CN104988177B

CN104988177B - 一种转基因西瓜植株的制备方法

Info

Publication number: CN104988177B
Application number: CN201510355406.6A
Authority: CN
Inventors: 宗梅; 刘凡; 王桂香; 许勇; 郭宁; 韩硕; 张月云
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2015-06-24
Filing date: 2015-06-24
Publication date: 2018-04-27
Anticipated expiration: 2035-06-24
Also published as: CN104988177A

Abstract

本发明提供了一种转基因西瓜植株的制备方法，属于转基因植物制备领域。该方法是利用转入外源基因的农杆菌侵染西瓜成熟子叶外植体；之后转入共培养基上培养，所述共培养基是由3层无菌滤纸和适量的液体共培养基组成；之后外植体转入筛选培养基，前期使用较低浓度的筛选剂，后期逐渐提高筛选剂浓度，经过芽伸长筛选、生根、炼苗、移栽，得到转入外源基因的西瓜植株，分子鉴定结果显示外源基因成功转入并能稳定表达。本发明方法提高外植体细胞活力，转化细胞数目多，转化细胞与再生细胞重叠性好，逃逸体频率低，转化率高，转基因植株生长健壮，生根好，驯化存活率高，适用于不同外源基因及农杆菌菌株类型转化，且重复性良好，具有良好的经济价值。

Description

一种转基因西瓜植株的制备方法

技术领域

本发明涉及植物转基因技术领域，具体地，涉及一种转化率高的转基因西瓜植株的制备方法。

背景技术

从1983年转基因植物诞生以来，植物基因工程成为发展最快、应用潜力最大的生物技术之一。植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因，导入到目的植物的基因组中，使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。农杆菌介导的转基因方法是一种天然的植物遗传转化系统，具有易操作、低费用、高效率、外源基因在转基因植物中的拷贝数低和遗传稳定等独特优点，已成为转基因策略中的首选方法，在植物的遗传转化中广泛应用。

西瓜(Citrullus lanatus(Thunb.)为葫芦科一年生草本，是世界性重要瓜类蔬菜作物。1994年韩国学者Choi等首次报道，利用农杆菌LBA4404,将卡那霉素(Kanamycin)抗性基因和GUS标记基因转入了2个西瓜品种。随后，许多研究者对西瓜遗传转化进行了深入研究，将抗病、抗逆、耐贮藏等外源基因导入西瓜，并取得了相应进展。但是西瓜仍然被认为是很难利用农杆菌介导的转基因技术取得成功转化的物种，且转化效率普遍偏低。牛胜鸟等(2005)利用西瓜成熟胚子叶将小西葫芦黄化花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)复制酶基因、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)复制酶基因导入西瓜，转化效率为0.17％；Cho等(2008)报道成功转入bar、nptII基因，转化效率为0.33～1.16％；Huang等(Huang YC，Chiang CH，Li CH.Transgenic watermelon lines expressing thenucleocapsid gene of watermelon silver mottle virus and the role of thiaminein reducing hyperhydricity in regenerated shootsPlant Cell Tiss Organ Cult,2011,106:21–29)报道转移西瓜银斑病外鞘蛋白基因的转化效率为0.9～1.9％；Yu等(YuTA，Chiang CH，Wu HW，et al.Generation of transgenic watermelon resistant toZucchini yellow mosaic virus and Papaya ringspot virus type W.Plant Cell Rep,2011.30:359-371)报道将小西葫芦黄化花叶病毒外鞘蛋白基因和番木瓜环斑病毒外鞘蛋白基因转入西瓜，种子转化效率为8.5～10％，(由此推算出其外植体切块转化效率约为1.06％～1.25％)。从已有的报道来看，不同研究者报道结论差异较大，且普遍转基因频率低下。因此农杆菌介导法转化技术在西瓜上的规模化应用目前还存在困难，现有技术不能满足开展西瓜功能基因研究及遗传改良的需要。

目前西瓜全基因组测序及骨干育种材料的重测序工作已经完成，大量功能基因有待验证，在此基础上，将全面带动西瓜分子育种工作的快速发展。这个形势下，对建立一个高效的西瓜转基因技术提出了迫切需求。西瓜是公认的较难转化的作物之一，制约西瓜遗传转化效率的因素主要是在西瓜转基因过程中，普遍存在共培养结束后因农杆菌过度生长导致外植体生长不良；转化细胞与再生细胞重叠性低；逃逸体形成频率高，转化芽频率低；再生株易玻璃化，生根困难等问题。这些问题是导致西瓜外植体转基因植株生产率低的重要原因，而在多数前人的研究工作中都没有引起足够重视，仅把主要研究点放在了激素种类及浓度的配比使用上，取得的进展依然有限，这需要从其他方面改进技术，以建立高效稳定的转基因西瓜的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种转化率高、转基因植株生长健壮、存活率高的转基因西瓜植株的制备方法。

本发明提供的一种转基因西瓜植株的制备方法，包括以下步骤：

(1)含外源目的基因的农杆菌菌液侵染西瓜成熟子叶外植体；

(2)侵染后，将外植体转入共培养基中培养，所述共培养基为三层无菌滤纸，加入液体共培养基浸透滤纸；外植体置于滤纸之上共培养；

(3)共培养结束后，将步骤(2)的外植体转移到含低浓度筛选剂的筛选培养基上进行筛选培养，之后逐渐提高筛选剂的浓度进行筛选培养，挑选抗性外植体；

(4)将抗性外植体幼芽转入芽伸长培养基继续筛选，取生长良好的完整幼苗，转入生根培养基，幼苗生根后炼苗、移栽，得到转基因西瓜植株。

本发明方法中，步骤(1)所述的西瓜子叶外植体获得方法为：取健康饱满的西瓜种子，剥去种皮，避免伤及种仁，用70％乙醇溶液消毒30sec，无菌水清洗；有效氯浓度为0.2％-0.3％的次氯酸钠溶液消毒10-15min，无菌水清洗后接入BM培养基，28℃暗培养3天，切取健康萌动的种仁，自子叶近轴端，1.5mm×1.5mm切片，及时接入MS液体培养基中。

本发明方法中，步骤(1)侵染方法为将OD600为0.8-1.0的含外源基因的农杆菌菌液与西瓜子叶外植体混匀，侵染10min。

本发明方法中，步骤(2)所述的共培养是在28℃黑暗条件下培养4天。

其中，步骤(2)所述共培养基的配方为1650mg/L NH₄NO₃，1900mg/L KNO₃，170mg/LKH₂P0₄，370mg/L MgSO_4.7H₂O，332mg/L CaCl₂，223mg/L MnSO₄.4H₂O，6.2mg/L H₃BO₃，8.6mg/LZnSO₄.7H₂O，0.83mg/L KI，0.025mg/L Na₂MoO₄.2H₂O，0.025mg/L CuSO₄.5H₂O，0.025mg/LCoCl₂.6H₂O，27.8mg/L FeSO₄.7H₂O 37.3mg/L EDTA.Na₂，1000mg/L肌醇5mg/L烟酸，5mg/LVB₁，0.5mg/L VB₆，1.5mg/L6-BA，30g/L蔗糖，6g/L琼脂(液体共培养基不加琼脂)，pH5.8，118℃，20min高压灭菌；

所述液体共培养基的配方为上述固体培养基配方中不含琼脂。

其中，步骤(2)的加入液体共培养基的量应同时满足以下条件，即刚好浸润滤纸且无多余液体流出并保证28℃共培养4天后滤纸不干涸。

本发明方法的步骤(3)中，选择除草剂为筛选剂，优选地，选择草铵膦(PPT，Phosphinothricin)为筛选剂。

进一步地，步骤(3)的具体方法为，共培养结束后，选择正常膨大的黄色子叶切片外植体直接转入含3-3.5mg/L草铵膦和300mg/L羧苄青霉素的筛选培养基，筛选培养2-3周后，将抗性外植体转入含4.5-5.5mg/L草铵膦和300mg/L羧苄青霉素的筛选培养基，继续筛选培养2-3周，当抗性外植体在切口边缘有绿色瘤状愈伤生成并分化出不定芽时，将不定芽切下转入含6.5-7.5mg/L草铵膦和300mg/L羧苄青霉素的筛选培养基继续培养2-3周。

优选地，步骤(3)的具体方法为，共培养结束后，选择正常膨大的黄色子叶切片外植体直接转入含3mg/L草铵膦和300mg/L羧苄青霉素的筛选培养基，筛选培养2周后，将抗性外植体转入含5mg/L草铵膦和300mg/L羧苄青霉素的筛选培养基，继续筛选培养2周，当抗性外植体在切口边缘有绿色瘤状愈伤生成并分化出不定芽时，将不定芽切下转入含7mg/L草铵膦和300mg/L羧苄青霉素的筛选培养基继续培养2周。

本发明方法中，步骤(4)是将抗性外植体幼芽转入芽伸长培养基继续筛选2-3周，每周继代一次，将不定芽基部残留外植体和瘤状愈伤逐渐切除，使芽与培养基充分接触。

其中，步骤(4)中，转入生根培养基后的培养条件为2000LUX，12小时/天；25-28℃。

步骤(4)所述的移栽，是指待植株发育正常，小心取出再生苗，洗净根部琼脂，移栽到事先灭菌的草炭：蛭石：园土为1:1:2(V/V/V)的基质中，附上薄膜注意保湿，成活后移栽到温室常规管理。

本发明所述的含外源基因的农杆菌为本领域公知的通过基因工程方法转化得到的含有外源目的基因的农杆菌。在本发明的实施例中，采用的农杆菌菌株类型为EHA105或C58。

本发明方法还包括对筛选得到的除草剂抗性西瓜植株进行PCR鉴定，鉴定的目标基因为农杆菌转化的外源目的基因。

本发明提供了上述方法在西瓜遗传改良及育种中的应用。

基于本发明的上述技术方案，本发明方法的优点表现在：外植体细胞活力高，生长能力强，转化细胞数目多，转化细胞与再生细胞重叠性好，逃逸体频率低，转化率高，转基因植株生长健壮，生根好，驯化存活率高，在应用于不同基因及农杆菌转化下重复性好等优点。分述如下：

1、共培养条件技术改进及功效

常规技术中常存在农杆菌过度生长导致外植体，尤其是切口处细胞腐败死亡的问题。通过在培养基中添加高浓度抗生素虽然可以控制农杆菌生长，但在西瓜中，使用过高的抗生素会导致外植体玻璃化，不定芽生长不正常，再生株生根困难；通过清洗外植体的方法不仅会增加杂菌污染的机会，还会增加外植体伤害，不利于伤口细胞恢复生长。本发明中采用液体培养基浸润的滤纸作为共培养基质，既可以有效地控制农杆菌的生长，又可以提高细胞的活力和增殖能力，而且使转化细胞团与再生细胞团重叠性好，从而大大有利于转化细胞的不定芽形成，对提高转化率做出了关键性贡献。

2、筛选培养条件技术改进及功效

逃逸体再生频率高是影响西瓜转化效率的重要因素之一，除了上述在共培养期间通过提高转化细胞与再生细胞的重叠率来降低逃逸体频率外，本发明的梯度筛选方法使不定芽中的逃逸体频率从筛选方法一即前期不使用筛选压，后期使用较高筛选压(非梯度筛选方法)的91％降低至26.3％，对形成植株的进一步GUS染色及PCR鉴定，结果显示筛选方法二再生株中阳性率达52.1％，最终外植体切片的总转化率(阳性植株数/子叶切块数)为18.7％，显著高于方法一(即前期不适用筛选剂，后期使用较高浓度筛选剂)筛选下的3.64％，以及常规恒压筛选(即自始至终使用一种浓度的筛选剂)下的1％左右。如果按照种子转化率(阳性植株数/种子数)计，高达126.6％，也远远高于Yu等(2011)在同一西瓜基因型上的最高转化效率。

3、共培养及筛选培养技术条件对转基因再生植株的后效影响

在共培养阶段采用本发明方法后，农杆菌的生长量得到控制，这样在筛选培养基中采用300mg/L的羧苄青霉素就能很好抑制残存农杆菌的生长，从而避免了由于添加高浓度羧苄青霉素导致的植物愈伤组织生长旺盛，植株畸形及玻璃化等现象，进一步也有利于植株维管束的分化形成正常根系。

4、应用于不同基因及农杆菌转化下的可重复性

本方法具有基因可变性(如实施例中的bar/GUS基因，糖转运蛋白干扰基因，磷转运蛋白干扰基因)、农杆菌类型可变性(如实施例中农杆菌胭脂碱型菌株C58，琥珀碱型菌株EHA105)。

由上可见，与国内外现阶段的西瓜转基因技术指标及效率相比，本发明所建立的转基因西瓜的制备方法克服了现有技术中的转化细胞与再生细胞重叠性低，逃逸体频率高，转化率低，重复性差等问题，转化率及可重复性都达到了实用化水平。

附图说明

图1为实施例1制备的转基因再生植株的RT-PCR鉴定结果，其中，M：2Kb marker；P:质粒pBGI；N：未转化惠玲cDNA；—:水对照；1-5：惠玲转化株cDNA；bar引物扩增，长度430bp；GUS引物扩增，长度973bp；内参actin引物扩增，长度240bp。

图2为实施例1制备的转基因再生植株的PCR鉴定结果，其中，M：2Kb marker；P为质粒pBGI；N为未转化惠玲DNA；—:水对照；1-14：惠玲转化株DNA。

图3为实施例5中三种共培养方法下外植体上的农杆菌增殖情况。

图4为实施例5中，方法I转化细胞数目(左图)和方法III转化细胞数目(右图)，实心箭头所指为转化细胞，虚线箭头所指为再生细胞，说明方法III的子叶外植体转化细胞数大大提高，并与再生细胞高度重叠。

图5为实施例5中三种共培养方法培养外植体后，GUS基因的瞬时表达情况，显示方法III条件下，具有GUS阳性细胞团的子叶切块比率显著高于方法I和方法II。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明采用的培养基的配方如下：

BM培养基：1650mg/L NH₄NO₃，1900mg/L KNO₃，170mg/L KH₂P0₄，370mg/LMgSO_4.7H₂O，332mg/L CaCl₂，223mg/L MnSO₄.4H₂O，6.2mg/L H₃BO₃，8.6mg/L ZnSO₄.7H₂O，0.83mg/L KI，0.025mg/L Na₂MoO₄.2H₂O，0.025mg/L CuSO₄.5H₂O，0.025mg/L CoCl₂.6H₂O，27.8mg/L FeSO₄.7H₂O37.3mg/L EDTA.Na₂，1000mg/L肌醇5mg/L烟酸，5mg/LVB₁，0.5mg/LVB₆，30g/L蔗糖，5-7g/L琼脂，pH5.8，118℃，20min高压灭菌。

共培养基：1650mg/L NH₄NO₃，1900mg/L KNO₃，170mg/L KH₂P0₄，370mg/LMgSO_4.7H₂O，332mg/L CaCl₂，223mg/L MnSO₄.4H₂O，6.2mg/L H₃BO₃，8.6mg/L ZnSO₄.7H₂O，0.83mg/L KI，0.025mg/L Na₂MoO₄.2H₂O，0.025mg/L CuSO₄.5H₂O，0.025mg/L CoCl₂.6H₂O，27.8mg/L FeSO₄.7H₂O37.3mg/L EDTA.Na₂，1000mg/L肌醇5mg/L烟酸，5mg/LVB₁，0.5mg/LVB₆，1.5mg/L6-BA，30g/L蔗糖，6g/L琼脂(液体共培养基不加琼脂)，pH5.8，118℃，20min高压灭菌。

筛选培养基：1650mg/L NH₄NO₃，1900mg/L KNO₃，170mg/L KH₂P0₄，370mg/LMgSO_4.7H₂O，332mg/L CaCl₂，223mg/L MnSO₄.4H₂O，6.2mg/L H₃BO₃，8.6mg/L ZnSO₄.7H₂O，0.83mg/L KI，0.025mg/L Na₂MoO₄.2H₂O，0.025mg/L CuSO₄.5H₂O，0.025mg/L CoCl₂.6H₂O，27.8mg/L FeSO₄.7H₂O 37.3mg/L EDTA.Na₂，1000mg/L肌醇5mg/L烟酸，5mg/LVB₁，0.5mg/LVB₆，1.5mg/L 6-BA，30g/L蔗糖，6g/L琼脂，pH5.8，118℃，20min高压灭菌，后加3-7mg/LPPT(草铵膦)，300mg/L羧苄青霉素。

芽伸长培养基：1650mg/L NH₄NO₃，1900mg/L KNO₃，170mg/L KH₂P0₄，370mg/LMgSO_4.7H₂O，332mg/L CaCl₂，223mg/L MnSO₄.4H₂O，6.2mg/L H₃BO₃，8.6mg/L ZnSO₄.7H₂O，0.83mg/L KI，0.025mg/L Na₂MoO₄.2H₂O，0.025mg/L CuSO₄.5H₂O，0.025mg/L CoCl₂.6H₂O，27.8mg/L FeSO₄.7H₂O 37.3mg/L EDTA.Na₂，1000mg/L肌醇5mg/L烟酸，5mg/LVB₁，0.5mg/LVB₆，0.1mg/L 6-BA，0.01mg/L萘乙酸，30g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH5.8，118℃，20min高压灭菌，后加3mg/LPPT，300mg/L羧苄青霉素。

生根培养基：1650mg/LNH₄NO₃，1900mg/L KNO₃，170mg/LKH₂P0₄，370mg/LMgSO_4.7H₂O，332mg/L CaCl₂，223mg/L MnSO₄.4H₂O，6.2mg/L H₃BO₃，8.6mg/L ZnSO₄.7H₂O，0.83mg/LKI，0.025mg/LNa₂MoO₄.2H₂O，0.025mg/L CuSO₄.5H₂O，0.025mg/L CoCl₂.6H₂O，27.8mg/LFeSO₄.7H₂O37.3mg/L EDTA.Na₂，1000mg/L肌醇0.5mg/L烟酸，2mg/L甘氨酸，0.1mg/LVB₁，0.5mg/L VB₆，0.5mg/LIBA，30g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH5.8，118℃，20min高压灭菌。

MS液体培养基：1650mg/L NH₄NO₃，1900mg/L KNO₃，170mg/L KH₂P0₄，370mg/LMgSO_4.7H₂O，332mg/L CaCl₂，223mg/L MnSO₄.4H₂O，6.2mg/L H₃BO₃，8.6mg/L ZnSO₄.7H₂O，0.83mg/L KI，0.025mg/L Na₂MoO₄.2H₂O，0.025mg/L CuSO₄.5H₂O，0.025mg/L CoCl₂.6H₂O，27.8mg/L FeSO₄.7H₂O 37.3mg/L EDTA.Na₂，1000mg/L肌醇0.5mg/L烟酸，2mg/L甘氨酸，0.1mg/LVB₁，0.5mg/L VB₆，30g/L蔗糖，pH5.2，118℃，20min高压灭菌。

YEB培养基：5g/L蛋白胨，1g/L酵母提取物，5g/L牛肉膏，5g/L蔗糖，0.5g/LMgSO_4.7H₂O，pH7.0，118℃，20min高压灭菌。

本发明实施例所用的工程菌均为通过常规基因工程的方法构建含外源基因的质粒载体，再将质粒载体转化入农杆菌中。

实施例1转基因西瓜植株的制备方法与鉴定(1)

1、无菌材料的获得：取健康饱满的西瓜种子(品种为‘惠玲’，购于农友种苗公司)，小心剥去种皮(尽量避免伤及种仁)，在超净工作台上用70％乙醇溶液消毒30sec，无菌水清洗两次。有效氯浓度为0.3％的次氯酸钠溶液消毒15min，无菌水清洗3次后接入BM培养基，28℃暗培养3天，促进种子萌发。

2、工程菌活化：将-80℃保存的工程菌(农杆菌C58菌株，质粒为pBGI，携带除草剂抗性筛选基因bar和标记基因GUS)2μL接种于10ml含有抗生素(卡那霉素200mg/L+利福平50mg/L+庆大霉素100mg/L)的YEB培养基，28℃200rpm培养至菌液OD600＝0.8～1.0。

3、遗传转化：

3.1农杆菌侵染子叶外植体：切取健康萌动的种仁，自子叶近轴端，1.5mm×1.5mm切片，及时接入盛有10ml MS液体培养基的9cm培养皿中，全部完成后，加入OD600约为0.8的菌液50μl，混匀，侵染10min后，滤干菌液，将外植体分别转入共培养基中。

3.2共培养：使用三层无菌滤纸+4ml液体共培养基(BM培养基+1.5mg/L6-BA)作为共培养基，使液体共培养基刚好浸润滤纸且无多余液体流出并保证28℃共培养4天后滤纸不干涸；于28℃黑暗条件下培养4天。

3.3筛选培养：共培养结束后，选择正常膨大的黄色子叶切片外植体直接转入筛选培养基(含PPT 3mg/L，羧苄青霉素300mg/L)。筛选培养2周后抗性外植体为绿色且能继续生长膨大，切口边缘有绿色愈伤组织形成，将绿色抗性外植体转入含PPT 5mg/L，羧苄青霉素300mg/L的培养基中继续筛选2周。抗性外植体经过4周筛选培养在切口边缘有绿色瘤状愈伤生成并分化出不定芽，将不定芽切下转入PPT 7mg/L羧苄青霉素300mg/L的培养基继续培养2周。

4、芽伸长筛选：将生长良好的绿色幼芽转入芽伸长培养基继续筛选，约3周，每周继代一次。此时应将不定芽基部残留外植体和瘤状愈伤逐渐切除，使芽与培养基充分接触。经过芽伸长筛选，抗性芽成绿色且生长旺盛，逃逸体和嵌合体不定芽逐渐呈浅绿色或黄色，最终死亡。

5、生根培养：切取生长良好完整幼苗，转入生根培养基，15天左右可获得生根植株。培养环境条件为：2000Lux 12h/d，25～28℃。

6、再生植株移栽：待植株发育正常，小心取出再生苗，洗净根部琼脂，移栽到事先灭菌的草炭：蛭石：园土为1:1:2(V/V/V)的基质中，附上薄膜注意保湿，成活后移栽到温室常规管理。

7、再生植株的鉴定：

7.1外源基因的PCR鉴定：CTAB法提取基因组DNA，对筛选得到的除草剂抗性植株进行PCR鉴定，bar基因引物扩增片段大小为430bp；GUS基因引物扩增片段大小为973bp；未转化的再生植株DNA为阴性对照，转化用质粒为阳性对照。

bar引物序列(5’-3’)：

BAR-L：GGTCTGCACCATCGTCAACCAC，

BAR-R:AGCTGCCAGAAACCCACGTCAT；

GUS引物序列(5’-3’)：

GUS-L:CAACTGGACAAGGCACTAGCGG，

GUS-R:CCATACCTGTTCACCGACGACG。

PCR反应程序：94℃预变性4min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

7.2外源基因表达的反转录PCR鉴定

提取转基因材料总RNA，反转录为cDNA后进行PCR检测。引物、

扩增反应程序与基因组PCR一致。

“惠玲”转化株的检测结果见图1、图2，结果显示成功制备得到转基因西瓜植株。

实施例2转基因西瓜植株的制备方法与鉴定(2)

1、无菌材料的获得：取健康饱满的西瓜种子(品种为‘feeling(慧玲)’，购于农友种苗公司)，小心剥去种皮(尽量避免伤及种仁)，在超净工作台上用70％乙醇溶液消毒30sec，无菌水清洗两次。有效氯浓度为0.3％的次氯酸钠溶液消毒15min，无菌水清洗3次后接入BM培养基，28℃暗培养3天，促进种子萌发。

2、工程菌活化：将-80℃保存的工程菌(农杆菌EHA105菌株，质粒为1331-17962，携带除草剂PPT抗性筛选基因bar和磷转运蛋白过表达基因)2μL接种于10ml含有抗生素(卡那霉素100mg/L)的YEB培养基，28℃200rpm培养至菌液OD600＝0.8～1.0。

其他步骤同实施例1的3、4、5、6步骤。

本实施例的步骤7为：CTAB法提取基因组DNA，对筛选得到的除草剂抗性植株进行PCR鉴定，引物为bar基因引物扩增片段大小为430bp；未转化的再生植株DNA为阴性对照，转化用菌液为阳性对照。

bar引物序列(5’-3’)：

BAR-L：GGTCTGCACCATCGTCAACCAC，

BAR-R:AGCTGCCAGAAACCCACGTCAT。

外源基因表达的反转录PCR鉴定：提取转基因材料总RNA，反转录为cDNA后进行PCR检测，引物、扩增反应程序与基因组PCR一致。电泳结果发现，待检测的植株材料中扩增出430bp bar基因的片段，说明本实施例成功制备得到转基因西瓜植株。

实施例3转基因西瓜植株的制备方法与鉴定(3)

1、无菌材料的获得：取健康饱满的西瓜种子(品种为‘秀玲’，购于农友种苗公司)，小心剥去种皮(尽量避免伤及种仁)，在超净工作台上用70％乙醇溶液消毒30sec，无菌水清洗两次。有效氯浓度为0.3％的次氯酸钠溶液消毒15min，无菌水清洗3次后接入BM培养基，28℃暗培养3天，促进种子萌发。

2、工程菌活化：将-80℃保存的工程菌(农杆菌C58菌株，质粒为1311-15835RNAi，携带除草剂PPT抗性筛选基因bar和糖转运蛋白干扰表达基因)2μL接种于10ml含有抗生素(卡那霉素100mg/L)的YEB培养基，28℃200rpm培养至菌液OD600＝0.8～1.0。

其他步骤均同实施例2的第3、4、5、6、7步骤。

PCR及RT-PCR鉴定结果发现，在待检测的植株材料中扩增出430bp bar基因的片段，说明本实施例成功制备得到转基因西瓜植株。

实施例4转基因西瓜植株的制备方法与鉴定(4)

1、无菌材料的获得：取健康饱满的西瓜种子(品种为‘feeling’，购于农友种苗公司)，小心剥去种皮(尽量避免伤及种仁)，在超净工作台上用70％乙醇溶液消毒30sec，无菌水清洗两次。有效氯浓度为0.3％的次氯酸钠溶液消毒15min，无菌水清洗3次后接入BM培养基，28℃暗培养3天，促进种子萌发。

2、工程菌活化：将-80℃保存的工程菌(农杆菌C58菌株，质粒为1302-17962RNAi，携带除草剂PPT抗性筛选基因bar和磷转运蛋白干扰表达基因)2μL接种于10ml含有抗生素(卡那霉素100mg/L)的YEB培养基，28℃200rpm培养至菌液OD600＝0.8～1.0。

其他步骤均同实施例2的第3、4、5、6、7步骤。

实施例5不同共培养方法对转基因西瓜转化率的影响

方法I为现有技术中常规的共培养方法，即将农杆菌侵染的外植体置于固体共培养基上。

方法II为在外植体与固体共培养基之间，铺一层滤纸，且无液体共培养基。

方法III为本申请实施例1记载的共培养方法，即在三层无菌滤纸上，加入液体共培养基，加入的液体共培养基的量满足刚好浸润滤纸且无多余液体流出并保证28℃共培养4天后滤纸不干涸。

按照本申请实施例1记载的方法制备转基因西瓜，仅在步骤3的共培养阶段分别采用上述方法I、方法II和方法III。实验结果见图3-5。

三种方法28℃共培养4天后外植体表面农杆菌数量检测，外植体各20块，浸泡在2ml无菌水中10min，稀释1000倍，取200μL稀释后的液体涂布在含有抗生素(卡那霉素200mg/L+利福平50mg/L+庆大霉素100mg/L)的LB固体培养基上，28℃倒置培养48h后统计菌落数量。结果如图3所示，经过统计农杆菌菌落数量，传统共培养方法菌落数为550个，共培养基附加一层滤纸和液体共培养基浸润的三层滤纸作为共培养方法菌落数分别为120和348个，远低于传统共培养方法，因此均能够控制农杆菌生长。

通过对不同处理下外植体上的农杆菌进行悬浮液涂布计数，可以看见，外植体与琼脂培养基直接接触的常规方法下(方法I)，子叶切块上的农杆菌生长旺盛，活细胞数最多(平均为27.5CFU/切块)，而在三层湿滤纸的隔离下(方法Ⅲ)，子叶切块上的农杆菌活细胞数量降低(平均为17.4CFU/切块)。进一步对不同共培养方法下外植体的生长情况调查可见，光照培养4小时后方法Ⅲ外植体切块的转绿率达到68.09％，切块平均鲜重达17mg/个；而方法Ⅰ外植体块转绿率为48.57％，平均鲜重为14mg/个，方法Ⅱ(在外植体与琼脂培养基间仅加一层滤纸，且无液体培养基)下外植体上的农杆菌生长量最小(平均为6CFU/切块)，但切块的转绿率为45.63％，平均鲜重为13mg/个，统计学分析差异达显著水平。由此可见本发明方法中液体共培养基浸润的3层滤纸(方法Ⅲ，也即实施例1中的共培养方法)既可以有效地控制农杆菌的生长，液体培养基又可以与外植体充分接触，提高细胞的活力和增殖能力，有利于外植体生长。

共培养后对GUS基因瞬时表达检测发现，方法Ⅲ条件下，具GUS阳性细胞团的子叶切块比率为66.67％，显著高于方法Ⅰ下的37.78％和方法Ⅱ下的22.22％(图5)。而且单一切块上的蓝色细胞团数由常规方法Ⅰ下的最高3-4团提高到最高14团。尤其重要的是，不像方法Ⅰ、方法Ⅱ中，蓝色GUS阳性细胞分布区域与不定芽形成区域细胞重叠性很差，方法Ⅲ中，转化细胞团与再生细胞团重叠性好(图4)，从而大大有利于转化细胞的不定芽形成，对提高转化率至关重要。

实施例6筛选培养条件对转基因西瓜转化率的影响

本实施例对筛选培养条件中采用梯度筛选剂的方法(即为方法二，具体采用实施例1的方法进行)，和筛选前期即外植体转入筛选培养基后3-4周不使用筛选压，筛选后期即外植体有球形愈伤形成并开始分化出芽时使用较高筛选压的方法，本实施例称为方法一)进行了对比试验。

结果说明本发明的梯度筛选方法(方法二)使不定芽中的逃逸体频率从方法一的91％降低至26.3％，对形成植株的进一步GUS染色及PCR鉴定，结果显示筛选方法二再生株中阳性率达52.1％，最终外植体切片的总转化率(阳性植株数/子叶切块数)为18.7％，显著高于方法一筛选下的3.64％，以及常规恒压筛选下的1％左右。如果按照种子转化率(阳性植株数/种子数)计，本方案下高达126.6％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种转基因西瓜植株的制备方法，包括以下步骤：

(1)含外源目的基因的农杆菌菌液侵染西瓜成熟子叶外植体；所述西瓜成熟子叶外植体获得方法为：取健康饱满的西瓜种子，剥去种皮，避免伤及种仁，用70％乙醇溶液消毒30sec，无菌水清洗；有效氯浓度为0.2％-0.3％的次氯酸钠溶液消毒10-15min，无菌水清洗后接入BM培养基，28℃暗培养3天，切取健康萌动的种仁，自子叶近轴端，1.5mm×1.5mm切片，及时接入MS液体培养基中；侵染方法为将OD600为0.8-1.0的含外源基因的农杆菌菌液与西瓜成熟子叶外植体混匀，侵染10min；

(2)侵染后，将外植体转入共培养基中，在28℃黑暗条件下培养4天，所述共培养基为三层无菌滤纸，加入液体共培养基浸透滤纸；外植体置于滤纸之上共培养；所述液体共培养基的配方为1650mg/L NH₄NO₃，1900mg/L KNO₃，170mg/L KH₂P0₄，370mg/L MgSO_4.7H₂O，332mg/LCaCl₂，223mg/L MnSO₄.4H₂O，6.2mg/L H₃BO₃，8.6mg/L ZnSO₄.7H₂O，0.83mg/L KI，0.025mg/LNa₂MoO₄.2H₂O，0.025mg/L CuSO₄.5H₂O，0.025mg/L CoCl₂.6H₂O，27.8mg/L FeSO₄.7H₂O37.3mg/L EDTA.Na₂，1000mg/L肌醇，5mg/L烟酸，5mg/LVB₁，0.5mg/L VB₆，1.5mg/L6-BA，30g/L蔗糖，pH5.8，高压灭菌；

(3)共培养结束后，将步骤(2)的外植体转移到含低浓度筛选剂的筛选培养基上进行筛选培养，之后逐渐提高筛选剂的浓度进行筛选培养，挑选抗性外植体；具体方法为：共培养结束后，选择正常膨大的黄色子叶切片外植体直接转入含3-3.5mg/L草铵膦和300mg/L羧苄青霉素的筛选培养基，筛选培养2-3周后，将抗性外植体转入含4.5-5.5mg/L草铵膦和300mg/L羧苄青霉素的筛选培养基，继续筛选培养2-3周，当抗性外植体在切口边缘有绿色瘤状愈伤生成并分化出不定芽时，将不定芽切下转入含6.5-7.5mg/L草铵膦和300mg/L羧苄青霉素的筛选培养基继续培养2-3周；

(4)将抗性外植体幼芽转入芽伸长培养基继续筛选2-3周，每周继代一次，将不定芽基部残留外植体和瘤状愈伤逐渐切除，使芽与培养基充分接触，取生长良好的完整幼苗，转入生根培养基，幼苗生根后炼苗、移栽，得到转基因西瓜植株。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)三层滤纸作为共培养基质且加入液体共培养基的量应同时满足以下条件，即刚好浸润滤纸且无多余液体流出并保证28℃共培养4天后滤纸不干涸。

3.如权利要求1-2任一所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)的具体方法为，共培养结束后，选择正常膨大的黄色子叶切片外植体直接转入含3mg/L草铵膦和300mg/L羧苄青霉素的筛选培养基，筛选培养2周后，将抗性外植体转入含5mg/L草铵膦和300mg/L羧苄青霉素的筛选培养基，继续筛选培养2周，当抗性外植体在切口边缘有绿色瘤状愈伤生成并分化出不定芽时，将不定芽切下转入含7mg/L草铵膦和300mg/L羧苄青霉素的筛选培养基继续培养2周。

4.权利要求1-3任一所述的制备方法在西瓜遗传改良及育种中的应用。