水稻转化的cry1Ah基因的改造合成

本发明根据水稻基因的密码子偏好性对mcry1Ah基因进行了植物用密码子优化。根据mcry1Ah基因的氨基酸序列(SEQ NO.3)，在保证氨基酸序列不变的前提下，采用水稻偏好密码子对SEQ NO.3进行人工优化改造。调整密码子的使用频率，使Cry1Ah蛋白的密码子使用频率与水稻基因的使用频率接近。最后确定进一步改造的mcry1Ah基因即mrcry1Ah基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示，为了后续基因操作方便，在人工合成的基因两边加上了BamHI位点。最后确定进一步改造的mcry1Ah基因即mrcry1Ah基因的核苷酸序列，如SEQNO.5所示。SEQ NO.7与SEQ NO.2同源性只有81％，而G+C含量由原来的37％提高到了51％。密码子在普通植物、在普通栽培稻、在籼稻和mrcry1Ah基因中的使用频率见表2。mrcry1Ah基因克隆到常用T-载体pTeasy上，获得质粒pTeasy-mrcry1Ah。

表2密码子在普通植物、水稻和改造基因中的使用频率比较

实施例3、mcry1Ah基因及mrcry1Ah基因在大肠杆菌中的表达

以pTeasy-mcry1Ah质粒为模板，用特异性引物扩增2Kb的PCR产物，回收纯化，用BamHI、Sal I消化后，与同样处理的pET-21b质粒(常用质粒，可以在大肠杆菌中诱导表达外源基因，可以在Novagen公司购买)连接，转化E.coli JM110，通过酶切分析及PCR鉴定(图7)，筛选出阳性重组子，把所获得的重组表达载体质粒命名为pET-1Ahp。

将重组质粒pET-1Ahp转化到大肠杆菌BL21中，150rpm，18℃诱导目的蛋白表达，超声破碎，离心，分别取上清与沉淀进行SDS-PAGE(8％)分析(图8)。mcry1Ah基因能够在大肠杆菌中表达。

同样的步骤使mrcry1Ah基因在大肠杆菌中表达。

实施例4、mCry1Ah蛋白生物活性的测定

(1)对小菜蛾(P.xylostella)的室内杀虫活性测定

蛋白用无菌水稀释，用清水作为阴性对照。将新鲜甘蓝叶片清洗，晾干；分别在蛋白液中浸润10s，取出，晾干，放入广口瓶中(每片叶柄裹无菌水浸湿的脱脂棉进行叶片保鲜)；每瓶接虫20头(每个处理20头虫，三次重复)，虫龄2～3龄。放入25℃光照培养箱培养，分别于72hrs后进行调查。

(2)对棉铃虫(H.armigera)的室内杀虫活性测定

称取10g人工饲料置于灭菌培养皿中，加入1ml待测样品稀释液，充分混匀，分装于经消毒(5％福尔马林浸泡)的24孔细胞培养板中。用毛笔轻轻接入棉铃虫1-2龄幼虫，每孔一头，每处理重复三次，放置25℃光照培养箱中，培养七天调查死、活虫数。生物活性测定结果见表3。

表3mCry1Ah蛋白生物活性测定结果

试虫	致死中浓度(LC50)
		小菜蛾	38.967(16.836-60.154)(μg/mL)
棉铃虫	30.532(4.807-89.042)(μg/g)

实施例5、用于水稻转化的mrcry1Ah基因表达产物杀虫活性测定

水稻二化螟室内杀虫活性测定

称取30克人工饲料放置于培养皿中，分别加入1ml不同含量的待测样品(mrcry1Ah基因在大肠杆菌的表达产物)，充分混匀，分装于经灭菌的试管当中，用毛笔轻轻接入初孵幼虫，每管10头，每次重复5次，放置25℃光照培养箱中，96小时调查结果，计算LC₅₀。

表4mrCry1Ah蛋白对水稻二化螟杀虫结果

实施例6、转化玉米植物表达载体的构建

用BamHI和KpnI酶切质粒实施例1中获得的pTeasy-mcry1Ah(中国农业科学院植物保护研究所生物技术组保存)回收2.0Kb片段，用同样的内切酶酶切质粒pUmG2(中国农业科学院生物技术研究所农业微生物基因工程实验室保存)，回收5.4Kb片段，连接，构建完成质粒pUbi-mAh，质粒构建图见图1，质粒酶切鉴定图见图2。质粒pUmG2的结构描述如下：质粒骨架为pGEM-7Zf(+)(该质粒为常用质粒，可在美国Promega公司购买到)，多克隆位点中连有启动子序列为玉米泛素蛋白ubiquitin启动子(Christensen AH et al，1992，Plant Mol Biol，18(4)：675-89)，mG2基因和nos终止子；质粒pUbi-mAh的结构描述如下：质粒骨架为pGEM-7Zf(+)(该质粒为常用质粒，可在美国Promega公司购买到)，多克隆位点中连有启动子序列为玉米泛素蛋白ubiquitin启动子(Christensen AH et al，1992，Plant Mol Biol，18(4)：675-89)，本发明获得的mcry1Ah基因和nos终止子，该质粒可以在植物中表达外源基因。用于驱动基因表达的启动子并不限于ubiquitin启动子，可以是来源于水稻的actin启动子、来源于花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子等。为了在转化玉米中利于将转基因愈伤组织筛选出来，利用HindIII酶切质粒p-Hyg(含有表达潮霉素磷酸转移酶基因，对潮霉素有抗性，该质粒在中国农业科学院生物技术研究所保存)，连入用同样酶切的质粒pUbi-mAh，构建得到pUbi-mAh-hpt质粒。作为筛选标记基因的不限于潮霉素筛选标记基因，可以选择来自土壤吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因和来自S.viridochromogenes的pat基因，也可以选择耐草甘膦的编码EPSP合酶的aroA基因。

实施例7、花粉管通道转化玉米和转基因植株筛选

玉米转化用花粉管通道法(周光宇.从生物学角度探讨远缘杂交的理论.1987，11(2)：16-20)。大量提取质粒pUi-mAh，质粒DNA提取采用Qiagen Plasmid Kit(tip-100)试剂盒，方法同试剂盒说明书。在玉米授粉前一天对玉米雄穗和雌穗套袋隔离，授粉时，收集雄穗的花粉，均匀的散布于雌穗花丝上，套好纸袋，并在植株上挂上标记牌，详细标明玉米品种、授粉方式、授粉时间等信息。于授粉后16～20h左右进行花粉管导入，DNA浓度为150～250ng/μL，每穗滴入约200μL DNA，即每穗DNA滴注量为30～50μg；重新套好纸袋，并在标记牌上详细标明导入时间、导入基因种类与浓度、总计导入量等信息；待导入玉米穗自然结实后收获；于次年播种检测。

田间播种花粉管转化的玉米种子，待植株生长到4-5叶期，取适量玉米叶片，提取叶片蛋白，用BT-Cry1Ab/Ac金标免疫检测试剂盒检测叶片蛋白，转基因植株会显现阳性条带(图9)，转基因植株占检测植株的1.8％。

实施例8、基因枪转化玉米

剥离授粉后10～12天的玉米幼胚，在含有2～4mg/L2，4-D的N6培养基上诱导胚性愈伤组织。取状态良好继代培养的胚性愈伤组织，放入含有N6培养基的直径6cm的培养皿中，用由金粉包裹质粒的子弹进行轰击，每皿轰击一次。

子弹的处理方法：取50μl金粉悬浮液放入500μl离心管中，加入5μl质粒DNA溶液(1μg/ul)，混匀后加入5μl2.5M CaCl₂溶液和20μl0.1M的亚精胺，在室温下放置10分钟，短暂离心，弃去上清，重悬于70％乙醇，低速Vortex，保持悬浮状态。

待轰击后的玉米材料暗培养过夜，然后转移到N6培养基，然后转移到含有20mg/L潮霉素的N6培养基含(2mg/L2，4-D)上进行筛选。2～3周后选择能够正常生长的愈伤组织转移到20mg/L潮霉素的N6培养基含(2mg/L2，4-D)上继续筛选。将抗性愈伤组织转入含有60g/L蔗糖的N6培养基(含减半的2，4-D)上，培养两周，诱导形成胚状体。将发育好的胚状体转移到不含激素的N6培养基上萌发生长。当小植株长到1～2cm长时，转移到三角瓶中继续培养。3～4叶期且根系发达时，将小苗移入小花盆，外罩塑料袋保温保湿，移入温室栽培5～7天，去掉塑料袋后，再培养一周，移入大花盆，直至开花结实。

实施例9、转化植株的生物活性检测和分子检测

待转基因植株种植长到七八叶期时，人工接虫玉米螟：将即将孵化的玉米螟卵接种到玉米的心叶中和叶腋处，接虫量在100头左右，5天后第二次接虫，接虫量同第一次，20天后统计玉米为害情况。通过生物活性检测结果表明，在检测的175株阳性植株有60株植株表现高抗，按国际玉米螟协作组制定的九级分类标准，60株植株均为1级或2级(图10)。

提取抗性玉米的基因组DNA，取1μg基因组DNA做模板，引物序列如下：

1Ah1：5′-GAC TTG ACC GAA GGC ATT AGC-3′

1Ah2：5′-TTG TTG TTC TGT GGT GGG ATC-3′

PCR扩增的反应条件为：94℃，5分钟，1个循环；94℃，1分钟，56℃，1分钟，72℃，2分钟，30个循环，电泳结果如图11所示。

提取玉米的叶片可溶性蛋白，50μg蛋白10％SDS-PAGE电泳，将电泳转移至PVDF膜上，转化方法参见Bio-Rad说明书，用3％BSA封闭，用1：1000的Cry1Ah蛋白的多克隆抗体作为一抗，用碱性磷酸酶标记的二抗以1：10000(Sigma公司购买)杂交，显色后可见转基因植株有阳性条带，证明Bt Cry1Ah蛋白在玉米中表达(图12)。

利用基因枪转化玉米，获得转基因抗虫玉米的转化率为1.5％。

实施例10、转mcry1Ah基因抗虫烟草的获得

首先构建植物表达载体，载体骨架是双元载体pCAMBIA2301(该质粒为常用质粒，CAMBIA机构可以提供)，基因的表达盒由CaMV35S启动子、本发明获得的mcry1Ah基因和NOS终止子(一段DNA序列，含有基因表达的终止信号)。最终得到质粒命名为pCAMBIAS1Ah。对质粒进行酶切鉴定，结果如图3所示；构建图谱见图4。

构建步骤：用HindIII、EcoR I双酶切质粒pUC19(该载体为常用载体，可在美国Promega公司购买到)和pBI121(该载体为常用载体，GenBank登录号为AF485783。见Chen PY，et al，2003，Mol.Breed，11：287-293.。申请人的生物实验室可向公众发放)，将pBI121上的组成型表达启动子CaMV35S、GUS基因和NOS终止子连接到pUC19上，构成pUC19-SGN。用BamH I、EcoR I酶切pUC19-SGN，回收大片段，同时用BamH I、EcoR I酶切实施例6中获得的载体pUbi-mAh，回收mcry1Ah基因和NOS终止子，约2.4kb的片段。两个片段进行连接，构建成载体pUCS1Ah。然后用HindIII、EcoR I双酶切质粒pCAMBIA2301(该质粒为常用质粒，CAMBIA机构可以提供)回收大片段，同时HindIII、EcoR I双酶切质粒pUCS1Ah，回收约3.1kb的片段，将两个片段连接，可以得到载体pCAMBIAS1Ah(图3)，质粒酶切鉴定结果见图4。该载体为双元载体，可以在大肠杆菌和农杆菌中表达，可以通过农杆菌转化植物，在植物中表达外源基因。

采用冻融直接转化法，将构建好的质粒pCAMBIAS1Ah转入根癌农杆菌LBA4404。转化子在卡那霉素100μg/ml和链霉素125μg/ml的双抗性YEB培养基的平板上筛选。随机选取转化得到的克隆，少量提取质粒DNA进行PCR扩增验证，证明质粒已转入农杆菌。

烟草转化采用叶盘法(HorschRB，1986，ProcNatlAcad Sci USA.83(8)：2571-5)，转化外植体取培养的烟草无菌苗顶部幼嫩叶片。共培养三天后，转至分化培养基(MS培养基+100μg/ml Kn+500μg/ml Cb+3mg/ml6-BA+0.2mg/ml NAA)进行见光分化，2周后，在叶片边缘有绿色愈伤点出现，而大部分转化体则可以直接分化出抗性芽，抗性芽长到2-3cm时，移至生根培养基(MS培养基+100μg/ml Kn+500μg/ml Cb)生根，约2周后可生出细嫩小根，逐渐成苗。

提取转化烟草的基因组DNA，取1μg基因组DNA做模板，引物序列如下：

AHF：5′-GCTCTAGAGCCATCGATTGAGCCATGTTTCC

AH2RI：5′-GTCAAAATTCAACAGCTGATCAATGTGGTAGTCAGT

PCR扩增的反应条件为：94℃，7分钟，1个循环；94℃，1分钟，56℃，1分钟，72℃，2分钟，30个循环，电泳结果如图13所示。转基因烟草占转化烟草的阳性率为26％。

选取七叶期烟草的第二、第三、第四片叶子作为生测对象；将脱脂棉球把叶柄包裹，置于放有灭过菌滤纸的平皿中，并滴加ddH₂O500μl于棉球上；接虫：初孵棉铃虫11头接于每片叶片上；实验共选三株进行检测，每株选取三片叶子，各三个重复)。编号封口，将平皿放于铺有湿纱布的筐中，并将四周盖上湿纱布，置于28℃培养室中；每天注意观察，保持纱布湿度和室内温度；三天后统计试虫死亡数，计算死亡率。

图14即为接虫后三天的结果，可以看出非转化植株叶片已造成许多缺刻，还可以看到试虫的粪便，而转基因植株叶片在被咬成小空洞之后，由于Bt Cry1Ah的毒害作用，试虫死亡，可以看到幼虫的尸体。对各样品的死虫数进行了统计，并计算得出了各个样品的对照死亡率，各个样品都表现出了较高的杀虫毒性，校正死亡率在90％以上。

实施例11、转mcry1Ah基因抗虫甘蓝的获得

采用直接冻融转化法，将构建好的质粒pCAMBIAS1Ah转入根癌农杆菌LBA4404。转化子在卡那霉素100μg/ml和链霉素125μg/ml的双抗性YEB培养基的平板上筛选。随机选取转化得到的克隆，少量提取质粒DNA进行PCR扩增验证，证明质粒已转入农杆菌。

甘蓝转化采用下胚轴和具柄子叶作为转化外植体，转化方法见文献(张七仙等，2001，农业生物技术学报，9(1)：72-76)。共培养2天后，转至筛选培养基(MS培养基+100μg/LKn+500μg/L Cb+0.02mg/L NAA+0.2mg/L2，4—D)进行筛选，10d后转入分化培养基，见光分化，2周后，在叶片边缘有绿色愈伤点出现，而大部分转化体则可以直接分化出抗性芽，抗性芽长到2-3cm时，移至生根培养基(MS培养基+100μg/L Kn+500μg/L Cb+0.15mg/LNAA+20mg/L sugar)生根，约2周后可生出细嫩小根，逐渐成苗(图15)。

提取转化甘蓝的基因组DNA，取1μg基因组DNA做模板，引物序列如下：

AHF：5′-GCTCTAGAGCCATCGATTGAGCCATGTTTCC

AH2R1：5′-GTCAAAATTCAACAGCTGATCAATGTGGTAGTCAGT

PCR扩增的反应条件为：94℃，7分钟，1个循环；94℃，1分钟，56℃，1分钟，72℃，2分钟，30个循环，电泳结果如图16所示。

取适量甘蓝叶片，提取叶片蛋白，用BT-Cry1Ab/Ac金标免疫检测试剂盒检测叶片蛋白，转基因植株会显现阳性条带(图17)。检测结果显示甘蓝的平均转化率为1.5％。

实施例12、转mrcry1Ah基因抗虫水稻的获得

用BamHI酶切质粒实施例2中获得的pT-mrcry1Ah(中国农业科学院植物保护研究所生物技术组保存，含有SEQ NO.5序列的mrcry1Ah基因)，回收2.0Kb片段，用Klenow酶补平，用BamHI和KpnI酶切质粒pUbi-mAh(本专利中质粒，中国农业科学院生物技术研究所农业微生物基因工程实验室保存)，回收5.4Kb片段，用Klenow酶补平，两个片段连接，构建完成质粒pUbi-mrAh。然后用HindIII、EcoR I双酶切质粒pCAMBIA3301(该质粒为常用质粒，CAMBIA机构可以提供)回收大片段，同时HindIII、EcoR I双酶切质粒pUbi-mrAh，回收约4.4kb的片段，将两个片段连接，可以得到载体pCAMBIAUbi-mrAh。质粒构建图谱见图5，质粒酶切鉴定结果见图6。

将含有pCAMBIAUbi-mrAh质粒的农杆菌克隆接种于含有卡那霉素100μg/ml和链霉素125μg/ml的YEB液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.6-0.8，在4℃4000rpm离心10min，倒掉上清，沉淀用100ml的AAM培养液加1mlAS、52ul2，4-D、20ul KT悬浮，即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液；将胚性愈伤组织与农杆菌共培养20分钟；取出水稻愈伤组织，用灭菌滤纸吸干菌液，放置到铺有一层滤纸的培养基中，26℃暗培养3天，3天后转移至筛选培养基(25mg/L Basta)，26℃，光/暗＝15小时/9小时，2周后，移至分化培养基，有绿色愈伤点出现，2周后，愈伤点分化成小植株，将小植株切下移至生根培养基生根，根部发育健壮后，移至花盆在土中继续生长。

提取转化水稻的基因组DNA，取0.5μg基因组DNA做模板，引物序列如下：

mrHF：5′-ATGAAGAACAGCATCAAACTCTC

mrHR：5′-CGGTATCTGGTAGATGTGGACGG

PCR扩增的反应条件为：94℃，5分钟，1个循环；94℃，1分钟，56℃，1分钟，72℃，1分钟30秒，30个循环，PCR检测结果见图18。

提取水稻叶片蛋白，30μg蛋白10％SDS-PAGE电泳，将电泳转移至PVDF膜上，转化方法参见Bio-Rad说明书，用3％BSA封闭，用1：1000的Cry1Ah蛋白的多克隆抗体作为一抗，用碱性磷酸酶标记的二抗以1：10000(Sigma公司购买)杂交，显色后可见转基因植株有阳性条带，证明Bt Cry1Ah蛋白在水稻中表达(图19)。转基因水稻的转化率为1.91％。

序列表：

Seq NO.1Cry1Ah基因氨基酸序列

Seq NO.3mcry1Ah基因的改造区段

Seq NO.4mcry1Ah基因

Seq NO.5mrcry1Ah基因

Seq NO.6mcry1Ah基因的5’端序列

Seq NO.7mrcry1Ah基因的改造区段

Claims (15)

1.一种人工合成的对鳞翅目害虫表达高毒力蛋白的基因序列，其特征在于编码区的核苷酸序列如Seq No.3所示。

2.一种人工合成的对鳞翅目害虫表达高毒力蛋白的基因序列，其核苷酸序列如Seq No.4所示。

3.一种人工合成的对鳞翅目害虫表达高毒力蛋白的基因序列，其核苷酸序列如Seq No.7所示。

4.一种人工合成的对鳞翅目害虫表达高毒力蛋白的基因序列，其核苷酸序列如Seq No.5所示。

5.包含权利要求1-4所述任一基因序列的植物表达载体。

6.根据权利要求5所述的植物表达载体，为pUbi-mAh，其结构如图1所示。

7.根据权利要求5所述的植物表达载体，为pCAMBIAS1Ah，其结构如图3所示。

8.根据权利要求5所述的植物表达载体，为pCAMBIAUbi-mrAh，其结构如图5所示。

9.权利要求5-8所述任一植物表达载体在转化植物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，是指将pUbi-mAh转化到玉米中，所述转化方法指基因枪法、花粉管通道法。

11.根据权利要求9所述的应用，是指将pCAMBIAS1Ah转化烟草或甘蓝，所述转化方法指农杆菌介导的遗传转化法。

12.根据权利要求9所述的应用，是指将pCAMBIAUbi-mrAh转化水稻，所述转化方法指农杆菌介导的遗传转化法。

13.一种转基因微生物，其特征在于该微生物转化的外源基因为权利要求1-6所述的任一基因序列。

14.权利要求13所述的转基因微生物在表达具有Seq No.1所示氨基酸序列的对鳞翅目害虫有高毒力蛋白上的应用。

15.一种转基因植物在表达具有Seq No.1所示氨基酸序列的对鳞翅目害虫有高毒力蛋白上的应用，所述转基因植物的外源基因为权利要求1-4所述的任一基因序列。 

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